DE69616558T2

DE69616558T2 - Enzymzusätze für futter von wiederkäuern

Info

Publication number: DE69616558T2
Application number: DE69616558T
Authority: DE
Inventors: A. Beauchemin; Lyle Rode; J. Sewalt
Original assignee: Agriculture and Agri Food Canada AAFC; UK Government
Current assignee: Agriculture and Agri Food Canada AAFC; UK Government
Priority date: 1995-07-05
Filing date: 1996-07-05
Publication date: 2002-05-29
Anticipated expiration: 2016-07-06
Also published as: JPH11506015A; CN1195268A; EP0841859B2; ES2137903T1; US5720971A; CA2222898C; DE69616558D1; NZ310950A; ES2137903T3; KR100307654B1; EP0841859A1; JP3037437B2; CA2222898A1; KR19990028675A; CN1103547C; WO1997001967A1; AU709411B2; DE841859T1; DK0841859T3; HK1016035A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Futtergemische für Wiederkäuer mit Xylanase und Cellulase.

Hintergrund der Erfindung

Hülsenfruchtfutter und Getreidefutter sind übliche Futtermittel für Wiederkäuer. Obwohl Hülsenfruchtfutter und Getreidefutter einen höheren verdaulichen Bestandteil haben als Grasfutter, enthalten sowohl die Hülsenfruchtfutter als auch Getreidefutter einen signifikanten teilweise verdaulichen oder schwer zu verdauenden Anteil, der hauptsächlich aus Pflanzenzellwänden besteht. Der Zellwandbestandteil des Futtermittels wird oft als der gesamte Faseranteil beschrieben.
Hülsenfruchtfutter enthalten bis zu 40% Gesamtfasern. Der Gesamtfaserbestandteil von Getreidefuttern beträgt allgemein bis zu 20% des Gesamttrockenanteils des Futters (Van Soest, 1982). Der Rest der Trockensubstanz des Futters besteht grundsätzlich aus nicht-strukturellen Kohlehydraten, die von Wiederkäuern vollständig verdaulich sind. Sowohl bei Getreidefutter als auch Hülsenfruchtfutter ist der nicht-strukturelle Kohlehydratanteil des Futters zu 90 bis 100% verdaulich oder in Energie umwandelbar, was zu Tierwachstum führt.
Im Getreidefutter ist der gesamte Faseranteil nur etwa zu 25% verdaulich, während bei Hülsenfruchtfutter der gesamte Faserbestandteil etwa zu 40% verdaulich ist (Van Soest, 1982).
Die Zellwand oder der gesamte Faseranteil des Hülsenfruchtfutters oder des Getreidefutters besteht hauptsächlich aus Cellulose, Hemicellulose und Lignin, die widerstandsfähig gegen Abbau sind. Obwohl Wiederkäuer nicht selbst Enzyme absondern, die in der Lage sind, diese Substanzen zu verdauen, erzeugen Bakterien und Pilze in den Wiederkäuern Enzyme, die Zellwandsubstanzen abbauen können. Das Ausmaß der Faserverdauung ist variabel und hängt von der Art des Futtermittels und der Faseraktivität der Mikroorganismen der Wiederkäuer ab. Die Cellulose- und Hemicellulosebestandteile der Gesamtfasern des Hülsenfruchtfutters und des Getreidefutters sind durch Cellulase und Xylanase verdaulich, die durch Wiederkäuerbakterien erzeugt werden. Die Verdaulichkeit der Hemicellulose und der Cellulose hängt u. a. von dem Grad und der Art der Assoziation der Hemicellulose und der Cellulose mit unverdaulichem Lignin ab. Cellulase und Xylanase schließen Cellulose und Hemicellulose zu Zucker auf, die ihrerseits zu Wiederkäuerbakterien in flüchtige Fettsäuren umgewandelt werden, die der Wiederkäuer als direkte Energiequelle nutzen kann. Im Falle von Futter mit hohem Faseranteil kann weniger als die Hälfte des Futters verdaut werden, und der unverdauliche Teil wird ausgeschieden. Dies führt zur Erzeugung einer großen Menge Dung.
Verbesserungen in der Futterverdaulichkeit sind erwünscht, da sie zuschnellerem Tierwachstum und zu weniger Erzeugung von Dung führen. Da der nicht strukturelle Kohlehydratanteil des Hülsenfruchtfutters und des Getreidefutters bereits hochgradig verdaulich ist, besteht wenig Raum für Verbesserungen. Die größten Möglichkeiten zur Verbesserung der Futterverdaulichkeit besteht demnach darin, die Verdaulichkeit des geringverdaulichen totalen Faseranteils zu erhöhen. Es gibt gegenwärtig keine lizenzierten Futterzusätze, die die Verdaulichkeit von faserigem Futtermittel für Wiederkäuer verbessern.
Die Zufuhr von Enzymen zu den Wiederkäuern, die pflanzliches Zellwandmaterial abbauen können, ist ein schwieriges Problem wegen der hochgradig proteolytischen Umgebung der Tiere. Wenn fibrolytische Enzyme wie Cellulase und Xylanase, die selbst Proteine sind, nur einfach dem Futtermittel hinzugefügt werden, werden die fibrolytischen Enzyme schnell in dem Pansen verdaut, bevor sie die Faserverdauung des Futtermittels erhöhen (Chesson, 1994, McAllister et al. 1994). Die direkte Zugabe von fibrolytischen Enzymen zur ruminalen Umgebung ist kaum von Vorteil, da der Pansen Bakterien, Pilze und Protozoen enthält, die das aktivste Cellulase und Xylanase produzieren, das in irgendeiner Umgebung bekannt ist (Gilbert, 1992). Ein Vorteil der Abgabe von fibrolytischen Enzymen an Wiederkäuer ist daher nur zu erwarten, wenn extrem hohe Enzymmengen verwendet werden. Nur mit einem sehr hohen Enzymanteil würde ein kleiner Teil der hinzugefügten Enzyme, der nicht schnell aufgeschlossen wird, ausreichen, um die fibrolytische Aktivität zu erhöhen, die natürlich innerhalb des Pansens auftritt. Eine solche Lösung wäre unpraktisch und unwirtschaftlich.
Mit der Vorverdauung von Futter mit Enzymen ist also eine Technik angewandt worden, um den Nährwert des Futters während des Einsäuerns zu verbessern. Die PCT-Anmeldung PCT/FI91 /00118 (SSV-Development OY, eingereicht am 18.04.1991) beschreibt die Zugabe von einem oder mehreren fibrolytischen Enzymen aus der Gruppe der Pectinase, Cellulase, Xylanase, Amylase, Arabinosidase, Cutinase, Lipase und Esterase zu feuchten Grünpflanzen (Feuchtigkeitsgehalt 50 bis 75%) zur Zeit des Einsäuerns. Dies führt zu einer Vorverdauung der Pflanzenzellwand und folglich zu einer. Verbesserung der säureproduzierenden Fähigkeit der Milchsäurebakterien. Der pH-Wert des Futters wird in einem Bereich unter 4 bis 4,5 gehalten, wodurch das Wachstum von schädlichen Bakterienarten ausgeschlossen wird. Auf ähnliche Weise beschreibt die deutsche Patentanmeldung Nr. DD 296 407 A5 die Anwendung eines Gemischs fibrolytischer Enzyme auf frische Grünpflanzen zum Zeitpunkt der Einsäuerung. Das japanische Patent Nr. 6,075,238 lehrt die Zugabe eines enzymmikrobischen Impfmittels zu Futtermitteln, die einen hohen Feuchtigkeitsgehalt haben, der in Vakuumverpackung aufrechterhalten wird, um mikrobische Fermentation zu ermöglichen.
Die Vorverdauung von Futter ist wegen des hohen Feuchtigkeitsgehalts (über 30% des Futters) unerwünscht, der erforderlich ist um Enzymaktivität zu erlauben. Feuchtes Futter ist instabil, da es zu Kontamination und Fäulnis durch Wachsturn neigt. Das erhöhte Gewichts des Futters wegen des hohen Feuchtigkeitsgehalts macht den Transport unpraktisch, und die übermäßige Feuchtigkeit erfordert eine zusätzliche Trocknung des Futters vor der Abgabe. Aus diesen Gründen ist die Vorverdauung von Futter eine unerwünschte Lösung zur Verbesserung der Futterverdaulichkeit. Es wäre besser, die Verdaulichkeit von Futtermitteln zu erhöhen, wobei das Futter einen geringen Feuchtigkeitsanteil behält. Techniken zum Schutz von Enzymen vor Magen- oder Darminaktivierung sind auch bekannt. Das kanadische Patent Nr. 1.322.159 (Ying, erteilt am 14.09.1993) lehrt die Beschichtung und Einkapselung von Enzymen mit säure-unlöslichem Polymer, das den Durchgang der Enzyme durch den Pansen erlaubt. Auf ähnliche Weise wird eine aminopolyamide Kunststoffbeschichtung von dem US-Patent Nr. 3,492,398 (Marco et al., erteilt am 27.01.197.0) gelehrt.
Ein Cellulase/Xylanase-Futterzusatz aus Pilzstämmen ist verwendet worden, um bei Geflügel ein krankhaftes Absorptionssyndrom zu behandeln (PCT-Anmeldung- Nr. PCT/DK90/00256 (Novo Nordisk A/S. eingereicht am 5.10.1.990). Versuche wurden mit begrenztem Erfolg durchgeführt, die Verdaulichkeit von Wiederkäuerfutter durch Zugabe von fibrolytischen Enzymen direkt zu dem Futter oder in Form eines Enzymzusatzes, der dem Futter zugefügt wird, zu erhöhen. Die meisten Zusätze, die im Stand der Technik beschrieben sind, erfordern eine Anzahl von Bearbeitungsschritten, einschließlich Anfeuchten des Futters, Wärmebehandlung, Trocknen, und Zugabe anderer Additive und Stabilisierungsmittel. Die europäische Patentanmeldung-Nr. 88 105 409.2 (Suomen Sokeri Oy, eingereicht am 04.04.1988) beschreibt die Zugabe eines nicht offenbarten Zusatzes zu einem Futtermittel mit einem Feuchtigkeitsgehalt zwischen 15 und 60%, gefolgt durch kombinierte hydrothermische und enzymatische Behandlung bei einer Temperatur unterhalb 100ºC. Das Futtermittel wird dann getrocknet, um die Enzyme zu stabilisieren und die Qualität des Futtermaterials zu verbessern.
Das US-Patent Nr. 5,314,692 (Haarasilta et al., erteilt am 24.05.1994) beschreibt ein thermostabiles Enzym-Vorgemisch mit 1-60% Gesamtenzymen aus der Gruppe Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Glucanase, Lipase, Proteinase und dergleichen und 40 bis 99% Mehl oder andere Stärke. Das Enzymvorgemisch wird pelletiert und mit anderem Futter bei Konzentrationen von 0,01 bis 0,05% gemischt. Das Enzymvorgemisch ist thermisch stabil und erleidet keine signifikante Verschlechterung der Enzyme bei Futterverarbeitungstemperaturen.
U.K.-Patentanmeldung Nr. 2,261,877 (Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd., angemeldet am 18.11.1992) beschreibt einen konzentrierten Tierfuttermittelzusatz mit einem Pflanzenzell-zerstörenden Enzym und wenigstens einer essentiellen Aminosäure zur Verbesserung der Milchabgabe, Verbesserung der Milchqualität, Förderung des Wachstums, Verbesserung der Fleischqualität und Erhöhung der Zuchtleistung.
Die deutsche Patentanmeldung Nr. DD 296 407 A5 beschreibt einen Wachstumsprozeß bestimmter Stämme von Penicillin-Arten von Pilzen auf einem Substrat von Getreide. Der Prozeß enthält eine Vorhydrolyse bei Temperaturen von 15 und 60ºC bei einem Feuchtigkeitsgehalt über 25%. Der resultierende Enzymkomplex enthält Cellulase, Hemicellulase, Amylase, Pectinase, Protease und β-1,4 Glucanase. Das Material stellt einen Futtermittelzusatz dar.
Feng et al. (1992, Nr. 1) T. Anim. Sci., 70, Suppl, Abstract 678 gibt an, daß die Anwendung eines unspezifizierten "hohen Maßes" eines Enzymgemischs, das Cellulase, Xylanase und Hemicellulase enthält, auf getrocknetes Grasfutter in vitro den Trockanteil (DM) erhöht und die Faserverdaulichkeit (NDF) um 12 und 20% verbessert. Ein "niedriger" Grad von Cellulase und Hemicellulase erhöht in vitro die DM-Verdaulichkeit um 8%. In situ DM und DF-Verdaulichkeit wurde gemessen, jedoch wurden keine Ergebnisse berichtet, vermutlich weil keine Wirkungen beobachtet werden konnten. Diese Bezugnahme illustriert, daß eine Kombination von drei Klassen von Enzymen in einem "hohen" Maß erforderlich waren, um die Verdaulichkeit von getrocknetem Heu zu verbessern. Die Enzyme wurden unmittelbar vor den in vitro und in situ-Verdauungsstudien hinzugefügt.
