JPH11514238A - 生物学的に活性なｅｐｈファミリーリガンド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 EphレセプターのElkサブファミリーを結合する新規なリガンド（Efl-6）が同定され、そして生物学的に活性な形態で可溶性Efl-6リガンドを製造する方法が記載される。この新規なタンパク質をコードするcDNAクローンは、組換えタンパク質の産生を可能にし、これはニューロンおよび他のEphレセプターを有する細胞群を支持するために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的に活性なEPHファミリーリガンド 序論 本発明は、Elkレセプターのようなレセプター様タンパク質チロシンキナーゼ のEphサブファミリーに属するタンパク質を結合する新規リガンド、ならびにこ のリガンドの生物学的に活性な可溶性形態を製造する方法を提供する。 発明の背景 ポリペプチドリガンドが細胞を結合しそれによって細胞増殖、生存、または分 化のような表現型応答を誘起する能力は、しばしば膜貫通チロシンキナーゼによ って媒介される。各レセプターチロシンキナーゼ（RTK）の細胞外部分は、その リガンド認識特徴を有するタンパク質を提供するので、一般的には分子の最も特 徴的な部分である。細胞外ドメインへのリガンドの結合は、生物学的シグナルを 細胞内標的タンパク質に伝達する細胞内チロシンキナーゼ触媒ドメインを介する シグナル伝達を生じる。この細胞質の触媒ドメインの配列モチーフの特定の整列 は、潜在的なキナーゼ基質へのその接近を決定する（Mohammadiら，1990，Mol． Cell．Biol．11: 5068-5078；Fantlら，1992，Cell，69:413-413）。 RTKは、リガンド結合後のダイマー化またはいくつかの関連の構造的変化を受 けるようであり（Schlessinger，J.，1988，Trend Biochem．Sci．13:443-447； UllrichおよびSchlessinger，1990，Cell，61:203-212；SchlessingerおよびUll rich，1992，Neuron 9:383-391）；ダイマー化している細胞質ドメイン間の分子 相互作用はキナーゼ機能の活性化を導く。ある場合、例えば、増殖因子である血 小板由来増殖因子（PDGF）の場合、リガンドは２つのレセプター分子を結合する ダイマーであるが（Hartら，1988，Science，240: 1529-1531；Heldin，1989，J ．Biol．Chem．264:8905-8912）、例えば、EGFの場合は、リガンドはモノマーで ある（Weberら，1984，J．Biol．Chem.，259:14631-14636）。 より高等な生物内の特定のチロシンキナーゼレセプターの組織分布は、レセプ ターの生物学的機能についての関連のあるデータを提供する。線維芽細胞増殖因 子（FGF）のようないくつかの増殖および分化因子についてのチロシンキナーゼ レセプターは広く発現され、それゆえ組織増殖および維持にいくつかの一般的な 役割を演じるようである。レセプターのTrk RTKファミリー（GlassおよびYancop oulos，1993，Trends in Cell Biol，3:262-268）のメンバーは、より一般的に は神経系の細胞に限定され、そしてこれらのレセプターを結合するNGF、BDNF、N T-3、およびNT-4/5からなる神経成長因子ファミリー（ニューロトロフィンとし て公知）は、脳および末梢においてニューロンの種々の群の分化を促進する（Li ndsay，R.M，1993，Neurotrophic Factors，S.E．LoughlinおよびJ.H．Fallon編 ，257-284頁(San Diego，CA: Academic Press)）。このようなTrkファミリーレ セプターの１つのtrkBの組織中の局在化は、このレセプター、ならびにこのレセ プターを結合するリガンド（本明細書ではコグネイトという）の潜在的な生物学 的役割への洞察を提供した。したがって、例えば、成体マウスでは、trkBは、脳 組織で優先的に発現されることが見いだされたが、trkB mRNAの顕著なレベルも また肺、筋肉、および卵巣で観察された。さらに、trkB転写物は、中期および後 期妊娠胚で検出された。14および18日齢マウス胚のインサイチュハイブリダイゼ ーション分析は、trkB転写物が、脳、脊髄、脊椎および頭蓋神経節、交感神経系 および種々の神経支配経路の脊椎労幹を含む中枢および末梢神経系に局在化する ことを示した。これは、trkB遺伝子産物が、神経発生および初期神経発育に関連 するレセプターであり得、ならびに成熟神経系で役割を演じることを示唆した。 RTKが発現される細胞性環境は、レセプターに対するリガンドの結合の際に示 される生物学的応答に影響を与え得る。したがって、例えば、Trkレセプターを 発現する神経細胞がそのレセプターを結合するニューロトロフィンに曝される場 合、ニューロンの生存および分化が起こる。同様のレセプターが線維芽細胞によ って発現される場合、ニューロトロフィンへの曝露は線維芽細胞の増殖を生じる （Glassら，1991，Cell 66:405-413）。したがって、細胞外ドメインはリガンド 特異性についてを決定する因子を提供するようであり、そして一旦シグナル伝達 が開始されると、細胞性環境はシグナル伝達の表現型の結果を決定する。 多数のRTKファミリーは、それらの細胞内ドメインにおける配列相同性に基づ いて同定されている。NGFによって利用されるレセプターおよびシグナル伝達経 路は、trkプロトオンコジーンの産物を包含する（Kaplanら，1991，Nature 350: 156-160；Kleinら，1991，Cell 65:189-197）。Kleinら（1989，EMBO J．8:3701 -3709）は、trkBの単離を報告しており、これは、ヒトtrkプロトオンコジーンに 非常に関連することが見いだされたレセプターのチロシンタンパク質キナーゼフ ァミリーの第２のメンバーをコードする。trkBはBDNF、NT-4、およびより少ない 範囲ではNT-3への機能的応答を結合し、そして媒介する（Squintoら，1991，Cel l 65:885-903；Ipら，1992，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．