DE69736597T2

DE69736597T2 - Gdnf rezeptor

Info

Publication number: DE69736597T2
Application number: DE69736597T
Authority: DE
Inventors: M. Gary Newbury Park FOX; Duanzhi Thousand Oaks WEN; Shuqian Thousand Oaks JING
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1996-04-22
Filing date: 1997-04-15
Publication date: 2006-12-21
Anticipated expiration: 2017-04-16
Also published as: US6455277B1; NO984757D0; BR9708959A; ATE338115T1; CA2250704C; AU2730997A; NZ332256A; US20030175876A1; AU720092B2; EA199800933A1; IL126553A0; SK140398A3; EP0909316B1; ES2271968T3; DE69736597D1; HUP9902640A2; EA002924B1; JP2000509271A; NO984757L; KR20000010571A

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Rezeptoren für einen von einer Gliazelllinie abgeleiteten neurotrophen Faktor (glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF) und stellt Nukleinsäuresequenzen und Aminosäuresequenzen zur Verfügung, die für den GDNF-Rezeptor (GDNFR) kodieren. Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf therapeutische Methoden zur Behandlung von auf GDNF ansprechenden Beschwerden.
2. Hintergrund der Erfindung
Der von einer Gliazelllinie stammende neurotrophe Faktor
Der von einer Gliazelllinie stammende neurotrophe Faktor (GDNF) wurde ursprünglich aus B49 Zellen der Ratte als ein potenter neurotropher Faktor isoliert und kloniert, der das Überleben von dopaminergen Neuronen des Mittelhirns verstärkt (Lin et al., Science, 260, 1130–1132, 1993). Jüngere Studien haben darauf hingedeutet, dass dieses Molekül eine Vielzahl weiterer biologischer Aktivitäten zeigt, die Wirkungen auf mehrere Arten von Neuronen sowohl des zentralen als auch des peripheren Nervensystems haben. In dem zentralen Nervensystem (ZNS) wurde gezeigt, dass GDNF den Axotomie-induzierten Tod von Motoneuronen des Gesichts und des Rückenmarks von Säugern verhindert (Li et al., Proceedings Of The National Academy Of Sciences, USA, 92, 9771–9775, 1995; Oppenheim et al., Nature, 373, 344–346, 1995; Yan et al., Nature, 373, 341–344, 1995; Henderson et al., Science, 266, 1062–1064, 1994; Zurn et al., Neuroreport, 6, 113–118, 1994) und sich entwickelnde Motoneurone des Vogels vor dem natürlichen programmierten Zelltod bewahrt (Oppenheim et al., 1995, sie oben). Es wurde gezeigt, dass die lokale Verabreichung von GDNF die nigralen dopaminergen Neurone vor einer Axotomie-induzierten (Kearns und Gash, Brain Research, 672, 104–111, 1995; Beck et al., Nature, 373, 339–341, 1995) oder einer Neurotoxin-induzierten Degeneration schützt (Sauer et al., Proceedings Of The National Academy Of Sciences USA, 92, 8935–8939, 1995; Tomac et al., Nature, 373, 335–339, 1995). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die lokale Verabreichung von GDNF das Aussprossen dopaminerger Neurone induziert, die Konzentrationen an Dopamin, Noradrenalin und Serotonin erhöht und die Motorik verbessert (Tomac et al., 1995 s.o.). Vor kurzem wurde berichtet, dass GDNF ein potenzieller trophischer Faktor für die noradrenergenen Neurone des Gehirns und für Purkinjezellen ist. Die Verpflanzung von Fibroblasten, die GDNF ektopisch exprimieren, verhinderte die 6-Hydroxydopamin-induzierte Degeneration und förderte den Phänotyp von adulten noradrenergen Neuronen in vivo (Arenas et al., Neuron, 15, 1465–1473, 1995), während exogen angewendetes GDNF das Überleben und die morphologische Differenzierung von embryonalen Purkinjezellen in vitro wirksam förderte (Mount et al., Proceedings Of The National Academy Of Sciences USA, 92, 9092–9096, 1995). Es wurde gezeigt, dass GDNF in dem peripheren Nervensystem das Überleben von Neuronen in nodösen, ziliaren und sympathischen Ganglien fördert, ebenso wie von kleinen Populationen embryonaler sensorischer Neurone in den dorsalen Wurzelganglien (dorsal root ganglia, DRG) und den trigeminalen Ganglien (Trupp et al., Journal Of Cell Biology, 130, 137–148, 1995; Ebendal et al., Journal Of Neuroscience Research, 40, 276–284, 1995; Oppenheim et al., 1995 s.o.; Yan et al., 1995 s.o.; Henderson et al., 194 s.o.). Von GDNF wurde außerdem berichtet, dass es die Expression des vasoaktiven intestinalen Peptids und der Präprotachykinin-A mRNA in kultivierten Neuronen des superioren cervikalen Ganglions (superior cervical ganglion, SCG) verstärkt und folglich den Phänotyp von SCG-Neuronen bewirkt und ein bündelähnliches Aussprossen induziert (Trupp et al., 1995 s.o.).
Die Expression von GDNF wurde in einigen verschiedenen Zellarten und Strukturen des Nervensystems beobachtet. In dem ZNS wurde eine GDNF mRNA-Expression mit Hilfe der reversen Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) sowohl in sich entwickelnden als auch im adulten Striatum der Ratte beobachtet, dem Hauptziel der nigralen dopaminergen Innervierung, sowie und weit verbreitet in anderen Regionen, einschließlich des Hippocampus, des Cortex, Thalamus, Septum, Cerebellum, Rückenmark und der Medulla oblongata (Arenas et al., s.o. 1995; Poulsen et al., Neuron, 13, 1245–1252, 1994; Springer et al., Experimental Neurology, 127, 167–170, 1994; Stroemberg et al., Experimental Neurology, 124, 401–412, 1993; Schaar et al., Experimental Neurology, 124, 368–371, 1993). Beim Menschen wurden GDNF-Transkripte außerdem im Striatum detektiert, mit den höchsten Konzentrationen in dem Caudatum und geringeren Konzent rationen in dem Putamen. Nachweisbare Mengen sind außerdem im Hippocampus, Cortex und Rückenmark festzustellen, jedoch nicht im Cerebellum (Schaar et al., Experimental Neurology, 130, 387–393, 1994; Springer et al., 1994 s.o.). In der Peripherie wurde die Expression der GDNF mRNA von Ratten einen Tag nach der Geburt beobachtet, im Ischiasnerv und in Primärkulturen neonataler Schwannzellen (Trupp et al., 1995 s.o.; Hoffer et al., Neuroscience Letters, 182, 107–111, 1994; Henderson et al., 1994 s.o., Springer et al., 1994 s.o.). Darüber hinaus haben jüngere Studien gezeigt, dass GDNF-Transkripte außerdem verbreitet in peripheren nicht-neuronalen Organen exprimiert werden, einschließlich den postnatalen Hoden und der Niere, der embryonalen Schnurrhaaranlage, dem Magen und der Haut. Eine Expression kann in geringerer Konzentration in embryonalem Muskel, der Nebenniere und den Extremitätenknospen sowie in der postnatalen Lunge, Leber und Ovar nachgewiesen werden (Trupp et al., 1995 s.o.; Henderson et al., 1994 s.o.). Die biologische Bedeutung der nicht-neuronalen Expression von GDNF ist jedoch bisher nicht klar.
Eine detaillierte Beschreibung der Herstellung und der Charakterisierung von GDNF-Proteinprodukten ist in der US-Patentanmeldung Nr. 08/182,183, eingereicht am 23. Mai 1994 und deren Stammanmeldungen (siehe auch PCT/US92/07888, WO 93/06116, eingereicht am 17. September 1992 und europäische Patentanmeldung Nr. 92921022.7, Veröffentlichungsnummer EP 610 254 ) zu finden, deren Offenbarungen hiermit durch Referenz eingeschlossen sind. Zusätzliche GDNF-Proteinprodukte werden in der anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 08/535,681, eingereicht am 28. September 1995, beschrieben, deren Offenbarung hiermit durch Referenz eingeschlossen wird. Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff "GDNF-Proteinprodukt" biologisch aktive synthetische oder rekombinante GDNF-Proteine und Analoga, ebenso wie chemisch modifizierte Derivate davon. GDNF-Analoge schließen Deletionsvarianten wie z. B. verkürzte GDNF-Proteine, ebenso wie Insertions- und Substitutionsvarianten von GDNF ein. Ebenfalls eingeschlossen sind GDNF-Proteine, die im Wesentlichen homolog zu dem humanen GDNF-Protein sind.
GDNF-Therapie
Die GDNF-Therapie ist hilfreich bei der Behandlung von Nervenschäden, die durch Bedingungen verursacht werden, die das Überleben und/oder die korrekte Funktion einer oder mehrerer Arten von Nervenzellen gefährden. Solche Nervenschäden können auf grund einer Vielzahl verschiedener Ursachen auftreten. Ein Nervenschaden kann bei einer oder mehreren Arten von Nervenzellen auftreten durch: (1) physische Verletzung, welche die Degeneration der axonalen Fortsätze oder Nervenzellkörper nahe der Stelle der Verletzung verursacht; (2) die vorübergehende oder permanente Einstellung des Blutflusses in Teilen des Nervensystems, wie z. B. bei einem Schlaganfall; (3) die beabsichtige oder versehentliche Exposition gegenüber Neurotoxinen, wie z. B. chemotherapeutischen Mitteln (z. B. Cisplatinum) zur Behandlung von Krebs oder Dideoxycytidin (ddC) zur Behandlung von AIDS; (4) chronische metabolische Erkrankungen, wie z. B. Diabetes oder Nierenfehlfunktion; oder (5) neurodegenerative Erkrankungen, wie z. B. Parkinsonsche Krankheit, Alzheimersche Krankheit und amyotrophe Lateralsklerose (ALS), die aus der Degeneration spezifischer neuronaler Populationen resultiert.
Mehrere Studien deuten darauf hin, dass die GDNF-Therapie besonders hilfreich bei der Behandlung neurodegenerativer Beschwerden ist, wie z. B. der Degeneration der dopaminergen Neurone der Substantia nigra bei der Parkinsonschen Krankheit. Die einzigen derzeit verfügbaren Behandlungen für die Parkinsonsche Krankheit sind palliativ und zielen darauf ab, die Dopaminmengen in dem Striatum zu erhöhen. Die erwartete Wirkung der GDNF-Therapie ist nicht einfach, eine Zunahme der dopaminergen Neurotransmission an den dopaminergen Nervenenden in dem Striatum zu erzeugen (was zu einer Verbesserung der Symptome führen wird), sondern außerdem das Fortschreiten der degenerativen Vorgänge zu verlangsamen oder sogar zu stoppen und die beschädigte nigrostriatale Achse zu reparieren und seine Funktion wiederherzustellen. GDNF kann außerdem bei der Behandlung anderer Arten der Schädigung dopaminerger Nervenzellen oder der inkorrekten Funktionen dopaminerger Nervenzellen in humanen Patienten verwendet werden. Ein(e) derartige(r) Schaden oder Funktionsstörung kann bei der Schizophrenie und anderen Arten von Psychosen auftreten. Die einzigen derzeit verfügbaren Behandlungen für solche Krankheitszustände sind symptomatisch und erfordern Arzneimittel, die auf die Dopaminrezeptoren oder die Orte der Dopaminaufnahme einwirken, was in Übereinstimmung mit der Ansicht steht, dass die inkorrekte Funktion der dopaminergen Neuronen, welche diese Rezeptor-tragenden neuronalen Populationen innervieren, an dem Krankheitsprozess beteiligt sein könnten.
Rezeptoren
Eine Zahl von Rezeptoren, welche die Bindung und die Antwort gegenüber Proteinfaktoren vermitteln, wurde charakterisiert und molekular kloniert, einschließlich der Rezeptoren für Insulin, für den von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor, den epidermalen Wachstumsfaktor und dessen Verwandte, den Fibroblasten-Wachstumsfaktor, verschiedene Interleukine, die hematopoetischen Wachstumsfaktoren und den ziliaren neurotrophen Faktor ( US 5,426,177 ). Studienergebnisse zeigen, dass einige Rezeptoren an verschiedene (verwandte) Wachstumsfaktoren binden können, während in anderen Fällen der gleiche Faktor verschiedene (verwandte) Rezeptoren aktivieren kann (z. B. Lupu et al., Science, 249: 1552–1555, 1990; Dionne et al., EMBO J., 9: 2685–2692, 1990; Miki et al., Science, 251: 72–75, 1991). Die meisten Rezeptoren können grob charakterisiert werden als Rezeptoren, die einen extrazellulären Teil oder eine extrazelluläre Domäne haben, der/die verantwortlich für die spezifische Bindung eines Proteinfaktors ist, eine Transmembrandomäne, welche die Zellmembran durchspannt und eine intrazelluläre Domäne, die häufig an der Auslösung einer Signaltransduktion bei Bindung des Proteinfaktors an den extrazellulären Teil des Rezeptors beteiligt ist. Obwohl viele Rezeptoren aus einer einzigen Polypeptidkette bestehen, benötigen andere Rezeptoren offensichtlich zwei oder mehr getrennte Untereinheiten, um ihren Proteinfaktor mit hoher Affinität zu binden und eine funktionelle Antwort nach der Bindung zu ermöglichen (z. B. Hempstead et al., Science, 243: 373–375, 1989; Hibi et al., Cell, 63: 1149–1157, 1990).
Die extrazellulären und intrazellulären Teile eines bestimmten Rezeptors können gemeinsame strukturelle Motive mit den entsprechenden Regionen anderer Rezeptoren teilen, was evolutionäre und funktionelle Verwandtschaften zwischen verschiedenen Rezeptoren nahe legt. Diese Verwandtschaften können häufig recht entfernt sein und können einfach die wiederholte Verwendung bestimmter allgemeiner Domänstrukturen widerspiegeln. Zum Beispiel verwendet eine Vielzahl verschiedener Rezeptoren, die nicht miteinander verwandte Faktoren binden, "Immunglobulin"-Domänen in ihren extrazellulären Teilen, während andere Rezeptoren "Cytokinrezeptor"-Domänen in ihren Faktor-bindenden Regionen verwenden (z. B. Akira et al., The FASEB J., 4: 2860–2867, 1990). Eine große Anzahl von Rezeptoren mit individuellen Bindungsdomänen (welche folglich verschiedene Faktoren binden) enthalten verwandte intracytoplasmatische Domänen, welche für Tyrosin-spezifische Proteinkinasen kodieren, die in Antwort auf die Bindung des Faktors aktiviert werden (z. B. Ullrich und Schlessinger, Cell, 61: 203–212, 1990). Die Mechanismen, durch welche die Bindung eines Faktors die Signaltransduktionsprozesse "aktiviert", sind kaum verstanden, selbst in dem Fall der Rezeptor-Tyrosinkinasen. Für andere Rezeptoren, in denen die intrazelluläre Domäne für eine Domäne mit unbekannter Funktion kodiert oder in denen die Bindungskomponente mit einem zweiten Protein mit unbekannter Funktion assoziiert (z. B. Hibi et al., Cell, 63: 1149–1157, 1990), ist die Aktivierung der Signaltransduktion nicht gut charakterisiert.
Die Wirkungsweise von GDNF in vivo ist auf dem Gebiet nicht eindeutig aufgeklärt, zum Teil aufgrund des Nichtvorhandenseins von Informationen über einen Rezeptor für GDNF. Zwei Gruppen haben unabhängig voneinander festgestellt, dass in das Striatum injiziertes [¹²⁵I]-markiertes GDNF retrograd von dopaminergen Neuronen in die Substantia nigra transportiert werden kann (Tomac et al., Proceedings Of The National Academy Of Sciences OF The United States Of America, 92, 8274–8278, 1995; Yan et al., 1995 s.o.). Der retrograde Transport von [¹²⁵I]-GDNF durch Motoneurone des Rückenmarks, sensorische Neurone der DRG und Neurone in der B-Schicht der Retina-Ganglien wurde ebenfalls beobachtet. Diese Phänomene des retrograden Transports können alle durch hundertfache oder höhere Konzentrationen an unmarkiertem GDNF spezifisch inhibiert werden, was einen sättigbaren, Rezeptor-vermittelten Transportvorgang nahe legt. In vitro wurde gezeigt, dass GDNF in sehr geringen Konzentrationen das Überleben von kultivierten dopaminergen Neuronen erhöht und die Dopaminaufnahme verstärkt. Die beobachtete halbmaximale wirksame Konzentration (EC₅₀) von GDNF auf diese Neuronen ist 0,2 bis 1,6 pM (Lin et al., 1993 s.o.). Es wurde außerdem gezeigt, dass GDNF das Überleben von dissoziierten Motoneuronen in niedrigen Konzentrationen unterstützt. Der berichtete EC₅₀ von GDNF auf Motoneuronen in einem Bereich von 5 bis 10 fM ist sogar niedriger als die auf dopaminerge Neuronen (Henderson et al., 1994 s.o.).
Zusammengefasst deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass Rezeptor(en) für GDNF, die in diesen Zellen exprimiert werden, sehr hohe Liganden-bindende Affinitäten aufweisen. Ähnlich wie bei Mitgliedern der TGF-β Familie, legen die breit gefächerte Gewebeverteilung und die verschiedenen biologischen Wirkungen von GDNF auf verschiedene Populationen von Zellen nahe, dass verschiedene Arten von Rezeptor(en) für GDNF oder Rezeptorkomplexe existieren könnten. Der Sättigungsstationärzustand und die kompetitive Bindung von [¹²⁵I]-GDNF an sympathische Neurone von E10 des Hühnchens haben gezeigt, dass diese Neurone GDNF-Bindungsstellen exprimieren, die sich von den in dopaminergen Neuronen und Motoneuronen beobachteten unterscheiden.
Die halbmaximale Sättigungskonzentration und die halbmaximale Inhibitionskonzentration von GDNF auf diese Bindungsstellen liegt im Bereich von 1 bis 5 nM (Trupp et al., 1995 s.o.). In ähnlicher Weise wurde berichtet, dass der EC₅₀ von GDNF bei der Unterstützung des Überlebens sympathischer Neurone aus P1 Ratten-SCG im nanomolaren Bereich liegt (Trupp et al., 1995 s.o.).
Um den Mechanismus besser zu verstehen, durch welchen GDNF die Signaltransduktion zur Ausübung seiner Wirkungen auf Zellen aktiviert, wäre es vorteilhaft, den Rezeptor/die Rezeptoren zu identifizieren, welche(r) die Bindung und die Antwort auf diesen Proteinfaktor vermittelt/vermitteln. Es wäre außerdem hilfreich für die GDNF-Therapie, akzessorische Moleküle, welche die GDNF-Signaltransduktion bereit stellen oder verstärken, zu identifizieren und ihre Herstellung zu ermöglichen. Darüber hinaus würde die Identifikation eines Proteinrezeptors für GDNF leistungsstarke Anwendungen bei der diagnostischen Verwendung zur Verfügung stellen, z. B. als Hilfsmittel bei der Bestimmung, ob Individuen von einer GDNF-Proteintherapie profitieren würden. Darüber hinaus könnte der Proteinrezeptor für GDNF eine Schlüsselkomponente in einem Assay zur Identifizierung zusätzlicher Moleküle sein, welche an den Rezeptor binden und zu der gewünschten biologischen Aktivität führen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Nukleinsäuresequenzen zur Verfügung, welche für ein Rezeptorprotein eines neurotrophen Faktors (ein neurotropher Faktor-Rezeptorprotein) kodieren, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, wie sie in 2 (SEQ ID NR: 2) dargestellt ist. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes und gereinigtes neurotropher Faktor-Rezeptorprotein zur Verfügung, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

(a) einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2;
(b) einer Aminosäuresequenz, die Ser¹⁸ bis Pro⁴⁴⁶ der SEQ ID NR: 2 umfasst;
(c) einer Aminosäuresequenz, die Asp²⁵ bis Leu⁴⁴⁷ der SEQ ID NR: 2 umfasst; und
(d) einer Aminosäuresequenz, die Cys²⁹ bis Cys⁴⁴² der SEQ ID NR: 2 umfasst;

Das Rezeptorprotein und die Proteinprodukte des neurotrophen Faktors gemäß der vorliegenden Erfindung werden hierin als von einer Gliazelllinie stammender neurotropher Faktor-Rezeptor(glial cell line-derived neurotrophic factor receptor, GDNFR)-Protein und -Proteinprodukte bezeichnet. Die neuen GDNFRs sind funktionell durch die Fähigkeit gekennzeichnet, GDNF spezifisch und mit hoher Affinität zu binden und als Teil eines molekularen Komplexes zu wirken, welcher die Signaltransduktionswirkungen von GDNF vermittelt oder verstärkt. GDNFR-Proteinprodukte werden typischerweise als ein lösliches Rezeptorprotein und in einer im Wesentlichen gereinigten Form zur Verfügung gestellt.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Herstellung von GDNFR-Proteinprodukten mit Hilfe rekombinanter gentechnologischer Verfahren zur Verfügung. In einer alternativen Ausführungsform werden die GDNF-Proteine mit Hilfe chemischer Methoden synthetisiert oder mit Hilfe einer Kombination der rekombinanten und chemischen Methoden.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können die GDNFR-Proteine in glycosylierter oder nicht-glycosylierten Formen hergestellt werden. Derivate des GDNFR-Proteins umfassen typischerweise die Anheftung des GDNFR-Proteins an ein wasserlösliches Polymer. Zum Beispiel kann das GDNFR-Protein mit ein oder mehreren Polyethylenglycolmolekülen konjugiert werden, um die Präzipitation des GDNFR-Proteinproduktes in einer wässrigen Umgebung zu verringern.
Ein noch weiterer Aspekt gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die verschiedenen Polynukleotide, welche für GDNFR-Proteine kodieren. Diese Nukleinsäuresequenzen werden für die Expression von GDNFR in einer eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtszelle verwendet, wobei das Expressionsprodukt oder Derivat davon durch die Fähigkeit gekennzeichnet ist, an GDNF zu binden und dadurch einen Komplex zu bilden, der fähig ist, die GDNF-Aktivität zu vermitteln, wie z. B. die Erhöhung der Dopaminaufnahme durch dopaminerge Zellen. Die Polynukleotide können außerdem in der Zelltherapie oder für Gentherapieanwendungen verwendet werden. Geeignete Nukleinsäuresequenzen schließen die spezifisch in den Figuren dargestellten ein, ebenso wie degenerierte Sequenzen, natürlich vorkommende allele Variationen und modifizierte Sequenzen auf Grundlage der vorliegenden Erfindung.
Beispielhafte Nukleinsäuresequenzen schließen Sequenzen ein, welche für ein neurotropher Faktor-Rezeptorprotein kodieren, das eine Aminosäuresequenz wie in 2 (SEQ ID NR: 2) dargestellt umfasst und das zur Komplexierung mit dem von einer Gliazelllinie stammenden neurotrophen Faktor (glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF) und zur Vermittlung einer Zellantwort gegenüber GDNF fähig ist. Solche Sequenzen schließen ein:

(a) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein neurotropher Faktor-Rezeptorprotein kodiert, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 umfasst;
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein neurotropher Faktor-Rezeptorprotein kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die Ser¹⁸ bis Pro⁴⁴⁶ der SEQ ID NR: 2 umfasst;
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein neurotropher Faktor-Rezeptorprotein kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die Asp²⁵ bis Leu⁴⁴⁷ der SEQ ID NR: 2 umfasst;
(d) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein neurotropher Faktor-Rezeptorprotein kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die Cys²⁹ bis Cys⁴⁴² der SEQ ID NR: 2 umfasst;
(e) eine Nukleinsäuresequenz, die eine in SEQ ID NR: 1 dargestellte Sequenz umfasst, welche die für Met¹ bis Ser⁴⁶⁵ kodierenden Nukleotide umfasst, wobei die genannte Sequenz für ein neurotropher Faktor-Rezeptorprotein (GDNFR) kodiert;
(f) eine Nukleinsäuresequenz, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die (1) mit einer komplementären Sequenz von (e) hybridisiert und (2) für eine Aminosäuresequenz mit GDNFR-Aktivität kodiert; und
(g) eine Nukleinsäuresequenz, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes mit einer komplementären Sequenz von (e) hybridisieren würde und (2) für eine Aminosäuresequenz mit GDNFR-Aktivität kodiert;

Ebenfalls hierin offenbart sind Vektoren, die derartige Nukleinsäuresequenzen umfassen, wobei die Sequenzen typischerweise mit einem oder mehreren funktionellen Elementen verbunden sind, die im Stande sind, die Amplifikation oder Expression der Nukleinsäuresequenz zu bewirken. Wirtszellen, die solche Vektoren enthalten, sind ebenfalls vorgesehen. Typischerweise wird die Wirtszelle ausgewählt aus Säugerzellen und Bakterienzellen, wie z. B. einer COS-7 Zelle bzw. E. coli.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst Vektoren, welche die für die GDNFR-Proteine kodierenden Polynukleotide enthalten, die funktionell mit Kontrollsequenzen für die Amplifikation und/oder Expression verbunden sind. Sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Wirtszellen können mit solchen Vektoren stabil transformiert oder transfiziert werden, um GDNFR-Proteine zu exprimieren. Die vorliegende Erfindung schließt weiterhin die rekombinante Herstellung eines GDNFR-Proteins ein, wobei derartige transformierten oder transfizierten Wirtszellen in einem geeigneten Nährmedium wachsen gelassen werden und das von diesen Zellen exprimierte GDNFR optional aus den Wirtszellen und/oder dem Nährmedium isoliert wird. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Verwendung von Polynukleotiden, die für GDNFR kodieren und von Vektoren, die solche Polynukleotide enthalten, in der Gentherapie oder Zelltherapie.
Die Wirtszelle kann außerdem aufgrund ihrer Eignung zur humanen Implantation selektiert werden, wobei die implantierte Zelle einen neurotropher Faktor-Rezeptor gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert und sezerniert. Die Wirtszelle kann außerdem in eine semipermeablen Membran eingeschlossen werden, die für die humane Implantation geeignet ist. Die Wirtszelle kann ex vivo transformiert oder transfiziert werden. Eine beispielhafte Vorrichtung zur Behandlung eines Nervenschadens umfasst: (a) eine für die Implantation geeignete semipermeable Membran; und (b) Zellen, die in der Membran eingekapselt sind, wobei die Zellen einen neurotropher Faktor-Rezeptor wie hierin offenbart exprimieren und sezernieren. Die Membran wird aus einem Material gewählt, das permeabel für das neurotropher Faktor-Rezeptorprotein ist, jedoch impermeabel für Materialien, die schädlich für die eingekapselten Zellen sind.
Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines neurotropher Faktor-Rezeptors gemäß der vorliegenden Erfindung werden ebenfalls offenbart. Ein beispielhaftes Verfahren um fasst: ein Verfahren zur Herstellung des neurotropher Faktor-Rezeptorproteins gemäß Anspruch 1, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Kultivieren einer Wirtszelle, die eine Nukleinsäuresequenz enthält, die für ein neurotropher Faktor-Rezeptorprotein gemäß Anspruch 1 kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (i) einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 2; (ii) einer Aminosäuresequenz, die Ser¹⁸ bis Pro⁴⁴⁶ der SEQ ID NR: 2 umfasst; (iii) einer Aminosäuresequenz, die Asp²⁵ bis Leu⁴⁴⁷ der SEQ ID NR: 2 umfasst; und (iv) einer Aminosäuresequenz, die Cys²⁹ bis Cys⁴⁴² der SEQ ID NO: 2 umfasst; unter Bedingungen, die für die Expression des genannten neurotropher Faktor-Rezeptorproteins durch die genannte Wirtszelle geeignet sind; und
(b) optional, Isolieren des genannten neurotropher Faktor-Rezeptorproteins, das von der genannten Wirtszelle exprimiert wird.

Die Wirtszelle kann eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein. Falls eine bakterielle Expression verwendet wird, kann das Verfahren weiterhin den Schritt der Rückhaltung des neurotropher Faktor-Rezeptors umfassen.
Die vorliegende Erfindung schließt ein isoliertes und gereinigtes Protein ein, das eine wie in 2 (SEQ ID NR: 2) dargestellte Aminosäuresequenz umfasst und Proteine, welche die Aminosäuresequenz Ser¹⁸ bis Pro⁴⁴⁶, Asp²⁵ bis Leu⁴⁴⁷ und Cys²⁹ bis Cys⁴⁴² wie in 2 (SEQ ID NR: 2) dargestellt umfassen, die fähig sind, mit dem von einer Gliazelllinie stammenden neurotrophen Faktor (GDNF) zu komplexieren und eine Zellantwort auf GDNF zu vermitteln, wie oben dargestellt. Die Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung können glycosyliert oder nicht-glycosyliert sein und können mit Hilfe rekombinanter Verfahren oder der chemischen Synthese hergestellt werden. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin Nukleinsäuresequenzen, die für ein Rezeptorprotein kodieren, das solche Aminosäuresequenzen umfasst.
Ebenfalls hierin offenbart sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein Proteinrezeptor gemäß der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen. Eine Vielzahl anderer Formulierungsmaterialien können verwendet werden, um die Herstellung, Lagerung, Handhabbarkeit, Lieferung und/oder Wirksamkeit zu erleichtern.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt die therapeutische Verwendung von GDNFR Genen und Proteinen ein. Die folgenden therapeutischen Verwendungen werden zur Verfügung gestellt:

(a) Verwendung des neurotropher Faktor-Rezeptorproteins gemäß Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
(b) Verwendung eines neurotropher Faktor-Rezeptorproteins gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung der Parkinsonschen Krankheit.
(c) Verwendung eines neurotropher Faktor-Rezeptorproteins gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung der Alzheimerschen Krankheit.
(d) Verwendung eines neurotrophen Proteins gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung der amyotrophen Lateralsklerose.

