-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
1. Gebiet der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft eine neue Xylanase-Verbindung und
ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Speziell betrifft die Erfindung
eine gereinigte Xylanase-Verbindung, die von Acidothermus sp. und
insbesondere Acidothermus cellulolyticus abstammt, und die Verwendung
dieses Enzyms beim Bleichen von Zellstoff und Papier und Behandeln
von Futterzusammensetzungen.
-
2. Stand der
Technik
-
Es
ist bekannt, dass Xylanasen von einer Anzahl von verschiedenen Mikroorganismen
produziert werden. Im Allgemeinen werden mehrere xylanolytische
Enzyme von einem Mikroorganismus produziert, wobei jede der Xylanasen
so wirkt, dass sie verschiedene Bindungen in dem Holzkomplex angreift.
Versuche, in industriellen Prozessen Enzyme, die sowohl aus Pilz-
als auch aus Bakterien-Quellen abstammen, z.B. für die Verbesserung der Delignifizierung
und der Aufhellung unter Verringerung oder Beseitigung der Verwendung von
Chlor beim Bleichen von Lignocellulose-Zellstoff in der Papierindustrie
oder zur Verbesserung des Wertes von Tierfutter zu verwenden, sind
in der Literatur beschrieben worden.
-
Xylanasen,
z.B. Endo-beta-Xylanasen (EC 3.2.1.8), welche die Xylan-Hauptkette
hydrolysieren, sind bezüglich
ihrer Verwendung beim Bleichen von Lignocellulose-Material untersucht
worden. Zum Beispiel ist im U.S. Pat. Nr. 5,179,021 die Kombination
einer Xylanase- und Sauerstoff-Behandlung beim Bleichen von Zellstoff
als besonders nützlich
offenbart. In der PCT-Anmeldung Veröffentlichungs-Nr. WO 92/03541
ist ein Verfahren zum Auflösen
von Hemicellulose mit Hemicellulasen offenbart, die von dem Pilz
Trichoderma reesei abstammen. Die Suche nach Xylanasen hat sich
jedoch auf thermophile und alkalophile Xylanasen konzentriert, die
unter Zellstoff-Bleichbedingungen mit Verwendung hoher Temperaturen
und von Alkali nützlich
sind. Jedoch findet die Verwendung von Sauerstoff- oder Ozon-Bleichen im Allgemeinen
bei einem niedrigereren pH statt. Demgemäß wäre es vorteilhaft, eine Xylanase
bei niedrigem pH zu entdecken, die bei hohen Temperaturen eine signifikante
Aktivität
aufweist
-
Kürzlich sind
mehrere thermophile Xylanasen aus Pilz- und Bakterien-Mikroorganismen
identifiziert worden. Zum Beispiel ist eine thermophile Xylanase
aus Actinomadura, die als Microtetraspora umklassifiziert worden
ist, mit einem optimalen pH von 6,0 – 7,0 und einem Temperaturbereich
von 70 – 80 °C isoliert
worden (Holtz, C. et al., Antonie van Leewenhoek 59: 1-7, 1991).
Die
EP 473 545 offenbart,
dass der Bakterienstamm Thermomonospora fusca thermostabile Xylanasen
produziert, die bei Temperaturen von 10 – 90 °C, bevorzugt 50 – 80 °C über einen
großen
pH-Bereich, d.h. von etwa 5 – 10,
mit einem bevorzugteren Bereich zwischen 6,6 – 9,5, aktiv sind. Zusätzlich offenbart
die WO 92/18612 ein Xylanase-Enzym, das von der Gattung Dictyoglomus
abstammt, mit einer Aktivität über einen
breiten pH-Bereich
(5,0 – 9,0)
und einer Thermostabilität
bei Temperaturen im Bereich von 60 – 90 °C. Das thermophile cellulolytische
Bakterium Acidothermus cellulolyticus ist in Mohagheghi et al.,
Int. J. Systematic Bact., Bd. 36, Nr. 3, S. 435-443 (1986) beschrieben,
und die Produktion von Cellulase ist in Shiang et al., Appl. Microb.
Biotech., Bd. 34, S. 591-597 (1991) beschrieben. Jedoch beschreibt
keine dieser Literaturstellen eine gereinigte Xylanase, die bei
niedrigem pH und hoher Temperatur nützlich sein kann.
-
Xylanasen
sind auch in Tierfuttern nützlich,
um zu ermöglichen,
dass die Tiere das Futter wirksamer verdauen. Ein Ergebnis des Zusatzes
von Xylanase zu Futter ist eine Verbesserung des Futter-Umrechnungsverhältnisses
(FCR [Feed Conversion Ratio]) eines Futters ohne Erhöhung von
dessen Kosten pro Gewichtseinheit. Das FCR eines Futters ist das
Verhältnis
der verzehrten Futtermenge relativ zur Gewichtszunahme des Tieres.
Ein niedriges FCR zeigt an, dass eine gegebene Futtermenge ein wachsendes
Tier zum Ergebnis hat, das eine verhältnismäßig größere Gewichtszunahme erzielt.
Dies bedeutet, dass das Tier das Futter wirksamer verwerten kann.
Eine Weise, in der das FCR verringert werden kann, besteht darin,
seine Verdaulichkeit durch ein Tier zu verbessern, wodurch der Ernährungsvorteil
erhöht
wird, den das Tier daraus ableiten kann.
-
Jedoch
gibt es verschiedene Beschränkungen
bei der Verdaulichkeit der Ernährungskomponenten
eines Futters, wie dessen Stärke-,
Fett-, Protein- und Aminosäure-Gehalt.
Diese Beschränkungen
umfassen:
- (i) die Viskosität der Materialien, die im Eingeweide
des Tiers anwesend sind; eine derartige Viskosität beruht zumindest teilweise
auf löslichen
Nicht-Stärke-Polysacchariden,
wie gemischt verknüpften β-Glucanen und
Arabinoxylanen;
- (ii) den Einschluss von Nährstoffen
innerhalb der Zellwände
des Futters, insbesondere derjenigen der Aleuronschicht in Zerealien.
Ein derartiger Einschluss wird durch die hohen Gehalte an Nicht-Stärke-Polysacchariden in
den Zellwänden
von Zerealien verursacht, die gegenüber einem Abbau durch das Verdauungssystem
des Tiers relativ beständig
sind. Dies verhindert, dass die Nährstoffe, die innerhalb der
Zellen eingeschlossen sind, für
das Tier als Ernährung
verfügbar
sind; und
- (iii) einen Mangel an endogener Enzym-Aktivität sowohl
des Tiers als auch der Eingeweide-Mikrobenpopulation, insbesondere in
einem jungen Tier.