89:3060-3064；Kl einら，1992，Neuron，8:947-956）。アミノ酸レベルでは、trkおよびtrkBの産 物は、細胞外領域において57パーセントの相同性を共有することが見いだされ、 これはtrk中に存在する11システインのうち９を含む。この相同性は、それぞれ のチロシンキナーゼ触媒ドメイン内で88パーセントに増加することが見いだされ た。Trk遺伝子ファミリーは、現在、trkC遺伝子座を含むように広げられており 、NT-3は、trkCに対する好ましいリガンドとして同定されている（Lamballeら， 1991，Cell 66: 967-979；Valenzuelaら，1993，Neuron 10:963-974）。 Eph関連膜貫通チロシンキナーゼは、レセプター様チロシンキナーゼの最大の 公知のファミリーを含み、多くのメンバーは、発生中および成熟神経系において 特異的発現を示す。Ehk（eph相同性キナーゼ）-1および-2と命名されたEph RTK ファミリーの２つの新規なメンバーは、脳において発現される遺伝子のポリメラ ーゼ連鎖反応（PCR）に基づくスクリーニングを使用して同定された（Maisonpie rreら，1993，Oncogene 8:3277-388）。これらの遺伝子は、神経系において排他 的に発現されるようであり、Ehk-1発現は神経発生において初期に開始される。 最近、関連のレセプターのこの群の新しいメンバーであるEhk-3がクローニング された（Valenzuelaら，1995，Oncogene 10:1575-1580）。 elk遺伝子は、ephサブファミリーにも属するレセプター様タンパク質チロシン キナーゼをコードし、そしてこれは脳において（および睾丸においてはより低い レベルで）排他的に発現される（Letwinら，1988; Oncogene 3:621-678；Lhotak ら，1991 Mol．Cell．Biol．11: 2496-2502）。その発現プロフィールに基づい て、Elkレセプターおよびそのコグネイトリガンドは、神経系において細胞相互 作用に対して細胞で役割を演じることが期待される。Elkと同じサブクラス内に 入るレセプターのEphファミリーの他のメンバーは、Nuk/Cek5、Hek2/Sek4、およ びHtkレセプターを含む（BrambillaおよびKlein，1995，Mol．Cell．Neurosci. ，6:487-495、Galeら，1996，Neuron 17:9-19）。 EhkおよびElkレセプターとは異なり、密接に関連したEckレセプターは、より 多面的な様式で機能するようである；これは、神経、上皮、および骨格組織中で 同定されており、そしてマウス胚におけるパターン形成の原腸形成、頭蓋顔面、 および肢芽部位に関連するようである（Ganjuら，1994，Oncogene 9:1613-1624 ）。 多数のレセプターチロシンキナーゼの同定は、それらのコグネイトリガンドの 同定をはるかに越える。よく見ても、このようなレセプターが発現される組織の 決定は、標的組織における細胞の成長、増殖、および再生の調節への洞察を提供 する。RTKが発生中に多くの重要な機能を媒介するようなので、それらのコグネ イトリガンドは、必然的に発生において重要な役割を演じる。 多くのスキームは、同定されている多くのオーファンレセプターに対するコグ ネイトリガンドの同定を考え出しているが、このようなリガンドはあまり同定さ れておらず、そしてこれまでに同定されているリガンドは、それらのコグネイト レセプターを結合する能力以外の活性を有さないようである。例えば、1994年5 月26日に公開された国際公開番号WO/94/11020は、Eckレセプターに結合するリガ ンドを記載する。特に、リガンドEBP（B61としても公知）が記載される。しかし 、EckレセプターへのB61の結合は開示されているが、生物学的活性は記載されて いない。同様に、Elkレセプターを結合するリガンドのPCT公開番号WO94/11384（ 1994年5月26日公開）における記載にもかかわらず、リガンドが、結合した膜と してまたは可溶性リガンドのFcダイマーの形態で存在するかどうかにかかわらず 、生物学的活性は観察されなかった。しかし、Elkレセプターに関して、キメラE GFR-Elkレセプター（Elk細胞質ドメインに融合したEGFRの細胞外ドメインを有す る）は、このレセプターの酵素的ドメインの機能的完全性（EGF刺激した自動リ ン酸化によって測定されるものとして）を証明するために使用されている（Lhot akおよびPawson，1993，Mol．Cell．Biol．13:7071-7079）。 発明の要旨 本発明は、細胞上のElk、Nuk/Cek5、Hek2/Sek4、Htk、およびSek1レセプター に結合する、Efl-6と命名された、新規なポリペプチドリガンドを提供する。よ り重要なことには、本発明は、このリガンドの生物学的に活性な可溶性形態を製 造する手段を提供し、これは、特徴のある機能を促進すること、および／または レセプターを有する細胞の成長および／または増殖のような表現型に影響を与え ることに有用である。本発明はまた、このようなポリペプチドリガンドをコード する核酸、ならびにこのようなタンパク質を産生するための原核生物および真核 生物発現系の両方を提供する。本発明はまた、これらのリガンドに対する抗体を 提供する。 本発明によれば、本明細書に記載のリガンドの可溶性形態は、Elk、Nuk/Cek5 、Hek2/SeK4、Htk、およびSek1レセプター発現細胞における生物学的応答を促進 するために使用され得る。特に、一般的方法が本明細書に記載され、これは、ep h関連レセプターに対するリガンドの「クラスタリング」を生じるか、他の点で 不活性な可溶性リガンドを生物学的に活性にするように機能するか、あるいは、 このようなクラスタリング不在下で、低いレベルの生物学的活性のみを有するリ ガンドの生物学的活性を増強する。 本明細書に記載のリガンドはまた診断的有用性を有する。本発明の特定の実施 態様では、それらの機能または発現における常規逸脱を検出する方法は、神経学 的または他の疾患の診断に使用され得る。 他の実施態様では、リガンドとそれらのコグネイトレセプターとの間の相互作 用の操作は、Ephレセプターリガンドのアゴニストおよびアンタゴニストの両方 を同定するために設計されたアッセイ系で使用され得る。このようなアゴニスト およびアンタゴニストは、神経学的または他の疾患の最終的な処置における使用 について開発され得る。 