Zum Beispiel kann ein zu zirkulierendes oder lösliches GDNFR-Proteinprodukt allein oder in Verbindung mit GDNF bei der Behandlung einer Erkrankung oder einer Verletzung des Nervensystems durch Verstärkung der Aktivität der Transmembran-Signalgebung von GDNF verwendet werden. Folglich können die Proteine und pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung inkorrekt funktionierender dopaminerger Nervenzellen, der Parkinsonschen Krankheit, der Alzheimerschen Krankheit und der amyotrophen Lateralsklerose verwendet werden. Alternativ kann ein rekombinantes GDNFR-Gen in die Zellen oder Gewebe insertiert werden, die von einer erhöhten Sensitivität gegenüber GDNF profitieren würden, wie z. B. die Motoneurone in Patienten, die an amyotropher Lateralsklerose leiden. In noch einer weiteren Ausführungsform kann GDNF verwendet werden, um die GDNF-Aktivität in solchen Fällen zu blockieren, in denen angenommen wird, dass die GDNF-Aktivität schädlich ist. Der GDNFR kann verwendet werden, um zu überprüfen, dass die beobachteten Wirkungen von GDNF auf den GDNFR zurückzuführen sind.
In noch einem weiteren Aspekt der Erfindung können GDNFR-Sonden verwendet werden, um Zellen und Gewebe zu identifizieren, die in normalen oder krankhaften Zuständen ansprechempfindlich gegenüber GDNF sind. Alternativ können die Sonden verwendet werden, um eine Anomalität der GDNFR-Expression in einem Patienten nachzuweisen, der an einer mit GDNF im Zusammenhang stehenden Störung leidet.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung können GDNFR-Sonden, einschließlich Nukleinsäuren- als auch Antikörpersonden verwendet werden, um mit GDNFR in Zusammenhang stehende Moleküle zu identifizieren. Zum Beispiel stellt die vorliegende Erfindung Moleküle zur Verfügung, die einen Komplex mit GDNFR bilden und dadurch an der GDNFR-Funktion beteiligt sind. Als weiteres Beispiel stellt die vorliegende Erfindung Rezeptormoleküle zur Verfügung, die homolog zu GDNFR oder antigen kreuzreaktiv mit GDNFR sind, jedoch nicht mit GDNFR identisch sind.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem die Entwicklung sowohl von Bindungsassays als auch von Funktionsassays für GDNF zur Verfügung, die auf dem Rezeptor basieren. Zum Beispiel können Systeme zum Nachweis einer GDNF-Aktivität Zellen umfassen, die hohe Konzentrationen an GDNFR exprimieren und die daher extrem sensitiv sogar gegenüber sehr geringen Konzentrationen an GDNF oder GDNF-ähnlichen Molekülen sind. In noch einer weiteren Ausführungsform kann löslicher GDNFR verwendet werden, um GDNF oder GDNF-ähnliche Moleküle zu binden oder ihr Vorhandensein nachzuweisen. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung experimentelle Modellsysteme zur Untersuchung der physiologischen Rolle von GDNF zur Verfügung. Solche Systeme schließen Assays ein, die anti-GDNFR Antikörper oder Oligonukleotidsonden umfassen, ebenso wie Tiermodelle, wie z. B. transgene Tiere, die hohe Konzentrationen an GDNFR exprimieren und daher hypersensibel gegenüber GDNF sind, oder Tiere, die unter Verwendung der embryonalen Stammzelltechnik erzeugt wurden, in denen die endogenen GDNFR-Gene aus dem Genom entfernt wurden. Ein anti-GDNFR Antikörper wird einen Peptidteil des neurotropher Faktor-Rezeptorproteins binden. Antikörper schließen monoklonale und polyklonale Antikörper ein. Alternativ können immunologische Markierungen, für die bereits Antikörper existieren, an das GDNFR-Protein angefügt werden, um den Nachweis zu erleichtern. Solche Markierungen (tags) schließen Flag-(IBI/Eastman Kodak) und myc-Sequenzen ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Andere Markierungssequenzen, wie z. B. Polyhistidin, wurden ebenfalls für die Detektion und die Reinigung auf metallchelatbildenden Säulen verwendet.
Zusätzliche Aspekte und Vorteile der Erfindung werden für die Fachleute auf dem Gebiet bei Betrachtung der folgenden Beschreibung offensichtlich werden, welche die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung im Detail beschreibt.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt eine Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NR: 1), die für den humanen Rezeptor des von einer Gliazelllinie abgeleiteten neurotrophen Faktors (GDNFR) kodiert. Die Aminosäuresequenz des vollständig langen GDNFR-Proteins wird durch die Nukleinsäuren 540 bis 1934 kodiert.
2 zeigt die Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 2) des vollständig langen humanen GDNFR-Proteins.
3 zeigt eine Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NR: 3), die für GDNFR der Ratte kodiert. Die Aminosäuresequenz des vollständig langen GDNFR-Proteins wird durch die Nukleinsäuren 302 bis 1705 kodiert.
4 zeigt die Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 4) des vollständig langen GDNFR-Proteins der Ratte.
5 zeigt das Alignment und den Vergleich von Teilen der GDNFR cDNA-Sequenzen, die in verschiedenen Klonen produziert wurden, ebenso wie die Consensus-Sequenz für humanes GDNFR.
6 zeigt die Identifikation der von Neuro-2A abgeleiteten Zelllinien, die GDNFR exprimieren.
7A und 7B zeigen die Ergebnisse der Äquilibriumbindung von [¹²⁵I]-GDNF an Zellen, die GDNFR exprimieren.
8 zeigt die Ergebnisse der chemischen Quervernetzung von [¹²⁵I]-GDNF mit GDNFR und Ret, das in Zellen exprimiert wird, die GDNFR exprimieren.
9 zeigt die Ergebnisse der Induktion der c-Ret Autophosphorylierung durch GDNF in Zellen, die GDNFR exprimieren.
10 zeigt die Ergebnisse der Induktion der c-Ret Autophosphorylierung durch GDNF und löslichen GDNFR.
11 zeigt die Ergebnisse der Blockierung der c-Ret Autophosphorylierung durch ein Ret-Fc-Fusionsprotein.
12 zeigt die Ergebnisse der Induktion der c-Ret Autophosphorylierung durch GDNF in Motoneuronen.
13 zeigt ein Modell für die GDNF-Signalgebung, die durch GDNFR und Ret vermittelt wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der von einer Gliazelllinie stammende neurotrophe Faktor (GDNF) ist ein potenter neurotropher Faktor, der ein breites Spektrum biologischer Aktivitäten auf eine Vielzahl von Zellarten sowohl des zentralen als auch des peripheren Nervensystems zeigt. Es ist ein glycosyliertes Disulfid-verbundenes Dimer, das entfernt verwandt ist (weniger als 20% Homologie) mit der Superfamilie des transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β). Die Fähigkeit von GDNF, das Überleben dopaminerger Neurone oder anderer Neuronenpopulationen zu verstärken, zeigt dessen therapeutisches Potenzial für die Behandlung der Parkinsonschen Krankheit ebenso wie für die Behandlung anderer Formen der Nervenschädigung oder Fehlfunktion.
Im Gegensatz zu den umfassenden Studien über die Verteilung und Bioaktivität von GDNF hat es über die Identifizierung eines Rezeptors oder von Rezeptoren, welche die Bindung von GDNF an eine Zelle vermitteln und dadurch die interzelluläre Signalgebung und eine Zellantwort vermitteln, keine Berichte gegeben. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung eines Rezeptors mit hoher Affinität, der zuerst auf der Oberfläche kultivierter Retinazellen von postnatalen Ratten festgestellt wurde. Diese Rezeptoren besitzen eine geschätzte GDNF-Bindungsaffinität, die vergleichbar mit der der Rezeptoren ist, die in dopaminergen Neuronen und Motoneuronen gefunden wurden; in dopaminergen Neuronen des Mittelhirns (Lin et al., 1993 s.o.; Sauer et al., 1995 s.o.; Kearns und Gash, 1995 s.o.; Beck et al., 1995 s.o.; Tomac et al., 1995a s.o.), Motoneuronen des Gesichts und Rückenmarks (Li et al, 1995 s.o.; Oppenheim et al., 1995 s.o.; Yan et al., 1995 s.o.; Zurn et al., 1994 s.o.; Henderson et al., 1994 s.o.). Das Rezeptormolekül wurde GDNF-Rezeptor (GDNFR) genannt, das es die erste bekannte Komponente eines Rezeptorsystems für GDNF ist. Die vorliegende Erfindung stellt außerdem die erste Beschreibung der Expressionsklonierung und Charakterisierung eines GDNFR-Proteins zur Verfügung. Zellen, die so verändert wurden, dass sie den rekombinanten Rezeptor exprimieren, binden GDNF mit hoher Affinität.
Unter Verwendung eines Dopaminaufnahmeassays und der [¹²⁵I]-GDNF-Bindung auf kultivierten Zellen wurden hochaffine Rezeptoren für GDNF auf der Oberfläche von Fotorezeptorzellen der Ratte nachgewiesen. Wie weiterhin in den Beispielen beschrieben, führte die Untersuchung der Fotorezeptorzellen zur Isolierung eines cDNA-Klons durch Expressionsklonierung eines GDNF-Rezeptors. Die Nukleinsäuresequenz für GDNFR kodiert für ein Protein von 468 Aminosäuren mit 31 Cysteinresten und drei möglichen N-Glycosylierungsstellen. Als nächstes wurde eine Nukleinsäuresequenz aus dem cDNA-Klon der Ratte verwendet, um sein humanes Homolog zu isolieren, das auf der Aminosäureebene fast identisch mit dem Rattenrezeptor war. Die humane GDNFR cDNA-Sequenz kodiert für ein Protein von 465 Aminosäuren, wobei die Positionen sämtlicher Cysteinreste und möglicher N-Glycosylierungsstellen im Vergleich zu dem Rattenrezeptor konserviert sind. Dieser hohe Grad an Konservierung der Primärsequenz deutet auf eine wichtige Rolle für diesen Rezeptor bei der biologischen Funktion von GDNF hin.
Wie oben erwähnt, weisen viele Rezeptoren drei Hauptdomänen auf: eine extrazelluläre oder Zelloberflächen-Domäne, die verantwortlich für die spezifische Bindung eines Proteinfaktors ist; eine Transmembrandomäne, die sich durch die Zellmembran erstreckt, und eine intrazelluläre oder cytoplasmatische Domäne, die typischerweise an der Auslösung der Signaltransduktion beteiligt ist, wenn ein Proteinfaktor an die extrazelluläre Domäne bindet. Es wurde jedoch festgestellt, dass GDNFR in seinen Sequenzeigenschaften oder strukturellen Eigenschaften nicht mit irgendeinem bekannten Protein verwandt ist (wie z. B. den Consensussequenzen, die in Rezeptorkinasen oder Cytokinrezeptoren gefunden werden), ihm eine cytoplasmatische Domäne fehlt, ihm die C-terminalen geladenen Reste fehlen, die für eine Transmembrandomäne charakteristisch sind und er über eine Glycosylphosphatidylinositol(GPI)-Bindung in der Zellmembran verankert ist, wie unten ausführlicher beschrieben. Obwohl die Abwesenheit einer intrazellulären katalytischen Domäne eine direkte Rolle bei der Transmembran-Signalgebung ausschloss, legte die hohe Bindungsaffinität und die ausgeprägte evolutionäre Sequenzkonservierung weiterhin nahe, dass dieser Rezeptor für die GDNF-Funktion wichtig war.
Da GDNFR eine cytoplasmatische Domäne fehlte, hat man gedacht, dass dieser Rezeptor zusammen mit einem oder mehreren akzessorischen Molekülen wirken muss, die eine Rolle bei der Transmembran-Signalgebung spielen. Es wurde dann entdeckt, dass transgene Mäuse, denen das Gen für GDNF fehlt, sterben und keine Nieren haben. Es wurde festgestellt, dass transgene Mäuse, denen das Gen für das c-Ret Protoonkogen (Schuchardt et al., Nature, 367; 380–383, 1994) fehlt, einen ähnlichen Phänotyp aufweisen. Das c-Ret Protoonkogen kodiert für eine Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK), deren normale Funktion noch nicht bestimmt worden ist. Sämtliche RTKs haben eine ähnliche Topologie: sie besitzen eine extrazelluläre Liganden-bindende Domäne, eine Transmembrandomäne und einen cytoplasmatischen Teil, der die katalytische Protein-Tyrosinkinasedomäne enthält. Die Bindung eines Liganden führt zur Aktivierung der Kinasedomäne und zur Phosphorylierung spezifischer Substrate in der Zelle, welche die intrazelluläre Signalgebung vermitteln. Die vorliegende Erfindung umfasst die Entdeckung, dass eine lösliche Form des GDNFR verwendet werden kann, um die Bindung von GDNF an das c-Ret Protoonkogen zu vermitteln und dadurch eine zelluläre Antwort auf GDNF hervorzurufen, ebenso wie zur Modifizierung dessen Zelltypspezifität.
Ähnliche Spezies, genannt "Rezeptor alpha"-Komponenten, sorgen für eine Liganden-Bindungsspezifität, weisen jedoch nicht die Fähigkeit auf, das Signal allein zu transduzieren. Solche Komponenten sind in den Rezeptorsystemen des ziliaren neurotrophen Faktors (CNTF) und des Interleukin-6 (IL-6) zu finden. Ebenso wie GDNFR – und im Gegensatz zu dem IL-6-Rezeptor – bindet der CNTF-Rezeptor seinen Liganden mit hoher Affinität, hat einen hydrophoben C-Terminus, keine cytoplasmatische Domäne und ist in der Zellmembran über GPI-Linkage verankert (Davis et al., 1991). Um die Signaltransduktion zu vermitteln, bindet CNTF zunächst an den CNTF-Rezeptor, wodurch ein Komplex erzeugt wird, der fähig ist, gp 130 zu binden. Dieser inaktive Komplex bindet anschließend an den LIF-Rezeptor, um den aktiven Signalgebungskomplex zu bilden (Davis et al., Science, 260, 1805–1807, 1993). Ebenso wie bei der vorliegenden Erfindung muss der CNTF-Rezeptor (die Liganden-spezifische Bindungskomponente) vorhanden sein, damit die Signalgebung auftritt, er muss jedoch nicht membrangebunden sein (Economides et al., Science, 270, 1351–1353, 1995).
Wie weiterhin unten beschrieben, kann das GDNFR-Protein in einer Zelloberfläche verankert sein oder es kann in löslicher Form zur Verfügung gestellt werden. In jedem Fall bildet das GDNFR-Protein einen Ligandenkomplex mit GDNF, und der Ligandenkomplex bindet an einen Zelloberflächenrezeptor, um die intrazelluläre Signalgebung zu bewirken. Folglich kann eine lösliche Form des GDNFR verwendet werden, um die Wirkung von GDNF zu ermöglichen und/oder dessen Zelltypspezifität zu modifizieren.
GDNFR ist nicht mit irgendeinem bekannten Rezeptor verwandt. Es gibt keine offensichtlichen Übereinstimmungen in der Genbank und den Washington University-Merck Datenbanken für verwandte Sequenzen. Eine exprimierte sequenzmarkierte Stelle (expressed sequence tag, EST), die in der Washington University-Merck EST-Datenbank gefunden wurde, weist 75% Homologie mit einem kleinen Teil der kodierenden Region des GDNFR auf (etwa 340 Nukleotide der 521 Nukleotide langen Sequenz, die von dem 5-Ende des Klons erzeugt wurde). Dieser Klon (GenBank Zugang #H12981) wurde aus einer mit Oligo-dT geprimten humanen Bibliothek des Kleinkindgehirns isoliert und gerichtet in den Lafmid BA-Vektor (Hillier, L. et al., unveröffentlichte Daten) kloniert. Das 3'-Ende des #H12981 Klons ist sequenziert worden, zeigt jedoch keine Homologie zu irgendeinem Teil des GDNFR. Das Auftreten einer Homologie zwischen diesen #H12981-Klons und GDNFR über einen kurzen Bereich, wobei die Homologie anschließend verschwindet, legt nahe, dass der #H12981 Klon ein ungespleistes Transkript darstellt oder ein Klonierungsartefakt, eher als ein wahrhaftiges cDNA-Transkript.
Folglich ermöglicht die vorliegende Erfindung die Klonierung des GDNFR-Proteins durch Bereitstellen eines Verfahrens zum Selektieren von Zielzellen, die GDNFR exprimieren. Durch Bereitstellen von Mitteln zur Anreicherung GDNFR-kodierender Sequenzen stellt die vorliegende Erfindung weiterhin die Reinigung des GDNFR-Proteins und die direkte Klonierung der für GDNFR kodierenden DNA zur Verfügung. Die vorliegende Beschreibung der GDNFR-Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen stellt die für die Reproduktion dieser Entitäten benötigte Information ebenso wie die für eine Vielzahl von GDNFR-Analoga zur Verfügung. Mit Hilfe dieser Information können GDNFR-Proteinprodukte isoliert werden oder mit Hilfe jeglicher den Fachleuten auf dem Gebiet bekannten Mittel erzeugt werden. Eine Vielzahl von Mitteln zur rekombinanten oder synthetischen Herstellung des GDNFR-Proteins sind offenbart.
Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff "GDNFR-Proteinprodukt" biologisch aktive gereinigte natürliche, synthetische oder rekombinante GDNFR, GDNFR-Analoga (d. h. GDNFR-Homologe und Varianten, die Insertions-, Substitutions- und Deletionsvariationen umfassen) und chemisch modifizierte Derivate davon. GDNFR-Analoga sind im Wesentlichen homolog zu den GDNFR-Aminosäuresequenzen, die in den 2 und 4 (SEQ ID NR: 2 und 4) dargestellt sind.
Der Begriff "biologisch aktiv", wie hierin verwendet, bedeutet, dass das GDNFR-Proteinprodukt eine hohe Affinitätsbindung zu GDNF aufweist und die GDNF-induzierte Signaltransduktion vermittelt oder verstärkt. Unter Verwendung der vorliegenden Offenbarung liegt es ohne weiteres im Rahmen der Fähigkeiten der durchschnittlichen Fachleute auf dem Gebiet zu bestimmen, ob ein GDNFR-Polypeptid analoges Protein im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die GDNFR-Proteinprodukte aufweisen, die in den 2 und 4 dargestellt sind.
Der Begriff "im Wesentlichen homologe" Aminosäuresequenz, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Aminosäuresequenz, die einen hohen Grad an "Ähnlichkeit" oder Homologie mit den in den 2 und 4 dargestellten GDNFR-Aminosäuresequenzen aufweist, so dass die homologe Sequenz eine biologische Aktivität oder Funktion ähnlich der für diese GDNFR-Aminosäuresequenzen beschriebenen hat. Es wird den Fachleuten auf dem Gebiet bewusst sein, dass eine relativ große Anzahl individueller oder gruppierter Aminosäurereste geändert, positionell ausgetauscht (z. B. in umgekehrter Reihenfolge angeordnet oder neu angeordnet) oder vollständig in einer Aminosäuresequenz deletiert werden können, ohne die dreidimensionale Konfiguration oder Aktivität des Moleküls zu beeinträchtigen. Solche Modifikationen liegen im Rahmen der Fähigkeiten des Fachmanns auf dem Gebiet, welcher der vorliegenden Offenbarung folgt. Die Identifikation und die Mittel zur Bereitstellung derartiger modifizierter Sequenzen werden unten detaillierter beschrieben. Es wird bevorzugt, dass der Grad an Homologie eines im Wesentlichen homologen Proteins (Peptids) gleich oder höher als 70% ist (d. h. im Bereich von 70% bis 100% Homologie liegt). Folglich kann eine bevorzugte "im Wesentlichen homologe" GDNFR-Aminosäuresequenz einen Homologiegrad aufweisen, der höher als oder gleich 70% der Aminosäuresequenz ist, die in den SEQ ID NRn: 2 und 4 dargelegt sind. Bevorzugter kann der Homologiegrad gleich oder höher als 85% sein. Noch bevorzugter ist er gleich oder größer als 90% oder am bevorzugtesten ist er gleich oder größer als 95%.
Die prozentuale Homologie wie hierin beschrieben wird berechnet als der prozentuale Anteil von Aminosäureresten, die in einer Proteinsequenz gefunden werden, die mit identischen oder ähnlichen Aminosäureresten in der zweiten Proteinsequenz übereinstimmend angeordnet sind. Folglich kann im Fall der GDNFR-Homologie der Grad der Sequenzhomologie durch optimales Alignment der Aminosäurereste des Vergleichsmoleküls mit denen eines Referenz-GDNFR-Polypeptids, wie z. B. den in SEQ ID NRn: 2 und 4 dargestellten oder denen, die durch in den Figuren abgebildete Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, bestimmt werden, um die Übereinstimmungen der Reste zwischen den beiden Sequenzen zu maximieren. Es wird den Fachleuten auf dem Gebiet bewusst sein, dass ein solches Alignment geeignete konservative Substitutionen von Resten einschließen kann, und Trunkierungen und interne Deletionen oder Insertionen der Vergleichssequenz durch Einfügen von Lücken nach Bedarf unberücksichtigt lässt; siehe z. B. Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure Vol. 5, wonach ein Durchschnitt von drei oder vier Lücken in einer Länge von 100 Aminosäuren eingeführt werden kann, um das Alignment zu unterstützen (Seite 124, National Biochemical Research Foundation, Washington D.C., 1972; wobei die Offenbarung hiermit durch Verweis eingeschlossen ist). Sobald die Polypeptide so aligned sind, wird der Prozentsatz durch die Anzahl alignter Reste in dem Vergleichspolypeptid, geteilt durch die Gesamtzahl der Reste in dem Vergleichspolypeptid bestimmt. Es ist weiterhin vorgesehen, dass die GDNFR-Sequenzen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, um einen Teil eines Fusionsproteins oder eines chimären Proteins zu bilden, das zumindest teilweise GDNFR-Aktivität aufweist. Das Alignment und die Homologie eines solchen Proteins würde bestimmt werden durch Verwendung dieses Teils des Fusionsproteins oder chimären Proteins, das mit der GDNFR-Aktivität in Zusammenhang steht.
Die Quellen derartiger im Wesentlichen homologen GDNFR-Proteine schließen die GDNFR-Proteine anderer Säuger ein, von denen erwartet wird, dass sie einen hohen Grad an Homologie mit dem humanen GDNFR-Protein aufweisen. Zum Beispiel beträgt der Homologiegrad zwischen den GDNFR-Proteinen der Ratte und den humanen GDNFR-Proteinen, die hierin offenbart werden, etwa 93%. Im Wesentlichen homologe GDNFR-Proteine können aus solchen Säugern mittels Kreuzreaktivität mit Antikörpern gegen die GDNFR-Aminosäuresequenzen der SEQ ID NRn: 2 und 4 isoliert werden. Alternativ können sie mit Hilfe von Nukleinsäuresequenzen exprimiert werden, die durch Hybridisierung mit dem Gen oder Segmenten des Gens, das für den GDNFR gemäß SEQ ID NRn: 2 und 4 kodiert oder mit einer komplementären Sequenz der Nukleinsäuresequenzen, die in den Sequenz-ID-Nummern 2 und 4 dargestellt sind, hybridisiert, isoliert werden. Geeignete Hybridisierungsbedingungen werden detaillierter unten beschrieben.
Die neuartigen GDNFR-Proteinprodukte werden typischerweise isoliert und gereinigt, um GDNFR-Proteinprodukte zu erhalten, die im Wesentlichen frei von ungewollten Substan zen sind, welche die Verwendung der vorliegenden Polypeptide zu einem beabsichtigten Zweck beeinträchtigen würden. Zum Beispiel können die GDNFR-Proteinprodukte im Wesentlichen frei von anderem humanen (z. B. nicht-GDNFR) proteinösen Material oder pathologischen Agentien sein. Vorzugsweise sind die GDNFR-Proteinprodukte zu etwa 80% frei von anderen Proteinen, die aufgrund der bei der Herstellung des GDNFR-Proteinproduktes verwendeten Produktionsmethode vorhanden sein können. Bevorzugter sind die GDNFR-Proteinprodukte zu etwa 90% frei von anderen Proteinen, insbesondere bevorzugt zu etwa 95% frei von anderen Proteinen, und am meisten bevorzugt zu etwa > 98% frei von anderen Proteinen. Zusätzlich liefert die vorliegende Erfindung den einzigartigen Vorteil des Bereitstellens von Polynukleotidsequenzen zur Herstellung homogener GDNFR-Proteine.
Eine Vielzahl von GDNFR-Varianten sind vorgesehen, einschließlich Additions-, Deletions- und Substitutionsvarianten. Zum Beispiel kann eine Reihe von Deletionsvarianten durch Entfernen eines oder mehrerer Aminosäurereste von dem Amino- und/oder Carboxyterminus des GDNFR-Proteins hergestellt werden. Unter Verwendung der Regeln zur Vorhersage der Spaltung des Signalpeptids, wie von von Heijne beschrieben (von Heijne, Nucleic Acids Research, 14, 4683–4690, 1986), ist der erste Aminosäurerest des GDNFR-Proteins, der an der GDNF-Bindung beteiligt sein könnte, Ser¹⁸, wie in der vollständig langen Aminosäuresequenz des humanen GDNFR in 2 (SEQ ID NR: 2) gezeigt. Die Aminosäurereste Met¹ bis Ser¹⁸ liegen in der aminoterminalen hydrophoben Region, die wahrscheinlich ein Teil einer Signalpeptidsequenz ist und daher in der reifen Form des Rezeptorproteins nicht enthalten ist. In ähnlicher Weise ist der letzte Aminosäurerest des GDNFR-Proteins, der vermutlich für die GDNF-Bindung notwendig ist, Ser⁴⁴⁶. Die Aminosäurereste Leu⁴⁴⁷ bis Ser⁴⁶⁵ liegen in der carboxyterminalen hydrophoben Region, die an der GPI-Verankerung des Proteins in der Zelloberfläche beteiligt ist. Folglich wird vorausgesehen, dass einer oder sämtliche der Reste von Met¹ bis Ser¹⁸ und/oder Leu⁴⁴⁷ bis Ser⁴⁶⁵ (wie in 2 (SEQ ID NR: 2) dargestellt) aus dem Protein entfernt werden kann, ohne die GDNF-Bindung an das GDNFR-Protein zu beeinträchtigen, wodurch eine "Kern"-Sequenz von Ala¹⁹ bis Pro⁴⁴⁶ zurückbleiben würde. Unter Verwendung bekannter Analysemethoden wird weiterhin vorhergesagt, dass N-terminale Trunkierungen die Entfernung eines oder mehrerer Aminosäurereste bis einschließlich Gly²⁴ einschließen können. Folglich können GDNFR-Trunkierungsanaloga die Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten von einem oder beiden Termini einschließen, so dass eine Aminosäuresequenz von Asp²⁵ bis Pro⁴⁴⁶ oder Leu⁴⁴⁷ die Grundlage für ein Kernmolekül bildet. Zusätzliche GDNFR-Analoga sind vorgesehen, welche die Aminosäurereste Ser¹⁸ bis Pro⁴⁴⁹, wie in der GDNFR-Aminosäuresequenz der 4 (SEQ ID NR: 4) dargestellt enthalten, d. h. bei denen ein oder mehrere Aminosäurereste von einem oder beiden Termini deletiert sind, einschließlich der hydrophoben Regionen, die als Aminosäurereste Met¹ bis Ser¹⁸ und/oder Pro⁴⁴⁹ bis Ser⁴⁶⁸ dargestellt sind.
Darüber hinaus wird vorhergesagt, dass ein oder mehrere Aminosäurereste von einem oder beiden Amino- und Carboxytermini entfernt werden können, bis der erste und letzte Cysteinrest in der vollständig langen Sequenz erreicht wird. Es ist vorteilhaft, die Cysteinreste für die korrekte intramolekulare Bindung des GDNFR-Proteins beizubehalten. Wie in der vollständig langen Aminosäuresequenz des humanen GDNFR in 2 (SEQ ID NR: 2) dargestellt, können ein Rest oder sämtliche Aminosäurereste von Met¹ bis Asp²⁸ von dem Aminoterminus entfernt werden, ohne den ersten Cysteinrest zu entfernen, der als Cys²⁹ erscheint. In ähnlicher Weise können ein Rest oder sämtliche Aminosäurereste von Gly⁴⁴³ bis Ser⁴⁶⁵ von dem Carboxyterminus entfernt werden, ohne den letzten Cysteinrest zu entfernen, der als Cys⁴⁴² erscheint. Weitere GDNFR-Analoga können unter Verwendung der Aminosäurereste Cys²⁹ bis Cys⁴⁴³ wie in der GDNFR-Aminosäuresequenz der 4 (SEQ ID NR: 4) dargestellt, hergestellt werden, d. h. durch Deletieren sämtlicher oder eines Teils der terminalen Regionen, die als Aminosäurereste Met¹ bis Asp²⁸ und/oder Ser⁴⁴⁴ bis Ser⁴⁶⁸ dargestellt sind.
Es wird den Fachleuten auf dem Gebiet bewusst sein, dass aus den gleichen Gründen vorgesehen ist, dass diese identifizierten Aminosäurereste anstelle einer Deletion ersetzt werden können, ohne die Funktion des GDNFR-Proteins zu beeinträchtigen. Alternativ können diese identifizierten Aminosäurereste durch Intra-Restinsertionen oder terminale Additionen modifiziert werden, ohne die Funktion des GDNFR-Proteins zu beeinträchtigen. In noch einer weiteren Ausführungsform kann eine Kombination ein oder mehrerer Deletionen, Substitutionen oder Additionen durchgeführt werden.
Die vorliegenden GDNFR-Proteine oder Nukleinsäuren können für Behandlungsverfahren oder für Herstellungsverfahren von Medikamenten zur Behandlung verwendet werden. Eine solche Behandlung umfasst Krankheitszustände, die durch eine überschüssige Produktion des GDNFR-Proteins gekennzeichnet sind, wobei die vorliegenden GDNFRs, insbesondere in löslicher Form, verwendet werden können, um überschüssiges GDNF- Protein zu komplexieren und dadurch zu inaktivieren. Diese Behandlung kann durch Herstellen eines löslichen Rezeptors (z. B. die Verwendung der GDNF-Bindungsdomäne) oder durch Herstellen einer Zellpopulation, die einen solchen GDNFR enthält und durch Transplantieren derartiger Zellen in das Individuum mit einem entsprechenden Bedarf erreicht werden. Die vorliegenden GDNFR-Proteinprodukte können außerdem zur Behandlung von Personen verwendet werden, die defekte GDNF-Rezeptoren aufweisen. Zum Beispiel kann man ein Individuum, das defekte GDNFRs aufweist, durch Herstellen und Verabreichen eines löslichen Rezeptors oder durch Herstellen einer Zellpopulation, die einen derartigen nicht-defekten GDNFR enthält und durch Transplantieren dieser Zellen in das Individuum behandeln. Oder ein Individuum kann eine unzureichende Anzahl von GDNF-Rezeptoren aufweisen, und Zellen, die derartige Rezeptoren enthalten, können transplantiert werden, um die Anzahl der GDNF-Rezeptoren, die einem Individuum zur Verfügung stehen, zu erhöhen. Solche Zusammensetzungen können zusammen mit der Verabreichung von GDNF verwendet werden. Es ist außerdem vorgesehen, dass GDNFR-Proteinprodukte bei der Behandlung von Krankheitszuständen, die auf die Aktivierung der c-Ret Rezeptor-Tyrisinkinase ansprechen, verwendet werden können.
In noch einem weiteren Aspekt gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein weiterer Vorteil der neuartigen Zusammensetzungen die Verwendung von GDNFR zur Stabilisierung pharmazeutischer Zusammensetzungen mit GDNF-Protein. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann ein GDNFR verwendet werden, um Verbindungen auf ihre antagonistische Aktivität zu untersuchen.
Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden für die Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich sein. Zum Beispiel schließen zusätzlichen Verwendungen neue Assaysysteme, transgene Tiere und die Antikörperproduktion ein.
Studienmodelle
Die vorliegende Erfindung stellt ein Assaysystem zur Verfügung, in dem die GDNF-Aktivität oder Aktivitäten ähnlich zur GDNF-Aktivität, die aus der Exposition gegenüber einem Peptid oder einer Nichtpeptidverbindung resultieren, durch Messen einer hervorgerufenen physiologischen Antwort in einer Zelle oder Zelllinie, welche die GDNFR-Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert, nachgewiesen werden. Eine physiologische Antwort kann jegliche der biologischen Wirkungen von GDNF umfassen, einschließlich der Dopaminaufnahme, der Verlängerung von Neuriten, dem erhöhten Zellüberleben oder Zellwachstum, ebenso wie der transkriptionellen Aktivierung von bestimmten Nukleinsäuresequenzen (z. B. Promotor/Enhancerelemente, ebenso wie strukturelle Gene), der mit GDNF in Zusammenhang stehenden Prozessierung, Translation oder Phosphorylierung und der Induktion von sekundären Prozessen in Antwort auf die direkt oder indirekt durch GDNF induzierten Prozesse, um einige zu nennen, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.
Zum Beispiel kann ein Modellsystem geschaffen werden, das verwendet werden kann, um die Wirkungen einer überschüssigen GDNF-Aktivität zu untersuchen. In einem solchen System kann die Antwort einer Zelle auf GDNF durch Manipulieren einer erhöhten Anzahl von GDNFRs auf der Zelle des Modellsystems im Vergleich zu Zellen, die nicht in dieser Weise modifiziert wurden, erhöht werden. Es kann außerdem ein System entwickelt werden, um auf selektive Weise eine erhöhte Anzahl von GDNFRs auf Zellen, die normalerweise GDNFRs exprimieren, bereitzustellen. Um die Expression von GDNFR sicherzustellen, kann das GDNFR-Gen unter die Kontrolle einer geeigneten Promotorsequenz gesetzt werden. Es kann wünschenswert sein, das GDNFR-Gen unter die Kontrolle eines konstitutiven und/oder gewebsspezifischen Promotors zu setzen (einschließlich des Promotors der ZNS Neuron-spezifischen Enolase, des Neurofilaments und der Tyrosinhydroxylase, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein), eines induzierbaren Promotors (wie z. B. des Metallothionein-Promotors), des UV-aktivierten Promotors in der langen terminalen Wiederholung des humanen Immundefizienzvirus (Valeri et al., 1988, Nature 333: 78–81) oder des CMV-Promotors (wie in pCMX enthalten, s.u.) oder eines entwicklungsgesteuerten Promotors.
Durch Erhöhen der Anzahl zellulärer GDNFRs kann die Antwort auf endogenes GDNF verstärkt werden. Wenn das Modellsystem wenig oder kein GDNF enthält, kann GDNF zu dem System dazugegeben werden. Es kann außerdem wünschenswert sein, zusätzliches GDNF zu den Modellsystemen dazu zu geben, um die Wirkungen einer übermäßigen GDNF-Aktivität zu untersuchen. Die Überexpression von GDNF (oder von sezerniertem GDNF) kann ein Verfahren sein zur Untersuchung der Wirkungen erhöhter Mengen an GDNF auf Zellen, die bereits GDNFR exprimieren.
GDNFR-Therapien
Gemäß einem weiteren Aspekt können bestimmte Krankheitszustände von einer Verstärkung der GDNF-Ansprechempfindlichkeit profitieren. Es kann daher vorteilhaft sein, die Anzahl oder Bindungsaffinität der GDNFRs in Patienten zu erhöhen, die an Krankheitszuständen leiden, die auf eine GDNF-Therapie ansprechen. Dieses könnte mit Hilfe der Gentherapie erreicht werden, wodurch die selektive Expression von rekombinantem GDNFR in geeigneten Zellen erreicht wird, z. B. durch Verwendung von GDNFR-Genen, die unter der Kontrolle gewebsspezifischer oder induzierbarer Promotoren stehen, oder durch Hervorrufen einer lokalisierten Infektion mit Replikations-defizienten Viren, die ein rekombinantes GDNFR-Gen tragen.
Es wird vorhergesehen, dass Krankheitszustände, die von GDNFR oder der kombinierten GDNF/GDNFR-Verabreichung profitieren, Funktionsstörungen der Motoneurone, einschließlich der amyotrophen Lateralsklerose, neurologische Funktionsstörungen, die mit Diabetes, Parkinsonscher Krankheit, Alzheimerscher Krankheit und Chorea Huntington assoziiert sind, umfassen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind. Zusätzliche Indikationen für die Verwendung von GDNFR oder der kombinierten GDNF/GDNFR-Verabreichung werden oben beschrieben und umfassen weiterhin die Behandlung von: Glaukom oder anderen Erkrankungen und Krankheitszuständen, welche die Zelldegeneration des retinalen Ganglions umfassen; sensorische Neuropathie, die durch Verletzung, Beschädigung oder Degeneration sensorischer Neurone verursacht wird; pathologische Krankheitszustände, wie z. B. die vererbte retinale Degeneration und Alters-, Krankheits- oder Verletzungs-bedingte Retinopathien, in denen eine Photorezeptordegeneration auftritt und die für den Sehverlust verantwortlich ist; und die Verletzung oder Degeneration der sensorischen Zellen des Innenohrs, wie z. B. Haarzellen und auditorische Neurone zur Verhinderung und/oder Behandlung eines Hörverlustes aufgrund einer Vielzahl von Ursachen.
Transgene Tiere
In einem noch weiteren Aspekt kann ein rekombinantes GDNFR-Gen verwendet werden, um das endogene Gen zu inaktivieren oder "auszuknocken" (z. B. durch homologe Rekombination) und dadurch eine GDNFR-defiziente Zelle, Gewebe oder Tier zu erzeugen. Zum Beispiel kann ein rekombinantes GDNFR-Gen manipuliert werden, so dass es eine Insertionsmutation enthält, die GDNFR inaktiviert. Ein derartiges Konstrukt unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors kann mit Hilfe jeder herkömmlichen Methode, einschließlich der Transfektion, Transduktion, Injektion usw. in eine Zelle eingeführt werden, wie z. B. eine embryonale Stammzelle. Zellen, die das Konstrukt enthalten, können anschließend selektiert werden, z. B. mit Hilfe der G418-Resistenz. Zellen, denen ein intaktes GDNFR-Gen fehlt, werden anschließend identifiziert (z. B. durch Southern Blotting oder Northern Blotting oder einen Expressionsassay). Zellen, denen ein intaktes GDNFR-Gen fehlt, können anschließend mit frühen Embryozellen fusioniert werden, um transgene Tiere zu erzeugen, denen der GDNFR fehlt. Ein Vergleich eines derartigen Tieres mit einem Tier, das kein endogenes GDNF exprimiert, würde offenbaren, dass die beiden Phänotypen entweder vollständig übereinstimmen oder dass sie es nicht tun, was die Gegenwart zusätzlicher GDNF-ähnlicher Faktoren oder Rezeptoren impliziert. Solch ein Tier kann verwendet werden, um spezifische neuronale Populationen oder andere in vivo-Prozesse zu definieren, die normalerweise von GDNF abhängig sind. Folglich kann man von diesen Populationen oder Prozessen erwarten, dass sie beeinträchtigt werden, wenn das Tier kein GDNFR exprimiert und folglich nicht auf GDNF antworten könnte.
Diagnostische Anwendungen
Gemäß der vorliegenden Erfindung können GDNFR-Sonden verwendet werden, um Zellen und Gewebe zu identifizieren, die in normalem Zustand oder krankhaftem Zustand auf GDNF ansprechen. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Identifizierung von Zellen zur Verfügung, die ansprechempfindlich gegenüber GDNF sind, durch Detektieren der GDNFR-Expression in solchen Zellen. Die GDNFR-Expression kann von der Transkription der GDNFR mRNA oder von der Produktion des GDNFR-Proteins zeugen. Die GDNFR-Expression kann unter Verwendung von Sonden nachgewiesen werden, welche die GDNFR-Nukleinsäure oder das -Protein nachweisen, oder durch Nachweisen von „Markierungs(Tag)"-Sequenzen, die künstlich an das GDNFR-Protein angefügt werden.
Eine Art von Sonde, die zum Nachweis der GDNFR-Expression verwendet werden kann, ist eine Nukleinsäuresonde, die verwendet werden kann, um die für GDNFR kodierende RNA mit Hilfe jeglicher auf dem Gebiet bekannter Verfahren nachzuweisen, einschließlich der in situ-Hybridisierung, der Northern Blot-Analyse oder PCR-verwandter Methoden, sind jedoch nicht auf diese limitiert. Nukleinsäureprodukte gemäß der Erfindung können mit detektierbaren Markern (wie z. B. radioaktiven Markierungen und nicht- isotopischen Markierungen wie z. B. Biotin) markiert werden und in Hybridisierungsverfahren verwendet werden, um die Position des humanen GDNFR-Gens und/oder die Position irgendeiner verwandten Genfamilie in einer Chromosomenkarte zu lokalisieren. Sie können außerdem zum Identifizieren humaner GDNFR-Generkrankungen auf der DNA-Ebene verwendet werden, und sie können als Genmarker zur Identifizierung benachbarter Gene und deren Erkrankungen verwendet werden. Ebenfalls hierin vorgesehen sind Kits, die solche markierten Materialien enthalten.
Polypeptidprodukte gemäß der Erfindung können durch Verbindung mit einer nachweisbaren Markersubstanz oder mit einer Markierung (z. B. einem radioaktiven Isotop, einer fluoreszenten oder chemilumineszenten Chemikalie, einem Enzym oder einer anderen dem Fachmann auf dem Gebiet zur Verfügung stehenden Markierung) "markiert werden", um Reagenzien zur Verfügung zu stellen, die für den Nachweis und die Quantifizierung von GDNF in soliden Gewebeproben und in Flüssigkeitsproben, wie z. B. Blut oder Urin, nützlich sind. Solche Produkte können außerdem bei dem Nachweis von Zellen und Geweben, die in normalen Zuständen oder Krankheitszuständen auf GDNF ansprechen, verwendet werden.
Ein weiteres mögliches Assay zum Nachweis des Vorhandenseins von GDNF in einer Testprobe oder zum Screening auf das Vorhandensein eines GDNF-ähnlichen Moleküls beinhaltet das Inkontaktbringen der Testprobe mit einem GDNFR-Peptid, das auf einer festen Phase immobilisiert wurde, wodurch GDNFR-gebundenes GDNF produziert wird. Das GDNFR-gebundene GDNF kann optional mit einem Nachweisreagenz in Kontakt gebracht werden, wie z. B. einem markierten Antikörper, der für GDNF spezifisch ist, wodurch ein nachweisbares Produkt gebildet wird. Solche Assays können in Form von Assayvorrichtungen zur Analyse einer Testprobe entwickelt werden. In einer Grundform schließen solche Vorrichtungen eine feste Phase ein, die GDNFR enthält oder mit GDNFR beschichtet ist. Ein Verfahren zur Analyse einer Testprobe auf das Vorhandensein von GDNF kann das Inkontaktbringen der Probe mit einem Assayreagenz beinhalten, welches das GDNFR-Protein umfasst, wobei das genannte GDNFR-Protein mit dem in der Testprobe vorhandenen GDNF reagiert und ein nachweisbares Reaktionsprodukt produziert, was auf das Vorhandensein von GDNF hindeutet.
Die hierin bereitgestellten Assayreagenzien können außerdem als Teil eines Kits oder als Produktionsartikel eingeschlossen sein. Vorgesehen ist ein Produktionssartikel, der ein Verpackungsmaterial und ein oder zwei Präparationen der vorliegend zur Verfügung gestellten Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen umfasst. Solch ein Verpackungsmaterial wird ein Etikett umfassen, das angibt, dass die Präparation nützlich zum Nachweis von GDNF, GDNFR oder GDNFR-Defekten in einer biologischen Probe ist. Als solches kann der Kit optional Materialien zur Ausführung einer solchen Untersuchung enthalten, wie z. B. Reagenzien, die nützlich zur Durchführung der Proteinanalyse, DNA- oder RNA-Hybridisierungsanalyse oder PCR-Analyse von Blut, Urin oder Gewebeproben sind.
Anti-GDNFR Antikörper
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das GDNFR-Protein oder Fragmente oder Derivate davon als Immunogen zur Erzeugung von anti-GDNFR Antikörpern verwendet werden. Um weiterhin die Wahrscheinlichkeit des Hervorrufens einer anti-GDNFR-Immunantwort zu erhöhen, kann die Aminosäuresequenz von GDNFR analysiert werden, um Teile des Moleküls zu identifizieren, die mit einer erhöhten Immunogenität in Verbindung gebracht werden können. Zum Beispiel kann die Aminosäuresequenz einer Computeranalyse unterzogen werden, um Oberflächenepitope zu identifizieren, die computergenerierte Plots der Hydrophilie, Oberflächenwahrscheinlichkeit, Flexibilität, des antigenen Index, der amphiphilen Helix, des amphiphiles Faltblatts und der Sekundärstruktur von GDNFR zeigen. Alternativ könnten die Aminosäuresequenzen von GDNFR von verschiedener Spezies verglichen werden und relativ nicht-homologe Regionen identifiziert werden; diese nicht-homologen Regionen wären mit einer größeren Wahrscheinlichkeit in verschiedenen Spezies immunogen.
Ebenfalls umfasst sind Polypeptidfragmente, die nur einen Teil der kontinuierlichen Aminosäuresequenz oder sekundären Konformationen innerhalb von GDNFR duplizieren, wobei diese Fragmente eine Aktivität des Säuger-GDNFR besitzen können (z. B. immunologische Aktivität) und nicht andere (z. B. GDNF-Proteinbindungsaktivität). Folglich kann die Herstellung von Antikörpern die Herstellung von anti-Peptid Antikörpern einschließen. Die folgenden beispielhaften Peptide wurden unter Verwendung von GDNFR-Sequenzen synthetisiert:
TABELLE 1 GDNFR-Peptide
Die Peptide SJP-6, 7 und 8 sind im GDNFR der Ratte und im humanen GDNFR identisch. Die Peptide SJP-9 und 10 sind von der Rattensequenz abgeleitet und unterscheiden sich jeweils in einer Aminosäure von der menschlichen Sequenz. Sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper können durch auf dem Gebiet bekannte Verfahren unter Verwendung dieser Peptide oder anderer Teile des GDNFR hergestellt werden.
Monoklonale Antikörper, die gegen GDNFR gerichtet sind, können mit Hilfe jeder bekannten Methode hergestellt werden, die die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur bereitstellt. Zum Beispiel kann die Hybridomtechnik, die ursprünglich von Kohler und Milstein zur Herstellung monoklonaler Antikörper entwickelt wurde (Nature, 256: 495–497, 1975), ebenso wie die Trioma-Methode, die humane B-Zell-Hybridomtechnik (Kozbor et al., Immunology Today 4: 72, 1983), die EBV-Hybridomtechnik (Cole et al., in "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc. Seiten 77–96, 1985) und dergleichen verwendet werden.
Humane monoklonale Antikörper oder chimäre human-Maus (oder andere Spezies) monoklonale Antikörper können ebenfalls zur therapeutischen Verwendung hergestellt werden und können durch jegliche der vielen auf dem Gebiet bekannten Methoden hergestellt werden (z. B. Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 7308–7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 72–79, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3–16, 1982). Es können chimäre Antikörpermoleküle hergestellt werden, die eine Maus-Antigen-bindende Domäne mit humanen konstanten Regionen enthält (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851, 1984; Takeda et al., Nature, 314: 452, 1985).
Verschiedene Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, können außerdem zur Herstellung polyklonaler Antikörper verwendet werden. Zur Herstellung eines Antikörpers können verschiedene Wirtstiere, einschließlich Kaninchen, Mäusen, Ratten usw., ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, durch Injektion mit GDNFR-Protein oder einem Fragment oder Derivat davon immunisiert werden. Verschiedene Adjuvantien können verwendet werden, um die immunologische Antwort zu verstärken, abhängig von der ausgewählten Wirtsspezies. Nützliche Adjuvantien schließen das Freund'sche Adjuvans (komplett oder inkomplett), Mineralgele wie z. B. Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie z. B. Lysolecithin, pluronic Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Keyhole Limpet Hämocyanine, Dinitrophenol und humane Adjuvantien wie z. B. BCG (Bacille Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Ein molekularer Klon eines Antikörpers gegen ein GDNFR-Epitop kann außerdem durch bekannte Verfahren hergestellt werden. Die rekombinante DNA-Methodik (siehe z. B. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982) kann verwendet werden, um Nukleinsäuresequenzen zu konstruieren, die für ein monoklonales Antikörpermolekül oder eine Antigen-bindende Region davon kodieren.
Antikörpermoleküle können mit Hilfe bekannter Verfahren gereinigt werden, z. B. durch Immunabsorption oder Immunaffinitätschromatographie, chromatografische Verfahren, wie z. B. die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie oder einer Kombination daraus usw.. Die vorliegende Erfindung stellt Antikörpermoleküle ebenso wie Fragmente solcher Antikörpermoleküle zur Verfügung. Antikörperfragmente, die den Idiotyp des Moleküls enthalten, können mit Hilfe bekannter Verfahren erzeugt werden. Zum Beispiel umfassen solche Fragmente, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein: das F(ab')2-Fragment, das durch Pepsinverdau des Antikörpermoleküls hergestellt werden kann; die Fab'-Fragmente, die durch Reduzieren der Disulfidbrücken des F(ab')2-Fragmentes erzeugt werden können, und die Fab-Fragmente, die durch Behandeln des Antikörpermoleküls mit Papain und einem reduzierenden Agens erzeugt werden können.
Solche selektiv bindenden Moleküle können selbst Alternativen zu dem GDNFR-Protein darstellen und können als pharmazeutische Zusammensetzung formuliert werden.
Rekombinante Expression des GDNFR-Proteins
Die vorliegende Erfindung stellt verschiedene Polynukleotide zur Verfügung, die für GDNFR-Proteine kodieren. Das Expressionsprodukt oder ein Derivat davon ist gekennzeichnet durch die Fähigkeit, spezifisch und mit hoher Affinität an GDNF zu binden, so dass weitere Interaktionen mit Signalgebungsmolekülen stattfinden können, wodurch die GDNF-Aktivität, wie z. B. die Erhöhung der Dopaminaufnahme durch dopaminerge Zellen, zur Verfügung gestellt oder verstärkt wird. Die Polynukleotide können außerdem in der Zelltherapie oder in Gentherapieanwendungen verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein neues GDNFR-Protein und DNA-Sequenzen, die für alle oder einen Teil derartiger Rezeptoren kodieren, zur Verfügung gestellt. Neue Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung schließen Sequenzen ein, die zur Sicherstellung der Expression von Polypeptidprodukten, die wenigstens einen Teil der primären strukturellen Konformation und eine oder mehrere der biologischen Eigenschaften des rekombinanten GDNFR aufweisen, in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen nützlich sind. Die Nukleinsäuren können gereinigt und isoliert werden, so dass die gewünschte kodierende Region zur Herstellung der vorliegenden Polypeptide geeignet ist. Alternativ kann die Nukleinsäuresequenz zu diagnostischen Zwecken verwendet werden, wie unten weiter beschrieben wird. Beispielhafte DNA-Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung schließen Nukleinsäuresequenzen ein, die für die GDNFR-Aminosäuresequenzen wie oben dargelegt kodieren, z. B. wie in der 2 und in SEQ ID NR: 2 dargestellt. Darüber hinaus umfassen DNA-Sequenzen, die in der vorliegenden Erfindung dargestellt werden, spezifisch: (a) eine der in den 1 und 3 dargestellten DNA-Sequenzen (und komplementäre Stränge); (b) eine Sequenz, die (unter Hybridisierungsbedingungen, die in dem Abschnitt über das Screening der cDNA-Bibliothek unten beschrieben werden, oder unter gleichartigen Bedingungen oder stringenteren Bedingungen) mit der DNA-Sequenz gemäß Teil (a) oder Fragmenten davon hybridisiert; und (c) eine DNA-Sequenz, die nur aufgrund der Degeneration des genetischen Codes mit der DNA-Sequenz gemäß Teil (a) hybridisieren würde. Spezifisch umfasst von den Teilen (b) und (c) sind genomische DNA-Sequenzen, die für allele variante Formen des humanen GDNFR und/oder für GDNFR aus anderen Säugerspezies kodieren, sowie hergestellte DNA-Sequenzen, die für GDNFR, Fragmente von GDNFR und Analoga von GDNFR kodieren, wobei die DNA-Sequenzen Codons enthalten können, welche die Transkription und Translation der Messenger-RNA in mikrobiellen Wirten er leichtern. Solche hergestellten Sequenzen können leicht in Übereinstimmung mit den Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, ebenso wie mit den hierin beschriebenen Verfahren konstruiert werden.
Rekombinante Expressionsmethoden, die in Übereinstimmung mit den hierin dargelegten Beschreibungen oder anderen bekannten Verfahren durchgeführt werden, können verwendet werden, um diese Polynukleotide herzustellen und die verschiedenen GDNFR-Proteine zu exprimieren. Zum Beispiel kann ein Fachmann auf dem Gebiet durch Insertieren einer Nukleinsäuresequenzen, die für ein GDNFR-Protein kodiert, in einen geeigneten Vektor große Mengen der gewünschten Nukleinsäuresequenz einfach herstellen. Die Sequenzen können anschließend verwendet werden, um Nachweissonden oder Amplifikationsprimer zu erzeugen. Alternativ kann ein Polynukleotid, das für ein GDNFR-Protein kodiert, in einen Expressionsvektor insertiert werden. Durch Einführen des Expressionsvektors in einen geeigneten Wirt kann das gewünschte GDNFR-Protein in großen Mengen hergestellt werden.
Wie weiterhin hierin beschrieben, sind eine Vielzahl von Wirt/Vektorsystemen zur Vermehrung von Nukleinsäuresequenzen und/oder zur Herstellung von GDNFR-Proteinen erhältlich. Diese schließen Plasmidvektoren, virale Vektoren und Insertionsvektoren sowie prokaryontische und eukaryontische Wirte ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann ein Wirt/Vektorsystem, das im Stande ist, heterologe DNA zu propagieren oder zu exprimieren, so anpassen, dass es die Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung produziert oder exprimiert.
Mittels derartiger rekombinanter Methoden werden die GDNFR-Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung einfach in kommerziellen Mengen mit größerer Reinheit produziert. Darüber hinaus wird den Fachleuten auf dem Gebiet angesichts der vorliegenden Offenbarung bewusst sein, dass die neuen Nukleinsäuresequenzen degenerierte Nukleinsäuresequenzen einschließen, die für die GDNFR-Proteine kodieren, die spezifisch in den Figuren dargestellt sind; Sequenzen, die für Varianten von GDNFR-Proteinen kodieren; und solche Nukleinsäuresequenzen, die – vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen – mit Komplementen dieser Nukleinsäuresequenzen hybridisieren (siehe Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual); Cold Spring Harbor Laboratory, Seiten 387 bis 389, 1982). Beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingungen sind die Hybridisierung in 4 × SSC bei 62–67°C, gefolgt von einem Waschschritt in 0,1 × SSC bei 62–67°C für etwa eine Stunde. Alternativ sind beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingungen die Hybridisierung in 45–55% Formamid, 4 × SSC bei 40–45°C. DNA-Sequenzen, die unter weniger stringenten Hybridisierungsbedingungen mit den komplementären Sequenzen für das GDNFR-Protein hybridisieren und die für ein GDNFR-Protein gemäß der vorliegenden Erfindung kodieren, sind ebenfalls hierin enthalten. Beispiele für solche weniger stringenten Hybridisierungsbedingungen sind 4 × SSC bei 45–55°C oder Hybridisierung mit 30–40% Formamid bei 40–45°C.
Herstellung von Polynukleotiden, die für GDNFR kodieren
Basierend auf der Offenbarung der vorliegenden Erfindung kann eine Nukleinsäuresequenz, die für ein vollständig langes GDNFR-Polypeptid oder ein Fragment davon kodiert, auf verschiedene Arten einfach hergestellt oder erhalten werden, einschließlich der chemischen Synthese, dem Screening einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek, dem Screening einer Expressionsbibliothek und/oder der Amplifikation von cDNA, ohne auf diese beschränkt zu sein. Diese Verfahren und andere, die zur Herstellung von Nukleinsäuresequenzen nützlich sind, sind auf dem Gebiet bekannt und sind z. B. von Sambrook et al. dargelegt (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, von Ausubel et al., Hrsg. (Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press, 1994) und von Berger und Kimmel (Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, Bd. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1987). Bevorzugte Nukleinsäuresequenzen, die für GDNFR kodieren, sind Säugersequenzen.