-
Die
vorstehenden Probleme, welche die Verdaulichkeit stören, sind
insbesondere im Fall von Futter auf Zerealien-Basis, wie jenem mit
einem hohen Weizen-Gehalt, festzustellen.
-
Aufgrund
des Problems einer schlechten Verdaulichkeit von Nährstoffen
aus dem Futter ist es normalerweise erforderlich, Futter zu formulieren,
die hohe Gehalte an Energie- und Protein-liefernden Materialien enthalten,
um die Nahrungsanforderungen der Tiere zu erfüllen.
-
Es
gibt nun umfangreiche Belege, die zeigen, dass die Einverleibung
gewisser (ergänzender)
Enzyme in Tierfutter auf Zerealien-Basis vorteilhaft sein kann,
die Viskosität
von im Eingeweide des Tiers vorliegendem Material zu verringern.
Diese Verringerung kann durch Enzyme wie Xylanasen erzielt werden,
die lösliche
Xylane hydrolysieren, wodurch die Viskosität des Nahrungsbreis verringert
wird, welche eine bedeutende Beschränkung beim Verdauungsvorgang
ist.
-
Die
Xylanasen, die als Ergänzungen
zugesetzt werden, müssen
bei den pH- und Temperatur-Bedingungen,
die im Gastrointestinal (GI)-Trakt des Zieltiers angetroffen werden,
stabil und aktiv sein. Wenn sie nicht stabil und aktiv sind, wenn
sie derartigen In-vivo-Bedingungen ausgesetzt werden, sind sie nicht
in der Lage, die Viskosität
des Speisebreis in irgendeinem signifikanten Ausmaß zu verringern.
Es ist derzeit bekannt, Xylanasen als Ergänzung in ein Tierfutter einzuschließen, welche
von Pilzen wie Trichoderma Iongibrachiatum, Aspergillus niger und
Humicola insolens abstammen. Bedford und Classen (The Journal of
Nutrition, Bd. 122, S. 560-569) offenbaren, dass es im Fall von
Brathühnchen
eine signifikante Korrelation zwischen der in vivo gemessenen Viskosität des Speisebreis
und der Körpergewichtszunahme
und den FCR-Werten gibt. Im Fall von an Geflügel verfüttertem Futter auf Weizen-
und Roggen-Basis wurde gezeigt, dass so viel wie 70 – 80 % der
Schwankungen der Gewichtszunahme und des FCR allein auf Unterschieden
der intestinalen Viskosität
beruhen. Dies hebt die Bedeutung der Viskosität des Speisebreis bei Futter
auf Zerealien-Basis hervor, das hohe Gehalte an löslichen
Arabinoxylanen enthält.
Wenn die Viskosität
des Speisebreis zunimmt, verringert diese die Verdaulichkeit aller
Nährstoffe
durch Störung
der Diffusion von Pankreas-Enzymen, Substraten und der Endprodukte
des Verdauungsvorgangs.
-
Jedoch
wird die Verwendung von Enzym-Ergänzungen, wie Xylanase, in Tierfutter
durch die Verarbeitungsanforderungen für körnige Zusätze erschwert. Häufig werden
derartige Enzym-Ergänzungen
erhalten, indem das Enzym einem physiologisch annehmbaren Träger, wie
einer Zerealie, einimprägniert
wird. Der imprägnierte
Träger
wird mit den anderen Komponenten des Futters gemischt und dann zu
Würfeln
oder Pellets für die
direkte Verfütterung
an Tiere gepresst. Die Verfahren, die entwickelt worden sind, verwenden
relativ hohe Temperaturen. Dies geschieht erstens, um die Effizienz
des Herstellungsverfahrens zu verbessern, und zweitens, um Futter
zu erzeugen, die frei von schädlichen
Bakterien, insbesondere Salmonella, sind. Zusätzlich verbessert die Verwendung
von hohen Temperaturen die Qualität und Haltbarkeit der resultierenden
Würfel und
Pellets, erhöht
den Bereich an Bestandteilen, die wirksam gehandhabt werden können und
erhöht
auch den Gehalt an flüssigen
Bestandteilen, wie Fetten und Melassen, die dem Futter einverleibt
werden können.
-
Die
Verarbeitungstechniken für
Futterkomponenten verwenden derzeit relativ hohe Temperaturen über eine
relativ lange Zeitspanne. Weiter wird die Mischung bei der Pelletierung
relativ hohen Drücken
ausgesetzt, um die Haltbarkeit der gebildeten Würfel oder Pellets zu erhöhen. Eines
der Verarbeitungsverfahren, das entwickelt worden ist, um die Ernährungseigenschaften
des Futters zu verbessern, ist die Wasserdampf-Pelletierung. Dieses
Verfahren umfasst den Schritt der Behandlung des compoundierten
Futters mit Wasserdampf, um dessen Temperatur und Feuchtigkeitsgehalt
zu erhöhen.
Dieser Schritt wird als Konditionierung bezeichnet. Die Konditionierung
dauert von wenigen Sekunden bis zu mehreren Minuten, abhängig von der
Art und Formulierung des Futters. Die Temperatur in der Konditioniervorrichtung
kann auf 100 °C
ansteigen. Danach wird das Futter durch eine Pelletierungsdüse geleitet,
die aufgrund von Reibung eine rasche Zunahme seiner Temperatur bewirkt.
-
Kürzlich ist
eine neue Vorrichtung zur Vorbehandlung und Konditionierung von
Futtern eingeführt
worden, die als Expander bezeichnet wird. Diese Vorrichtung ermöglicht eine
aufrechterhaltene Konditionierung unter Druck, gefolgt von einer
Pelletierung. Gemäß dieser
Technik werden verschiedene Futter-Komponenten, die zuvor einer
Wasserdampf-Konditionierung unterzogen worden sind, in eine Kompressionsschnecke
eingespeist, in die mehr Wasserdampf eingespritzt wird, und die
Masse wird dann einem zunehmenden Druck und einer zunehmenden Schereinwirkung
ausgesetzt und dann durch einen variablen Ausgangsspalt gepresst. Das
komprimierte Produkt wird nach Verringerung der Teilchengröße in eine
Standard-Pelletierungspresse eingespeist. Die Verweilzeit der Futter-Komponenten
in dem Expander beträgt
etwa 5 – 20
Sekunden, und die erreichte Temperatur kann so hoch wie 145 °C sein. Ein
Kompressionsdruck von etwa 3,5 MPa wird erreicht, aber der Aufbau
von sowohl Temperatur als auch Druck ist sehr rasch, und beide fallen
schnell, wenn das Produkt aus den Austrittsspalt ausgestoßen wird.