Mit Feng et al. (1992, No. 2) 1. Anim. Sci. 70, suppl' Abstract 679, lehrt die Anwendung eines kommerziellen Enzymgemischs mit Cellulase, Hemicellulase und Xylanase auf trockenes Grasheu unmittelbar vor dem Verfüttern. Durch persönliche Kommunikation mit den Autoren haben die Erfinder festgestellt, daß das verwendete Enzymgemisch ein kommerzielles Produkt namens Grass-Zyme war, welches zusätzlich zu Cellulase, Hemicellulase und Xylanase andere Klassen von Enzymen enthält wie Glucoseoxydase und Amylase. Diese Vorbehandlung erhöhte die Heu-DM-Aufnahme um 12% gegenüber unbehandeltem Heu. Die Verdaulichkeit von DM und MDF war durch die Enzymvorbehandlung ebenfalls verbessert. Die in situ NDF-Verdauungsrate war durch die Trockenheu- Vorbehandlung mit dem Enzymgemisch unmittelbar vor dem Verfüttern erhöht. Wenn unbehandeltes Heu in situ in den Pansen von jungen Ochsen aufgenommen wurde, die vorbehandeltes Heu konsumieren, wurde kein Vorteil beobachtet. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die Enzymvorbehandlung zu einer partiellen Verdauung von Grasheu vor der Nahrungsmittelaufnahme führt anstelle einer Zunahme der ruminalen Enzymaktivität.
WO-A-9201389 ist darauf gerichtet, ein zu säuerndes Futter mit Endo-Xylanse anzureichern, um eine Silage zu erzeugen, die einen erhöhten wasserlöslichen Kohlenhydratanteil hat zur Verwendung durch Milchsäurebakterien oder als Nährstoffe für Tiere, die die Silage zu sich nehmen. Die Verwendung von Cellulase ist ebenfalls beschrieben.
Im Hinblick auf den Stand der Technik ist offensichtlich, daß ein Bedürfnis nach einem Enzymzusatz besteht, um die Verdaulichkeit von Getreidefutter und Hülsenfruchtfutter für Wiederkäuer zu verbessern. Ein solcher Zusatz sollte dem Futtermittel leicht hinzuzufügen sein und keine komplexen, teuren oder zeitaufwendigen Verfahrensschritte erfordern. Idealerweise sollte ein solcher Zusatz dem Futter nahe der Fütterungszeit oder auch früher hinzugefügt werden, so daß das Futter in kommerziell akzeptabler Form verarbeitet werden kann. Ein solcher Zusatz sollte daher das Futter nicht vorverdauen oder aufschließen, sondern einen stabilen Komplex mit dem Futter bilden, so daß das Futtergemisch konserviert und gelagert werden kann. Der Zusatz sollte die Futterverdaulichkeit bei niedrigem oder moderatem Enzymlevel optimieren, um praktisch und wirtschaftlich zu sein.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfinder haben herausgefunden, daß dann, wenn bestimmte Verhältnisse und Aktivitätsgrade von faserabbauenden Enzymen, nämlich Cellulase und Xylanaseenzymen, verwendet werden, um Hülsenfruchtfutter und Getreidefutter (Futtermaterial) durch ein Verfahren zu behandeln, das von den Erfindern aufgefunden wurde, sich überraschende Zuwächse in der Verdaulichkeit des Futtermaterials und dem Tierwachstum ergeben. Bessere Ergebnisse werden erzielt, wenn Mengen von Enzymen innerhalb bestimmter bevorzugter Bereiche verwendet werden, als wenn übermäßige Enzymmengen verwendet werden. Ein unerwarteter synergistischer Effekt zwischen den Aktivitäten der Xylanase und Cellulase auf die Verbesserung auf die Verdaulichkeit des Futtermaterials und des Tierwachstums wurde demonstriert, daß die Verbesserungen der Verdaulichkeit des Futtermaterials und des Tierwachstums infolge der Anwendung der Enzymgemische der vorliegenden Erfindung größer sind als die einfache additive Verbesserung von Xylanase und Cellulase, die getrennt angewendet werden. Die verbesserten, synergistischen Ergebnisse werden nicht beobachtet, wenn das Enzymgemisch der vorliegenden Erfindung durch eine andere Methode als die, die die Erfinder entwickelt haben, auf das Futtermaterial aufgebracht werden.
Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren der Erzeugung von Futtergemischen durch Aufbringen von faserabbauenden Enzymen auf trockene, bearbeitete oder unbearbeitete Futtermaterialien vor, um ein stabiles Futtergemisch für Wiederkäuer gemäß den Ansprüchen 11 bis 17 zu erzeugen. Dieses Verfahren verbessert die Verdaulichkeit der Futtermaterialien, wenn dieses an Wiederkäuer abgegeben wird. Die Erfindung erstreckt sich auf Enzymzusätze, die bestimmte Gemische von faserabbauenden Enzymen gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 enthalten, und Futtergemische, die Futtermaterial und ein Gemisch von Enzymen gemäß den Ansprüchen 6 bis 10 aufweisen. Unter "Wiederkäuern" werden Rinder, Schafe, Ziegen, Rehe, Bisons, Wasserbüffel und Kamele verstanden. Die erhöhte Verdaulichkeit des Futtermaterials führt zu erhöhter Tierleistung durch verbesserte Zunahme und Milchabgabe, wirkungsvollere Umwandlung der Futterenergie in Fleisch oder Milch, weniger Nahrungsmittelbedarf zur Erreichung desselben Produktivitätslevels, größere Futteraufnahme durch Tiere, die einen größeren Energiebedarf haben, verringertem Erfordernis nach zusätzlichen Energiequellen wie Getreide und Fetten und reduzierter Dungproduktion.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Enzyme der vorliegenden Erfindung in einer wässrigen Lösung gelöst und auf das trockene Futtermaterial bei der Futterverarbeitung aufgebracht. Die Enzyme können als getrennte Lösungen oder als eine einzige Lösung aufgebracht werden, die ein Gemisch von Enzymen enthält. Vorzugsweise ist die wässrige Lösung ein schwacher Puffer mit einem pH-Wert zwischen 4,5 und 7,0. Die wässrige Enzymlösung wird auf das Futtermaterial aufgebracht, um das Futtermaterial zu beschichten und eine gleichmäßige Verteilung der wässrigen Lösung über das Futtermaterial zu erreichen. Typischerweise wird die Enzymlösung auf das Futtermaterial gesprayt, während das Futtermaterial gleichzeitig gemischt wird, um eine gleichmäßige Verteilung der Enzymlösung zu erreichen. Die Enzyme schließen das Futtermaterial nicht auf oder vorverdauen dieses, sondern haften an dem Futtermaterial, wodurch ein stabiler Enzym/Futtermaterial-Komplex (Futtergemisch) geformt wird. Die Enzyme haften nur an dem Futtermaterial, wenn dieses trocken genug ist, um eine beträchtliche Absorbtion der wässrigen Lösung, die die gelösten Enzyme enthält, in das Futtermaterial zu ermöglichen. Es wurde herausgefunden, daß das Futtermaterial einen Feuchtigkeitsgehalt haben soll, der nicht größer als 15% (Gewicht/Gewicht) beträgt, damit eine geeignete Absorbtion auftritt. Die Feuchtigkeit nimmt Raum in dem Futtermittel in Anspruch. Wenn die Feuchtigkeit verdampft, bilden sich Poren in dem Futtermittel, in das die Enzymzusätze der vorliegenden Erfindung absorbiert werden, wobei sie den Platz der verdampften Feuchtigkeit einnehmen. Wenn der Feuchtigkeitsgehalt des Futtermittels erheblich über 15% liegt, wird der Enzymzusatz nicht in das Futtermittel absorbiert. Wenn ferner der Feuchtigkeitsgehalt des Futtermittels über etwa 18 bis 21% gehalten wird, kann dieses verderben. Auf dem Feld getrocknetes Hülsenfruchtfutter und Getreidefutter hat üblicherweise einen Feuchtigkeitsgehalt von etwa 12%. Die Absorbtion der wässrigen Enzymlösung und die Bildung des stabilen Enzym/Futtermittel-Komplexes erfordert die Inkubation des Futtermaterials mit der wässrigen Enzymlösung bei Temperaturen zwischen 5 und 8000 über wenigstens 3 Stunden bevorzugt wenigstens 8 Stunden. Der resultierende Enzym/Futtermittel-Komplex ist wenigstens ein Jahr lang stabil. Das Futtermaterial kann vor oder nach der Behandlung durch Rollen, Zerhacken, Tempern, Zermahlen, Zerbrechen, Extrudieren, Verkleinern, Rösten, Kochen verarbeiten werden, oder nach der Behandlung durch Pelletieren oder in Würfelform bringen. Futtermaterialien enthalten Hülsenfruchtheu, Ernterückstände und Getreide.
Der Enzymzusatz enthält Cellulase und Xylanase in bestimmten Verhältnissen und Konzentrationen. Er kann auch Pektinase, Estriase, Arabinosidase und β-1,3- Glucanase enthalten, erfordert jedoch nicht Protease, Lipase oder Amylase. Die Cellulase und Xylanase kann aus jedem breiten Spektrum von Cellulase und Xylanase bestehen, vorzugsweise aus mikropischen Quellen, angewandt bei standartisierten Aktivitätslevel. Die Aktivität von Cellulase ist auf der Basis von Filterpapierabbau standardisiert, ausgedrückt in Filterpapiereinheit (FPU)-Aktivität (mol Glucose produziert von Filterpapier pro Einheit Enzym pro Minute). Die Xylanase-Aktivität basiert auf dem Abbau von Haferspelz-Xylan in Xylose und wird ausgedrückt in internationalen Einheiten (IU) (mol reduzierende Zucker, die pro Enzymeinheit pro Milliliter pro Minute erzeugt werden). Versuche zur Bestimmung der Cellulase- und Xylanase-Aktivität sind in den Beispielen 6, 7 und 8 angegeben. Die Aktivität von Cellulase, die oben diskutiert ist, bezieht sich auf exo-Cellulase und wird in FPU gemessen. Endo-Cellulase kann ebenfalls zur Verwendung geeignet sein. Cellulase gemäß der vorliegenden Erfindung wird IU gemessen, wie in Beispiel 7 angegeben ist. 25 IU von endo-Cellulase-Aktivität ist äquivalent 1 FPU exo-Cellulase-Aktivität.
Die Erfinder haben herausgefunden, daß die Zunahme an Faserverdaulichkeit und Tierleistung sowohl von der Gesamtmenge von Enzymen, die dem Futtermaterial hinzugefügt ist (ausgedrückt als Total-Enzym-Aktivität pro Kilogramm Trockenmasse Futter) als auch von dem relativen Verhältnis von Cellulase zu Xylanase abhängt. Das Verhältnis zwischen Enzymkonzentration und Tierwirkung ist nicht-linear und für Hülsenfruchtfutter und Getreidefutter verschieden. Für Hülsenfruchtfutter wie Luzerneheu ist eine Enzymkonzentration von 16 bis 120, insbesondere 18 bis 72 FPU Cellulase und zwischen 800 und 6.000, bevorzugt 900 bis 3.600 IU Xylanase pro Kilogramm Futter-Trockenmasse optimal. Für Getreidefutter wird die höchste Leistung der Tiere bei Enzymkonzentrationen von 10 bis 200, bevorzugt 40 bis 160 FPU Cellulase und von 500 bis 10.000, bevorzugt 2.000 bis 8.000 IU Xylanase pro Kilogramm Futter-Trockenmasse erreicht. Für Hülsenfruchtfutter und Getreidefutter beträgt das Verhältnis der Cellulase-Aktivität zur Xylanase-Aktivität bevorzugt 2 bis 5 FPU Cellulase pro 100 IZ Xylanase.
Nach einem weiteren breiten Aspekt erstreckt sich die Erfindung insbesondere auf Futtergemische für Wiederkäuer. Allgemein bestehen die Futtergemische aus Futtermaterial mit geringem Feuchtigkeitsgehalt, das dicht verbunden ist mit einem Gemisch aus Cellulase und Xylanase, um einen stabilen Futtermittel/Enzym-Komplex zu bilden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Futtergemisch ein stabiler Enzym/Futtermittel-Komplex, bei dem die Enzyme zwischen 60 bis 120, bevorzugt 18 bis 72 FPU Cellulase-Aktivität und zwischen 800 und 6.000, bevorzugt 900 bis 3.600 IU Xylanase-Aktivität pro Kilogramm Futtermaterial aufweisen und wobei das Futtermaterial ein trockenes Hülsenfruchtfutter ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Futtergemisch ein stabiler Enzym/Futter-Komplex, in dem die Enzyme 10 bis 200, bevorzugt 40 bis 160 FPU Cellulose-Aktivität und 500 bis 10.000, bevorzugt 2.000 bis 8.000 IU Xylanase-Aktivität pro Kilogramm Futtermaterial vorsehen, wobei das Futtermaterial ein trockenes Getreidefutter ist. Diese Futtergemische können in Würfelform, pelletierter Form, geschnipselter, gerollter, temperierter, grundierter, gebrochener, extrudierter, mikronisierter, gerösteter, gekochter oder auseinandergezogener Form vorliegen.
In einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfindung einen Enzymzusatz zur Verwendung bei den oben erwähnten Verfahren und Futtergemischen vor. Der Enzymzusatz ist ein Gemisch von Cellulase und Xylanase, wobei die Enzyme in solchen Mengen eingeschlossen sind, daß das Verhältnis der Cellulaseaktivität zu der Xylanaseaktivität zwischen 2 bis 5 FPU Cellulase pro 100 IU Xylanase beträgt. Der Enzymzusatz kann in einer wässrigen Lösung zum Aufbringen auf die Futtermaterialien gelöst sein. Die wässrige Lösung ist bevorzugt ein weicher Puffer mit einem pH-Wert zwischen 4,5 und 7,0.
Ohne daß dies bindend ist, glauben die Erfinder, daß der Mechanismus, durch den die vorliegende Erfindung eine synergistische Beziehung zwischen der Xylanase und der Cellulase in den Enzymzusätzen hervorruft, nicht ein Ergebnis der einfachen Faseraktivität dieser Enzyme ist. Die Verbesserungen in dem Futterumwandlungsverhältnis (Trockensubstanzaufnahme (DEMI)/durchschnittlicher täglicher Gewinn/(ADG)), die in den Beispielen dargestellt sind, wären zu groß im Verhältnis zu den verhältnismäßig kleinen Mengen der Gesamtfaser, die in Hülsenfruchtfutter und Getreidefutter sind, um dies in den geringen Größen der Enzymaktivität zuzuweisen.
Man könnte Verbesserungen in der Futterverdaulichkeit erwarten, wenn große Enzymlevel auf Grasfutter angewendet würden (wie bei den Feng et al. Druckschriften). Grasheu, wie dasjenige, das von Feng et al. getestet wurde, hat einen höheren Faseranteil als Hülsenfruchtfutter oder Getreidefutter. Etwa 50% der Gesamtfaser in Grasheu ist Hemicellulose (d. h. Xylan). Die restlichen 50% der Gesamtfaser ist Lignin und Cellulose (Van Soest, 1982). Beispielsweise enthält sonnengetrocknetes Timothy-Heu (International Reference No. 1-04-885) 70% Gesamtfaser mit 29% Hemicellulose und 34% Cellulose (National Research Council, 1982).
Wie oben erwähnt, unterscheidet sich die Faserzusammensetzung von Hülsenfruchtfutter und Getreidefutter von derjenigen von Grasheu. Hülsenfruchtfutter wie Luzern (Intern. Referenz Nr. 1-00-068) enthält 50% Gesamtfaser, bestehend aus 11 % Hemicellulose und 28% Cellulose. Das Hülsenfruchtfutter proportional weniger. Hemicellulose als Grasheu enthält, ist es unerwartet, daß die Zugabe von Gellulase und Xylanase zu einem Hülsenfruchtfutter die Futterverdaulichkeit oder die Wachstumsrate von Wiederkäuer signifikant verbessert.
In ähnlicherweise enthält Körnerfutter wie Gerste (Intern. Ref. No. 4 -00-549) relativ kleine Mengen von Fasern (19% Gesamtfaser, von denen 5% Hemicellulose ist) und sie werden sehr schnell in dem Pansen verdaut.
Wiederkäuer, die Futter mit einem hohen Anteil von Getreidefutter fressen, würden - so ist zu erwarten - nicht signifikant von Enzymzusätzen profitieren.
Grasfutter unterscheidet sich von Hülsenfruchtfutter und Getreidefutter sowohl in der morphologischen Struktur als auch in der chemischen Zusammensetzung (Nelson et al., 1994). Blätter von Gras haben sowohl strukturelle als auch metabolische Funktionen, während bei Hülsenfrüchten Blätter nur eine metabolische Funktion haben. Die morphologische Struktur von Getreidefutter unterscheidet sich sehr von Heu darin, daß der relativ kleine Anteil von Fasern in Getreide sich in der Hülfe befindet und das stärkehaltige Nährgewebe umgibt.
Verfahren der Vorbehandlung, die den Nährwert von Grasheu verbessern, sind nicht wirksam hinsichtlich der Verbesserung des Nährwertes von Hülsenfruchtfutter. Beispielsweise war in 24 Studien mit Monocot (Gras) Resten die DM- Aufnahme um 22% erhöht als Ergebnis einer Natriumhydroxitbehandlung, während die zwei Studien von Dicot (Hüsenfrucht) Resten die DM-Aufnahme nur um 6% anstieg (Berger et al., 1994).
Die Cellulosezusammensetzung von Gras und Hülsenfruchtfutter ist allgemein ähnlich. Im Vergleich zu Hülsenfruchtfutter haben die Cellulose von Gras jedoch eine hohe Konzentration von Xylan-Lignin-Verbindungen. In Hülsenfruchtfutter sind die Polysaccharide (Xylan und Cellulose) und Lignine diskreter abgeteilt. Als Ergebnis wirkt Lignin als eine größere physikalische Barriere für die Faserverdauung in Hülsenfruchtfutter als bei Gras. Weitere Unterschiede in der Faserchemie bewirken, das Gras mehr auf chemische Behandlung anspricht als Hülsenfruchtfutter. Enzymbehandlungen, die den Nährwert von Grasheu erhöhen können nicht eine Wirksamkeit bei Hülsenfruchtfutter oder Getreidefutter erwarten lassen. Das Verhältnis von Hemicellulose : Cellulose in temperiertem Grasfutter reicht von 0,57 bis 0,7 gegen über 0,32 bis 0,40 in Hülsenfrüchten. Die hauptsächlichen Hemicellulose-Polysaccharide in Hülsenfrüchten sind Arabinoxylane, Xyloglycane, Arabinane und Galactane, während die hauptsächlichen Hemicellulose-Polysaccharide in Gras Xyloglucane und Arabinoxylane. Xylose machen 30% der Zucker in Grashemicellulose und 20% der Zucker in Hülsenfruchtfutter-Hemicellulose aus. Da die Hemicellulose in Hülsenfruchtfutter ein komplexeres Gemisch von Zuckern ist als die Hemicellulose von Gras, müßte ein komplexeres System von fibrolytischen Enzymen als erforderlich für den Abbau von Hülsenfruchtfutter-Hemicellulose erwartet werden.
Wie oben diskutiert, würde auf der Basis von bekannten Bemühungen erwartet werden, daß sehr hohe Level von fibrolytischen Enzymen erforderlich sind, um die Verdaulichkeit von Futtermitteln wesentlich zu erhöhen, insbesondere von Hülsenfruchtftutter und Körnerfutter mit einem niedrigerem Gesamtfaseranteil, da der Pansen eine hochgradig proteolytische Umgebung ist und ein hochentwickeltes System von Mikroben hat, die hoch-aktive fibrolytische Enzyme produzieren. Hülsenfruchtfutter und Körnerfutter mit ihren verhältnismäßig kleinen Anteilen von Gesamtfasern würden weniger wahrscheinlich Verbesserungen in der Verdaulichkeit zeigen als Grasfutter. Trotzdem haben die Erfinder wesentliche Verbesserungen bei der Verdaulichkeit von Hüsenfruchtutter und. Getreidefutter bei relativ geringer Enzymzugabe festgestellt. Das Futterumwandlungsverhältnis, das für Futtergerste beobachtet wurde, stieg um 12% (Tabelle 3 bei den Beispielen), was eine Verdoppelung der Verdaulichkeit des Gesamtfaseranteils des Getreides erwarten läßt. Das Futterumwandlungsverhältnis für Luzerne (eine Hülsenfrucht) stieg um 17% (9,92 kg Futter/kg Gewinn für unbehandeltes Heu, 8,48 kg Futter/kg Gewinn für Luzerneheu, das mit 3.600 IU Xylanase und 148 FPU Cellulase pro Kilogramm Trockensubstanz behandelt wurde), was eine beträchtliche Verbesserung der Verdaulichkeit der Gesamtfasern bedeutet. Diese überraschende Verbesserung in der Verdaulichkeit dürfte nicht aus den einfach addierten enzymatischen Effekten der hinzugefügten Gellulase und Xylanase resultieren. Ohne hieran gebunden zu sein, glauben die Erfinder, daß die Enzymzugaben der vorliegenden Erfindung Befestigungsbereiche für ruminale Bakterien auf behandelten Futterpartikeln bilden, wodurch die Kolonienbildung und nachfolgende Verdauung der Futterpartikel und ruminale Bakterien verbessert ist.
Es ist bekannt, daß Pflanzen, um als Futtermittel nutzbar zu sein, widerstandsfähig gegen Mikrobenangriff sein müssen, während sie auf dem Feld wachsen, jedoch zugänglich der Durchdringung, Kolonisierung und Verdauung durch Mikroorganismen innerhalb des Pansens. Schutzbarrieren und Substanzen, die gegen Mikrobenangriff auf dem Feld verteidigen (d. h. wachsartige Haut oder Phenolsäuren) beeinträchtigen die Verdauung des Pflanzenmaterials in dem Pansen. Ruminale Mikroorganismen umgehen diese Verteidigung durch weniger resistente Pflanzenstrukturen oder durch Aufbrechen der Schutzbarrieren durch Kauen oder durch mechanische Bearbeitung (McAllister et al.., 1994):
Wenn der Zugang erreicht ist, haften die Rumenbakterien an den inneren Bakterien, bilden Biofilme und beginnen die Verdauung. Die ersten geben Verdauungsprodukte frei, die zusätzliche Produkte zum Verdauungsort anziehen, wodurch ein komplexes System von Bakterien gebildet wird, das das innere Pflanzengewebe verdauen kann. Auf diese Weise schreitet die Verdauung des Futters in dem Pansen fort, wobei die Geschwindigkeit und der Verdauungsgrad des Futtermaterials auch von dem Ausmaß diktiert wird, in dem ruminale Mikroorganismen inneres Gewebe erreichen können (McAllister et al., 1994).
Die Enzymzusätze der vorliegenden Erfindung werden in das Futtermittel absorbiert, wo sie gegen Löslichkeit in der proteolytischen Pansenumgebung geschützt sind. Die Erfinder glauben, daß innerhalb des Futtermaterials die Enzyme Befestigungsbereiche zur anfänglichen Kolonisierung durch Pansenbakterien schaffen. Es wird ferner angenommen, daß ein höherer Level der Enzymbehandlung nicht effektiv ist, denn die überzähligen Enzymmoleküle werden über den Befestigungsbereichen gebunden und bilden eine Barriere für die Mikrobenbefestigung und Aktivität. Die überraschende Entdeckung der Erfindung ist von großer Nützlichkeit, da sie Verbesserungen der Verdaulichkeit der Gesamtfasern bei Futtermaterialien ermöglichen, die anderweitig relativ unzugänglich für Enzymbehandlungen sind, wobei kostengünstige Mengen von Enzymen in sehr speziellen Verhältnissen und Aktivitätslevels auf einfache und bequeme Weise verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine grafische Darstellung des täglichen Durchschnittsgewinns (ADG) in kg pro Tag von Ochsen, die ein Futtergemisch aus trockenem Luzernefutter erhielten, also eine Funktion des Enzymaktivitätslevels pro kg Futtermaterial. Nur der Xylanaselevel ist dargestellt. Das Verhältnis von Cellulase zu Xylanase- Aktivität lag konstant bei 4 FPU Gellulaseaktivität pro 100 IU Xylanaseaktivität.
Fig. 2 ist eine Darstellung, die den durchschnittlichen täglichen Gewinn (ADG) in kg pro Tag von Stieren, die eine Diät von Trockenthimothy-Futter erhielten, also eine Funktionsaktivitätslevels pro kg Futtermaterial. Nur der Xylanaselevel ist dargestellt. Das Verhältnis von Cellulase zu Xylanase-Aktivtät war konstant bei 4 FPI Cellulaseaktivität pro 100 IU Xylanaseaktivität.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, die den täglichen Durchschnittsgewinn (ADG) in kg pro Tag bei Stieren, die mit einer Diät aus Trockengerstesilage gefüttert werden, als eine Funktion des Enzymaktivitätslevels pro kg Futtermaterial angibt. Es ist nur der Xylanaselevel dargestellt. Das Verhältnis von Cellulase zu Xylanase-Aktivität war konstant bei 4 FPU Cellulaseaktivität pro 100 IU Xylanase-Aktivität.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, die das Verschwinden einer neutralen Reinigermasse-Faser (NDF) von getrocknetem Luzerneheu in einem Ruminalfluid als eine Funktion des Verhältnisses der Cellulase zu Xylanase-Aktivität des Enzymzusatzes bei zwei Enzymverhältnisses darstellt.
Fig. 5 ist eine dreidimensionale Darstellung, die das NDF-Verschwinden von getrocknetem Luzerneheu in einem Ruminalfluid als eine Funktion bei der Cellulase : Xylanase-Aktivitätsverhältnissen des Enzymzusatzes, ausgedrückt als IU-Xylanase: 1 FPU Cellulase und des Levels der hinzugefügten Enzyme angibt, ausgedrückt als IU Xylanase-Aktivität pro kg Futtertrockenmasse.
Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, die die Trockensubstanzverdaulichkeit (NDF-Verschwinden) von getrocknetem Luzerneheu in einem Ruminalfluid als eine Funktion der Inkubationszeit der Enzym-behandelten Luzerne nach der Enzymbehandlung angibt.