Die chemische Synthese einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GDNFR-Protein kodiert, kann außerdem unter Verwendung von auf dem Gebiet bekannten Verfahren erreicht werden, wie z. B. denen von Engels et al. (Angew. Chem. Intl. Ed.. 28: 716–734, 1989). Diese Verfahren schließen unter anderem die Phosphotriester-, Phosphoramidit und H-Phosphonat-Verfahren der Nukleinsäuresequenz-Synthese ein. Ein bevorzugtes Verfahren für eine derartige chemische Synthese ist die Polymer-unterstützte Synthese unter Verwendung der Standard-Phosphoramiditchemie. Typischerweise wird die für das gewünschte Polypeptid kodierende DNA mehrere Hundert Basenpaare (bp) oder Nukleotide lang sein. Nukleinsäuresequenzen, die größer als etwa 100 Nukleotide sind, können unter Verwendung dieser Verfahren als einzelne Fragmente synthetisiert werden. Die Fragmente können anschließend zusammen ligiert werden, um eine Sequenz zur Expression eines vollständig langen GDNFR-Polypeptids oder eines Teils davon zu bilden.
Alternativ kann eine geeignete Nukleinsäuresequenz durch Screenen einer geeigneten cDNA-Bibliothek (d. h. einer Bibliothek, die aus einer oder mehreren Gewebequelle(n) hergestellt wurde, von der angenommen wird, dass sie das Protein exprimiert) oder einer genomischen Bibliothek (einer Bibliothek, die aus gesamtgenomischer DNA hergestellt wurde) erhalten werden. Die Quelle der cDNA-Bibliothek ist typischerweise ein Gewebe, von dem angenommen wird, dass es angemessene Mengen GDNFR exprimiert. Typischerweise ist die Quelle der genomischen Bibliothek irgendein Gewebe oder mehrere Gewebe einer Säugerspezies, von der/denen angenommen wird, dass sie ein Gen enthalten, das für GDNFR kodiert. Die Bibliothek kann unter Verwendung einer oder mehrerer Nukleinsäuresonden auf das Vorhandensein der GDNFR cDNA/des GDNFR-Gens (wie z. B. Oligonukleotide, cDNA oder genomische DNA-Fragmente, die auf den vorliegend offenbarten Sequenzen basieren), die selektiv mit der/den GDNFR cDNA(s) oder dem(n) GDNFR-Gen(en), die in der Bibliothek vorhanden sind, hybridisieren, untersucht werden. Die Sonden, die typischerweise für ein solches Bibliothekscreening verwendet werden, kodieren gewöhnlich für einen kleinen Bereich der GDNFR-Nukleinsäuresequenz aus derselben oder einer ähnlichen Spezies wie die Spezies, von der die Bibliothek hergestellt wurde. Alternativ können die Proben degeneriert sein, wie hierin erwähnt.
Das Bibliothekscreening wird typischerweise durch Annealen der Oligonukleotidsonde oder der cDNA mit den Klonen in der Bibliothek unter Stringenzbedingungen erreicht, die eine nichtspezifische Bindung verhindern, jedoch eine Bindung (Hybridisierung) solcher Klone erlauben, die einen signifikanten Homologiegrad mit der Sonde oder dem Primer aufweisen. Typische Hybridisierungs- und Wasch-Stringenzbedingungen sind zum Teil abhängig von der Größe (d. h. der Anzahl der Nukleotide) der cDNA oder Oligonukleotidsonde und ob die Probe degeneriert ist. Die Wahrscheinlichkeit zum Erhalt eines Klons/mehrerer Klone wird außerdem bei der Zusammenstellung der Hybridisierungslösung berücksichtigt (z. B., ob eine cDNA oder eine genomische Bibliothek gescreent wird; wenn es eine cDNA-Bibliothek ist, die Wahrscheinlichkeit, dass die cDNA von Interesse in einer hohen Konzentration vorhanden ist).
Werden DNA-Fragmente (wie z. B. cDNAs) als Sonden verwendet, schließen typische Hybridisierungsbedingungen die in Ausubel et al., Hrsg., s.o., ein. Nach der Hybridisierung wird der die Bibliothek enthaltende Blot mit einer geeigneten Stringenz gewaschen, die von mehreren Faktoren abhängig ist, wie z. B. der Sondengröße, der erwarteten Homologie der Sonde zu dem Klon, der Art der zu screenenden Bibliothek, der Anzahl der gescreenten Klone und dergleichen. Beispiele für stringente Waschlösungen (die gewöhnlicherweise eine geringe ionische Stärke aufweisen und mit relativ hohen Temperaturen verwendet werden) sind die Folgenden. Ein solcher stringenter Waschschritt ist 0,015 M Natriumchlorid, 0,005 M Natriumcitrat und 0,1% SDS bei 55–65°C. Ein weiterer derartiger stringenter Puffer ist 1 mM Na₂EDTA, 40 mM NaHPO₄, pH 7,2 und 1% SDS bei etwa 40–50°C. Ein weiterer stringenter Waschschritt ist 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei etwa 50–65°C.
Es gibt auch beispielhafte Protokolle für stringente Waschbedingungen, in denen Oligonukleotidsonden zum Screenen von cDNA- oder genomischen Bibliotheken verwendet werden. Zum Beispiel verwendet ein erstes Protokoll 6 × SSC mit 0,05% Natriumpyrophosphat bei einer Temperatur zwischen etwa 35 und 62°C, abhängig von der Länge der Sonde. Zum Beispiel werden 14 Basen lange Sonden bei 35–40°C, 17 Basen lange Sonden bei 45–50°C, 20 Basen lange Sonden bei 52–57°C und 23 Basen lange Sonden bei 57–63°C gewaschen. Die Temperatur kann um 2–3°C erhöht werden, wenn der Hintergrund der nichtspezifischen Bindung hoch erscheint. Ein zweites Protokoll verwendet Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) zum Waschen. Eine solche stringente Waschlösung ist 3 M TMAC, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 0,2% SDS.
Ein weiteres geeignetes Verfahren zum Erhalt einer Nukleinsäuresequenz, die für ein GDNFR-Protein kodiert, erfolgt mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR). In diesem Verfahren wird Poly(A)+RNA oder Gesamt-RNA aus einem Gewebe extrahiert, das GDNFR exprimiert. Eine cDNA wird anschließend unter Verwendung des Enzyms Reverse Transkriptase von der RNA hergestellt (d. h. durch RT-PCR). Zwei Primer, die typischerweise komplementär zu zwei verschiedenen Regionen der GDNFR cDNA sind (Oligonukleotide), werden anschließend zusammen mit einer Polymerase, wie z. B. der Taq-Polymerase, zu der cDNA gegeben, und die Polymerase amplifiziert den cDNA-Bereich zwischen den beiden Primern.
Erfordert das ausgewählte Verfahren zur Herstellung der Nukleinsäuresequenzen, die für das gewünschte GDNFR-Protein kodieren, die Verwendung von Oligonukleotidprimern oder Sonden (z. B. PCR, cDNA-Screening oder Screening einer genomischen Bibliothek), sollten die als Sonden oder Primer ausgewählten Oligonukleotidsequenzen eine adäquate Länge aufweisen und ausreichend eindeutig sein, um die Menge an nichtspezifischer Bindung, die während des Bibliothekscreening oder der PCR-Amplifikation auftritt, zu minimieren. Die eigentliche Sequenz der Sonden oder Primer basiert gewöhnlich auf konservierten oder stark homologen Sequenzen oder Regionen desselben Gens oder eines ähnlichen Gens eines anderen Organismus, wie z. B. der Nukleinsäuresequenz der Ratte, die von der vorliegenden Erfindung umfasst ist. Optional können die Sonden oder Primer vollständig oder teilweise degeneriert sein, d. h. eine Mischung von Sonden/Primern enthalten, die alle für dieselbe Aminosäuresequenz kodieren, dazu jedoch verschiedene Codons verwenden. Eine Alternative zur Herstellung degenerierter Sonden ist, ein Inosin in einigen oder sämtlichen der Codonpositionen einzufügen, die sich zwischen den Arten unterscheiden. Die Oligonukleotidsonden oder Primer können mit Hilfe chemischer Syntheseverfahren für DNA wie oben beschrieben hergestellt werden.
GDNFR-Proteine, die auf diesen für GDNFR kodierenden Nukleinsäuresequenzen basieren, die oben dargelegt sind, sind ebenfalls als von der vorliegenden Erfindung umfasst vorgesehen. Mutierte Sequenzen oder Variantensequenzen schließen solche Sequenzen ein, die ein oder mehrere Nukleotidsubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen im Vergleich zu der Wildtyp-Sequenz enthalten und die zu der Expression von Aminosäuresequenz-Variationen im Vergleich zu der Wildtyp-Aminosäuresequenz führen. In einigen Fällen können aufgrund der Existenz der natürlichen allelen Variation natürlich vorkommende GDNFR-Aminosäuremutanten oder -varianten existieren. GDNFR-Proteine, die auf solchen natürlich vorkommenden Mutanten oder Varianten beruhen, sind ebenfalls von dem Umfang der Erfindung umfasst oder durch die vorliegende Erfindung dargestellt. Die Herstellung synthetischer mutierter Sequenzen ist auf dem Gebiet wohlbekannt und ist z. B. in Wells et al. (Gene, 34: 315, 1985) und in Sambrook et al., s.o., beschrieben.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, Nukleinsäure- und/oder Aminosäure-Varianten von natürlich vorkommendem GDNFR herzustellen. Nukleinsäurevarianten (in denen ein oder mehrere Nukleotide so vorgesehen sind, dass sie sich von dem Wildtyp oder dem natürlich vorkommenden GDNFR unterscheiden) können unter Verwendung der ortsspezifischen Mutagenese oder PCR-Amplifikation, in welcher der/die Primer die gewünschten Punktmutationen aufweisen, hergestellt werden (siehe Sambrook et al., s.o. und Ausubel et al., s.o., für die Beschreibungen der Mutagenesemethoden). Die chemische Synthese unter Verwendung der von Engels et al., s.o., beschriebenen Verfahren kann ebenfalls verwendet werden, um solche Varianten herzustellen. Andere den Fachleuten auf dem Gebiet bekannte Verfahren können ebenfalls verwendet werden. Bevorzugte Nukleinsäurevarianten sind solche, die Nukleotidsubstitutionen enthalten, welche die Codonpräferenz in der Wirtszelle, die zur rekombinanten Herstellung von GDNFR verwendet werden soll, berücksichtigten. Andere bevorzugte Varianten sind solche, die für konservative Aminoaustausche (z. B. in denen die Ladung oder die Polarität der natürlich vorkommenden Aminosäureseitenkette nicht wesentlich durch die Substitution einer anderen Aminosäure verändert wird) im Vergleich zum Wildtyp kodieren und/oder solche, die entworfen wurden, um eine neue Glycosylierungs- oder Phosphorylierungs-Stelle(n) im GDNFR zu erzeugen, oder solche, die entworfen wurden, um eine existierende Glycosylierungs- oder Phosphorylierungs-Stelle(n) im GDNFR zu deletieren.
Vektoren
Die cDNA oder genomische DNA, die für das gewünschte GDNFR-Protein kodiert, wird für die weitere Klonierung (Amplifikation der DNA) oder für die Expression in einen Vektor insertiert. Geeignete Vektoren sind kommerziell erhältlich, oder der Vektor kann speziell konstruiert werden. Mögliche Vektoren schließen Cosmide, Plasmide oder modifizierte Viren ein, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, jedoch muss das Vektorsystem mit der ausgewählten Wirtszelle kompatibel sein. Solche Vektoren schließen Bakteriophagen, wie z. B. Lambda-Derivate oder Plasmide, wie z. B. pBR322, pUC oder Bluescript^®-Plasmidderivate (Stratebene, La Jolla CA) ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Die rekombinanten Moleküle können durch Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation oder andere bekannte Methoden in die Wirtszellen eingeführt werden.
Zum Beispiel wird die für GDNFR kodierende Nukleinsäuresequenz in einen Klonierungsvektor insertiert, der zum Transformieren, Transfizieren oder Infizieren geeigneter Wirtszellen verwendet wird, so dass viele Kopien der Nukleinsäuresequenz erzeugt werden. Dies kann durch Ligieren eines DNA-Fragments in einen Klonierungsvektor, der komplementäre kohäsive Enden aufweist, erreicht werden. Wenn die komplementären Restriktionsstellen, die zur Fragmentierung der DNA verwendet werden, nicht in dem Klonierungsvektor vorhanden sind, können die Enden der DNA-Moleküle enzymatisch modifiziert werden. Es kann sich außerdem als vorteilhaft herausstellen, Restriktionsendonuklease-Spaltstellen in die Oligonukleotidprimer, die in der Polymerasekettenreaktion verwendet werden, einzufügen, um die Insertion der resultierenden Nukleinsäuresequenz in Vektoren zu erleichtern. Alternativ kann jede gewünschte Stelle durch Ligieren von Nukleinsäuresequenzen (Linkern) an die DNA-Termini hergestellt werden; diese ligierten Linker können spezifische chemisch synthetisierte Oligonukleotide umfassen, die für Restriktionsendonuklease-Erkennungssequenzen kodieren. In einem alternativen Verfahren kann der geschnittene Vektor und die für GDNFR kodierende Nukleinsäuresequenz durch Ankoppeln von Homopolymerschwänzen modifiziert werden. In spezifischen Ausführungsformen ermöglicht die Transformation von Wirtszellen mit rekombinanten DNA-Molekülen, die ein isoliertes GDNFR-Gen, cDNA oder synthetisierte DNA-Sequenzen tragen, die Erzeugung vielfacher Kopien des Gens. Folglich kann die für GDNFR kodierende Nukleinsäuresequenz durch Kultivieren der Transformanten, Isolieren der rekombinanten DNA-Moleküle aus den Transformanten und – falls nötig – Zurückgewinnen des insertierten Gens aus der isolierten rekombinanten DNA, in großen Mengen erhalten werden.
Die Auswahl oder Konstruktion des geeigneten Vektors ist abhängig 1) davon, ob er für die DNA-Amplifikation oder für die DNA-Expression verwendet werden soll, 2) von der Größe der in den Vektor zu insertierenden DNA und 3) von der Wirtszelle (z. B. Säugerzellen, Insektenzellen, Hefezellen, Pilzzellen, Pflanzenzellen oder Bakterienzellen), die mit dem Vektor transformiert werden soll. Jeder Vektor enthält verschiedene Komponenten abhängig von seiner Funktion (Amplifikation von DNA oder Expression von DNA) und seiner Kompatibilität mit der beabsichtigten Wirtszelle. Für die DNA-Expression können die Vektorkomponenten ein oder mehrere der folgenden einschließen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: eine Signalsequenz, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Selektions- oder Marker-Gene, Enhancerelemente, Promotoren, eine Transkriptionsterminationssequenz und dergleichen. Diese Komponenten können aus natürlichen Quellen erhalten werden oder mit Hilfe bekannter Verfahren synthetisiert werden. Die Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen eine Nukleinsäuresequenz, die für das GDNFR-Protein von Interesse kodiert, funktionell mit ein oder mehreren Elementen zur Amplifikation, Expressionskontrolle, regulatorischen Elementen oder ähnlichen funktio nellen Elementen verbunden sein, die fähig sind, die Amplifikation oder Expression der für GDNFR kodierenden Nukleinsäuresequenz in der ausgewählten Wirtszelle zu steuern, zu kontrollieren oder auf andere Weise zu bewirken.
Expressionsvektoren, welche die GDNFR-Nukleinsäuresequenz-Inserts enthalten, können durch drei allgemeine Ansätze identifiziert werden: (a) DNA-DNA-Hybridisierung; (b) die Gegenwart oder Abwesenheit von "Marker"-Genfunktionen und (c) der Expression der insertierten Sequenzen. In dem ersten Ansatz kann das Vorhandensein einer fremden Nukleinsäuresequenz, die in einen Expressionsvektor insertiert wurde, mit Hilfe der DNA-DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden, die Sequenzen umfassen, die homolog zu einer insertierten für GDNFR kodierenden Nukleinsäuresequenz sind, nachgewiesen werden. In dem zweiten Ansatz kann das rekombinante Vektor/Wirtssystem aufgrund der Gegenwart oder Abwesenheit bestimmter "Marker"-Genfunktionen (z. B. Thymidin-Kinaseaktivität, Resistenz gegenüber Antibiotika, Transformationsphänotyp, Bildung von Okklusionskörpern in Baculovirus usw.), die durch Insertion einer fremden Nukleinsäuresequenz in den Vektor verursacht wird, identifiziert und selektiert werden. Zum Beispiel können Rekombinante, die das GDNFR-Insert enthalten, aufgrund der Abwesenheit der Marker-Genfunktion identifiziert werden, wenn eine für GDNFR kodierende Nukleinsäuresequenz in die Marker-Gensequenz des Vektors insertiert wird. In dem dritten Ansatz können rekombinante Expressionsvektoren durch Nachweis des fremden Proteinproduktes, das durch die rekombinante Nukleinsäuresequenz exprimiert wird, identifiziert werden. Solche Assays können auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des exprimierten GDNFR-Proteinproduktes, z. B. durch Bindung des GDNFR-Proteins an GDNF oder an einen Antikörper, der GDNFR direkt erkennt, basieren.
Signalsequenz
Die Signalsequenz kann eine Komponente des Vektors sein oder sie kann ein Teil der GDNFR DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die native GDNFR DNA kodiert für eine Signalsequenz an dem Aminoterminus des Proteins, die während der posttranslationalen Prozessierung des Proteins abgespalten wird, um das reife GDNFR-Protein zu bilden. Von dem Umfang dieser Erfindung umfasst sind GDNFR-Polynukleotide mit der nativen Signalsequenz ebenso wie GDNFR-Polynukleotide, in denen die native Signalsequenz deletiert ist und durch eine heterologe Signalsequenz ersetzt ist. Die ausge wählte heterologe Signalsequenz sollte eine sein, die von der Wirtszelle erkannt und prozessiert wird, d. h. durch eine Signalpeptidase gespalten wird. Für prokaryontische Wirtszellen, welche die native GDNFR-Signalsequenz nicht erkennen und prozessieren, wird die Signalsequenz durch eine prokaryontische Signalsequenz ersetzt, die z. B. ausgewählt ist aus der Gruppe der alkalischen Phosphatase, Penicillinase oder hitzestabilen Enterotoxin II-Leadern. Für die Hefesekretion kann die native GDNFR-Signalsequenz durch die Leader der Hefeinvertase, des Alphafaktors oder der sauren Phosphatase ersetzt werden. Für die Säugerzellexpression ist die native Signalsequenz ausreichend, obwohl andere Signalsequenzen des Säugers geeignet sein können.
Replikationsursprung
Expressions- und Klonierungsvektoren beinhalten im Allgemeinen eine Nukleinsäuresequenz, die dem Vektor eine Replikation in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen ermöglicht. In Klonierungsvektoren ist diese Sequenz typischerweise eine Sequenz, die dem Vektor ermöglicht, unabhängig von der chromosomalen DNA des Wirtes zu replizieren und schließt Replikationsursprünge oder autonom replizierende Sequenzen ein. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefen und Viren wohlbekannt. Der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten gramnegativen Bakterien geeignet, und verschiedene Ursprünge (z. B. SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Klonierungsvektoren in Säugerzellen nützlich. Im Allgemeinen ist eine Replikationsursprungskomponente für Säugerexpressionsvektoren nicht notwendig (z. B. wird der SV40-Origin häufig nur verwendet, weil er den frühen Promotor enthält).
Selektionsgen
Die Expressions- und Klonierungsvektoren können ein Selektionsgen enthalten. Dieses Gen kodiert für ein "Marker"-Protein, das notwendig ist für das Überleben oder das Wachstum der transformierten Wirtszellen, wenn sie in einem selektiven Kulturmedium wachsen. Wirtszellen, die nicht mit dem Vektor transformiert wurden, werden das Selektionsgen nicht enthalten und folglich werden sie in dem Kulturmedium nicht überleben. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) eine Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen verleihen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, (b) auxotrophe Defizienzen komplementieren; oder (c) wichtige Nährstoffe liefern, die in dem Kulturmedium nicht vorhanden sind.
Weitere Selektionsgene können verwendet werden, um das Gen zu amplifizieren, das exprimiert wird. Amplifikation ist das Verfahren, in dem Gene, die für die Produktion eines Proteins, das für das Wachstum kritisch ist, sehr gefragt sind, innerhalb der Chromosomen von aufeinander folgenden Generationen rekombinanter Zellen in Tandem wiederholt werden. Beispiele für geeignete selektive Marker für Säugerzellen schließen die Dihydrofolatreduktase (DHFR) und die Thymidinkinase ein. Die Säugerzelltransformanten werden unter Selektionsdruck gesetzt, an den nur die Transformanten in einzigartiger Weise mittels des in dem Vektor vorhandenen Markers zum Überleben angepasst sind. Selektionsdruck wird durch Kultivieren der transformierten Zellen unter Bedingungen, in denen die Konzentration des Selektionsmittels in dem Medium nach und nach verändert wird, was zu einer Amplifikation sowohl des Selektionsgens als auch der für GDNFR kodierenden DNA führt, ausgeübt. Als ein Resultat werden erhöhte Mengen an GDNFR von der amplifizierten DNA synthetisiert.
Zum Beispiel werden Zellen, die mit dem DHFR-Selektionsgen transformiert sind, zunächst durch Kultivieren sämtlicher Transformanten in einem Kulturmedium, das Methotrexat, einen kompetitiven Antagonisten von DHFR, enthält, identifiziert. Wenn Wildtyp-DHFR verwendet wird, ist eine geeignete Wirtszelle die Ovarzelllinie des chinesischen Hamsters, die eine Defizienz in der DHFR-Aktivität aufweist (siehe z. B. Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(7): 4216–4220, 1980). Die transformierten Zellen werden anschließend zunehmenden Konzentrationen an Methotrexat ausgesetzt. Dies führt zu der Synthese mehrfacher Kopien des DHFR-Gens und, als Begleiterscheinung, mehrfacher Kopien der anderen DNA, die in dem Expressionsvektor vorhanden ist, wie z. B. der für ein GDNFR-Protein kodierenden DNA.
Promotor
Die Expressions- und Klonierungsvektoren gemäß der vorliegenden Erfindung werden typischerweise einen Promotor enthalten, der von dem Wirtsorganismus erkannt wird und funktionell mit der für das GDNFR-Protein kodierenden Nukleinsäuresequenz verbunden ist. Promotoren sind untranslatierte Sequenzen, die stromaufwärts (5') des Startcodons eines strukturellen Gens (im Allgemeinen innerhalb von etwa 100 bis 1000 bp) lokalisiert sind, welche die Transkription und Translation einer bestimmten Nukleinsäuresequenz kontrollieren, wie z. B. der für GDNFR kodierenden. Promotoren werden her kömmlicherweise in eine von zwei Klassen eingeteilt, induzierbare Promotoren und konstitutive Promotoren. Induzierbare Promotoren induzieren in Antwort auf einige Veränderungen der Kultivierungsbedingungen, wie z. B. der Gegenwart oder Abwesenheit eines Nährstoffes oder einer Temperaturveränderung erhöhte Transkriptionslevel der DANN, die unter ihrer Kontrolle steht. Eine Vielzahl von Promotoren, die von einer Vielzahl potenzieller Wirtszellen erkannt werden, sind wohlbekannt. Diese Promotoren werden durch Isolieren des Promotors aus der Quell-DNA mit Hilfe eines Restriktionsenzymverdaus und durch Insertieren der gewünschten Promotorsequenz in den Vektor funktionell mit der für GDNFR kodierenden DNA verbunden. Die native GDNFR-Promotorsequenz kann verwendet werden, um die Amplifikation und/oder Expression der GDNFR DNA zu bewirken. Ein heterologer Promotor wird jedoch bevorzugt, wenn er eine stärkere Transkription und höhere Ausbeuten des exprimierten Proteins im Vergleich zu dem nativen Promotor erlaubt und wenn er kompatibel mit dem Wirtszellsystem ist, das für die Verwendung ausgewählt wurde.
Zur Verwendung mit prokaryontischen Wirten geeignete Promotoren schließen die beta-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme; die alkalische Phosphatase, ein Tryptophan(trp)-Promotorsystem; und Hybridpromotoren, wie z. B. den Taq-Promotor ein. Andere bekannte bakterielle Promotoren sind ebenfalls geeignet. Ihre Nukleotidsequenzen wurden publiziert, wodurch sie dem Fachmann auf dem Gebiet ermöglichen, sie unter Verwendung von Linkern oder Adaptoren nach Bedarf an die gewünschte(n) DNA-Sequenz(en) zu ligieren, um für jede benötigte Restriktionsstelle zu sorgen.
Geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten sind ebenfalls auf dem Gebiet bekannt. Hefeenhancer werden in vorteilhafter Weise mit Hefepromotoren verwendet. Geeignete Promotoren zur Verwendung mit Säugerwirtszellen sind wohlbekannt und schließen solche ein, die aus den Genomen von Viren, wie z. B. dem Polyomavirus, dem Geflügelpockenvirus, dem Adenovirus (wie z. B. dem Adenovirus 2), dem bovinen Papillomvirus, dem Sarkomvirus des Vogels, dem Cytomegalievirus, einem Retrovirus, dem Hepatitis B-Virus und am meisten bevorzugt dem Simian Virus 40 (SV40) erhalten werden. Andere geeignete Säugerpromotoren schließen heterologe Säugerpromotoren ein, z. B. Hitzeschockpromotoren und den Actinpromotor. Ein Promotor zur möglichen Verwendung bei der Herstellung von GDNFR-Proteinen in CHO Zellen ist Sra (siehe Takebe et al., Mol. Cell. Biol., 8(1): 466–472, 1988). Ein geeigneter Expressionsvektor ist pDSRa2. Die pDSRa2-Konstrukte, welche die geeignete GDNFR cDNA enthalten, kön nen im Wesentlichen in Übereinstimmung mit dem in der ebenfalls in Besitz befindlichen und parallel anhängigen US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 501,904, die am 29. März 1990 eingereicht wurde (siehe auch europäische Patentanmeldung Nr. 90305433, Publikationsnummer EP 398 753 , die am 18. Mai 1990 eingereicht wurde und WO 90/14363 (1990), deren Offenbarungen hiermit durch Verweis eingeschlossen sind), beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Zusätzliche Promotoren, die für die Kontrolle der GDNFR-Expression von Interesse sein können, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: die Region des SV40 frühen Promotors (Bernoist und Chambon, Nature, 290: 304–310, 1981); den CMV-Promotor; den Promotor, der in der 3' langen terminalen Wiederholung des Rous-Sarkomvirus enthalten ist (Yamamoto et al., Cell, 22: 787–797, 1980); den Herpes-Thymidinkinase-Promotor (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 144–1445, 1981); die regulatorischen Sequenzen des Metallothioningens (Brinster et al., Nature, 296: 39–42, 1982); die prokaryontischen Expressionsvektoren, wie z. B. den beta-Lactamasepromotor (Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 3727–3731, 1978); oder den Taq-Promotor (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21–25, 1983). Ebenfalls von Interesse sind die folgenden tierischen transkriptionellen Kontrollregionen, die eine Gewebsspezifität aufweisen und in transgenen Tieren verwendet wurden: die Kontrollregion des Elastase I-Gens, die in pankreatischen Acinuszellen aktiv ist (Swift et al., Cell, 38: 639–646, 1984; Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399–409, 1986; MacDonald, Hepatology, 7: 425–515, 1987); die Kontrollregion des Insulingens, die in pankreatischen Betazellen aktiv ist (Hanahan, Nature, 315: 115–122, 1985); die Kontrollregion des Immunglobulingens, die in lymphatischen Zellen aktiv ist (Grosschedl et al., Cell, 38: 647–658, 1984; Adames et al., Nature, 318: 533–538, 1985; Alexander et al., Mol. Cell. Biol., 7: 1436–1444, 1987) die Kontrollregion des Maus-Brusttumorvirus, die im Hoden, der Brust, lymphatischen Zellen und Mastzellen aktiv ist (Leder et al., Cell, 45: 485–495, 1986); die Kontrollregion des Albumingens, die in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., Genes and Devel., 1: 268–276, 1987); die Kontrollregion des alpha-Fetoproteingens, die in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol., 5: 1639–1648, 1985; Hammer et al., Science, 235: 53–58, 1987); die Kontrollregion des alpha 1-Antitrypsingens, die in der Leber aktiv ist (Kelsey et al., Genes and Devel., 1: 161–171, 1987); die Kontrollregion des beta-Globingens, die in Myeloidzellen aktiv ist (Mogram et al., Nature, 315: 338–340, 1985; Kollias et al., Cell, 46: 89–94, 1986); die Kontrollregion des myelinbasischen Proteingens, die in Oligodendroczyten im Gehirn aktiv ist (Read head et al., Cell, 48: 703–712, 1987); die Kontrollregion des leichte Kette-2-Gens des Myosins, die im Skelettmuskel aktiv ist (Sani, Nature, 314: 283–286, 1985) und die Kontrollregion des Gens für das Gonadotropin Releasinghormon, die in dem Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., Science, 234: 1372–1378, 1986).
Enhancerelement
Eine Enhancersequenz kann in den Vektor insertiert werden, um die Transkription einer für ein GDNFR-Protein gemäß der vorliegenden Erfindung kodierende DNA-Sequenz durch höhere Eukaryonten zu erhöhen. Enhancer sind cis-agierende Elemente der DNA, die gewöhnlicher Weise etwa 10–300 bp lang sind, die auf den Promotor wirken, um dessen Transkription zu erhöhen. Enhancer sind relativ orientierungs- und positionsunabhängig. Sie wurden 5' und 3' der Transkriptionseinheit festgestellt. Mehrere Enhancersequenzen, die aus Säugergenen erhältlich sind, sind bekannt (z. B. Globin, Elastase, Albumin, alpha-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise jedoch wird ein Enhancer von einem Virus verwendet werden. Der SV40-Enhancer, der Enhancer des Cytomegalievirus frühen Promotors, der Polyomaenhancer und der Adenovirusenhancer sind beispielhafte Enhancerelemente für die Aktivierung eukaryontischer Promotoren. Während ein Enhancer an einer Position 5' oder 3' der GDNFR DNA in den Vektor insertiert werden kann, ist er typischerweise 5' des Promotors lokalisiert.
Transkriptionstermination
In eukaryontischen Wirtszellen (Hefezellen, Pilzen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, tierischen Zellen, humanen Zellen oder einen Nukleus enthaltenden Zellen aus anderen multizellulären Organismen) verwendete Expressionsvektoren werden außerdem Sequenzen enthalten, die zur Terminierung der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA notwendig sind. Solche Sequenzen sind allgemein aus den 5' untranslatierten Regionen und gelegentlich aus den 3' untranslatierten Regionen eukaryontischer DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nukleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente in den untranslatierten Teilen der für GDNFR kodierenden mRNA transkribiert werden.
Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere der oben aufgeführten Komponenten zusammen mit der gewünschten für GDNFR kodierenden Sequenz ent halten, wird mit Hilfe von Standard-Ligationsmethoden erreicht. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zurechtgestutzt und in gewünschter Reihenfolge religiert, um die benötigten Plasmide zu erzeugen. Um zu bestätigen, dass die korrekten Sequenzen konstruiert wurden, können die Ligationsmischungen verwendet werden, um E. coli zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten können mit Hilfe bekannter Verfahren selektiert werden, wie z. B. der Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz, wie oben beschrieben. Plasmide aus den Transformanten können anschließend hergestellt werden, durch Restriktionsendonuklease-Verdau analysiert werden und/oder sequenziert werden, um das Vorhandensein des gewünschten Konstruktes zu bestätigen.
Vektoren, welche die transiente Expression einer für GDNFR kodierenden DNA in Säugerzellen ermöglichen, können ebenfalls verwendet werden. Im Allgemeinen beinhaltet die transiente Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der fähig ist, effizient in einer Wirtszelle zu replizieren, so dass die Wirtszelle viele Kopien des Expressionsvektors akkumuliert und wiederum hohe Mengen des gewünschten Proteins, das durch den Expressionsvektor kodiert wird, synthetisiert. Transiente Expressionssysteme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine geeignete Wirtszelle umfassen, erlauben den einfachen positiven Nachweis von Proteinen, die durch die klonierten DNAs kodiert werden, ebenso wie das rasche Screenen solcher Proteine nach den gewünschten biologischen oder physiologischen Eigenschaften. Folglich sind transiente Expressionssysteme besonders nützlich bei der Identifizierung von Varianten des Proteins.
Selektion und Transformation von Wirtszellen
Wirtszellen (z. B. bakterielle Zellen, Säugerzellen, Insektenzellen oder Pflanzenzellen), die mit Nukleinsäuresequenzen zur Verwendung bei der Expression eines rekombinanten GDNFR-Proteins transformiert wurden, werden ebenfalls von der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt. Die transformierte Wirtszelle wird unter geeigneten Bedingungen kultiviert, welche die Expression der Nukleinsäuresequenz erlauben. Die Selektion geeigneter Wirtszellen und Verfahren zur Transformation, Kultivierung, Amplifikation, Screening und Produktherstellung sowie -reinigung sind auf dem Gebiet wohlbekannt. Siehe z. B. Gething und Sambrook, Nature, 293: 620–625 (1981), oder alternativ Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 5(7): 1750–1759 (1985) oder Howley et al., US-Patent Nr. 4,419,446. Zusätzliche beispielhafte Materialien und Methoden werden hierin erwähnt. Die transformierte Wirtszelle wird in einem geeigneten Medium kultiviert, und das expri mierte GDNFR-Protein wird anschließend optional aus dem Kulturmedium (oder aus der Zelle, wenn es intrazellulär exprimiert wird) durch ein geeignetes den Fachleuten auf dem Gebiet bekanntes Verfahren gewonnen, isoliert und gereinigt.
Verschiedene Wirtszellen weisen charakteristische und spezifische Mechanismen für die translationelle und post-translationelle Prozessierung und Modifikation (z. B. Glycosylierung, Spaltung) der Proteine auf. Geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme können ausgewählt werden, um die gewünschte Modifizierung und Prozessierung des exprimierten fremden Proteins sicherzustellen. Zum Beispiel kann die Expression in einem Bakteriensystem verwendet werden, um ein nicht-glycosyliertes Kernproteinprodukt herzustellen. Die Expression in Hefe kann verwendet werden, um ein glycosyliertes Produkt herzustellen. Die Expression in Säugerzellen kann verwendet werden, um eine "native" Glycosylierung des heterologen GDNFR-Proteins sicherzustellen. Darüber hinaus können verschiedene Vektor/Wirts-Expressionssysteme Prozessierungsreaktionen, wie z. B. die proteolytische Spaltung, in verschiedenen Maßen bewirken.
Geeignete Wirtszellen zur Klonierung oder Expression der hierin offenbarten Vektoren sind prokaryontische Zellen, Hefezellen oder höhere Eukaryontenzellen. Eukaryontische Mikroben, wie z. B. filamentöse Pilze oder Hefe, können geeignete Wirte zur Expression der GDNFR-Proteine sein. Saccharomyces cerevisiae, oder die gewöhnliche Beckerhefe, ist die am häufigsten verwendete unter den niedrigeren eukaryontischen Wirtsmikroorganismen, jedoch sind eine Anzahl weiterer Gattungen, Arten und Stämme wohlbekannt und allgemein erhältlich.
Zur Expression glycosylierter GDNFR-Proteine zu verwendende Wirtszellen sind ebenfalls von multizellulären Organismen abgeleitet. Solche Wirtszellen weisen komplexe Prozessierungs- und Glycosylierungsaktivitäten auf. Prinzipiell kann jegliche Zellkultur höherer Eukaryonten verwendet werden, egal ob eine solche Kultur Zellen von Vertebraten oder Invertebraten umfasst, einschließlich der Pflanzen- und Insektenzellen. Die Propagierung von Vertebratenzellen in der Kultur (Gewebekultur) ist ein wohlbekanntes Verfahren. Beispiele nützlicher Säuger-Wirtszelllinien schließen die mit SV40 transformierte Nieren CV1-Linie des Affen ein, die humane embryonale Nierenlinie (293 oder für das Wachstum in der Suspensionskultur subklonierte 293 Zellen), Nierenzellen des Babyhamsters und Ovarzellen des chinesischen Hamsters, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Andere geeignete Säugerzelllinien umfassen HeLa, Maus L-929 Zellen, 3T3- Linien, die von Swiss Balb-c- oder NIH-Mäusen abgeleitet sind, BHK oder HaK-Hamsterzelllinien, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Geeignete Wirtszellen schließen außerdem prokaryontische Zellen ein. Prokaryontische Wirtszellen umfassen Bakterienzellen, wie z. B. gramnegative oder grampositive Organismen, z. B. E. coli, Bacilli wie z. B. B. subtilis, Pseudomonas species wie z. B. P. aeruginosa, Salmonella typhimurium oder Serratia marcescans, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Zum Beispiel sind verschiedene Stämme von E. coli (z. B. HB101, DH5a, DH10 und MC1061) als Wirtszellen auf dem Gebiet der Biotechnologie wohlbekannt. Verschiedene Stämme von Streptomyces spp. und dergleichen können ebenfalls verwendet werden. Vorliegend bevorzugte Wirtszellen zur Herstellung von GDNFR-Proteinen sind Bakterienzellen (z. B. Escherichia coli) und Säugerzellen (wie z. B. die Ovarzellen des chinesischen Hamsters, COS Zellen usw.).
Die Wirtszellen werden mit den oben beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren transfiziert oder vorzugsweise transformiert und in einem herkömmlichen Nährmedium kultiviert. Das Medium kann in geeigneter Weise zum Induzieren der Promotoren, zum Selektieren der Transformanten oder zum Amplifizieren der Gene, die für die gewünschten Sequenzen kodieren, modifiziert werden. Die Transfektion und Transformation werden unter Verwendung von Standardmethoden, die den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind und die in für die beteiligte Wirtszelle geeigneter Weise ausgewählt werden, durchgeführt. Zum Beispiel kann für Säugerzellen ohne Zellwände die Calciumphosphat-Präzipitationsmethode verwendet werden. Die Elektroporation, Mikroinjektion und andere bekannte Methoden können ebenfalls verwendet werden.
Kultivieren der Wirtszellen
Die zur Produktion der GDNFR-Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung transformierten Zellen werden in geeigneten Medien kultiviert. Die Medien können wie benötigt mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie z. B. Insulin, Transferrin oder epidermalem Wachstumsfaktor), Salzen (wie z. B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie z. B. Hepes), Nukleosiden (wie z. B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z. B. Gentamicin), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die gewöhnlicher Weise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorhanden sind) und Glucose oder anderen Energiequellen ergänzt werden. Andere Er gänzungsmittel können ebenfalls eingeschlossen sein, in geeigneten Konzentrationen, wie den Fachleuten auf dem Gebiet bewusst sein wird. Geeignete Kultivierungsbedingungen, wie z. B. die Temperatur, pH und dergleichen, sind den Fachleuten auf dem Gebiet für die Verwendung mit den ausgewählten Wirtszellen bekannt.
Sobald das GDNFR-Protein hergestellt wurde, kann es mit Hilfe von Standardverfahren, einschließlich der Chromatografie (z. B. Ionenaustausch-, Affinitäts- und Größentrennungs-Säulenchromatografie), der Zentrifugation, der differenziellen Löslichkeit oder durch irgendeine andere Standardmethode zur Reinigung von Proteinen isoliert und gereinigt werden. Insbesondere kann das GDNFR-Protein durch Binden an eine Affinitätssäule, die GDNF oder anti-GDNFR Antikörper gebunden an einen festen Träger umfasst, isoliert werden.
Homologe Rekombination
Es ist weiterhin vorgesehen, dass GDNFR-Proteine mit Hilfe der homologen Rekombination oder mit Hilfe rekombinanter Herstellungsverfahren, die Kontrollelemente verwenden, die in Zellen eingeführt werden, welche bereits für GDNFR kodierende DNA enthalten, hergestellt werden. Zum Beispiel können homologe Rekombinationsverfahren verwendet werden, um eine Zelle zu modifizieren, die ein normalerweise Transkriptions-inaktives GDNFR-Gen oder unterexprimiertes Gen enthält und dadurch wird eine Zelle geschaffen, die GDNFR exprimiert. Die homologe Rekombination ist ein Verfahren, das ursprünglich zum Targeting von Genen entwickelt wurde, um Mutationen in transkriptionell aktiven Genen zu induzieren oder zu korrigieren (Kucherlapati, Prog. in Nucl. Acid Res. And Mol. Biol., 36: 301, 1989). Die Grundtechnik wurde als Verfahren zum Einführen spezifischer Mutationen in spezifische Regionen des Säugergenoms entwickelt (Thomas et al., Cell, 44: 419–428, 1986; Thomas und Capecchik, Cell, 51: 503–512, 1987; Doetschman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 8583–8587, 1988) oder um spezifische Mutationen innerhalb defekter Gene zu korrigieren (Doetschman et al., Nature, 330: 576–578, 1987). Beispielhafte homologe Rekombinationsverfahren werden in US 5,272,071 ( EP 91 90 3051 , EP-Veröffentlichungsnummer 505 500; PCT/US90/07642, internationale Veröffentlichung Nr. WO 91/09955) beschrieben, deren Offenbarung hiermit durch Referenz einschlossen ist.
Durch homologe Rekombination kann die in das Genom zu insertierende DNA-Sequenz direkt in einen spezifischen Bereich des Gens von Interesse durch Anfügen an die Ziel-DNA dirigiert werden. Die Ziel-DNA ist die DNA, die komplementär (homolog) zu einem Bereich der genomischen DNA ist. Kurze Abschnitte der Ziel-DNA, die komplementär zu einem spezifischen Bereich des Genoms sind, werden während des DNA-Replikationsprozesses mit dem elterlichen Strang in Kontakt gebracht. Es ist eine allgemeine Eigenschaft von DNA, die in eine Zelle insertiert wurde, mit anderen Abschnitten endogener DNA über gemeinsame homologe Bereiche zu hybridisieren und folglich zu rekombinieren. Wenn dieser komplementäre Strang an ein Oligonukleotid angefügt wird, das eine Mutation oder eine verschiedene DNA-Sequenz enthält, wird dieses als Ergebnis der Rekombination ebenfalls in den neu synthetisierten Strang eingefügt. Als ein Ergebnis der Korrekturlesefunktion ist es für die neue DNA-Sequenz möglich, als ein Template zu dienen. Folglich wird die transferierte DNA in das Genom inkorporiert.
Ist die Sequenz eines bestimmten Gens bekannt, wie z. B. die Nukleinsäuresequenz, die Präpro-Sequenz oder die Expressionskontrollsequenz von GDNFR, die hierin dargestellt werden, kann ein Stück DNA, das komplementär zu einem ausgewählten Bereich des Gens ist, synthetisiert oder anderweitig erhalten werden, wie z. B. durch geeignete Restriktion der nativen DNA an spezifischen Erkennungsstellen, die den Bereich von Interesse begrenzen. Dieses Stück dient als Zielsequenz bei der Insertion in die Zelle und wird an seinen homologen Bereich innerhalb des Genoms hybridisieren. Wenn diese Hybridisierung währen der DNA-Replikation stattfindet, wird dieses Stück DNA und jede zusätzliche daran angefügte Sequenz als ein Okazaki-Fragment wirken und in den neu synthetisierten Tochterstrang der DNA eingefügt werden.
An diese Stücke der Ziel-DNA werden DNA-Bereiche angefügt, die mit der Expression eines GDNFR-Proteins interagieren können. Zum Beispiel wird ein Promotor-Enhancerelement, ein Suppressor oder ein exogenes, die Transkription modulierendes Element in das Genom der beabsichtigten Wirtszelle in einer Nähe und Orientierung, die ausreicht, um die Transkription der für das gewünschte GDNFR-Protein kodierenden DNA zu beeinflussen, insertiert. Das Kontrollelement kodiert nicht für GDNFR, sondern kontrolliert stattdessen einen Teil der DNA, die in dem Wirtszellgenom vorhanden ist. Folglich kann die Expression von GDNFR-Proteinen nicht durch Transfektion der DNA, die für das GDNFR-Gen selbst kodiert, erreicht werden, sondern durch die Verwendung einer Ziel-DNA (die Homologiebereiche zu dem endogenen Gen von Interesse enthält), die mit regulatorischen DNA-Segmenten verbunden ist, welche die endogene Gensequenz mit erkennbaren Signalen für die Transkription eines GDNFR-Proteins ausstattet.
A. GDNFR-Varianten
Wie oben erwähnt, umfasst der Begriff "GDNFR-Analoga", wie hierin verwendet, Polypeptide, von denen Aminosäuren deletiert wurden ("Deletionsvarianten"), in die Aminosäuren insertiert wurden ("Additionsvarianten") oder in denen Reste ausgetauscht wurden ("Substitutionsvarianten") innerhalb der Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden GDNFR-Polypeptide, einschließlich der in den 2 und 4 (SEQ ID NRn: 2 und 4) dargestellten. Solche Varianten sind auf die oben dargestellten Ausführungsformen beschränkt und werden durch Einführen der geeigneten Nukleotidaustausche in die für das Polypeptid kodierende DNA oder durch in vitro-chemische Synthese des gewünschten Polypeptids hergestellt. Den Fachleuten auf dem Gebiet wird bewusst sein, dass viele Kombinationen von Deletionen, Insertionen und Substitutionen in einer Aminosäuresequenz, wie z. B. dem reifen humanen GDNFR, ausgeführt werden können, vorausgesetzt, dass das Endmolekül eine GDNFR-Aktivität aufweist.
Basierend auf der vorliegenden Beschreibung der GDNFR-Aminosäuresequenzen kann man eine Vielzahl von Nukleinsäuresequenzen, die zur Verwendung bei der rekombinanten (z. B. mikrobiellen) Expression von Polypeptiden mit einer primären Konformation, die sich von den in den Figuren dargestellten bezüglich der Identität oder Lokalisierung eines oder mehrerer Reste unterscheidet, einfach entwickeln und herstellen. Mutagenesemethoden für das Ersetzen, die Insertion oder Deletion von einem oder mehreren ausgewählten Aminosäureresten, die von den in den 2 und 4 dargestellten Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, sind dem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt (z. B. US-Patent Nr. 4,518,584, dessen Offenbarung hiermit durch Referenz eingeschlossen ist). Es gibt zwei prinzipielle Variablen bei der Konstruktion von Substitutionsvarianten: die Lokalisation der Mutationsstelle und die Art der Mutation. Bei der Entwicklung von GDNFR-Substitutionsvarianten wird die Auswahl des Mutationsortes und der Art der Mutation von den GDNFR-Eigenschaft(en) abhängig sein, die verändert werden sollen. Die Stellen für die Mutation können individuell oder nacheinander modifiziert werden, z. B. durch (1) Substituieren erstens durch konservative Aminosäure-Modifikationen und anschließend mit einer radikaleren Auswahl, abhängig von den erreichten Ergebnissen, (2) Deletieren der Ziel-Aminosäurereste oder (3) Insertieren von Aminosäureresten benachbart zu der lokalisierten Stelle. Konservative Austausche von 1 bis 30 aufeinanderfolgenden Aminosäuren werden bevorzugt. N-terminale und C-terminale Deletionsvarianten des GDNFR-Proteins können außerdem durch proteolytische Enzyme erzeugt werden.
Bei den GDNFR-Deletionsvarianten liegen die Deletionen im Allgemeinen in einem Bereich von etwa 1 bis 30 aufeinander folgenden Resten, gewöhnlicher in einem Bereich von etwa 1 bis 10 aufeinander folgenden Resten und typischerweise im Bereich von etwa 1 bis 5 aufeinander folgenden Resten. N-terminale, C-terminale und interne Intrasequenzdeletionen sind ebenfalls vorgesehen. Deletionen können in Bereichen des Moleküls eingeführt werden, die eine geringe Homologie mit nichthumanem GDNFR aufweisen, um die Aktivität von GDNFR zu modifizieren. Deletionen in Bereichen substantieller Homologie mit nichthumanen GDNFR-Sequenzen werden mit größerer Wahrscheinlichkeit die biologische Aktivität von GDNFR signifikant modifizieren. Die Anzahl konsekutiver Deletionen wird typischerweise so gewählt, dass die Tertiärstruktur des GDNFR-Proteinproduktes in der betroffenen Domäne, z. B. die Cystein-Quervernetzung, erhalten wird. Nicht limitierende Beispiele für Deletionsvarianten schließen trunkierte GDNFR-Proteinprodukte ein, denen die N-terminalen oder C-terminalen Aminosäurereste fehlen. Zum Beispiel kann man einen löslichen Rezeptor durch Eliminieren der Peptidregion, die an einer Glycosylphosphatidylinositol(GPI)-Verankerung des GDNFR-Rezeptors in die cytoplasmatische Membran beteiligt ist, herstellen.
Bei GDNFR-Additionsvarianten schließen Aminosäuresequenzadditionen typischerweise N- und/oder C-terminale Fusionen oder terminale Additionen ein, die im Bereich einer Länge von einem Rest liegen, an Polypeptide, die 100 oder mehr Reste enthalten, ebenso wie interne oder mediale Additionen einzelner oder mehrerer Aminosäurereste. Polypeptide gemäß der Erfindung können außerdem einen Start-Methionin-Aminosäurerest (bei Position –1 in Bezug auf den ersten Aminosäurereste des gewünschten Polypeptids) beinhalten. Interne Additionen können im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 10 aufeinander folgenden Resten, typischer im Bereich von etwa 1 bis 5 Resten und gewöhnlicherweise im Bereich von etwa 1 bis 3 Aminosäureresten liegen. Beispiele für N-terminale Additionsvarianten schließen GDNFR mit dem Einschluss einer heterologen N-terminalen Signalsequenz in dem N-Terminus von GDNFR ein, um die Sekretion des reifen GDNFR aus rekombinanten Wirtszellen zu erleichtern und dadurch die Gewinnung und Bioverfügbarkeit zu erleichtern. Solche Signalsequenzen werden im Allgemeinen aus der beabsichtigten Wirtszellspezies stammen und folglich mit dieser homolog sein. Additionen können außerdem Aminosäuresequenzen umfassen, die von der Sequenz anderer neurotropher Faktoren abgeleitet sind. Zum Beispiel ist vorgesehen, dass ein Fusionsprotein von GDNF und GDNFR hergestellt werden kann, mit oder ohne eine Linkersequenz, wodurch eine therapeutische Entität aus einem einzigen Molekül gebildet wird.
In GDNFR-Substitutionsvarianten sind ein oder mehrere Aminosäurereste der GDNFR-Aminosäuresequenz entfernt, und ein anderer Rest(e) ist an dessen Stelle insertiert. Solche Substitutionsvarianten schließen allele Varianten ein, die durch natürlich vorkommende Nukleotidsequenzaustausche in der Speziespopulation gekennzeichnet sind, die zu einem Aminosäureaustausch führen können oder nicht. Wie bei den anderen Variantenformen können Substitutionsvarianten den Austausch eines einzigen Restes oder aufeinanderfolgender Aminosäurereste an einer oder mehreren verschiedenen Stellen umfassen.
Spezifische Mutationen der GDNFR-Aminosäuresequenz können Modifikationen einer Glycosylierungsstelle (z. B. Serin, Threonin oder Asparagin) umfassen. Das Fehlen einer Glycosylierung oder eine nur teilweise Glycosylierung resultiert aus einer Aminosäuresubstitution oder -deletion an einer Asparagin-verknüpften Glycosylierungserkennungsstelle oder an irgendeiner Stelle des Moleküls, die durch Addition eines O-verknüpften Kohlenhydrats modifiziert ist. Eine Asparagin-verknüpfte Glycosylierungserkennungsstelle umfasst eine Tripeptidsequenz, die spezifisch von geeigneten zellulären Glycosylierungsenzymen erkannt wird. Diese Tripeptidsequenzen sind entweder Asn-Xaa-Thr oder Asn-Xaa-Ser, wobei Xaa jede Aminosäure sein kann außer Pro. Eine Vielzahl von Aminosäuresubstitutionen oder -deletionen an einer oder beiden der ersten oder dritten Aminosäureposition einer Glycosylierungserkennungsstelle (und/oder eine Aminosäuredeletion an der zweiten Position) führt zu einer Nicht-Glycosylierung an der modifizierten Tripeptidsequenz. Folglich führt die Expression geeigneter veränderter Nukleotidsequenzen zu Varianten, die an dieser Stelle nicht glycosyliert sind. Alternativ kann die GDNFR-Aminosäuresequenz so modifiziert werden, dass Glycosylierungsstellen hinzugefügt werden.
Ein Verfahren zur Identifizierung von Aminosäureresten oder -bereichen für die Mutagenese wird "Alanin Scanning Mutagenese" genannt, wie von Cunningham und Wells (Science, 244: 1081–1085, 1989) beschrieben. Bei diesem Verfahren werden Aminosäurereste oder Gruppen von Zielresten identifiziert (z. B. geladene Reste, wie z. B. Arg, Asp, His, Lys und Glu) und durch neutrale oder negativ geladene Aminosäuren ersetzt (am bevorzugtesten Alanin oder Polyalanin), um die Interaktion der Aminosäuren mit der umgebenden wässrigen Umgebung in oder außerhalb der Zelle zu beeinträchtigen. Solche Domänen, die eine funktionelle Empfindlichkeit gegenüber den Substitutionen aufweisen, können anschließend durch Einführen zusätzlicher oder alternativer Reste an den Orten der Substitution verbessert werden. Folglich wird die Zielstelle zur Einführung einer Aminosäuresequenzvariation bestimmt, eine Alanin Scanning- oder Zufallsmutagenese wird an dem entsprechenden Zielcodon oder der Zielregion der DNA-Sequenz durchgeführt, und die exprimierten GDNFR-Varianten werden nach der optimalen Kombination der gewünschten Aktivität und dem Aktivitätsgrad gescreent.
Die Stellen von größtem Interesse für die substitutionelle Mutagenese schließen Stellen ein, an denen sich die in GDNFR-Proteinen von verschiedenen Spezies festgestellten Aminosäuren bezüglich der Seitenkettenmenge, -ladung und/oder Hydrophobie wesentlich unterscheiden. Andere Stellen von Interesse sind solche, in denen bestimmte Reste der GDNFR-ähnlichen Proteine, die von verschiedenen Spezies erhalten wurden, identisch sind. Solche Positionen sind im Allgemeinen wichtig für die biologische Aktivität eines Proteins. Anfänglich werden diese Stellen in einer relativ konservativen Art und Weise substituiert. Solche konservativen Substitutionen sind in Tabelle 2 unter der Überschrift der bevorzugten Substitutionen gezeigt. Führen solche Substitutionen zu einer Veränderung der biologischen Aktivität, können substantiellere Austausche (beispielhafte Substitutionen) eingefügt werden und/oder andere Additionen oder Deletionen durchgeführt werden, und die resultierenden Produkte werden auf ihre Aktivität hin gescreent.
TABELLE 2 Aminosäuresubstitutionen
Es wird erwartet, dass konservative Modifikationen der Aminosäuresequenz (und die entsprechenden Modifikationen der kodierenden Nukleinsäuresequenzen) GDNFR-Proteinprodukte hervorbringen, die funktionelle und chemische Eigenschaften haben, die ähnlich denen des natürlich vorkommenden GDNFR sind. Dagegen können durch Auswahl von Substitutionen, die sich signifikant in ihrer Wirkung auf die Aufrechterhaltung (a) der Struktur des Polypeptidrückgrats in dem Bereich der Substitution, z. B. einer Faltblatt- oder Helixkonformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der Menge der Seitenkette unterscheiden, substantielle Modifikationen der funktionellen und/oder chemischen Eigenschaften der GDNFR-Proteinprodukte er reicht werden. Natürlich vorkommende Reste können auf Grundlage ihrer Seitenketteneigenschaften in Gruppen eingeteilt werden:

1) hydrophob: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) neutral hydrophil: Cys, Ser, Thr;
3) sauer: Asp, Glu;
4) basisch: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
5) Reste, welche die Kettenorientierung beeinflussen: Gly, Pro; und
6) aromatisch: Trp, Tyr, Phe.

Nichtkonservative Substitutionen können den Austausch eines Mitglieds einer dieser Klassen gegen ein Mitglied einer anderen Klasse umfassen. Solche substituierten Reste können in Bereiche des humanen GDNFR-Proteins eingeführt werden, die homolog zu nichthumanen GDNFR-Proteinen sind oder in die nicht-homologen Bereiche des Moleküls.
Folglich schließen GDNFR Proteine, Analoga oder Derivate biologisch aktive Moleküle ein, die als primäre Aminosäuresequenz die gesamten oder einen Teil der Aminosäuresequenzen, die in den 2 und 4 (SEQ ID NR: 2 und 4) dargestellt sind, enthalten, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Die Proteine werden geänderte Sequenzen einschließen, in denen biologisch äquivalente Aminosäurereste Reste innerhalb der Sequenz ersetzen, was zu einem stummen Austausch führt. Zum Beispiel können ein oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure mit einer ähnlichen Polarität, die als funktionelles Äquivalent wirkt, ersetzt werden, was zu einer stummen Änderung führt. Der Ersatz für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz kann ausgewählt werden aus Mitgliedern der Klasse, zu der die Aminosäure gehört. Zum Beispiel schließen die nichtpolaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Die polar neutralen Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein. Es ist außerdem vorgesehen, dass die GDNFR Proteine, Analoga oder Fragmente oder Derivate davon während oder nach der Translation unterschiedlich modifiziert werden können, z. B. durch Phosphorylierung, Glycosylierung, Quervernetzung, Acylierung, proteolytische Spaltung, Kopplung an ein Antikörpermolekül, Membranmolekül oder an einen anderen Liganden.
B. GDNFR-Derivate
Chemisch modifizierte Derivate von GDNFR oder GDNFR-Analoga können von dem Fachmann auf dem Gebiet auf Grundlage der oben dargestellten Offenbarung hergestellt werden. Die chemischen Reste, die am geeignetsten für die Derivatisierung sind, schließen wasserlösliche Polymere ein. Ein wasserlösliches Polymer ist wünschenswert, weil das Protein, an das es angefügt wird, nicht in einer wässrigen Umgebung präzipitiert, wie z. B. einer physiologischen Umgebung. Vorzugsweise wird das Polymer pharmazeutisch annehmbar für die Herstellung eines therapeutischen Produktes oder einer therapeutischen Zusammensetzung sein. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird in der Lage sein, das gewünschte Polymer auf Grundlage von Überlegungen, wie z. B., ob das Polymer/Proteinkonjugat therapeutisch verwendet werden wird und wenn ja, der gewünschten Dosierung, Zirkulationszeit, Resistenz gegenüber Proteolyse und anderen Betrachtungen, auszuwählen. Die Effektivität der Derivatisierung kann durch Verabreichen des Derivates in der gewünschten Form (z. B. durch eine osmotische Pumpe oder, bevorzugter, durch Injektion oder Infusion, oder weiter formuliert für orale, pulmonale oder andere Verabreichungswege) und Bestimmen seiner Effektivität bestimmt werden.
Geeignete wasserlösliche Polymere schließen Polyethylenglycol, Copolymere von Ethylenglycol/Propylenglycol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Poly-1,3-Dioxolan, Poly-1,3,6-trioxan, Ethylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymer, Polyaminosäuren (entweder Homopolymere oder zufällige Copolymere) und Dextran oder Poly(n-vinylpyrrolidon)polyethylenglycol, Propropylenglycol-Homopolymere, Polypropylenoxid/Ethylenoxid-Copolymere, polyoxyethylierte Polyole (z. B. Glycerin), Polyvinylalkohol und Mischungen daraus ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Polyethylenglycolpropionaldehyd kann aufgrund seiner Stabilität in Wasser Vorteile bei der Herstellung haben.
Das Polymer kann irgendein Molekulargewicht aufweisen und kann verzweigt oder unverzweigt sein. Für Polyethylenglycol liegt das bevorzugte Molekulargewicht für eine leichte Handhabung und Herstellung etwa zwischen 2 kDa und etwa 100 kDa (der Begriff "etwa" deutet darauf hin, dass in Herstellungen von Polyethylenglycol einige Moleküle mehr, einige weniger als das angegebene Molekulargewicht wiegen werden). Andere Größen können verwendet werden, abhängig von dem gewünschten therapeutischen Profil (z. B. der gewünschten Dauer der anhaltenden Freisetzung; den Wirkungen, sofern es welche gibt, auf die biologische Aktivität; der Leichtigkeit der Handhabung; dem Grad oder dem Fehlen der Antigenität und anderen bekannten Wirkungen von Polyethylenglycol auf ein therapeutisches Protein oder eine therapeutische Variante).
Die Anzahl der so angefügten Polymermoleküle kann variieren, und ein Fachmann auf dem Gebiet wird im Stande sein, die Wirkung auf die Funktion festzustellen. Man kann mono-derivatisieren oder eine Di-, Tri-, Tetra- oder Kombination der Derivatisierung zur Verfügung stellen, mit denselben oder unterschiedlichen chemischen Resten (z. B. Polymere, wie z. B. verschiedene Gewichte von Polyethylenglycolen). Das Verhältnis von Polymermolekülen zu Protein(oder Peptid)-Molekülen wird variieren, ebenso wie ihre Konzentration in der Reaktionsmischung. Im Allgemeinen wird das optimale Verhältnis (was die Effizienz der Reaktion betrifft, so dass es keinen Überschuss an nicht reagiertem Protein oder Polymer gibt) durch Faktoren bestimmt werden, wie z. B. dem gewünschten Grad der Derivatisierung (z. B. Mono-, Di-, Tri- usw.), dem Molekulargewicht des ausgewählten Polymers, ob das Polymer verzweigt oder unverzweigt ist und den Reaktionsbedingungen.
Die Polyethylenglycolmoleküle (oder andere chemische Reste) sollten unter Berücksichtigung der Wirkungen auf die funktionellen oder antigenen Domänen des Proteins angefügt werden. Es gibt einige Verfahren zum Anfügen, die den Fachleuten auf dem Gebiet zur Verfügung stehen. Siehe z. B. EP 0 401 384 , deren Offenbarung hiermit durch Referenz eingeschlossen wird (Koppeln von PEG an G-CSF), siehe auch Malik et al., Exp. Hematol., 20: 1028–1035, 1992 (der von der Pegylierung von GM-CSF unter Verwendung von Tresylchlorid berichtet). Zum Beispiel kann Polyethylenglycol kovalent durch Aminosäurereste über eine reaktive Gruppe, wie z. B. eine freie Amino- oder Carboxylgruppe gebunden werden. Reaktive Gruppe sind solche, an die ein aktiviertes Polyethylenglycolmolekül gebunden werden kann. Die Aminosäurereste, die eine freie Aminogruppe aufweisen, können Lysinreste und den N-terminalen Aminosäurerest einschließen. Solche, die eine freie Carboxylgruppe haben, können Asparaginsäurereste, Glutaminsäurereste und den C-terminalen Aminosäurerest einschließen. Sulfhydrylgruppen können ebenfalls als reaktive Gruppe zum Anfügen der Polyethylenglycolmoleküle verwendet werden. Zu therapeutischen Zwecken wird das Anfügen an eine Aminogruppe, wie z. B. das Anfügen an den N-Terminus oder eine Lysingruppe, bevorzugt. Das Anfügen an Reste, die wichtig für die Rezeptorbindung sind, sollte vermieden werden, wenn eine Rezeptorbindung gewünscht wird.
Es kann speziell ein an dem N-Terminus chemisch modifiziertes Protein gewünscht sein. Unter Verwendung von Polyethylenglycol zur Veranschaulichung der vorliegenden Zusammensetzungen kann man aus einer Vielzahl von Polyethylenglycolmolekülen auswählen (nach Molekulargewicht, Verzweigung usw.), das Verhältnis der Polyethylenglycolmoleküle zu Protein(oder Peptid)-Molekülen in der Reaktionsmischung wählen, die Art der durchzuführenden Pegylierugsreaktion und das Verfahren zum Erhalten des ausgewählten N-terminal pegylierten Proteins. Das Verfahren zum Erhalten der N-terminal pegylierten Herstellung (d. h. die Trennung dieses Restes von anderen monopegylierten Resten, falls notwendig) kann durch Reinigung des N-terminal pegylierten Materials aus einer Population von pegylierten Proteinmolekülen erfolgen. Eine selektive N-terminale chemische Modifikation kann durch reduktive Alkylierung erreicht werden, welche die unterschiedliche Reaktivität der verschiedenen Arten von primären Aminogruppen (Lysin gegenüber der N-terminalen), die zur Derivatisierung in einem bestimmten Protein zur Verfügung stehen, ausnutzt. Unter den geeigneten Reaktionsbedingungen wird eine im Wesentlichen selektive Derivatisierung des Proteins am N-Terminus mit einer Carbonylgruppe, die das Polymer enthält, erreicht. Zum Beispiel kann man das Protein selektiv N-terminal pegylieren, indem man die Reaktion bei einem pH durchführt, der es erlaubt, sich die pKa-Unterschiede zwischen der E-Aminogruppe der Lysinreste und der A-Aminogruppe des N-terminalen Restes des Proteins zunutze zu machen. Durch eine selektive Derivatisierung wird das Anfügen eines wasserlöslichen Polymers an ein Protein kontrolliert: Die Konjugation mit dem Polymer findet hauptsächlich an dem N-Terminus des Proteins statt, und es tritt keine signifikante Modifizierung der anderen reaktiven Gruppen, wie z. B. der Lysin-Seitenkettenaminogruppen auf. Bei der Verwendung der reduktiven Alkylierung kann das wasserlösliche Polymer von der oben beschriebenen Art sein und sollte ein einziges reaktives Aldehyd für die Kopplung an das Protein aufweisen. Polyethylenglycolpropionaldehyd, das ein einziges reaktives Aldehyd enthält, kann verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung sieht die Verwendung von Derivaten vor, die von Prokaryonten exprimiertes GDNFR, oder Varianten davon, gekoppelt an wenigstens ein Polyethylenglycolmolekül sind, ebenso wie die Verwendung von GDNFR oder Varianten davon, die über eine Acyl- oder Alkylbindung an ein oder mehrere Polyethylenglycolmoleküle angefügt sind.
Die Pegylierung kann mit Hilfe sämtlicher auf dem Gebiet bekannten Pegylierungsreaktionen ausgeführt werden. Siehe z. B.: Focus on Growth Factors, 3(2): 4–10, 1992; EP 0 154 316 , deren Offenbarung hiermit durch Referenz eingeschlossen ist; EP 0 401 384 ; und die anderen hierin zitierten Publikationen, die sich auf Pegylierung beziehen. Die Pegylierung kann über eine Acylierungsreaktion oder eine Alkylierungsreaktion mit einem reaktiven Polyethylenglycolmolekül (oder einem analogen reaktiven wasserlöslichen Polymer) ausgeführt werden.
Die Pegylierung durch Acylierung umfasst im Allgemeinen die Reaktion eines aktiven Esterderivates von Polyethylenglycol (PEG) mit dem GDNFR-Protein oder der GDNFR-Variante. Jedes bekannte oder später entdeckte reaktive PEG-Molekül kann verwendet werden, um die Pegylierung des GDNFR-Proteins oder der GDNFR-Variante auszuführen. Ein bevorzugter aktivierter PEG-Ester ist verestert mit N-Hydroxysuccinimid (NHS). Wie hierin verwendet, ist vorgesehen, dass "Acylierung" ohne Beschränkungen die folgenden Arten der Kopplung zwischen dem therapeutischen Protein und einem wasserlöslichen Polymer wie z. B. PEG umfasst: Amid, Carbamat, Urethan und dergleichen. Siehe Bioconjugate Chem., 5: 133–140, 1994. Die Reaktionsbedingungen können aus den auf dem Gebiet der Pegylierung oder den später entwickelten ausgewählt werden, es sollten jedoch Bedingungen wie Temperatur, Lösungsmittel und pH vermieden werden, die den zu modifizierenden GDNFR oder die GDNFR-Variante inaktivieren würde.
Die Pegylierung durch Acylierung wird im Allgemeinen zu einem poly-pegylierten GDNFR-Protein oder eine GDNFR-Variante führen. Vorzugsweise wird die verbindende Verknüpfung ein Amid sein. Ebenfalls bevorzugt wird das resultierende Produkt im Wesentlichen nur (z. B. > 95%) mono-, di- oder tri-pegyliert sein. Jedoch können einige Spezies mit einem höheren Grad an Pegylierung in Mengen gebildet werden, die abhängig von den verwendeten spezifischen Reaktionsbedingungen sind. Wenn dies gewünscht ist, können mit Hilfe von Standardreinigungsmethoden, einschließlich u.a. der Dialyse, dem Aussalzen, der Ultrafiltration, der Ionenaustauschchromatografie, der Gelfiltrationschromatografie und der Elektrophorese stärker gereinigte pegylierte Spezies aus der Mischung abgetrennt werden, insbesondere nicht reagierte Spezies.
Die Pegylierung durch Alkylierung umfasst im Allgemeinen die Reaktion eines terminalen Aldehydderivates von PEG mit dem GDNFR-Protein oder der Variante in der Gegenwart eines reduzierenden Mittels. Die Pegylierung durch Alkylierung kann ebenfalls zu einem poly-pegylierten GDNFR-Protein oder einer GDNFR-Variante führen. Darüber hinaus kann man die Reaktionsbedingungen manipulieren, um eine Pegylierung im Wesentlichen nur an der A-Aminogruppe des N-Terminus des GDNFR-Proteins oder der Variante zu bevorzugen (d. h. ein mono-pegyliertes Protein). Sowohl im Falle der Monopegylierung als auch der Polypegylierung werden PEG-Gruppen bevorzugt über eine -CH2-NH- Gruppe an das Protein angefügt. Mit besonderem Verweis auf die -CH2- Gruppe wird diese Art der Kopplung hierin als eine "Alkyl"-Bindung bezeichnet.
Die Derivatisierung über reduktive Alkylierung zur Herstellung eines mono-pegylierten Produktes nutzt die unterschiedliche Reaktivität der verschiedenen Arten der primären Aminogruppen (Lysin im Vergleich zu N-terminal), die für die Derivatisierung zur Verfügung stehen, aus. Die Reaktion wird bei einem pH durchgeführt, der es ermöglicht, die pKa-Unterschiede zwischen den E-Aminogruppen der Lysinreste und dem der A-Aminogruppe des N-terminalen Restes des Proteins auszunutzen. Durch eine solche selektive Derivatisierung wird das Anfügen eines wasserlöslichen Polymers, das eine reaktive Gruppe wie z. B. ein Aldehyd enthält, an ein Protein kontrolliert: die Konjugation mit dem Polymer findet hauptsächlich an dem N-Terminus des Proteins statt, und an anderen reaktiven Gruppen, wie z. B. der Lysin-Seitenkettenaminogruppen, findet keine signifikante Modifikation statt. In einem wichtigen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung einer im Wesentlichen homogenen Herstellung von Monopolymer/GDNFR-Protein(oder -Variante)-Konjugatmolekülen vor (was ein GDNFR-Protein oder eine Variante bezeichnet, an das ein Polymermolekül im Wesentlichen (d. h. > 95%) nur an einer einzigen Stelle angefügt wurde). Genauer gesagt umfasst die vorliegende Erfindung, wenn Polyethylenglycol verwendet wird, auch die Verwendung eines pegylierten GDNFR-Proteins oder einer Variante, dem/der möglicherweise antigene Bindungsgruppen fehlen und an das/die das Polyethylenglycolmolekül direkt an das GDNFR-Protein oder die -Variante gekoppelt ist.
Folglich schließen GDNFR-Proteinprodukte gemäß der vorliegenden Erfindung pegylierte GDNFR-Proteine oder -Varianten ein, in denen die PEG-Gruppe(n) über Acyl- oder Alkylgruppen angefügt ist (sind). Wie oben erwähnt, können solche Produkte mono-pegyliert oder poly-pegyliert sein (z. B. 2–6 und vorzugsweise 2–5 PEG-Gruppen enthal ten). Die PEG-Gruppen sind im Allgemeinen an die A- oder E-Aminogruppen der Aminosäuren an das Protein angefügt, es ist jedoch auch vorgesehen, dass die PEG-Gruppen an irgendeine an das Protein angefügte Aminogruppe angefügt werden könnten, die ausreichend reaktiv ist, um unter geeigneten Reaktionsbedingungen an die PEG-Gruppe angefügt zu werden.
Die Polymermoleküle, die sowohl bei den Acylierungs- als auch bei den Alkylierungsansätzen verwendet werden können, können aus den wasserlöslichen Polymeren wie oben beschrieben ausgewählt werden. Das ausgewählte Polymer sollte so verändert sein, dass es eine einzige reaktive Gruppe aufweist, wie z. B. vorzugsweise einen aktiven Ester für die Acylierung oder ein Aldehyd für die Alkylierung, so dass der Grad der Polymerisierung wie in den vorliegenden Methoden zur Verfügung gestellt kontrolliert werden kann. Ein beispielhaftes reaktives PEG-Aldehyd ist Polyethylenglycolpropionaldehyd, das in Wasser stabil ist oder Mono-C1-C10-Alkoxy- oder Aryloxy-Derivate davon (siehe US-Patent 5,252,714). Das Polymer kann verzweigt oder unverzweigt sein. Für die Acylierungsreaktionen sollte das ausgewählte Polymer/die ausgewählten Polymere eine einzige reaktive Estergruppe haben. Für die vorliegende reduktive Alkylierung sollte das Polymer/die Polymere eine einzige reaktive Aldehydgruppe haben. Im Allgemeinen wird das wasserlösliche Polymer nicht aus natürlich vorkommenden Glycosylresten ausgewählt werden, da diese im Allgemeinen einfacher mit Hilfe rekombinanter Expressionssysteme des Säugers hergestellt werden. Das Polymer kann irgendein Molekulargewicht aufweisen und kann verzweigt oder unverzweigt sein.
Ein beispielhaftes wasserlösliches Polymer zur Verwendung hierin ist Polyethylenglycol. Wie hierin verwendet, ist Polyethylenglycol so gemeint, dass es jede Form des PEG umfasst, die verwendet wurde, um andere Proteine zu derivatisieren, wie z. B. Mono-(C1-C10)Alkoxy- oder Aryloxypolyethylenglycol.
Im Allgemeinen kann die chemische Derivatisierung unter jeden geeigneten Bedingungen durchgeführt werden, die verwendet werden, um eine biologisch aktive Substanz mit einem aktiven Polymermolekül zur Reaktion zu bringen. Verfahren zum Herstellen eines pegylierten GDNFR-Proteinproduktes werden im Allgemeinen die Schritte des (a) Zur-Reaktion-Bringen eines GDNFR-Proteinproduktes mit Polyethylenglycol (wie z. B. einem reaktiven Ester oder Aldehydderivat von PEG) unter Bedingungen, durch die das Protein an eine oder mehrere PEG-Gruppen angefügt wird und (b) des Erhaltens des Reakti onsproduktes/der Reaktionsprodukte umfassen. Im Allgemeinen werden die optimalen Reaktionsbedingungen für die Acylierungsreaktionen von Fall zu Fall auf Grundlage bekannter Parameter und des gewünschten Resultates bestimmt werden. Zum Beispiel ist der prozentuale Anteil des poly-pegylierten Produktes umso größer je größer das Verhältnis von PEG:Protein ist.
Die reduktive Alkylierung zur Herstellung einer im Wesentlichen homogenen Population des Mono-Polymers/GDNFR-Proteinproduktes wird im Allgemeinen die folgenden Schritte umfassen: (a) Zur-Reaktion-Bringen eines GDNFR-Proteins oder einer GDNFR-Variante mit einem reaktiven PEG-Molekül unter reduktiven Alkylierungsbedingungen, bei einem pH, der geeignet ist, die selektive Modifikation der A-Aminogruppe an dem Aminoterminus des genannten GDNFR-Proteins oder der genannten Variante zu erlauben; und (b) Erhalten des Reaktionsproduktes/der Reaktionsprodukte.
Für eine im Wesentlichen homogene Population des Mono-Polymer/GDNFR-Proteinproduktes sind die Reaktionsbedingungen für die reduktive Alkylierung solche, die das selektive Anfügen des wasserlöslichen Polymerrestes an den N-Terminus des GDNFR-Proteins oder der GDNFR-Variante erlauben. Solche Reaktionsbedingungen sorgen im Allgemeinen für pKa-Unterschiede zwischen den Lysinaminogruppen und den A-Aminogruppen am N-Terminus (wobei der pKa der pH-Wert ist, bei dem 50% der Aminogruppen protoniert sind und 50% nicht). Der pH beeinträchtigt außerdem das Verhältnis von verwendetem Polymer zu Protein. Im Allgemeinen wird, wenn der pH niedrig ist, ein größerer Überschuss an Polymer zu Protein gewünscht sein (d. h. je weniger reaktiv die N-terminale A-Aminogruppe, desto mehr Polymer wird benötigt, um optimale Bedingungen zu erreichen). Wenn der pH höher liegt, muss das Polymer:Protein-Verhältnis nicht so groß sein (d. h. je mehr reaktive Gruppen zur Verfügung stehen, desto weniger Polymermoleküle werden benötigt). Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der pH im Allgemeinen in einem Bereich von 3–9, vorzugsweise 3–6, liegen.
Ein weiterer wichtiger Gesichtspunkt ist das molekulare Gewicht des Polymers. Im Allgemeinen gilt, je höher das Molekulargewicht des Polymers, desto weniger Polymermoleküle können an das Protein angefügt werden. In ähnlicher Weise sollte die Verzweigung des Polymers berücksichtigt werden, wenn diese Parameter optimiert werden. Im Allgemeinen gilt, je höher das Molekulargewicht oder je mehr Verzweigungen, desto höher ist das Polymer:Protein-Verhältnis. Im Allgemeinen liegt für die hierin vorgesehenen Pegylierungsreaktionen das bevorzugte durchschnittliche Molekulargewicht bei etwa 2 kDa bis etwa 100 kDa. Das bevorzugte mittlere Molekulargewicht liegt bei etwa 5 kDa bis etwa 50 kDa, besonders bevorzugt bei etwa 12 kDa bis etwa 25 kDa. Das Verhältnis von wasserlöslichem Polymer zu GDNF-Protein oder GDNF-Variante wird im Allgemeinen im Bereich von 1:1 bis 100:1, bevorzugter (für die Polypegylierung) bei 1:1 bis 20:2 und (für die Monopegylierung) bei 1:1 bis 5:1 liegen.
Unter Verwendung der oben angegebenen Bedingungen wird die reduktive Alkylierung für ein selektives Anfügen des Polymers an irgendein GDNFR-Protein oder eine GDNFR-Variante sorgen, die eine A-Aminogruppe am Aminoterminus aufweisen und eine im Wesentlichen homogene Herstellung des Monopolymer/GDNFR-Protein(oder GDNFR-Variante)-Konjugats zur Verfügung stellen. Der Begriff "Monopolymer/GDNFR-Protein(oder -Variante)-Konjugat" wird hierin verwendet, um eine Zusammensetzung zu bezeichnen, die aus einem einzigen Polymermolekül, angefügt an ein Molekül des GDNFR-Proteins oder des GDNFR-Variantenproteins, besteht. Das Monopolymer/GDNFR-Protein(oder -Variante)-Konjugat wird typischerweise ein Polymermolekül aufweisen, das sich am N-Terminus befindet, jedoch nicht an Lysin-Aminoseitengruppen. Die Herstellung wird im Allgemeinen mehr als 90% Monopolymer/GDNFR-Protein(oder -Variante)-Konjugat enthalten und gewöhnlicher mehr als 95% Monopolymer/GDNFR-Protein(oder -Variante)-Konjugat, wobei der Rest der erkennbaren Moleküle unreagiert ist (d. h. Protein, dem die Polymereinheit fehlt). Es ist außerdem vorgesehen, dass das GDNFR-Proteinprodukt die Herstellung eines pegylierten Moleküls umfassen kann, welches das ein Fusionsprotein oder miteinander verbundene GDNFR- und GDNF-Moleküle umfassen kann.
Für die vorliegende reduktive Alkylierung sollte das reduzierende Mittel in wässriger Lösung stabil sein und vorzugsweise fähig sein, nur die während des Anfangsprozesses der reduktiven Alkylierung gebildete Schiffsche Base zu reduzieren. Geeignete reduzierende Mittel können ausgewählt werden aus Natriumborhydrid, Natriumcyanborhydrid, Dimethylaminboran, Trimethylaminboran und Pyridinboran. Ein besonders geeignetes reduzierendes Mittel ist Natriumcyanoborhydrid. Andere Reaktionsparameter, wie z. B. das Lösungsmittel, die Reaktionszeiten, Temperaturen usw. sowie Mittel zur Reinigung der Produkte, können von Fall zu Fall auf Grundlage der veröffentlichten Informationen in Bezug auf die Derivatisierung von Proteinen mit wasserlöslichen Polymeren bestimmt werden (siehe die hierin zitierten Veröffentlichungen).
C. Pharmazeutische Zusammensetzungen des GDNFR-Proteinproduktes
Pharmazeutische Zusammensetzungen des GDNFR-Proteinproduktes umfassen typischerweise eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge des GDNFR-Proteinproduktes in Gemisch mit einem oder mehreren pharmazeutisch und physiologisch annehmbaren Formulierungsmaterialien, die nach Eignung für die Art der Verabreichung ausgewählt werden. Geeignete Formulierungsmaterialien schließen Antioxidantien, Konservierungsmittel, Farbstoffe, Geschmacksstoffe und Verdünnungsmittel, Emulgatoren, Suspensionsmittel, Lösungsmittel, Füllstoffe, Füllmittel, Puffer, Liefervehikel, Verdünnungsmittel, Arzneimittelträger und/oder pharmazeutische Adjuvantien ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Zum Beispiel kann ein geeignetes Vehikel für die Injektion Wasser, physiologische Salzlösung oder künstlicher Liquor sein, möglicherweise angereichert mit anderen Materialien, die in Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung häufig vorkommen. Neutral gepufferte Salzlösung oder Salzlösung, die mit Serumalbumin gemischt ist, sind weitere beispielhafte Vehikel. Der Begriff "pharmazeutisch annehmbarer Träger" oder "physiologisch annehmbarer Träger", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Formulierungsmaterial(ien), die für das Erreichen oder Verstärken der Verabreichung des GDNFR-Proteinproduktes als pharmazeutische Zusammensetzung geeignet sind.
Das primäre Lösungsmittel in einem Vehikel kann entweder wässriger oder nichtwässriger Natur sein. Darüber hinaus kann das Vehikel weitere Formulierungsmaterialien zur Modifizierung oder Aufrechterhaltung des pHs, Osmolarität, Viskosität, Klarheit, Farbe, Sterilität, Stabilität, Auflösungsrate oder Geruch der Formulierung enthalten. In ähnlicher Weise kann das Vehikel zusätzliche Formulierungsmaterialien zum Modifizieren oder Aufrechterhalten der Freisetzungsrate des GDNFR-Proteinproduktes oder zum Fördern der Absorption oder Penetration des GDNFR-Proteinproduktes durch die Blut-Hirn-Schranke enthalten.
Sobald die therapeutische pharmazeutische Zusammensetzung formuliert worden ist, kann sie in sterilen Behältern als Lösung, Suspension, Gel, Emulsion, Feststoff oder dehydriertes lyophilisiertes Puder gelagert werden. Solche Formulierungen können entweder in einer gebrauchsfertigen Form oder in einer Form gelagert werden (z. B. lyophilisiert), welche die Aufbereitung vor der Verabreichung erfordert.
Die optimale pharmazeutische Formulierung wird von den Fachleuten auf dem Gebiet in Abhängigkeit von dem beabsichtigten Verabreichungsweg und der gewünschten Dosis bestimmt werden. Siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) Seiten 1435–1712, deren Offenbarung hiermit durch Referenz eingeschlossen ist. Solche Zusammensetzungen können den physikalischen Zustand, die Stabilität, die in vivo-Freisetzungsrate und die in vivo-Clearancerate der vorliegenden Proteine und Derivate beeinflussen.
Wirksame Verabreichungsformen, wie z. B. (1) Formulierungen mit langsamer Freisetzung, (2) Inhalationsaerosole oder (3) oral aktive Formulierungen, sind vorgesehen. Die pharmazeutische Zusammensetzung des GDNFR-Proteinproduktes kann außerdem für die parenterale Verabreichung formuliert werden. Solche parenteral verabreichten therapeutischen Zusammensetzungen liegen typischerweise in Form einer Pyrogen-freien, parenteral annehmbaren wässrigen Lösung vor, die das GDNFR-Proteinprodukt in einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff umfasst. Ein bevorzugter Hilfsstoff ist physiologische Salzlösung. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen des GDNFR-Proteinproduktes können außerdem partikuläre Herstellungen polymerer Verbindungen, wie z. B. Milchsäure, Glycolsäure usw. oder in Liposomen enthalten. Hyaluronsäure kann außerdem verwendet werden, und dies kann die Wirkung haben, die anhaltende Verweildauer im Blutkreislauf zu fördern.
Ein besonders geeigneter Hilfsstoff für die parenterale Injektion ist steriles destilliertes Wasser, in dem das GDNFR-Proteinprodukt als eine sterile, isotone Lösung formuliert ist, gut konserviert. Noch eine andere Herstellung kann die Formulierung des GDNFR-Proteinproduktes mit einem Mittel umfassen, wie z. B. injizierbaren Mikrosphären oder Liposomen, das für eine langsame oder anhaltende Freisetzung des Proteins sorgt, die dann als Depotinjektion verabreicht werden kann. Andere geeignete Mittel für die Verabreichung des GDNFR-Proteinproduktes schließen implantierbare Arzneimittel-Liefervorrichtungen ein, die das GDNFR-Proteinprodukt enthalten.
Die Zubereitungen gemäß der vorliegenden Erfindung können weitere Komponenten umfassen, z. B. parenteral annehmbare Konservierungsmittel, tonisierende Mittel, Cosolventien, Benetzungsmittel, Komplexierungsmittel, puffernde Mittel, antimikrobielle Mittel, Antioxidantien und oberflächenwirksame Substanzen, wie sie auf dem Gebiet wohl bekannt sind. Zum Beispiel schließen geeignete, die Tonizität verstärkende Mittel Alkalimetallhalogenide ein (vorzugsweise Natrium- oder Kaliumchlorid), Mannitol, Sorbitol und Ähnliche. Geeignete Konservierungsmittel schließen Benzalkoniumchlorid, Thimerosal, Phenethylalkohol, Methylparaben, Propylparaben, Chlorhexidin, Sorbinsäure und dergleichen ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Hydrogenperoxid kann ebenfalls als Konservierungsmittel verwendet werden. Geeignete Cosolventien sind z. B. Glycerol, Propylenglycol und Polyethylenglycol. Geeignete Komplexierungsmittel sind z. B. Koffein, Polyvinylpyrrolidon, beta-Cyclodexrin oder Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin. Geeignete oberflächenaktive Stoffe oder Benetzungsmittel schließen Sorbitanester, Polysorbate, wie z. B. Polysorbat 80, Tromethamin, Lecithin, Cholesterol, Tyloxapal und dergleichen ein. Die Puffer können herkömmliche Puffer sein, wie z. B. Borat, Citrat, Phosphat, Bicarbonat oder Tris-HCl.
Die Komponenten der Formulierung sind in Konzentrationen vorhanden, die für den Verabreichungsort annehmbar sind. Zum Beispiel werden Puffer verwendet, um einen physiologischen pH oder einen etwas niedrigeren pH der Lösung, typischerweise in einem pH-Bereich von etwa 5 bis etwa 8, aufrechtzuerhalten.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung kann zum Zwecke der Inhalation formuliert werden. Zum Beispiel kann das GDNFR-Proteinprodukt als trockenes Puder zur Inhalation formuliert werden. Inhalationslösungen des GDNFR-Proteinproduktes können außerdem in einem verflüssigten Treibgas zur Aerosolverabreichung formuliert werden. In noch einer weiteren Formulierung können Lösungen aerosoliert werden.
Es ist außerdem vorgesehen, dass bestimmte Formulierungen, die das GDNFR-Proteinprodukt enthalten, oral verabreicht werden sollen. Das GDNFR-Proteinprodukt, das auf diese Weise verabreicht wird, kann mit oder ohne Trägerstoffe formuliert werden, die üblicherweise bei der Zusammenstellung fester Dosierungsformen, wie z. B. Tabletten oder Kapseln, verwendet werden. Zum Beispiel kann eine Kapsel so konstruiert werden, dass der wirksame Teil der Formulierung zu dem Zeitpunkt im Gastrointestinaltrakt freigesetzt wird, zu dem die Bioverfügbarkeit maximal ist und die präsystemische Zersetzung minimal ist. Zusätzliche Formulierungsmaterialien können eingeschlossen werden, um die Absorption des GDNFR-Proteinproduktes zu erleichtern. Verdünnungsmittel, Geschmacksstoffe, Wachse mit niedrigem Schmelzpunkt, pflanzliche Öle, Schmiermittel, Suspensionsmittel, Tabletten-zersetzende Mittel und Bindestoffe können ebenfalls verwendet werden.
Eine weitere Zubereitung kann eine wirksame Menge des GDNFR-Proteinproduktes, gemischt mit nicht-toxischen Arzneimittelträgern umfassen, die zur Herstellung von Tabletten geeignet sind. Durch Auflösen der Tabletten in sterilem Wasser oder anderen geeigneten Hilfsstoffen, können Lösungen in Form einer Einheitsdosis hergestellt werden. Geeignete Arzneimittelträger schließen inerte Verdünnungsmittel, wie z. B. Calciumcarbonat, Natriumcarbonat oder Bicarbonat, Lactose oder Calciumphosphat ein; oder Bindungsmittel, wie z. B. Stärke, Gelatine oder Akazin; oder Schmiermittel wie z. B. Magnesiumstearat, Stearinsäure oder Talk, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Zusätzliche GDNFR-Proteinprodukt-Formulierungen werden für die Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich sein, einschließlich Formulierungen, die das GDNFR-Proteinprodukt in Kombination mit dem GDNF-Proteinprodukt umfassen. Methoden zur Formulierung einer Vielzahl anderer Mittel zur anhaltenden oder kontrollierten Verabreichung, wie z. B. Liposomträger, bio-erodierfähige Mikropartikel oder poröse Kügelchen und Depotinjektionen, sind den Fachleuten auf dem Gebiet ebenfalls bekannt. Siehe, z. B., Supersaxo et al., Beschreibung von porösen polymeren Mikropartikeln zur kontrollierten Freisetzung für die Verabreichung pharmazeutischer Zusammensetzungen (internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/15722; internationale Anmeldung Nr. PCT/US93/00829), deren Offenbarung hiermit durch Referenz eingeschlossen ist.
D. Verabreichung des GDNFR-Proteinproduktes
Das GDNFR-Proteinprodukt kann parenteral über eine Vielzahl von Wegen verabreicht werden, einschließlich der subkutanen, intramuskulären, intravenösen, transpulmonalen, transdermalen, intrathekalen und intracerebralen Verabreichung. Darüber hinaus können Proteinfaktoren, welche die Blut-Hirn-Schranke nicht einfach überwinden können, direkt intracerebral oder anderweitig zusammen mit anderen Elementen, die sie durch die Schranke transportieren, verabreicht werden. Zum Beispiel kann das GDNFR-Proteinprodukt intrazerebroventrikulär oder in den Subarachnoidalraum des Gehirns oder des Rückenmarks verabreicht werden. Das GDNFR-Proteinprodukt kann außerdem intracerebral direkt in das Parenchym des Hirns verabreicht werden. Das GDNFR-Proteinprodukt kann extracerebral in einer Form verabreicht werden, die chemisch modifi ziert oder verpackt wurde, so dass es die Blut-Hirn-Schranke überwindet, oder zusammen mit einem oder mehreren Mitteln, welche fähig sind, das Durchdringen des GDNFR-Proteinproduktes durch die Schranke zu fördern. Zum Beispiel wurde von einem Konjugat aus NGF und monoklonalen anti-Transferrinrezeptor Antikörpern festgestellt, dass sie über die Bindung an Transferrinrezeptoren in das Hirn transportiert werden.
Um die gewünschte Konzentration des GDNFR-Proteinproduktes zu erreichen, können wiederholte tägliche oder weniger häufige Injektionen verabreicht werden, oder das GDNFR-Proteinprodukt kann kontinuierlich oder periodisch von einer implantierten Pumpe mit konstantem Fluss oder programmierbarem Fluss infundiert werden. Implantate mit langsamer Freisetzung, die den neurotrophen Faktor eingebettet in eine bio-abbaubare Polymermatrix enthalten, können ebenfalls das GDNFR-Proteinprodukt liefern. Die Frequenz der Dosierung wird abhängig sein von den pharmakokinetischen Parametern des GDNFR-Proteinproduktes in der formulierten Form sowie von dem Weg und der Stelle der Verabreichung.
Ungeachtet der Art der Verabreichung kann die spezifische Dosis gemäß dem Körpergewicht, der Körperoberflächenfläche und der Organgröße berechnet werden. Eine weitere Verfeinerung der Berechnungen, die notwendig sind, um die geeignete Dosis zur Behandlung mit jeder der oben erwähnten Formulierungen zu bestimmen, wird routinemäßig von den durchschnittlichen Fachleuten auf dem Gebiet vorgenommen und liegt im Bereich der von ihnen routinemäßig durchgeführten Aufgaben. Geeignete Dosierungen können unter Verwendung geeigneter Dosis-Response-Daten ermittelt werden.
Das endgültige von einem Verfahren zur Behandlung einer spezifischen Verletzung oder eines spezifischen Krankheitszustandes umfasste Dosierungsschema wird von dem behandelnden Arzt bestimmt. Im Allgemeinen wird eine wirksame Menge der vorliegenden GDNFR-Polypeptide unter Berücksichtigung verschiedener Faktoren bestimmt, welche die Wirkung von Arzneimitteln beeinflussen, z. B. dem Alter, Zustand, Körpergewicht, Geschlecht und Ernährung des Patienten, der Schwere der jeweiligen Infektion, der Zeit der Verabreichung und anderen klinischen Faktoren. Siehe Remington's Pharmaceutical Sciences, s.o., auf den Seiten 697–773, was hierin durch Referenz eingeschlossen ist. Es ist vorgesehen, dass, wenn GDNFR zum Verstärken der GDNF-Wirkung verwendet wird, die GDNFR-Dosis so ausgewählt wird, dass sie ähnlich der für die GDNF-Therapie benötigten ist; wird GDNFR verwendet, um die GDNF-Wirkung zu antagonisieren, dann wäre die GDNFR-Dosis ein Vielfaches der GDNF-Dosis. Die Dosierung kann ein oder mehrere Male täglich oder weniger häufig vorgenommen werden und kann zusammen mit weiteren Zusammensetzungen wie hierin beschrieben vorgenommen werden. Es sollte erwähnt werden, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die hierin zitierten Dosierungen beschränkt ist.