Die Verwendung von Expandern ist vorteilhaft, da sie schädliche Bakterien,
insbesondere Salmonella, wirksam eliminieren. Weiter ist es möglich, vor
der Pelletierung relativ hohe Gehalte an Fett und anderen flüssigen Bestandteilen
in die Mischung einzuschließen.
Zusätzlich
hat das Kochen und die Druck/Schereinwirkung eine größere Stärke-Verkleisterung
zur Folge.
-
Leider
sind die Hochtemperatur- und Hochdruck-Verarbeitungsbedingungen,
die für
Expander- und Pelletierungstechnologie charakteristisch sind, insbesondere,
wenn sie unter den feuchten Bedingungen angewendet werden, auf die
man normalerweise bei der Pelletierung trifft, für gewisse Futterkomponenten
potentiell zerstörerisch.
Dies ist insbesondere für
alle Enzyme, einschließlich
Xylanasen, die anwesend sind, wahr. So wiesen die Enzyme des Standes
der Technik allgemein das Problem auf, dass sie unter den Verarbeitungsbedingungen
von kommerziellen Pelletierungsvorgängen nicht ausreichend stabil
sind, um eine wirtschaftliche Verwendung derartiger Pelletierungstechniken
zu ermöglichen.
-
Obwohl
Teillösungen
des Problems der Enzymstabilität
während
der Futterverarbeitung verfügbar sind,
löst demnach
keine von ihnen das Problem auf eine vollständig wirksame Weise.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Es
ist ein Ziel der Erfindung, eine neue Xylanase mit einer signifikanten
Aktivität
bei niedrigem pH und hoher Temperatur bereitzustellen.
-
Es
ist ein weiteres Ziel der Erfindung, verbesserte Mittel zur Behandlung
von Futterkörnern
zur Verbesserung von deren Verdaulichkeit bereitzustellen.
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine gereinigte Xylanase bereitgestellt, welche durch
die folgenden physikalischen Eigenschaften gekennzeichnet ist: ein
pH-Optimum von etwa 3,6 bis 4,2, ein Molekulargewicht von etwa 50 – 55 kD,
wie durch Gelfiltration bestimmt, ein Temperaturoptimum von etwa
70 – 80 °C und einen
pI von etwa 6,0 – 6,5.
Vorzugsweise stammt die Xylanase von Acidothermus sp., bevorzugter
von Acidothermus cellulolyticus und am bevorzugtesten von Acidothermus
cellulolyticus ATCC 43068 ab.
-
In
einer Verbindungs-Ausführungsform
der Erfindung wird eine gereinigte Xylanase-Verbindung bereitgestellt,
wobei die Xylanase von Acidothermus sp. abstammt und ein pH-Optimum
von etwa 3,6 bis etwa 4,2, ein Molekulargewicht von etwa 50 – 55 kD,
wie durch Gelfiltration bestimmt, ein Temperaturoptimum von etwa
70 – 80 °C und einen
pI von etwa 6,0 – 6,5
aufweist.
-
In
einer weiteren Zusammensetzungs-Ausführungsform der Erfindung wird
ein Futterzusatz bereitgestellt, in dem der Futterzusatz eine Xylanase
umfasst, die von Acidothermus sp. abstammt und ein pH-Optimum von
etwa 3,6 bis 4,2, ein Molekulargewicht von etwa 50 – 55 kD,
wie durch Gelfiltration bestimmt, ein Temperaturoptimum von etwa
70 – 80 °C und einen
pI von etwa 6,0 – 6,5
aufweist.
-
In
einer weiteren Verfahrensausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Futterzusatz, der eine von Acidothermus
sp. abstammende Xylanase umfasst, wie in Anspruch 1 angegeben, zur
Verbesserung der Qualität
von Tierfutter auf Körner-Basis
verwendet.
-
KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
1 veranschaulich
die Temperaturabhängigkeit
der Aktivität
von Xylanase gemäß der Erfindung
bei RBB-Xylan bei einem pH von 4,5 über 10 Minuten;
-
2 veranschaulicht
die Halbwertszeit von Xylanase, die in einem Temperaturbereich behandelt wird.
-
3 veranschaulicht
die relative Aktivität
von Xylanase der Erfindung in einem pH-Bereich und zeigt das pH-Optimum;
-
4 veranschaulicht
die Stabilität
von Xylanase der Erfindung im Lauf der Zeit nach Behandlung bei einem
pH von 3,3.
-
DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine gereinigte Xylanase bereitgestellt, die durch
die folgenden physikalischen Eigenschaften charakterisiert ist:
ein pH-Optimum von etwa 3,6 bis 4,2, ein Molekulargewicht von etwa
50 – 55
kD, wie durch Gelfiltration bestimmt, einen pI von etwa 6,0 bis
6,5 und ein Temperaturoptimum von etwa 70 – 80 °C. Vorzugsweise stammt die Xylanase
von Acidothermus sp., bevorzugter von Acidothermus cellulolyticus
und am bevorzugtesten von Acidothermus cellulolyticus ATCC 43068
(hinterlegt bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn
Drive, Rockville, Maryland, USA 20852) ab. Acidothermus cellulolyticus
ist taxonomisch in Int. J. Systematic Bact., Bd. 36, S. 435-443
(1986) und im U.S Patent Nr. 5,366,884 beschrieben, welche hierin
durch Bezugnahme aufgenommen werden.
-
In
einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Xylanase, die von Acidothermus
sp. und bevorzugt von Acidothermus cellulolyticus abstammt, bei
der Herstellung eines Tierfutters auf Zerealien-Basis verwendet.
In einem derartigen Futter auf Zerealien-Basis ist die Zerealie
bevorzugt mindestens eine aus Weizen, Gerste, Mais, Sorghum, Roggen,
Hafer, Triticale und Reis. Es wird besonders bevorzugt, dass die
Zerealie Weizen ist.
