DE69633133T2

DE69633133T2 - TFPI-verwandte Peptide die das Wachstums von glatten Muskelzellen inhibieren

Info

Publication number: DE69633133T2
Application number: DE69633133T
Authority: DE
Inventors: Yo Kikuchi-gun NAKAHARA; Saburo Hara; Yuichi Kamikubo; Sumiyo Takemoto; Seiji Miyamoto
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1995-10-24
Filing date: 1996-10-23
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2016-10-24
Also published as: WO1997015598A1; CA2232240C; DE69633133D1; EP0867450B1; EP0867450A1; KR100465222B1; AU7335796A; CA2232240A1; ATE273322T1; EP0867450A4; AU719366B2; JP3930050B2; US6191113B1; KR19990066965A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Peptid, welches das Wachstum glatter Muskelzellen hemmen kann. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Medikament zur Hemmung des Wachstums glatter Muskelzellen, welches das Peptid umfaßt.
Glatte Muskelzellen finden sich in der Media der Aorta, dem Magen-Darm-Trakt, der Lunge und Ähnlichem. Es gibt bekannte Erkrankungen, die mit dem außerordentlichen Wachstum der glatten Muskelzellen verbunden sind, einschließlich Arteriosklerose, Restenose nach Angioplastie, luminale Stenose nach Blutgefäßtransplantation, ein Sarkom des glatten Muskels und Ähnliche.
Arteriosklerose wird im Allgemeinen als eine örtliche arterielle Läsion definiert, die eine Verdickung der Intima, eine Rekonstruktion, eine Sklerose oder eine funktionelle Verschlechterung der Arterienwand aufweist, und pathologisch in drei Gruppen eingeteilt, d. h. in Mikro-Arteriosklerose, Mediaverkalkung und Atherosklerose. Unter diesen drei Gruppen verursacht Atherosklerose ischämische Herzerkrankungen, Gehirnschlag oder Hirninfakt und ist somit klinisch von größter Bedeutung. Wenn eine Atherosklerose an der Koronararterie stattfand, verursacht sie durch die Verengung des Lumens Angina pectoris oder führt zu ernsthaften Erkrankungen wie z. B. einer instabilen Angina oder einem Myokard-Infarkt durch Bildung eines Blutgerinnsels im Falle eines Aufbrechens der atherosklerotischen Läsion. Wenn eine Atherosklerose an der cerebralen Arterie stattfand, verursacht sie ebenfalls einen Hirninfarkt oder eine intracerebrale Blutung oder sie führt zu okklusiver Arteriosklerose im Falle der die Beine versorgenden Arterien (ab der Aorta unter der Niere bis zu der gemeinsamen Oberschenkelarterie). Somit stellt Atherosklerose eine Ursache schwerwiegender Erkrankungen dar.
Als Mechanismus für den Beginn einer Atherosklerose ist die Theorie der Injury to Response heute weitestgehend akzeptiert [Ross, R., Nature 362, S. 801 (1993)]. Das bedeutet, dass die Endothelzellen des Blutgefäßes verschiedene Wachstumsfaktoren produzieren, die das Wachstum der glatten Muskelzellen beschleunigen, wenn diese verletzt worden sind oder nach Stimuli wie z. B. Hyperlipidämie, Virusinfektion oder Bluthochdruck. Als Folge führt das Wachstum der glatten Muskelzellen zur Verdickung der Intima.
Zur inneren Behandlung der Arteriosklerose werden bis heute Medikamente zur Behandlung der Risikofaktoren verabreicht, wie z. B. ein Antihyperlipidämie- oder ein blutdrucksenkendes Mittel oder ein Medikament zur Hemmung des Beginns der Arteriosklerose wie z. B. ein Antioxydans, ein Antithrombocytenmittel, ein gefäßerweiterndes Mittel oder ein Antigerinnungsmittel. Diese Medikamente sind jedoch aus klinischer Sicht nicht ausreichend wirksam.
Bei Angina pectoris oder Myokardinfarkt, die durch Arteriosklerose verursacht wurden, wurden einige chirurgische Behandlungen wie z. B. die Percutane Transluminale Koronar-Angioplastie, die Atherektomie, die Laserexcision oder die Implantierung eines Stents, bis zur einem gewissen Grad erfolgreich angewendet. Unter diesen wurde die Percutane Transluminale Koronar-Angioplastie (PTCA) verbreitet angewendet, um den Blutfluß aufrecht zu erhalten. Die PTCA wurde bald als fundamentales Heilmittel zur Behandlung der Angina pectoris populär, und sie ist heutzutage eines der etablierten Verfahren zur Behandlung der Angina pectoris, da sie bequemer handzuhaben ist als die Transplantation eines aorta-koronaren Bypass (CABG), leicht wiederholt angewendet werden kann und weniger postoperative Komplikationen, sogar bei älteren Personen, hervorruft [Landau, C., N. Engl. J. Med. 330, S. 981 (1994)].
Obwohl eine Verbesserung der Verfahren oder der Instrumente oder eine Entwicklung neuer Verfahren bei diesen PTCA- und Atherektomie-Angioplastien stattfand, bleibt jedoch ein entscheidendes Problem ungelöst, und das ist, dass man bei 25 bis 49% der Patienten, die drei bis fünf Monate nach einer Operation operiert wurden, eine Restenose beobachtet. Da die Restenose eine weitere Behandlung wie z. B. durch PTCA oder CABG erfordert, stellt dies ein sehr ernsthaftes Problem in Hinsicht auf die Belastung der Patienten oder die finanziellen Schwierigkeiten mit der Versicherung dar. Obwohl verschiedene Arzneistoffe zum Zwecke der Hemmung des Beginns der Restenose verabreicht wurden, sind diese nicht ausreichend wirksam.
Es wurde ein Mechanismus des Beginns der Restenose untersucht. Kürzlich veröffentlichte Studien zeigen, dass das Wachstum der glatten Muskelzellen in der Intima der Blutgefäße eine Ursache für eine Restenose darstellt [Hanke, H. et al., Circulation Res. 67, S. 651 (1990)]. Das heißt, es wird vermutet, dass Restenose durch das Wachstum der glatten Muskelzellen in den Blutgefäßen verursacht wird, das stattfand, um die Struktur der Blutgefäße zu reparieren, die zum Beispiel durch einen Ballon-Katheter physikalisch zerstört wurden, und das sich aber ungehindert weiter fortsetzte. Daher bestand ein Versuch zur Behandlung der Restenose in der Hemmung des Wachstums der glatten Muskelzellen am Ort der Restenose, der einen klinischen Test mit Heparin umfaßte [Ellis, S. G. et al., Am. Heart J. 117, S. 777 (1989)], sowie einen klinischen Test mit einer Kombination von Aspirin und Dipyridamol [Schwartz, L. et al., N. Engl. J. Med. 318, S. 1714 (1988)] und Ähnlichem. Keiner dieser Tests konnte jedoch die Restenose wirksam hemmen.
