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Die
Erfindung betrifft Verbindungen, die die Angiogenese induzieren,
und deren Anwendungen, insbesondere bei der Behandlung von bestimmten
Gefäßpathologien.
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Die
Angiogenese ist ein fundamentales physiologisches Phänomen, welches
während
der gesamten Lebensdauer eines Individuums auftritt und welches
erlaubt, die strukturelle und funktionale Unversehrtheit des Organismus
aufrechtzuerhalten. Die Angiogenese tritt in Reaktion auf örtliche
Stimuli auf, die eine Kaskade von Ereignissen induzieren, welche
zu der Bildung von neuen Blutgefäßen ausgehend
von vorexistierenden Gefäßen führen.
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Während einer
Neovaskularisierung stellen die Endothelzellen das zentrale, unabdingbare
Element für die
Erzeugung von neuen Gefäßen dar.
Ihre Entwicklung und ihre Vermehrung werden durch positive (angiogenetische)
und negative (angiostatische) Faktoren reguliert. Bei den bereits
gebildeten Gefäßen befinden sich
die Endothelzellen in ruhendem Zustand. Indessen machen sich diese
Zellen in Reaktion auf einen angiogenetischen Stimulus daran, zu
proliferieren und in Richtung des Orts der Erzeugung der neuen Gefäße zu wandern,
was die Erzeugung von Wechselwirkungen mit den umgebenden Zellen
und mit den Elementen der extrazellulären Matrix erfordert.
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Beim
Erwachsenen ist die Angiogenese ein Schlüsselprozess der reproduktiven
Funktionen (Bildung des Gelbkörpers,
Bildung der Placenta, Entwicklung des Endometriums) und vor allem
der Gewebereparatur während
Traumata (Vernarbung) und Ischämien.
Es ist folglich evident, dass die Stimulation der Angiogenese durch
die Verabreichung von exogenen Molekülen einen bedeutenden Fortschritt
bei der Therapie von bestimmten Leiden, wie beispielsweise der Reparatur
von Haut-, Knochen-, gastrischen oder ophthalmischen Wunden, darstellen
würde.
Die Perspektiven einer klinischen Anwendung von solchen angiogenetischen
Vermittlersubstanzen umfassen gleichfalls die Förderung der mit ischämischen
Pathologien verbundenen Geweberegeneration oder die Endothelialisierung
von Prothesen.
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Es
wurden mehrere angiogenetische Faktoren, die in der Lage sind, in
vitro wie in vivo die Schritte der Angiogenese zu induzieren, identifiziert
(Angiogenin, Angiopoietin, Interleukin 8 (IL-8), der „epidermal
growth factor" (EGF),
die „fibroblast
growth factors" (FGFs),
der „transforming
growth factor" (TGF) α und β, der „hepatocyte
growth factor (HGF), der „Plateled-derivated
endothelial growth factor" (PDGF),
der „tumor
necrosis factor α" (TNF α), die „vascular
endothelial growth factors" (VEGFs),
der „placental
growth factor" (PIGF).
Alle diese Faktoren von Proteinnatur bilden den Gegenstand von intensiven
Untersuchungen über
deren Eignung für
die Gewebereparatur beim Menschen. Es wurden klinische Versuche
in Phase I und II mit den VGEFs und den FGFs begonnen. Insbesondere
werden diese Faktoren hinsichtlich ihrer therapeutischen Wirkungen
bei ischämischen
ebenso wie kardialen und zerebralen Pathologien ausgewertet. Die
aktuellen Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, dass unabhängig von
der Verabreichungsweise dieser Faktoren (Perfusion der rekombinanten
Proteine oder Gentherapie) diese Letzteren die erwartete therapeutische
Wirksamkeit nicht zeigen (Ferrara, N., Alitalo, K., 1999, Clinical
applications of angiogenic growth factors and their inhibitors.
Nature Med., 5:1359-1364). Neue Wege, die darauf abzielen, die Gewebeneovaskularisierung
zu stimulieren, richten sich gegenwärtig auf Therapien, die mehrere
angiogenetische Faktoren kombinieren.
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Die
Verfügbarkeit
der angiogenetischen Faktoren in Form von rekombinanten Proteinen
hat erlaubt, zu zeigen, dass deren örtliche Anwendung die Heilung
von Wunden beschleunigen könnte.