-
Das
Futter auf Zerealien-Basis gemäß der vorliegenden
Erfindung kann Tieren wie Truthähnen,
Gänsen,
Enten, Schafen und Kühen
verfüttert
werden. Es wird jedoch besonders bevorzugt, dass das Futter Schweinen
und Geflügel
und insbesondere Brathühnchen
verfüttert
wird. Das Futter auf Zerealien-Basis
umfasst bevorzug 0,00001 – 10
g Xylanase-Protein pro Kilo des Futters, bevorzugter schließt es etwa
0,0001 – 1 g
Xylanase-Protein pro Kilo des Futters und am bevorzugtesten etwa
0,001 – 0.1
g Xylanase-Protein pro Kilo des Futters ein. Das Futter auf Zerealien-Basis
umfasst mindestens 20 Gew.-% Zerealie. Bevorzugter sollte es mindestens
30 Gew.-% der Zerealie und am bevorzugtesten mindestens 50 % Gew.-%
der Zerealie einschließen.
Bei der Zerealie kann es sich um irgendeine der vorstehend erwähnten handeln,
wobei Weizen besonders bevorzugt ist.
-
Obwohl
die Zerealien-Komponente eines Futters auf Zerealien-Basis eine
Proteinquelle darstellt, ist es gewöhnlich notwendig, Quellen von
ergänzendem
Protein in das Futter einzuschließen, wie jene, die von Fischmehl,
Fleischmehl oder Pflanzen abstammen. Quellen von Pflanzenproteinen
umfassen mindestens eines aus Vollfett-Sojabohnen, Rapssamen, Canola,
Sojabohnenmehl, Rapssamenmehl und Canolamehl. Verglichen mit herkömmlichen
Futtern kann die relative Menge der zusätzlichen Proteinquellen, wie
Fischmehl, Fleischmehl oder Pflanzenprotein, verringert werden,
wenn man die Lehre der vorliegenden Erfindung übernimmt, was signifikante
Kosteneinsparungen zur Folge hat. Dies ist der Fall, da die relativen
Kosten von Zerealien signifikant geringer sind als diejenigen von
herkömmlichen
Protein-Ergänzungen.
Im Hinblick darauf kann gemäß der Lehre
der vorliegenden Erfindung ein Futter hergestellt werden, das den
gleichen Nährwert
bezüglich
verfügbarer
Energie, verfügbaren
Aminosäuren
und verfügbarem
Protein aufweist wie herkömmliches
Futter, das aber einen höheren
relativen Anteil an Zerealie und einen niedrigeren relativen Anteil
an Protein-Ergänzungen
einschließt.
Es wird auch gefunden, dass der Einschluss einer thermostabilen
Xylanase in ein Tierfutter die Wirkung besitzt, dass verringerte
Konzentrationen an Energie-Ergänzungen,
wie Fetten und Ölen, eingeschlossen
werden müssen,
um ein Futter mit einem gewissen Maß an Qualität zu erzielen.
-
Der
Einschluss einer thermostabilen Xylanase in ein Tierfutter gemäß der vorliegenden
Erfindung ermöglicht,
dass der Rohprotein-Wert und/oder die Verdaulichkeit und/oder der
Aminosäure-Gehalt
und/oder die Verdaulichkeits-Koeffizienten des Futters erhöht werden,
was eine Verringerung der Mengen an alternativen Proteinquellen
und/oder Aminosäure-Ergänzungen
ermöglicht,
die früher
erforderliche Bestandteile von Tierfuttern waren. Wenn der Protein-Verdaulichkeitskoeffizient
und/oder der Gehalt an verfügbarem
Rohrprotein von Weizen durch den Zusatz der thermostabilen Xylanase
erhöht
wird, können
Haupteinsparungen bei den verringerten Konzentrationen an Protein-
und/oder Energie-Ergänzungen
gefunden werden, die herkömmlich zugesetzt
werden mussten. Alternativ werden, wenn nur der Aminosäure-Gehalt
oder die Verdaulichkeits-Koeffizientenwerte durch den Zusatz der
thermostabilen Xylanase erhöht
werden, die Haupteinsparungen bei den verringerten Anteilen an Aminosäure-Ergänzungen
gefunden, welche herkömmlich
den Futtern zugesetzt werden mussten.
-
Das
Futter, das von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird,
kann auch andere Enzym-Ergänzungen
einschließen,
wie eine oder mehrere aus β-Glucanase,
Glucoamylase, Mannanase, α-Galactosidase, Phytase,
Lipase, α-Arabinofuranosidase,
Protease, α-Amylase,
Esterase, Oxidase, Oxido-Reduktase
und Pektinase. Es wird besonders bevorzugt, eine Protease als weitere
Enzym-Ergänzung
einzuschließen,
wie ein Subtilisin, das von der Gattung Bacillus abstammt. Derartige
Subtilisine sind zum Beispiel in Einzelheiten im U.S. Patent Nr.
4,760,025 beschrieben.
-
Ein
geeignetes Futter gemäß der vorliegenden
Erfindung kann erhalten werden, indem man einen Futterzusatz, der
einen physiologisch annehmbaren Träger und die thermostabile Xylanase
umfasst, herstellt und dann diesen Zusatz in Mengen von 0,01 bis
50 g pro Kilogramm mit den anderen Komponenten mischt, die das Tierfutter
ausmachen (einschließlich
der Zerealie und anderer Quellen von Protein-Ergänzung), bevorzugter 0,1 – 10 g/kg
und am bevorzugtesten etwa 1 g/kg.
-
Der
physiologisch annehmbare Träger
in diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt eine Zerealie
oder stammt von einer Zerealie ab. Derartige Zerealien umfassen
gemahlenen Weizen, Mais, Soja, Zucker, Stärken oder ein Nebenprodukt
irgendeines oder irgendeiner von diesen. Derartige Träger sind
auf diesem technischen Gebiet herkömmlich und werden deshalb nicht
in weiterer Einzelheit beschrieben.
-
Der
Futterzusatz gemäß diesem
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird mit anderen Futter- Komponenten vereinigt,
um ein Futter auf Zerealien-Basis zu produzieren. Derartige andere
Futterkomponenten umfassen eine oder mehrere andere (bevorzugt thermostabile)
Enzym-Ergänzungen,
Vitamin-Futterzusätze,
Mineral-Futterzusätze
und Amino-Futterzusätze.
Der resultierende (kombinierte) Futterzusatz, der möglicherweise
mehrere verschiedene Arten von Verbindungen einschließt, kann
dann in einer geeigneten Menge mit den anderen Futter-Komponenten,
wie Zerealie und Protein-Ergänzungen,
gemischt werden, um ein Tierfutter zu bilden. Die Verarbeitung dieser
Komponenten zu einem Tierfutter kann unter Verwendung irgendeiner
der derzeit verwendeten Verarbeitungsvorrichtungen, wie einer Doppelpelletierungsmaschine,
einer Wasserdampf-Pelletiervorrichtung, einem Expander oder einem
Extruder, durchgeführt
werden.