図面の簡単な説明 図１。Efl-6のヌクレオチドおよびコードされたタンパク質配列。推定シグナ ル配列は、約ヌクレオチド202から約ヌクレオチド273によってコードされる。成 熟タンパク質のコーディング領域は、約ヌクレオチド274で始まりそして約ヌク レオチド1224で終わる。寄託したクローンは698位にＡを有する。この変化はQ(G ln)からR(Arg)へのアミノ酸変化を生じた。推定膜貫通ドメインについてのコー ディング領域を下線で示す。約ヌクレオチド274から約ヌクレオチド873によって コードされる、コードされた細胞外ドメインのアミノ酸配列を、太字で示す。 発明の詳細な説明 本発明は、Elkレセプターに結合する新規なポリペプチドリガンドを提供する 。本発明の新規なポリペプチドリガンドはまた、Nuk/Cek5、Hek2/Sek4、およびH tkを含むEphレセプターのElkサブクラスの他のメンバー、ならびにSek1として知 られる「クロスサブクラス」に公知の唯一のレセプターを結合し得る（Brambill aおよびKlein，1995，Mol．Cell．Neurosci.，6:487-495、Galeら，1996，Neuro n 17:9-19）。したがって、本明細書で使用する場合、「Elk」レセプターとは、 Elk、ならびにElkリガンドを結合することが知られる上記レセプターをいう。 本発明はさらに、Efl-6リガンドの生物学的に活性な可溶性形態を製造する手 段を提供し、これは、特徴のある機能を促進すること、および／またはレセプタ ーを有する細胞の成長および／または増殖のような表現型に影響を与えることに 有用である。本発明はまた、このようなポリペプチドリガンドをコードする核酸 、ならびにこのタンパク質を産生するための原核生物および真核生物発現系の両 方を提供する。本発明はまた、このリガンドに対する抗体を提供する。 本明細書に記載の新規なリガンドは、Efl（Eph膜貫通チロシンキナーゼファミ リーリガンド）-6と命名される。Efl-6をコードするpbluescript SK^-と命名され た寄託を、1995年10月19日にアメリカンタイプカルチャーコレクションで行い、 そして受託番号97319を受けた。 本発明によれば、Elkリガンドの可溶性形態（本明細書ではEfl-6という）は、 Elkレセプター発現細胞中で生物学的応答を促進するために使用され得る。特に 、一般的方法が本明細書に記載され、これは、Efl-6リガンドの「クラスタリン グ」を生じるか、他方では不活性な可溶性リガンドを生物学的に活性にするよう に機能するか、あるいは、このようなクラスタリング不在下で、低いレベルの生 物学的活性のみを有するリガンドの生物学的活性を増強する。 本明細書に記載のEfl-6リガンドはまた診断的有用性を有し得る。本発明の特 定の実施態様では、その機能または発現における異常を検出する方法は、神経学 的または他の疾患の診断に使用され得る。他の実施態様では、リガンドとそのコ グネイトレセプターとの間の相互作用の操作は、神経学的または他の疾患の処置 に使用され得る。 本明細書で使用する場合、Efl-6は、アミノ酸残基がサイレント変化を生じる 配列内の残基を置換する、機能的に等価な分子を包含する。例えば、配列内の１ つ以上のアミノ酸残基は、機能的等価物として作用する同様の極性の別のアミノ 酸によって置換され得、サイレント改変を生じる。配列内のアミノ酸の置換は、 アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎 水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、 フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる。極性中性ア ミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラ ギン、およびグルタミンが含まれる。正の電荷を有する（塩基性）アミノ酸には 、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれる。負の電荷を有する（酸性 ）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。本発明の範囲 内には、タンパク質、あるいは、同じまたは同様の生物学的活性を示すそのフラ グメントまたは誘導体、ならびに、例えば、グリコシル化、タンパク質分解切断 、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって翻訳中または翻訳後 に区別的に改変される誘導体もまた含まれる。 Efl-6を発現する細胞は、適切な発現ベクター中で本明細書に記載のEfl-6をコ ードする核酸の、トランスジェニック動物を介する、トランスフェクション、形 質導入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションによって、上記の ようにこのリガンドを産生するために、まさに天然にまたは遺伝学的に操作され 得る。EFl-6をコードするcDNAを含むベクターは、pBluescriptSK^-Efl-6として、 1995年10月19日にブタペスト条約の規定に基づいてアメリカンタイプカルチャー コレクションに寄託し、ATCC番号97319を与えられる。 本発明は、上記の寄託したプラスミド中に含まれるDNA配列、ならびに、例え ば、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第2版，第1巻，10 1-104頁，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)に定義されるように、穏 やかなストリンジェント条件下でそこに含まれるEfl-6をコードする配列にハイ ブリダイズするDNAおよびRNA配列を包含する。したがって、本発明に包含される 核酸には、寄託物中に含まれるようなおよび図１に記載のような配列、このよう な配列にハイブリダイズしそしてElkレセプターを結合する核酸の配列、および 、遺伝子コードの結果として上記の配列の縮重であるがElkレセプターを結合す る１つまたは複数のリガンドをコードする核酸配列が含まれる。 さらに、本発明は、可溶性形態、短縮型形態、およびタグを付けた形態での、 本明細書に記載のリガンドの使用を意図する。これは、レセプターに結合しそし てアンタゴニストとして機能し得るリガンドのモノマー形態を含む。 