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1. GEBIET
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur
Verhinderung oder Inhibierung eines mikrobiellen Wachstums in Kulturmedien
für Pflanzengewebekulturen,
die normalerweise die Einhaltung von sterilen Bedingungen erfordern.
In dem Kulturmedium werden spezifische chemische Mittel in Konzentrationen
verwendet, die die mikrobielle Kontamination vermindern oder verhindern,
die jedoch eine im wesentlichen normale Keimung von Samen oder ein
im wesentlichen normales Wachstum oder eine im wesentlichen normale
Entwicklung von Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben oder
Pflanzenzellen ermöglichen.
Die offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren sind nützlich für Forscher
bei der Pflanzen-Gewebekultur und Pflanzen-Molekularmikrobiologie
sowie für
Pflanzenzüchter
und Beschäftigte
von Pflanzenzuchtgärten,
sowie für
eine Vielzahl von kommerziellen Anwendungen.
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2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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2.1. IN VITRO PFLANZENKULURSYSTEME
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Das
Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung sind grundlegende biologische
Prozesse von hohem wissenschaftlichem, erzieherischem und kommerziellem
Interesse. Diese biologischen Prozesse können durch die Keimung von
Samen und die Aufzucht von ganzen Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben und
Pflanzenzellen in vitro in steriler Kultur auf verschiedenen Typen
von Kulturmedien beobachtet und manipuliert werden.
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Die
Praxis einer Züchtung
von Pflanzen in vitro ist gut entwickelt. Vergleiche zum Beispiel,
Thorpe, T.A. (ed.) Plant Tissue Culture: Methods and Applications
in Agriculture, Academic Press, Inc., New York (1981); Evans et al.
(ed.), Handbook of Plant Cell Culture, Vol. 1, MacMillan Publishing
Co., New York, London, (1983); und Dixon, R.A. (ed), Plant Cell
Culture: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, Washington DC
(1985).
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Für ein normales
Wachstum und eine normale Entwicklung benötigen in vitro gezüchtete Pflanzen mindestens
ein Medium, das essentielle Mineralsalze enthält. Vergleiche beispielsweise
Salisbury, F.B. und Ross, C.W. Plant Physiology, 3d Ed., Wadsworth
Publishing Co. (1985). Zusätzlich
benötigen
kultivierte Pflanzengewebe und -zellen typischerweise verschiedene
Kombinationen von Pflanzenhormonen (Phytohormonen), Vitaminen und
einem oder mehreren einfachen Zuckern. Vergleiche Thorpe, supra.
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Leider
stellen derartige Kulturmischungen auch eine reichhaltige Mischung
von Nährstoffen
dar, die das rasche Wachstum von Bakterien und Pilzen unterstützen können. Wenn
einmal derartige Kontaminantien in der Kultur heimisch geworden
sind, wachsen sie üblicherweise
rasch, entziehen dem Medium Nährstoffe und
erzeugen Toxine, die das Wachstum des kultivierten Pflanzengewebes
beeinträchtigen
und dieses schließlich
töten können.
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Demgemäß war die
Anwendung von Steriltechniken eine strikte Anforderung an alle in
vitro-Pflanzenkulturmanipulationen. Beispielsweise erfordert die
Herstellung und Wartung eines Standard-Gewebekultursystems die Sterilisierung
des Kulturmediums, entweder durch Hitze oder Filtration, die Sterilisierung
des Kulturbehälters,
die Oberflächensterilisierung
des zu kultivierenden Samens oder Pflanzengewebes, und die Sterilisierung
aller Instrumente, die dazu verwendet werden, das Pflanzengewebe
zu handhaben oder zu manipulieren. Zusätzlich muss jede nachfolgende
Manipulation des Pflanzengewebes typischerweise in einer Umgebung
mit filtrierter Luft durchgeführt
werden, beispielsweise unter einem Laminarströmungsabzug.
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Trotz
der striktesten Anwendung der Steriltechniken durch den erfahreren
Fachmann bleibt die Kontamination von Pflanzenkulturen ein andauerndes
Problem, das zu Verlusten führen kann,
die von geringen Zahlen von Kulturen bis zu einem katastrophalen
Verlust von ganzen Ansätzen
von Kulturmedium und Gewebekulturen reichen. Die Kontamination durch
Bakterien und Pilze ist ein heimtückischer Prozess, der Pflanzengewebekulturen
während
der gesamten Dauer der Kulturperiode kontinuierlich bedroht. Trotz
der Tatsache, dass Pflanzengewebekulturen steril sein können, wenn
sie gestartet werden, können
Mikroorganismen häufig Kulturen
zu einem beliebigen Zeitpunkt während
anschließender
Gewebekulturmanipulationen kontaminieren. Es wäre daher nützlich, ein chemisches Mittel
zur Verfügung
zu stellen, das die mikrobielle Kontamination von Pflanzengewebe-Kulturmedien
vermindert oder verhindert und die Sterilität der Medien für die Dauer
der Kulturperiode aufrechterhält.
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2.2 ANTIMIKROBIELLE MITTEL
IN DER PFLANZENGEWEBEKULTUR
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In
Pflanzengewebekulturen wurden verschiedene Typen von antimikrobiellen
chemischen Mitteln getestet. Auf ihre Fähigkeit zur Inhibierung oder
Verhinderung des Wachstums von Bakterien in Pflanzenkulturen wurden
im großen
Umfange Antibiotika getestet. Die Verwendung von Antibiotika unterliegt
jedoch bestimmten Einschränkungen.
Beispielsweise sind Antibiotika teuer, sind häufig nur gegen Bakterien, jedoch
nicht gegen Pilze wirksam, der Bereich ihrer Wirksamkeit gegen Typen
von Bakterien ist häufig
eng, sie sind üblicherweise wärmelabil,
und sie sind häufig
phytotoxisch oder auf andere Weise in der Lage, das Verhalten von
kultivierten Pflanzengeweben zu verändern.
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Beispielsweise
beschreiben Phillips, R., et al., Plant Sci. Lett., 21: 235–240 (1981)
Tests von sechs Antibiotika, d.h. Benzylpenicillin, Phosphomycin,
Chloramphenicol, Streptomycin, Rifampicin und Nalidixinsäure, zur
Verhinderung von bakteriellen Infektionen in Topinamur-Kulturen
(Helianthus tuberosus). Nur Rifampicin war in der Lage, die bakterielle
Kontamination zu bekämpfen,
ohne das Ausmaß der
Pflanzenzellteilung, Zelldifferenzierung oder DNA-Synthese in kulti vierten
Explantaten zu beeinträchtigen.
Rifampicin löste
jedoch eine Zunahme der Proteinsynthese aus.
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Pollock,
K., et al., Plant Cell Reports, 2: 36–39 (1983), beschreiben die
Toxizität
von mehr als zwanzig unterschiedlichen Antibiotika auf den Plattierungswirkungsgrad
von Protoplasten abgeleiteten Zellen von Nicotiana plumbaginifolia.
Während
die Betalactane, d.h. die Penicilline und die Cephalosporine, nur
einen geringen beobachtbaren toxischen Effekt auf den Plattierungswirkungsgrad
der Zellen aufwiesen, stimulierten diese Antibiotika das Wachstum
von Pflanzenzellkolonien. Die Aminoglycoside, z.B. Streptomycin
und Kanamycin, waren im Gegensatz dazu für Pflanzenzellen klar toxisch.
Erythromycin war für
Pflanzenzellen relativ nicht-toxisch, während die Tetracycline in Langzeit-Toxizitätstests
stark inhibitorisch wirkten.
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Gilbert,
J.E., et al., Ann. Appl. Biol., 119: 113–120 (1991) beschreiben die
Verwendung von Antibiotika zur Bekämpfung einer latenten bakteriellen
Kontamination in Kartoffelzellkulturen. Zwei unterschiedliche Kombinationen
von Antibiotika, entweder Penicilllin, Streptomycin und Amphotericin
oder Erythromycin, Streptomycin und Carbenicillin wurden getestet.
Jede Kombination verminderte bei ihrer Zugabe zu Medien, die zur
Kultivierung von Mikropflänzchen
verwendet wurden, das Pflanzenwachstum und lösten in höheren Konzentrationen eine
Chlorose aus. Die Mischungen waren nicht nur phytotoxisch, sondern
versagten auch in Hinblick auf die Eliminierung einer Kontamination.
Wenn die obige Mischung von Antibiotika jedoch zu Enzymmedien zugesetzt
wurde, die dazu verwendet wurden, Protoplasten herzustellen, wurde
eine Kontamination anscheinend eliminiert.
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Zusätzlich zu
Antibiotika wurden chemische Biozide auf ihre Fähigkeit untersucht, die Kontamination in
Pflanzenkulturen zu inhibieren oder zu verhindern.