-
Die
Anwesenheit der thermostabilen Xylanase in dem resultierenden Futter
auf Zerealien-Basis weist die Wirkung der Verringerung von dessen
FCR auf. Die Xylanase kann alternativ oder zusätzlich die Verdaulichkeit des
Futters auf Zerealien-Basis erhöhen.
Weiter kann der Einschluss der Xylanase zusätzlich oder alternativ die
Rate der Körpergewichtszunahme
in einem Tier pro Mengeneinheit Futter erhöhen, welche das Tier aufnimmt.
-
Weiter
können
die Xylanasen der vorliegenden Erfindung Anwendung bei der Verbesserung
der Delignifizierung und/oder des Bleichens von Zellstoff gemäß auf diesem
Gebiet anerkannten Techniken finden. Das Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen
des Zellstoffs mit Xylanase des ganzen Überstands oder einer oder mehreren
der oben beschriebenen gereinigten Xylanasen und hängt von
Faktoren wie dem pH, der Temperatur, der Behandlungszeit, der Enzymdosierung
und der Menge und der Art des Zellstoffs ab.
-
Das
obige Verfahren sollte bei einer Temperatur und einem pH durchgeführt werden,
der die Enzymaktivität
verstärkt.
Die Temperaturen können
im Bereich von etwa 50 – 90 °C liegen,
wobei 70 bis 85 °C
bevorzugt sind. Der bevorzugte pH des Verfahrens liegt im Bereich
von etwa 5 – 11,
bevorzugt von etwa, am bevorzugtesten bei über 7 bis etwa 9. Es ist für die gereinigten
Xylanasen der vorliegenden Erfindung charakteristisch, dass sie über einen
breiten alkalischen pH-Bereich aktiv sind sowie eine hohe Aktivität im bevorzugten pH-Bereich
von etwa 7 bis etwa 9 aufweisen.
-
Die
bevorzugte Behandlungszeitspanne für die Anwendung der gereinigten
Xylanasen der vorliegenden Erfindung beträgt etwa 30 Minuten bis etwa
4 Stunden, abhängig
von Faktoren wie z.B. den gewünschten Ergebnissen,
der Menge und der Qualität
des behandelten Zellstoffs und der Konzentration des Enzyms.
-
Eine
geeignete Enzymdosis beträgt
etwa 0,10 bis 200 Einheiten/g trockener Zellstoff, bevorzugter 0,50 bis
50 Einheiten/g. Die Xylanase-Aktivität der Enzym-Präparate wird
wie folgt bestimmt: zu 1,8 ml Xylan-Lösung (0,6 % Sigma Nr. X-0627,
hergestellt in 0,05 M Natriumacetat-Puffer und mit Essigsäure auf
pH 5,3 eingestellt) werden 0,200 ml geeignet verdünntes Enzym
in dem gleichen Puffer gegeben. Die Lösung wird genau 30 Minuten
bei 40 °C
inkubiert. Die Reaktion wird dann durch Zugabe von 3 ml DNS-Reagens (3,5-Dinitrosalicylat
10 g/l; Na,K-Tartrat 300 g/l) gestoppt, und die Farbe wird durch
fünfminütiges Kochen
der Probe entwickelt. Die Extinktion wird dann bei einer Wellenlänge von
540 nm gemessen. Eine Enzym-Einheit setzt unter Assay-Bedingungen
ein Mikromol reduzierende Zucker, berechnet als Xylose, pro Minute
frei. Die Aktivität
wird aus einer Enzym-Verdünnung
berechnet, die 4 Mikromol reduzierenden Zucker unter Assay-Bedingungen
freisetzt.
-
Die
gereinigte Xylanase gemäß der vorliegenden
Erfindung kann angewendet werden, um irgendeinen einer großen Vielfalt
von verarbeiteten Zellstoffen, d.h. Zellstoffen, die bereits zuvor
auf irgendeine einer Vielfalt von Weisen behandelt worden sind,
um deren Lignin-Gehalt zu verringern, zu veredeln oder um zu der Veredelung
beizutragen, und sie werden wie oben beschrieben behandelt, um die
Lignin-Entfernung durch chemische Verfahren weiter zu verbessern.
Die vorliegende Xylanase kann zur Behandlung von Hartholz- und Weichholz-Kraft-Zellstoffen
verwendet werden, um die Lignin-Entfernung
zu verbessern und die Zellstoffe aufzuhellen. Die Xylanase gemäß der vorliegenden
Erfindung ist insbesondere auf chemische Zellstoffe anwendbar, d.h.
jene, in denen die Lignin-Komponente chemisch durch verschiedene
chemische Behandlungen, wie in den Sulfat- (Kraft-) Verfahren und
in der Sauerstoff-Delignifizierung, chemisch modifiziert worden
ist, und wird bevorzugt auf Kraft-Zellstoffe angewendet. Die Enzyme
der vorliegenden Erfindung können
auf den Zellstoff nach Kraft-Aufschluss oder Sauerstoff-Delignifizierung,
aber vor dem Bleichen angewendet werden. In dem Fall, in dem sowohl
Kraft-Aufschluss
als auch Sauerstoff-Delignifizierung bei demselben Zellstoff durchgeführt werden,
kann das Enzym nach dem Kraft-Aufschluss, vor der Sauerstoff-Delignifizierung
oder nach der Sauerstoff-Delignifizierung
angewendet werden. Die vorliegende Xylanase ist auch auf Ozon-gebleichte
Zellstoffe anwendbar.
-
Der
resultierende Zellstoff wird behandelt, um die freisetzbare Lignin-Komponente
unter Verwendung eines geeigneten Extraktionsmittels zu entfernen.