ベクター中へのDNAフラグメントの挿入について当業者に公知の方法のいずれ かは、適切な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コーディング配列を使用 して、Efl-6をコードする発現ベクターを構築するために使用され得る。これら の方法は、インビトロ組換えDNAおよび合成技法ならびにインビボ組換え（遺伝 子組換え）を含み得る。Efl-6またはそのペプチドフラグメントをコードする核 酸配列の発現は、タンパク質またはペプチドが組換えDNA分子で形質転換された 宿主中で発現されるように、第２の核酸配列によって調節され得る。例えば、本 明細書に記載のEfl-6の発現は、当該分野で公知の任意のプロモーター／エンハ ンサーエレメントによって制御され得る。リガンドの発現を制御するために使用 され得るプロモーターには、squintoら，（1991，Cell 65:1-20）に記載のよう な長末端反復；SV40初期プロモーター領域（BernoistおよびChambon，1981，Nat ure 290:304-310）、CMVプロモーター、M-MuLV 5'末端反復、ラウス肉腫ウイル スの3'長末端反復に含まれるプロモーター（Yamamotoら，1980，Cell 22:787-79 7）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら，1981，Proc．Natl．A cad．Sci．U.S.A．78:144-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinst erら，1982，Nature 296:39-42）；β-ラクタマーゼプロモーター（Villa-Kamar offら，1978，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．75:3727-3731）またはtacプロモ ーター（DeBoerら，1983，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．80:21-25）のような 原核生物発現ベクター、「Useful proteins from recombinant bacteria」Scien tific American，1980，242:74-94も参照のこと；Gal 4プロモーター、ADH（ア ルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、PGK（ホスホグリセロールキナーゼ ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターのような、酵母または他 の菌類からのプロモーターエレメント、および組織特異性を示しそしてトランス ジェニック動物で利用されている以下の動物転写制御領域：膵小胞体細胞で活性 なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swiftら，1984，Cell 38:639-646；Ornitzら ，1986，Cold Spring Harbor Symp．Quant．Biol．50:399-409；MacDonald，198 7，Hepatology 7:425-515）；膵臓β細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域（H anahan，1985，Nature 315:115-122）、リンパ球で活性な免疫グロブリン遺伝子 制御領域（Grosschedlら，1984，Cell 38:647-658；Adamesら，1985，Nature 31 8 :533-538；Alexanderら，1987，Mol．Cell．Biol．7:1436-1444）、睾丸細胞、 ***細胞、リンパ球、およびマスト細胞で活性なマウス乳ガンウイルス制御領域 （Lederら，1986，Cell 45:485-495）、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域 （Pinkertら，1987，Genes and Devel．1:268-276）、肝臓で活性なα-フェトプ ロテイン遺伝子制御領域（Krumlaufら，1985，Mol．Cell．Biol．5:1639-1648； Hammerら，1987，Science 235：53-58）；肝臓で活性なα 1-アンチトリプシン 遺伝子制御領域（Kelseyら，1987，Genes and Devel．1:161-171）、骨髄性細胞 で活性なβ-グロビン遺伝子制御領域（Mogramら，1985，Nature 315:338-340；K olliasら，1986，Cell 46:89-94）；脳内のオリゴデンドロサイト細胞で活性な ミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readheadら，1987，Cell 48:703-71 2）；骨格筋で活性なミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域（Shani，1985，Nature 314 :283-286）、および視床下部で活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ma sonら，1986，Science 234:1372-1378）を含むが、これらに限定されない。 したがって、本発明によれば、本明細書に記載のようなEfl-6をコードする核 酸を含む細菌または真核生物宿主で複製され得る発現ベクターは、宿主をトラン スフェクトし、それによってこのような核酸の発現を指示して、Efl-6タンパク 質を産生するために使用され、Efl-6タンパク質は次いで生物学的に活性な形態 で回収され得る。本明細書で使用する場合、生物学的に活性な形態には、Elkの ような関連のあるレセプターに結合し得、そして区別された機能を生じるおよび ／またはレセプターを発現する細胞の表現型に影響を与え得る形態が含まれる。 このような生物学的に活性な形態は、例えば、Elkレセプターのチロシンキナー ゼドメインのリン酸化、または細胞性DNAの合成の刺激を誘導する。あるいは、 生物学的に活性なEfl-6リガンドは、レセプターを結合しそしてアンタゴニスト として作用するモノマー形態を含む。 