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Beispielsweise
beschreiben Macek, T., et al., Biotechnology Techniques, 8(12):
885–888
(1994) die Verwendung von Diethylpyrocarbonat (DPC) zur chemischen
Sterilisation von Nährstoffmedien
für Pflanzenzellkulturen.
DPC tötete
alle kontaminierenden Mikroorganismen ab, ohne die Wachstumseigenschaften
von kultivierten Pflanzenzellen zu verändern. Da sich DPC jedoch innerhalb
eines Zeitraums von mehreren Stunden zu Ethanol und Kohlendioxid
zersetzt, wenn es mit Wasser in Kontakt gebracht wird, kann DPC
nicht dazu dienen, die Sterilität
von Pflanzenzellkulturen über
die Dauer der Kulturperiode aufrechtzuhalten.
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Das
japanische Patent Nr. 4-311326 offenbart ein Verfahren zur Eliminierung
einer Pilzkontamination in Gewebekulturen von Alpenveilchen-Pflanzen,
das das Eintauchen eines Gewebeschnitts aus einer Alpenveilchen-Pflanze
in eine Lösung,
die ein Imidazol- oder Triazol-Fungizid enthält, oder die Kultivierung eines
Gewebeschnitts auf einem Kulturmedium, das das Fungizid enthält, umfasst.
Diese Behandlung dient jedoch nicht dazu, eine bakterielle Kontamination
zu inhibieren.
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Das
japanische Patent Nr. 4-63589 beschreibt die Verwendung von Allylisothiocyanat (CH2=CHCH2N=C=S) als
Sterilisierungsmittel in Pflanzenkulturmedien, in denen das chemische
Mittel die Notwendigkeit beseitigte, eine Autoklavenbehandlung durchzuführen, und
es wurde keine Anormalität
bei Gewebekulturen von Nelken-Pflanzen beobachtet.
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Kombinationen
von Antibiotika und chemischen Bioziden wurden auf ihre Fähigkeit
untersucht, eine mikrobielle Kontamination in Pflanzenkulturen zu
inhibieren.
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Beispielsweise
beschreibt Francko, D.A., Aquatic Botany, 26: 113–117 (1986)
die Verwendung von Antibiotika (Penicillin G und Streptomycinsulfat)
in Kombination mit einem Fungizid (Captan) bei einem Versuch, axenische
Pflanzen aus Samen der Wasserpflanze Nelumbo lutea (Willd.) zu erhalten.
Tests zeigten, dass wenn diese Mittel zu den Inkubationsmedien zugegeben
wurden, etwa die Hälfte
der Samenkulturen nach zwei Wochen des Wachstums keine nachweisbaren
Kontaminantien enthielten. Vier Wochen nach der Übertragung auf frische Medien,
denen die Antibiotika und Fungizide fehlten, blieben jedoch nur
11% der Anfangskulturen frei von Kontaminantien.
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Haldeman,
J.H., et al., Hortscience, 22(2: 306–307 (1987) beschreiben die
Verwendung einer Kombination aus einem Fungizid (Benomyl) und einem
Antibiotikum (Rifampicin) als Behandlung zur Bekämpfung einer andauernden Kontamination
durch Pilze und Bakterien in Kulturen von Kamelien-Sprossspitzenexplantaten
aus feldgezüchteten
Pflanzen. Eine 24 h-Behandlung
von Sprossspitzen mit dieser Mischung nach Standard-Entkeimungsbehandlungen
in Bleichlösung
verminderte die Kontamination erheblich, beseitigte sie jedoch nicht.
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Kneifel,
W. und Leonhardt, W., Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 29:
139–144
(1992) beschreiben Tests unterschiedlicher Kombinationen von Antibiotika
und chemischen Bioziden gegen grampositive und gramnegative Bakterien,
die aus Pflanzengewebekulturen isoliert wurden. Eine Mischung aus
ImipenemTM (N-Formimidoylthienanycinmonohydrat;
Merck, USA) und Ampicillin, und eine Mischung aus ImipenemTM und Penicillin G erwiesen sich als am
wirksamsten bei der Inhibierung einer bakteriellen Kontamination
und wiesen keine erkennbare Wirkung auf die Wachstumsgeschwindigkeit
oder das Wurzelwachstum auf, noch war irgendeine Schädigung des
Chlorophylls erkennbar. Eine Mischung aus IMIPENEMTM und
KATHONTM (5-Chlor-2-methyl-4-isothiazolin-3-on
und 2-Methyl-4-isothiazolin-3-on;
Rohm & Haas, Österreich),
führte
jedoch zu einem verminderten Wurzelwachstum von zwei getesteten
Pflanzenspezies.
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Auf
dem Fachgebiet sind eine Vielzahl von anderen Chemikalien dafür bekannt,
dass sie eine allgemeine konservierende oder biozide Aktivität aufweisen.
Vier dieser Chemikalien, die in der vorliegenden Erfindung von Nutzen
sind, sind Kaliumsorbat, Natriumbenzoat, Methylchlorisothiazolinon
und Methylisothiazolinon.
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Im
Merck Index (10th Ed., 1983, Entry No. 7555) wird Kaliumsorbat als
Schimmel- und Hefeinhibitor aufgelistet, und Natriumbenzoat (Entry
No. 8413) als ein Konservierungsmittel, insbesondere für Lebensmittelprodukte.
Ryu, D. und Holt, D.L., J. Food Protection, 56(10): 862–867 (1993)
zeigen, dass Kaliumsorbat das Wachstum von Penicillium expansum
in Pilzkultur und auf Äpfeln
inhibiert. Hall, D.J., Proc. Fla. State Hort, Soc., 101; 184–187 (1988)
zeigt, dass Kaliumsorbat und Natriumbenzoat jeweils als Nachernte-Fungizide
bei Citrusfrüchten
wirksam sind. Idise, O.E. und Izuagbe, Microbios Lett., 28: 117–121 (1985)
zeigen, dass Natriumbenzoat wirksam das Wachstum von Bakterien und
Hefe in einem auf Flaschen abgefüllten
Palmwein inhibiert.
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Sodeko,
O.O., et al., Microbios, 51: 133–143 (1987) zeigen, dass Natriumbenzoat
wirksam Bakterien und Pilze in Orangensaft inhibiert. Das US-Patent
Nr. 3 122 432 von Biggs beschreibt eine Zusammensetzung zur Konservierung
von Schnittblumen, die verschiedene Zutaten enthält, einschließlich Natriumbenzoat,
das als Fermentations- und Schimmelinhibitor beschrieben wird.
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Methylchlorisothiazolinon
und Methylisothiazolinon, zusammen mit Magnesiumsalzen als Stabilisatoren,
sind in dem Biozid KATHONTM CG (Rohm & Haas, USA) enthalten,
das in einem großen
Bereich von Kosmetika, Anstrichfarben, Air Condition-Einheiten, usw. verwendet
wird. Gruvberger, B., et al., Contact Dermatitis, 15: 24–27 (1986)
beschreiben chromatographische Verfahren, um KATHONTM CG
in Kosmetika nachzuweisen. Haack, T.K. und Warwick, E.F., in: Pesticide
Formulations and Application Systems, Devisetty, D.G., et al. (eds),
Am. Soc. Testing and Materials, Philadelphia (1993), Seiten 105–115 stellen
Daten zur Verfügung, die
das Landwirtschafts-Konservierungsmittel Legend MKTM betreffen,
das eine andere kommerzielle Ausführungsform von Methylchlorisothiazolinon
und Methylisothiazolinon darstellt, und das darin als wirksames
antimikrobielles Mittel für
wässrige
fließfähige Pestizidzusammensetzungen
beschrieben wird. Green, P.N. Lett. Appl. Microbiol., 17: 158–161 (1993)
zeigt, dass von fünf
getesteten kommerziellen Bioziden die Mischung aus Methylchlorisothiazolinon
und Methylisothiazolinon gegen im Labor erzeugte mikrobielle Biofilme
von Legionella bozemanii hochwirksam war.
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Chapman,
J.S. Am. Clin. Lab., Seiten 13–14,
(Aug. 1994) beschreibt, wie eine dritte kommerzielle Ausführungsform einer
Mischung von Methylchlorisothiazolinon und Methylisothiazolinon,
vermarktet als ProClinTM (Rohm & Haas, vertrieben
von Supelco, Inc.) hochwirksam ist gegen ein breites Spektrum von
wenigstens 14 unterschiedlichen Spezies von gramnegativen Bakterien,
9 unterschiedlichen Spezies von grampositiven Bakterien und 18 unterschiedlichen
Spezies von Pilzen.