Das Produkt, das das interessanteste zu sein scheint, ist TGFβ. Seine Vernarbungseigenschaften
sind seit mehreren Jahren fest etabliert und es laufen klinische
Studien.
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Auf
jeden Fall sind der größte Teil
dieser angiogenetischen Faktoren Proteine von hohem Molekulargewicht,
die lediglich auf rekombinantem Wege erhalten werden können, was
gerade dadurch den Selbstkostenpreis der Behandlung erhöht.
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Wenn
auch bestimmte Polypeptide in der Lage sind, die Angiogenese zu
stimulieren, ist es den Erfindern gelungen, eine angiogenetische
Akti vität
zu zeigen, die Peptidstrukturen von geringer Größe und spezieller von vier
Aminosäuren
zu eigen ist.
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Es
ist festzuhalten, dass die Peptide von geringer Größe, welche
die Formel I oder wenigstens die drei Aminosäuren (umfassend die Reste entsprechend
A1, A2, A3) einschließen, gleichfalls einen Teil
der Erfindung bilden.
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Aus
diesem Grunde betrifft die Erfindung für diesen Anwendungstyp die
Verwendung von kleinen Peptiden, deren chemische Synthese kein Problem
aufwirft und deren Selbstkostenpreis ausreichend niedrig ist.
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Außerdem weist
die Verwendung dieser Peptide auf industrieller Ebene eine bestimmte
Anzahl von Vorteilen auf, darunter insbesondere die Tatsache, dass
sie leichter handhabbar sind als Proteine.
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung der Formel I:
in welcher
A
1 der D- oder L-Ser entsprechende Rest ist,
A
2 der D- oder L-Asp oder -Glu entsprechende
Rest ist,
A
3 der D- oder L-Lys, -Arg
oder -Orn entsprechende Rest ist,
A
4 der
D- oder L-Pro entsprechende Rest ist,
wobei R
1 und
R
2 unabhängig
voneinander aus H, substituiertem oder nicht-substituiertem C
1-C
12-Alkyl, substituiertem
oder nicht-substituiertem C
7-C
20-Arylalkyl,
R
9CO oder R
4COO,
wobei R
4 substituiertes oder nicht-substituiertes
C
1-C
12-Alkyl, substituiertes
oder nichtsubstituiertes C
7-C
20-Arylalkyl
ist, ausgewählt
werden; unter den Substitutionen müssen OH, NH
2 oder
COOH aufgeführt
werden;
X
1 und X
2 Peptid-
oder Pseudopeptidbindungen sind,
X
3 CO
oder CH
2 ist und
R
3 OH,
NH
2, C
1-C
12-Alkoxy oder NH-X
4-CH
2-Z ist, X
4 ein normaler
oder verzweigter C
1-C
12-Kohlenwasserstoff ist,
Z H, OH, CO
2H oder CONH
2 ist,
oder ebenso der entsprechenden Tripeptide, die die Reste A
1, A
2, A
3 umfassen,
wie
auch der pharmazeutisch annehmbaren Salze für die Herstellung eines Arzneimittels,
welches für
die Behandlung von Pathologien, die aus einer Angiogenese Nutzen
ziehen können,
bestimmt ist.
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Mit
dem Ausdruck „aus
einer Angiogenese Nutzen ziehen" versteht
man, dass aus einer Induktion und/oder einer Stimulation der Angiogenese
Nutzen gezogen werden kann.
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Die
Peptide oder Pseudopeptide, die diesen Formeln entsprechen, leiten
sich von der Grundstruktur des Tetrapeptids Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro
(AcSDKP) ab, wobei diese Derivate insbesondere dazu bestimmt sind,
die angiogenetische Aktivität
zu erhöhen,
die Nebenwirkungen zu verringern und/oder die Lebensdauer in physiologischem
Milieu zu erhöhen.
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Unter
den Verbindungen der Erfindung muss das Tripeptid erwähnt werden,
das von einem Peptid AcSDKP abgeleitet ist und die Reste A1, A2, A3 umfasst.