Detaillierte Beschreibunci bevorzugter Ausführungsformen

Die vorliegende Erfindung gibt Enzymzusätze zur Verbesserung der Verdaulichkeit von Trockenhülsenfruchtfutter und getrocknetem Getreidefutter an, die an Wiederkäuer verfüttert werden, und ein Verfahren zur Behandlung von Hülsenfruchtfutter und Getreidefutter mit einem Enzymzusatz, um einen stabilen Enzym/Futter-Komplex zu bilden.
Der Begriff "trocken" bedeutet im Zusammenhang mit dem Futtermaterial ein Futtermittel mit einem Feuchtigkeitsgehalt, der nicht größer als 15% (Gewicht/Gewicht) ist.
Der. Begriff "Hülsenfruchtfutter" bedeutet den geschnittenen und luftgehärteten Anteil einer Pflanze, der als Tierfutter verwendet ist, der eine Dicotyledonous Pflanzenart ist, die Mitglied der botanischen Familie Leguminosae ist. Beispiele sind, ohne Begrenzung, Luzerne, Sainfoin, Klee und Wicken. "Hülsenfruchtfutter" schließt Futter mit mehr als 50% Pflanzenmaterial der Leguminosae-Familie und bis zu 49% Pflanzenmaterial anderer Spezies ein.
"Getreidefutter" bedeutet die Saat von Pflanzen, die typischerweise an Wiederkäuer verfüttert werden, die die äußere Hülle, die Hülse oder Spelze der Saat enthält oder nicht enthält. Beispiele für Getreidefutter enthalten - ohne Begrenzung - Gerste, Weizen, Korn, Sorghum, Tritical, Roggen, Canola und Sojabohnen.
"Cellulase" bedeutet ein Enzym, das Zucker von Cellulose löst, und "Xylanase" bedeutet ein Enzym, das Zucker von Hemicellulose löst.
Der verwendete Begriff "Futtermaterial" bedeutet Hülsenfruchtfutter oder Getreidefutter.
Der verwendete Begriff "stabil" in Zusammenhang mit Futtergemischen der vorliegenden Erfindung, bedeutet, daß die Xylanase und die Cellulase aktiv bleibt und daß das Futtermaterial nicht fault, einer Vorverdauung unterliegt oder anderweitig schlechter wird innerhalb etwa eines Jahres nach der Behandlung.
Der verwendete Begriff "Überzug" im Zusammenhang mit der auf das Futtermaterial aufgebrachten Enzymlösung bedeutet, daß die Enzymlösung im wesentlichen gleichmäßig über das Futtermaterial verteilt ist. Die Überdeckung des Futtermaterial mit der Enzymlösung kann diskontinuierlich sein. Im Durchschnitt ist jedoch die Verteilung der Enzymlösung im wesentlichen gleichförmig.
Der Enzymzusatz enthält Cellulase und Xylanase in bestimmten bevorzugten Verhältnissen und Konzentrationen. Er kann Pektinase, Esterase, Arabinosidase und β 1-3 Glucanase enthalten. Protease, Lipase oder Amylase sind nicht erforderlich.
Es ist festgestellt worden, daß die Enzymzusätze am wirkungsvollsten bei der Steigerung der Futterverdaulichkeit sind, wenn die Xylanase und die Cellulase in bevorzugten Verhältnissen der Enzymaktivität und Konzentration vorliegen. Der Begriff "Konzentration" bedeutet im Zusammenhang mit der Konzentration von Enzym, daß einem Futtermaterial hinzugefügt ist, den Aktivitätslevel eines Enzyms pro kg Trockensubstanz eines Futtergemischs, das ein mit dem Enzymzusatz behandeltes Futtermaterial aufweist. Die Aktivität von Cellulase ist auf der Basis von Filterpapierabbau standardisiert, ausgedrückt in Filterpapiereinheit (FPU)-Aktivität (mol Glucose, erzeugt von dem Filterpapier pro Einheitenzym pro Minutel. Xylanase-Aktivität basiert auf der Hydrolyse von Haferspelze-Xylan in Xylose und wird ausgedrückt in internationalen Einheiten (IU) (mol reduzierende Zucker, produziert pro Einheit Enzym pro ml pro Minute). Untersuchungen von Cellulase und Xylanase-Aktivitäten sind in den Beispielen aufgeführt.
Wenn die Cellulase und die Xylanase in dem Enzymzusastz innerhalb der bevorzugten Verhältnisse und Konzentrationsbereiche vorhanden sind, ist ein synergistischer Effekt zwischen den Aktivitäten der Cellulase und der Xylanase hinsichtlich der Verdaulichkeit des mit den Enzymzusätzen behandelten Futtermaterials zu beobachten. Die erzielten Verbesserungen der Verdaulichkeit sind größer, als sie zu erwarten wären, wenn die Futtermaterialien getrennt mit Xylanase und Cellulase versehen würden. Der synergistische Effekt wird nicht beobachtet, wenn die Cellulase und die Xylanase in dem Enzymzusatz in Verhältnissen und Konzentrationen entweder unterhalb oder oberhalb den angegebenen Bereichen der vorliegenden Erfindung liegen.
Bei Hülsenfruchtfutter wie Luzerneheu wird die maximale Verbesserung der Verdaulichkeit des Futtermaterial beobachtet, wenn die Cellulase und die Xylanase in dem Enzymzusatz in einem Verhältnis von 2 bis 5 FPU Cellulase pro 100 IU Xylanase vorliegen. Die bevorzugte Größe der Cellulase- und Xylanase- Aktivität in dem Enzymzusatz ist derart, daß bei Anwendung auf Trockenhülsenfruchtfutter gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung die Cellulase-Aktivität zwischen 16 bis 120, bevorzugt 18 bis 72 FPU und die Xylanase-Aktivität zwischen 800 und 6.000, bevorzugt 900 bis 3.600 IU pro kg Trockensubstanz vorliegen.
Für Getreidefutter ist das optimale Verhältnis von Cellulase zu Xylanase 2 bis 5 FPU Cellulase pro 100 Xylanase. Der Enzymzusatz enthält bevorzugt ausreichende Mengen von Cellulase und Xylanase, um 100 bis 200, bevorzugt 40 bis 60 FPU Cellulase-Aktivität und 500 bis 10.000, bevorzugt 2.000 bis 8.000 IU Xylanase-Aktivität pro kg Trockenfutter hervorzurufen.
Um die gewünschten synergistischen Effekte und Verbesserung einer Verdaulichkeit von Futtermaterialien zu erreichen, sollte die Cellulase- und Xylanase-Enzyme entsprechend bestimmten Verfahren und Parametern auf das Futtermaterial aufgebracht werden. Die vorliegende Erfindung sieht somit ein Verfahren zur Behandlung von Futtermaterial mit Enzymen vor, um die Verdaulichkeit des Futtermaterials zu verbessern. Die verbesserte Verdaulichkeit und der synergistische Effekt von Xylanase und Cellulase sind maximiert, wenn die Enzyme in einer wässrigen Pufferlösung mit pH-Werten zwischen 4,5 und 7,9 gelöst sind. Die Enzyme können in getrennten Lösungen, bevorzugt in einem Gemisch in einer wässrigen Lösung vorliegen. Die wässrige Lösung (Lösungen) wird gleichmäßig auf das Futtermaterial mit einem Feuchtigkeitsgehalt von weniger als etwa 15% bei einer Umgebungstemperatur zwischen 5 und 80ºC aufgebracht. Das befeuchtete Futtermaterial sollte dann für wenigstens 3 Stunden inkubiert werden, bevorzugt über wenigsten 8 Stunden, um den sich ergebenen Futter/Enzym-Komplex (Futtergemisch) zu stabilisieren.
Die Behandlung von Trockenhülsenfruchtfutter oder Getreidefutter gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann kombiniert werden mit verschiedenen typischen Futterbehandlungsschritten, die vor oder nach der Enzymbehandlung stattfinden können. Solche Bearbeitungsschritte, ohne Begrenzung, das Temperieren, Rösten, Kochen oder Aufbrechen des Futters. Wenn der Bearbeitungsschritt auf solche Weise zum Zusammendrücken oder Verdichten des Futters führt, das die Adsorption des Enzymzusatzes in das Futtermaterial verhindert ist, wird die Enzymbehandlung bevorzugt vor diesem Verfahrensschritt ausgeführt. Solche Bearbeitungsschritte können, ohne Begrenzung Pelletieren, in Würfelform bringen oder Bündeln de Futters enthalten. Wenn die Bearbeitungsschritte bei hohen Temperaturen stattfinden, werden die Enzyme vorzugsweise nach der Bearbeitung aufgebracht.
Cellulase und Xylanase, das gemäß dem vorliegenden Verfahren verwendet wird, ist entweder in Pulverform oder in flüssiger Form verfügbar. In flüssiger Form befinden sich die Enzyme bevorzugt in wässriger Lösung, aufgelöst in einer wässrigen Pufferlösung bei einem pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 7,0. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren, befindet sich das Hülsenfruchtfutter oder Getreidefutter in einem getrocknetem Zustand, bevorzugt bei einem Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 15% (Gewicht/Gewicht). Die Feldtrocknung erreicht im allgemeinen diesen Trockengrad, obwohl eine zusätzliche Trocknung in Trocknern oder dergleichen erforderlich sein kann. Bezüglich der Masse des Hülsenfruchtfutters oder Getreidefutters wird genügend pulverförmiges oder flüssiges Xylanase und Cellulase in Wasser oder einer Pufferlösung aufgelöst, um das gewünschte Verhältnis von Cellulase zu Xylanase und den gewünschten Aktivitätslevel von Xylanase und Cellulase pro kg Futtermaterial zu erhalten. Die Enzyme können getrennt eingebracht oder in einer vorgemischten Form bei bestimmten bevorzugten Verhältnissen. Das Volumen von Wasser oder Puffer, das verwendet wird, um die Enzyme zu lösen, ist solange nicht kritisch, als ein so großes Volumen verwendet wird, um den Feuchtigkeitsgehalt des Futtermaterials um etwa 15 bis 18% zu erhöhen.
Die Enzymlösung wird dann gleichmäßig aufgebracht, so daß sie über das Futtermaterial verteilt ist (beispielsweise durch Sprayen). Das behandelte Futtergemisch wird dann bei einer Temperatur bevorzugt zwischen 5 und 80ºC über wenigstens 3 Stunden, bevorzugt wenigstens etwa 8 Stunden inkubiert, damit die Enzyme in das Futtermaterial absorbiert werden können und daran anhaften, damit überflüssige Feuchtigkeit verdampft und damit ein stabiles Futter/Enzym-Gemisch entsteht. Das resultierende Futtergemisch sollte wenigstens ein Jahr stabil bleiben.
Weitere spezielle Ausführungsformen und Anwendungen dieser Erfindung sind in den folgenden, nicht-begrenzenden Beispielen dargestellt.

Beispiel 1

Anwendung spezieller Verhältnisse von Xylanase und Zellulase auf Trockenhülsenfruchtfutter führt zu einer verbesserten Tierleistung