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Zusätzlich beschreiben
die US-Patente 3 523 121; 3 761 488; 4 105 431; 4 243 403; 4 252
694; 4 265 899; und 4 279 762 von Lewis neue Isothiazolone, die
gegen ein breites Spektrum von Mikroorganismen biodzid wirksam sind,
die einschließen
Bakterien, Algen und Pilze, und zwar in einem breiten Bereich von
Anwendungen, einschließlich
Seifen, Waschmitteln, Anstrichen, Kosmetika, Schneidölen und
als Fungizide auf Samen, die in die Erde gepflanzt werden sollen.
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Außerdem beschreiben
die US-Patente Nr. 4 454 146, 4 499 071; 4 540 570; und 4 555 400
von Borovian synergistische Konservierungszusammensetzungen zur
Inhibierung des Wachstums von Mikroorganismen, wobei die Zusammensetzungen
wenigstens zwei Bestandteile aufweisen, von denen der erste aus
einer Gruppe ausgewählt
ist, die aus einem oder mehreren herkömmlichen Konservierungsstoffen,
einschließlich Benzoesäure, Sorbinsäure und
einer Mischung von Methylchlorisothiazolinon und Methylisothiazolinon,
besteht, und einem zweiten Bestandteil, der eine polycyclische Verbindung
ist, die darin definiert wird, die, in Kombination mit dem ersten
Bestandteil, Mikroorganismen synergistisch tötet oder inhibiert.
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Schließlich beschreiben
die US-Patente 5 028 620 und 5 100 905 von Hsu eine synergistische
Biozidzusammensetzung mit einem verminderten Sensibilisierungspotential,
deren erster Bestandteil Methylchlorisothiazolinon im Bereich von
1,2 bis 25,4% ist, und deren zweiter Bestandteil Methylisothiazolinon
im Bereich von etwa 74,6 bis etwa 98,8% ist.
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Obwohl
die vier Bestandteile, d.h. Kaliumsorbat, Natriumbenzoat, Methylchlorisothiazolinon
und Methylisothiazolinon dafür
bekannt sind, dass sie konservierende oder biozide Wirkungen aufweisen,
gibt es auf dem Fachgebiet keine Lehre und keinen Vorschlag, dass
diese Chemikalien, oder irgendeine Kombination davon, dafür nützlich sein
könnten,
eine mikrobielle Kontamination in Pflanzengewebekulturen zu vermindern oder
zu verhindern, und zwar ohne eine negative Beeinflussung der Pflanzengewebe.
Tatsächlich
führt der
Bericht von Kneifel, W. und Leonhardt, W., supra, betreffend ein
vermindertes Wurzelwachstum auf einer Mischung aus IMIPENEMTM und KATHONTM von
einer Verwendung von KATHONTM enthaltenden
Mitteln in Pflanzengewebekulturen weg.
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Es
wäre vorteilhaft,
weitere chemische Mittel bereitzustellen, die Pflanzengewebe-Kulturmedien
zugesetzt werden können,
wobei die Mittel eine Kontamination mit Bakterien und Pilzen für die Dauer
der Kulturperiode vermindern oder verhindern könnten, und eine im wesentlichen
normale Keimung von Samen oder ein im wesentliches normales Wachstum
oder eine im wesentlichen normale Entwicklung von kultivierten Samen, Pflanzen,
Pflanzenorganen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen gestatten würden.
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3. KURZDARSTELLUNG
DER ERFINDUNG
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Es
ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen und Verfahren
zur Verminderung oder Verhinderung einer mikrobiellen Kontamination
von in vitro-Pflanzengewebekulturen während der Kulturperiode bereitzustellen.
Ein derartiges Ziel kann dadurch erreicht werden, dass man ein chemisches
Mittel in ein Pflanzenkulturmedium in einer Konzentration einarbeitet,
die das Wachstum von Bakterien und Pilzen wirksam vermindert oder
verhindert, und die eine im wesentlichen normale Keimung von Samen
oder ein im wesentlichen normales Wachstum oder eine im wesentlichen
normale Entwicklung von Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben
oder Pflanzenzellen ermöglicht.
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Es
ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Pflanzengewebe-Kulturmedium
bereitzustellen, das ein chemisches Mittel in einer Konzentration
aufweist, die im Hinblick auf eine Verminderung oder Verhinderung
einer mikrobiellen Kontamination während der gesamten Kulturperiode
wirksam ist und eine im wesentlichen normale Keimung von Samen oder
ein im wesentlichen normales Wachstum oder eine im wesentlichen normale
Entwicklung von Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben oder
Pflanzenzellen gestattet.
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Es
ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Kit zum
Kultivieren von Samen, Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben
oder Pflanzenzellen auf einem Pflanzengewebe-Kulturmedium bereitzustellen,
der ein chemisches Mittel in einer Konzentration aufweist, die zur
Verminderung oder Verhinderung einer mikrobiellen Kontamination
während
der Kulturperiode wirksam ist und die eine im wesentlichen normale Keimung
von Samen oder ein im wesentliches normales Wachstum oder eine im
wesentlichen normale Entwicklung von Pflanzen, Pflanzenorganen,
Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen ermöglicht, wobei der Kit einen
Kulturbehälter
aufweist, der ein Pflanzengewebe-Kulturmedium aufweist, das das
chemische Mittel aufweist, d.h. für eine sofortige Verwendung
bereit ist, oder das, beispielsweise durch Zugabe von Wasser, feritg für eine Zubereitung
ist. Der Kit umfasst außerdem
einen oder mehrere Pflanzensamen, die vorzugsweise oberflächensterilisiert
wurden, oder eine oder mehrere Pflanzen, Pflanzenorgane, Pflanzengewebe
oder Pflanzenzellen.
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4. DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zur
Verminderung oder Verhinderung einer mikrobiellen Kontamination
von in vitro-Pflanzenkulturen während
der gesamten Kulturperiode bereit. Dem Pflanzenkulturmedium wird
ein chemisches Mittel in einer Konzentration zugesetzt, die wirksam ist,
das Wachstum von Bakterien und Pilzen zu vermindern oder zu verhindern,
und die eine im wesentlichen normale Keimung von Samen oder ein
im wesentliches normales Wachstum oder eine im wesentlichen normale
Entwicklung von Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben oder
Pflanzenzellen gestattet. Die Erfindung stellt ein Pflanzengewebe-Kulturmedium bereit,
das ein chemisches Mittel aufweist, wobei dieses chemische Mittel
umfaßt:
Methylchlorisothiazolinon in einem Konzentrationsbereich von etwa
2,0 bis etwa 2,6 g/l; Methylisothiazolinon in einem Konzentrationsbereich
von etwa 0,6 bis etwa 0,8 g/l; Magnesiumchlorid in einem Konzentrationsbereich
von etwa 15,0 bis etwa 30,0 g/l; und Magnesiumnitrat in einem Konzentrationsbereich von
etwa 15,0 bis etwa 30,0 g/l; wobei das chemische Mittel in einem
Konzentrationsbereich von etwa 0,01% (v/v) bis etwa 0,20% (v/v)
vorhanden ist, um eine mikrobielle Kontamination des Pflanzengewebe-Kulturmediums
zu vermindern oder zu verhindern und eine im wesentlichen normale
Keimung der Samen oder ein im wesentlichen normales Wachstum oder
eine im wesentlichen normale Entwicklung von Pflanzen, Pflanzenorganen,
Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zu ermöglichen.
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Stärker bevorzugt
umfasst das chemische Mittel eine Mischung aus Methylchlorisothiazolinon,
Methylisothiazolinon, Magnesiumchlorid, Magnesiumnitrat und Kaliumsorbat
oder Natriumbenzoat. Am stärksten
bevorzugt umfasst das chemische Mittel eine Mischung von Methylchlorisothiazolinon,
Methylisothiazolinon, Magnesiumchlorid, Magnesiumnitrat, Kaliumsorbat
und Natriumbenzoat.
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Die
Anmelder haben überraschenderweise
entdeckt, dass diese Kombination von Chemikalien, in einem bestimmten
Bereich von Konzentrationen, wirksam im Hinblick auf eine Verminderung
oder Verhinderung einer mikrobiellen Kontamination in Pflanzengewebekulturen
für die
Dauer der Gewebekulturperiode ist, jedoch eine im wesentlichen normale
Keimung von Samen oder ein im wesentliches normales Wachstum oder eine
im wesentliches normale Entwicklung von Pflanzen, Pflanzenorganen,
Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen ermöglicht.