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Die
Grundstruktur ist ein Molekül,
das aus dem Knochenmark eines Rinderfötus isoliert worden ist und dessen
Anwendungen bis heute mit einer Funktion der Hemmung der Proliferation
der hämopoetischen Stammzellen
in Verbindung gebracht worden ist, welche insbesondere in WO 88/00594
beschrieben wird.
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Unter „entsprechender
Rest" muss man den
Rest A der Formel: NH2-CH(A)-COOH, welche der
Aminosäure
entspricht, verstehen.
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So
ist A
-CH2OH für Ser,
-CH2COOH
für Asp,
-CH2-CH2-COOH für Glu,
-(CH2)3-NH-C(NH)NH2 für
Arg,
-(CH2)3-NH2 für
Orn und
-(CH2)4-NH2 für
Lys;
bei der aminoterminalen Aminosäure A4 handelt
es sich entweder um die Struktur:
= N-CH(A)-CO- oder NH-(CH)A-CO-.
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Mit "Pseudopeptid" sollen Verbindungen
bezeichnet werden, die zu den Referenzpeptiden ähnlich sind, in welchen aber
eine oder mehrere Peptidbindungen -CO-NH- durch eine zu der Peptidbindung äquivalente
Bindung ersetzt worden ist bzw. sind, die als pseudopeptidisch bezeichnet
wird, entweder -CH2-NH-, -CH2-S-,
-CH2-O-, -CO-CH2-,
-CH2-CO-, -CH2-CH2-, dargestellt durch Ψ(CH2NH)
beispielsweise.
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Unter
den Resten R1 und R2 wird
man ganz besonders die Reste: H und (C1-C3)-alkyl-CO-, insbesondere CH3CO,
wie auch HOOC-CH2-CH2-CO-O
bevorzugen.
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Ebenso
ist R3 vorzugsweise NH2,
OH oder NHCH3.
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Unter
den Verbindungen sollten aufgeführt
werden:
CH3CO-Ser-Asp-Lys-Pro-OH
CH3CO-Ser-Ψ-(CH2NH)-Asp-Lys-Pro-OH
CH3CO-Ser-Asp-Ψ-(CH2NH)-Lys-Pro-OH
CH3CO-Ser-Asp-Lys-Ψ-(CH2N)-Pro-OH
CH3CO-Ser-Ψ-(CH2NH)-Asp-Lys-Pro-NH2
CH3CO-Ser-Asp-Ψ-(CH2NH)-Lys-Pro-NH2
CH3CO-Ser-Asp-Lys-Ψ-(CH2N)-Pro-NH2
H-Ser-Ψ-(CH2NH)-Asp-Lys-Pro-OH
H-Ser-Asp-Ψ-(CH2NH)-Lys-Pro-OH
H-Ser-Asp-Lys-Ψ-(CH2N)Pro-OH
HOOCCH2CH2CO-Ser-Ψ-(CH2NH)-Asp-Lys-Pro-OH
HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-Ψ-(CH2NH)-Lys-Pro-OH
HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-Lys-Ψ-(CH2N)-Pro-OH
H-Ser-Ψ-(CH2NH)-Asp-Lys-Pro-NH2
H-Ser-Asp-Ψ-(CH2NH)-Lys-Pro-NH2
H-Ser-Asp-Lys-Ψ-(CH2N)-Pro-NH2
HOOCCH2CH2CO-Ser-Ψ-(CH2NH)-Asp-Lys-Pro-NH2
HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-Ψ-(CH2NH)-Lys-Pro-NH2
HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-Lys-Ψ-(CH2N)-Pro-NH2
CH3CO-Ser-Asp-Lys-Pro-NH2
H-Ser-Asp-Lys-Pro-NH2
CH3CO-Ser-Asp-Lys-Pro-NHCH3
H-Ser-Asp-Lys-Pro-NHCH3
HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-Lys-Pro-NHCH3
HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-Lys-Pro-NH2.