遺伝子挿入物を含む発現ベクターは、３つの一般的アプローチによって同定さ れ得る：(a)DNA-DNAハイブリダイゼーション、(b)「マーカー」遺伝子機能の存 在または不在、および(c)挿入された配列の発現。第１のアプローチでは、発現 ベクターに挿入された外来遺伝子の存在は、挿入されたefl-6遺伝子に相同な配 列を含むプローブを使用するDNA-DNAハイブリダイゼーションによって検出され 得る。第２のアプローチでは、組換えベクター／宿主系は、ベクター中の外来遺 伝子の挿入によって引き起こされる特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チ ミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおけ る封入体形成など）の存在または不在に基づいて同定および選択され得る。例え ば、efl-6遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されるならば、挿入 物を含む組換え体はマーカー遺伝子機能の不在によって同定され得る。第３のア プローチでは、組換え発現ベクターは、組換え体によって発現される外来遺伝子 産物をアッセイすることによって同定され得る。このようなアッセイは、例えば 、Elkレセプターまたは例えば検出可能な抗体またはその部分でタグを付けられ 得るその部分へのリガンド結合、あるいはEfl-6タンパク質またはその部分に対 して生じた抗体への結合による、例えば、efl-6遺伝子産物の物理的または機能 的特性に基づくことであり得る。 Efl-6は、細胞質ドメインを有する従来の膜貫通タンパク質であるようである 。膜貫通ドメインを、図１に下線で示す。したがって、リガンド（sEfl-6）の可 溶性または細胞外ドメインは、約ヌクレオチド274から約ヌクレオチド873までの ヌクレオチド配列によってコードされる。 本明細書に記載のリガンドは、動物細胞発現系において膜に結合した形態とし て産生され得るか、または可溶性形態で発現され得る。リガンドの可溶性形態は 、当業者に公知の方法を使用して発現され得る。通常使用される方策は、オリゴ ヌクレオチドプライマーの使用が含まれ、これらのプライマーの１つは、タンパ ク質のＮ末端に広がり、他のプライマーはタンパク質の疎水性セグメントのすぐ 上流の領域に広がり、これは、GPI-連結認識ドメインかまたはタンパク質の膜貫 通ドメインのいずれかを示す。C-末端領域に広がるオリゴヌクレオチドは、疎水 性ドメインの前に停止コドンを含むように改変される。２つのオリゴヌクレオチ ドは、結合した膜の代わりに分泌されるタンパク質をコードする遺伝子の改変型 を増幅するために使用される。あるいは、ベクター中の好都合な制限部位は、GP I-連結認識ドメインまたは膜貫通ドメインを除去する改変された配列を挿入する ために使用され得、したがって、タンパク質の分泌された形態を発現し得るベク ターを生じる。そのように産生された可溶性タンパク質は、Ｎ末端から疎水性GP I認識ドメインまたは膜貫通ドメインの前の領域までのタンパク質の領域を含む 。 出願人らは、本発明に従って産生された可溶性リガンドがephサブファミリー 流のレセプターに結合するが、このような可溶性リガンドがしばしばほとんどま たは全く生物学的活性を有さないことを発見した。このような可溶性リガンドは 、リガンド「クラスタリング」によって、本発明に従って、活性化される。本明 細書で使用される場合、「クラスタリング」とは、本明細書に記載のリガンドの 可溶性部分のマルチマーを生成するための当業者に公知の任意の方法をいう。 １つの実施態様では、「クラスタリングした」efl-6はダイマーであり、例え ば、IgGのFcドメインを利用して本発明に従って作成され（Aruffoら，1991，Cel l 67:35-44）、これは、ジスルフィド結合したホモダイマーとして、可溶性リガ ンドの発現を生じる。他の実施態様では、リガンドの分泌された形態は、それら のＣ末端でエピトープタグで構築され；次いで、抗タグ抗体はリガンドを凝集す るために使用される。 さらに、本発明は、マルチマーとして存在するまたはマルチマーを形成する他 の「操作された」リガンド分子を意図する。例えば、細胞外ドメインのダイマー は、ロイシンジッパーを使用して操作され得る。ヒト転写因子c-junおよびc-fos のロイシンジッパードメインは、1:1の化学量論で安定なヘテロダイマーを形成 することが示されている［BuschおよびSassone-Corsi，Trends Genetics 6: 36- 40（1990）；Gentzら，Science 243: 1695-1699(1989)］。jun-junホモダイマー も形成することが示されているが、それらはjun-fosヘテロダイマーよりも約100 0倍安定ではない。fos-fosホモダイマーは検出されていない。c-junまたはc-fos のいずれかのロイシンジッパードメインは、キメラ遺伝子を遺伝子操作すること によって、上記のリガンドの可溶性または細胞外ドメインのＣ末端でフレーム内 で融合される。融合物は指示され得、あるいは、これらは、ヒトIgGのヒンジ領 域のようなフレキシブルリンカードメイン、あるいはグリシン、セリン、スレオ ニン、またはアラニンのような小さなアミノ酸からなるポリペプチドリンカーを 、種々の長さおよび組み合わせで用い得る。さらに、キメラタンパク質は、金属 キレートクロマトグラフィーによって迅速に精製するためにHis-His-His-His-Hi s-His（His6）によって、および／またはウエスタンブロット、免疫沈降、また はバイオアッセイでの活性枯渇／ブロッキングの検出を可能にするために抗体が 利用可能なエピトープによって、タグを付けられ得る。 あるいは、マルチマーは、hIgGのFc-ドメインに続くリガンドの可溶性または 細胞外部分、次いで上記のc-junまたはc-fosのいずれかのロイシンジッパーから なる分子を遺伝子操作および発現することによって作成され得る［Kostelnyら， J.Immunol．148: 1547-1553(1992)］。これらのロイシンジッパーは優先的にヘ テロダイマーを形成するので、所望のヘテロダイマーの形成を誘導するために使 用され得る。ロイシンジッパーを使用する上記のキメラタンパク質については、 これらはまた、金属キレートまたはエピトープでタグを付けられ得る。このタグ を付けたドメインは、金属キレートクロマトグラフィーによる、および／または ウエスタンブロット、免疫沈降、またはバイオアッセイでの活性枯渇／ブロッキ ングの検出を可能にするために抗体による、迅速な精製のために使用され得る。 