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Die
relativen Konzentrationen der individuellen Bestand teile, die das
chemische Mittel umfasst, können
variiert werden, um eine Mischung zu erzeugen, die zur praktischen
Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahrens
für irgendein
spezielles Pflanzenkulturmedium, eine Pflanzenspezies, einen Pflanzensamen,
eine Pflanze, ein Pflanzenorgan, ein Pflanzengewebe oder eine Pflanzenzelle
optimal wirksam ist. Eine stärker
bevorzugte Mischung der Bestandteile in dem chemischen Mittel umfasst
außerdem:
Kaliumsorbat in einem Konzentrationsbereich von etwa 15 bis etwa
25 g/l oder Natriumbenzoat in einem Konzentrationsbereich von etwa 13
bis etwa 27 g/l.
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Eine
besonders bevorzugte Mischung der Bestandteile im chemischen Mittel
umfasst außerdem:
Kaliumsorbat in einem Konzentrationsbereich von etwa 15 bis etwa
25 g/l; und Natriumbenzoat in einem Konzentrationsbereich von etwa
13 bis etwa 27 g/l.
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In
allen Fällen
werden Bestandteile des chemischen Mittels unter Bildung einer Vorratslösung des
chemischen Mittels vermischt, wobei man irgendeine Flüssigkeit
verwendet, in der sich die Bestandteile auflösen, vorzugsweise jedoch Wasser
und am stärksten
bevorzugt destilliertes oder entionisiertes Wasser.
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Bei
der Verwendung in der vorliegenden Anmeldung bezieht sich "Pflanzengewebekultur" oder "kultivierte Pflanzengewebe" auf irgendein Verfahren,
das in vitro durchgeführt
wird, bei dem Samen zur Keimung gebracht werden, oder Pflanzen,
Pflanzenorgane, Pflanzengewebe oder Pflanzenzellen aufgezogen, differenziert,
subkultiviert oder in anderer Weise auf einem Kulturmedium gehalten
werden, und zwar einem definierten oder undefinierten, das typischerweise
in einem sterilen (synonym: aseptischen, axenischen) Zustand gehalten
wird, d.h. frei von mikrobieller Kontamination, und das im allgemeinen
unter kontrollierten Umgebungsbedingungen inkubiert wird.
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Bei
der Verwendung in der vorliegenden Anmeldung betrifft die "mikrobielle Kontamination" das Wachstum von
irgendwelchen unerwünschten
Mikroorganismen, z.B. Bakterien oder Pilzen in einer Pflanzengewebekultur.
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Bei
der Verwendung in der vorliegenden Anmeldung beziehen sich die Begriffe "Pflanzengewebekulturmedium", "Pflanzenkulturmedium", "Kulturmedium" und "Medium" auf ein festes Subtrat
oder eine flüssige Lösung, in
denen ein Pflanzensamen keimt, eine Pflanze gehalten oder gezüchtet werden
kann und ein isoliertes Pflanzenorgan oder Pflanzengewebe gehalten,
aufgezogen oder differenziert werden kann, oder auch eine oder mehrere
isolierte Pflanzenzellen, Pflanzenzellaggregate oder Pflanzenzellprotoplasten
gehalten, aufgezogen oder differenziert werden können, und das in einem sterilen
Zustand gehalten werden muss, d.h. im wesentlichen frei von mikrobieller
Kontamination.
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Die
Begriffe "Pflanzengewebekulturmedium", "Pflanzenkulturmedium", "Kulturmedium" und "Medium" sollen ferner auch
Wasser bezeichnen, das eine geeignete Mischung von Mineralsalzen
enthält.
Das Kulturmedium kann außerdem,
in geeigneten Konzentrationen, Phytohormone, einschließlich beispielsweise
Auxine, Cytokinine oder Gibberelline, Vitamine wie beispielsweise
eines oder mehrere der B-Vitamine, eine oder mehrere Kohlenstoffquellen,
einschließlich
beispielsweise Saccharose oder Glukose, und einen oder mehrere undefinierte(n)
Wachstumsverstärker
wie beispielsweise Kokosnussmilch, beinhalten. Die Bestandteile
der Mineralssalzmischung können
gemäß den Anforderungen
der speziellen Pflanzenspezies, die aufgezogen wird, ausgewählt und
hergestellt werden. Die geeignete Zusammensetzung der Mineralsalze
kann entweder empirisch bestimmt sein, oder aus Mineralsalzzusammensetzungen
ausgewählt
sein, die vorher auf dem Fachgebiet der Pflanzengewebekultur bekannt
waren und entsprechend hergestellt werden. Alternativ können die
Mineralsalze aus irgendeiner Anzahl von kommerziell erhältlichen
Mischungen ausgewählt
werden (z.B. von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.). Mineralsalzmischungen,
die für
die praktische Umsetzung der vorliegenden Erfindung nützlich sind,
schließen
beispielsweise Hoaglands Basalsalzmischung, Gamborgs B-5 Basalsalzmischung,
Hellers Basalsalzmischung, Murashige und Skoog Basalsalzmischung,
Nitsch und Nitsch-Basalsalzmischung,
Whites Basalsalzmischung und Variationen davon ein. Zusätzlich können verschiedene
Makronährstoffe,
Mikronährstoffe
und Vitaminbestandteile, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, auf
verschiedene Weise kombiniert werden, um ein Kulturmedium herzustellen,
das für
die Pflanzenspezies, die aufgezogen wird, geeignet ist.
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Gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung wird das chemische Mittel dem Pflanzengewebekulturmedium
in einer Konzentration zugesetzt, die das Wachstum von Bakterien
oder Pilzen oder beiden vermindert oder verhindert, und die eine
im wesentlichen normale Samenkeimung oder ein im wesentliches normales
Wachstum oder eine im wesentlichen normale Entwicklung einer Pflanze,
eines Pflanzenorgans, Pflanzengewebes oder einer Pflanzenzelle,
die darauf kultiviert werden, ermöglicht.
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Gemäß der Verwendung
in der vorliegenden Erfindung ist ein chemisches Mittel dann zur
Verminderung oder Verhinderung eines mikrobiellen Wachstums in einem
Pflanzenkulturmedium wirksam, wenn die Zugabe des chemischen Mittels
zu dem Pflanzenkulturmedium in einer Konzentration, die eine im
wesentlichen normale Samenkeimung oder ein im wesentlichen normales
Wachstum oder eine im wesentlichen normale Entwicklung von Pflanzen,
Pflanzenteilen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen ermöglicht,
die Menge einer Kontaminierung mit Bakterien oder Pilzen um wenigstens
80%, verglichen mit Kontrollmedien, denen das chemische Mittel fehlt,
vermindert.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist eine im wesentlichen normale Keimung von Samen definiert
als ein Prozentsatz an Keimung, der wenigstens 50% des Prozentsatzes
an Keimung auf Kontrollkulturmedien, die das chemische Mittel nicht
enthalten, beträgt.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist ein im wesentlichen normales Wachstum einer Pflanze,
eines Pflanzenorgans, Pflanzengewebes oder einer Pflanzenzelle definiert
als eine Wachstumsrate oder Zellteilungsrate der Pflanze, des Pflan zenorgans,
des Pflanzengewebes oder der Pflanzenzelle, die wenigstens 50% der
Wachstumsrate oder Rate der Zellteilung bei einer entsprechenden
Pflanze, einem Pflanzenorgan, Pflanzengewebe oder einer Pflanzenzelle
auf einem Kontroll-Kulturmedium,
das das chemische Mittel nicht enthält, beträgt.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist eine im wesentlichen normale Entwicklung einer Pflanze,
eines Pflanzenorgans, Pflanzengewebes oder einer Pflanzenzelle definiert
als das Erscheinen von einem oder mehreren Entwicklungsereignissen
bei der Pflanze, dem Pflanzenorgan, dem Pflanzengewebe oder der
Pflanzenzelle, das im wesentlichen das gleiche ist wie dasjenige,
das bei einer entsprechenden Pflanze, einem Pflanzenorgan, Pflanzengewebe
oder einer Pflanzenzelle auf einem Kontrollkulturmedium, das das
chemische Mittel nicht enthält,
auftritt.
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Im
allgemeinen ist das chemische Mittel, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
nützlich
ist, in einem Bereich von Konzentrationen in dem Kulturmedium wirksam,
die eine im wesentlichen normale Samenkeimung oder ein im wesentlichen
normales Wachstum oder eine im wesentlichen normale Entwicklung
einer Pflanze, eines Pflanzenorgans, Pflanzengewebes oder einer
Pflanzenzelle, die darauf kultiviert werden, ermöglichen.
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Ein
stärker
bevorzugter Konzentrationsbereich des chemischen Mittels in dem
Kulturmedium beträgt von
etwa 0,02% bis etwa 0,10% (v/v). Der am stärksten bevorzugte Konzentrationsbereich
des chemischen Mittels in dem Kulturmedium beträgt von etwa 0,03% bis etwa
0,05% (v/v).