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wie
auch die folgenden Verbindungen:
CH3CO-Ser-Asp-Lys-OH
CH3CO-Ser-Ψ-(CH2NH)-Asp-Lys-OH
CH3CO-Ser-Asp-Ψ-(CH2NH)-Lys-OH
CH3CO-Ser-Ψ-(CH2NH)-Asp-Lys-NH2
CH3CO-Ser-Asp-Ψ-(CH2NH)-Lys-NH2
H-Ser-Ψ-(CH2NH)-Asp-Lys-OH
H-Ser-Asp-Ψ-(CH2NH)-Lys-OH
HOOCCH2CH2CO-Ser-Ψ-(CH2NH)-Asp-Lys-OH
HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-Ψ-(CH2NH)-Lys-OH
H-Ser-Ψ-(CH2NH)-Asp-Lys-NH2
H-Ser-Asp-Ψ-(CH2NH)-Lys-NH2
HOOCCH2CH2CO-Ser-Ψ-(CH2NH)-Asp-Lys-NH2
HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-Ψ-(CH2NH)-Lys-NH2
CH3CO-Ser-Asp-Lys-NH2
H-Ser-Asp-Lys-NH2
CH3CO-Ser-Asp-Lys-NHCH3
H-Ser-Asp-Lys-NHCH3
HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-Lys-NHCH3
HOOCCH2CH2CO-Ser-Asp-Lys-NH2
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Unter
den pharmazeutisch annehmbaren Salzen sind insbesondere die Salze
mit anorganischen Säuren,
Chlorid-, Sulfat-, Phosphat-, Nitrat-, Hydrochlorid-Salze, aber
gleichfalls mit den organischen Säuren, insbesondere beispielsweise
die Lactat- und Citratsalze, wie auch die Salze mit Basen aufzuführen.
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Die
Erfinder haben jetzt nachgewiesen, dass dieses Tetrapeptid oder
verwandte Peptide der Formel I in der Lage sind, die Angiogenese
zu induzieren.
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Unter
den Behandlungen von Pathologien, die aus einer Stimulation der
Angiogenese Nutzen ziehen können,
sind die vaskulären
Pathologien aufzuführen,
insbesondere bei der Behandlung von Ischämien. So können die erfindungsgemäßen Verbindungen
insbesondere in den folgenden Fällen
eingesetzt werden:
- 1. Induktion der Bildung
von Kollateralgefäßen im Falle
von ischämischen
Pathologien;
– Myokardischämie (Erkrankung
der Herzkranzgefäße, Myokardinfarkt),
– periphere
Ischämie
(Okklusion der peripheren Arterien),
– zerebrale Ischämien (zerebrale
Gefäßerkrankungen),
- 2. Narbenbildungen und Reparatur von Brüchen im Falle von Gewebeläsionen:
– Dermatologie:
Verbrennungen oder Verletzungen, chronische Geschwüre,
– Ophthalmologie:
Kornea- oder Retinaläsionen,
– Gastroenterologie:
gastroduodenale Geschwüre,
– Knochenchirurgie:
Reparatur von harten Geweben: Knochen Knorpel,
- 3. Regeneration von Nerven,
- 4. rekonstruktive Chirurgie und kosmetische Chirurgie,
- 5. Endothelialisierung von Biomaterialien und Gefäßimplantaten,
- 6. Transplantation von Organen (beispielsweise Langerhans-Inseln).
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Die
vorangehende Liste stellt lediglich einen Teil der möglichen
Anwendungen dar; insbesondere im Falle von kombinierten Behandlungen
kann eine Beschleunigung der Angiogenese die Heilung erlauben.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
sind gleichfalls bei den ex vivo- oder
in vitro-Kulturen von Geweben, welche eine Neovaskularisierung erfordern,
als Angiogeneseinduktoren, beispielsweise bei der Kultivierung von
Haut oder bei den Umhüllungen
von Materialien durch Gewebe, nützlich.
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Es
konnte in vitro gezeigt werden, dass AcSDKP in der Lage ist, die
Vermehrung von humanen Endothelzellen (HUVEC und EA.hy926) und von
Endothelzellen, die aus den Kapillaren von Rinderhirnen stammen, (BBC)
signifikant zu stimulieren.
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In
vivo ist die angiogenetische Aktivität von AcSDKP an dem experimentellen
Modell „der
Chorioallantoismembran des Hühnerembryos" getestet worden.
In diesem Modell induziert AcSDKP die Neovaskularisierung auf bedeutende
Weise.