Zweiundsiebzig heranwachsende Stiere mit einem Gewicht von 300 kg (im Bereich von 235 bis 367 kg) untergebracht in einzelnden Fütterpferchen wurden drei Futternahrungen zugewiesen (24 Tiere/Futter):
1. Luzerne Heuwürfel;
2. Timothy Heuwürfel;
3. Gerstensilage.
Diese Futtermittel repräsentierten drei Arten von Futtermittel: Hülsenfruchtheu (Luzerne), Grasheu (Timothy) und Grassilage (Gerstensilage).
Jeder Nahrung wurden abgemessene Mengen eines wässrigen Gemischs von kommerzieller Exozellulase (Spezyme CP, Genencor, Rochester, NY) und Xylanase (Xylanase B, Enzyme Development Corporation, New Your, NY) zugefügt in einer 3 · 6 Anordnung (3 Nahrungen · 6 Enzymkonzentrationen). Innerhalb jeder Nahrung wurden vier Tiere jedem Enzymlevel (n = 4) zugeordnet. Die Enzyme wurden der Luzerne und dem Timothy-Heu während des Würfelprozesses bei verschiedenen Level hinzugefügt (Tabelle 1 ). Die Enzyme wurden mindestens sieben Tage vor der Verfütterung auf die Nahrungsmittel aufgebracht. Bei der Gerstensilage wurden die Enzyme in den geeigneten Konzentrationen hinzugefügt und direkt vor der Verfütterung gemischt. Protein/Mineral-Zusätze wurden jeder Nahrung hinzugefügt, um ein Minimum von 12% Rohprotein, ein adäquates im Pansen nicht abbaubares Protein, Ca, P und Mikromierale (NRC, 1994) zu erhalten. Da der Rohproteingehalt von Luzernewürfeln erheblich höher war, als derjenige von Timothy-Würfeln und Gerstensilage, war die gesamte Rohproteinaufnahme dieser Tiere höher, jedoch die Aufnahme von im Pansen nicht abbaubarem Protein war ähnlich. Die Tiere erhielten einmal am Tag Futter an 10.00 Uhr. Die Futtererlaubnis war 5 bis 10% höher als die Aufnahme.
Die Tiere wurden um 8.00 Uhr in 7- oder 14-Tage-Intervallen gewogen. Die einzelne Futteraufnahme wurde während des Experiments bestimmt. Die Tiere, die Heuwürfel erhielten, wurden handgefüttert, die Tiere, die Gerstensilage erhielten, wurden mit einem automatischen Futtermischer gefüttert. Das übriggebliebene Futter wurde gesammelt und vor dem Verfüttern, an jedem Montag, Mittwoch und Freitag gewogen. Die wöchentlich verweigerten Gemische wurden bei 55ºC über 72 Stunden getrocknet, um die Trockenmasse (DM) zu bestimmen.
Der durchschnittliche tägliche Gewinn (ADG) wurde aus den Lebendgewichten durch lineare Regression errechnet. Die Daten wurden einer 2-Wege-Analyse der Unterschiede bezüglich des Futters und der Enzymzugabe als Haupteffekte unterworfen. Wegen der konsistenten Nahrung x Enzym-Wechselwirkung wurden die Enzymauswirkungen bei jedem Futter durch eine Ein-Weg-Unterschiedsanalyse mit der Enzymaddition als Haupteffekt und dem Ausgangsgewicht als Covariante untersucht. Die folgende nicht-autogonale Gegenüberstellung wurde getestet: Niedrige Enzymlevel (Level 1, 2 und 3) gegen Kontrolle und hoher Enzymlevel (Level 5) gegen alle anderen Enzymlevel (einschließlich Kontroll- Nullenzym).
Die chemische Zusammensetzung der Futter ist in Tabelle 2 angegeben. Die Zugabe von faserigen Enzymen verringerte etwas NDF und ADF der Timothy- Würfel, jedoch nicht der Luzerne-Würfel, was eine partielle Faserhydrolysis vor der Nahrungsaufnahme von Gras andeutet, jedoch nicht von Hülsenfruchheu. Der durchschnittliche tägliche Gewinn wurde verstärkt durch Enzymzugabe zu Luzerne (P = .15) und Timothy-Würfeln (P = .0651, jedoch nicht (P = .67) für Gerstensilage (Tabelle 1). Die Dosisreaktion auf die Enzymzugabe war jedoch nicht-linear (siehe Fig. 1, 2 und 3). Bei Luzerne, einem Hülsenfruchtfutter, stieg ADG mit niedrigen Leveln von fibrolytischen Enzymen. Hohe Level von fibrolytischen Enzymen waren unwirksam. Die maximale Reaktion in ÄDG wurde bei 3.600 IU Xylanase/kg DM (Fig. 1) beobachtet. Die ADG bei diesem Level lag signifikant höher (P = .021) als bei der Kontrolle (1.34 gegenüber 1.03 kg/d), war aber ähnlich (P = .57) der ADG bei niedrigen Enzymleveln. Bei gemeinsamer Gegenüberstellung gegen die Kontrolle stiegen die drei niedrigen Enzymkonzentrationen (P = .015) ADG.
Bei Timothy, einem Grasfutter, wurde die maximale Reaktion in ADG bei der höchsten Enzymkonzentrationi (12.999 IU Xylanase/kg DM) (Fig. 2) erhalten. Der ADG bei diesem Level (1.66 kg/d) war höher (P < .01) als für die Kontrolle (1.22 kg/d) und alle niedrigen Enzymlevel. Die Ergebnisse für Timothyheu stimmten mit denjenigen überein, die beim Stand der Technik beobachtet wurden.
Wie erwartet, unterschied sich die DM-Aufnahme ("DMI") (P < .001) beträchtlich innerhalb der Futtermittel (Tabelle 1) und war am niedrigsten für Gerstensilage und am höchsten für Luzerne. Enzymzugaben wirkten sich nicht auf DMI von Luzerne (P = .60) oder Gerstensilage (P = .23). Bei Timothy hatten die Tiere, die die höchsten Konzentrationen von Enzymen erhielten, einen höheren (P = .043) DMI als bei der Kontrolle und allen anderen Enzymleveln. Im Gegensatz hierzu profitierten Tiere, denen Gerstensilage verfüttert wurde, nicht von fibrolytischen Enzymen, die unmittelbar vor der Verfütterung hinzugefügt wurden (Fig. 3).

Tabelle 1

Wirkung des Enzymlevels auf den durchschnittlichen täglichen Gewinn (ADG; kg/d) und die Trockenmasse-Aufnahme (DMI; kg/d) bei Stieren, die unterschiedliche Futter aufnehmen.
*IU = Internationale Einheiten von Xylanase/kg Trockenmasse
**FPU = Filterpapiereinheiten von Zellulyse/kg DM Tabelle 2 Sauerreinigende Faser (ADF) und neutralreinigende Faser (NDF) in Luzerne und Timothy, die mit verschiedenen Enzymlevel behandelt sind

Beispiel 2

Die Anwendung von speziellen Verhältnissen von Xylanase und Cellulase auf Trockengetreidefutter führt zu verbesserter Tierleistung

19 Stiere mit einem Gewicht von 410 kg, die in einzelnen Futterpferchen untergebracht wurden, erhielten drei Futtermittel:
1. Gerste - kein Enzym
2. Gerste mit 6.000 IU Xylanase und 200 FPU Cellulase/kg DM
3. Gerste mit 2.400 IU Xylanase und 420 FPU Cellulase/kg DM
Die Futtermittel bestanden aus 93% Gerstenkonzentrat und 7% Gerstensilage (DM-Basis). Wässrige Gemische von kommerzieller Exozellulase (Spezyme, CP, Genencor, Rochester, NY) und Xylanase (Xylanase B, Enzyme Development Corporation, New York, NY) wurden dem Trockengetreide wenigstens 24 h vor der Verfütterung beigefügt. Die Gerste wurde mit Dampf gerollt und anschließend direkt vor der Verfütterung mit der Gerstensilage vermischt. Protein/Mineral-Zusätze wurden jedem Futtermittel hinzugefügt, um wenigstens 12% Rohprotein, ein adäquates im Pansen nicht abbaubares Protein, Ca, P und Mikromineralien zu erhalten (NRC, 1984). Die Tiere erhielten das Futter einmal am Tag gegen 10.00 Uhr. Das Futterangebot übertrag 5 bis 10% der gewollten Aufnahme.
Die Tiere wurden um 8.00 Uhr n sieben- oder vierzehntägigen Intervallen gewogen. Die einzelne Futteraufnahme wurde während des Experiments ermittelt. Die Tiere, die Heuwürfel erhielten, wurden handgefüttert, und die Tiere, die Gerstensilage erhielten, wurden mit Hilfe eines automatisierten Futtermischers gefüttert. Das übriggebliebene Futter wurde gesammelt und vor dem Verfüttern jeden Montag, Mittwoch und Freitag gewogen. Die wöchentlichen verweigerten Germische wurden bei 55ºC über 72 h getrocknet, um DM zu bestimmen.
Der durchschnittliche tägliche Gewinn (ADG) wurde aus den Lebendgewichten durch lineare Regression nach 78 Tagen der Fütterung errechnet. Die Tage wurden einer Ein-Weg-Analyse der Abweichung mit Enzymzugabe als Haupteffekt unterworfen. Die Ergebnisse (Tabelle 3) zeigen, daß die hinzugefügten Enzyme zu dem Getreidefutter den durchschnittlichen täglichen Gewinn um 6,3% und die Wirksamkeit der Futterumwandlung um 12,3% (B < 0.05) erhöhten. Bessere Resultate wurden mit der 3.3 FPU Cellulase: 100 IU Xylanase-Zugabe als mit der 17,5 FPU Cellulase zu 100 IU Xylanase-Zugabe erzielt.

Tabelle 3

Der durchschnittliche tägliche Gewinn von Stieren, die Futtermittel mit 93% Gerste (DM Basis) erhielten, die mit fibrolytischen Enzymen behandelt wurde.
*IU = Internationale Einheit Xylanase/kg DM
**FPU = Filterpapiereinheiten Cellulase/kg DM

Beispiel 3

Spezielle Verhältnise von Xylanase und Cellulase führen zu verbesserter Futterverdauung. Die Verwendung anderer Verhältnisse führen zu keiner Verbesserung oder negativen Auswirkungen auf die Verdaulichkeit.

Bei den ersten beiden von drei Experimenten wurde in vitro das Verschwinden von neutraler reinigender Faser (NDF) von trockenem Luzerneheu nach 24 h Inkubation bestimmt. Proben von ofengetrocknetem Luzerneheu wurden im gepuffertem Ruminalfluid (20% Rumenfluid, 80% Puffer) inkubiert, dem fibrolytische Enzyme wie oben angegeben hinzugefügt wurden. Die gesamte Enzymkonzentration (Endocellulase + Xylanase) betrug 6.000 IU/kg mit variierenden Endocellulase: Xylanase-Verhältnissen (0 : 100, 25 : 75, 50 : 50, 75 : 25, 100 : 0). Bei dem zweiten Experiment wurde dasselbe Protokoll verwendet mit der Ausnahme, daß andere Endocellulase : Xylanase-Verhältnisse verwendet wurden (0 : 100, 5 : 95, 10 : 90, 15 : 85, 20 : 80, 25 : 75 und 100 : 0). Bei dem dritten Experiment wurde dasselbe Protokoll verwendet mit der Ausnahme das Spezyme CP Exocellulase anstelle von CEP Endocellulase verwendet wurde. Die Enzymlevel für diese Experiment sind in Tabelle 5 angegeben.
Bei allen Experimenten war das Ruminal-Puffer das Phosphat-Bicarbonat-Puffer von Goering und Van Soest (1970). Makromineralien, Mikromineralien, Peptone und Reduzierungsmittel wurden dem Puffer hinzugefügt, und der Puffer wurde mit CO&sub2; gesprudelt, bis er vollständig reduziert war, bevor er mit dem Ruminalfluid gemischt wurde. Nach 24 h Inkubation bei 39ºC wurden die Rohrinhalte über 1 h in einer kochenden neutralen Reinigungslösung extrahiert und der Rest wurde über Nacht bei 105ºC (Experiment 1) getrocknet oder nach 24 h Inkubation bei 39ºC, die Rohrinhalte wurden gefiltert in vorgewogenen Schmelztiegeln und über Nacht bei 150ºC getrocknet, um die DM-Verdauung zu messen. In vitro Ergebnisse wurden statistisch mit einem 2-Weg-Anova mit Hülsenfrucht und Enzymbehandlung als Haupteffekte untersucht. Die Enzymeffekte wurden durch Gegenüberstellung mit der Kontrolle (keine Enzyme) gegen Enzyme (ungeachtet des Verhältnisses) getrennt.

Experimente 1 und 2

Die Zugabe von fibrolytischen Enzymen erhöhte signifikant (P < .01) NDF Verschwinden. Das Faserverschwinden stieg mit abnehmendem Cellulase : Xylanase-Verhältnis, und zwar bei dem 25 : 75 Cellulase : Xylanase- Gemisch mehr (P < .01, Tabelle 4) als für andere Enzymverhältnisse. Die alleinige Anwendung von Xylanase-Enzym war weniger wirksam in der Verbesserung des NDF Verschwindens, wobei 100% Cellulase effektiver war. Es gab jedoch einen zugehörigen synergistischen Effekt zwischen Cellulase und Xylanase- Anwendung. Während Cellulase allein effektiver war als Xylanase allein, führte die Kombination einer kleinen Menge von Cellulase (5-25% der gesamten Enzymaktivität) zu dem größten Anstieg der NDF-Verdauung (Fig. 4). Überall führte ein Gemisch von fibrolytischen Enzymen mit 25% Endocellulase und 75% Xylanase der Gesamtaktivität zu einer Verbesserung von 26% und 8,2% in den Experimenten 1 und 2. Tabelle 4 Die Wirkung von Xylanase und Cellulase auf in vitro NDF Verdauung (24 h) von Luzerne)

Experiment 3

Die Ergebnisse dieses Experimentes zeigen weiter den assoziativen Effekt von Xylanase und Cellulase (Tabelle 5 und Fig. 5). Die Methode war identisch derjenigen der Experimente 1 und 2 mit der Ausnahme, daß eine Exocellulase (Spezyme CP) verwendet wurde. Bodenluzerne wurde in vitro mit verschiedenen Kombinationen und Level von Xylanase und Cellulase inkubiert. Tabelle 5, Spalte 4, enthält Werte für die DM-Verdauung, die beobachtet wurden, wenn Xylanase alleine verwendet wurde. Spalte 5 enthält Werte, die beobachtet wurden, wenn Cellulase alleine verwendet wurde. Spalte 6 enthält die erwartete DM- Verdauung, die erwartet wird, wenn Xylanase und Cellulase in ihren Auswirkungen auf die DM-Verdauung von Luzerne addiert werden (Summe der Verbesserungen der Verdauung, die bei Cellulase allein plus Xylanase allein beobachtet wurde). Spalte 7 enthält aktuell beobachtete DM-Verdauung. Die Differenz zwischen der beobachteten und der erwarteten DM-Verdauung (Spalte 8) ausgedrückt in Prozent ist die Veränderung in Folge der Wirkung von Cellulase und Xylanase, die assoziativ, auf synergistische Weise wirkt. Tabelle 5 Assoziative Wirkung der hinzugefügten Kombinationen von Xylanase und Cellulase im Vergleich mit der Hinzufügung einzelner Enzyme auf in vitro DM- Verdauung von Luzerne
Da der Anteil von Xylanase und Cellulase ansteigt (Fig. 5 zeigt nur das Maß der Xylanase-Aktivität) ist die assoziative Wirkung der Enzyme erhöht. Der maximale assoziative Effekt tritt auf, wenn Xylanase in einer Höhe von 2.000 IU/kg DM beigefügt wurde. Der assoziative Effekt wurde auch durch das Verhältnis von Xylanase: Cellulase beeinflußt. Der maximale assoziative Effekt tritt auf, wenn das Verhältnis von Xylanase: Cellulase (IU: FPU) zwischen 30 : 1 und 40 : 1 (2.5 bis 3.3 FPU Cellulase pro 100 IU Xylanase) betrug. Beispielsweise führte die Anwendung von 1.500 IU Xylanase und 50 FPU Cellulase pro kg DM zu einer DM-Verdaulichkeit von 63, 1% im Vergleich zu 40,1% bei unbehandelter Luzerne, 43,98% bei 1.500 IU Xylanase/0 FPU Cellulase und 45,6% für 0 IU Xylanase/50 FPU Cellulase-behandelte Luzerne. Die Addition von hoher Xylanase und Cellulase = Aktivität verringerte die Verdaulichkeit. Beispielsweise führte die Anwendung von 8.000 IU Xylanase und 400 FPU Cellulase pro kg DM (20 : 1 Verhältnis) zu einer DM-Verdaulichkeit von 53,4% im Vergleich zu 40,1% bei unbehandelter Luzerne, 44,05% für 8.000 IU Xylanase/0 FPU Cellulase und 54,3% für 0 IU Xylanase/400 FPU Cellulase-behandelte Luzerne. Diese Ergebnisse zeigen, daß es ein optimale Maß und Verhältnis von Xylanase und Cellulase gibt, um die Verdaulichkeit von Luzerne zu erhöhen. Die Anwendung ungeeigneter Verhältnisse und Level außerhalb der spezifizierten führt zu keinen oder sogar negativen Wirkungen.