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Für diejenigen
Pflanzensamen, Pflanzen, Pflanzenorgane, Pflanzengewebe oder Pflanzenzellen
von irgendeiner Spezies, für
die die obigen Bereiche nicht zufriedenstellend sind, kann die optimale
wirksame Konzentration des chemischen Mittels in dem Kulturmedium
zur Verwendung bei dem beanspruchten Verfahren empirisch dadurch
bestimmt werden, dass man den genannten Samen, die Pflanze, das
Pflanzenorgan, das Pflanzengewebe oder die Pflanzenzelle in einem
Pflanzen gewebe-Kulturmedium bei einem Bereich von Konzentrationen
des chemischen Mittels züchtet,
und eine oder mehrere Konzentrationen auswählt, bei denen die mikrobielle
Kontamination vermindert oder verhindert ist, die jedoch eine im
wesentlichen normale Samenkeimung ermöglichen oder die ein im wesentlichen
normales Wachstum oder eine im wesentlichen normale Entwicklung
der Pflanze, des Pflanzenorgans, des Pflanzengewebes oder der Pflanzenzelle
ermöglichen.
Eine derartige empirische Bestimmung kann ohne unzumutbare Versuche
und unter Anwendung von Standardtechniken für die Samenkeimung oder die
Aufzucht von Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen
durchgeführt
werden, und zwar in Kombination mit Routine-Screeningtechniken,
die dem einschlägigen
Fachmann bekannt sind.
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Beispielsweise
können
Pflanzengewebekulturmedien gemäß irgendeinem
Standardrezept für
Pflanzengewebekulturmedien, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt
werden, wobei das chemische Mittel in einem Bereich von Konzentrationen
zugesetzt wird, und zwar für
ein Screenen, sowie ohne chemisches Mittel (Kontrolle). Pflanzensamen
können
in diese Medien "eingepflanzt" werden, geeignet
inkubiert werden und nach einem ausreichenden Zeitraum untersucht
werden, um den Prozentsatz der Keimung zu bestimmen. Zusätzlich kann
eine Bewertung des Wachstums oder der Entwicklung von Wurzeln und
Sprossen von gekeimten Samen, wie sie beispielsweise unter Verwendung
irgendwelcher morphologischer, anatomischer oder biochemischer Kennwerte
bestimmt wurden, dadurch erfolgen, dass man Samen, die auf Kulturmedien
keimten, das das chemische Mittel enthielt, mit Samen, die auf Kulturmedien
ohne chemisches Mittel keimten, vergleicht.
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Der
erfahrene Fachmann kennt verschiedene morphologische, anatomische,
physiologische und biochemische Assays, und kann diese anwenden,
die für
die Bestimmung der Wirkungen von chemischen Mitteln auf das Wachstum
von Pflanzen nützlich
sind. Beispielsweise kann eine morphologische Analyse einen Vergleich
der Form, Größe oder
Anzahl von Wurzeln, Sprossen, Blättern
oder Fortpflanzungsorganen oder Teilen davon umfassen. Eine anatomische
Analyse kann beispielsweise eine vergleichende Analyse der Größe, Form,
des Musters der Differenzierung von Zellen umfassen, wie beispielsweise
die Menge, Anordnung oder Reifung von Gefäßgeweben, Pflanzenhaaren oder
Spaltöffnungen
oder die Anwesenheit oder das Fehlen von sich aktiv teilenden Meristemen.
Eine physiologische Analyse kann beispielsweise eine vergleichende
Analyse des Grads der Atmung, Photosynthese, des Spaltöffnungswiderstands
oder der Ethylenproduktion umfassen. Eine biochemische Analyse kann
beispielsweise eine vergleichende Analyse der Protein- oder DNA-Synthese, des
Chlorophyllabbaus oder der Anwesenheit, des Fehlens oder der Menge
an anderen Pigmenten umfassen. Einer oder mehrere dieser Assays,
die alle dem erfahrenen Fachmann bekannt sind, kann zu einer empirischen
Bestimmung der optimalen Konzentration des chemischen Mittels in
einem Pflanzengewebekulturmedium beitragen, um das Verfahren der
vorliegenden Erfindung bei einer speziellen Pflanzenspezies in die
Praxis umzusetzen.
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Wenn
einmal die optimale Konzentration des chemischen Mittels für die praktische
Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahrens
bestimmt ist, kann es dem Kulturmedium zugesetzt werden, das danach
in flüssiger
Form für
Flüssigkulturen
verwendet wird, einschließlich
beispielsweise Zellsuspensionskulturen oder Photoplastenkulturen,
oder das anschließend
durch Zugabe eines Geliermittels verfestigt wird. Das Kulturmedium
wird typischerweise auf einen geeigneten pH eingestellt, beispielsweise
pH 5,8, indem man geeignete saure oder basische Lösungen verwendet,
z.B. Chlorwasserstoffsäure
(HCl) oder Kaliumhydroxid (KOH).
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In
denjenigen Fällen,
wenn das Kulturmedium verfestigt werden soll, kann ein Geliermittel,
beispielsweise PHYTAGELTM-Gellangummi (Sigma
Chemical Co.) in einem geeigneten Konzentrationsbereich, beispielsweise
von 0,2% bis 0,3% (w/v) für
Gellangummi, zu dem Kulturmedium zugesetzt werden. Das Kulturmedium
muss dann ausreichend erwärmt
werden, z.B. durch Autoklavenbehandlung, um das Geliermittel aufzulösen. Die
Anwesenheit des chemischen Mittels macht jedoch eine Autoklavenbehandlung
zu Sterilisationszwecken unnötig.
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Die
antimikrobielle Aktivität
eines Kulturmediums, das das chemische Mittel aufweist, wird durch
Autoklavenbehandlung (121 °C,
15 min) nicht vermindert. Zusätzlich
haben die Anmelder entdeckt, dass ein Pflanzenkulturmedium mit dem
chemischen Mittel, das einer Autoklavenbehandlung unterzogen wurde,
im Hinblick auf eine Pflanzensamenkeimung oder das Wachstum oder
die Entwicklung von Pflanzen, Pflanzenorganen, Pflanzengeweben oder
Pflanzenzellen weniger hemmend, verglichen mit dem gleichen Kulturmedium mit
dem chemischen Mittel, das keiner Autoklavenbehandlung unterzogen
wurde. Das bedeutet jedoch nicht, dass eine Autoklavenbehandlung
zur Durchführung
der Erfindung im strengen Sinne erforderlich ist, sondern nur, dass
der Bereich von Konzentrationen des chemischen Mittels in dem Kulturmedium,
die zur praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung nützlich sind,
in einigen Fällen
niedriger sein kann, wenn das Kulturmedium keiner Autoklavenbehandlung
unterzogen wurde.
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Nach
der Autoklavenbehandlung kann das Kulturmedium mit dem chemischen
Mittel und dem aufgelösten
Geliermittel dann auf einzelne Kulturbehälter irgendeines Typs übertragen
werden, die auf dem Fachgebiet verwendbar sind, und man kann das
Medium abkühlen
und verfestigen lassen.
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Ein
weiterer Vorteil des chemischen Mittels ist der, dass dann, wenn
eine Autoklavenbehandlung zum Auflösen eines Geliermittels nicht
erforderlich ist, wärmelabile
Bestandteile des Kulturmediums wie Vitamine und Zucker nicht mehr
länger
eine Filter-Sterilisierung benötigen.
Das so hergestellte Kulturmedium kann für einen ausgedehnten Zeitraum
gelagert werden, oder sofort verwendet werden.
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Ansätze von
Kulturmedien können
durch Übertragung
auf einen oder mehrere auf dem Fachgebiet verwendbare Kulturbehälter aufgeteilt
werden, einschließlich
Kolben, Becher, quadratische Behälter,
Schraubdeckelgläser,
Kulturröhrchen
oder irgendwelche anderen Behälter,
die für
Kultursamen, Pflanzen, Pflanzenorgane, Pflanzengewebe oder Pflanzenzellen nützlich sind.
Kulturbehälter
können
aus Glas hergestellt sein, einschließlich beispielsweise Borsilikatglas
oder Natronglas, sowie aus Kunststoffen, einschließlich beispielsweise
durchsichtiges Polystyrol oder Polypropylen. Die Kulturbehälter sollten
im allgemeinen sauber sein, d.h. frei von Textilstaub, Staub oder
chemischen Rückständen; die
Zugabe des chemischen Mittels zu dem Kulturmedium macht jedoch die
Sterilisierung der Kulturbehälter
durch Hitze, Strahlung oder auf anderem chemischem Wege unnötig.