本発明の他の実施態様では、マルチマーの可溶性リガンドは、フレキシブルリ ンカーループを利用するキメラ分子としての発現によって調製される。キメラタ ンパク質をコードするDNA構築物は、フレキシブルループによってタンデムに（ 「真向かいに(head to head)」）一緒に融合した２つ以上の可溶性または細胞外 ドメインを発現するように設計される。このループは、完全に人工的であり得 るか（例えば、一定の間隔でセリンまたはスレオニンによって中断されるポリグ リシン反復）、または天然に存在するタンパク質から「借用され」得る（例えば 、hIgGのヒンジ領域）。ループの長さおよび組成が異なる分子は、所望の特徴を 有する分子の選択を可能にするように操作され得る。理論によって結びつけるこ とは望まないが、出願人らは、リガンドの膜接着がリガンドクラスタリングを容 易にし、これは、次にレセプターマルチマー化および活性化を促進すると考える 。したがって、本発明によれば、可溶性リガンドの生物学的活性は、溶液中で、 膜に結合したリガンドクラスタリングを模倣することによって達成される。した がって、生物学的に活性な、クラスタリングした可溶性ephファミリーリガンド は、(可溶性Efl)_nを含み、ここで可溶性eflはephファミリーレセプターを結合す るリガンドの細胞外ドメインであり、そしてｎは２以上である。本明細書で記載 されるように、Efl-6は、本発明のプロセスに従って生物学的に活性にされる。 各場合では、当業者は、クラスタリングの成功が、本明細書に記載のようなバ イオアッセイを利用する生物学的活性の分析を必要とすることを認識する。例え ば、リガンドの膜形態、リガンドの可溶性形態、およびクラスタリングしたリガ ンドを過発現するCOS細胞で、レセプターを発現するリポーター細胞を刺激する ことによって誘導されるレセプターリン酸化が、比較され得る。 いくつかの場合にはリガンドのダイマー化が生物学的活性を誘導するのに十分 であるが、特定の場合には、本明細書に記載の方法は、特定のクラスタリング技 法の十分さを決定するために使用される。Fcを利用する可溶性リガンドのしばし ばのダイマー化は生物学的応答を達成するために十分ではないようであるが、さ らに抗Fc抗体を使用する本発明に従ったリガンドのクラスタリングは、生物学的 活性の実質的な上昇を生じ得る。 本発明の細胞は、天然の形態で、あるいは本明細書に記載のようなタグを付け たEfl-6またはクラスタリングしたEfl-6としての可溶性形態で、一時的に、優先 的に、構成的に、および持続的に、Efl-6を発現し得る。 組換え因子は、安定な、生物学的に活性なタンパク質の持続的形成を可能にす る任意の技法によって精製され得る。例えば、そして限定されることなく、この 因子は、可溶性タンパク質としてまたは封入体としてのいずれかで細胞から回収 され得、そこから8M 塩酸グアニジニウムおよび透析によって定量的に抽出され 得る。この因子をさらに精製するために、従来のイオン交換クロマトグラフィー 、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、またはゲル濾 過が使用され得る。 本発明のさらなる実施態様では、組換えefl-6は、相同組換えによって内因性 遺伝子を不活性化または「ノックアウト」するために使用され得、それによって Efl-6タンパク質欠損細胞、組織、または動物を生成する。例えば、そして限定 されることなく、組換えeflは、挿入変異（例えば、天然のefl-6遺伝子を不活性 化するneo遺伝子）を含むように操作され得る。適切なプロモーターの制御下の このような構築物は、トランスフェクション、形質導入、インジェクションなど のような技法によって、胚幹細胞のような細胞中に導入され得る。次いで、この 構築物を含む細胞は、G418耐性によって選択され得る。次いで、インタクトなef l-6を含まない細胞は、例えば、サザンブロッティングまたはノーザンブロッテ ィングまたは発現のアッセイによって、同定され得る。次いで、インタクトなef l-6を含まない細胞は、このようなリガンドが欠損したトランスジェニック動物 を生成するために初期胚細胞に融合され得る。このような動物と内因性Efl-6を 発現する動物との比較は、発生および維持におけるリガンドの役割の解明の助け になる。このような動物は、特定のニューロン集団、あるいは任意の他のインビ ボプロセスを定義するために使用され得、通常はリガンドに依存する。 本発明はまた、例えば、診断適用における、リガンドの検出に有用である、本 明細書に記載のEfl-6に対する抗体を提供する。リガンドに対する抗体はまた、 本発明に従って、クラスタリングを達成するために有用であり得る。内因性リガ ンドが存在する場合、抗体自体は、存在するリガンドを活性化することによって 治療物として作用し得る。 Efl-6に対するモノクローナル抗体の調製について、培養物中の連続細胞株に よる抗体分子の産生を提供するための任意の技法が使用され得る。例えば、Kohl erおよびMilstein（1975，Nature 256:495-497）によって最初に開発されたハイ ブリドーマ技法、ならびにトリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ko zborら，1983，Immunology Today 4:72）、およびヒトモノクローナル抗体を産 生するためのEBVハイブリドーマ技法（Coleら，1985,「Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy」Alan R．Liss，Inc．77-96頁）などが、本発明の範囲内で ある。 診断用または治療用のためのモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体 またはキメラヒト-マウス（または他の種）モノクローナル抗体であり得る。ヒ トモノクローナル抗体は当該技術分野で公知の多くの技法のいずれかによって作 成され得る（例えば、Tengら，1983，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．80:7308- 7312；Kozborら，1983，Immunology Today 4:72-79；Olssonら，1982，Meth．En zymol．92:3-16）。