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Andererseits
hat eine an Knochenmarkszellen vorab ausgeführte Untersuchung enthüllt, dass
AcSDKP in vitro die Haftung von diesen Zellen an verschiedenen Komponenten
der extrazellulären
Matrix, wie Fibronektin, Collagen IV und Laminin, erhöht. Vergleichbare
Ergebnisse wurden in einem vorab ausgeführten Experiment erhalten,
welches mit humanen HUVEC-Endothelzellen ausgeführt wurde. Es ist gut etabliert,
dass diese Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen und der extrazellulären Matrix
für die
Neovaskularisierung bestimmend sind und an verschiedenen Schritten
der Angiogenese beteiligt sind. Tatsächlich beeinflusst die extrazelluläre Matrix
die Proliferation und die Wanderung der vaskulären Endothelzellen wie auch
deren Vermögen,
zu differenzieren und sich in Kapillaren zu organisieren, um neue
funktionale Gefäße zu bilden,
die an deren Gewebe-Mikroumgebung angepasst sind.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
in einer geeigneten pharmazeutischen Form, beispielsweise auf oralem,
intravenösem,
transdermalem, pulmonalem, subkutanem, nasalem oder andersartigem
Wege, verabreicht werden mittels der entsprechenden Formen, seien
es Tabletten, injizierbare Lösungen oder
Pommaden, Gele, insbesondere wenn man Zusammensetzungen herzustellen
wünscht,
die dazu bestimmt sind, die Narbenbildung zu verbessern.
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Bei
der Revaskularisierung, insbesondere bei der Behandlung von Ischämien, wird
man vorzugsweise auf injizierbare Wege und insbesondere auf Perfusionen
zurückgreifen.
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Selbstverständlich werden
die erfindungsgemäßen Verbindungen
in Kombination mit anderen Wirkstoffen, die gegebenenfalls dazu
bestimmt sind, die Pathologie direkt zu behandeln, wenn die Angiogenese lediglich
eine Ergänzungstherapie
zu einer Haupttherapie bildet, beispielsweise bei der Behandlung
von gastroduodenalen Geschwüren,
eingesetzt werden können.
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Was
die Verabreichungsdosen betrifft, wurde in den verwendeten Modellen
festgestellt, dass die angiogenetische Wirkung ein Maximum durchläuft, um
dann erneut abzufallen, wenn man die verabreichten Dosen erhöht. Es ist
folglich eventuell nötig,
die Verabreichungsdosis an die Art der Pathologie und an den Patienten
anzupassen, wenn dies erforderlich ist. Die optimalen Dosen von
AcSDKP liegen zwischen 10-5 und 10-11 M und werden vorzugsweise zwischen 10-6 und 10-9 liegen.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
durch Syntheseverfahren vom Peptid- oder Pseudopeptidtyp, insbesondere
die Verfahren, die in WO 88/00594, welches die Synthese des Derivats
AcSDKP beschreibt, und in dem Patent WO 97/28183, welches die Synthese
von mit AcSDKP verwandten Pseudopeptiden beschreibt, beschrieben
werden, synthetisiert werden.
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Legende der Figuren:
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1a, 1b und 1c: AcSDKP stimuliert in vitro die Vermehrung
von Rinder-Endothelzellen (BBC) und humanen Endothelzellen (HUVEC
und EA.hy926).
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2a, 2b und 2c:
Wirkung von AcSDKP und von dessen Analoga auf die Vaskularisierung der
Chorioallantoismembran des Hühnerembryos
(CAM).
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3:
Wirkung von AcSDKP auf die Bildung von Gefäßtuben in vitro durch Endothelzellen
(EA.hy 926) in Matrigel.
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BEISPIEL 1
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Die
folgenden Versuche wurden mit dem Tetrapeptid AcSDKP ausgeführt; es
wurden die folgenden Ergebnisse beobachtet:
AcSDKP stimuliert
signifikant die Vermehrung von Endothelzellen, die aus den Kapillaren
von Rinderhirnen stammen, (BBC) und von humanen Nabelschnurvenen-Endothelzellen
(HUVEC) wie auch die Vermehrung einer Linie von immortalisierten
HUVEC-Zellen (EA.hy926). Die mitogene Wirkung von AcSDKP manifestiert sich
bei Konzentrationen, die von 10-6 bis 10-11 M gehen, mit einem Maximum bei 10-9 M.