Es ist vorgesehen, dass die kontinuierliche Verabreichung oder anhaltende Verabreichung der GDNFR-Proteinprodukte für eine bestimmte Behandlungsform von Vorteil sein kann. Während die kontinuierliche Verabreichung mittels mechanischer Mittel, wie z. B. einer Infusionspumpe, erreicht werden kann, ist vorgesehen, dass andere Arten der kontinuierlichen oder fast kontinuierlichen Verabreichung ausgeübt werden können. Zum Beispiel kann die chemische Derivatisierung oder Verkapselung zu Formen der anhaltenden Freisetzung des Proteins führen, welche die Wirkung eines kontinuierlichen Vorhandenseins in dem Blutstrom in vorhersagbaren Mengen, basierend auf einem bestimmten Dosierungsschema, haben. Folglich schließen die GDNFR-Proteinprodukte Proteine ein, die derivatisiert oder auf andere Weise formuliert wurden, um eine solche kontinuierliche Verabreichung zu bewirken. Formen der anhaltenden Freisetzung der GDNFR-Proteinprodukte werden formuliert werden, um die gewünschten täglichen oder wöchentlichen wirksamen Dosierungen zur Verfügung zu stellen.
Es ist weiterhin vorgesehen, dass das GDNFR-Proteinprodukt in einer kombinierten Form mit GDNF verabreicht werden kann. Alternativ können die GDNFR- und GDNF-Proteinprodukte getrennt verabreicht werden, entweder nacheinander oder gleichzeitig.
Das GDNFR-Proteinprodukt gemäß der vorliegenden Erfindung kann außerdem bei der Behandlung von Nervenkrankheiten verwendet werden, allein oder in Kombination mit anderen Wachstumsfaktoren. Darüber hinaus können andere Faktoren oder andere Moleküle, einschließlich chemischer Zusammensetzungen, zusammen mit einem GDNFR-Proteinprodukt verwendet werden. Bei der Behandlung der Parkinsonschen Krankheit ist vorgesehen, dass das GDNFR-Proteinprodukt allein oder zusammen mit der Verabreichung von Levodopa verwendet wird, wobei der GDNFR die Aktivität des endogenen GDNF verstärken würde und dadurch die neuronale Aufnahme erhöhter Konzentrationen an Dopamin verstärken würde.
Wie oben erwähnt ist außerdem vorgesehen, dass zusätzliche neurotrophe Faktoren oder Neuron-versorgende Faktoren (neuron nurturing factors) nützlich oder notwendig sein werden, um einige neuronale Zellpopulationen oder einige Arten von Verletzungen oder Erkrankungen zu behandeln. Weitere Faktoren, die zusammen mit GDNFR oder einer Kombination aus GDNFR und GDNF verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: Mitogene, wie z. B. Insulin, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren, den epidermalen Wachstumsfaktor, den vasoaktiven Wachstumsfaktor, das die Adenylatzyklase aktivierende Polypeptid der Hirnanhangdrüse, Interferon und Somatostatin; neurotrophe Faktoren, wie z. B. den Nervenwachstumsfaktor, den vom Hirn abgeleiteten neurotrophen Faktor, Neurotrophin-3, Neurotrophin-4/5, Neurotrophin-6, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor, ziliaren neurotrophen Faktor, sauren und basischen Fibroblastenwachstumsfaktor, Fibroblastenwachstumsfaktor-5, transformierenden Wachstumsfaktor-β, Kokain-Amphetamin-reguliertes Transkript (CART); und andere Wachstumsfaktoren, wie z. B. den epidermalen Wachstumsfaktor, Leukämie-inhibitorischen Faktor, Interleukine, Interferone und Kolonie-stimulierende Faktoren; ebenso wie Moleküle und Materialien, die funktionelle Äquivalente zu diesen Faktoren darstellen.
Zelltherapie und Gentherapie mit dem GDNFR-Proteinprodukt
Die GDNFR-Proteinprodukt-Zelltherapie, z. B. die intracerebrale Implantation von Zellen, die das GDNFR-Proteinprodukt produzieren, ist ebenfalls vorgesehen. Diese Ausführung würde das Implantieren von Zellen, die im Stande sind, eine biologisch aktive Form des GDNFR-Proteinproduktes zu synthetisieren und zu sezernieren, in den Patienten umfassen. Solche GDNFR-Proteinprodukt-produzierenden Zellen können Zellen sein, die natürliche Produzierer des GDNFR-Proteinproduktes sind, oder es können rekombinante Zellen sein, deren Fähigkeit, das GDNFR-Proteinprodukt zu produzieren, durch Transformation mit einem Gen, das für das gewünschte GDNFR-Produkt kodiert, verstärkt wurde. Eine solche Modifikation kann mittels eines Vektors erreicht werden, der zur Lieferung des Gens geeignet ist, ebenso wie zur Förderung seiner Expression und Sekretion. Um eine potenzielle immunologische Reaktion in Patienten, denen ein GDNFR-Proteinprodukt einer fremden Spezies verabreicht wurde, zu minimieren, wird bevorzugt, dass die natürlichen, das GDNFR-Proteinprodukt produzierenden Zellen aus einer humanen Quelle stammen und ein humanes GDNFR-Proteinprodukt produzieren. In ähnlicher Weise wird bevorzugt, dass die das GDNFR-Proteinprodukt produzierenden re kombinanten Zellen mit einem Expressionsvektor transformiert werden, der ein Gen enthält, das für ein humanes GDNFR-Proteinprodukt kodiert.
Implantierte Zellen können eingekapselt werden, um die Infiltration umgebender Gewebe zu vermeiden. Humane oder nichthumane tierische Zellen können in biokompatiblen, semipermeablen polymeren Umhüllungen oder Membranen, welche die Freisetzung des GDNFR-Proteinproduktes ermöglichen, jedoch die Zerstörung der Zellen durch das Immunsystem des Patienten oder durch andere schädliche Faktoren aus dem umgebenden Gewebe verhindern, in den Patienten implantiert werden. Alternativ könnten die eigenen Zellen des Patienten, die ex vivo transformiert wurden, um das GDNFR-Proteinprodukt zu produzieren, ohne eine solche Verkapselung direkt in den Patienten implantiert werden.
Verfahren zur Verkapselung lebender Zellen sind den Fachleuten mit durchschnittlichem Können auf dem Gebiet bekannt, und die Herstellung der verkapselten Zellen und ihre Implantation in Patienten kann ohne unzumutbares Experimentieren erreicht werden. Zum Beispiel beschreiben Baetge et al. (internationale Veröffentlichungsnr. WO 95/05452; internationale Anmeldung Nr. PCT/US94/09299, deren Offenbarung hiermit durch Referenz eingeschlossen wird) biokompatible Kapseln, die genetisch veränderte Zellen zur wirksamen Verabreichung biologisch aktiver Moleküle enthalten. Siehe außerdem US Patente Nm. 4,892,538, 5,011,472 und 5,106,627, die jeweils spezifisch durch Referenz eingeschlossen sind. Ein System zur Verkapselung lebender Zellen wird in der PCT-Anmeldung WO 91/10425 von Aebischer et al. beschrieben, die hierin spezifisch durch Referenz eingeschlossen ist. Siehe auch PCT-Anmeldung WO 91/10470 von Aebischer et al., Winn et al., Exper. Neurol., 113: 322–329, 1991, Aebischer et al., Exper. Neurol., 111: 269–275, 1991, Tresco et al., ASAIO, 38: 17–23, 1992, die jeweils spezifisch hierin durch Referenz eingeschlossen sind.
Die in vivo und in vitro Gentherapie-Verabreichung des GDNFR-Proteinproduktes ist ebenfalls vorgesehen. Die in vitro Gentherapie kann durch Einführen des für das GDNFR-Proteinprodukt kodierenden Gens in Zielzellen durch lokal Injektion eines Nukleinsäurekonstruktes oder anderer geeigneter Liefervektoren erreicht werden. (Hefti, J. Neurobiol., 25: 1418–1435, 1994). Zum Beispiel kann eine Nukleinsäuresequenz, die für ein GDNFR-Proteinprodukt kodiert, für die Lieferung in die Zielzellen in einem Adeno-assoziierten Virusvektor enthalten sein (z. B. Johnson, internationale Veröffentlichung Nr. WO 95/34670; internationale Anmeldung Nr. PCT/US95/07178, deren Offenbarung hiermit durch Referenz eingeschlossen ist). Alternative virale Vektoren schließen Retrovirus-, Adenovirus-, Herpes simplex-Virus- und Pappilomvirus-Vektoren ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Der physikalische Transfer, entweder in vivo oder ex vivo, je nachdem wie er geeignet ist, kann außerdem durch einen von Liposomen vermittelten Transfer, durch direkte Injektion (nackte DNA), durch Rezeptor-vermittelten Transfer (Liganden-DNA-Komplex), Elektroporation, Calciumphosphatpräzipitation oder Beschuss mit Mikropartikeln (Genpistole) erreicht werden.
Es ist außerdem vorgesehen, dass die Gentherapie oder Zelltherapie mit dem GDNFR-Proteinprodukt weiterhin die Verabreichung des GDNFR-Proteinproduktes umfassen kann. Zum Beispiel kann die Wirtszelle modifiziert werden, um sowohl das GDNFR-Proteinprodukt als auch das GDNF-Proteinprodukt zu exprimieren und freizusetzen. Alternativ können die GDNFR- und GDNF-Proteinprodukte in verschiedenen Zellen exprimiert und von verschiedenen Zellen freigesetzt werden. Solche Zellen können getrennt voneinander in den Patienten eingeführt werden, oder die Zellen können in einer einzigen implantierbaren Vorrichtung enthalten werden, wie z. B. der Verkapselungsmembran, die oben beschrieben ist.
Es sollte erwähnt werden, dass die GDNFR-Proteinprodukt-Formulierungen, die hierin beschrieben sind, sowohl für veterinäre als auch humane Anwendungen verwendet werden können, und dass der Begriff "Patient" nicht in beschränkter Weise aufgefasst werden sollte. Im Falle von Veterinäranwendungen können die Dosierungsbereiche wie oben beschrieben bestimmt werden.
BEISPIELE
Beispiel 1
Identifikation von Zellen, die GDNF-Bindungsstellen mit hoher Affinität exprimieren
Die Expressionsklonierung umfasst die Selektion einer mRNA-Quelle, von der wahrscheinlich ist, dass sie signifikante Menge des Zieltranskriptes enthält. Es wurde festgestellt, dass Fotorezeptorzellen der Retina gegenüber GDNF in sehr niedrigen Konzentrationen ansprechempfindlich sind, was das Vorhandensein eines funktionellen Rezeptors mit hoher Affinität nahe legt. Um zu bestätigen, dass Fotorezeptorzellen der Ratte einen hochaffinen Rezeptor für GDNF exprimieren, wurden [¹²⁵I]-GDNF-Bindungsanalysen und Analysen mit fotografischer Emulsion durchgeführt.
Retina-Zellkulturen der Ratte
Die neuralen Retinas von 5 Tage alten C57BI/I Mäusejungen oder 3 Tage alten Sprague-Dawley Rattenjungen (Jackson Laboratories, Bar Harbor, MA) wurden vorsichtig entfernt und von Pigmentepithel frei präpariert, in 1 mm² Fragmente zerschnitten und in eiskalte phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate-buffered saline; PBS) gelegt. Die Retinas wurden anschließend in 10 ml Hank's balancierter Salzlösung (Hank's balanced salt solution, HBSS), enthaltend 120 Einheiten Papain und 2000 Einheiten DNAase transferiert und 20 Minuten lang bei 38°C auf einem Rotationsplattformschüttler bei etwa 200 Upm inkubiert. Die Zellen wurden anschließend durch Trituration durch feuerpolierte Pasteurpipetten dispergiert, durch ein 20 μm Nitex-Nylonsieb gesiebt und anschließend für fünf Minuten bei 200 × g zentrifugiert. Das resultierende Zellpellet wurde in HBSS, enthaltend 1% Ovalbumin und 500 Einheiten DNAase, resuspendiert, auf eine 4 Ovalbuminlösung (in HBSS) geschichtet und 10 Minuten lang bei 500 × g zentrifugiert. Das endgültige Pellet wurde in Vollkulturmedium (s.u.) resuspendiert, auf 15000 Zellen/mL eingestellt und in 90 μl Aliquots in Gewebskulturplatten, die wie zuvor beschrieben mit Polyornithin und Laminin beschichtet wurden (Louis et al., Journal Of Pharmacology And Experimental Therapeutics, 262, 1274–1283, 1992), ausgesät.
Das Kulturmedium bestand aus einer 1:1-Mischung aus Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) und F12-Medium, und war mit 2,5% hitzeinaktiviertem Pferdeserum (Hyclon, Logan, UT), B27 Mediumergänzung (GIBCO, Grand Island, NY), D-Glucose (Endkonzentration: 5 mg/ml), L-Glutamin (Endkonzentration: 2 mM), 20 mM HEPES, bovinem Insulin und humanem Transferrin (Endkonzentrationen: 2,5 bzw. 0,1 mg/mL) angereichert.
Immuncytochemischer Nachweis der Fotorezeptoren
Die Fotorezeptoren wurden durch Immunfärbung von Arrestin, einem Stäbchen-spezifischen Antigen, nachgewiesen. Fotorezeptorkulturen wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4% Paraformaldehyd in PBS, pH 7,4, fixiert, gefolgt von drei Waschschritten in PBS. Die fixierten Kulturen wurden anschließend in Superblock Blockie rungspuffer inkubiert (Pierce, Rockford, IL), der 1% Nonidet P-40 enthielt, um die Penetration der Antikörper zu erhöhen. Die anti-Arrestin Antikörper (polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen die synthetische Peptidsequenz von Arrestin: Val-Phe-Glu-Glu-Phe-Ala-Arg-Gln-Asn-Leu-Lys-Cys) wurden anschließend mit einer Verdünnung zwischen 1:2000 in demselben Puffer verwendet, und die Kulturen wurden eine Stunde lang bei 37°C auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Nach drei Waschschritten mit PBS wurden die Kulturen eine Stunde lang bei 37°C mit Ziege anti-Kaninchen IgG (Vectastain Kit von Vector Laboratories, Burlingame, CA) mit einer 1:500 Verdünnung inkubiert. Nach drei Waschschritten mit PBS wurden die sekundären Antikörper anschließend mit einem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex markiert, der 1:500 verdünnt war (45 Minuten bei 37°C). Nach drei weiteren Waschschritten mit PBS wurden die markierten Zellkulturen 5–20 Minuten in einer Lösung aus 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, enthaltend 0,04% 3',3'-Diaminobenzidin-(HCl)4, 0,06% NiCl₂ und 0,02% Wasserstoffperoxid, zur Reaktion gebracht. Auf Grundlage der Arrestin-Immunreaktivität waren etwa 90% der Zellen in den Kulturen Stäbchen-Fotorezeptoren.
Das Überleben der Fotorezeptoren wurde durch Untersuchen der Arrestin-gefärbten Kulturen mit Hellfeldoptik bei 200-facher Vergrößerung bestimmt. Die Anzahl der Arrestin-positiven Fotorezeptoren wurde in einem diametralen 1 × 6 mm Streifen gezählt, was etwa 20% der gesamten Oberfläche einer 6 mm Vertiefung darstellt. Lebende Fotorezeptoren waren dadurch gekennzeichnet, dass sie einen gleichmäßig geformten Zellkörper aufweisen, mit einem gewöhnlicherweise kurzen Axon-ähnlichen Fortsatz. Fotorezeptoren, die Zeichen der Degeneration zeigten, z. B. irreguläre, vakuolierte Perikaryen oder fragmentierte Neuriten aufwiesen, wurden von den Zählungen ausgeschlossen (die meisten degenerierenden Fotorezeptoren lösten sich jedoch von dem Kultursubstrat). Die Zellzahlen wurden jeweils als Zellen/6 mm-Vertiefung ausgedrückt.
Kultivierte Retinazellen der Ratte, die aufgrund von Fotorezeptoren angereichert wurden (10000/6 mm-Vertiefung) wurden mit humanem rekombinantem GDNF behandelt (10-fache serielle Verdünnungen im Bereich von 10 ng/ml bis 1 pg/ml). Die Kulturen wurden nach sechs Tagen fixiert und gegen Arrestin immungefärbt, einem Stäbchen-Fotorezeptor-spezifischen Antigen. In Kulturen, die nicht mit GDNF behandelt wurden, nahm die Zahl der Fotorezeptoren mit der Zeit ständig ab, bis sie nach sechs Tagen in Kultur etwa 25% der Anfangszahl erreichten. Die Behandlung der Kulturen mit GDNF führte zu einer zweifach höheren Anzahl lebender Arrestin-positiver Fotorezeptoren nach sechs Tagen in Kultur. Die Wirkung von GDNF war bei etwa 200 pg/ml maximal, mit einer ED₅₀ von etwa 30 pg/ml. Zusätzlich zur Förderung des Überlebens des Fotorezeptors stimulierte die Zugabe von GDNF außerdem die Verlängerung ihres Axon-ähnlichen Fortsatzes, wodurch eine Wirkung auf die morphologische Entwicklung der Fotorezeptoren nachgewiesen wurde (durchschnittliche Neuritenlänge der Fotorezeptoren in GDNF: 68 μm, im Vergleich zu 27 ± 18 μm in den Kontrollkulturen).
Um zu bestätigen, dass die Retinazellen der Ratte hochaffine GDNF-Rezeptoren exprimieren, wurden [¹²⁵I]-GDNF-Bindungsanalysen und Analysen mit fotografischer Emulsion durchgeführt. Fotorezeptorzellen postnataler Ratten wurden drei oder vier Tage vor den Experimenten auf Plastic Slide Flaskettes (Nunc) mit einer Dichte von 2800 Zellen/mm² ausgesät. Die Zellen wurden einmal mit eiskaltem Waschpuffer (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), enthaltend 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES), pH 7,5) gewaschen. Für die kompetitive Bindung wurden die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen an [¹²⁵I]-GDNF in Bindungspuffer (DMEM, enthaltend 25 mM HEPES, pH 7,5 und 2 mg/ml bovines Serumalbumin (BSA)) in Gegenwart oder Abwesenheit von 500 nM unmarkiertem GDNF bei 4°C für vier Stunden inkubiert. Die Zellen wurden viermal mit eiskaltem Waschpuffer gewaschen, in 1 M NaOH lysiert, und die mit den Zellen assoziierte Radioaktivität wurde in einem Gammazähler bestimmt. Eine signifikante Menge [¹²⁵I]-GDNF hat sogar in geringen Ligandenkonzentrationen (so niedrig wie 30 pM) an die Fotorezeptorzellen gebunden, und diese Bindung wurde vollständig durch die Gegenwart eines Überschusses an unmarkiertem GDNF inhibiert.
Für den Nachweis mit fotografischer Emulsion wurden die Zellen mit 50 pM [¹²⁵I]-GDNF in Bindungspuffer in Gegenwart oder Abwesenheit von 500 nM unmarkiertem GDNF bei 4°C für vier Stunden inkubiert. Die Zellen wurden sechsmal mit eiskaltem Waschpuffer gewaschen, mit 2,5% Glutaraldehyd fixiert und nacheinander mit 50% und 70% Ethanol dehydriert und in NTB-2 fotografische Emulsion (Eastman Kodak, Rochester, NY getaucht. Nach 5-tätiger Exposition wurden die Objektträger entwickelt und untersucht. Die Analyse mit fotografischer Emulsion zeigte die Assoziation von [¹²⁵I]-GDNF mit einigen Fotorezeptorzellen, wodurch das Vorhandensein eines Rezeptors für GDNF angezeigt wird. Diese Assoziation wurde jedoch wirksam durch Zugabe von unmarkierten GDNFs blockiert.
Beispiel 2
Expressionsklonierung eines GDNFR aus Fotorezeptorzellen
Fotorezeptorzellen der Ratten wurden als mögliche Quelle eines hochaffinen Rezeptors für GDNF basierend auf ihrer Zelloberflächenbindung von radioaktiv markiertem GDNF und ihrer Fähigkeit, auf sehr geringe Konzentrationen des Liganden anzusprechen, wie es in Beispiel 1 beschrieben wird, ausgewählt. Um den Rezeptor zu identifizieren, wurde eine Größen-selektierte cDNA-Bibliothek von etwa 50000 unabhängigen Klonen unter Verwendung eines Säuger-Expressionsvektors (einem Derivat von pSR, Takebe et al., 1988, s.o.) und isolierter DNA aus kultivierten Fotorezeptorzellen postnataler Ratten mit Hilfe der unten beschriebenen Verfahren konstruiert. Die Bibliothek wurde in Pools von etwa 1500 bis etwa 2000 unabhängigen Klonen eingeteilt und unter Verwendung eines etablierten Expressionsklonierungsansatzes gescreent (Gearing et al., EMBPO Journal, 8, 3667–3676, 1989). Plasmid-DNA, die jeden Pool der Bibliothek repräsentiert, wurde hergestellt und in COS7 Zellen transfiziert, die auf Plastic Slide Flaskettes (Nunc, Naperville, IL) gewachsen waren.
Die transfizierten Zellen wurden mit [¹²⁵I]-GDNF behandelt, mit Glutaraldehyd fixiert, dehydriert und in für die Autoradiografie fotografische Emulsion getaucht. Im Anschluss an eine fünf Tage lange Exposition wurden die Objektträger entwickelt und auf das Vorhandensein von Zellen hin untersucht, die von Silberkörnern bedeckt waren, was die Bindung von [¹²⁵I]-GDNF an die Zelloberfläche als Ergebnis der Expression eines Rezeptors für GDNF durch die Zelle hinweist. Mit EGF-Rezeptor transfizierte Zellen, die mit [¹²⁵I]-EGF behandelt wurden, wurden als positive Kontrolle verwendet.
Einer der 27 Pools (F8-11), die auf diese Weise untersucht wurden, zeigte nach der Transfektion 19 positive Zellen. Folglich wurde ein einziger cDNA Bibliothekspool identifiziert, der einen cDNA-Klon enthielt, der GDNFR exprimierte. Dieser Pool wurde in 60 kleinere Subpools mit 100 Klonen/Pool geteilt, die erneut mit Hilfe des gleichen Verfahrens wie oben beschrieben gescreent wurden. Fünf dieser Pools wurden als positiv identifiziert, und zwei der fünf Pools wurden weiterhin unterteilt, um einzelne Klone zu erzeugen, die für die GDNF-Bindungsaktivität verantwortlich sind. Die Transfektion der Plasmid-DNA aus den Einzelklonen in COS7 Zellen führte zur Bindung von [¹²⁵I]-GDNF in etwa 15% der Zellen. Diese Bindung wurde durch Kompetition mit einem Überschuss an unmarkiertem GDNF spezifisch inhibiert.
Konstruktion von Expressions-cDNA-Bibliotheken
Retinazellen der Ratten wurden aus 3–7 Tage alten postnatalen Ratten gewonnen und in mit Laminin und Polyornithin beschichteten Kulturplatten mit einer Dichte von etwa 5700 Zellen/mm² ausgesät. Nach 3–4 Tagen in Kultur wurde angenommen, dass die Population etwa 80% Fotorezeptorzellen enthält. Gesamt-RNA wurde aus dieser Kultur mit Hilfe von Standardverfahren hergestellt, und Poly A+RNA wurde unter Verwendung eines Poly A-tract Kits (Promega, Madison, WI) gereinigt. Eine cDNA-Bibliothek wurde aus der Poly A–RNA des Fotorezeptors der Ratte unter Verwendung des Gibco Superscript Choice Systems (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) konstruiert. 2 μg der Poly A–RNA wurden mit 50 ng Zufallshexameren gemischt, 10 Minuten lang auf 70°C erhitzt und anschließend rasch auf Eis gekühlt. Die Synthese des ersten Stranges wurde mit Hilfe von 400U Superscript II RT bei 37°C eine Stunde lang ausgeführt.
Die Synthese des zweiten Stranges wurde in demselben Gefäß nach Zugabe von dNTPs, 10U E. coli DNA-Ligase, 40U E. coli DNA-Polymerase I und 2U E. coli RNase H durchgeführt. Nach zwei Stunden bei 16°C wurden durch Behandlung mit 10U T4-Polymerase für weitere fünf Minuten bei 16°C stumpfe cDNA-Enden hergestellt. Nach der Präzipitation mit Isopropanol wurden durch Ligation mit 10 μg unphosphorylierten EcoRI Adapter-Oligonukleotiden über Nacht EcoRI-Klonierungsstellen an die cDNA angefügt.
Die cDNA mit dem EcoRI-Adapter wurde anschließend phosphoryliert und auf eine Sephacryl S-500 HR Größenfraktionierungssäule aufgetragen. Nach der Beladung wurde die Säule mit 100 μl Aliquots TEN-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 25 mM NaCl) gewaschen, und 30 μl Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen 6 bis 8, die etwa 34 ng der cDNA mit hohem Molekulargewicht enthielt, wurden vereinigt und präzipitiert. Die gewonnene, mit EcoRI-Adaptern versehene cDNA wurde über Nacht mit 50 ng eines mit EcoRI geschnittenen Vektors pBJ5 ligiert. Aliquots der Ligationsmischung, die jeweils etwa 15 ng cDNA enthielten, wurden mit Hilfe der Elektroporation in kompetente Zellen transformiert (E. coli-Stamm DH10B; GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD). Die Transformationsmischung wurde titriert und anschließend auf 27 Amp/LB-Platten mit einer Dichte von 1500 Kolonien/Platte ausplattiert. Die Kolonien wurden von jeder Platte abgeschabt und in 10 ml Luria-Nährmedium (Luria broth, LB) gesammelt, um 27 Pools von jeweils 1500 unabhängigen Klonen zu ergeben. Ein Teil der Zellen aus jedem Pool wurde in Glycerin eingefroren, und der Rest wurde verwendet, um unter Verwendung eines Qiagen Tip-500 Kits (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) Plasmid-DANN zu isolieren.
Transfektion von COS Zellen und Analyse mit fotografischer Emulsion
COS7 Zellen wurden auf Plastic Slide Flaskettes (Nunc), die mit ProNectin beschichtet waren (10 μg/ml in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS)), einen Tag vor der Transfektion ausgesät (220000 Zellen/Objektträger). Für die Transfektion wurden 700 μl Opti MEMI (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD), enthaltend 2 μg cDNA, sanft mit 35 μl DEAE-Dextranlösung (10 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO) in einem Eppendorf-Gefäß gemischt. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und mit der Transfektionsmischung 30 Minuten bei 37°C in einer 5% CO₂-Atmosphäre inkubiert. Nach der Inkubation wurden 3 ml DMEM-Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum (FCS) und 80 nM Chloroquin (Sigma, St. Louis, MO), zu jeder Flaskette gegeben. Die Zellen wurden weitere 3,5 Stunden lang inkubiert, mit 10% Dimethylsulfoxid in DMEM bei Raumtemperatur für zwei Minuten unter Schock gesetzt, einmal mit PBS gewaschen und in DMEM, enthaltend 10% FCS wachsen gelassen. Nach 48 Stunden wurden die transfizierten COS7 Zellen einmal mit eiskaltem Waschpuffer (DMEM, enthaltend 25 mM HEPES, pH 7,5) gewaschen und in eiskaltem Bindungspuffer (DMEM, enthaltend 25 mM HEPES, pH 7,5 und 2 mg/ml BSA), der mit 50 pM [¹²⁵I]-GDNF angereichert war, bei 4°C für vier Stunden inkubiert. Die Zellen wurden sechsmal in eiskaltem Waschpuffer gewaschen, mit 2,5% Glutaraldehyd bei Raumtemperatur fünf Minuten lang fixiert, nacheinander mit 50% und 70% Ethanol dehydriert und anschließend in NTB-2 fotografische Emulsion (Eastman Kodak) getaucht. Nach 4–5-tägiger Exposition bei 4°C im Dunkeln wurden die Objektträger entwickelt und mit Hilfe der Hellfeld- und Dunkelfeld-Mikroskopie untersucht.
Unterteilung der positiven Pools
Ein einziger Pool wurde identifiziert, der einen möglichen GDNF-Rezeptorklon enthielt. Klone dieses Pools wurden auf 60 Platten mit einer Dichte von 100 Kolonien/Platte ausplattiert. Die Zellen wurden von jeder Platte gekratzt, in LB gesammelt und 4–5 Stunden bei 37°C wachsen gelassen. Gefrorene Stammlösungen und DNA-Präparationen wurden wie zuvor von jedem Pool hergestellt, um 60 Subpools zu erzeugen, die jeweils 100 un abhängige Klone enthalten. Zwei dieser 60 Subpools wurden mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens als positiv identifiziert, und Klone dieser Pools wurden in einer geringen Dichte ausplattiert, um die Isolation einzelner Kolonien zu ermöglichen. Einzelne Kolonien (384) wurden von jedem dieser zwei Subpools gepickt und sechs Stunden lang in 200 μl LB in 96-Well-Platten wachsen gelassen. Um einzelne Klone auszuwählen, die GDNFR exprimieren, wurden die vier 96-Well-Platten in einer einzigen großen Matrix bestehend aus 16 Reihen und 24 Spalten angeordnet. Zellen aus den Vertiefungen in jeder Reihe und in jeder Säule wurden kombiniert, um insgesamt 40 Mischungen zu erzielen. Diese Gemische wurden über Nacht in 10 ml LB/Amp (100 μg/ml) wachsen gelassen, und DNA wurde unter Verwendung eines Qiagen Tip-20 Kits hergestellt. Als sie auf mögliche GDNF-Rezeptorklone untersucht wurden, ergaben drei Reihen-Mischungen und drei Spalten-Mischungen positive Signale, was auf neun potenzielle positive Einzelklone hindeutete. DNA wurde von jedem der potenziellen positiven Einzelklone hergestellt und mit EcoRI und PstI verdaut. Die DNA von drei der neun Einzelklone zeigte identische Restriktionsmuster, während die anderen sechs in keinem Zusammenhang standen, was nahe legte, dass die drei authentische Klone darstellten, die GDNFR enthielten.
Beispiel 3
DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse
DNA von positiven, einzelnen Klonen wurde hergestellt und unter Verwendung eines automatisierten ABI373A DNA-Sequenzierers (Perkin/Elmer Applied Biosystems, Santa Clara, CA) und Dideoxy-Farbstoff-Terminatoren in Übereinstimmung mit den Herstellerangaben sequenziert. Ein Vergleich der GDNF-Rezeptorsequenz mit sämtlichen erhältlichen öffentlichen Datenbanken wurde unter Verwendung des FASTA-Programm-Algorithmus (Pearson und Lipman, Proceedings Of The National Academy Of Sciences USA, 85, 2444–2448, 1988) wie in der University of Wisconsin Genetics Computer Group Package beschrieben (Programm-Anleitung für das Wisconsin Package, Version 8, September 1994, Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) durchgeführt.
Sequenzcharakterisierung des GDNFR der Ratte
Plasmid-DNA der in Beispiel 2 oben beschriebenen Klonen wurde hergestellt und zur DNA-Sequenzanalyse eingereicht. Die Nukleotidsequenzanalyse der klonierten 2138 bp cDNA der Ratte ergab einen einzigen großen offenen Leserahmen, der für ein Translationsprotein mit 468 Aminosäureresten kodiert (3).
Die kodierende Sequenz wird von einem 5'-untranslatierten Bereich mit 301 bp und einem 3'-untranslatierten Bereich mit 430 bp flankiert, der keine potenzielle Polyadenylierungsstelle enthält. Das Vorhandensein eines Stoppcodons im Leserahmen stromaufwärts des ersten ATGs bei Basenpaar 302 und dessen umgebender Nukleotidkontext deuten darauf hin, dass dieses Methionin-Codon die wahrscheinlichste Translationsinitiationsstelle ist (Kozak, Nucleic Acids Research, 15, 8125–8148, 1987).
Kein Polyadenylierungssignal ist in den 430 Nukleotiden der 3'-nichttranslatierten Sequenz in dem cDNA-Klon der Ratte festzustellen. Dies ist nicht überraschend, da die Northern Blot-Daten zeigen, dass die kürzesten mRNA-Transkripte etwa 3,6 kb lang sind.
Die GDNFR-Polypeptidsequenz weist eine N-terminale hydrophobe Region mit etwa 19 Resten (Methionin-1 bis Alanin-19, 3) mit den Eigenschaften eines sekretorischen Signalpeptids auf (von Heijne, Protein Sequences And Data Analysis, 1, 41–42, 1987; von Heijne, Nucleic Acids Research. 14, 4683–4690, 1986). Keine interne hydrophobe Domäne, die als Transmembrandomäne dienen könnte, wurde gefunden. Stattdessen ist eine Carboxy-terminale hydrophobe Region mit 21 Resten (Leucin-448 bis Serin-468 in 3) vorhanden und könnte an der Glycosylphosphatidylinositol(GPI)-Verankerung des Rezeptors mit der cytoplasmatischen Membran beteiligt sein. Abgesehen von dem Vorhandensein von drei potenziellen N-verknüpften Glycosylierungsstellen, wurden keine konservierten Sequenzen oder strukturellen Motive festgestellt. Das Protein ist extrem reich an Cystein (31 der 468 Aminosäurereste), jedoch stimmt deren Abstand nicht mit den cysteinreichen Domänen überein, die in den extrazellulären Teilen bekannter Rezeptoren gefunden wurden.
Die GDNFR-Sequenz wurde unter Verwendung von FASTA mit Sequenzen in verfügbaren öffentlichen Datenbanken verglichen. Die Recherche förderte keine signifikante Homologie mit anderen publizierten Sequenzen zutage. Sobald der cDNA-Klon der Ratte erhalten wurde, wurde er radioaktiv markiert und verwendet, um eine aus der Substantia nigra des humanen Gehirns hergestellte cDNA-Bibliothek wie unten in Beispiel 5 beschrieben zu untersuchen.
Beispiel 4
GDNF-Bindung an Zellen, die GDNFR exprimieren
Ein Bindungsassay wurde in Übereinstimmung mit einem Assayverfahren, das zuvor von Jing et al. beschrieben wurde, durchgeführt (Journal Of Cell Biology, 110, 283–294, 1990). Das Assay beinhaltete die Bindung von [¹²⁵I]-GDNF an Fotorezeptorzellen der Ratte, an COS7 Zellen oder an 293T Zellen, die transfiziert wurden, damit sie GDNFR exprimieren. Rekombinantes GDNFR, das auf der Oberfläche von 293T Zellen exprimiert wurde, war fähig, GDNF spezifisch und mit einer Affinität zu binden, die vergleichbar zu der für GDNF-Bindungsstellen auf Retinazellen der Ratte beobachteten war.
Fotorezeptorzellen der Ratten wurden wie in Beispiel 1 oben beschrieben hergestellt und mit einer Dichte von 5,7 × 10⁵ Zellen/cm² zwei oder drei Tage vor dem Assay in 24 Well Costar-Gewebskulturplatten, die zuvor mit Polyornithin und Laminin beschichtet wurden, ausgesät. COS7 Zellen wurden mit einer Dichte von 2,5 × 10⁴ Zellen/cm² einen Tag vor dem Assay ausgesät und mit 10–20 μg Plasmid-DNA unter Verwendung des DEAE-Dextran-Chloroquinverfahrens transfiziert (Aruffo und Seed, Proceedings Of The National Academy Of Sciences USA, 84, 8573–8577, 1987). Zellen aus jeder Schale wurden entfernt und in 30 Vertiefungen von 24-Well Costar-Gewebskulturplatten 24 Stunden nach der Transfektion erneut ausgesät und weitere 48 Stunden lang wachsen gelassen. Die Zellen wurden anschließend 5 bis 10 Minuten auf Eis gelassen, einmal mit eiskaltem Waschpuffer gewaschen und mit 0,2 ml Bindungspuffer, enthaltend verschiedene Konzentrationen an [¹²⁵I]-GDNF, mit oder ohne unmarkiertem GDNF, bei 4°C für vier Stunden inkubiert. Die Zellen wurden viermal mit 0,5 ml eiskaltem Waschpuffer gewaschen und mit 0,5 ml 1 M NAOH lysiert. Die Lysate wurden in einem 1470 Wizard automatischen Gammazähler gezählt.
Für einige Bindungsexperimente wurden transient transfizierte 293T Zellen verwendet (siehe unten für die 293T-Zell-Transfektion). Zwei Tage nach der Infektion wurden die Zellen mit Hilfe von 2 × Versine aus den Platten entfernt. Die Zellen wurden pelletiert, einmal mit eiskaltem Bindungspuffer gewaschen und in eiskaltem Bindungspuffer mit einer Dichte von 3 × 10⁵ Zellen/ml resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in Aliquots enthaltend 1,5 × 10⁵ Zellen/Probe aufgeteilt. Die Zellen wurden anschließend pelletiert und mit verschiedenen Konzentrationen an [¹²⁵I]-GDNF in der Gegenwart oder Abwe senheit von 500 nM unmarkiertem GDNF bei 4°C vier Stunden lang bei leichtem Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden viermal mit eiskaltem Waschpuffer gewaschen und in 0,5 ml Waschpuffer resuspendiert. Zwei 0,2 ml Aliquots der Suspension wurden in einem Gammazähler gezählt, um die Menge des mit den Zellen assoziierten [¹²⁵I]-GDNF zu bestimmen.
In sämtlichen Assays wurde die nichtspezifische Bindung durch Verwendung von Duplikatproben, von denen eine 500 nM nicht markiertes GDNF enthielt, bestimmt. Der Grad der nichtspezifischen Bindung variierte zwischen 10 bis 20% der spezifischen Bindung, die in Abwesenheit von unmarkiertem GDNF gemessen wurde und wurde von der spezifischen Bindung subtrahiert. Die Assays zeigten, dass Zellen GDNF nicht banden, sofern die Zelle nicht mit dem GDNFR cDNA-Klon transfiziert worden war.
Beispiel 5
Gewebsverteilung der GDNFR mRNA
Das Expressionsmuster der GDNFR mRNA in Geweben embryonaler Mäuse, adulter Mäuse, der Ratte und des Menschen wurde mit Hilfe der Northern Blot-Analyse untersucht. Die klonierte GDNFR cDNA der Ratte wurde unter Verwendung des Random Primed DNA Labeling Kits (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers markiert. RNA-Blots mit Rattengewebe, Mausgewebe und humanem Gewebe (erworben von Clontech, Palo Alto, CA) wurden mit der Sonde hybridisiert und unter Verwendung der Reagenzien des ExpressHyb Kits (Clontech) in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers gewaschen.
Gewebe-Northern Blots, die aus adulten Rattengeweben, Mausgeweben und humanen Geweben hergestellt wurden, zeigten, dass die GDNFR mRNA am stärksten in der Leber, im Hirn und in der Niere exprimiert wird. Eine starke mRNA-Expression wurde außerdem in der Lunge nachgewiesen, in geringeren oder nicht detektierbaren Mengen in der Milz, im Darm, den Hoden und im skeletalen Muskel. In Blots, die von aus Mäuseembryonen isolierter mRNA hergestellt wurden, war die Expression bis zum embryonalen Tag 7 nicht nachweisbar, wurde am Tag E11 sichtbar und war am stärksten am Tag E17. Die GDNFR mRNA wurde in relativ gleichen Mengen in Geweben exprimiert, die aus verschiedenen Subregionen des adulten humanen Hirns isoliert wurde. Die Expres sion der GDNFR mRNA im humanen adulten Gehirn wies eine geringe Spezifität für irgendeine bestimmte Region auf.
In den meisten Geweben waren Transkripte mit zwei unterschiedlichen Größen vorhanden. In Mausgeweben und humanen Geweben wurden Transkripte mit 8,5 und 4,4 kb festgestellt, während die Transkripte in der Ratte 8,5 und 3,6 kb lang waren. Die relativen Mengen der größeren und kleineren Transkripte veränderten sich mit der Gewebeart, wobei das kleinere Transkript in der Leber und der Niere vorherrschte und das größere reichlicher im Hirn vorhanden war. Die Bindung von GDNF an 293T Zellen, die mit einem GDNFR cDNA-Klon in dem pBKRSV-Vektor transfiziert wurden, wurde mit Hilfe der Scatchard-Analyse untersucht. Zwei Klassen von Bindungsstellen wurden nachgewiesen, eine mit einer Bindungsaffinität im niedrigen picomolaren Bereich und eine weitere mit einer Affinität von etwa 500 pM.
Beispiel 6
Rekombinantes humanes GDNFR
Eine cDNA-Bibliothek der adulten humanen Substantia nigra (5'-Stretch plus cDNA Library, Clontech, Palo Alto, CA), die in den Bakteriophagen gt10 kloniert war, wurde unter Verwendung des GDNFR cDNA-Klons der Ratte aus Beispiel 1 als Sonde untersucht. Die Sonde wurde mit [³²P]-dNTPs unter Verwendung eines Random Primed DNA Labeling Kits (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) in Übereinstimmung mit den Herstellerangaben markiert. Etwa 1,2 × 10⁶ gt10-Phagen aus der cDNA-Bibliothek der humanen Substantia nigra wurden auf 15 cm Agaroseplatten ausplattiert und auf Duplikat-Nitrocellulosefiltern repliziert. Die Filter wurden anschließend durch Hybridisieren mit der radioaktiv markierten Sonde gescreent. Die Filter wurden in 200 ml 6 × SSC, 1 × Denhardts, 0,5% SDS, 50 μg/ml Lachssperma-DNA bei 55°C für 3,5 Stunden prähybridisiert. Nach der Zugabe von 2 × 10⁸ cpm der radioaktiv markierten Sonde wurde die Hybridisierung für 18 Stunden fortgesetzt. Die Filter wurden anschließend zweimal jeweils 30 Minuten lang in 0,5 × SSC, 0,1% SDS bei 55°C gewaschen und über Nacht auf einen Röntgenfilm mit Verstärkerfolie exponiert.