ヒト定常領域とともにマウス抗原結合ドメインを含むキメラ 抗体分子が調製され得る（Morrisonら，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A． 81:6851、Takedaら，1985，Nature 314:452）。 当該技術分野で公知の種々の手順は、本明細書に記載のEfl-6のエピトープに 対するポリクローナル抗体の産生のために使用され得る。抗体の産生について、 種々の宿主動物が、Efl-6、あるいはそのフラグメントまたは誘導体を用いたイ ンジェクションによって免疫され得、宿主動物には、ウサギ、マウス、ラットな どを含むがこれらに限定されない。種々のアジュバントが、宿主種に依存して、 免疫学的応答を増加させるために使用され得、これには、フロイント（完全およ び不完全）、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リゾレシチンのような表面 活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジ ョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにBCG （Bacille Calmette-Guerin）およびCorynebacterium parvumのような潜在的に 有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。 選択されたEfl-6エピトープに対する抗体の分子クローンは、公知の技法によ って調製され得る。組換えDNA方法論（例えば、Maniatisら，1982，Molecular C loning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New Yorkを参照のこと）は、モノクローナル抗体分子、またはその抗原 結合領域をコードする核酸配列を構築するために使用され得る。 抗体分子は、公知の技法、例えば、免疫吸着または免疫アフィニティークロマ トグラフィー、HPLC（高速液体クロマトグラフィー）のようなクロマトグラフ方 法、またはそれらの組み合わせなどによって精製され得る。 本発明は、抗体分子ならびにこのような抗体分子のフラグメントを提供する。 分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、公知の技法によって生成され 得る。例えば、このようなフラグメントには、以下のものを含むがこれらに限定 されない：抗体分子のペプシン切断によって産生され得るF(ab')₂フラグメント ；F(ab')₂フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得 るFab'フラグメント、およびパパインおよび還元剤で抗体分子を処理することに よって生成され得るFabフラグメント。 本発明はまた、Efl-6、そのペプチドフラグメント、またはElkレセプターに結 合し得るその誘導体の有効量で患者を処置する工程を包含する、神経学的疾患に かかっている患者を処置する方法を提供する。 Elkレセプターはまた、脳において最初に発現される。したがって、本明細書 に記載のElk結合リガンドが、特徴のある機能の誘導を支持しおよび／またはこ のレセプターを発現する神経細胞の増殖および／または生存のような表現型に影 響を与えると考えられる。Galeら，1996，Oncogene 13:1343-1352に記載のよう に、Elk-6（参考文献においてElkリガンド３として記載される）は、発生中の神 経管の底板および上衣板におけるその顕著に制限されたおよび顕著な発現、なら びに発生中の後脳におけるその菱脳節特異的発現について注目に値する。この分 布は、発生中の脊椎動物の中枢神経系の組織化における重要な特徴である、ニュ ーロンの指針および境界形成におけるEfl-6およびその相互レセプターの役割を 示唆する。 本発明はまた、適切な薬理学的キャリア中に、本明細書に記載のEfl-6、その ペプチドフラグメント、または誘導体を含む薬学的組成物を提供する。 Efl-6タンパク質、ペプチドフラグメント、または誘導体は、全身にまたは局 所に投与され得る。当該分野で公知の投与の任意の適切な態様が使用され得、こ れには、静脈内、莢膜内、動脈内、鼻内、経口、皮下、腹腔内、あるいは局所注 射または外科的移植によるものを含むが、これらに限定されない。持続放出処方 物もまた提供される。 神経変性疾患／神経外傷の理解がより明らかになるので、内因性Efl-6の効果 を減少させるために有利であることが明らかになり得る。したがって、神経系外 傷の領域において、Elkレセプターとの相互作用について細胞と結合したリガン ドと競合し得るEfl-6の可溶性形態を含むがこれらに限定されない、Efl-6アンタ ゴニストを提供することが所望であり得る。あるいは、Elkレセプターの可溶性 形態（例えば、本明細書に記載のように産生された「レセプター体」として発現 される）は、結合すること、およびそれによってリガンドを不活性化することに よって、アンタゴニストとして作用し得る。このようなアンタゴニストを全身的 よりもむしろ傷害部位に局所的に提供することが所望され得る。Efl-6アンタゴ ニストを提供する移植物の使用が所望であり得る。 あるいは、特定の症状は、Efl-6応答性の増加で利益を得てもよい。したがっ て、このような症状にかかっている患者におけるEfl-6の数または結合親和性を 増加させるために有益であり得る。これは、Efl-6、Efl-6発現細胞、あるいはEl kレセプターまたはレセプターキメラ（Elkレセプターの細胞外ドメインを発現す る細胞）のいずれかを使用して、遺伝子治療によって達成され得た。適切な細胞 におけるこのような組換えタンパク質の選択的発現は、組織特異的または誘導性 プロモーターによって制御されたそれらをコードする遺伝子を使用して、あるい は組換え遺伝子を有する複製欠損ウイルスで局在化した感染を生じることによっ て、達成され得た。 ATCCで寄託されそして受託番号97319を有するEfl-6をコードするDNAを、Strat agene（La Jolla，California）ヒト脳（前頭皮質）ライブラリー（カタログ番 号936212）から単離した。ライブラリーはλZAPIIベクター中にある。このベク ターのEfl-6コーディング領域の配列を、図１に示す。 Efl-6タンパク質のアッセイまたは精製は、Elkレセプター体の使用によって行 われ得、これはIgG1定常領域に融合したElkの細胞外ドメインからなる。