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Irgendein
Pflanzensamen, eine ganze Pflanze, ein isoliertes Pflanzenorgan,
Pflanzengewebe oder eine Pflanzenzelle kann in dem Pflanzengewebe-Kulturmedium,
das das chemische Mittel enthält,
kultiviert werden. Beispielsweise können Samen irgendeiner Pflanzenspezies
in dem Kulturmedium der vorliegenden Erfindung zum Keimen gebracht
werden. Derartige Samen können
von irgendeiner Spezies von zweikeimblättrigen, einkeimblättrigen
oder nacktsamigen Pflanze stammen, einschließlich irgendeiner holzigen
Pflanzenspezies, die als Baum oder Strauch wächst, irgendeiner krautartigen
Spezies oder irgendeiner Spezies, die essbare Früchte, Samen oder Gemüse produziert,
oder irgendeiner Spezies, die farbige oder duftende Blumen erzeugt.
Beispielsweise kann der Samen, die ganze Pflanze, das isolierte
Pflanzenorgan, das Pflanzengewebe oder die Pflanzenzelle aus einer
Pflanzenspezies ausgewählt
werden, aus der Gruppe, die besteht aus Gurke, Trichterwinde, Springkraut,
Paprika, Aubergine, Ringelblume, Lotosblume, Kohl, Gänseblümchen und
Nelke. Außerdem
umfasst für
Zwecke der vorliegenden Erfindung der Begriff "Pflanzensamen" auch die Sporen von Farnen und anderen
niedrigeren Gefäßpflanzen,
sowie die Sporen von Nichtgefäß-Pflanzen
wie beispielsweise Moosen, Lebermoosen und Hornmoosen.
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Trotz
der antimikrobiellen Natur des chemischen Mittels ist es bevorzugt,
dass bevor man einen Samen, eine Pflanze oder ein Pflanzenorgan
zur Initiierung einer neuen Kultur in das Kulturmedium gibt, der
Samen, die Pflanze oder das Pflanzenorgan oberflächensterilisiert werden sollten,
um Pilz- oder Bakteriensporen zu entfernen, die häufig zu Beginn
darauf in einer relativ hohen Dichte vorhanden sind. Techniken zur
Oberflächensterilisation
von Samen, Pflanzen und Pflanzenorganen sind auf dem Fachgebiet
gut bekannt und können unter
Verwendung irgendeines allgemein verfügbaren Sterilisierungsmittel
durchgeführt
werden, wobei jedoch eine Haushaltsbleiche (Natriumhypochloritlösung) mit
Wasser verdünnt
bevorzugt ist. Beispielsweise können einer
oder mehrere Samen wirksam durch Eintauchen in eine verdünnte Lösung von
Haushaltsbleiche in Wasser in einer Konzentration von beispielsweise
etwa 5 bis 20% (v/v) Bleiche mit oder ohne Tensid wirksam sterilisiert
werden, und zwar für
eine Zeit, die ausreicht, die Samen oberflächlich zu sterilisieren, beispielsweise etwa
10 min bis etwa 120 min. Die Samen werden dann vorzugsweise 3 mal
mit Wasser gewaschen.
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Pflanzenorgane,
die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
kultiviert werden können,
können,
ohne darauf beschränkt
zu sein, Blätter,
Stengel, Wurzeln, Vegetationsknospen, Blütenknospen, Meristeme, Embryonen,
Keimblätter,
Endosperm, Kelchblätter,
Blütenblätter, Stempel,
Carpellen, Stamina, Antheren, Pollen, Pollenschläuche, Keimknospen, Fruchtknoten
und Früchte
sein sowie Abschnitte, Schnitte oder Scheiben, die daraus gewonnen
wurden.
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Pflanzengewebe,
die gemäß der vorliegenden
Erfindung kultiviert werden können,
schließen,
ohne darauf beschränkt
zu sein, ein Kallusgewebe, zerkleinerte Gewebe, Gefäßgewebe,
Speichergewebe, Meristemgewebe, Blattgewebe, Sprossgewebe, Wurzelgewebe,
Gallengewebe, Pflanzentumorgewebe und reproduktive Gewebe.
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Pflanzenzellen,
die auf dem Kulturmedium der vorliegenden Erfindung kultiviert werden
können, schließen, ohne
darauf beschränkt
zu sein, ein isolierte Zellen mit Zellwänden, Aggregate davon mit unterschiedlichen
Größen sowie
Protoplasten.
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Irgendwelche
Pflanzen, Pflanzenorgane, Pflanzengewebe oder Pflanzenzellen, die
in vitro auf dem erfindungsgemäßen Kulturmedium
kultiviert wurden, können
auf frisches Kulturmedium mit dem chemischen Mittel zu geeigneten
Zeitpunkten für
ein kontinuierliches Wachstum, eine kontinuierliche Entwicklung
oder Differenzierung in vitro übertragen,
d.h. subkultiviert, werden.
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Die
vorliegende Erfindung weist einen zusätzlichen Vorteil dahingehend
auf, dass die Subkultivierung von Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen
durchgeführt
werden kann, ohne dass man Steriltechniken in einem strengen Sinne
anwenden muss oder eine sterile Arbeitsumgebung, wie beispielsweise
einen Laminarströmungsabzug,
verwenden muss.
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Die
vorliegende Erfindung sieht vor, dass kultivierte Pflanzen, Pflanzenorgane,
Pflanzengewebe und Pflanzenzellen von dem Kulturmedium der vorliegenden
Erfindung auf Kulturmedium übertragen
werden können,
das das chemische Mittel nicht umfasst, oder umgekehrt, je nach
Anwendungsfall.
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Die
vorliegende Erfindung sieht ferner vor, dass eine intakte Pflanze
oder ein intaktes Pflanzenorgan, die kultiviert, regeneriert oder
auf andere Weise auf dem erfindungsgemäßen Kulturmedium gehalten wurden, anschließend aus
der in vitro-Gewebekulturumgebung entfernt werden können und
auf ein Substrat übertragen
werden können,
beispielsweise Erde oder Vermikulit, für ein fortgesetztes Wachstum
und eine Entwicklung außerhalb
der in vitro-Umgebung.
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Die
vorliegende Erfindung stellt außerdem
einen Kit zur Kultivierung von Samen, Pflanzen, Pflanzenorganen,
Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen auf einem Pflanzengewebe-Kulturmedium
bereit, der ein chemisches Mittel in einer Konzentration aufweist,
die wirksam ist, eine mikrobielle Kontamination während der gesamten
Kulturperiode zu vermindern oder zu verhindern und die eine im wesentlichen
normale Keimung von Samen oder ein im wesentlichen normales Wachstum
oder eine im wesentlichen normale Entwicklung von Pflanzen, Pflanzenorganen,
Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen ermöglichen, wobei der Kit einen
Kulturbehälter
umfasst, der ein Pflanzengewebe-Kulturmedium mit dem chemischen
Mittel aufweist, in dem das Kulturmedium entweder bereits hergestellt
ist, d.h. fertig für
eine unmittelbare Verwendung ist, oder dafür bereit ist, durch Zugabe
von beispielsweise Wasser hergestellt zu werden. Der Kit umfasst
ferner einen oder mehrere Pflanzensamen, die vorzugsweise oberflächensterilisiert
wurden, oder eine oder mehrere Pflanzen, Pflanzenorgane, Pflanzengewebe
oder Pflanzenzellen.
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Nachdem
die Erfindung nunmehr in allgemeiner Form beschrieben wurde, läßt sich
diese einfacher unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele
verstehen, die zu Illustrationszwecken angeführt werden und nicht einer
Beschränkung
der vorliegenden Erfindung dienen sollen.
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5. BEISPIEL: HEMMEFFEKT
DES CHEMISCHEN MITTELS AUF EINE MIKROBIELLE KONTAMINATION
-
Die
folgenden Versuche wurden durchgeführt, um die antimikrobielle
Wirkung von zunehmenden Konzentrationen des chemischen Mittels in
einem Pflanzengewebe-Kulturmedium zu untersuchen.
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Ein
Standard-Pflanzenkulturmedium wurde hergestellt, das aus Murashige
und Skoog-Mineralsalzen, 2% (w/v) Saccharose, 0,4% (w/v) GelriteTM, mit KOH auf einen pH 5,8 eingestellt,
bestand und das nachfolgend beschriebene chemische Mittel entweder
enthielt oder nicht.
-
In
einem ersten Satz von Versuchen wurde ein chemisches Mittel, das
die folgenden Bestandteile umfasste, für die Zugabe zu dem Kulturmedium
vor der Autoklaven-Behandlung hergestellt.