Weiter kann der Zellstoff, der mit den Enzymen der vorliegenden
Erfindung behandelt worden ist, anschließend mit Lignin-abbauenden
Chemikalien, wie Chlor, Chlordioxid und Peroxid, behandelt werden
und weiter mit einem geeigneten Extraktionsmittel extrahiert werden. Darüber hinaus
kann der mit Enzym behandelte Zellstoff mit einem geeigneten Extraktionsmittel
behandelt werden, gefolgt von einem Lignin-Abbau und einer Endbehandlung
mit einem geeigneten Extraktionsmittel. Derartige Extraktionsmittel
lösen im
Wesentlichen die beeinflusste Lignin-Komponente, und geeignete Extraktionsmittel
umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Basen, wie Alkalimetallhydroxid
(E), DMF, Dioxan, Aceton und Alkohol. Die Hydroxid-Extraktionen können mit
Wasserstoffperoxid (Ep) oder Sauerstoff
(Eo) kombiniert werden. Der resultierende
Zellstoff kann dann weiter durch eine chemische Bleichsequenz, wie Chlordioxid
(DED) oder Peroxid (P-P), zu der gewünschten Helligkeit gebleicht
werden, wodurch wesentlichen Einsparungen an Chemikalien beobachtet
werden, verglichen mit Zellstoff, der durch die gleiche Sequenz
zu der gleichen Helligkeit, aber ohne Verwendung der Enzym-Behandlung,
gebleicht wird. Die Verringerung von Chlorhaltigen Chemikalien oder
Peroxid ist auf eine solche Weise erzielbar. Zusätzlich kann man mittels der Durchführung eines
derartigen Verfahrens mit den oben dargestellten Enzymen die gleiche
Menge an Bleichchemikalien auf den Zellstoff anwenden und eine noch
größere Helligkeit
des behandelten Zellstoffs erzielen.
-
Zusätzliche
Anwendungen der vorstehend beschriebenen gereinigten Enzyme oder
des ganzen Xylanase-Überstands,
der Xylanasen der vorliegenden Erfindung enthält, sind in einer Vielfalt
von industriellen Umgebungen möglich.
Beispielsweise können
die gereinigten Xylanasen oder ganzer Xylanase-Überstand verwendet werden,
um enzymatisch Landwirtschaftsabfälle für die Produktion von Alkoholtreibstoffen
und anderen wichtigen Industriechemikalien abzubauen, oder als Komponente
in einer Detergens-Zusammensetzung verwendet werden.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1
-
Reinigung
von Acidothermus-Xylanase
-
Acidothermus
cellulolyticus ATCC 43068 wurde von der American Type Culture Collection
in Rockville Md erhalten. Ein Kultur-Filtrat wurde erhalten, indem
man den Stamm in einem Medium, welches enthielt: Henssen-Medium
(Henssen-Medium (g/L))
K2HPO4 | 0,2
g |
MgSO4.·7H2O | 0,3
g |
CaCO3 | 0,2
g |
FeSO4.·7H2O | 0,005
g |
Hefeextrakt | 0,1
g |
Casaminosäure | 0,1
g |
NH4NO3 | 0,2
g |
Harnstoff | 0,1
g |
Asparagin | 0,25
g |
Casein | 0,2
g |
pH | 5,5 |
mit dem Zusatz von Haferspelzenxylan (1 %) bei
einem pH von 5,5 und einer Temperatur von 55 – 60 °C in einem 250 ml-Erlenmeyer-Kolben
bei 100 U/min über
6 – 8
Tage kultivierte. Der Kulturüberstand
wurde einer Ultrafiltration unterzogen, um den Überstand einschließlich extrazellulären Xylanase-Enzyms
zu konzentrieren, wobei das Pellet verworfen wurde. Wie nachstehend
beschrieben, umfasste der Überstand
eine signifikante Xylanase-Aktivität.
-
Beispiel 2
-
Bestimmung der Charakteristika
von Acidothermus-Xylanase
-
Gereinigte
Xylanase, erhalten wie oben in Beispiel 1 beschrieben, wurde verwendet,
um die Charakteristika der Xylanase zu erhalten.
-
MOLEKULARGEWICHT
-
Der
Kulturüberstand,
der Xylanase-Aktivität
enthielt, wurde 4X unter Verwendung von Centriprep-3-Ultrafiltrationszellen
konzentriert (Amicon, wie gemäß Hersteller-Anweisungen).
Unter Verwendung eines Pharmacia FPLC-Systems wurde 1 ml konzentriertes
Material auf zwei Gelfiltrationssäulen aufgetragen, die Tandem-verbunden
waren (Pharmacia Superdex G-200 10/30, gefolgt von Pharmacia Superdex
G-75 10/30) und mit 100 mM NaCl-50 mM Citrat/Phosphat-Puffer, pH
6,0, äquilibriert
worden waren. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 0,5 ml/min.,
die UV-Absorption wurde bei 280 nm überwacht, 1 ml-Fraktionen wurden
gesammelt.
-
Die
Fraktionen wurden wie folgt auf die Xylanase-Aktivität getestet:
Die Anwesenheit von Xylanase wurde unter Verwendung eines Remazol-Brillant-Blau-gefärbten Birkenholz-Xylan
(RBB-Xylan, Megazyme, Australien) -Substrats bestimmt. 50 μl-Proben
werden mit 400 μl
Substrat-Lösung
(1,25 [Gew./Vol.] RBB-Xylan in 50 mM Natriumacetat, pH 4,5) gemischt
und 10 Minuten bei 40 °C
inkubiert.
-
Unverdautes
Xylan wird durch Zugabe von 1 ml 95 %-igem Ethanol gefällt und
durch Zentrifugation entfernt. Freigesetzter Farbstoff, der in Lösung verbleibt,
wird durch Spektrophotometrie (OD590) quantifiziert und
ist proportional zur Xylanase-Aktivität. Die Aktivität kann unter
Verwendung einer Standardkurve quantifiziert werden und wird als
XAE/ml (Xylanase-Aktivitäts-Einheiten
pro Milliliter) mitgeteilt. Man fand, dass die Xylanase-Aktivität unter
Verwendung dieses Systems nach 42 Minuten eluierte. Pharmacia-Gelfiltrationsstandards
mit niedrigem Molekulargewicht (1,25 mg/ml) wurden unter Verwendung
der obigen Bedingungen auf das System aufgetragen, und die Elutionsergebnisse
wurden verwendet, um eine Molekulargewichts-Standardkurve zu schaffen.
Die Elution von Acidothermus-Xylanase
entsprach einem Molekulargewicht zwischen 50 – 55 Kilodalton, (etwa 52,9
Kilodalton) im Vergleich zur Standardkurve.
-
ISOELEKTRISCHER
PUNKT
-
Ein
Gelüberlagerungsverfahren
wurde verwendet, um den isoelektrischen Punkt (pI) von Acidothermus-Xylanase
zu bestimmen. Eine isoelektrische Fokussierung (IEF) von Kulturüberstand,
der Xylanase-Aktivität
enthielt, wurde unter Verwendung eines PhastSystem (Pharmacia) gemäß den Anweisungen
des Herstellers durchgeführt.