Beispiel 4

Die Enzyme müssen auf trockene Futtermaterialien aufgebracht werden und vor der Nahrungsaufnahme in das Futtermaterial absorbiert werden und daran anhaften. Eine minimale Zeitspanne zum Stabilisieren des Enzym-Futtermittelkomplexes ist erforderlich.

Ein Experiment wurde durchgeführt, um die Wirkungen der Zugabe eines fibrolytischen Enzymgemischs zu Luzernesilage bei der Aufnahme und Verdauung von Trockensubstanz zu bestimmen, und ob das Enzymgemisch gleich wirksam ist auf trockenes oder feuchtes Futter.
Zweitgeschnittene Luzerne wurde geschnitten und als Silage bereitgestellt unter Verwendung von drei kleinen aufrechten Versuchssilos, die jeweils etwa 700 kg Silage enhalten. Ein Teil der Silage wurde getrocknet unter Verwendung eines kleinen Drehtrommeltrockners, der für Versuchszwecke von dem Alberta Fram Machinery Research Institute in Lethbridge konstruiert wurde. Etwa 850 kg feuchte Silage (mit einem Trockensubstanzanteil von etwa 33%) wurde zwischen 60 und 70ºC über etwa 6 bis 8 Stunden auf einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 15% in drei verschiedenen Versuchsmengen getrocknet.
Fünf Einrichtungen wurden benutzt in einem Experiment, ausgebildet als ein 5 · 5- modifiziertes Quadrat mit fünf 14-Tage Versuchsperioden. Die Futtermittel wurden so angeordnet, daß alle Schafe am Ende des Experiments alle Futtermittel erhielten. Die fünf Futtermittel waren:
1. Luzernesilage
2. Luzernesilage mit fibrolytischen Enzymen
3. getrockneter Luzernesilage
4. getrockneter Luzernesilage mit fibrolytischen Enzymen und
5. Luzernesilagewürfel
Das fibrolytische Enzymgemisch, das in dieser Studie verwendet wurde, war ein Gemisch von Xylanase (Xylanase B, Enzyme Development Corporation, New York, NY) und Gellulase (Spezyme CP, Genencor, Rochester, NYI aufgebracht in 3.75 internationalen Einheiten (IU von Xylanase und .25 Filterpapiereinheiten (FPU) Cellulase-Programm-Trockenfuttersubstanz. Das Enzymgemisch wurde zur Zeit der Verfütterung aufgebracht.
Die feuchten Luzernefuttermittel wurden während der ersten zwei Perioden angeboten, um ihr Verderben zu verhindern. Das Futter wurde zweimal täglich in 110% der freiwilligen Aufnahme angeboten. Das zurückgewiesene Futter wurde täglich gesammelt und zur chemischen Analyse behalten, um die freiwillige Futteraufnahme zu bestimmen. Die Schafe wurden in Sammelgittern über wenigstens 10 Tage jeder Periode gehalten, um die tägliche Sammlung zu erleichtern.
Die Daten der täglichen Trockensubstanzaufnahme und Trockensubstanzverdaulichkeit des Futters unter Verwendung eines allgemein linearen Modells mit Schafen und Futter in dem Modell analysiert. Zeitdauereffekte wurden nicht in das Modell eingeschlossen, da das Futter nicht wirklich zufällig verteilt war gemäß einem Latin-Quadrat-Design.
Die Wirksamkeit der hinzugefügten Enzyme hingen davon ab, ob die Silage feucht oder trocken war. Die Zugabe des Enzymgemischs erhöhte die Trockensubstanzverdaulichkeit um 2,9% (63.1 gegenüber 61.3%; P < .04; Tabelle 6) im Falle trockener Silage, hatte aber keine Auswirkung auf die Verdaulichkeit von feuchter Silage. Die Tiere, die Trockensilage erhielten, konsumierten mehr als diejenigen, die feuchte Silage erhielten, jedoch hatte die Enzymzugabe keine Wirkung (P > .05) auf die Trockensubstanzaufnahme. Die Aufnahme von verdaulicher Trockensubstanz war wegen der Enzymzugabe marginal erhöht.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die in Enzymzugabe die Futterverdaulichkeit erhöht, wenn sie auf eine Weise aufgebracht wird, die es erlaubt, daß die Enzyme an dem Substrat anhaften. Im Falle von Trockensilage wurde das flüssige Enzymgemisch sofort absorbiert, wenn es auf das Futter aufgebracht wurde, während ein hoher Feuchtigkeitsgehalt der feuchten Silage die Absorbtion der Enzyme verhindert hat. Die Enzyme können von dem feuchten Futter leichter bei Aufnahme durch das Tier oder bei Kontakt mit Ruminalfluid gelöst worden sein.
Bei dem Beispiel 1, bei dem Gerstensilage an Rinder verfüttert wurde, hatten vor der Verfütterung aufgebrachte Enzyme keine Wirkung auf die Tierleistung. In dieser Studie waren Enzyme, die auf Trockenfutter (d. h. Timothy und Luzernewürfel) zum Zeitpunkt der Verarbeitung aufgebracht wurden, wirksam. Beide Beispiele 1 und 4 zeigen, daß die Enzyme auf Trockenfutter aufgebracht werden müssen. Tabelle 6 Die Wirkung von fibrolytischen Enzymen auf die Verdaulichkeit von Luzernesilage Trockensubstanz (DM)
a.b. Die Wirkung des Enzyms, das Trockensilage hinzugefüg wurde, war signifikant (P < .04).

Beispiel 5

Der Enzym/Futterkomplex erfordert eine minimale Inkubationsdauer, um stabil zu werden.

Ein Experiment wurde durchgeführt, um die Auswirkung der Stabilisierungszeit eines fibrolytischen Enzymgemischs auf die Verdaulichkeit von Luzerneheu zu bestimmen.
Proben trockenem Luzerneheu wurden gemahlen, so daß sie durch ein 2 mm- Sieb hindurchgingen. Eine Lösung von fibrolytischen Enzymen auf Xylanase (Xylanase B, Enzyme Development Corporation, New York, NY) Cellulase (Spezyme, Genencor, Rochester, NY) und 10 mM Actetatpuffer (pH 4.8) wurde auf jede Probe gesprüht. Die Lösung wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,09 ml/g des Futters (ist-Basis) aufgesprüht. Der Luzerne wurde 2.000 iU Xylanase und 67 FPU Cellulase pro kg Trockensubstanz hinzugefügt. Die Enzyme wurden auf dem Futter über 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24 und 32 h stabilisiert. Das behandelte Futter wurde in gepufferter (pH 6,8) Ruminalflüssigkeit (20% Rumenfluid, 80% Puffer) nach den Methoden von Goering und Van Soest (1970) inkubiert. Die gepufferte Ruminalflüssigkeit wurde der 0 h Stundenbehandlung in einer Aufbringungszeit der Enzymlösung von 5 min hinzugefügt. Eine abschließende Behandlung bestehend aus der Hinzufügung der Enzymlösung hinter der Ruminalflüssigkeit wurde dem Futter beigefügt. Bei jeder Stabilisierungszeit wurde eine Futterprobe ohne Enzyme inkubiert und als Kontrolle für die Stabilisierungszeit verwendet. Diese Kontrollen waren nötig, um die variable Natur der Rumenflüssigkeit bei Wiederholungen zu eliminieren. Alle Inkubationen wurden dreifach über 24 h bei 39ºC durchgeführt. Nach der Inkubation wurden die Proben gefiltert, um die Trockensubstanzverdaulichkeit zu bestimmen. Reste wurden analysiert hinsichtlich neutraler Reinigungsfaser (NDF), um die Faserverdaulichkeit zu bestimmen. Die Ergebnisse der Verdaulichkeit sind als Prozent der jeweiligen Kontrollinkubation berichtet.
Die Ergebnisse dieser Studie sind in Fig. 6 dargestellt. Das Trocksubstanzverschwinden erhöhte sich über die unbehandelte Kontrolle bei jeder Steigerung der Inkubationszeit bis zu 24 h. Diese Ergebnisse zeigen klar die Notwenigkeit einer Zeitspanne, um den Enzym/Futterkomplex stabilisieren zu können. Für Zeitspannen bis zu 2 h gab es einen Nominalanstieg in der DM- Verdaulichkeit. Eine ausreichende Stabilisierung wurde in 3 h erreicht. Der meiste Stabilisierungseffekt wurde durch 8 h mit maximaler Stabilität und DM- Verdaulichkeit bei 24 h Stabilisation erreicht. Die Luzerne war trocken, so daß keine Vorverdauung stattfand. Das beobachtete Ergebnis war eine Folge der Bindung der Enzyme an das Futter, und die Zeit war erforderlich, um diesen stabilen Komplex zu bilden.

Beispiel 6

Prüfung der Exo-Cellulose Aktivität, ausgedrückt in Filterpapiereinheiten.

Prinzip

Die Cellulase in der Probe schließt das Substrat, Filterpapier auf und die so freigegebenen reduzierten Zucker werden spektrophotometrisch unter Verwendung Dinitrosalicylsäure untersucht.

Einheit der Aktivität

Die Einheit der Filterpapieraktivit ist FPU (siehe Berechnung).

Versuchsbedingungen

Substrat Filterpapier
pH 4.8
Inkubationstemperatur 50ºC
Inkubationszeit 60 min

Ausrüstung

Wasserbad 50ºC
Wasserbad 100ºC
Testrohrmixer (Vortex)
Spectrophotometer

Reagenzien

Alle Lösungen werden in deionisiertem Wasser bereitet, Milli-Q oder äquivalent.

1. Citratpuffer (0,05 M, pH 4,8)

Bereite 0.05 M Lösungen von Zitronensäure (C&sub6;H&sub8;O&sub7;·H&sub2;O·10.51 g/l,) und Natriumcitrat (C&sub6;H&sub5;Na&sub3;O&sub7;·2H&sub2;O, 14.71 g/l) in Wasser. Stelle den pH-Wert der 0.05 M Citratlösung auf 4,8 mit der 0.05 M Zitronensäurelösung ein (dies sollte etwa 667 ml Zitronensäurelösung pro 1 l Natriumcitratlösung erfordern).

2. Substrat

Whatman No. 1 Filterpapierstreifen, 5 mm W · 120 mm L (49.6-50.5 mg).
Beachte: Es ist wichtig, daß dieses Gewicht erreicht wird, und die kann durch Wegschneiden der Ecke des Streifens und Wiegen geschehen.

3. DNS Reagenz

Löse 5,0 g von 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoicsäure (auch bekannt als 3,5 dintirosalicylsäure - Merck 800141) in etwa 4 l Wasser. Bei fortlaufendem magnetischen Rühren füge allmählich 8,0 g von NaOH hinzu und laß dies Lösen. Füge 150 g Rochelle Salz (Kna-tartrate, Merck 8087) in kleinen Portionen bei fortlaufendem Umrühren hinzu. Die Lösung kann vorsichtshalber auf eine maximale Temperatur von 45ºC erwärmt werden. Kühle auf Raumtemperatur ab und löse mit Wasser zu 500 ml in einem Glaskolben. Wenn die Lösung nicht klar ist, Filter durch Whatman 1 Filterpapier. Aufbewahren in einer dunklen Flasche bei Raumtemperatur.