Methylchlorisothiazolinon | 2,3
g |
Methylisothiazolinon | 0,7
g |
Magnesiumchlorid | 23,0
g |
Magnesiumnitrat | 23,0
g |
Kaliumsorbat | 20,0
g |
Natriumbenzoat | 20,0
g |
Destilliertes Wasser bis zu einem Gesamtvolumen
von 1 l.
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Es
wurden unterschiedliche Konzentrationen des obigen chemischen Mittels
in dem Kulturmedium untersucht, um die optimalen Konzentrationen
für eine
antimikrobielle Aktivität
zu bestimmen. Beispielsweise wurde ein Bereich von Konzentrationen
des chemischen Mittels von 0,2 bis 1,0% (v/v) in dem Kulturmedium in
0,1%-Schritten untersucht. Ein Konzentrationsbereich des chemischen
Mittels von 0,1 bis 0,2 (v/v) wurde in 0,025%-Schritten untersucht.
Schließlich
wurde ein Konzentrationsbereich des chemischen Mittels von 0,01 bis
0,1% in dem Kulturmedium in 0,01%-Schritten untersucht.
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Nach
der Zugabe des chemischen Mittels wurde das Kulturmedium einer Autoklavenbehandlung
(15 min, 121 °C)
unterzogen, um das Geliermittel aufzulösen. Alle anschließenden Manipulationen
erfolgten unter nicht-sterilen Bedingungen. Kulturmedien, die das
chemische Mittel enthielten, wurden in nicht-sterile Polystyrolbehälter gegossen,
mit nicht-sterilen Deckeln abgedeckt, und man ließ sie verfestigen.
Kulturmedium, das das chemische Mittel nicht enthielt, wurde entweder
in nicht-sterile Behälter
(Kontrolle A) oder in sterile Behälter (Kontrolle B) gegossen,
wobei die Behälter
mit nicht-sterilen bzw. sterilen Abdeckungen abgedeckt wurden, und
man ließ sie
verfestigen. Zehn Behälter,
die Kulturmedium mit dem chemischen Mittel bei jeder Konzentration
enthielten, und zehn Behälter
des Kontrollmediums A wurden 7 Tage bei 28 °C in der Dunkelheit inkubiert.
Nach einer Woche wurde in keinem Behälter, der Kulturmedium mit
dem chemischen Mittel enthielt, irgendeine mikrobielle Kontamination
festgestellt. Im Gegensatz dazu war eine mikrobielle Kontamination
in allen Kontrollbehältern
A zu erkennen, die ein Mittel von 6,5 Kolonien von Pilzen und Bakterien,
insgesamt, pro Behälter
enthielten.
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In
einem zweiten Experiment wurden 10 Behälter, die Kulturmedium mit
dem chemischen Mittel bei der jeweiligen Konzentration enthielten,
sowie 10 Kontrollbehälter
B aufgedeckt und der Außenluft
für 8 Stunden
ausgesetzt. Die Behälter
wurden wieder abgedeckt und 7 Tage bei 28 °C in der Dunkelheit inkubiert.
In keinem Behälter,
der Medium mit dem chemischen Mittel enthielt, war eine mikrobielle
Kontamina tion zu erkennen, mit Ausnahme von zwei Behältern, die
die niedrigste Konzentration des chemischen Mittels enthielten, d.h.
0,01% (v/v), von denen jeder eine einzelne Pilzkolonie auf der Oberfläche des
Mediums enthielt. Im Gegensatz dazu waren alle Kontrollbehälter B kontaminiert,
indem sie ein Mittel von 2,5 Kolonien von Pflanzen und Bakterien,
insgesamt, pro Behälter
enthielten.
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Es
wurden zusätzliche
Versuche durchgeführt,
um die Wirksamkeit von verschiedenen Formulierungen des chemischen
Mittels zu testen. Es wurde ein erstes chemisches Mittel hergestellt,
das alle sechs Bestandteile, die in dem oben formulierten chemischen
Mittel verwendet wurden, aufwies, d.h. Methylchlorisothiazolinon,
Methylisothiazolinon, Magnesiumchlorid, Magnesiumnitrat, Kaliumsorbat
und Natriumbenzoat, jeweils in der gleichen Konzentration wie oben.
Es wurde ein zweites chemisches Mittel mit den gleichen Bestandteilen
in den gleichen Konzentrationen wie oben hergestellt, dem jedoch
Natriumbenzoat fehlte. Es wurde ein drittes chemisches Mittel mit
den gleichen Bestandteilen in den gleichen Konzentrationen wie oben
hergestellt, dem jedoch Kaliumsorbat fehlte. Es wurde ein viertes
chemisches Mittel mit den gleichen Bestandteilen in den gleichen
Konzentrationen wie oben hergestellt, dem jedoch sowohl Kaliumsorbat
als auch Natriumbenzoat fehlten. Es wurde ein fünftes chemisches Mittel mit
nur Kaliumsorbat und Natriumbenzoat in den gleichen Konzentrationen
wie oben hergestellt. Es wurde ein sechstes chemisches Mittel mit
nur Kaliumsorbat in der gleichen Konzentrat wie oben hergestellt.
Es wurde ein siebtes chemisches Mittel mit nur Natriumbenzoat in der
gleichen Konzentration wie oben hergestellt.
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Pflanzenkulturmedien
wurden wie oben hergestellt. Die sieben wie oben hergestellten unterschiedlichen
chemischen Mittel wurden in verschiedene Ansätze eines obigen Pflanzenkulturmediums
bis zu einer Endkonzentration von 0,035% (v/v) in allen Medien außer den
Kontrollmedien eingearbeitet. Alle Pflanzenkulturmedien wurden dann
autoklavenbehandelt (121 °C,
15 min). Die Pflanzenkulturmedien mit den unterschiedlichen chemischen
Mitteln wurden in jeweils 10 nicht-sterile Polystyrolbehälter gegossen
und mit nichtsterilen Deckeln abgedeckt. Ein Kontrollkulturmedium
ohne chemisches Mittel wurde ebenfalls wie oben hergestellt. Die
Behälter
wurden 14 Tage bei 27 °C
in der Dunkelheit inkubiert.
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Nach
der Inkubation zeigten die 10 Behälter mit Kontrollkulturmedium
eine Gesamtzahl von 82 mikrobiellen Kolonien (0% wirksam). Kulturmedium
mit dem ersten chemischen Mittel (mit allen sechs Bestandteilen)
zeigten keine mikrobiellen Kolonien (100% wirksam). Kulturmedium
mit dem zweiten chemischen Mittel, dem nur Natriumbenzoat fehlte,
zeigte 7 mikrobielle Kolonien (91% wirksam). Kulturmedium mit dem
dritten chemischen Mittel, dem nur Kaliumsorbat fehlte, wies 10
mikrobielle Kolonien auf (88% wirksam). Kulturmedium mit dem vierten
chemischen Mittel, dem sowohl Kaliumsorbat als auch Natriumbenzoat
fehlten, wies 13 mikrobielle Kolonien auf (84% wirksam). Kulturmedium
mit dem fünften
chemischen Mittel, das nur Kaliumsorbat und Natriumbenzoat aufwies,
wiesen 31 mikrobielle Kolonien auf (22% wirksam). Kulturmedium mit
dem sechsten chemischen Mittel, das nur Kaliumsorbat aufwies, wies
55 mikrobielle Kolonien auf (33 wirksam). Schließlich wies Kulturmedium mit
dem siebten chemischen Mittel, das nur Natriumbenzoat umfasste,
65 mikrobielle Kolonien auf (21% wirksam).
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass verschiedene Formulierungen des chemischen
Mittels im Hinblick auf eine Verminderung oder Verhinderung des
Wachstums von Bakterien und Pilzen in Pflanzenkulturmedien unter
nicht-sterilen Bedingungen wirksam sind. Um jedoch gemäß der vorliegenden
Erfindung wirksam zu sein, müssen
die Bestandteile Methylchlorisothiazolinon, Methylisothiazolinon,
Magnesiumchlorid und Magnesiumnitrat in dem chemischen Mittel enthalten
sein.
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6. BEISPIEL: WIRKUNG DES
CHEMISCHEN MITTELS AUF DIE SAMENKEIMUNG
-
Die
folgenden Experimente wurden durchgeführt, um die Wirkungen von zunehmenden
Konzentrationen an chemischem Mittel in einem Pflanzenkulturmedium
auf die Samenkeimung und das anschließende Wachstum von Sprossen
und Wurzeln zu untersuchen. Das für diese Experimente verwendete
chemische Mittel umfasste Methylchlorisothiazolinon, Methylisothiazolinon,
Magnesiumchlorid, Magnesiumnitrat, Kaliumsorbat und Natriumbenzoat
und war wie oben für
den ersten Satz Versuche im Abschnitt 5 beschrieben formuliert und
wurde dem Kulturmedium wie oben zugesetzt. Das Kulturmedium wurde
dann autoklavenbehandelt (121 °C,
15 min).