Darüber hinaus wurde neben der vorstehend erwähnten Koronar-Angioplastie eine Operation zur Transplantation eigener Blutgefäße aus anderen Körperteilen (vorwiegend werden die innere Throraxarterie, die gastroepiploische Arterie und die große Vena saphena verwendet), d. h. ein Bypass der Koronararterie, klinisch dazu verwendet, den Blutfluß für die Koronararterie an den Orten wieder herzustellen, wo eine übermäßige Stenose oder eine Verstopfung als Ursache einer ischämischen Herzerkrankung stattgefunden hatte. Jedoch erfolgt sogar bei einem Bypass der Koronararterie häufig eine Verdickung der Intima des transplantierten Blutgefäßes, die das Lumen dieses transplantierten Gefäßes verengt und den Blutfluß unterbricht, und somit ist er aus klinischer Sicht nicht verläßlich. Es wurde berichtet, dass das Wachstum der glatten Muskelzellen und die Neusynthese der extrazellulären Matrix, die damit verbunden ist, eine zentrale Rolle bei einer solchen Verdickung der Intima spielt [Toshinobu Horie, Nippon Rinsho, 52, S. 1010 (1994)], und daher wird durch die Hemmung des Wachstums der glatten Muskelzellen eine Durchlässigkeit des Transplantats über einen langen Zeitraum erwartet. Darüber hinaus und nicht beschränkt auf die Koronararterie, wird die Transplantation eigener Blutgefäße als Ersatz für die verletzten Gefäße üblicherweise im Falle einer chirurgischen Verletzung der Extremitäten im Gebiet der plastischen Chirurgie angewendet. Es ist bekannt, dass die luminale Stenose, die durch das Wachstum der glatten Muskelzellen verursacht wird, häufig an den anastomosierenden Stellen mit normalen Blutgefäßen stattfindet.
Im Falle der Transplantation von Blutgefäßen wird ebenfalls ein künstlich hergestelltes Blutgefäß (hierin nachstehend als "künstliches Gefäß" bezeichnet) als Transplantat anstelle des eigenen Blutgefäßes aus einem anderen Körperteil verwendet. Das künstliche Gefäß wird nicht nur für die Koronararterie verwendet, sondern auch für andere Gefäße, einschließlich zum Beispiel für verletzte Blutgefäße nach der Amputation von Extremitäten, als Blutgefäß für einen AV-Shunt bei Patienten mit künstlicher Dialyse und Ähnlichem. Jedoch sogar im Falle eines künstlichen Gefäßes ist es auch bekannt, dass die Verdickung der Intima häufig an der anastomosierenden Stelle mit einem normalen Blutgefäß stattfindet und den Blutfluß unterbricht [Toshiya Shindo et al., Jinko Zoki 22, S. 459 (1993)]. Sowohl für eigene Blutgefäße als auch für künstliche Gefäße wurde ein Arzneistoff, der das Wachstum der glatten Muskelzellen wirksam hemmen kann, noch nicht gefunden, und daher besteht der Wunsch ein solches Arzneimittel zu entwickeln.
Ein Sarkom des glatten Muskels, d. h. ein aus glatten Muskelzellen stammender bösartiger Tumor, tritt vorwiegend am Uterus und dem Magen-Darm-Trakt auf, sowie am hinteren Bauchfell und dem subcutanen Weichgewebe, wächst destruktiv und invasiv und bildet in der Regel über den Blutkreislauf Metastasen in die Lunge aus. Ein Sarkom des glatten Muskels wurde durch chirurgische Entfernung in Kombination mit der Verabreichung eines üblichen Antikrebsmittels behandelt. Ein übliches Antikrebsmittel weist jedoch nicht akzeptierbare Nebenwirkungen auf, und daher besteht der Wunsch einen Arzneistoff zu entwickeln, welcher das Wachstum der glatten Muskelzellen spezifisch hemmen kann.
Unter diesen Voraussetzungen und um eine Substanz zu finden, die die Arteriosklerose und die Restenose nach einer Percutanen Transluminalen Koronar-Angioplastie oder anderen Angioplastien wirksam hemmen kann, haben die vorliegenden Erfinder nach einem die Restenose beschleunigenden Faktor und einem die Restenose hemmenden Faktor gesucht; dies erfolgte unter der Verwendung eines Tiermodells für die Verdickung der Intima eines Blutgefäßes, die durch die Verletzung mittels eines Ballons hergestellt wurde, sowie einer Kultur von glatten Muskelzellen aus Blutgefäßen. Als Ergebnis haben die vorliegenden Erfinder bereits herausgefunden, dass der Gewebefaktorinhibitor (TFPI) eine vollständig neuartige Aktivität aufweist, mit der das Wachstum glatter Muskelzellen gehemmt werden kann (Japanische Patentanmeldung Nr. 245548/1995).
TFPI ist ein Glycoprotein, von dem bekannt ist, dass es die äußerliche Blutgerinnung hemmt [Broze, G. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, S. 1886 (1987)]. TFPI besitzt eine Proteinstruktur, in der drei Regionen, die im Allgemeinen als "Kunitz" bezeichnet werden (vom aminoterminalen Ende her als "Kunitz 1", "Kunitz 2" und "Kunitz 3" bezeichnet), in Reihe vorliegen, an deren Carboxyterminus eine Region angefügt ist, die reich an basischen Aminosäuren ist (hierin nachstehend als "C-terminale Region" bezeichnet). Kunitz 1 bindet an aktivierten Faktor VII, einen der Blutgerinnungsfaktoren, um die Proteaseaktivität dieses Faktors zu neutralisieren. Kunitz 2 bindet an aktivierten Faktor X, ebenfalls einen der Blutgerinnungsfaktoren, um die Proteaseaktivität dieses Faktors zu neutralisieren. Es wird angenommen, dass TFPI durch diese Aktivitäten die Blutgerinnung im frühen Stadium wirksam hemmt. Von der C-terminalen Region ist bekannt, dass sie an Glycosaminoglycane mit einer negativen Ladung bindet, insbesondere an Heparin. Der menschliche TFPI besteht aus 276 Aminosäureresten und besitzt ein Molekulargewicht von etwa 42.000.
Die vorliegenden Erfinder untersuchten weiterhin die Aktivität des TFPI, um das Wachstum von glatten Muskelzellen zu hemmen. Als Ergebnis haben die vorliegenden Erfinder herausgefunden, dass die C-terminale Region des TFPI für die Aktivität das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen verantwortlich ist; dies erfolgte durch die Beobachtungen, dass (i), TFPI, dem die C-terminale Region fehlt, die hemmende Aktivität nicht aufweist, und dass (ii), ein synthetisches Peptid, das eine ähnliche Aminosäuresequenz wie die C-terminale Region besitzt, diese Aktivität in hohem Maß aufweist. Die vorliegenden Erfinder untersuchten weiterhin ein der C-terminalen Region homologes. Peptid, und als Ergebnis fanden sie, dass ein Peptid, das ein Peptid (A) mit einer Aminosäuresequenz umfaßt, die reich an basischen Aminosäuren ist, und ein Peptid (B) mit einer Aminosäuresequenz umfaßt, die aus mindestens zwei aufeinanderfolgenden hydrophoben Aminosäureresten besteht, wobei das Peptid (B) mit dem carboxyterminalen Ende des Peptids (A) direkt oder über mehrere Aminosäurereste verbunden ist, die Aktivität aufweist, das Wachstum von glatten Muskelzellen zu hemmen, und somit wurde die vorliegende Erfindung fertig gestellt.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einen neuen Peptids, welches aus einer Aminosäuresequenz besteht, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Arzneimittels, umfassend ein Peptid, das der C-terminalen Region des Gewebefaktorinhibitors (TFPI) entspricht, mit der Aktivität, das Wachstum von glatten Muskelzellen zu hemmen, wobei die C-terminale Region nach der Entfernung einer Region erhältlich ist, die sich von dem N-Terminus bis mindestens zur Kunitz 3-Region des TFPI erstreckt, wobei das Peptid aus einem Peptid (A) mit einer 13 Aminosäure langen Aminosäuresequenz besteht, unter denen vier oder mehr Aminosäuren basische Aminosäuren sind, und einem Peptid (B) mit einer Aminosäuresequenz besteht, die ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Ile-Phe, Ile-Phe-Val, Ile-Phe-Val-Xaa, Ile-Phe-Val-Xaa-Asn und Ile-Phe-Val-Xaa-Asn-Met, wobei Xaa entweder Lys oder Gln ist, wobei das Peptid (B) mit dem C-Terminus des Peptids (A) direkt oder über mehrere Aminosäurereste verbunden ist, und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten oder ein pharmazeutisch verträgliches Additiv.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung der Verwendung einen Peptids für die Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung oder Behandlung pathologischer Zustände, die in Verbindung mit dem Wachstum von glatten Muskelzellen stehen, wie z. B. Arteriosklerose, Restenose nach Angioplastie, luminale Stenose nach einer Blutgefäßtransplantation und ein Sarkom des glatten Muskels, wobei das Peptid ein Peptid ist, bestehend aus einem Peptid (A) mit einer Aminosäuresequenz mit einer Länge von 13 Aminosäuren, unter denen vier oder mehr Aminosäuren basische Aminosäuren sind, und einem Peptid (B) mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ile-Phe, Ile-Phe-Val, Ile-Phe-Val-Xaa, Ile-Phe-Val-Xaa-Asn und Ile-Phe-Val-Xaa-Asn-Met, in welchen Xaa entweder Lys oder Gln ist, wobei das Peptid (B) mit dem C-Terminus des Peptids (A) direkt oder über mehrere Aminosäurereste verknüpft ist.