IEF-Gele, pH 3 – 9,
wurden mit einer geschmolzenen Agarose-Substrat-Suspension (0,4
% (Gew./Vol.) Agarose, 7 mg/ml RBB-Xylan, 0,5 % (Gew./Vol.) Glycerol
in 50 mM Natriumacetat, pH 4,5) überschichtet
und bei 37 °C
inkubiert. Nach 1 Stunde wurde die Xylanase-Aktivität als eine
Klärungszone
sichtbar. Man ließ die
Gele vollständig
trocknen und bewahrte sie auf. Der pI von Xylanase wurde durch Vergleich
mit identisch laufen gelassenen IEF-Gelen bestimmt, die mit Silber
angefärbte
pI-Marker enthielten (breites pI-Kit pH 3,5 – 9,3, Pharmacia Biotech).
Die Sichtbarmachung der Proteine geschah durch PhastSystem-Entwicklungs-Silberfärbung gemäß Anweisungen.
-
pH- UND TEMPERATURPROFIL
-
Enzymproben
wurden unter Verwendung des oben in diesem Beispiel beschriebenen
RBB-Xylan-Assays
getestet. Das pH-Profil der gereinigten Xylanase wurde bestimmt,
indem man den RBB-Assay bei pHs von 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 6,0 und
7,0 durchführte.
Wie in 2 gezeigt, weist die gereinigte Xylanase unter
den Bedingungen des Assays ein pH-Optimum von etwa 3,6 – 4,2 auf.
-
Das
Temperaturprofil der Xylanase wurde bestimmt, indem man den RBB-Xylan-Assay
bei pH 4,5 und einer Temperatur von 37 °C, 55 °C, 65 °C, 70 °C und 80 °C über eine Zeitspanne von 10
Minuten durchführte. Wie
in 1 gezeigt, weist die gereinigte Xylanase unter
den Bedingungen des Assays eine optimale Temperatur zwischen etwa
70 bis 80 °C
auf.
-
THERMOSTABILITÄT
-
Getrennte
Proben von gereinigter Xylanase wurden bei Temperaturen von 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C oder 90 °C inkubiert.
Aliquoten wurden in gewissen Zeitabständen entnommen, um die Aktivität der Xylanase nach
einer gegebenen Inkubationszeit bei der gegebenen Temperatur zu
bestimmen. Die Aliquoten wurden gemäß dem RBB-Xylan-Assay bei 60 °C, pH 4,5
und einer Zeit von 10 Minuten auf Aktivität getestet, und die Halbwertszeit
der Xylanase bei den Inkubationstemperaturen wurden berechnet. Die
Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Die Halbwertszeiten
bei 70 °C
und 75 °C
unter den Bedingungen des Experiments waren größer als 24 Stunden.
-
STABILITÄT BEI NIEDRIGEM
pH
-
Eine
gereinigte Probe von Xylanase, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde
mit Natriumhydroxid auf einen pH von 3,3 eingestellt und bei RT
inkubiert. Die Aktivität
der Probe wurde nach 30, 60, 90 und 120 Minuten unter Verwendung
des oben beschriebenen RBB-Assays bei 65 °C, pH 4,5, über 10 Minuten gemessen. Wie in 4 gezeigt,
verblieb ein signifikanter Anteil der Aktivität der Xylanase nach 2 Stunden
bei niedrigem pH.
-
Beispiel 3
-
Behandlung
von Tierfutter mit Acidothermus-Xylanase
-
Der
für die
Xylanase-Aktivität
verwendete Assay war ein in Viskositäts-verringernder In-vitro-Assay
unter Verwendung von Weizen-Arabinoxylan als viskosem Substrat unter
Bedingungen, welche jene nachahmen, die im GI-Trakt eines Tiers
gefunden werden. Ein derartiger In-vitro-Assay dient als Richtlinie,
ob eine Xylanase (oder Mischung von Xylanasen) die gewünschte Wirkung
der Verringerung der Viskosität
von Speisebrei aufweisen würde,
wenn sie als Ergänzung
in einem Tierfutter verwendet würde.
Die Aktivität
wurde wie folgt bestimmt:
Eine Einheit Xylanase-Aktivität ist die
Enzymmenge, die ein 1 μMol
reduzierende Zucker (ausgedrückt
als Xylose-Äquivalente)
in einer Minute unter den beschriebenen Bedingungen aus dem Substrat
freisetzt.
-
Reagenzien
-
1. 1 % (Gew./Vol.) Xylan-Substrat
-
Man
gebe 10 ml 0,5 M Natriumhydroxid zu 1,0 g Xylan (Fluka 95590). Man
mische 30 Minuten mit einem Magnetrührer. Man gebe etwa 40 ml 0,05
M Natriumacetat-Puffer, pH 6,5, dazu. Man stelle den pH mit 1 M
Essigsäure
auf 6,5 ein. Man fülle
mit 0,05 M Natriumacetat-Puffer, pH 6,5, auf 100 ml auf. Das Substrat
sollte die ganze Zeit gemischt werden, wenn es verwendet wird.
-
2. 1 M Essigsäure
-
Man
pipettiere 5,7 ml Eisessig in einen Messkolben und fülle mit
destilliertem Wasser auf 100 ml auf.
-
3. 0,05 M Natriumacetat-Puffer,
pH 6,5
-
- A. Man löse
4,1 g Natriumacetat in destilliertem Wasser und fülle mit
destilliertem Wasser auf 1000 ml auf.
- B. Man löse
3,0 g Eisessig in destilliertem Wasser und fülle mit destilliertem Wasser
auf 1000 ml auf.
-
Man
stelle den pH der Lösung
A mit der Lösung
B auf pH 6,5 ein.
-
4. Dinitrosalicylsäure (DNS)-Reagens
-
Man
suspendiere 20,0 g 3,5-Dinitrosalicylsäure in etwa 800 ml destilliertem
Wasser. Man gebe allmählich
unter fortwährendem
Rühren
300 ml Natriumhydroxid-Lösung
(32,0 g NaOH in 300 ml destilliertem Wasser) dazu. Man erwärme die
Suspension in einem Wasserbad (die Temperatur darf +48 °C nicht überschreiten),
während
man rührt,
bis die Lösung
klar ist. Man gebe allmählich
600 g Kaliumnatriumtartrat dazu. Man erwärme die Lösung (die Temperatur darf +48 °C nicht überschreiten),
falls erforderlich, bis die Lösung
klar ist.
-
Man
fülle mit
destilliertem Wasser auf 2000 ml auf und filtriere durch ein grobes
Sinterglasfilter. Man bewahre in einer dunklen Flasche bei Raumtemperatur
auf. Das Reagens ist maximal 6 Monate stabil.