Fünf positive Plaques wurden isoliert, deren cDNA-Inserts Teile der humanen GDNFR cDNA repräsentierten. Im Vergleich zu der Nukleinsäuresequenz des Ratten-GDNFR, die in 3 dargestellt ist (bp 0 bis 2140), wurde von den fünf humanen GDNFR-Klonen festgestellt, dass sie die folgenden Sequenzen enthalten: TABELLE 3

Klon 2	1247 bis 2330 (SEQ ID NR: 21)
Klon 9	1270 bis 2330 (SEQ ID NR: 23)
Klon 21-A	–235 bis 1692 (SEQ ID NR: 9)
Klon 21-B	–237 bis 1692 (SEQ ID NR: 11)
Klon 29	805 bis 2971 (SEQ ID NR: 15)

Ein Alignment und Vergleich der Sequenzen, wie in 5 dargestellt, stellte eine Consensussequenz für humanes GDNFR zur Verfügung. Das von der humanen cDNA-Sequenz vorhergesagte Translationsprodukt besteht aus 465 Aminosäuren und ist zu 93% identisch mit dem GDNFR der Ratte.
Um eine humane cDNA zu erzeugen, die für das vollständig lange GDNFR kodiert, wurden Teile der Klone 21B und 2 an einer internen BglII-Stelle zusammengespliced und in den Säuger-Expressionsvektor pBKRSV subkloniert (Strategene, La Jolla, CA).
Rekombinante humane GDNFR-Expressionsvektoren können zur Expression in Säugerzellen hergestellt werden. Wie oben beschrieben kann die Expression außerdem in Nicht-Säugerzellen, wie z. B. Bakterienzellen stattfinden. Die hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen können in einen kommerziell erhältlichen Säugervektor (z. B. CEP4, Invitrogen) zur Expression in Säugerzellen, einschließlich der kommerziell erhältlichen humanen embryonalen Nierenzelllinie "293" gesetzt werden. Für die Expression in Bakterienzellen würde man typischerweise den für die Leadersequenz kodierenden Teil (z. B. Nukleinsäuren 1–590 der 1) eliminieren. Man kann zur bakteriellen Expression ein zusätzliches Methionyl an den N-Terminus anfügen. Darüber hinaus kann man zur Erleichterung der Expression die native Leadersequenz durch eine andere Leadersequenz oder eine andere Sequenz für die Spaltung ersetzen.
Beispiel 7
Lösliche GDNFR-Konstrukte
Lösliche humane GDNFR-Proteinprodukte wurden hergestellt. Die folgenden Beispiele stellen vier verschiedene Formen zur Verfügung, die sich nur an dem Carboxyterminus unterscheiden, was durch die Nummerierung der Reste wie in 2 dargestellt angezeigt wird. Zwei sind lösliche Formen, die an verschiedenen Stellen kurz stromaufwärts von dem hydrophoben Schwanz und stromabwärts von dem letzten Cysteinrest trunkiert sind. Die anderen beiden sind dieselben Trunkierungen, jedoch mit Addition der "FLAG"-Sequenz, einem Octapeptid, gegen das ein kommerzieller Antikörper erhältlich ist (Eastman-Kodak). Die FLAG-Sequenz lautet H2N-DYKDDDDK-COOH.
Verfahren
Der Lambda-Phagenklon #21, der fast die gesamte kodierende Region des humanen GDNFR enthält, wurde mit EcoRI verdaut, um das cDNA-Insert auszuschneiden. Dieses Fragment wurde gereinigt und in den mit EcoRI geschnittenen pBKRSV-Vektor (Stratagene, La Jolla, CA) ligiert, um den Klon 21-B-3/pBKRSV zu erzeugen. Die Primer 1 und 2 wie unten gezeigt wurden in einer PCR-Reaktion mit dem humanen GDNFR-Klon 21-B-3/pBKRSV als Template verwendet. Die PCR-Bedingungen waren 94°C, fünf Minuten, gefolgt von 25 Zyklen mit 94°C, eine Minute; 55°C, eine Minute; 72°C, zwei Minuten und einer finalen Extension von fünf Minuten bei 72°C. Dieses brachte ein Fragment hervor, das aus den Nukleotiden 1265–1868 des humanen GDNFR-Klons plus einem Terminationscodon und einer HindII-Restriktionsstelle, die durch den Primer 2 zur Verfügung gestellt wurde, besteht. Dieses Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII (enthalten in Primer 2) und BglII (Position 1304 in dem humanen GDNFR) verdaut, und das resultierende 572 Nukleotidfragment wurde mit Hilfe der Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment enthielt die für hGDNFR kodierende Region von Isoleucin-255 bis Glycin-443. Eine ähnliche Strategie wurde mit den Primern 1 und 3 verwendet, um ein Fragment mit BglII und HindIII-Enden zu erzeugen, das für Isoleucin-255 bis Prolin-446 kodierte. Die Primer 4 und 5 wurden entworfen, um Fragmente herzustellen, die für dieselben Regionen von hGDNFR kodieren und die Primer 1 und 3, jedoch mit der Addition der für das Flag-Peptid kodierenden Sequenz (IBI/Kodak, New Haven, CN). Die Flag-Peptidsequenz besteht aus acht Aminosäuren (H2N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-COOH), gegen die Antikörper kommerziell erhältlich sind. Die Primer 1 und 4 oder 1 und 5 wurden in PCR-Reaktionen mit demselben Template wie zuvor verwendet und mit HindII und BglII wie zuvor verdaut. Dieses Verfahren erzeugte Fragmente, die für Isoleucin-255 bis Glycin-443 und Isoleucin-255 bis Prolin-446 kodieren, jedoch mit der Addition des Flag-Peptids an deren Carboxytermini.
Primer

1) 5'-CTGTTTGAATTTGCAGGACTC-3' (SEQ ID NR: 30)
2) 5'-CTCCTCTCTAAGCTTCTAACCACAGCTTGGAGGAGC-3' (SEQ ID NR: 31)
3) 5'-CTCCTCTCTAAGCTTCTATGGGCTCAGACCACAGCTT-3' (SEQ ID NR: 32)
4) 5'-CTCCTCTCTAAGCTTCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCACCACAGCTTGGAGGAGC-3' (SEQ ID NR: 33)
5) 5'-CTCCTCTCTAAGCTTCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCTGGCTCAGACCACAGCTT-3' (SEQ ID NR: 34).