1 zeigt die Aktivität, die das Wachstum glatter Muskelzellen hemmt, nach der Zugabe des Volllängen-TFPI oder des TFPI, dem die C-terminale Region fehlt.
2 zeigt die Aktivität, die das Wachstum glatter Muskelzellen hemmt, nach der Zugabe von drei Peptiden, die der C-terminalen Region des TFPI entsprechen, wobei Peptid 1 eine Sequenz von 23 Aminosäureresten besitzt: KTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM, welche den Aminosäureresten von Nr. 254 (Lysin) bis zur Nr. 276 (Methionin) des menschlichen TFPI entsprechen; das Peptid 2 besitzt eine Sequenz von 11 Aminosäureresten: KTKRKRKKQRV, welche den Aminosäureresten von Nr. 254 (Lysin) bis zur Nr. 264 (Valin) des menschlichen TFPI entsprechen; und das Peptid 3 besitzt eine Sequenz von 12 Aminosäureresten: KIAYEEIFVKNM, welche den Aminosäureresten von Nr. 265 (Lysin) bis zur Nr. 276 (Methionin) des menschlichen TFPI entsprechen.
3 zeigt die Aktivität des Peptids, welches dem C-Terminus des TFPI (Peptid 1) entspricht, bei verschiedenen Konzentrationen, das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen.
4 zeigt die Aktivität verschiedener synthetischer Peptide, das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen.
Das Peptid, das in dem Arzneimittel der vorliegenden Erfindung oder zu seiner Herstellung verwendet wird, ist ein Peptid, das aus einem Peptid (A) mit einer 13 Aminosäure langen Aminosäuresequenz besteht, die reich an basische Aminosäureresten ist, und einem Peptid (B) mit einer Aminosäuresequenz besteht, die ausgewählt wurde aus Ile-Phe, Ile-Phe-Val, Ile-Phe-Val-Xaa, Ile-Phe-Val-Xaa-Asn und Ile-Phe-Val-Xaa-Asn-Met, in denen Xaa entweder Lys oder Gln ist, wobei das Peptid (B) mit dem C-Terminus des Peptids (A) direkt oder über mehrere Aminosäurereste verknüpft ist.
Die basischen Aminosäuren, die in dem Peptid (A) verwendet werden können, umfaßen Lysin (auch als "Lys" oder "K" bezeichnet), Arginin (auch als "Arg" oder "R" bezeichnet) oder Histidin (auch als "His" oder "H" bezeichnet). Bezüglich der Anzahl der basischen Aminosäuren, die in dem Peptid (A) verwendet werden können, sind mindestens vier basische Aminosäuren in dem Peptid (A) mit 13 Aminosäureresten enthalten. Ein solches Peptid mit einer Aminosäuresequenz aus 13 Aminosäureresten besitzt eine ganz ausgezeichnete Aktivität um das Wachstum von glatten Muskelzellen zu hemmen, wenn es neun basische Aminosäurereste besitzt.
Das Peptid (A), das neun basische Aminosäurereste in einer Sequenz von 13 Aminosäureresten besitzt, umfaßt ein Peptid mit der Aminosäuresequenz: Ba1-Xa1-Ba2-Ba3-Ba4-Ba5-Ba6-Ba7-Xa2-Ba8-Xa3-Ba9-Xa4, wobei Ba1, Ba2, Ba3, Ba4, Ba5, Ba6, Ba7, Ba8 und Ba9 basische Aminosäuren sind, die jeweils aus Lys, Arg oder His ausgewählt werden; Xa1, Xa2, Xa3 und Xa4 sind beliebige Aminosäuren. Spezifisch umfaßt ein solches Peptid ein Peptid mit der Aminosäuresequenz: Lys-Xal-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Xa2-Arg-Xa3-Lys-Xa4. Noch spezifischer umfaßt ein solches Peptid ein Peptid mit der Aminosäuresequenz: Lys-Thr-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-lle.
Das Peptid (B) umfaßt ein Peptid mit der Aminosäuresequenz: Ile-Phe; Ile-Phe-Val; Ile-Phe-Val-Xaa; ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Ile-Phe-Val-Xaa-Asn und ein Peptid mit der Aminosäuresequenz: Ile-Phe-Val-Xaa-Asn-Met, wobei Xaa entweder Lys oder Gln ist.
Das Peptid der vorliegenden Erfindung selbst oder wie es in dem Arzneimittel der vorliegenden Erfindung enthalten ist oder wie es zur Herstellung des Arzneimittels verwendet wird, umfaßt ein Peptid mit der Aminosäuresequenz, die der C-terminalen Region des Gewebefaktorinhibitors (TFPI) entspricht. Die C-terminale Region umfaßt im Allgemeinen eine Region, die sich C-terminal von Kunitz 3 (nicht mit eingeschlossen) befindet, die reich an basischen Aminosäuren ist und die bis zu 37 Aminosäurereste des C-Terminus des menschlichen oder des Kaninchen-TFPI oder bis zu 30 Aminosäurereste des C-Terminus des Ratten-TFPI umfaßt.
Die Aminosäuresequenz des TFPI wurde veröffentlicht für Mensch [Wun, T.-C. et al., J. Biol. Chem. 263, S. 6001 (1988)), Affe [Kamei, S. et al., J. Biochem. 115, S. 708 (1994)), Kaninchen [Wesselschmidt, R. L. et al., Nucl. Acids Res. 18, S. 6440 (1990); Warn-Cramer, B. J. et al., Nucl. Acids Res. 20, S. 3642 (1992)], Ratte [Enjyoji, K. et al., J. Biochem. 111, S. 681 (1992) und Ähnliche. Zur Verabreichung an Menschen sollte das Peptid der C-terminalen Region der vorliegenden Erfindung auf der Grundlage der Aminosäuresequenz des menschlichen TFPI hergestellt werden, um eine immunologische Abstoßung zu minimieren und um eine ausreichende Wirksamkeit zu erzielen.