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Die
Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in den 1a, 1b und 1c zusammengestellt.
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Eine
ergänzende
Untersuchung, die an Gesamtknochenmark (welches unter anderem Endothelzellen enthält) ausgeführt wurde,
hat gezeigt, dass AcSDKP in vitro die Haftung der Knochenmarkszellen
an verschiedenen Komponenten der extrazellulären Matrix, wie Fibronektin,
Collagen IV und Laminin, erhöht.
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Die
optimale Konzentration von AcSDKP liegt bei diesem Modelltyp zwischen
10-6 und 10-8 M.
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Vergleichbare
Ergebnisse wurden in vorab durchgeführten Experimenten, die an
humanen HUVEC-Endothelzellen ausgeführt wurden, erhalten.
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Es
ist gut etabliert, dass diese Wechselwirkungen zwischen den Endothelzellen
und der extrazellulären
Matrix für
die Neovaskularisierung bestimmend sind und an verschiedenen Schritten
der Angiogenese beteiligt sind. Tatsächlich beeinflusst die extrazelluläre Matrix
die Proliferation und die Wanderung der vaskulären Endothelzellen wie auch
deren Vermögen,
zu differenzieren und sich in Kapillaren zu organisieren, um neue funktionale
Gefäße zu bilden,
die an deren Gewebe-Mikroumgebung
angepasst sind.
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BEISPIEL 2
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Die
folgenden Experimente wurden an dem experimentellen Modell der Chorioallantoismembran
des Hühnerembryos
ausgeführt
und an diesem Modell wurde die Aktivität von AcSDKP und von dessen
Analoga getestet. Es konnte gezeigt werden, dass AcSDKP und dessen
proteolysebeständiges
Analog AcSDKP-NH2 auf signifikante Weise
die Neovaskularisierung induzieren, wohingegen dessen optisches
Isomer, AcSDDKP keinerlei angiogenetische
Wirkung hatte. Die Erhöhung
der Vaskularisierungsdichte variiert abhängig von der untersuchten Dosis
mit einer maximalen Wirkung für
AcSDKP und AcSDKP-NH2 bei Konzentrationen
zwischen 10-9 M und 10-7 (2a, 2b und 2c).
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BEISPIEL 3
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Die
Ergebnisse einer in vivo-Untersuchung, die bei der Ratte ausgeführt wurde,
zeigen, dass AcSDKP gleichfalls die Neovaskularisierung bei Säugetieren
induziert.
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In
diesen Experimenten wurde AcSDKP in den abdominalen Muskel bei der
normalen Ratte injiziert (Behandlung zweimal täglich während 5 Tagen). Eine Angiographie
der Bauchwände,
die bei dem am Tag 8 getöteten
Tier ausgeführt
wurde, hat eine stärker
entwickelte Vaskularisierung (signifikante Erhöhung der Anzahl von kleinen
Gefäßen) bei
den mit AcSDKP in einer Dosis von 5 μg/kg/Injektion behandelten Tieren
gezeigt. Es muss betont werden, dass diese Wirkung über die
Zeit anhält
(einen Monat nach dem Beginn der Behandlung vorgenommene Beobachtungen).
Nach der Verabreichung von AcSDKP in einer Dosis von 50 μg/kg/Injektion
wurde keinerlei signifikante Modifizierung der Vaskularisierung
beobachtet.
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Der
mit der Erhöhung
der verabreichten Dosis verbundene Verlust der angiogenetischen
Aktivität
von AcSDKP, den man gleichermaßen
in vitro (Zellen in Kultur) wie in vivo (Hühner- und Rattenembryos) beobachtet
hat, stimmt überein
mit der Existenz einer glockenförmigen
Dosis-Wirkungs-Kurve
für AcSDKP,
wie sie zuvor beschrieben wurde [(Guignon, M., Bonnet, D., Lemoine,
F., Kobari, L., Parmentier, C., Mary, JY, Najman, A. (1990) Inhibition
of human bone marrow progenitors by the synthetic tetrapeptide AcSDKP;
Exp. Hematol. 18, 1112; Jackson, JD, Yan, Y., Ewel, C., Talmage,
JE. (1996) Activity of Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro (AcSDKP) on hematopoietic progenitors
in short term and long-term murine bone marrow cultures, Exp. Hematol.,
24, 475)].