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Samen
von 10 Pflanzenspezies wurden entweder oberflächensterilisiert oder nicht
oberflächensterilisiert.
Samen, die oberflächensterilisiert
werden sollten, wurden in 20–40%
(v/v) Haushalts-Bleichlösung
für 30 min
eingetaucht und dreimal mit normalem, nicht-sterilem Leitungswasser
gewaschen. Die Samen wurden dann etwa 1/10 Zoll in verfestigtes
Kulturmedium mit dem chemischen Mittel bei der jeweiligen Konzentration eingeschoben.
Bei jeder Konzentration des chemischen Mittels wurden 100 Samen
für jede
Pflanzenspezies getestet. Die Behälter wurden 7 Tage bei 28 °C in der
Dunkelheit inkubiert, und dann auf sowohl mikrobielle Kontamination
als auch den Prozentsatz der Samenkeimung gescreent.
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Was
die mikrobielle Kontamination angeht, erschienen bei Konzentrationen
des chemischen Mittels von 0,4% (v/v) und weniger Kolonien von Bakterien
und Pilzen auf etwa 86% der Samen, die nicht oberflächensterilisiert
waren, während
oberflächensterilisierte
Samen bei allen Konzentrationen frei von irgendeiner mikrobiellen
Kontamination blieben.
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Die
Wirkung der Konzentration des chemischen Mittels auf den Prozentsatz
der Samenkeimung variierte mit der Pflanzenspezies. Beispielsweise
keimten oberflächensterilisierte
Gurkensamen bei einer 1,0% (v/v)-Konzentration des chemischen Mittels
zu einem hohen Prozentsatz (72%), während die Keimung von oberflächensterilisierten
Lotussamen dramatisch vermindert war (5%) (Tabelle 1). Der Prozentsatz
der Keimung von oberflächensterilisierten
Samen blieb für
alle Spezies (>50%)
bei Konzentrationen des chemischen Mittels bis zu und einschließlich 0,2%
(v/v) hoch.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe des chemischen Mittels zu dem
Kulturmedium bis zu einer Konzentration von 0,2% (v/v) eine im wesentlichen
normale Samenkeimung für
alle untersuchten Spezies gestattete, dass jedoch einige Spezies,
z.B. Gurke, Trichterwinde, Springkraut usw. eine im wesentlichen
normale Keimung bis zu einer Konzentration des chemischen Mittels
im Medium von 1,0% (v/v) zeigten. Zusätzlich zeigen diese Ergebnisse,
dass eine Oberflächensterilisation
von Samen bevorzugt ist, damit das chemische Mittel in dem Kulturmedium
seine optimale Wirkung auf die Verminderung oder Verhinderung einer
mikrobiellen Kontamination von Pflanzengewebekulturen entwickelt,
und zwar aufgrund der hohen Dichte von Bakterien- und Pilzsporen,
die normalerweise auf den Samen der meisten Pflanzenspezies vorhanden
sind.
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Es
ist bemerkenswert, dass Samen, die nicht oberflächensterilisiert waren, im
allgemeinen einen höheren
Prozentsatz von Keimung zeigten, als Samen der gleichen Spezies,
die oberflächensterilisiert
waren (Tabelle 1). Dieser Unterschied war deutlicher in Medien mit
Konzentrationen des chemischen Mittels von 0,2% (v/v) und höher, und
kann das Ergebnis der Bleichung sein, die die Samenhülle durchlässiger macht,
wodurch der Samen gegenüber
dem chemischen Mittel empfindlicher wird.
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Im
Hinblick auf das anschließende
Wachstum von Sprossen und Wurzeln aus den keimenden Samen wuchsen
für alle
Spezies bei Konzentrationen des chemischen Mittels von 0,3% (v/v)
und höher
entweder keine Wurzeln aus den keimenden Samen, oder die Wurzeln,
die wuchsen, waren in ihrem Wachstum und ihrer Entwicklung eingeschränkt (Tabelle
2). Ein normales Wachstum und eine normale Entwicklung von sowohl Sprossen
als auch Wurzeln wurden für
alle Pflanzenspezies in Kulturmedien beobachtet, die eine Konzentration
des chemischen Mittels von 0,05% oder weniger enthielten.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass während
eine Konzentration von 0,05% (v/v) des chemischen Mittels oder weniger
in dem Kulturmedium ein im wesentlichen normales Wachstum und ein
im wesentlichen normale Entwicklung von Sprossen und Wurzeln bei
allen untersuchten Spezies ermöglichte,
einige Spezies, z.B. Gurke und Kohl, im wesentlichen normale Sprossen
und Wurzeln in Kulturmedium liefern, das das chemische Mittel in
einer Konzentration bis zu 0,2% (v/v) enthielt. Wie oben im Abschnitt
4 beschrieben wurde, kann die optimale Konzentration des chemischen
Mittels für
andere Pflanzenspezies empirisch und ohne unzumutbaren Versuchsaufwand
bestimmt werden.
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7. BEISPIEL: WIRKUNG DES
CHEMISCHEN MITTELS AUF DIE ORGANBILDUNG AUS KALLUSGEWEBE
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Die
folgenden Versuche wurde durchgeführt, um die Wirkungen von steigenden
Konzentrationen des chemischen Mittels in Kulturmedien auf die Organbildung
aus Kallusgewebe zu untersuchen. Das für diese Experimente verwendete
chemische Mittel umfasste Methylchlorisothiazolinon, Methylisothiazolinon,
Magnesiumchlorid, Magnesiumnitrat, Kaliumsorbat und Natriumbenzoat,
formuliert wie oben.
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Auberginenblätter (cv.
Black Beauty) von Pflanzen, die in vitro gezüchtet worden waren, wurden
in kleine Quadrate (etwa 1 × 1
cm) geschnitten und zwar unter Anwendung von Steriltechniken. Zehn
Blattquadrate wurden auf Kulturmedium mit Murashige und Skoog Mineralsalzen,
Vitaminen, einschließlich
Thiamin, Pyridoxin und Nikotinsäure,
3 Saccharose (w/v), 2 mg/l Naphthalinessigsäure (NAA) und 0,8% Agar (w/v)
(Kontrollmedium) bei pH 5,8 inkubiert, wobei das Medium vor der
Verwendung einer Autoklaven-Behandlung unterzogen worden war (121 °C, 15 min).
Zehn Blattquadrate wurden jeweils auf dem gleichen Typ von Kulturmedium wie
oben inkubiert, das jedoch außerdem
entweder 0,03% oder 0,04% (v/v) des chemischen Mittels aufwies. Die
Kulturen wurden in der Dunkelheit bei 27 °C inkubiert. Nach 30–40 Tagen
hatten sich etwa 50 mg weißes Kallusgewebe
auf allen Blattquadraten auf allen Medien vermehrt.
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Das
Kallusgewebe wurde von jeden der Blattquadrate getrennt und auf
frischen Kulturmedien, die wie oben hergestellt worden waren, subkultiviert,
außer
dass NAA durch trans-Zeatin (2 mg/l) ersetzt wurde. Die Kallusgewebe
wurden bei 27 °C
mit einer Lichtbehandlung von 10.000 ft-candles für 10 Stunden
pro Tag unterzogen. Nach 37 Tagen regenerierten die Kallusgewebe
auf allen Medien im Mittel 28 Sprossen pro Kallusgewebe. Die Sprossen
wurden von dem Kallusgewebe getrennt und in frisches Kulturmedium
eingesetzt, das wie oben hergestellt worden war, dem jedoch alle
Phytohormone fehlten. Alle Sprossen führten zu einer Regeneration
von Wurzeln auf allen Kulturmedien.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe einer antimikrobiell wirksamen
Konzentration an chemischem Mittel zu dem Kulturmedium die Kallusbildung,
Kallusvermehrung oder Pflanzenregeneration nicht negativ beeinträchtigte.
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Während die
vorliegende Erfindung in Verbindung mit spezifischen Ausführungsformen
beschrieben wurde, versteht es sich, dass sie weiteren Modifikationen
unterzogen werden kann. Diese Anmeldung soll irgendwelche Variationen,
Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung abdecken, die im allgemeinen
den Prinzipien der Erfindung folgen und soll solche Abweichungen
von der vorliegenden Offenbarung beinhalten, zu denen es bei einer
bekannten oder üblichen
Praxis auf dem Fachgebiet, auf das sich die Erfindung bezieht, kommt,
und wie sie auf die wesentlichen oben beschriebenen Merkmale angewandt
werden können,
wie es sich aus dem Bereich der beigefügten Ansprüche ergibt.
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