Das Peptid der C-terminalen Region, wie es in dem Arzneimittel der vorliegenden Erfindung verwendet wird oder wie es zur Herstellung des erfindungsgemäßen Arzneimittels verwendet wird, umfaßt ein Peptid, das eine Sequenz aus 23 Aminosäureresten besitzt: KTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM, wobei N Asparagin (Asn) ist; E Glutaminsäure (Glu) ist; Q Glutamin (Gln) ist; A Alanin (Ala) ist; V Valin (Val) ist; M Methionin (Met) ist; I Isoleucin (Ile) ist; F Phenylalanin (Phe) ist, K Lysin (Lys) ist; R Arginin (Arg) ist, T Threonin (Thr) ist und Y Tyrosin (Tyr) ist (Peptid 1; SEQ ID NO: 1), und das den Aminosäureresten von Nr. 254 (Lysin) bis zur Nr. 276 (Methionin) des menschlichen TFPI entspricht.
Das Peptid der C-terminalen Region, wie es in dem Arzneimittel der vorliegenden Erfindung verwendet wird oder wie es zur Herstellung des erfindungsgemäßen Arzneimittels verwendet wird, umfaßt ebenfalls ein Peptid, das eine Sequenz aus 24 Aminosäureresten besitzt: IKTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM (Peptid 20; SEQ ID NO: 20), das den Aminosäureresten von Nr. 253 (Isoleucin) bis zur Nr. 276 (Methionin) des menschlichen TFPI entspricht.
Ein Peptid mit der Aminosäuresequenz KTKRKRKKQRVKIAYEEIFVQNM (Peptid 5; SEQ ID NO: 5), das durch den Ersatz des dritten Lys des C-Terminus des Peptids 1 durch Gln (Glutamin) hergestellt wurde, besitzt eine noch bessere Aktivität, um das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen, als die des Peptids 1.
Ein Arzneimittel, welches das Peptid der vorliegenden Erfindung umfaßt, das die Aktivität besitzt, das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen, kann als Medikament zur Behandlung oder zur Vorbeugung pathologischer Zustände verwendet werden, die mit dem Wachstum glatter Muskelzellen verbunden sind, wie z. B. Arteriosklerose, Restenose nach Angioplastie, luminale Stenose nach einer Blutgefäßtransplantation und ein Sarkom des glatten Muskels. Die Angioplastie schließt die Percutane Transluminale Koronar-Angioplastie, die Atherektomie, die Laserexcixion, die Implantation eines Stents und Ähnliches mit ein.
Zur Verbesserung der Wirksamkeit des Arzneimittels, wie z. B. zum Erreichen einer verlängerten Halbwertszeit im lebenden Körper oder zur Verbesserung der Absorption oder der örtlichen Konzentration an einer verletzten Stelle, umfaßt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die das Peptid umfaßt, welches der C-terminalen Region des TFPI mit einer teilweisen chemischen Modifikation, genauer gesagt, einer chemischen Modifikation der Aminogruppe am aminoterminalen Ende (N-Terminus) oder der Carboxylgruppe am C-Terminus, oder mit Zufügung oder in Mischung mit einem Zucker oder einem Lipid oder in Fusion mit einer anderen Verbindung oder einem Protein entspricht.
Das Peptid, auf das in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, kann durch ein beliebiges Verfahren hergestellt werden, wie z. B. durch chemische Synthese oder durch ein genetisches Rekombinationsverfahren. Alternativ kann das Peptid, auf das in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, auch durch einen Verdau des TFPI erhalten werden, der aus natürlichem Plasma gereinigt wurde oder der durch ein genetisches Rekombinationsverfahren hergestellt wurde; dies erfolgt durch eine chemische Behandlung oder durch eine geeignete Protease.
Um die Wirksamkeit des Arzneimittels maximal aufrecht zu erhalten, sollte es verschlossen werden und in trockenem Zustand nach der Gefriertrocknung aufbewahrt werden, wobei die Zusammensetzung je nach Bedarf zusätzlich die üblichen Exzipienten oder Additive umfassen kann.
Eine solches Arzneimittel kann weiterhin andere Arzneistoffe, wie z. B. ein Antihyperlipidämemittel, ein blutdrucksenkendes Mittel, ein Antioxydans, ein Antithrombocytenmittel, ein gefäßerweiterndes Mittel oder ein Antigerinnungsmittel umfassen, sofern die Sicherheit des Arzneistoffes bestätigt wurde.
Das vorliegende Arzneimittel kann in einer geeigneten Dosierungsform zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger zur direkten Verabreichung in die Läsion des Blutgefäßes über ein Arzneistoff-Anlieferungs-Katheder formuliert werden, auf die Oberfläche eines Stents oder eines Ballons aufgetragen sein, der dann an die Läsion des Blutgefäßes verabreicht wird oder in die Vene oder die Arterie als Bolus oder kontinuierlich eingebracht werden. Alternativ kann das Arzneimittel zur direkten Verabreichung an die Läsion als Puder hergestellt werden, ohne dass es solubilisiert wird, oder es kann auf ein gefäßerweiterndes Instrument wie z. B. einen Stent oder einen Ballon als trockenes Pulver aufgetragen werden. Als Alternative kann das Arzneimittel zur oralen Verabreichung in einem flüssigen oder festen Zustand hergestellt werden. Als weitere Alternative kann das Arzneimittel zur Verabreichung in einer solchen Weise hergestellt werden, dass das Gen, das für das Peptid codiert und in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut ist, zum direkten Einführen in die Läsion der glatten Muskelzellen hergestellt wird, um eine überschüssige Expression des Peptids in dieser Läsion zu induzieren.
Die vorliegende Erfindung wird mittels der folgenden Beispiele in Einzelheiten erläutert, um ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung zu erreichen, dies sollte aber nicht so verstanden werden, dass die Erfindung auf die Beispiele begrenzt ist.
Beispiel 1
Die Herstellung des Volllängen-TFPI und des TFPI, dem die C-terminale Region fehlt
Der in diesem Beispiel verwendete TFPI wurde aus dem Kulturüberstand einer Zelllinie von Ovarzellen des chinesischen Hamsters gereinigt, in die eine cDNA, die den menschlichen TFPI codiert, eingebracht worden war; dies erfolgte durch eine Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung eines mit einem monoclonalen anti-TFPI-Antikörper (HTFPI-K9 (BIKOKEN KINKI14467)) verbundenen Gels und eines Heparin-Gels (Pharmacia-LKB), wie durch Kamei et al. (Japanische Patentanmeldung Nr. 188746/1993) oder durch Enjyoji et al. [Biochemistry 34, S. 5725 (1995)] beschrieben. Der Überstand enthielt sowohl den Volllängen-TFPI als auch den TFPI, dem die C-terminale Region fehlte, beide können voneinander durch eine Affinitäts-Chromatographie mit einem Heparin-Gel, gefolgt von einer Elution mit einem linearen NaCl-Gradienten getrennt werden, wobei der TFPI, dem die C-terminale Region fehlt, bei 0,4 bis 0,5 Mol/l NaCl eluiert wird, wohingegen der Volllängen-TFPI bei 0,8 bis 0,9 Mol/l NaCl eluiert wird. Von dem so erhaltenen Volllängen-TFPI wurde bestätigt, dass er ein intaktes TFPI-Molekül darstellt, wohingegen von dem TFPI, dem die C-terminale Region fehlte, bestätigt wurde, dass er ein Produkt darstellt, das nach Spaltung der Peptidbindung zwischen dem Aminosäurerest Nr. 259, Lys, und dem Aminosäurerest Nr. 250, Gly entstand, d. h. einen TFPI darstellt, dem ein Peptid von 27 Aminosäureresten des C-Terminus des TFPI fehlt, wie durch Aminosäure-Sequenzierung oder durch SDS-PAGE bestimmt wurde.