4. Glucosestandard

Löse 1,00 g von Glucose (Merck 8337; stored in desicator) in Citratpuffer und erzeuge ein Volumen bis zu 250 ml in einem Glaskolben. Diese Lösung enthält 2,0 mg Glucose in 0,5 ml.
Probe: Die Probe wird in Citratpuffer gelöst. Wenigstens zwei Lösungen müssen aus jeder untersuchten Enzymprobe bestehen. Eine Lösung sollte etwas mehr und eine etwas weniger (absolute Menge) als 2,0 mg Glucose (äquivalent reduzierenden Zucker als Glucose) in den Reaktionsbedingungen freigeben.
Versuch: Wickel des Filterpapierstreifen dicht in kleine Kringel, plaziere ihn in dem trockenen Teströhrchen (25 ml) und füge 1,0 ml Citratpuffer mit einer Pipette hinzu, um das Papier unter der Flüssigkeit zu halten. Halte dies bei 50ºC 5 min Lang. Zur Zeit 0 gebe 0,5 ml der Probe in das Teströhrchen und mische (der Streifen muß unter der Flüssigkeitsfläche bleiben). Nach genau 60 min Inkubationszeit bei 50ºC füge 3,0 ml DNS Reagenz zu und mische. Plaziere alle Röhrchen (alle Proben, Enzymrohlinge, Glucosestandard und Reagenzien) gleichzeitig in ein kochendes Wasserbad. Nach genau 5 min Kochen entferne die Röhrchen und kühle sie auf Raumtemperatur ab. Füge 20 ml Wasser hinzu. Mische mehere Male durch vollständiges Umdrehen der Röhrchen. Wenn sich der Inhalt beruhigt hat, d. h. nach wenigstens 20 min. wird die Lösung mit einer Pipette in eine Cuvette überführt und die gebildete Form wird gegen einen Reagenzrohling bei 540 nm gemessen.
Enzymrohling 1,0 ml
0,5 ml Probe
3,0 ml DNS
Puffer Reagenzrohling 1, 5 ml Puffer
3,0 ml DNS
Glucosestandard 1,0 ml Puffer
0,5 ml Standard
3,0 ml DNS
Koche 5 min lang, füge 20 ml Wasser hinzu etc. Messe das Absorbieren der Probe, der Enzymrohlinge und Glucosestandard gegen das Reagenz bei 540 nm.

Berechnuno

Die Einheit FPU basiert auf internationale Einheit (Beachte: FPU Versuch ist nicht linear, die Verwendung von internationalen Einheiten ist epr se unkorrekt).
1 IU = 1 mol min&supmin;¹ von umgewandeltem Substrat = 1 mol min-1 hergestelltes Produkt (reduzierende Zucker als Glucose, das Molekulargewicht von Glucose ist 180 g mol-1)
Die absolute Menge der in dem FPU Versuch freigegebenen Glucose in der kritischen Lösung ist 2,0 mg. Diese Menge Glucose wird durch 0,5 ml Enzyme in 60 min in der Hydrolysereaktion erzeugt und ist äquivalent zu:
2,0 mg/0,18 mg mol&supmin;¹ · 0.5 ml · 60 min = 0,37 mol min&supmin;¹ ml&supmin;¹
Trage die Probenaufnahme (nach Substrahieren der Enzymrohlinge) gegen die Enzymlösung (Gesamtvolumen der Lösung geteilt durch das Volumen der Enzymen in Lösung) auf einem halblogarythmischen graphischen Papier auf. Lies die kritische Lösung für jede Probe entsprechend der Aufnahme des Standards.
FPU/ml = kritische Lösung 0.37

Beispiel 7

Untersuchung der Enco-Cellulase (Carboxy-Methyl Cellulose) Aktivität ausgedrückt in internationalen Einheiten.

Prinzip.

Die CMCase in der Probenhydrolyse des Substrats, Carboxymethylcellulose (CMC) und die so freigegebenen reduzierenden Zucker werden spektrophotometrisch untersucht unter Verwendung von Dinitrosalicylsäure.

Einheit der Aktivität

Die Einheiten werden als internationale Einheiten (IU) ausgedrückt. Eine IU der Aktivität befreit 1 umol von reduzierenden Zuckern (ausgedrückt als Glucoseäquivalente) in einer Minute unter Versuchsbedingungen.

Versuchsbedingungen

Substrat Carboxymethylcellulose
pH 4,8
Inkubationstemperatur 50ºC
Inkubationszeit 60 min

Ausrüstung

Wasserbad 50ºC
Wasserbad 100ºC
Teströhrchenmixer (Vortex)
Spectrophotometer

Reagenzien

Alle Lösungen werden in deionisiertem Wasser hergestellt, Milli-Q oder äquivalent.

1. Citratpuffer (0.05 M, pH 4.8)

Bereite 0.05 M Lösungen von Zitronensäure (C&sub6;H&sub8;O&sub7;·H&sub2;O·10.51 g/l,) und Natiumcitrat (C&sub6;H&sub5;Na&sub3;O&sub7; 2H&sub2;O, 14,71 g/l,) in Wasser. Stelle den pH-Wert der 0,05 M Citratlösung auf 4.8 mit 0,05 M Zitronensäurelösung ein (dies dürfte etwa 667 ml Zitronensäurelösung pro 1 l Natriumcitratlösung erfordern).

2. Substrat - 1% Carboxymethylcellulose

Löse 1,0 g CMC; mittlere Viskosität (Sigma No. C-4888) in etwa 80 ml von 0,05 M Citratpuffer vorzugsweise unter Verwendung eines Heizmagnetrührers auf. Erhitze auf den Siedepunkt und kühle unter fortlaufendem Rühren, decke ab und, rühre langsam über Nacht. Fülle das Volumen auf zu 100 ml mit dem Citratpuffer. Dies kann bei 4ºC maximale eine Woche lang aufbewahrt werden.

3. DNS Reagenz

Löse 5,0 g von 2-Hydroxy-3,5-Dinitrobenzoicsäure (ebenfalls bekannt als 3,5 Dinitrosalicylsäure - Merck 800141) in etwa 4 l Wasser auf. Unter fortlaufendem magnetischen Rühren füge allmählich 8,0 g NaOH hinzu und laß dies lösen. Füge 150 Rochelle Salz (Kna-tartrate, Merck 8087) in kleinen Mengen unter fortlaufendem Rühren hinzu. Die Lösung kann vorsichtig auf eine maximale Temperatur von 45ºC erwärmt werden. Kühle auf Raumtemperatur und löse mit Wasser zu 500 ml in einem Glaskolben. Wenn die Lösung nicht klar ist, filter durch Whatman 1 Filterpapier. Aufbewahren in einer dunklen Flasche bei Raumtemperatur.

Probe

Die Probe wird in 0,05 M Natriumcitratpuffer gelöst. Eine geeignete Lösung hat eine Aufnahmefähigkeit von 0,3 bis 0,5.

Versuch

Füge 1,8 ml Substratlösung in zwei Teströhrchen und halte sie bei 50ºC über 5 min. Füge 200 l einer geeignete gelösten Enzymlösung in eine der Röhrchen und mische mit dem Vortex-Mischer. Nach genau 5 min bei 50ºC füge 3,0 ml DNS Reagenz in beide Röhrchen und mische. Füge 200 l der Probenlösung in das Röhrchen, die ohne Probe (Enzymrohling) inkubiert ist. Gebe beide Röhrchen gleichzeitig in ein kochendes Wasserbad. Nach genau 5 min kochen entferne die Röhrchen und kühle im kalten Wasser auf Raumtemperatur. Messe die Probenaufnahme gegen diejenige des Enzymrohlings bei 540 nm. Lese die Aktivtät aus der Standardlinie und multipliziere mit dem Lösungsfaktor.

Standard

Bereite 0.01 M Vorratslösung von Glucose durch Lösen von 0,180 g Glucose (Merck 833/, sotre in dessicator) in 100 ml Puffer) Die Vorratslösung kann in kleinen Teilmengen bei -20ºC gefroren werden, nach der Entnahme aus den Röhrchen muß sie sorgfältig gemischt werden. Mache folgende Lösungen aus der Vorratslösung in Citratpuffer:

Lösung Glucose

mol/ml
1 : 1 10,0
1 : 2 5,0
1 : 4 2,5
1 : 5 2,0
Mache dreifache Versuche mit jeder Standardlösung in der gleichen Weise wie der Enzymrohling. Gebe mit der Pipette 1,8 ml Substrat in das Teströhrchen, inkubiere 5 min bei 50ºC, füge 3,0 ml DNS und 200 ul Standardlösung hinzu. Bereite den Reagenzrohling durch Hinzufügen von 200 ul Citratpuffer anstelle der Standardlösung. Koche die Röhrchen exakt 5 min. kühle und messe die Aufnahme gegen den Reagenzrohling bei 540 nm. Erzeuge eine Standardlinie für jede Serie der Versuche.

Beispiel 8

Untersuchung der Xylanase-Aktivität, ausgedrückt in internationalen Einheiten.

Prinzi

Xylanase hydrolisiert in der Probe das Substrat, Haferspelzxylan, und die Menge der freigegebenen reduzierenden Kohlenhydrate wird spektrophotometrisch unter Verwendung von Odinitrosalicylsäure bestimmt.

Einheit der Aktivität

Eine Xylanaseeinheit (internationale Einheit; IU) ist definiert als die Menge Enzyme, die reduzierende Kohlehydrate erzeugt, die eine reduzierende Kraft haben, die einem umol Xylose (als reduzierende Zuckeräquivalente) von Haferspelzxylan in einer Minute unter Versuchsbedingungen entspricht.

Versuchsbedingungen

Substrat Haferspelzxylan
pH 5,3
Temperatur 50ºC ± 0,5ºC
Inkubationszeit 5 min.

Ausrüstung

Wasserbad 50ºC
Wasserbad 100ºC
Teströhrchemischer (Vortex)
Spektrophotometer

Reagenzien

1. 0,05 M Natriumcitratpuffer, pH 5,3. Bereite 0,05 M Lösungen von Zifironensäure und Natriumcitrat durch Abwiegen von 10,5 g Zitronensäure (C&sub6;H&sub8;O&sub7; · H&sub2;O) in 1 l deionisiertes Wasser und 14,7 g Natriumcitrat (C&sub6;H&sub5;O&sub7;Na&sub3; · 2H&sub2;O) in 1 l deionisiertes Wasser. Die Zitronensäurelösung wird der Natriumcitratlösung zugefügt bis der pH-Wert des Gemisches 5,3 beträgt.

2. Substrat-1% Haferspelzxylan

Löse 1,0 g Xylan (Sigma Nr. X-0627) in etwa 80 ml von 0,05 M Citratpuffer bevorzugt unter Verwendung eines Heizmagnetrührers auf. Erhitze auf den Siedepunkt und kühle bei fortlaufendem Rühren, decke ab und rühre langsam über nacht. Fülle das Volumen mit Citratpuffer auf 100 ml. Kann bei 4ºC maximal eine Woche fang aufbewahrt werden.

3. DNS Reagenz

Löse 20,8 g 2-Hydroxy-3,5-Dinitrobenzoicsäure (Merk 800141) in etwa 400 ml deionisiertem Wasser. Bei fortlaufendem magnetischem Rühren füge allmählich dieser Suspension 300 ml NaOH Lösung hinzu (32, g NaOH in 300 ml deionisiertes Wasser). Die Lösung kann vorsichtig in einem Wasserbad auf eine maximale Temperatur von 45ºC erwärmt werden, bis sie vollständig klar ist. Füge 600 g Rochellesalz (Kna-tartrate) in kleinen Teilmengen unter fortlaufendem Rühren hinzu. Verdünne die Lösung schließlich mit deionisiertem Wasser auf 2.000 ml. Wenn die Lösung nicht klar ist, filter durch ein Filterpapier (Whatman Nr. 1). In einer dunklen Flasche bei Raumtemperatur aufbewahren.

Probe

Die Probe wird in 0,05 M Natriumcitratpuffer verdünnt. Eine geeignete Verdünnung hat eine Absorbtion von 0,3 bi 0,5.

Versuch

Gebe 1,8 ml Substratlösung in zwei Teströhrchen und halte bei 50ºC 5 min lang. Füge 200 pl einer geeignet verdünnten Enzymlösung in eines der Röhrchen und mische mit dem Vortexmischer. Nach genau 5 min bei 50ºC füge 3,0 ml DNS Reagenz in beide Röhrchen hinzu und mische. Füge 200 ul der Probenlösung in das Röhrchen, das ohne Probe (Enzymrohling) inkubiert ist. Gebe beide Röhrchen gleichzeitig in ein kochendes Wasserbad. Nach genau 5 min kochen entferne die Röhrchen und kühle in kaltem Wasser auf Raumtemperatur. Messe die Probenabsorbanz gegen diejenigen des Enzymrohlings bei 540 nm. Lese die Aktivität von der Standardlinie und multipliziere mit dem Verdünnungfaktor.

Standard

Bereite 0,1 M Vorratslösung von Xylose durch Lösen von 0,150 g Xylose (Merck 8689; store in desiccator) in 100 ml Puffer. Die Vorratslösung kann in kleinen Teilmengen bei -20ºC eingefroren werden; nach dem Auftauen der Röhrchen muß sorgfältig gemischt werden. Mache die folgenden Verdünnungen aus der Vorratslösung in Citratpuffer:

Verdünnung Xylose

umol/ml
1 : 1 10,0
1 : 2 5,0
1 : 4 2,5
1 : 5 2,0
Mache Dreifach-Versuche für jede Standardverdünnung auf dieselbe Weise wie den Enzymrohling. Fülle mit der Pipette 1,8 ml Substrat in das Teströhrchen, inkubiere 5 min bei 50ºC, füge 3,0 ml DNS und 200 ul Standardverdünnung hinzu. Bereite den Reagenzrohling durch Hinzufügen von 200 ul Citratpuffer anstelle der Standardverdünnung. Koche die Röhrchen genau 5 mm, kühle und messe die Absorbanz gegen den Reagenzrohling bei 450 nm. Konstruiere eine Standardlinie für jede Serie der Versuche.