-
Verfahren
-
1. Enzymprobe
-
1
ml Enzym-Verdünnung
(in 0,05 M Natriumacetat-Puffer, pH 6,5) wird bei +50 °C äquilibriert.
Man gebe 1 ml Xylan-Substrat dazu, rühre und inkubiere genau 30
Minuten lang bei +50 °C.
Man gebe 3 ml DNS-Reagens dazu, rühre und koche die Reaktionsmischung
genau 5 Minuten lang. Man kühle
die Reaktionsmischung in einem kalten Wasserbad auf Raumtemperatur
ab und messe die Extinktion bei 540 nm gegen destilliertes Wasser.
-
2. Enzym-Blindprobe
-
Man
inkubiere 1 ml Xylan-Substrat 30 Minuten lang bei +50 °C. Man gebe
3 ml DNS-Lösung
dazu und rühre.
Man gebe 1 ml Enzym-Verdünnung
(in 0,05 M Natriumacetat-Puffer, pH 6,5) dazu und rühre.
-
Man
koche die Mischung genau 5 Minuten lang. Man kühle die Reaktionsmischung in
einem kalten Wasserbad auf Raumtemperatur ab und messe die Extinktion
bei 540 nm gegen destilliertes Wasser.
-
Der
Extinktionsunterschied zwischen der Enzymprobe und der Enzym-Blindprobe
sollte 0,3 – 0,5
betragen.
-
3. Standardkurve
-
Man
stelle Standardlösungen
aus wasserfreier Xylose in 0,05 M Natriumacetat-Puffer, pH 6,5,
her. Die Xylose-Konzentration in den Standards sollte 0,05 – 0,5 mg/ml
betragen. Man pipettiere 1 ml Standardlösung, 1 ml Xylan-Substrat und
3 ml DNS-Reagens in ein Reagensglas. Man rühre und koche genau 5 Minuten
lang. Man kühle
in einem kalten Wasserbad auf Raumtemperatur ab und messe die Extinktion
bei 540 nm gegen eine Standard-Blindprobe. In der Standard-Blindprobe
ist die Xylose-Lösung
durch 1 ml 0,05 M Natriumacetat-Puffer, pH 6,5, ersetzt. Ansonsten
wird die Standard-Blindprobe wie der Xylose-Standard behandelt.
-
Man
trage die Xylose-Konzentration als Funktion der Extinktion auf.
Für jedes
neue DNS-Reagens wird eine neue Standardkurve erstellt.
-
Berechnung
-
Die
Xylase-Aktivität
der Probe wird gemäß der folgenden
Gleichung berechnet:
worin:
- A(X)
- = Extinktion der Enzymprobe
- A(O)
- = Absorption der Enzym-Blindprobe
- k
- = Steigung der Standardkurve
- C0
- = Achsenabschnitt
der Xylose-Standardkurve
- 1000
- = Faktor, mMol → μMol
- Df
- = Verdünnungsfaktor
(ml/g)
- MWxyl
- = Molekulargewicht
von Xylose (150,13 mg/mMol)
- t
- = Reaktionszeit (30
Minuten)
-
Der
Viskositäts-Verringerungs-Assay,
der verwendet wird, um die Fähigkeit
einer Xylanase zu messen, die Viskosität zu verringern, wurde wie
folgt durchgeführt.
Der Assay wird in allen Fällen
in zweifacher Ausführung
durchgeführt.
-
Das
zu testende Xylanase-Enzym wird mit 0,1 M Na-Phosphat-Puffer mit
einem pH von 6,5 verdünnt, um
die Xylanase-Konzentration so einzustellen, dass die resultierende
Lösung
eine Xylanase-Aktivität von 1,0 Einheiten
pro ml besitzt. Eine derartige Xylanase-Aktivität wird gemäß dem oben in Einzelheiten
beschriebenen Assayverfahren für
die Xylanase-Aktivität
bestimmt.
-
100 μl der Enzym-Lösung wurden
zu 400 μl
einer Lösung
von Weizen-Arabinoxylan (erhalten von Megazyme Pty) in 0,1 M Na-Phosphat
bei pH 6,5 in einem Glasreagensröhrchen
gegeben, so dass die Endkonzentration an Enzym in der resultierenden
Lösung
0,2 E/ml betrug und diejenige des Weizen-Arabinoxylans 1,0 % Gew./Gew. betrug.
-
Die
Reagensgläser,
welche die Lösungen
enthielten, wurden dann verschlossen und für eine gewisse Zeitspanne,
typisch 1 Minute oder 5 Minuten, in ein Wasserbad gegeben, das bei
95 °C eingestellt
war. Nach dieser Wärmebehandlung
wurden die Reagensgläser
in einem Eiswasserbad gekühlt.
Die Viskosität
der resultierenden Lösung
wurde bei einer Temperatur von 40 °C unter Verwendung eines Brookfield
DV-II, CP 40-Viskosimeters gemessen, das so programmiert war, dass
es die Viskosität
einmal pro Sekunde maß.
Die in Tabelle 1 gezeigten Zahlen sind Viskositätsmessungen nach 20-minütiger Inkubation.
Xylanase aus Acidothermus cellulolyticus wurde mit Xylanase aus
Aspergillus niger und Trichoderma viride verglichen, zwei wohlbekannten
Zusätzen
für Futter.
Die Ergebnisse waren wie folgt.
-
-
Wie
in Tabelle I gezeigt, hatte die Einwirkung einer Temperatur von
95 °C über 1 Minute
im Wesentlichen keine Erhöhung
des Viskositätsniveaus
bei Xylanase, die von Acidothermus cellulolyticus abstammte, zum
Ergebnis, während
bei den Xylanasen aus Aspergillus niger und Trichoderma viride signifikante
Erhöhungen
der Viskosität
gezeigt wurden. Ähnlich
war die Erhöhung
der Viskosität
von Xylanase aus Acidothermus cellulolyticus nach 5-minütiger Einwirkung
einer Temperatur von 95 °C
weniger als die Hälfte
derjenigen der Xylanasen, die von Aspergillus niger and Trichoderma
viride abstammten.
-
Natürlich sollte
verstanden werden, dass ein großer
Bereich von Änderungen
und Abwandlungen bei den oben beschrieben bevorzugten Ausführungsformen
vorgenommen werden kann. Es ist deshalb beabsichtigt, dass verstanden
wird, dass es die folgenden Ansprüche sind, einschließlich aller Äquivalente,
welche den Bereich der Erfindung definieren.