Beispiel 2
Die Beteiligung der C-terminalen Region des TFPI an der Aktivität, die das Wachstum glatter Muskelzellen hemmt
Es wurden vaskuläre glatte Muskelzellen aus der menschlichen Aorta (bezogen von Kurabo K. K.) verwendet und einer Kultur über mehrere Passagen mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (hierin nachstehend als "DME" bezeichnet) unterworfen, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt worden war. Die glatten Muskelzellen nach sechs Passagen wurden bei dem folgenden Experiment verwendet.
Die in DME suspendierten glatten Muskelzellen wurden in eine Kulturplatte mit 48 Vertiefungen (hergestellt durch Iwaki Glass K. K.) mit einer Zelldichte von 5.000 Zellen/Vertiefung plattiert und in einem CO₂-Inkubator bei 37°C inkubiert. Zwei Tage nach dem Plattieren wurde das Kulturmedium mit DME, das 50 μg/ml des Volllängen-TFPI oder 50 μg/ml des TFPI ohne C-terminale Region enthielt, oder mit DME alleine als Kontrolle ausgetauscht, und die Anzucht wurde in dem CO₂-Inkubator bei 37°C fortgesetzt, wobei das Kulturmedium alle 2 Tage durch frisches Medium ersetzt wurde. Das Kulturmedium wurde in einer Menge von 0,3 ml/Vertiefung verwendet. Neun Tage nach dem Ausplattieren wurden die an die Platte angehefteten Zellen durch Behandlung mit einer Trypsin/EDTA-Lösung abgelöst, und anschließend wurde die Zahl an Zellen pro Vertiefung mit einem Hämocytometer gezählt. 1 ist eine Darstellung, die die mittlere Zellzahl sowie die Standardabweichung für drei Vertiefungen jeder Gruppe angibt. Die Gruppe mit der Zugabe des Volllängen-TFPI besaß eine signifikant erniedrigte Zellzahl (t-Test nach Student: p < 0.05) verglichen mit der Kontrollgruppe, was die Wirkung, das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen, aufzeigt. Dagegen zeigte der TFPI ohne C-terminale Region diese Wirkung nicht, und somit wurde gezeigt, dass die C-terminale Region des TFPI zur Hemmung des Wachstums glatter Muskelzellen nötig war. Der Volllängen-TFPI wurde auf seine Toxizität mit dem Cytotox 96-Kit (hergestellt von Promega) zur Bestimmung der zellulären Toxizität untersucht, und als Ergebnis wurde gefunden, dass der Volllängen-TFPI keine zelluläre Toxizität aufweist, was zeigt, dass die Wirkung, das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen, nicht durch zelluläre Toxizität hervorgerufen wurde.
Beispiel 3
Die Herstellung des Peptids der C-terminalen Region aus menschlichem TFPI
Um die Aktivität eines Peptids, das der C-terminalen Region des TFPI entspricht, sowie eines Homologs davon, das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen, zu untersuchen, wurden die folgenden Peptide hergestellt:
Peptid 1: ein Peptid, das eine Sequenz aus 23 Aminosäureresten besitzt: KTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM (SEQ ID NO: 1), welche den Aminosäureresten von Nr. 254 (Lysin) bis zur Nr. 276 (Methionin) des menschlichen TFPI entsprechen;
Peptid 2: ein Peptid, das eine Sequenz aus 11 Aminosäureresten besitzt: KTKRKRKKQRV (SEQ ID NO: 2), welche den Aminosäureresten von Nr. 254 (Lysin) bis zur Nr. 264 (Valin) des menschlichen TFPI entsprechen;
Peptid 3 ein Peptid, das eine Sequenz aus 12 Aminosäureresten besitzt: KIAYEEIFVKNM (SEQ ID NO: 3), welche den Aminosäureresten von Nr. 265 (Lysin) bis zur Nr. 276 (Methionin) des menschlichen TFPI entsprechen.
Weiterhin wurden die folgenden Peptide hergestellt, die ein modifiziertes Peptid 1 darstellen, das eine Deletion, einen Austausch, eine Insertion oder eine Addition besitzt:
wobei gilt: A ist Alanin (Ala); E ist Glutaminsäure (Glu); F ist Phenylalanin (Phe); I ist Isoleucin (Ile); K ist Lysin (Lys); L ist Leucin (Leu); M ist Methionin (Met); N ist Asparagin (Asn); Q ist Glutamin (Gln); R ist Arginin (Arg); S ist Serin (Ser); T ist Threonin (Thr); V ist Valin (Val) und Y ist Tyrosin (Tyr).
Diese Peptide wurden durch die FastMoc^TM-Festphasen-Synthese unter Verwendung des 431A-Peptid-Synthesegeräts (hergestellt durch Perkin Elmer Japan Applied Biosystems) gemäß der Vorschrift zu diesem Gerät chemisch synthetisiert. Zum Beispiel wurden die Peptide 1 und 3 oder das Peptid 2 aus 0,25 mMol Fmoc-L-Met-Harz beziehungsweise 0,25 mMol Fmoc-L-Val-Harz (beide durch Perkin Elmer Japan Applied Biosystems hergestellt) synthetisiert, die durch Anhängen jeweils einer Aminosäure nacheinander an das N-terminale Ende verlängert wurden. Das gleiche Verfahren wurde bei der Synthese der anderen Peptide verwendet. Das bei der Verlängerungsreaktion verwendete Aminosäure-Monomer bestand jeweils aus 1 mMol der durch Fmoc geschützten Aminosäure (hergestellt durch Perkin Elmer Japan Applied Biosystems). Von den so synthetisierten Peptiden wurden die Schutzgruppen entfernt und sie wurden von dem Harz abgespalten, wie in der Vorschrift "Einführung in Spaltungstechniken" von Perkin Elmer Japan Applied Biosystems beschrieben wird.
Dann wurden die Peptide mit destilliertem Wasser aus den Rohkristallen extrahiert, die nach dem Entfernen der Schutzgruppen und der Abspaltung von dem Harz erhalten worden waren, und lyophilisiert, um Roh-Peptide zu erhalten, die durch eine Brownlee-Umkehrphasen-Säule (Durchmesser 10 mm, Länge 250 mm; Perkin Elmer Japan Applied Biosystems) mit einem Konzentrationsgradienten (0 bis 100%) von 0,1% Trifluoressigsäure und 70% Acetonitril, das 0,09% Trifluoressigsäure enthielt, gereinigt wurden.