Beispiel 9

Eine Enzymlösung mit 90 FPU Cellulaseaktivität und 4.300 IU Xylanaseaktivität pro ml wird verwendet, um 1.000 kg Luzerneheu mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 10% zu behandeln. 250 ml des Enzymgemischs wird in 501 Wasser verdünnt und direkt vor dem Bündeln auf das Luzerneheu aufgesprüht. Das resultierende Futtergemisch hat einen Feuchtigkeitsgehalt von 15% und enthält genügend Zellulase und Xylanase, um 25 FPU Cellulaseaktivität und 1.194 IU Xylanaseaktivität pro kg Futter DM zu haben.

Beispiel 10

200 ml einer Enzymlösung enthaltend 8.000 IU Xylanase und 200 FPU Cellulase pro ml in Acetatpuffer (100mM Natriumacetat; pH 5,0) wird zubereitet zu 1,0 l mit Acetatpuffer. Die resultierende Lösung enthält 1.600 IU Xylanase/ml und 40 FPU Cellulase/ml. Die Lösung wird auf das Gerstengetreide in einer Menge von 1,0 l/t gesprüht. Das behandelte Getreidefutter enthält genügend Cellulase und Xylanase, um 40 FPU Cellulase/kg Getreidefutter und 1.600 IU Xylanase/kg Getreidefutter zu haben. Das Getreide kann anschließend bearbeitet werden, indem es in einer kommerziellen Mühle gerollt wird.

Beispiel 11

Vier Teile eines Pulvers mit 10.000 LU Xylanaseaktivität/g werden mit einem Teil eines Pulvers mit 1.000 FPU Cellulaseaktivität/g gemischt. Das resultierende Gemisch enthält 8.000 IU Xylanase/g und 200 FPU Cellulase/g. 400 g des Pulvers wird in 5,0 l eines Citratpuffers (50 mM Natriumcitrat; pH 4,5) gelöst. Die Enzymlösung wird auf Luzerneheu (8% Feuchtigkeitsgehalt) in einer Menge von 5,0 l/t gesprüht. Das resultierende Futtergemisch enthält genügend Cellulase und Xylanase, um 80 FPU Cellulase/kg und 3.200 IU Xylanase/kg Luzernefutter zu haben. Das resultierende Futtergemisch wird dann durch Düsen in eine kommerzielle Futtermühle gezwängt, um Würfel zu bilden.
Alle in dieser Beschreibung erwähnten Publikationen richten sich an den Fachmann des Gebiets, auf das sich die Erfindung bezieht. Alle Publikationen werden durch Bezugnahme in dem Ausmaß eingeschlossen, in dem jede einzelne Publikation speziell und einzeln angegeben ist, um sie durch die Bezugnahme einzuschließen.
Obwohl die vorliegende Erfindung in einigen Einzelheiten durch Darstellungen und Beispiele zum besseren Verständnis beschrieben ist, ist offenkundig, daß gewisse Änderungen und Modifikationen im Rahmen der beigefügten Ansprüche liegen.

Veröffentlichungen

1. Feng, P., C.W. Hunt, W.E. Julien, K. Dickinson and T. Moen. 1992. Ettect of enzyme additives on in situ and in vitro degradation of mature coolseason grass forage. J. Anim. Sci. 70 (Suppl. 1): 309.
2. Feng, P., C.W. Hunt, W.E. Julien, S.C. Haeny and G.T. Pritichard. 1992. Effect of enzyme additives to coolseason grass forage an voluntary intake and digestive function in mature beef steers. J. Anim. Sci. 70 (Suppl. 1) : 310.
3. Chesson, A. 1994. Manipulation of fibre degradation - an old theme revisited. Pages 83-98 in T.P. Lyons and K.A. Jacques (Eds). otechnology in the feed industry. Nottingham University Press. Loughborough, UK.
4. McAllister, T.A., H.D. Bae, L.J. Yanke, K.-J. Cheng and J.K. Ha. 1994. A review of the microbial digestion of feed particles in the rumen. Asian J. Animal Sci. 7: 303-316.
5. Gilbert, H.J., G.P. Hazlewood, J.I. Laurie, C.G. Orpin and G.P. Xue. 1992. Homolgous catalytic domains in a rumen fungus xylanase: evidence for gene duplication and prokaryontic origin. Molec. Microbiology 6: 2065.
6. Van Soest, P.J. 1982. Nutritional Ecology of the Ruminant. O&B Books. corvallis, OR.
7. National Research Council. 1982. United States-Canadian Tables of Feed Composition. National Academy Press. Washington, D.C.
8. Nelson, C.J. and L.E. Moser. 1994. Plant factors affecting forage quality. Pages 115-154 in G.C. Fahey (ed.) Forage Quality and Utilization. American Society of Agronomy Inc., Madison, Wl.
9. Verber, L.L., G.C. Fahey, L.D. Bourquin and E.C. titgemeyer. 1994. Modification of forage quality after harvest. In G.C. Fahey (ed.) Forage quality and Utilization. American Society of Agronomy Inc.; Madison, WI.
10. Bailey, M.J. and K. Poutanen. 1989. Production of xylanase by strains of Aspergillus. Appl. Microbiol. Biotechnol. 30: 5-10.
11. National Research Council. 1984. Nutrient Requirements of Beef Cattle (6th ed.) National Academy Press. Washington, D.C.
12. . Goering, H.K and P.J Van Soest. 1970. Forage Fiber Analyses. Agriculture No. 379. Agriculture Research Service. United States Department of Agriculture.

Claims

1. Enzymzusatz als Zugabe zu Trockenhülsenfruchtfutter oder Trockengetreidefutter für Wiederkäuer mit:

einem Gemisch aus Zellulase- und Xylanase-Enzymen, wobei die Zellulase und die Xylanase in solchen Mengen vorgesehen sind, daß das Verhältnis der Zellulase-Aktivität zur Xylanase-Aktivität etwa 2 bis 5 Filterpapiereinheiten (filter paper units FPU) Zellulase-Aktivität pro 100 internationalen Einheiten (international units IU) Xylanase-Aktivität liegt.

2. Enzymzusatz nach Anspruch 1 in Dosiereinheitform als Zugabe zu Trockenhülsenfruchtfutter, wobei der Enzymzusatz genügend Zellulase und Xylanase enthält, um ungefähr 16 bis 120 FPU Zellulase-Aktivität und etwa 800 bis 6000 IU Xylanase-Aktivität pro kg Trockenhülsenfruchtfutter hervorzurufen und wobei das Verhältnis der Zellulase-Aktivität zu der Xylanase-Aktivität bei etwa 2 bis 5 FPU Zellulase-Aktivität pro 100 IU Xylanase-Aktivität liegt.

3. Enzymzusatz nach Anspruch 1 in Dosiereinheitform als Zugabe zu Trockenhülsenfruchtfutter, wobei der Enzymzusatz ausreichend Zellulase und Xylanase enthält, um etwa 18 bis 72 FPU Zellulase-Aktivität und etwa 900 bis 3600 IU Xylanase-Aktivität pro kg Trockenhülsenfruchtfutter hervorzurufen und wobei das Verhältnis der Zellulase-Aktivität zu der Xylanase-Aktivität bei etwa 2 bis 5 FPU Zellulase-Aktivität pro 100 IU Xylanase-Aktivität liegt.

4. Enzymzusatz nach Anspruch 1 in Dosiereinheitform zur Zugabe von Trockengetreidefutter, wobei der Enzymzusatz genug Zellulase und Xylanase enthält, um etwa 10 bis 200 FPU Zellulase-Aktivität und etwa 500 bis 10000 IU Xylanase-Aktivität pro kg Trockengetreidefutter hervorzurufen und wobei das Verhältnis der Zellulase-Aktivität zu der Xylanase-Aktivität bei etwa 2 bis 5 FPU Zellulase-Aktivität pro 100 IU Xylanase-Aktivität liegt.

5. Enzymzusatz nach Anspruch 1 in Dosiereinheitform zur Zugabe zu Trockengetreidefutter, wobei der Enzymzusatz genug Zellulase und Xylanase enthält, um etwa 40 bis 160 FPU Zellulase-Aktivität und etwa 2000 bis 8000 IU Xylanase-Aktivität pro kg Trockengetreidefutter hervorzurufen, und wobei das Verhältnis der Zellulase-Aktivität zu der Xylanase-Aktivität bei etwa 2 bis 5 FPU Zellulase-Aktivität pro 100 IU Xylanase-Aktivität liegt.

6. Futtergemisch mit

a) einem Futtermittel, das aus Hülsenfruchtfutter, Getreidefutter oder einem Gemisch davon ausgewählt ist, wobei das Futtermittel einen Feuchtikeitsgehalt hat, der nicht mehr als 15% beträgt (Gewicht/Gewicht), so daß Zellulase und Xylanase in einer wäßrigen Lösung von dem Futtermittel absorbiert werden und daran anhaften, und

b) einem Gemisch aus Zellulase und Xylanase, das von dem Futtermaterial absorbiert ist und daran anhaftet, um ein stabiles Futtergemisch für Wiederkäuer zu bilden, mit Zellulase und Xylanase in solchen Mengen, daß das Verhältnis der Zellulase-Aktivität zu der Xylanase-Aktivität etwa zwischen 2 und 5 Papierfiltereinheiten (filter paper units FPU) Zellulose-Aktivität pro 100 internationale Einheiten (international units IU) Xylanase-Aktivität liegt.

7. Futtergemisch nach Anspruch 6, wobei das Futtermaterial Hülsenfruchtfutter ist, beispielsweise Luzerne.

8. Futtergemisch nach Anspruch 7 mit genügend Zellulase und Xylanase, um die Zellulase-Aktivität und die Xylanase-Aktivität pro kg Hülsenfruchtfutter und das Verhältnis der Zellulase-Aktivität und Xylanase-Aktivität hervorzurufen wie in Anspruch 2 oder 3 angegeben.

9. Futtergemisch nach Anspruch 6, wobei das Futtergemisch ein Getreidefutter ist, beispielsweise Gerste.

10. Futtergemisch nach Anspruch 9 mit genügend Zellulase und Xylanase, um die Zellulase-Aktivität und die Xylanase-Aktivität pro kg Getreidefutter und das Verhältnis der Zellulase-Aktivität zu der Xylanase-Aktivität hervorzurufen wie im Anspruch 4 oder 5 angegeben.

11. Verfahren zur Herstellung eines Futtergemischs mit folgenden Schritten:

a) Bereitstellen einer oder mehrerer wäßriger Lösungen, die Zellulase- und Xylanase-Enzyme enthalten, getrennt oder in einem Gemisch;

b) Bereitstellen eines Futtermaterials ausgewählt aus Hülsenfruchtfutter, Getreidefutter oder einem Gemisch davon, wobei das Futtermaterial einen Feuchtigkeitsgehalt hat, der nicht größer als 15% ist (Gewicht/Gewicht), so daß dann, wenn die wäßrigen Lösungen mit Zellulase und Xylanase auf das Futtermaterial aufgebracht werden, die Zellulase und Xylanase von dem Futtermaterial absorbiert werden und daran anhaften;

c) Aufbringen der Zellulase und Xylanase enthaltenden wäßrigen Lösungen auf das Futtermaterial, so daß das Futtermaterial damit benetzt wird, wobei Zellulase und Xylanase in solchen Mengen vorgesehen sind, daß das Verhältnis der Zellulase-Aktivität zur Xylanase-Aktivität bei etwa 2 bis 5 Filterpapiereinheiten (FPU) Zellulase-Aktivität pro 100 internationalen Einheiten (IN) Xylanase- Aktivität liegt;

d) Halten des mit den wäßrigen Lösungen versehenen Futtermaterials, bis die Xylanase und die Zellulase in das Futtermaterial aufgenommen sind und daran anhaften, wodurch ein stabiles Futtergemisch bereitgestellt ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1l, wobei bei Schritt c) ein ausreichend kleines Volumen der wäßrigen Lösungen auf das Futtermaterial aufgebracht wird, so daß der Feuchtigkeitsgehalt des Futtermaterials nicht über etwa 18% steigt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei bei Schritt d) das Futtermaterial über wenigstens etwa 3 Stunden gehalten wird, vorzugsweise über wenigstens 8 Stunden.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Futtermaterial ein Hülsenfruchtfutter ist, beispielsweise Luzerne.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei ausreichend Zellulase und Xylanase auf das Futtermaterial aufgebracht werden, damit die Zellulase-Aktivität und die Xylanase-Aktivität pro kg Hülsenfruchtfutter und das Verhältnis der Zellulase-Aktivität zu der Xylanase-Aktivität wie in den Ansprüchen 2 oder 3 angegeben sind.

16. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Futtermaterial ein Getreidefutter ist, beispielsweise Gerste.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei ausreichend Zellulase und Xylanase auf das Futtermaterial aufgebracht werden, so daß die Zellulase-Aktivität und die Xylanase-Aktivität pro kg Getreidefutter und das Verhältnis der Zellulase- Aktivität zu der Xylanase-Aktivität wie im Anspruch 4 oder 5 angegeben sind.