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BEISPIEL 4
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Die
Organisation der Endothelzellen in Gefäßtuben bildet einen wichtigen
Schritt der Angiogenese. Es wurde gezeigt, dass AcSDKP sowohl in
vitro wie in vivo die Bildung der Tuben in Matrigel stimuliert.
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Die
in vitro mit zwei Arten von Endothelzellen ausgeführten Experimente
zeigen, dass AcSDKP in Konzentrationen von 10-9 M
und 10-11 M eine Erhöhung der Gesamtoberfläche des
Gefäßsystems
bezogen auf die Kontrollwerte induziert. Die maximalen Stimulationen,
welche einer Erhöhung
um 60% bzw. 58% entsprechen, wurden nach 6 h Exposition der Zellen
gegenüber
dem Tetrapeptid beobachtet. Diese Wirkungen sind vergleichbar mit
jenen, die durch FGFb in einer Konzentration von 1 ng/ml erzeugt
werden (3).
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In
vivo induziert AcSDKP auf Dosis-abhängige Weise die Gefäßinvasion
von Matrigel, welches unter der Haut eines Tiers (Sprague-Dawley-Ratte) platziert
ist. In diesem Experiment wurde AcSDKP vor der Implantierung mit
dem Matrigel gemischt. Sieben Tage später wurden die Tiere getötet und
die Matrigel-Proben wurden entnommen, in Formol fi xiert und waren
der Gegenstand einer histologischen Untersuchung. Die mikroskopischen
Beobachtungen und die Quantifizierung der Gefäße nach Anfärbung und Immunmarkierung haben
das Vorhandensein einer viel bedeutenderen Anzahl von Gefäßen im Inneren
des Matrigels, welches AcSDKP enthalten hat, bezogen auf die Matrigel-Vergleichsprobe
enthüllt
(Tabelle 1). Für
die Quantifizierung wurden die Gefäßschnitte auf 10 aufeinanderfolgenden
Feldern (Oberfläche
= 32 mm2) ausgehend von der reichsten Zone
gezählt.
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Tabelle
1 Wirkung
von AcSDKP auf die Gefäßinvasion
von Matrigel in vivo
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BEISPIEL 5
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Unter
Berücksichtigung
des Vermögens
der angiogenetischen Faktoren, in vivo die Bildung von neuen Gefäßen in Läsionen aufweisenden
Regionen, die durch einen Vaskularisierungsmangel gekennzeichnet
sind, zu stimulieren, haben wir die Wirksamkeit von AcSDKP, die
Reparatur von Gewebeläsionen
zu begünstigen, unter
Verwendung eines Hautlappenmodells untersucht. Tatsächlich resultiert
die distale Nekrose von Hautlappen im Allgemeinen aus einer Ruptur
des Gefäßsystems
und folglich aus einem nicht ausreichenden arteriellen Fluss, was
bedeutende Probleme auf den Gebieten der kosmetischen und rekonstruktiven
Chirurgie aufwirft. Es ist bewiesen worden, dass die Verabreichung
eines angiogenetischen Faktors, der zu der Revaskularisierung dieser
Lappen beiträgt,
so deren Überleben
erhöht.
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Wir
haben gezeigt, dass subkutane Injektionen von AcSDKP in der Region
der Lappen deren Nekrosen verringern. Die ventralen Stielhautlappen
(6 × 6
cm) (linker inguinaler Stiel (Pediculus)) wurden bei Sprague-Dawley-Ratten
untersucht. AcSDKP wurde in einer Dosis von 5 μg/kg/Injektion (250 μl/Injektion)
unmittelbar nach dem chirurgischen Eingriff, dann noch fünfmal in
Zeitabständen
von 12 h verabreicht. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass das Überleben
der Lappen bei den mit AcSDKP behandelten Tieren um 10% bezogen
auf die Kontrollen zunimmt. Auf makroskopischer Ebene wird die Verringerung
der Nekrose von der Erhöhung
der Dichte der Vaskularisierung auf der inneren Oberfläche der
Lappen begleitet.