Beispiel 4
Die Aktivität der Peptide der C-terminalen Region des menschlichen TFPI, das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen
Die Zellen wurden wie in Beispiel 2 angeimpft. Zwei Tage nach dem Animpfen wurde das Kulturmedium durch DME ausgetauscht, das die entsprechende Konzentration der Peptide der C-terminalen Region enthielt, und die Zellen wurden in einem CO₂-Inkubator bei 37°C angezogen, während das Anzuchtmedium mit DME alle 2 Tage ausgetauscht wurde. Das Anzuchtmedium wurde in einer Menge von 0,3 ml/Vertiefung verwendet, und als Kontrolle wurde DME alleine verwendet. Neun Tage nach dem Animpfen wurde die Zahl der Zellen pro Vertiefung wie in Beispiel 2 gezählt. 2 ist eine Zeichnung, die den Mittelwert und die Standardabweichung für eine Zellzahl jeder Gruppe angibt, die 3 Vertiefungen umfaßt. Die Gruppe, der 20 μg/ml des Peptids 1 zugefügt worden waren, welches den 23 Aminosäureresten der C-terminalen Region des menschlichen TFPI entspricht, zeigte eine signifikante Abnahme in der Zellzahl verglichen mit der Kontrollgruppe (t-Test nach Student; p < 0,05). Somit wurde bestätigt, dass das Peptid 1 alleine ein wirksames Mittel zur Hemmung des Wachstums glatter Muskelzellen darstellen könnte.
Im Gegensatz dazu wurde für das Peptid 2, welches 11 Aminosäureresten in der N-terminalen Region des Peptids 1 entspricht, oder für das Peptid 3, welches 12 Aminosäureresten in der C-terminalen Region des Peptids 1 entspricht, keine Aktivität gefunden, die das Wachstum glatter Muskelzellen hemmt, sogar, wenn sie zu 20 μg/ml zugegeben wurden. Daraus wurde abgeschätzt, dass sowohl die Aminosäuresequenz des Peptids 2 oder ein Teil davon als auch die Aminosäuresequenz des Peptids 3 oder ein Teil davon in einem einzigen Molekül vorliegen sollte, um die Aktivität, das Wachstum von glatten Muskelzellen zu hemmen, ausüben zu können.
Beispiel 5
Die Aktivität, die das Wachstum von glatten Muskelzellen hemmt, wird durch das Peptid 1 in einer konzentrationsabhängigen Weise ausgeübt
Es wurden vaskuläre glatte Muskelzellen aus Blutgefäßen der menschlichen Aorta (bezogen von Kurabo K. K.) verwendet. Das Anzuchtmedium bestand aus Humedia-SG (hergestellt durch Kurabo K. K.), das den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), den epidermalen Wachstumsfaktor (EFG), Insulin und 5% fötales Kälberserum enthielt. Bei dem folgenden Experiment wurden die glatten Muskelzellen nach sechs Passagen verwendet.
Die in Humedia-SG suspendierten Zellen wurden in eine Kulturplatte mit 48 Vertiefungen (hergestellt durch Iwaki Glass K. K.) zu 2.500 Zellen/Vertiefung geimpft und in einem CO₂-Inkubator bei 37°C angezogen. Am Tage nach dem Animpfen wurde das Anzuchtmedium durch Humedia-SG (0,3 ml/Vertiefung) ersetzt, das die entsprechende Konzentration an Peptid 1 enthielt, und die Anzucht wurde bei 37°C fortgesetzt, wobei das Anzuchtmedium mit frischem Humedia-SG alle 2 Tage ausgetauscht wurde. Neun Tage nach dem Animpfen wurde die Zahl an Zellen wie in Beispiel 2 gezählt. 3 zeigt den Mittelwert und die Standardabweichung der Zellzahl jeder Gruppe, die 4 Vertiefungen umfaßt.
Es wurde gezeigt, dass Peptid 1 eine signifikante Aktivität, das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen, aufwies, wenn es in einer Konzentration von etwa 3 bis 5 μM oder mehr im Anzuchtmedium vorlag. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass das in diesem Beispiel verwendete Anzuchtmedium sehr reich an verschiedenen Wachstumsfaktoren ist, und daher würde im Falle dass DME, das 10% FCS enthält, wie es gewöhnlich für die Anzucht glatter Muskelzellen verwendet wird, oder im Falle einer Verabreichung in den lebenden Körper, das Peptid 1 die signifikante Aktivität, das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen, möglicherweise in geringerem Maße ausüben.
Beispiel 6
Die Aktivität verschiedener Peptide das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen
Die Zellen wurden wie in Beispiel 5 angeimpft. Am Tage nach dem Animpfen wurde das Anzuchtmedium mit Humedia-SG ausgetauscht, das die entsprechenden Peptide enthielt, die in Beispiel 3 hergestellt worden waren, und zwar in einer Endkonzentration von 20 μM, und die Anzucht wurde bei 37°C weitergeführt, wobei das Anzuchtmedium mit Humedia-SG ausgetauscht wurde. Zehn Tage nach dem Animpfen wurde die Zahl an Zellen pro Vertiefung wie in Beispiel 2 gezählt. 4 zeigt den Mittelwert und die Standardabweichung der Zellzahl jeder Gruppe, die 4 Vertiefungen umfaßt. Jede Gruppe wies 5% oder weniger einer letalen Rate an Zellen auf.
Die Ergebnisse, die in 4 gezeigt werden, führten zu folgenden Schlußfolgerungen:
(1) Vergleich zwischen Peptid 1 und den Peptiden 2 + 3
Die Peptide 2 + 3 sind ein Gemisch gleicher Mengen (jeweils 20 μM) des Peptids 2, welches 11 Aminosäureresten der N-terminalen Region des Peptids 1 entspricht, und des Peptids 3, welches 12 Aminosäureresten der C-terminalen Region entspricht. Das Peptid 1 hemmte das Wachstum glatter Muskelzellen stark, wohingegen die Peptide 2 + 3 keine Aktivität zeigten. Aus diesem Ergebnis wurde offenbar, dass sowohl die spezifische Aminosäuresequenz des Peptids 2 als auch die des Peptids 3 in einem einzigen Molekül vorliegen sollten, so dass die Aktivität, das Wachstum von glatten Muskelzellen zu hemmen, ausgeübt wird.
(2) Vergleich zwischen Peptid 1 und den Peptiden 7 bis 9
Die Peptide 7, 8 und 9 stellen ein modifiziertes Peptid 1 dar, worin die vier Aminosäurereste (Ala-Tyr-Glu-Glu), die von dem 14-ten Aminosäurerest Ala bis zu dem 17-ten Aminosäurerest Glu reichen, entweder deletiert oder ausgetauscht sind. Da die Aktivität, das Wachstum von glatten Muskelzellen zu hemmen, wie bei Peptid 1 sogar nach einer Deletion oder einem Austausch in dieser Region ausgeübt wurde, wurde offenbar, dass dreizehn Aminosäurereste und sechs Aminosäurereste in der N-, beziehungsweise der C-terminalen Region des Peptids 1 für die Aktivität das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen verantwortlich sind.
(3) Vergleich zwischen Peptid 1 und Peptid 4
Peptid 4 ist dergestalt, dass 13 Aminosäurereste in der N-terminalen Region des Peptids 1, die reich an basischen Aminosäureresten ist, an den C-Terminus plaziert wurden, während sechs Aminosäurereste aus der C-terminalen Region des Peptids 1, die viele hydrophobe Aminosäurereste umfaßt, an den N-Terminus plaziert wurden. Da Peptid 4 keine Aktivität, das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen, aufwies, wurde offenbar, dass die Plazierung der Region, die reich an basischen Aminosäureresten ist, und der Region, die viele hydrophobe Aminosäurereste besitzt, am N-Terminus beziehungsweise am C-Terminus für die Ausübung der Aktivität essentiell ist.