Alle vier wie oben beschrieben hergestellten Fragmente wurden zurück in 21B3/pBKRSV transferiert. Der 21B3/pBKRSV-Klon wurde mit BglII und HindIII verdaut und mit alkalischer Phosphatase aus dem Kälberdarm (calf intestinal alkaline phosphatase, CIAP) behandelt. Das große Fragment, das den Vektor und die für GDNFR kodierende Region bis zu der BglII-Stelle enthält, wurde mit Hilfe eines Gels gereinigt und aus dem Gel extrahiert. Jedes der vier wie oben beschrieben hergestellten BglII/HindIII-Fragmente wurde in diesen Vektor ligiert, was zu den folgenden Konstrukten in dem pBKRSV-Vektor führte: TABELLE 4

1) GDNFR/gly-443/pBKRSV	hGDNFR, das bei Glycin 443 endet, gefolgt von einem Stoppcodon
2) GDNFR/pro-446/pBKRSV	hGDNFR, das bei Prolin 446 endet, gefolgt von einem Stoppcodon
3) GDNFR/gly-443/Flag/pBKRSV	hGDNFR, das bei Glycin 443 endet, mit einer C-terminalen Flag-Markierung, gefolgt von einem Stoppcodon
4) GDNFR/pro-446/Flag/pBKRSV	hGDNFR, das bei Prolin 446 endet, mit einer C-terminalen Flag-Markierung, gefolgt von einem Stoppcodon

Die korrekte Konstruktion sämtlicher Klone wurde mit Hilfe der DNA-Sequenzierung bestätigt. Inserts aus den pBKRSV-Klonen wurden in andere Expressionsvektoren unter Verwendung der in der pBKRSV-Polylinkersequenz vorhandenen Enzymstellen wie unten beschrieben transferiert. Lösliche GDNFRs (z. B. sGDNFR/gly und sGDNFR/pro) wurden zur transienten Expression ebenfalls in Vektoren transfiziert und zur stabilen Expression in CHO Zellen pDSR-2.
pDSRα2+PL Klone:
Der geeignete pBKRSV-Klon wird mit XbaI und DalI verdaut. Das Insert wird in pDSRα2+PL, der mit denselben Enzymen geschnitten und mit CIAP behandelt wurde, ligiert. Diese Konstruktion kann zur stabilen Expression von GDNFR in CHO Zellen verwendet werden.
PCEP4 Klone:
Der geeignete pBKRSV-Klon wird mit SpeI und XhoI verdaut. Das Insert wird in pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA), der mit NheI (SpeI-Enden) und XhoI verdaut und mit CIAP behandelt wurde, ligiert. Diese Konstruktion kann zur transienten Expression des GDNFR verwendet werden.
Das Plasmidkonstrukt pDSR-2 wird im Wesentlichen in Übereinstimmung mit dem Verfahren hergestellt, das in der ebenfalls in Besitz befindlichen und anhängigen US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 501,904, eingereicht am 29. März 1990 beschrieben wird (siehe auch europäische Patentanmeldung Nr. 90305433, Publikation Nr. EP 398 753 , eingereicht am 18. Mai 1990 und WO 90/14363 (1990), deren Offenbarungen hier durch Referenz eingeschlossen sind). Es wird den Fachleuten auf dem Gebiet bewusst sein, dass eine Vielzahl von Nukleinsäuresequenzen, die für GDNFR-Analoga kodieren, verwendet werden können.
Ein weiteres Konstrukt ist pDSRα2, ein Derivat des Plasmids pCD (Okayama & Berg, Mol Cell Biol. 3: 280–289, 1983) mit drei Hauptmodifikationen: (i) das SV40-Polyadenylierungssignal wurde gegen das Signal aus der α-Untereinheit des bovinen Follikel-stimulierenden Hormons, α-bFSH (Goodwin et al., Nucleic Acids Res. 11: 6873–6882, 1983) ersetzt; (ii) ein Dihydrofolatreduktase-Minigen der Maus (Gasser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 6522–6526, 1982) wurde stromabwärts der Expressionskassette insertiert, um die Selektion und Amplifikation der Transformanten zu ermöglichen; und (iii) ein 267 bp-Fragment, welches das "R-Element" und einen Teil der "U5"-Sequenzen der langen terminalen Wiederholung (long terminal repeat, LTR) des humanen T-Zell-Leukämievirus Typ I (HTLV-I) enthält, wurde kloniert und zwischen den SV40-Promotor und die Splicesignale wie zuvor beschrieben (Takebe et al., Mol. Cell Biol. 8: 466–472, 1988) insertiert.
Die Expression von GDNFR in CHO Zellen wurde durch die Bindung von iodiniertem GDNF an die Zelloberfläche überprüft. Wie oben erwähnt, kann das rekombinant exprimierte lösliche GDNFR-Proteinprodukt verwendet werden, um die Aktivität oder Zellspezifität von GDNF zu potenzieren. Lösliches GDNFR, das an eine nachweisbare Markierung angefügt ist, kann außerdem in den oben erwähnten diagnostischen Anwendungen verwendet werden.
Beispiel 8
Chemische Quervernetzung von GDNF mit GDNFR
Um seine Bindungseigenschaften und molekularen Eigenschaften zu untersuchen, wurde GDNFR durch Transfektion des cDNA-Klons der Ratte transient auf der Oberfläche von 293T Zellen exprimiert. Die Transfektion der 293T Zellen wurde unter Verwendung des Calciumphosphat-Transfektionssystems (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers durchgeführt. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen durch Behandlung mit 2 × Versine entfernt, einmal mit Waschpuffer gewaschen und mit einer Dichte von 2 × 10⁶ Zellen/ml in Waschpuffer resuspendiert. Ein Duplikatset der Zellen wurde mit 0,5 μ/ml PI-PLC bei 37°C für 30 Minuten vor der [¹²⁵I]-GDNF-Bindung inkubiert. Diese Zellen wurden dreimal mit eiskaltem Bindungspuffer gewaschen und anschließend mit 1 bis 3 nM [¹²⁵I]-GDNF zusammen mit anderen Zellen bei 4°C vier Stunden lang inkubiert. Die Zellen wurden viermal mit eiskaltem Waschpuffer gewaschen, in Waschpuffer resuspendiert, dem 1 mM Bissuberat für die Quervernetzung zugesetzt war (BS³ Pierce, Rockford, IL) und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert. Nach drei Waschschritten mit TBS wurde eine Duplikatgruppe der Proben mit 0,5 μ/ml PI-PLC bei 37°C für 30 Minuten behandelt. Diese Zellen wurden pelletiert, und die Überstände wurden gesammelt. Die Zellen wurden anschließend mit Waschpuffer gewaschen und zusammen mit allen anderen Zellen mit 2 × SDS-PAGE-Probenpuffer lysiert. Die Zelllysate und die gesammelten Überstände wurden auf einer 7,5% SDS-PAGE aufgelöst.
Die Zellsuspension wurde in Aliquots aufgeteilt, die 1,5 × 10⁵ Zellen/Probe enthielten. Die Zellen wurden anschließend pelletiert und mit verschiedenen Konzentrationen an [¹²⁵I]-GDNF in der Gegenwart oder Abwesenheit von 500 nM unmarkiertem GDNF bei 4°C vier Stunden lang bei leichtem Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden viermal mit eiskaltem Waschpuffer gewaschen und in 0,5 ml Waschpuffer resuspendiert. Zwei 0,2 ml Aliquots der Suspension wurden in einem Gammazähler gezählt, um die mit den Zellen assoziierte Menge des [¹²⁵I]-GDNF zu bestimmen.
Obwohl scheintransfizierte 293T Zellen keine GDNF-Bindungskapazität zeigten, banden mit GDNFR transfizierte Zellen [¹²⁵I]-GDNF sogar in picomolaren Konzentrationen stark. Diese Bindung wurde fast vollständig durch 500 nM unmarkiertes GDNF inhibiert, was auf eine spezifische Bindung des nativen GDNFs an die exprimierten Rezeptoren hindeutet.
Das von den 293T Zellen exprimierte GDNFR kann durch Behandlung mit Phosphatidylinositol-spezifischer Phospholipase C (PI-PLC, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) aus den Zellen freigesetzt werden. Die Behandlung transfizierter Zellen mit PI-PLC vor der Ligandenbindung eliminiert die GDNF-Bindungskapazität der Zelle fast vollständig.
Darüber hinaus setzte die Behandlung der transfizierten Zellen nach der Quervernetzung die Mehrheit der quervernetzten Produkte in das Medium frei. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass GDNFR in der Zellmembran über eine GPI-Verankerung verankert ist.
Die Daten zur Quervernetzung zeigten ferner, dass das Molekulargewicht von GDNFR etwa 50 bis 65 kD ist, was nahe legt, dass es einen geringen Grad der Glycosylierung gibt. Obwohl die quervernetzte Haupt-Spezies eine molekulare Masse aufweist, die mit einem Monomer des Rezeptors übereinstimmt, wurde eine Neben-Spezies gefunden, die in etwa die Masse aufweist, wie sie für ein Dimer erwartet wird.
Beispiel 9
Die GDNF-Signalgebung wird durch einen Komplex aus GDNFR und der Ret Rezeptor-Proteintyrosinkinase vermittelt
Einführung
Mäuse, die gezielte Nullmutationen in dem GDNF-Gen tragen, zeigen verschiedene Funktionsstörungen in Geweben, die von Zellen der Neuralleiste abgeleitet sind, im autonomen Nervensystem und in den trigeminalen Motoneuronen und Motoneuronen des Rückenmarks. Die schwersten Defekte sind das Nichtvorhandensein von Nieren und der vollständige Verlust der enterischen Neuronen im Verdauungstrakt. Der Phänotyp der GDNF Knockout-Mäuse ist in dem c-Ret Knockout-Tiere (Schuchardt et al., 1994) erstaunlich ähnlich, was eine mögliche Verbindung zwischen den Signaltransduktionswegen von GDNF und c-Ret nahe legt.
Das Protoonkogen c-Ret wurde unter Verwendung von Sonden, die von einem in Gentransferexperimenten isolierten Onkogen abgeleitet wurden, identifiziert (Takahashi et al., Cell. 42, 581–588, 1985); Takahashi und Cooper, Mol. Cell. Biol., 7, 1378–1385, 1987). Die Sequenzanalyse der c-Ret cDNA offenbarte einen großen offenen Leserahmen, der für eine neue Rezeptor-Proteintyrosinkinase (PTK) kodiert. Die Familie der Rezeptor-PTKs wurde gemäß der Struktur der extrazellulären Domäne und der Sequenzhomologie innerhalb der intrazellulären Kinasedomäne in Unterfamilien eingeteilt (van der Geer et al., 1994). Die einzigartige Struktur der extrazellulären Domäne von Ret ordnet es außerhalb jeder bekannten Rezeptor-PTK-Unterfamilie ein; es enthält ein Signal peptid, ein Cadherin-ähnliches Motiv und eine Cystein-reiche Region (van Heyningen, Nature, 367, 319–320, 1994; Iwamoto et al., 1993). Die in situ-Hybridisierung und immunhistochemische Analyse zeigte hohe Expressionslevel der Ret mRNA und des Ret-Proteins in den sich entwickelnden zentralen und peripheren Nervensystemen und dem exkretorischen System der Mäuseembryonen (Pachnis et al., 1993; Tsuzuki et al., Oncogene, 10, 191–198, 1995), was eine Rolle des Ret-Rezeptors entweder bei der Entwicklung oder der Funktion dieser Gewebe nahe legt. Ein funktioneller Ligand des Ret-Rezeptors wurde nicht identifiziert, was das weitere Verständnis des molekularen Mechanismus der Ret-Signalgebung beschränkt. Mutationen in dem c-Ret Gen sind mit der vererbten Prädisposition für Krebs in dem familiären medullären Schilddrüsenkarzinom (familial medullary thyroid carcinoma, FMTC) und der multiplen endokrinen Neoplasie Typ 2A (MEN2A) und 2B (MEN2B) verbunden. Diese Erkrankungen sind möglicherweise durch "Gain of function"-Mutationen verursacht, welche die Ret-Kinase konstitutiv aktivieren (Donis-Keller et al., Hum. Molec. Genet. 2, 851–856, 1993; Hofstra et al., Nature. 367, 375–376, 1994; Mulligan et al., Nature. 363, 458–460, 1993; Santoro et al., Science. 267, 381–383, 1995). Sie verleihen eine Prädisposition für Malignome speziell in Geweben, die von der Neuralleiste abgeleitet sind, wo Ret normalerweise während der frühen Entwicklung exprimiert wird. Eine weitere mit Ret assoziierte genetische Störung, der Morbus Hirschsprung (HSCR), ist durch das angeborene Fehlen der parasympathischen Innervierung in dem unteren Intestinaltrakt gekennzeichnet (Edery et al., Nature. 367, 378–380, 1994; Romeo et al., 1994). Die wahrscheinlichsten Ursachen für HSCR sind Nonsense-Mutationen, die zu der Produktion eines verkürzten Ret-Protein führen, dem eine Kinasedomäne fehlt, oder Missense-Mutationen, welche die Ret-Kinase inaktivieren. Wie oben erwähnt, führt die gezielte Zerstörung des c-Ret Protoonkogens in Mäusen zu einer renalen Agenesie oder schweren Dysgenesie und zum Fehlen enterischer Neurone im gesamten Verdauungstrakt (Schuchardt et al., 1994). Dieser Phänotyp ähnelt stark dem von GDNF Knockout-Mäusen. Zusammengefasst legen diese Daten nahe, das sowohl Ret als auch GDNF an Signaltransduktionswegen beteiligt sind, die für die Entwicklung der Niere und des enterischen Nervensystems entscheidend sind. Wie Ret und GDNF jedoch beteiligt sind, war nicht bekannt.
Die Isolation und Charakterisierung der cDNA für GDNFR durch Expressionsklonierung, wie oben beschrieben, führte zur Expression von GDNFR in der transformierten humanen embryonalen Nierenzelllinie 293T. Die Transformation führte sowohl zum Auftreten von Bindungsstellen mit hoher Affinität (K_d von etwa 2 pM) als auch mit niedriger Affinität (K_d von etwa 200 pM). Die hochaffinen Bindungsstellen könnten aus Homodimeren oder Homooligomeren aus GDNFR allein bestehen, oder aus Heterodimeren oder Heterooligomeren aus GDNFR mit anderen Molekülen. Wie oben erwähnt, muss GDNFR, da ihm eine cytoplasmatische Domäne fehlt, über ein oder mehrere akzessorische Moleküle wirken, um eine Rolle bei der GDNF-Signaltransduktion zu spielen. In dieser Studie bestätigen wir, dass GDNF in der Gegenwart von GDNFR mit dem Ret-Proteintyrosinkinase-Rezeptor assoziiert und rasch die Ret-Autophosphorylierung induziert.
Ergebnisse
Neuro-2a Zellen, die GDNFR exprimieren, binden GDNF mit hoher Affinität
Neuro-2a ist eine Neuroblastomzelllinie der Maus, die endogen eine hohe Konzentration des Ret-Proteins exprimiert (Ikeda et al., Oncogene. 5, 1291–1296, 1990; Iwamoto et al.; Oncogene. 8, 1087–1091, 1993; Takahashi und Cooper, 1987) jedoch keine nachweisbaren Mengen der GDNFR mRNA exprimiert, wie mit Hilfe des Northern Blots festgestellt wurde. Um zu bestimmen, ob Ret mit GDNF in der Gegenwart von GDNFR assoziieren könnte, wurde eine Studie durchgeführt, um die Bindung von [¹²⁵I]-GDNF an Neuro-2a Zellen, die modifiziert wurden, um GDNFR zu exprimieren, zu untersuchen, Neuro-2a Zellen wurden mit einem Säuger-Expressionsvektor transfiziert, der die GDNFR cDNA der Ratte enthält (wie z. B. das oben beschriebene Expressionsplasmid). Drei klonale Linien, NGR-16, NGR-33 und NGR-38, wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, [¹²⁵I]-GDNF zu binden. Das ungebundene [¹²⁵I]-GDNF wurde am Ende der Inkubation entfernt, und die mit den Zellen assoziierte Radioaktivitätsmenge wurde wie in dem Abschnitt Experimentelle Verfahren beschrieben bestimmt. Alle drei Linien waren im Stande, [¹²⁵I]-GDNF spezifisch zu binden, während die parentalen Neuro-2a Zellen eine geringe oder keine [¹²⁵I]-GDNF-Bindung zeigten (6). Die Bindung konnte durch die Zugabe von 500 nM unmarkiertem GDNF effektiv kompetitiert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass der auf Neuro-2a Zellen exprimierte Ret-Rezeptor unfähig ist, GDNF in der Abwesenheit von GDNFR zu binden und stimmen mit den vorherigen Beobachtungen, wonach GDNFR nicht in nachweisbaren Mengen in Neuro-2a Zellen exprimiert wird, überein.
Die Gleichgewichtsbindung von [¹²⁵I]-GDNF an NGR-38 Zellen wurde über einen breiten Bereich von Ligandenkonzentrationen (0,5 pM bis 1 nM [¹²⁵I]-GDNF in der Gegenwart oder Abwesenheit von 500 nM unmarkiertem GDNF) untersucht (siehe 7A). Nach der Inkubation wurde ungebundenes [¹²⁵I]-GDNF entfernt, und die mit den Zellen assoziierte Radioaktivität wurde wie in dem Abschnitt Experimentelle Verfahren beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt: (A) Gleichgewichtsbindung von [¹²⁵I]-GDNF an NGR-38 Zellen (Kreise) und Neuro-2a Zellen (Quadrate) in der Gegenwart (offene Kreise und offene Quadrate) oder Abwesenheit (ausgefüllte Kreise und ausgefüllte Quadrate) von unmarkiertem GDNF; (B) Scatchard-Analyse der [¹²⁵I]-GDNF-Bindung an NGR-38 Zellen. Neuro-2a Zellen zeigten sogar bei einer Konzentration von 1 nM [¹²⁵I]-GDNF eine geringe Bindung, und diese Bindung wurde durch Zugabe eines Überschusses an unmarkiertem GDNF nicht beeinträchtigt. Die Bindung an NGR-38 Zellen wurde mit Hilfe eines Scatchard-Plots wie in 7B gezeigt analysiert. Zwei Klassen von Bindungsstellen wurden nachgewiesen, die eine mit einer K_d = 1,5 ± 0,5 pM und die andere mit einer K_d = 332 ± 53 pM. Diese Dissoziationskonstanten sind den Werten sehr ähnlich, die für die Bindungsstellen mit hoher und niedriger Affinität in 293T Zellen erhalten wurden, die GDNF transient exprimieren, wie oben beschrieben.
GDNF assoziiert mit Ret in Neuro-2a Zellen, die GDNFR exprimieren
Um zu bestimmen, ob die Ret-Rezeptor-PTK mit GDNF in Zellen assoziieren könnte, die GDNFR exprimieren, wurde ein Quervernetzungsexperiment unter Verwendung von NGR-38 und parentalen Neuro-2a Zellen durchgeführt. Die NGR-38 Zellen wurden mit [¹²⁵I]-GDNF inkubiert, mit einem Quervernetzungsmittel behandelt, anschließend entweder direkt in SDS-PAGE-Probenpuffer oder in Triton X-100-Lysispuffer lysiert und ferner mit anti-Ret Antikörper immunpräzipitiert, wie in den experimentellen Verfahren beschrieben. Die Immunpräzipitate wurden mit Hilfe der SDS-PAGE in Abwesenheit (NR) oder Gegenwart (R) von Mercaptoethanol analysiert. Die Lysate wurden mit Ret-spezifischem Antikörper behandelt, immunpräzipitiert und mit Hilfe von SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert (siehe 8, die Banden sind wie folgt gekennzeichnet: ~75 kD, ausgefülltes Dreieck; ~150 kD, offenes Dreieck; ~185 kD, ausgefüllter Pfeil; ~250 kD, Sternchen; ~400 kD, offener Pfeil. Die am deutlichsten sichtbaren kreuzvernetzten Spezies lagen bei ~75 kD und ~185 kD, wobei weniger intensive Banden mit ~150 kD und ~250 kD auftauchten. Eine sehr schwache Bande mit ~400 kD war ebenfalls sichtbar (8, Spur 2). Als die Immunpräzipitate mit Hilfe einer nichtreduzierenden SDS-PAGE analysiert wurden, waren die ~75 kD, ~150 und ~185 kD-Banden mit etwa derselben Intensität wie in dem reduzierenden Gel vorhanden, jedoch nahm die Menge der ~400 kD-Bande dramatisch zu (8, Spur 4). Ebenfalls deutlicher sichtbar wurde die Bande bei ~250 kD.
Sowohl unter reduzierenden als auch unter nichtreduzierenden Bedingungen wurden Banden mit ähnlichem Molekulargewicht, jedoch stark verringerter Intensität beobachtet, wenn parentale Neuro-2a Zellen anstelle der NGR-38 Zellen verwendet wurden (8, Spuren 1 und 3). Die ~75 kD und ~150 kD-Spezies repräsentieren vermutlich quervernetzte Komplexe aus GDNF und GDNFR, da Spezies mit identischen Molekulargewichten durch Quervernetzen in 293T Zellen, die kein Ret exprimieren, erzeugt werden. Da das Molekulargewicht von Ret 170 kD ist, muss darüber hinaus jeder Komplex, der Ret einschließt, mindestens diese Größe aufweisen.
Die Tatsache, dass diese Komplexe mit Hilfe des anti-Ret Antikörpers immunpräzipitiert werden, zeigt, dass sie Produkte einer Assoziation zwischen Ret und dem GDNF/GDNFR-Komplex sind, der unter den Bedingungen der Gelanalyse zerstört wurde. Es wird vorausgesagt, dass die breite Bande bei ~185 kD wahrscheinlich aus einem Molekül Ret (170 kD) besteht, das mit einem Molekül des monomeren rekombinanten GDNF (15 kD) quervernetzt ist, obwohl etwas dimeres GDNF eingeschlossen sein könnte. Das Vorhandensein von Ret in dieser Spezies wurde durch ein separates Experiment bestätigt, in dem eine Bande mit demselben Molekulargewicht beobachtet wurde, als unmarkiertes GDNF mit NGR-38 Zellen quervernetzt wurde und die Produkte mit Hilfe eines Western Blots mit anti-Ret Antikörper untersucht wurden (Daten nicht gezeigt). Die ~400 kD Bande wurde nicht verlässlich identifiziert, zum Teil aufgrund der Schwierigkeit bei der Abschätzung ihres Molekulargewichtes. Die Tatsache, dass sie nur unter nichtreduzierenden Bedingungen deutlich erkennbar ist, zeigt, dass es ein Disulfid-verknüpftes Dimer aus einer oder mehreren der unter reduzierenden Bedingungen beobachteten Spezies ist. Die wahrscheinlichste Erklärung ist, dass sie ein Dimer der 185 kD Spezies darstellt, obwohl sie eine Mischung aus hochmolekularen Komplexen sein kann, die aus zwei Ret-Molekülen, ein oder zwei GDNFR-Molekülen und ein oder zwei GDNF-Molekülen bestehen. Die genaue Identität der ~250 kD-Bande wurde noch nicht bestimmt. Eine Möglichkeit ist, dass sie quervernetzte Heterodimere der ~75 kD (GDNF + GDNFR)- und ~185 kD (GDNF + Ret)-Komplexe repräsentiert.
GDNF stimuliert die Autophosphorylierung von Ret in Neuro-2a Zellen, die GDNFR exprimieren
Die Fähigkeit des Ret-Proteintyrosinkinase-Rezeptors, mit GDNF in Gegenwart von GDNFR zu assoziieren, führte zu der Studie der GDNF-Stimulierung der Autophosphorylierung von Ret. NGR-38 Zellen wurden mit GDNF behandelt, lysiert und die Lysate wurden mit einem anti-Ret Antikörper immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden mit Hilfe eines Western Blots unter Verwendung eines anti-Phosphotyrosin Antikörpers wie in dem Abschnitt Experimentellen Verfahren beschrieben analysiert. Als die NGR-38 Zellen (9A, Spuren 2 bis 4) mit gereinigtem rekombinanten GDNF behandelt wurden, das entweder in Säugerzellen (CHO Zellen; 9A, Spur 4) oder in E. coli Zellen (9A, Spuren 1, 3) produziert wurde, wurde eine starke Bande bei 170 kD beobachtet, was auf eine Autophosphorylierung der Tyrosinreste auf der reifen Form von Ret hindeutet. Eine wesentliche schwächere entsprechende Bande wurde in GDNF-behandelten Neuro-2a Zellen beobachtet (9A, Spur 1). Keine Phosphorylierung wurde auf den alternativ glycosylierten 150 kD Vorläufer-Formen von Ret beobachtet (9A). Die Induktion der Autophosphorylierung von Ret durch GDNF war dosisabhängig. Die Dosisantwort und die Kinetiken der durch GDNF induzierten Ret-Tyrosinphosphorylierung in NGR-38 Zellen sind in den Abbildungen B und C gezeigt. In sämtlichen Abbildungen sind die Tyrosin-phosphorylierten 170 kD Ret-Banden durch ausgefüllte Pfeile angezeigt. Die Menge des Ret-Proteins, das in jede Spur geladen wurde, wie sie durch erneute Untersuchung des Immunoblots mit einem anti-Ret Antikörper bestimmt wurde (Santa Cruz, C-19, Cat. #sc.-167), wird auf der rechten Seite der Abbildung A gezeigt. Die Bande bei ~150 kD repräsentiert eine alternativ glycosylierte unreife Form von Ret, die nicht autophosphoryliert. Wie in 9B gezeigt, konnte die Stimulation der Ret-Autophosphorylierung in NGR-38 Zellen mit 50 pg/ml GDNF nachgewiesen werden, und die Antwort war bei 20–50 ng/ml GDNF gesättigt. Die Stimulation der Ret-Autophosphorylierung durch gereinigtes rekombinantes GDNF in NGR-38 Zellen über eine Zeitspanne von 0–20 Minuten nach der Behandlung ist in 9C gezeigt. Erhöhte Mengen der Ret-Autophosphorylierung konnten innerhalb von einer Minute der GDNF-Behandlung beobachtet werden und war 10 Minuten nach der Behandlung maximal (9C).
GDNF und löslicher GDNFR induzieren die Ret-Autophosphorylierung in Neuro-2a Zellen
Wie oben erwähnt, ist GDNFR mit der cytoplasmatischen Membran über eine GPI-Verankerung verankert und kann durch Behandlung mit Phosphatidylinositol-spezifischer Phospholipase C (PI-PLC) freigesetzt werden. Als NGR-38 Zellen mit PI-PLC inkubiert wurden, war die GDNF-induzierte Rezeptor-Autophosphorylierung von Ret in diesen Zellen aufgehoben (10A; mit PI-PLC behandelte (Spur 1) oder unbehandelte (Spuren 2 und 3) NGR-38 Zellen wurden mit (Spuren 1 und 3) oder ohne (Spur 2) GDNF inkubiert und auf Ret-Autophosphorylierung durch Immunblotting wie in den Experimentellen Verfahren beschrieben analysiert).
10B stellt parentale Neuro-2a Zellen dar, die mit (Spuren 2,4, 6, 8) oder ohne (Spuren 1, 3, 5 7) GDNF in der Gegenwart (Spuren 5–8) oder Abwesenheit (Spuren 1–4) von PI-PLC/CM behandelt wurden, das aus Neuro-2a- oder NGR-38 Zellen erhalten wurde, die mit Hilfe eines Immunblottings wie in den Experimentellen Verfahren beschrieben auf die Ret-Autophosphorylierung, analysiert wurden. NGR-38 Zellen, die mit GDNF behandelt wurden, wurden als positive Kontrolle verwendet. In beiden Abbildungen A und B sind die autophosphorylierten 170 kD Ret-Banden durch ausgefüllte Pfeile markiert. Wurde konditioniertes Medium, das löslichen GDNFR enthielt, der durch PI-PLC-Behandlung (PI-PLC/CM) aus NGR-38 Zellen freigesetzt wurde, zu parentalen Neuro-2a Zellen zusammen mit GDNF dazugegeben, wurde eine Autophosphorylierung des Ret-Rezeptors beobachtet, die vergleichbar mit der durch GDNF-Behandlung von NGR-38 Zellen erhaltenen war (10B, Spuren 2 und 8). Lediglich Hintergrundmengen der Ret-Autophosphorylierung wurden beobachtet, wenn kein GDNF dazugegeben wurde oder wenn konditioniertes Medium getestet wurde, das von der PI-PLC-Behandlung von Neuro-2a Zellen stammte (10B, Spuren 3–7).
Das Ret-Fc Fusionsprotein blockiert die durch GDNF und löslichen GDNFR induzierte Ret-Phosphorylierung
Um zu bestätigen, dass die durch GDNF in der Gegenwart von GDNFR induzierte Ret-Phosphorylierung das Ergebnis einer Rezeptor-Autophosphorylierung ist, wurde eine Studie durchgeführt, um zu bestimmen, ob ein Fusionsprotein aus der extrazellulären Domäne des Ret/Immunglobulin Fc (Ret-Fc) die Ret-Aktivierung blockieren könnte. Auf grund der technischen Schwierigkeit, die große Zahl der GDNF alpha-Rezeptoren, die auf NGR-38 Zellen exprimiert werden, zu blockieren, wurden Ret-Phosphorylierungsassays unter Verwendung von Neuro-2a als Zielzellen und von Kulturmedium, das von mit PI-PLC behandelten NGR-38 Zellen stammte, als GDNFR-Quelle, durchgeführt. Die Zellen wurden mit Mischungen behandelt, die verschiedene Kombinationen aus GDNF (50 ng/ml), lösliches GDNFR enthaltendem Medium (z. B. PI-PLC/CM, das von NGR-38 Zellen stammte) und verschiedenen Konzentrationen der Ret-Fc Fusionsproteine umfassten, entweder allein oder in verschiedenen Kombinationen wie in 11 angegeben. Neuro-2a Zellen wurden mit GDNF, lösliches GDNFR enthaltendem Medium, Ret-Fc oder den präinkubierten Mischungen behandelt. Die Zellen wurden anschließend lysiert, und die Lysate wurden mit Hilfe der Immunpräzipitation unter Verwendung eines anti-Ret Antikörpers wie in den Experimentellen Verfahren beschrieben auf die c-Ret Autophosphorylierung analysiert. Die Immunpräzipitate wurden durch Western Blot unter Verwendung eines Anti-Phosphotyrosin Antikörpers analysiert.
Die vorinkubierten Mischungen aus GDNF und lösliches GDNFR enthaltendem Medium induzierten die Tyrosinphosphorylierung der Ret-Rezeptoren, die in Neuro-2a exprimiert wurden, in einer Konzentration, die vergleichbar zu der mit GDNF behandelten NGR-38-Kontrollzellen war (11, Spuren 7 und 2). Die Position der autophosphorylierten 170 kD Ret-Banden sind durch einen ausgefüllten Pfeil markiert. War das Ret-Fc Fusionsprotein in die vorinkubierte GDNF/GDNFR-Mischung eingeschlossen, wurde die Ret-Phosphorylierung in einer dosisabhängigen Weise inhibiert (11, Spuren 8–10). Dies zeigte, dass die Ret-Phosphorylierung das Ergebnis einer GDNF/Ret-Interaktion ist, die durch GDNFR vermittelt wird. In unbehandelten Neuro-2a Zellen oder in Zellen, die mit irgendeiner Kombination aus GDNF oder Ret-Fc Fusionsproteinen in Abwesenheit von GDNFR behandelt wurden, wurden nur Hintergrundmengen an Ret-Phosphorylierung beobachtet (11, Spuren 3–6).
GDNF induziert die Autophosphorylierung von c-Ret, das in embryonalen Motoneuronen exprimiert wird
Motoneurone des Rückenmarks sind eines der Hauptziele der GDNF-Wirkung in vivo (Henderson et al., Science. 266, 1062–1064, 1994; Li et al., Proceedings Of The National Academy Of Sciences, USA, 92, 9771–9775, 1995; Oppenheim et al., Nature. 373, 344–346, 1995; Yan et al., Nature. 373, 341–344, 1995; Zurn et al., Neuroreport. 6, 113–118, 1995). Um die Fähigkeit von GDNF zur Induktion der Ret-Autophosphorylierung in diesen Zellen zu untersuchen, wurden Motoneurone des Rückenmarks von embryonalen Ratten mit (Spuren 2 und 4) oder ohne (Spuren 1 und 3) 20 ng/ml GDNF behandelt, gefolgt von einer Lyse der Zellen, der Immunpräzipitation mit einem anti-Ret Antikörper und der Analyse durch Western Blot mit einem anti-Phosphotyrosin Antikörper, wie in den Experimentellen Verfahren beschrieben. In Lysaten von Zellen, die mit GDNF behandelt wurden, wurde eine Bande eines Tyrosin-phosphorylierten Proteins mit einer Molekularmasse von ~170 kD beobachtet (12, Spur 2). Ein solches Signal wurde nicht in Zellen beobachtet, die allein mit Bindungspuffer behandelt wurden (12, Spur 1). Als derselbe Western Blot-Filter gestrippt und erneut mit einem anti-Ret Antikörper untersucht wurde (d. h., die Menge des c-Ret Proteins, das in jede Spur geladen wurde, wurde durch erneutes Sondieren des Immunblots mit dem anti-Ret Antikörper bestimmt), erschienen Banden mit derselben Molekularmasse und denselben Intensitäten in beiden Proben (12, Spuren 3 und 4). Die Phosphotyrosinbande in mit GDNF behandelten Zellen migriert gleichauf mit der Ret-Proteinbande, was auf eine durch GDNF stimulierte Autophosphorylierung von Ret hindeutet. Die autophosphorylierten Ret-Banden (Spuren 1 und 2) und die entsprechenden Proteinbanden (Spuren 3 und 4) wurden mit einem ausgefüllten Pfeil gekennzeichnet.
Diskussion
Polypeptid-Wachstumsfaktoren rufen eine biologische Wirkung über die Bindung an ihre verwandten Zelloberflächenrezeptoren hervor. Rezeptoren können in mehrere Klassen eingeteilt werden, basierend auf ihrer Struktur und ihrem Wirkungsmechanismus. Diese Klassifizierung umfasst die Proteintyrosinkinasen (PTKs), die Serin/Theroninkinasen und die Cytokinrezeptoren. Die Signalgebung der Rezeptor-PTK wird über eine direkte Interaktion mit einem Liganden initiiert, was eine Rezeptor-Dimerisierung oder -Oligomerisierung induziert, die wiederum zur Rezeptoren-Autophosphorylierung führt. Der aktivierte Rezeptor rekrutiert und phosphoryliert anschließend intrazelluläre Substrate, was eine Kaskade von Ereignissen in Gang setzt, die in einer biologischen Antwort gipfelt (Schlessinger und Ullrich, Neuron 9, 383–391, 1992). Dagegen umfasst die Signalgebung durch Serin/Threoninkinase- oder Cytokin-Rezeptoren häufig die Bildung von Rezeptorkomplexen aus mehreren Komponenten, in denen sich die Liganden-bindenden und signaltransduzierenden Komponenten unterscheiden. Beispiele sind der TGF-Rezeptorkomplex, ein Serin/Threoninkinase-Rezeptor, der aus getrennten bindenden (Typ 2) und signalgebenden (Typ 1) Komponenten der CNTF-Familie besteht. CNTF, Interleukin-6 (IL-6) und der Leukozyten-inhibitorische Faktor (LIF) teilen die gemeinsamen Signalgebungskomponenten, gp 130 und/oder LIFR, in ihren entsprechenden Rezeptorkomplexen. Während die Ligandenspezifität dieser Komplexe durch eine spezifische Bindungs-Untereinheit für jeden individuellen Liganden bestimmt wird, erfordert die Signaltransduktion die Assoziation des ursprünglichen Komplexes aus Ligand und Liganden-bindender Untereinheit mit weiteren Rezeptoruntereinheiten, die den Liganden nicht direkt binden können (Ip et al., Cell. 69, 1121–1132, 1992). In dem CNTF-Rezeptorkomplex ist die Liganden-bindende Komponente der CNTF-Rezeptor (CNTFR), der ähnlich wie GDNFR ein GPI-verankertes Membranprotein ist. Die vorliegende Erfindung umfasst die Beschreibung des ersten Beispiels für eine Rezeptor-PTK, deren Autophosphorylierung abhängig von der Assoziation mit einer separaten Liganden-spezifischen Bindungskomponente ist.
Die vorliegende Studie bestätigt, dass GDNFR, ein GPI-verankertes Membranprotein, das GDNF mit hoher Affinität bindet, für die effiziente Assoziation von GDNF mit der Ret-Rezeptor-PTK benötigt wird. In Abwesenheit von GDNFR ist GDNF unfähig, an Ret zu binden oder die Ret-Rezeptor-Autophosphorylierung zu stimulieren. In der Gegenwart von GDNFR assoziiert GDNF mit Ret und induziert rasch die Ret-Autophosphorylierung in einer dosisabhängigen Weise. GDNFR ist in der Lage, entweder als Membrangebundene oder lösliche Form zu fungieren (11), wie oben erwähnt. GDNF-Konzentrationen von 50 pg/ml (1,7 pM) sind im Stande, die Ret-Tyrosinkinase in Zellen, die GDNFR exprimieren, zu aktivieren. Dies entspricht der Dissoziationskonstante (1,5 pM), die für die hochaffinen GDNF-Bindungsstellen auf NGR-38 Zellen festgestellt wurde. Die rasche Induktion der Ret-Phosphorylierung durch GDNF (nachweisbar eine Minute nach der Behandlung) und die Fähigkeit von Ret-Fc, die Autophosphorylierung zu blockieren, legt nahe, dass Ret direkt aktiviert wird, eher als dass es eine Konsequenz der Phosphorylierung eines anderen Rezeptors ist.
Quervernetzungsstudien unterstützen die Hypothese, dass die effiziente Assoziation von Ret mit GDNF von GDNFR abhängig ist. Die Quervernetzung von GDNF mit Ret in NGR-38 Zellen, die hohe Konzentrationen an GDNFR exprimieren, ist stark, jedoch sind in parentalen Neuro-2a Zellen quervernetzte Produkte kaum nachweisbar. Obwohl die eindeutige Identifikation sämtlicher quervernetzter Komplexe schwierig ist, beweisen die Daten klar eine Assoziation von Ret mit GDNF, die abhängig von der Gegenwart von GDNFR ist und weisen nach, dass GDNFR in einigen der kreuzvernetzten Produkte enthalten ist. Der Grund für das Vorhandensein von quervernetzten Nebenspezies in Neuro-2a Zellen ist nicht klar. Während die Expression der GDNFR mRNA in Neuro-2a Zellen nicht durch Northern Blot nachgewiesen werden konnte, ist es möglich, dass GDNFR in diesen Zellen in sehr geringen Mengen exprimiert wird.
Die Tatsache, dass Ret durch GDNF in kultivierten Motoneuronen des Rückenmarks von Rattenembryonen aktiviert werden kann, zeigt weiterhin die biologische Relevanz der Ret-GDNF-Interaktion. Diese Zellen sind ein primäres Ziel von GDNF in vivo und es konnte gezeigt werden, dass sie auf geringe Dosen des GDNF in vitro ansprechen (Henderson et al., 1994). Die Stimulation der Ret-Phosphorylierung wurde aufgehoben, als die Motoneuronzellen mit PI-PLC vorbehandelt wurden (Daten nicht gezeigt), was nahe legt, dass die Aktivierung von Ret durch GDNF GDNFR benötigt.
Obwohl die Bindung des Liganden an die extrazelluläre Domäne des Rezeptors der erste Schritt bei der Aktivierung anderer bekannter Rezeptor-PTKs ist, haben die vorliegenden Daten gezeigt, dass dies für GDNF und Ret nicht der Fall ist. 13 zeigt ein Modell für die Bindung von GDNF an GDNFR und Ret und die anschließende Aktivierung der Ret-PTK in Antwort auf GDNF. Das initiale Ereignis in diesem Prozess ist die Bindung des Disulfid-verknüpften dimeren GDNF an GDNFR entweder in monomerer oder dimerer Form. Obwohl es zur Zeit keinen direkten Hinweis auf die Existenz eines dimeren GDNFR gibt, traten zwei Klassen von Bindungsstellen auf, als 293T Zellen mit GDNFR cDNA transfiziert wurden. Die einfachste Erklärung für diese Beobachtung ist die Existenz von monomerem und dimerem GDNFR, jeweils mit seiner eigenen Liganden-Bindungsaffinität. Dies stimmt überein mit der Feststellung, dass die GDNF-Bindungsaffinitäten offensichtlich durch die Gegenwart von Ret nicht beeinträchtigt werden. Da die vorliegenden Experimente nicht die Frage untersuchen, ob dimeres GDNFR in der Gegenwart von GDNF im Gleichgewicht mit seinem Monomer auftritt, oder ob die Dimerisierung durch GDNF-Bindung induziert wird, werden diese Möglichkeiten als alternative Wege dargelegt. Der Komplex, der aus dimerem GDNFR und dimerem GDNF besteht, kann zwei Moleküle Ret binden, was einen aktiven Signalgebungskomplex bildet. Wie bei anderen PTKs führt der enge Kontakt zwischen den intrazellulären katalytischen Domänen der beiden Ret-Moleküle vermutlich zu einer Rezeptor-Autophosphorylierung. Diese Ansicht, dass Ret durch diesen Mechanismus funktioniert, wird von der Tatsache unterstützt, dass die MEN2A-Mutation, die eine stationäre Dimeri sierung von Ret verursacht, zu einer konstitutiven Aktivierung der Ret-Kinase führt (Santoro et al., 1995).
Von Motoneuronen wurde berichtet, dass sie auf GDNF mit einer so niedrigen ED₅₀ wie 5 fM ansprechen (Henderson et al., 1994). Obwohl es schwierig ist, die Bindungsaffinität mit der ED₅₀ für eine biologische Antwort zu vergleichen, ist es möglich, dass GDNF-Bindungsstellen mit sehr hoher Affinität auf diesen Zellen existieren. Von anderen Zellen wie z. B. sympathischen Neuronen des Hühnchenembryos wurde berichtet, dass sie GDNF mit einer Kd von 1–5 nM binden (Trupp et al., Journal Of Cell Biology. 130, 137–148, 1995). Es ist unwahrscheinlich, dass GDNFR an einem Rezeptorkomplex mit Stellen mit solch einer geringen Affinität beteiligt ist, aber eine schwache direkte Interaktion zwischen GDNF und Ret könnte vorhanden sein.
Die Expression von c-Ret wurde während der Embryogenese in vielen Zelllinien des sich entwickelnden zentralen und peripheren Nervensystems beobachtet, einschließlich der Zellen des enterischen Nervensystems (Pachnis et al., Development, 119, 1005–1017, 1993; Tsuzuki et al., 1995). Außerhalb des Nervensystems wurde eine c-Ret Expression in dem Wolffschen Gang, dem Epithel der Ureterknospe und in den Sammelröhren der Niere nachgewiesen (Pachnis et al., s.o.; Tsuzuki et al., 1995). Die Ret-Expression wurde außerdem in sämtlichen Neuroblastomzelllinien nachgewiesen, die von der Neuralleiste abgeleitet sind (Ikeda et al., 1990) sowie von chirurgisch entfernten Neuroblastomen (Nagao et al., 1990; Takahashi & Cooper, 1987). Die GDNF-Expression wurde sowohl im ZNS als auch im PNS beobachtet, ebenso in nicht-neuronalen Geweben während der Embryonalentwicklung. Die Mengen der GDNF-Expression, die in vielen nicht-neuronalen Geweben festgestellt wurde, waren höher als im Nervensystem (Choi-Lundberg und Bohn, Brain Res. Dev. Brain Res. 85, 80–88, 1995). Obwohl die Expression von GDNFR nicht ausführlich untersucht wurde, wies eine erste Northern Blot-Analyse das Vorhandensein hoher Konzentrationen der GDNF mRNA in der Leber, dem Hirn und der Niere von adulten Ratten und Mäusen nach. Die Ähnlichkeit der Expressionsmuster von Ret, GDNF und GDNFR in dem sich entwickelnden Nervensystem und der Niere stimmt mit ihrer kombinierten Wirkung während der Entwicklung überein.
Es wurde postuliert, dass die Nierenentwicklung des Säugers aus den reziproken Interaktionen zwischen dem Metanephron und dem sich entwickelnden Ureters resultiert, einem Zweig, der sich aus dem kaudalen Teil des Wolffschen Gang entwickelte (Saxen, Organogenesis of the kidney. Development and Cell Biology series, Cambridge University Press, Cambridge, England, 1987). Während die Expression von Ret an der Ureterknospe, jedoch nicht in dem umgebenden Mesenchym in sich entwickelnden Embryos festgestellt wurde, wurde die Expression von GDNF in den undifferenzierten, jedoch nicht adulten metanephrischen Kappe der Niere nachgewiesen. Diese Beobachtungen legen nahe, dass eine Interaktion zwischen GDNF und Ret verantwortlich für die Initiation der Entwicklung der Ureterstruktur ist. Eine weitere Stützung dieser Hypothese wird durch die gezielte Zerstörung der GDNF- und Ret-Gene zur Verfügung gestellt, die zu sehr ähnlichen phänotypischen Funktionsstörungen in der Niere führen (Schuchardt et al., Nature. 367, 380–383, 1994; Sanchez, im Druck). Eine weitere phänotypische Haupt-Funktionsstörung, die sowohl in GDNF (–/–) als auch in Ret (–/–) Knockout-Tieren beobachtet wird, ist der vollständige Verlust der enterischen Neuronen im gesamten Verdauungstrakt. Der Morbus Hirschsprung, eine genetische Störung, die durch das vererbte Fehlen einer parasympathischen Innervierung in dem unteren Verdauungstrakt gekennzeichnet ist, wurde ebenfalls mit "Loss of function"-Mutationen in Ret in Zusammenhang gebracht (Romeo et al., Nature. 367, 377–378, 1994; Edery et al., 1994). Ein späterer Bericht (Angrist et al., Hum. Mol. Genet. 4, 821–830, 1995) zeigte, dass – im Gegensatz zu früheren Beobachtungen – einige Hirschsprung-Patienten keine Mutationen in Ret aufweisen. Es wird nun vorhergesagt, dass solche Patienten Mutationen in GDNF, GDNFR oder einigen anderen wesentlichen Komponenten dieses Signalgebungsweges tragen.
Experimentelle Verfahren
[¹²⁵I]-GDNF-Bindung an Neuro-2a Zellen, die GDNFR exprimieren
Neuro-2a Zellen (ATCC #CCL 131) wurden mit einem Expressionsplasmid wie oben beschrieben unter Verwendung des Calciumphosphat-Transfektionsystems (GIBCO/BRL) in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden nach Expression von dem Plasmid durch Wachstum in 400 μg/ml G418-Antibiotikum (Sigma) selektiert. G418-resistente Klone wurden expandiert und auf GDNFR-Expression durch Bindung an [¹²⁵I]-GDNF untersucht (Amersham, Inc., Individuelle Iodierung, Katalog #IMQ1057). Zellen von jedem Klon wurden mit einer Dichte von 3 × 10⁴ Zellen/cm² in Duplikatvertiefungen von 24 Well-Gewebskulturplatten (Becton Dickinson), die mit Polyornithin vorbeschichtet wurden, ausgesät. Die Zellen wurden einmal mit eiskaltem Waschpuffer (DMEM, enthaltend 25 mM HEPES, pH 7,5) gewaschen und anschließend mit 50 pM [¹²⁵I]-GDNF in Bindungspuffer (Waschpuffer plus 0,2% BSA) bei 4°C für vier Stunden entweder in der Gegenwart oder Abwesenheit von 500 mM unmarkiertem GDNF inkubiert. Die Zellen wurden anschließend viermal mit eiskaltem Waschpuffer gewaschen, in 1 M NaOH lysiert, und die mit den Zellen assoziierte radioaktive Markierung wurde in einem 1470 Wizard automatisierten Gammazähler (Wallac Inc.) quantifiziert. Die Menge der GDNFR, der von den einzelnen Klonen exprimiert wurde, wurde durch das Verhältnis des an die Zellen gebundenen [¹²⁵I]-GDNF in der Abwesenheit und Gegenwart von unmarkiertem GDNF bestimmt. Drei Klone wurden als repräsentative Klone für eine hohe, mittlere und geringe Expression des GDNFR zur Verwendung in den Bindungsexperimenten ausgewählt. Die Verhältnisse von [¹²⁵I]-GDNF, das in der Abwesenheit und Gegenwart von unmarkiertem GDNF gebunden war, betrug für diese Klone: NGR-38) 16:1, NGR-16) 12,8:1 und NGR-33) 8:1. Die Gleichgewichtsbindung von [¹²⁵I]-GDNF an NGR-38 Zellen wurde wie oben beschrieben ausgeführt, außer dass die Konzentrationen des markierten GDNF im Bereich von 0,5 pM bis 1 nM lagen. In sämtlichen Assays wurde die unspezifische Bindung, wie sie anhand der Bindung der radioaktiven Markierung an Zellen in Gegenwart von 500 nM unmarkiertem GDNF abgeschätzt wurde, wurde von der Bindung in Abwesenheit von unmarkiertem GDNF abgezogen. Die Bindungsdaten wurden mit Hilfe eines Scatchard-Plots analysiert.
Chemische Quervernetzung
Neuro-2a oder NGR-38 Zellen wurden einmal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,1) gewaschen, anschließend für vier Stunden bei 4°C mit 1 oder 3 nM [¹²⁵I]-GDNF in Bindungspuffer in der Gegenwart oder Abwesenheit von 500 nM unmarkiertem GDNF behandelt. Nach der Bindung wurden die Zellen viermal mit eiskaltem Waschpuffer gewaschen und bei Raumtemperatur für 45 Minuten mit 1 mM Bissuberat (BS³, Pierce) in Waschpuffer inkubiert. Die Quervernetzungsreaktion wurde durch dreimaliges Waschen der Zellen mit Tris-gepufferter Salzlösung (TBS, pH 7,5) gestoppt. Die Zellen wurden anschließend entweder direkt in SDS-PAGE-Probenpuffer (80 mM Tris HCl [pH 6,8], 10% Glycerol, 1% SDS, 0,025% Bromphenol blau) oder in Triton X 100-Lysepuffer (50 mM Hepes, pH 7,5, 1% Triton X-100, 50 mM NaCl, 50 mM NaF, 10 mM Natriumpyrophosphat, 1% Aprotinin (Sigma, Kat. #A-6279), 1 mM PMSF (Sigma, Kat. #P-7626), 0,5 mM Na₃VO₄ (Fisher, Kat. #S454-50) lysiert. Die Lysate wurden durch Zentrifugation geklärt, mit 5 μg/ml anti-Ret Antikörper (Santa Cruz Antibody, C-19, Kat. #SC-167) inkubiert, und die resultierenden Immunkomplexe wurden durch Präzipitation mit Protein-A-Sepharose CL-4B (Pharmacia) gesammelt. Die Immunpräzipitate wurden dreimal mit dem Lysepuffer gewaschen, einmal mit 0,5% NP-40, enthaltend 50 mM NaCl und 20 mM Tris-Cl, pH 7,5 und wurden anschließend in SDS-PAGE Probenpuffer resuspendiert. Sowohl die Gesamtzelllysate als auch die Immunpräzipitate wurden mit Hilfe eines 7,5% SDS-PAGE mit einem Verhältnis von Bis:Acrylamid von 1:200 aufgetrennt.
Western Blot-Analyse
Die Autophosphorylierung des Ret-Rezeptors wurde mit Hilfe der Western Blot-Analyse untersucht. Kurz beschrieben wurden die Zellen 24 Stunden vor dem Assay in 6-Well-Gewebskulturschalen mit einer Dichte von 1,5 × 10⁶ Zellen/Vertiefung ausgesät. Die Zellen wurden einmal mit Bindungspuffer gewaschen und mit unterschiedlichen Konzentrationen verschiedener Reagenzien (einschließlich GDNF, PI-PLC, PI-PLC/CM und Ret-Fc Fusionsprotein), entweder allein oder in Kombination, in Bindungspuffer für verschiedene Zeitspannen behandelt. Die behandelten Zellen und unbehandelten Kontrollen wurden in Triton X-100 Lysepuffer lysiert und mit dem anti-Ret Antikörper (Santa Cruz, C-19, Kat. #SC-167) und Protein-A-Sepharose wie oben beschrieben immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden mit Hilfe der SDS-PAGE fraktioniert und auf Nitrocellulose-Membranen wie von Harlow und Lane beschrieben transferiert (Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, New York, 1988). Die Membranen wurden mit 5% BSA (Sigma) vorgeblockt und der Grad der Tyrosinphosphorylierung auf dem Rezeptor wurde durch Blotten der Membran mit einem anti-Phosphotyrosin monoklonalen Antikörper 4G10 (UBI, Kat. #05-321) bei Raumtemperatur für zwei Stunden bestimmt. Die Menge des Proteins, die in jeder Spur vorhanden war, wurde durch Strippen und erneute Untersuchung derselben Membrane mit dem anti-Ret Antikörper bestimmt. Schließlich wurde die Membran mit Chemilumineszenz-Reagenzien (ECL, Amersham) in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers behandelt und auf Röntgenfilmen exponiert (Hyperfilm-ELC, Amersham).
Behandlung der Zellen mit PI-PLC und Herstellen von PI-PLC-behandeltem konditioniertem Medium
Um den GPI-verankerten GDNFR von der Zelloberfläche freizusetzen, wurden die Zellen einmal mit Waschpuffer gewaschen, anschließend mit 1 U/ml Phosphatidylinositol-spezifischer Phospholipase C (PI-PLC, Boehringer Mannheim Kat. #1143069) in Bindungspuffer bei 37°C für 45 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden anschließend dreimal mit Waschpuffer gewaschen und für das Ret-Autophosphorylierungsassay oder die Quervernetzung weiter verarbeitet. Zur Erzeugung von PI-PLC-behandeltem konditioniertem Medium (PI-PLC/CM) wurden 8 × 10⁶ Zellen durch Behandlung der Zellen mit PBS, enthaltend 2 mM EDTA, bei 37°C für 5 bis 10 Minuten von den Gewebskulturschalen entfernt. Die Zellen wurden einmal mit Waschpuffer gewaschen, in 1 ml Bindungspuffer, enthaltend 1 U/ml PI-PLC resuspendiert und bei 37°C für 45 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden pelletiert und das PI-PLC/CM wurde gewonnen.
Herstellen des Ret-Fc Fusionsproteins
Eine cDNA, welche die gesamte kodierende Region von c-Ret umfasst, wurde aus einer Plazenta-cDNA-Bibliothek einer Tag 17-Ratte unter Verwendung einer Oligonukleotidsonde isoliert, die den ersten 20 Aminosäuren des c-Ret der Maus entspricht (Iwamoto et al., 1993; van Heyningen, 1994). Die für die extrazelluläre Domäne des Ret-Rezeptors kodierende Region (die mit der letzten Aminosäure, R636, endet) wurde im Leserahmen mit der für die Fc-Region des humanen IgG (IgG1) kodierenden DNA fusioniert und in den Expressionsvektor pDSR2 wie zuvor beschrieben subkloniert (Bartley et al., Nature. 368, 558–560, 1994). Das Ret-Fc/pDSRa2-Plasmid wurde in Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO Zellen) transfiziert, und das rekombinante Ret-Fc Fusionsprotein wurde mit Hilfe einer Affinitätschromatografie unter Verwendung einer Ni⁺⁺-Säule (Qiagen) gereinigt.
Herstellen von Kulturen des Motoneurons aus dem Rückenmark der embryonalen Ratte
Angereicherte embryonale Ratten-Rückenmarks-Motoneuron-Kulturen wurden aus dem gesamten Rückenmark von E15-Sprague-Dawley Rattenföten 24 Stunden vor den Experimenten hergestellt. Die Rückenmärke wurden präpariert und die Meningen und dorsalen Wurzelganglien (DRGs) wurden entfernt. Die Rückenmärke wurden in kleinere Fragmente geschnitten und mit Papain in L15-Medium verdaut (Papain Kit, Worthington). Die Motoneurone, die größer als andere Zellarten sind, die in der dissoziierten Zellsuspension vorhanden waren, wurden unter Verwendung eines 6,8% Metrizamid-Gradienten angereichert (Camu und Henderson, J Neuroscience. 44, 59–70, 1992). Angereicherte Motoneurone, die sich an dem Übergang zwischen dem Metrizamidkissen und der Zellsuspension befinden, wurden gesammelt, gewaschen und in mit poly-L-Ornithin und Laminin vorbeschichteten Gewebskulturschalen mit einer Dichte von ~9 × 10⁴ Zellen/cm² ausgesät und bei 37°C kultiviert.
Während die vorliegende Erfindung in Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen und beispielhafte Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen beschrieben wurde, ist klar, dass den Fachleuten auf dem Gebiet Variationen und Modifikationen einfallen werden. Daher ist beabsichtigt, dass die angefügten Ansprüche sämtliche äquivalente Variationen, die in den Bereich der beanspruchten Erfindung fallen, abdecken.
Referenzen