このレ セプター体は以下のように調製される：ヒンジ領域から始まりそして分子のカル ボキシ末端まで広がるヒトIgG1のFc部分を、ヒトIgG1の公開された配列に対応す るオリゴヌクレオチドでのPCRを使用して、胎盤cDNAからクローニングした。好 都合な制限部位も、発現ベクター中へのPCRフラグメントのクローニングを可能 にするようにオリゴヌクレオチドに組み込んだ。全長レセプターを含む発現ベク ターを、膜貫通および細胞内ドメインをこれらの部位へのヒトIgG1フラグメント のクローニングを可能にする制限部位で置換するように、制限酵素切断によって またはPCR法によってのいずれかで改変した；これを、そのアミノ末端としてレ セプターエクトドメインおよびそのカルボキシ末端としてヒトIgG1のFc部分を有 する融合タンパク質を生成するような方法で行った。レセプター体を調製する代 わりの方法は、Goodwinら，1993，Cell 73:447-456に記載される。微生物の寄託 以下のベクターを、ブダペスト条約に従って、アメリカンタイプカルチャーコ レクション、12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852で寄託した。寄託物 受託番号 pBluescript SK^-Efl-6 97319 本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施態様によって限定されない。実 際、本明細書に記載されたものに加えて、本発明の種々の改変は、上記の説明お よび付随する図面から当業者には明らかになる。このような改変は、添付の請求 の範囲の範囲にはいることが意図される。 種々の参考文献が本明細書で引用され、その開示は全体で参考として援用され る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 ゲイル，ニコラス ダブリュー. アメリカ合衆国 ニューヨーク 10522, ドブスフェリー，ベイコン ヒル ロード 155，アパートメント ５ (72)発明者 ヤンコプロス，ジョージ ディー. アメリカ合衆国 ニューヨーク 10598, ヨークタウンハイツ，バプティスト チャ ーチ ロード 1519

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Efl-6[Eph膜貫通チロシンキナーゼファミリーリガンド-６]タンパク質を コードする単離および精製された核酸分子であって、該核酸の配列が以下からな る群より選択される、核酸分子： (a) 1995年10月19日にアメリカンタイプカルチャーコレクションで寄託されそ して97319と命名されたプラスミドpBluescriptSK^-Efl-6に含まれる成熟Efl-6タ ンパク質をコードするDNAの配列； (b) 図１に記載のアミノ酸配列を有する成熟Efl-6タンパク質をコードするDNA の配列； (c) 穏やかなストリンジェントな条件下で(a)または(b)のDNAにハイブリダイ ズし、そしてEphレセプターのElkサブファミリー：Elk、Nuk/Cek 5、Hek 2/Sek 4、HtkおよびSek 1に結合するタンパク質をコードするDNA配列；および (d) (a)、(b)、または(c)のDNA配列に対する遺伝子コードの結果として縮重さ れ、そしてEphレセプターのElkサブファミリー： Elk、Nuk/Cek 5、Hek 2/Sek 4 、HtkおよびSek 1に結合するEfl-6タンパク質をコードするDNA配列。 ２．請求項１に記載の核酸によってコードされる単離および精製されたEfl-6 タンパク質。 ３．Elkレセプターに結合し得る、図１に記載のアミノ酸配列を有する単離お よび精製された成熟Efl-6タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体。 ４．以下から選択される配列を有するEfl-6（sEfl-6）の細胞外ドメインをコ ードする単離された核酸： (a) 図１の約ヌクレオチド274から約ヌクレオチド873に記載の配列；および (b) 図１に記載のようなEfl-6の細胞外ドメインをコードする配列。 ５．請求項４に記載のヌクレオチド配列によってコードされる精製されたsEfl -6。 ６．請求項５に記載のsEfl-6タンパク質を含む(sEfl-6)_nであって、ここでｎ が２以上である、(sEfl-6)_n。 ７．請求項５に記載の可溶性Efl-6タンパク質およびIgGのFc部分を含む、Efl- 6リガンド体。 ８．請求項１に記載の核酸分子を含むベクター。 ９．前記核酸分子が、宿主細胞においてその発現を指示し得る発現制御配列に 作動可能に連結される、請求項８に記載のベクター。 １０．請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。 １１．請求項４に記載の核酸分子を含むベクター。 １２．前記核酸分子が、宿主細胞においてその発現を指示し得る発現制御配列 に作動可能に連結される、請求項１１に記載のベクター。 １３．請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞。 １４．Efl-6リガンドを産生する方法であって、該リガンドの産生を可能にす る条件下で請求項９に記載の宿主の細胞を増殖させる工程、およびこのように産 生された該リガンドを回収する工程、を包含する方法。 １５．Efl-6可溶性リガンドを産生する方法であって、該リガンドの産生を可 能にする条件下で請求項１２に記載の宿主の細胞を増殖させる工程、およびこの ように産生された該リガンドを回収する工程、を包含する方法。 １６．請求項２、３または５に記載のリガンドを特異的に結合する抗体。 １７．モノクローナル抗体である、請求項１６に記載の抗体。 １８．薬学的組成物であって、請求項２、３または５で定義されるElkレセプ ターに結合するEfl-6タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体、およ び薬理学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。 １９．神経学的疾患の診断または処置に使用される薬剤の製造における、請求 項２、３または５で定義されるElkレセプターに結合するEfl-6タンパク質または そのフラグメントもしくは誘導体の使用。