(4) Vergleich zwischen Peptid 1 und Peptid 10
Das Peptid 10 ist ein modifiziertes Peptid 1, worin die N-terminale Region, die reich an basischen Aminosäureresten ist, durch eine entsprechende Region ersetzt wird, die weniger basische Aminosäurereste enthält. Spezifischer ist Peptid 10 ein modifiziertes Peptid 1, worin 12 Aminosäurereste in der N-terminalen Region durch die Heparin bindende Region des Thrombocyten-Faktors IV ersetzt sind, welche die Aminosäuresequenz: LYKKIIKKLLES besitzt. Das Peptid 1 umfaßt neun basische Aminosäurereste in der N-terminalen Region aus 13 Aminosäureresten, wohingegen Peptid 10 nur vier basische Aminosäurereste umfaßt. Obwohl die Verminderung der Zahl an basischen Aminosäureresten auf vier die Aktivität, das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen, verglichen mit Peptid 1 sehr stark verminderte, verblieb noch eine statistisch signifikante Aktivität verglichen mit der Kontrollgruppe (t-Test nach Student; p < 0,05). Somit wurde offenbar, dass mindestens vier von 13 Aminosäureresten in der Region, die reich an basischen Aminosäureresten ist, basische Aminosäuren sein sollten, um die hemmende Aktivität auszuüben.
(5) Vergleich zwischen Peptid 1 und Peptid 6
Peptid 6 ist ein modifiziertes Peptid 1, worin die hydrophoben Aminosäurereste Ile, Phe, Val und Met in der C-terminalen Region, die aus sechs Aminosäureresten (Ile-Phe-Val-Lys-Asn-Met) im Peptid 1 besteht, durch eine andere hydrophobe Aminosäure, Leucin (Leu), ersetzt sind. Es wurde gezeigt, dass Peptid 6 immer noch eine starke Aktivität, das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen, aufwies, obwohl sie etwa um 1/3 vermindert war. Dies offenbarte, das die hydrophoben Aminosäurereste in der C-terminalen Region des Peptids nicht auf diejenigen beschränkt sind, die in Peptid 1 vorliegen, sondern beliebige hydrophobe Aminosäurereste sein können, und dass die hydrophoben Aminosäurereste in der C-terminalen Region eine wichtige Rolle bei der Ausübung der Aktivität, das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen, spielen.
(6) Vergleich zwischen Peptid 1 und den Peptiden 11 bis 20
Das Peptid 20 ist ein modifiziertes Peptid 1, worin die hydrophobe Aminosäure Ile an den N-Terminus des Peptids 1 angefügt ist. Da das Anfügen dieses einen Aminosäurerestes die Aktivität, das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen, verglichen mit Peptid 1 erhöhte, wird bevorzugt, mindestens eine hydrophobe Aminosäure (z. B. Ile) an den N-Terminus der Region anzufügen, die reich an basischen Aminosäureresten ist, um Peptide zu entwerfen, die eine noch wirksamere Aktivität besitzen, das Wachstum von glatten Muskelzellen zu hemmen.
Die Peptide 11–19 sind jeweils Modifikationen des Peptids 20, worin die C-terminale Region des Peptids 20 bis zu einem bestimmten Grad deletiert ist. Spezifisch stellen die Peptide 19–14 ein modifiziertes Peptid 20 dar, worin jeweils eine Aminosäure in der C-terminalen Region des Peptids 20 nacheinander deletiert ist. Die Peptide 13–11 stellen ein modifiziertes Peptid 14 dar, worin vier, sechs bzw. acht Aminosäurereste in der C-terminalen Region des Peptids 14 deletiert sind. Als Ergebnis wurde gezeigt, dass Peptid 16, bei dem vier Aminosäurereste in der C-terminalen Region von Peptid 20 deletiert sind, die starke Aktivität, das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen, beibehält, wohingegen Peptid 15, worin fünf Aminosäurereste in der C-terminalen Region von Peptid 20 deletiert sind, die Aktivität fast verloren hat.
Es wurde gezeigt, dass (i) aus den Ergebnissen, die in Punkt (2) erhalten wurden, die vier Aminosäurereste (Ala-Tyr-Glu-Glu), die dem 14-ten Aminosäurerest Ala bis zu dem 17-ten Aminosäurerest Glu entsprechen, gezählt ab dem N-Terminus des Peptids 1, nicht zu der Aktivität, das Wachstum von glatten Muskelzellen zu hemmen, mit beitragen; und dass (ii) aus den Ergebnissen, die in Punkt (5) erhalten wurden, die hydrophoben Aminosäurereste in der C-terminalen, sechs Aminosäuren langen Sequenz des Peptids 1 eine wichtige Rolle bei der Aktivität spielen, das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen, und somit mindestens zwei aufeinanderfolgende hydrophobe Aminosäurereste in der C-terminalen Region vorliegen sollten, um die Aktivität ausüben zu können.
(7) Vergleich zwischen Peptid 1 und Peptid 5
Peptid 5 ist ein modifiziertes Peptid 1, worin die basische Aminosäure Lys, die sich an der 3-ten Position befindet, gezählt ab dem C-Terminus des Peptids 1, durch die nicht-hydrophile Aminosäure Gln ersetzt wurde. Dieser Aminosäureaustausch verstärkte die Aktivität des Peptids 1. Das bedeutet, dass Lys an der 3-ten Position, gezählt ab dem C-Terminus des Peptids 1, bevorzugt durch Gln ausgetauscht wird, um die ausgezeichnete Aktivität, das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen, ausüben zu können.
Das Peptid der vorliegenden Erfindung besitzt die ausgezeichnete Aktivität, das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen, und kann als ein Medikament zur Vorbeugung und zur Behandlung pathologischer Zustände wirksam sein, die mit dem Wachstum glatter Muskelzellen verbunden sind, wie z. B. Arteriosklerose, Restenose nach Angioplastie, luminale Stenose nach Transplantation von Blutgefäßen und ein Sarkom glatter Muskelzellen. Ein Arzneimittel, welches das Peptid der vorliegenden Erfindung umfaßt, ist vorteilhaft in den folgenden Punkten:

(i) Es kann zu geringen Kosten in einer großen Menge durch chemische Synthese ohne die Verwendung menschlichen Plasmas als Startmaterial oder ohne die Notwendigkeit, es durch genetische Rekombinationsverfahren herstellen zu müssen, hergestellt werden. Als Ergebnis wird das Risiko einer Kontamination mit Krankheitskeimen aus dem menschlichen Plasma oder der Wirtszelle, die bei dem genetischen Rekombinationsverfahren verwendet wird, vermieden, was die Herstellung eines ziemlich sicheren Medikaments erlaubt.
(ii) Bei dem Entwerfen des Peptids der vorliegenden Erfindung, so dass es nur die Aktivität aufweist, das Wachstum glatter Muskelzellen zu hemmen, sind eine unnötige physiologische Aktivität oder unbekannte Nebenwirkungen ausgeschlossen, die durch diejenigen Regionen induziert werden, die für die gewünschte Aktivität irrelevant sind, was die Verabreichung des Peptids in einer höheren Konzentration und in einer größeren Menge erlaubt. Zum Beispiel beugt ein solches Peptid hämorrhagischen Nebenwirkungen vor, die möglicherweise durch die Verabreichung des Volllängen-TFPI induziert werden.