Angrist, M., Bolk, S., Thiel, B., Puffenberger, E. G., Hofstra, R. M., Buys, C. H., Cass. D. T. und Chakravarti, A. (1995). Mutation analysis of the RET receptor tyrosine kinase in Hirschsprung disease. Hum. Mol. Genet. 4, 82–830.
Arenas, E., Trupp, M., Akerud, P. und Ibanez, C. F. (1995). Gliazelllinie Prevents degeneration and promotes the phenotype of brain noradrenergic neurons in vivo. Neuron 15, 1465–1473.
Aruffo, A. und Seed, B. (1987). Molecular cloning of a CD28 cDNA by a high-efficiency COS cell expression system. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 84, 8573–8577.
Bartley, T. D., Hunt, R. W., Welcher, A. A., Boyle, W. J., Parker, V. P., Lindberg, R. A., Lu, H. S., Colombero, A. M., Elliott, R. L., Guthrie, B. A., Holst, P. L., Skrine, J. D., Toso, R. J., Zhang, M., Fernandez, E., Trail, G., Varnum, B., Yarden, Y., Hunter, T. und Fox, G. M. (1994). B61 is a Ligand for the ECK Receptor protein-tyrosine kinase. Nature. 368, 558–560.
Beck, K. D., Valverde, J., Alexi, T., Poulsen, K., Moffat, B., Vandlen, R. A., Rosenthal, A. und Hefti, F. (1995). Mesencephalic dopaminergic neurons protected by GDNF from axotomy-induced degeneration in the adult brain. Nature. 373, 339–341.
Camu, W. und Henderson, C. (1992). Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. J. Neuroscience. 44, 59–70.
Choi-Lundberg, D. L. und Bohn, M. C. (1995). Ontogeny and distribution of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA in rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 85, 80–88.
Davis, S., Aldrich, T. H., Valenzuela, D. M., Wong, V. V., Furth, M. E., Squinto, S. P. und Yancopoulos, G. D. (1992). The receptor for ciliary neurotrophic factor. Science. 253, 59–63.
Donis-Keller, H., Dou, S., Chi, D., Carlson, K., Toshima, K., Lairmore, T., Howe, J., Moley, J., Goodfellow, P. und Wells, S. (1993), Mutations in the ret proto-oncogene are associated with MEN2A and FMTC. Hum. Molec. Genet. 2, 851–856.
Ebendal, T., Tomac, A., Hoffer, B. J. und Olson, L. (1995). Glial cell line-derived neurotrophic factor stimulates fiber formation and survival in cultured neurons from peripheral autonomic ganglia. Journal Of Neuroscience Research. 40, 276–284.
Economides, A. N., Ravetch, J. V., Yancopoulos, G. D. und Stahl, N. (1995). Designer cytokines: targeting actions to cells of choice. Science 270, 1351–1353.
Edery, P., Lyonnet, S., Mulligan, L., Pelet, A., Dow, E., Abel, L., Holder, S., Nihoul-Fekete, C., Ponder, B. und Munnich, A. (1994). Mutations of the ret proto-oncogene in Hirschsprug's disease. Nature. 367, 378–380.
Gearing, D. P., King, J. A., Gough, N. M. und Nicola, N. A. (1989). Expression cloning of a receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. EMBO Journal 8, 3667–3676.
Henderson, C. E., Phillips, H. S., Pollock, R. A., Davies, A. M., Lemeulle, C., Armanini, M., Simpson, L. C., Moffet, B., Vandlen, R. A., Koliatsos, V. E. und et al (1994). GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266, 1062–1064.
Hoffer, B. J., Hoffman, A., Bowenkamp, K., Huettl, P., Hudson, J., Martin, D., Lin, L. F. und Gerhardt, G. A. (1994). Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induces injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neuroscience Letters. 182, 107–111.
Hofstra, R., Landsvater, R., Ceccherini, I., Stulp, R., Stelwagen, T., Luo, Y., Pasini, B., Hoppener, J., van Amstel, H., Romeo, G., Lips, C. und Buys, C. (1994). A mutation in the ret proto-oncogene associated with multipleendocrine neoplasia type 2B and sporadic medullary thyroid carcinoma. Nature. 367, 375–376.
Ikeda, I., Ishizaka, Y., Tahira, T., Suzuki, T., Onda, M., Sugimura, T. und Nagao, M. (1990). Specific expression of the ret proto-oncogene in human neuroblastoma cell lines. Oncogene. 5, 1291–1296.
Ip, NY., Nye, S. H., Boulton, T. G., Davis, S., Yasukawa, K., Kishimoto, T., Anderson, D. J. und et al (1992). CNTF and LIF act on neuronal cells via shared signaling pathways that involve the IL-6 signal transducing receptor component gp 120. Cell. 69, 1121–1132.
Iwamoto, T., Taniguchi, M., Asia, N., Ohkusu, K., Nakashima, I. Und Takahashi, M. (1993). CDNA cloning of mouse ret proto-oncongene and its sequence similarity to the cadherin superfamily. Oncogene. 8, 1087–1091.
Jing, S. Q., Spencer, T., Miller, K., Hopkins, C. und Trowbridge, I. S. (1990). Role of the human transferrin receptor cytoplasmic domain in endocytosis: localization of a specific signal sequence for internalization. Journal Of Cell Biology. 110, 283–294.
Kearns, C. M. und Gash, D. M. (1995). GDNF protects nigral dopamine neurons against 6-hydroxydopamine in vivo. Brain Research. 672, 104–111.
Kozak, M. (1987). An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15, 8125–8148.
Li, L., Wu, W., Lin, L. F., Lei, M., Oppenheim, R. W. und Houenou, L. J. (1995). Rescue of adult mouse motoneurons from injury-induced cell death by glial cell line-derived neurotrophic factor. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States of America. 92, 9771–9775.
Lin, L-F. H., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S. und Collins, F. (1993). GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science. 260, 1130–1132.
Louis, J. C., Magal, E. und Varon, S. (1992). Receptor-mediated toxicity of norepinephrine on cultured catecholaminergic neurons of the rat brain stern. Journal Of Pharmacology And Experimental Therapeutics. 262, 1274–1283.
Mount, H. T., Dean, D. O., Alberch, J., Dreyfus, C. F. und Black, I. B. (1995). Glial cell line-derived neurotrophic factor promotes the survival and morphologic differentiation of Purkinje cells. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America, 92, 9092–9096.
Mulligan, L., Kwok, J., Healey, C., Elsdon, M., Eng, C., Gardner, E., Love, D., Mole, S., Moore, J., Papi, L., Ponder, M., Telenius, H., Tunnacliffe, A. und Ponder, A. (1993). Germ-line mutations of the ret proto-oncongene in multiple endocrine neoplasia type 2A. Nature. 363, 458–460.
Oppenheim, R. W., Houenou, L. J., Johnson, J. E., Lin, L. F., Li, L., Lo, A. C., Newsome, A. L., Prevette, D. M. und Wang, S. (1995). Developing motor neurons rescued from programmed and axotomy-induced cell death by GDNF. Nature. 373, 344–346.
Pachnis, V., Mankoo, B. und Constantini, F. (1993). Expression of the c-ret proto-oncogene during mouse embryogenesis. Development, 119, 1005–1017.
Pearson, W. R. und Lipman, D. J. (1988). Improved tools for biological sequence comparison. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States OF America. 85, 2444–2448.
Poulsen, K. T., Armanini, M. P., Klein, R. D., Hynes, M. A., Phillips, H. S und Rosenthal, A. (1994). TGF beta 2 and TGF beta 3 are potent survival factors for midbrain dopaminergic neurons. Neuron. 13, 1245–1252.
Romeo, G., Patrizia, R., Luo, Y., Barone, V., Seri, M., Ceccherini, I., Pasini, B., Bocciardi, R., Lerone, M., Kaariainen, H. und Maartucciello, G. (1994). Point mutations affecting the tyrosine kinase domain of the ret proto-oncogene in Hirschsprung's disease. Nature. 367, 377–378.
Santoro, M. Carlomagno, F., Romeo, A., Bottaro, D., Dathan, N., Grieco, M., Fusco, A., Vecchio, G., Matoskova, B., Kraus, M. und Di Fiore, P. (1995). Activation of ret as a dominant transforming gene by germline mutations of MEN2A and MEN2B. Science. 267, 381–383.
Sauer, H., Rosenblad, C. und Bjoerklund, A. (1995). Glial cell line-derived neurotrophic factor but not transforming growth factor beta 3 prevents delayed degeneration of nigral dopaminergic neurons following striatal 6-hydroxydopamine lesion. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States OF America. 92, 8935–8939.
Saxen, L. (1987). Organogenesis of the kidney. Development and Cell Biology series, Cambridge University Press, Cambridge, England.
Schaar, D. G., Sieber, B. A., Dreyfus, C. F. und Black, I. B. (1993). Regional and cellspecific expression of GDNF in rat brain. Experimental Neurology. 124, 368–371.
Schaar, D. G., Sieber, B. A., Sherwood, A. C., Dean, D., Mendoza, G., Ramakrishnan, L., Dreyfus, C. F. und Black, I. B. (1994). Multiple astrocyte transcripts encode nigral trophic factors in rat and human. Experimental Neurology. 130, 387–393.
Schlessinger, J. und Ullrich, A. (1992). Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron 9, 383–391.
Schuchardt, A., D'Agati, V., Larsson-Blomberg, L., Constantini, F. und Pachnis, V. (1994). Defects in the kidney and enteric nervous system of mice lacking the tyrosine kinase receptor ret. Nature. 367, 380–383.
Segarini, P. R., Ziman, J. M., Kane, C. J. und Dasch, J. R. (1992). Two novel patterns of transforming growth factor beta (TGF-beta) binding to cell surface proteins are dependent upon the binding of TGF-beta 1 and indicate a mechanism of positive cooperativity. Journal Of Biological Chemistry. 267, 1048–1053.
Springer, J. E., Mu, X., Bergmann, L. W. und Trojanowski, J. Q. (1994). Expression of GDNF mRNA in rat and human nervous tissue. Experimental Neurology. 127, 167–170.
Stroemberg, I., Bjoerklund, L., Johansson, M., Tomac, A., Collins, F., Olson, L., Hoffer, B. und Humpel, C. (1993). Glial cell line-derived neurotrophic factor is expressed in the developing but not adult striatum and stimulates developing dopamine neurons in vivo. Experimental Neurology. 124, 401–412.
Takahashi, M., Ritz, J. und Cooper, G. (1985). Activation of a novel human transforming gene, ret, by DNA rearrangement. Cell. 42, 581–588.
Takahashi, M. und Cooper, G. (1987). Ret transforming gene encodes a fusion protein homologous to tyrosine kinases. Mol. Cell. Biol., 7, 1378–1385.
Takebe, Y., Seiki, M., Fujisawa, H., Hoy, P., Yokota, K., Arai, K., Yoshida, M. und Arai, N. (1988). Sra promoter: an efficient and versatile mammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40 early promoter and the R-U5 segment of human T-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat. Mol. Cell. Biol. 8, 466–472.
Tomac, A., Lindqvist, E., Lin, L. F., Ogren, S. O., Young, D., Hoffer, B. J. und Olson, L. (1995a). Protection and repair of the nigrostriatal dopaminergic system by GDNF in vivo. Nature. 373, 335–339.
Tomac, A., Widenfalk, J., Lin, L. F., Kohno, T., Ebendal, T., Hoffer, B. J. und Olson, L. (1995b). Retrograde axonal transport of glial cell line-derived neurotrophic factor in the adult nigrostriatal system suggests a trophic role in the adult. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States OF America. 92, 8274–8278.
Trupp, M., Ryden, M., Joernvall, H., Funakoshi, H., Timmusk, T., Arenas, E. und Ibanez, C. F. (1995). Peripheral expression and biological activities of GDNF, a new neurotrophic factor for avian and mammalian peripheral neurons. Journal Of Cell Biology. 130, 137–148.
Tsuzuki, T., Takahashi, M., Asai, N., Iwashita, T., Matsuyama, M. und Asai, J. (1995). Spatial and temporal expression of the ret proto-oncongene product in embryonic, infant and adult rat tissues. Oncogene, 10, 191–198.
Ullrich, A. und Schlessinger, J. (1990). Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Cell, 61, 203–211.
van der Geer, P., Hunter, T. und Lindberg, R. A. (1994). Receptor proteintyrosine kinases and their signal transduction pathways. 10, 251–337.
van Heyningen, V. (1994). One gene-four syndromes. Nature, 367, 319–320.
von Heijne, G. (1986). A new method for predicting signal sequence cleavage sites. Nucleic Acids Research. 14, 4683690.
Yan, Q., Matheson, C. und Lopez, O. T. (1995). In vivo neurotrophic effects of GDNF on neonatal and adult facial motor neurons. Nature. 373, 341–344.
Zurn, A. D., Baetge, E. E., Hammang, J. P., Tan, S. A. und Aebischer, P. (1994). Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), a new neurotrophic factor for motoneurones. Neuroreport. 6, 113–118.

Sequenzprotokoll

Claims

Ein isoliertes und gereinigtes neurotropher Faktor-Rezeptorprotein (neurotrophic factor receptor protein), das eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (a) einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2; (b) einer Aminosäuresequenz, die Ser¹⁸ bis Pro⁴⁴⁶ der SEQ ID NR: 2 umfasst; (c) einer Aminosäuresequenz, die Asp²⁵ bis Leu⁴⁴⁷ der SEQ ID NR: 2 umfasst; und (d) einer Aminosäuresequenz, die Cys²⁹ bis Cys⁴⁴² der SEQ ID NR: 2 umfasst; wobei das Protein fähig ist, mit dem von einer Gliazelllinie stammenden neurotrophen Faktor (glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF) zu komplexieren und dadurch eine Zellantwort auf GDNF zu vermitteln.
Das Protein gemäß Anspruch 1, welches glycosyliert ist.
Das Protein gemäß Anspruch 1, welches nicht glycosyliert ist.
Das Protein gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, das durch Rekombinationstechnologie oder chemische Synthese erhältlich ist.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beanspruchtes Protein in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein neurotropher Faktor-Rezeptorprotein kodiert, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 umfasst; (b) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein neurotropher Faktor-Rezeptorprotein kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, welche Ser¹⁸ bis Pro⁴⁴⁶ der SEQ ID NR: 2 umfasst; (c) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein neurotropher Faktor-Rezeptorprotein kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die Asp²⁵ bis Leu⁴⁴⁷ der SEQ ID NR: 2 umfasst; (d) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein neurotropher Faktor-Rezeptorprotein kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die Cys²⁹ bis Cys⁴⁴² der SEQ ID NR: 2 umfasst; (e) eine Nukleinsäuresequenz, die eine in SEQ ID NR: 1 dargestellte Sequenz umfasst, welche die für Met¹ bis Ser⁴⁶⁵ kodierenden Nukleotide umfasst, wobei die genannte Sequenz für ein neurotropher Faktor-Rezeptorprotein (GDNFR) kodiert; (f) eine Nukleinsäuresequenz, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die (1) mit einer komplementären Sequenz von (e) hybridisiert und (2) für eine Aminosäuresequenz mit GDNFR-Aktivität kodiert; und (g) eine Nukleinsäuresequenz, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die aber aufgrund der Degeneration des genetischen Codes mit einer komplementären Sequenz von (e) hybridisieren würde und (2) für eine Aminosäuresequenz mit GDNFR-Aktivität kodiert; wobei die Sequenz, die in (f) oder (g) definiert wird, nicht die Nukleotidsequenz einschließt, die für das in SEQ ID NR: 4 dargestellte Protein kodiert; wobei die Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungsbedingungen stattfindet und wobei das Protein gemäß (a) bis (g) fähig ist, mit dem von Gliazelllinien stammenden neurotrophen Faktor (GDNF) zu komplexieren und dadurch eine Zellantwort auf GDNF zu vermitteln.
Ein Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 6 umfasst, die funktionell mit einem oder mehreren funktionellen Elementen verbunden ist, das/die fähig ist/sind, die Expression der genannten Nukleinsäuresequenz zu bewirken.
Der Vektor gemäß Anspruch 7, wobei der genannte Vektor eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für ein neurotropher Faktor-Rezeptorprotein kodiert, das die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NR: 2 dargestellt umfasst, welche funktionell mit einem oder mehreren funktionellen Elementen verbunden ist, das/die fähig ist/sind, die Expression der genannten Nukleinsäuresequenz zu bewirken.
Eine isolierte Wirtszelle, die mit dem Vektor gemäß Anspruch 7 transformiert oder transfiziert ist.
Die Wirtszelle gemäß Anspruch 9, die mit dem Vektor gemäß Anspruch 8 transformiert ist.
Die Wirtszelle gemäß Anspruch 9, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Säugerzellen und Bakterienzellen.
Die Wirtszelle gemäß Anspruch 11, die eine COS-7 Zelle oder E. coli ist.
Die Wirtszelle gemäß Anspruch 9, wobei die genannte Zelle für die humane Implantation geeignet ist und wobei die genannte Zelle den genannten neurotropher Faktor-Rezeptor exprimiert und sezerniert.
Die Wirtszelle gemäß Anspruch 10, wobei die genannte Zelle für die humane Implantation geeignet ist und wobei die genannte Zelle den genannten neurotropher Faktor-Rezeptor exprimiert und sezerniert.
Die Wirtszelle gemäß Anspruch 9, wobei die genannte Zelle ex vivo transformiert oder transfiziert wird.
Die Wirtszelle gemäß Anspruch 9, wobei die genannte Zelle in einer semipermeablen Membran eingeschlossen ist, die für die humane Implantation geeignet ist.
Ein Verfahren zur Herstellung des neurotropher Faktor-Rezeptorproteins gemäß Anspruch 1, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Kultivieren einer Wirtszelle, die eine Nukleinsäuresequenz enthält, die für ein neurotropher Faktor-Rezeptorprotein gemäß Anspruch 1 kodiert, das eine A minosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (i) einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 2; (ii) einer Aminosäuresequenz, die Ser¹⁸ bis Pro⁴⁴⁶ der SEQ ID NR: 2 umfasst; (iii) einer Aminosäuresequenz, die Asp²⁵ bis Leu⁴⁴⁷ der SEQ ID NR: 2 umfasst; und (iv) einer Aminosäuresequenz, die Cys²⁹ bis Cys⁴⁴² der SEQ ID NO: 2 umfasst; unter Bedingungen, die für die Expression des genannten neurotropher Faktor-Rezeptorproteins durch die genannte Wirtszelle geeignet sind; und (b) optional, Isolieren des genannten neurotropher Faktor-Rezeptorproteins, das von der genannten Wirtszelle exprimiert wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die Wirtszelle mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 6 transformiert oder transfiziert ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18, das weiterhin den Schritt der Rückfaltung des isolierten neurotropher Faktor-Rezeptors umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18, wobei die genannte Wirtszelle eine prokaryontische Zelle ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18, wobei die genannte Wirtszelle eine eukaryontische Zelle ist.
Das gereinigte neurotropher Faktor-Rezeptorprotein gemäß Anspruch 1, das durch das Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18 erhältlich ist.
Das gereinigte neurotropher Faktor-Rezeptorprotein gemäß Anspruch 1 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung eines neurotropher Faktor-Rezeptorproteins gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Parkinsonschen Krankheit.
Verwendung eines neurotropher Faktor-Rezeptorproteins gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Alzheimerschen Krankheit.
Verwendung eines neurotropher Faktor-Rezeptorproteins gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der amyotrophen lateralen Sklerose.
Ein Antikörper, der spezifisch an ein neurotropher Faktor-Rezeptorprotein bindet, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 umfasst.
Der Antikörper gemäß Anspruch 27, wobei der genannte Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Der Antikörper gemäß Anspruch 27, wobei der genannte Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist.
Der Antikörper gemäß Anspruch 27, wobei der genannte Antikörper durch Immunisieren eines Tieres mit einem neurotropher Faktor-Rezeptorprotein erhältlich ist, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 umfasst.
Ein Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper produziert, der spezifisch an ein neurotropher Faktor-Rezeptorprotein bindet, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 umfasst.
Eine Vorrichtung zur Behandlung eines Nervenschadens, umfassend: (a) eine semipermeable Membran, die zur Implantation geeignet ist; und (b) Zellen, die in der genannten Membran eingekapselt sind, wobei die genannten Zellen ein neurotropher Faktor-Rezeptorprotein gemäß Anspruch 1 sezernieren; wobei die genannte Membran für das neurotropher Faktor-Rezeptorprotein permeabel ist und für Materialien, die schädlich für die genannten Zellen sind, impermeabel ist; und wobei die eingekapselten Zellen Zellen sind, die mit einem Vektor transformiert sind, der die Nukleinsäure gemäß Anspruch 6 umfasst.
Eine Vorrichtung zur Behandlung eines Nervenschadens, umfassend: (a) eine semipermeable Membran, die zur Implantation geeignet ist; und (b) Zellen, die in der genannten Membran eingekapselt sind, wobei die genannten Zellen ein neurotropher Faktor-Rezeptorprotein gemäß Anspruch 1 sezernieren; wobei die genannte Membran für das neurotropher Faktor-Rezeptorprotein permeabel ist und für Materialien, die schädlich für die genannten Zellen sind, impermeabel ist; und wobei die genannten Zellen natürlich vorkommende Zellen sind, die das genannte neurotropher Faktor-Rezeptorprotein sezernieren.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 32, wobei die genannten Zellen modifiziert wurden, damit sie das genannte neurotropher Faktor-Rezeptorprotein mittels einer Nukleinsäuresequenz sezernieren, die umfasst: (a) eine Sequenz, die in Sequenz SEQ ID NR: 1 dargestellt ist, umfassend Nukleotide, die Met¹ bis Ser⁴⁶⁵ kodieren, die für ein neurotropher Faktor-Rezeptorprotein (GDNFR) kodieren, das fähig ist, mit dem von einer Gliazelllinie stammenden neurotrophen Faktor (GDNF) zu komplexieren und die Zellantwort auf GDNF zu vermitteln; (b) eine Nukleinsäuresequenz, die (1) mit einer komplementären Sequenz von (a) hybridisiert und (2) für eine Aminosäuresequenz mit GDNFR-Aktivität kodiert; und (c) eine Nukleinsäuresequenz, die aber aufgrund der Degeneration des genetischen Codes mit einer komplementären Sequenz von (a) hybridisieren würde und (2) für eine Aminosäuresequenz mit GDNFR-Aktivität kodiert; wobei die Sequenz, die in (b) oder (c) definiert wird, nicht die Nukleotidsequenz einschließt, die für das Protein wie in SEQ ID NR: 4 dargestellt kodiert; und wobei die Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungsbedingungen stattfindet.
Eine Assay-Vorrichtung zur Analyse einer Testprobe auf das Vorhandensein des von einer Gliazelllinie stammenden neurotrophen Faktors, umfassend: eine feste Phase, die das GDNFR-Protein gemäß Anspruch 1 enthält oder mit diesem beschichtet ist, wobei das genannte GDNFR-Protein mit GDNF, das in der Testprobe vorhanden ist, reagiert und ein nachweisbares Reaktionsprodukt produziert, welches auf das Vorhandensein von GDNF hinweist.
Ein Verfahren zur Analyse einer Testprobe auf das Vorhandensein des von einer Gliazelllinie stammenden neurotrophen Faktors, umfassend: in Kontakt bringen der Probe mit einem Assayreagenz, welches das GDNFR-Protein gemäß Anspruch 1 umfasst, wobei das genannte GDNFR-Protein mit dem in der Testprobe vorhandenen GDNF reagiert und ein nachweisbares Reaktionsprodukt produziert, welches auf das Vorhandensein von GDNF hinweist.