(iii) Ein noch wirksameres Arzneimittel kann durch geeignete Veränderungen der Aminosäuresequenz des Peptids der vorliegenden Erfindung oder durch eine geeignete chemische Modifizierung hergestellt werden. Darüber hinaus ist es möglich, die Wege der Verabreichung zu erweitern, wie z. B. durch Formulierung als ein Arzneimittel, das oral verabreicht werden kann.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Peptid, welches aus einer Aminosäuresequenz besteht, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, und SEQ ID NR: 9.
Arzneimittel, umfassend ein Peptid, das einer C-terminalen Region des Gewebefaktorinhibitors (TFPI) entspricht mit der Aktivität, das Wachstum von glatten Muskelzellen zu hemmen, wobei die C-terminale Region erhältlich ist nach der Entfernung einer Region, die sich von dem N-Terminus bis mindestens zur Kunitz 3-Region vom TFPI erstreckt, wobei das Peptid aus einem Peptid (A) besteht mit einer 13 Aminosäuren langen Aminosäuresequenz, unter denen vier oder mehr Aminosäuren basische Aminosäuren sind, und einem Peptid (B) mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ile-Phe, Ile-Phe-Val, Ile-Phe-Val-Xaa, Ile-Phe-Val-Xaa-Asn und Ile-Phe-Val-Xaa-Asn-Met, wobei Xaa entweder Lys oder Gln ist, wobei das Peptid (B) mit dem C-Terminus des Peptids (A) direkt oder über mehrere Aminosäurereste verbunden ist, und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten oder Additiv.
Arzneimittel nach Anspruch 2, wobei die basischen Aminosäurereste in dem Peptid (A) ausgewählt sind aus Lysin (auch bezeichnet als „Lys" oder „K"), Arginin (auch bezeichnet als „Arg" oder „R") und Histidin (auch bezeichnet als „His" oder „H").
Arzneimittel nach Anspruch 2, wobei 9 der 13 Aminosäurereste von Peptid (A) basische Aminosäuren sind.
Arzneimittel nach Anspruch 4, wobei das Peptid (A) aus der folgenden Sequenz von 13 Aminosäureresten besteht: Ba1-Xa1-Ba2-Ba3-Ba4-Ba5-Ba6-Ba7-Xa2-Ba8-Xa3-Ba9-Xa4, in welcher Ba1, Ba2, Ba3, Ba4, Ba5, Ba6, Ba7, Ba8 und Ba9 basische Aminosäuren sind, jeweils ausgewählt aus Lys, Arg und His; Xa1, Xa2, Xa3 und Xa4 beliebige Aminosäuren sind.
Arzneimittel nach Anspruch 5, wobei die Sequenz aus 13 Aminosäureresten die Sequenz Lys-Xal-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Xa2-Arg-Xa3-Lys-Xa4 hat.
Arzneimittel nach Anspruch 6, wobei die Sequenz aus 13 Aminosäureresten die Sequenz Lys-Thr-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Ile hat.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei das Peptid aus der Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 17, SEQ ID NR: 18, SEQ ID NR: 19 oder SEQ ID NR: 20 besteht.
Verwendung eines Peptids für die Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung oder Behandlung pathologischer Zustände, die in Verbindung stehen mit dem Wachstum von glatten Muskelzellen, wie Arteriosklerose, Restenose nach Angioplastie, luminale Stenose nach einer Blutgefäßtransplantation und ein Sarkom des glatten Muskels, wobei das Peptid ein Peptid ist bestehend aus einem Peptid (A) mit einer Aminosäuresequenz mit einer Länge von 13 Aminosäuren, unter welchen vier oder mehr Aminosäuren basische Aminosäuren sind, und einem Peptid (B) mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ile-Phe, Ile-Phe-Val, Ile-Phe-Val-Xaa, Ile-Phe-Val-Xaa-Asn und Ile-Phe-Val-Xaa-Asn-Met, in welchen Xaa entweder Lys oder Gln ist, wobei das Peptid (B) mit dem C-Terminus des Peptids (A) direkt oder über mehrere Aminosäurereste verknüpft ist.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Angioplastie entweder eine percutane transluminale Koronarangioplastie, eine Atherektomie, eine Laserexzision oder ein Stentimplantat ist.
Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, wobei der basische Aminosäurerest im Peptid (A) ausgewählt ist aus Lysin (auch bezeichnet als „Lys" oder „K"), Arginin (auch bezeichnet als „Arg" oder „R") oder Histidin (auch bezeichnet als „His" oder „H").
Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei das Peptid (A) aus einer Sequenz von 13 Aminosäureresten besteht, unter welchen vier oder mehr Aminosäurereste eine basische Aminosäure sind.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei 9 von 13 Aminosäureresten eine basische Aminosäure sind.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Sequenz aus 13 Aminosäureresten die Sequenz Ba1-Xa1-Ba2-Ba3-Ba4-Ba5-Ba6-Ba7-Xa2-Ba8-Xa3-Ba9-Xa4 hat, in welcher Ba1, Ba2, Ba3, Ba4, Ba5, Ba6, Ba7, Ba8 und Ba9 basische Aminosäuren sind, jeweils ausgewählt aus Lys, Arg und His; Xa1, Xa2, Xa3 und Xa4 beliebige Aminosäuren sind.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Sequenz aus 13 Aminosäureresten die Sequenz Lys-Xa1-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Xa2-Arg-Xa3-Lys-Xa4 hat.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Sequenz aus 13 Aminosäureresten die Sequenz Lys-Thr-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Ile hat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 16, wobei mindestens zwei aufeinanderfolgende hydrophobe Aminosäurereste im Peptid (B) ausgewählt sind aus den folgenden Aminosäuren: Phenylalanin (auch bezeichnet als „Phe" oder „F"), Isoleucin (auch bezeichnet als „Ile" oder „I"), Leucin (auch bezeichnet als „Leu" oder „L"), Methionin (auch bezeichnet als „Met" oder „M"), Prolin (auch bezeichnet als „Pro" oder „P"), Valin (auch bezeichnet als „Val" oder „V"), Tryptophan (auch bezeichnet als „Trp" oder „W") und Tyrosin (auch bezeichnet als „Tyr" oder „Y").
Verwendung nach Anspruch 17, wobei mindestens zwei aufeinanderfolgende hydrophobe Aminosäurereste im Peptid (B) eine Aminosäuresequenz Ile-Phe oder Ile-Phe-Val oder Ile-Phe-Val-Xaa oder Ile-Phe-Val-Xaa-Asn oder Ile-Phe-Val-Xaa-Asn-Met haben.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei Xaa Lys oder Gln ist.
Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz der C-terminalen Region des Gewebefaktorinhibitors (TFPI) hat.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei die C-terminale Region erhältlich ist nach Entfernung einer Region, die sich vom N-Terminus bis mindestens zur Kunitz 3-Region vom TFPI erstreckt.
Verwendung nach Anspruch 20 oder 21, wobei die C-terminale Region die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 1 hat.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei mindestens ein hydrophober Aminosäurerest in der C-terminalen Region von SEQ ID NR: 1 (IFVKNM) durch einen hydrophoben Aminosäurerest ersetzt wird.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei mindestens ein hydrophober Aminosäurerest am N-Terminus von SEQ ID NR: 1 hinzugefügt wird.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR 5, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 8, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 17, SEQ ID NR: 18, SEQ ID NR: 19 oder SEQ ID NR 20 hat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 25, wobei das Peptid die Aktivität besitzt, das Wachstum von glatten Muskelzellen zu hemmen.