DE69029579T3

DE69029579T3 - Blutplättchen-Aggregationsinhibitoren

Info

Publication number: DE69029579T3
Application number: DE69029579T
Authority: DE
Inventors: Robert M. Belmont SCARBOROUGH; David Lawrence Palo Alto WOLF; Israel F. Lafayette CHARO
Original assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1989-06-16
Filing date: 1990-06-15
Publication date: 2006-06-22
Anticipated expiration: 2010-06-16
Also published as: FI104364B; KR0180918B1; HUT59835A; KR920702627A; JP3281370B2; US5958732A; NO312965B1; CA2388770A1; NO914962D0; ES2097150T3; EP0751219A1; ES2097150T5; EP0477295A1; DK0477295T4; DE69029579T2; NL990043I1; US5736339A; WO1990015620A1; FI915919A0; EP0477295B1

Description

Die Erfindung betrifft eine Gruppe von Peptiden, die Blutplättchen-Aggregationsinhibitoren sind oder zu diesen verwandt sind, aus verschiedenen Schlangengiften isoliert und gereinigt wurden. Diese Peptide sind nützlich als Arzneimittel zur Behandlung und Vorbeugung von Blutplättchen-assoziierten ischämischen Störungen. Insbesondere betrifft die Erfindung Peptide, die spezifische Rezeptoren für adhesive Proteine, die in der Blutplättchen-Anheftung und Aggregation involviert sind, blockieren. Darüberhinaus beschreibt die Erfindung Verfahren zum Nachweis und zur Reinigung dieser Peptide zur substantiellen Homogenität von Schlangengiften sowie Verfahren zur Verwendung der primären Aminosäuresequenz dieser Polypeptide zur Herstellung aktiver Peptide sowohl synthetisch als auch unter Verwendung von rekombinanten DNA-Methoden.
Herzkrankheiten sind die primäre Todesursache in den meisten westlichen Gesellschaften. Der Tod aufgrund von Herzstörungen wird oft durch Blutplättchen-abhängige ischämische Syndrome induziert, die durch Atherosklerose und Arteriosklerose initiiert werden und umfassen in nicht beschränkender Weise einen akuten Herzinfarkt, chronische unstabile Angina, vorübergehende ischämische Attacken und Anfälle, periphere vaskuläre Krankheiten, arterielle Thrombose, Präklampsie, Embolie, Restenose und/oder Thrombose im Anschluß an Angioplastie, Karotis-Endarteriektomie, Anastomose von vaskulären Transplantaten und chronischen kardiovaskulären Vorrichtungen (z.B. Verweil-Katheter oder Ableitung-"extracorporale Kreislaufvorrichtungen"). Diese Syndrome stellen eine Vielzahl von stenotischen und oklusiven vaskulären Störungen dar, von denen angenommen wird, daß sie durch Blutplättchen-Aktivierung initiiert werden, entweder auf den Gefäßwänden oder innerhalb des Lumens durch vom Blut abstammende Mediatoren. Diese manifestieren sich durch Blutplättchen-Aggregate, die Blutgerinnsel formen, die den Blutfluß begrenzen.
Eine Vielzahl von Studien hat dazu beigetragen, die Mechanismen der Blutplättchen-Aggregation und der Thrombusbildung zu verstehen. Blutplättchen antworten auf eine Vielzahl von Blutgefäß-Verletzungen wie Verengung des Lumens, Plaque-Bildung und die Gegenwart von Fremdkörpern (z.B. Kathetern) und dergleichen. Die Antwort der Blutplättchen auf diese Verletzungen ist eine Sequenz von Ereignissen einschließlich der Blutplättchen-Anheftung und Aktivierung und der Ausschüttung von Blutplättchen-granulären-Komponenten, einschließlich des potentiellen zellulären mitogenen Faktors. Die aktivierten Blutplättchen-Aggregate induzieren die Bildung von Fibrin, das den Thrombus weiter stabilisiert.
Viel ist nun bekannt über die Mechanismen der Regulierung dieser Antworten. Obgleich unstimulierte Blutplättchen Rezeptoren für mehrere adhäsive Proteine enthalten einschließlich Laminin (VLA 2, VLA 6) und Collagen (VLA 2, GPIV, und andere), wird angenommen, daß das anfängliche Anheften der Blutplättchen an das Subendothelium durch Binden des Blutplättchen-Membranglykoproteins (GP) Ib an den immobilisierten von-Willebrand-Faktor vermittelt wird. Die nachfolgende Blutplättchen-Aktivierung kann initiiert werden durch ein oder mehrere der bekannten physiologischen Agonisten einschließlich: ADP, Epinephrin, Thrombin, Collagen und Thromboxan A2.
Die Blutplättchen-Aggregation wird durch einen GP IIb-IIIa-Komplex auf der Blutplättchenmembranoberfläche vermittelt. GP IIb-IIIa existiert auf der Oberfläche von unstimulierten Blutplättchen in einer inaktiven Form. Wenn die Blutplättchen durch Adhäsion und die physiologischen Agonisten aktiviert werden, wird GP IIb-IIIa ebenfalls aktiviert, so daß es ein Rezeptor wird für Fibrinogen (Fg), von-Willebrand-Faktor (vWF) und Fibronectin (Fn) (vgl. Phillips et al., Blood, 71, 1988, 831–843). Jedoch wird angenommen, daß die Bindung von Fibrinogen und/oder von-Willebrand-Faktor prinzipiell für die Blutplättchen-Aggregation und die Thrombusbildung in vivo verantwortlich ist.
Daher hemmen Substanzen, die spezifisch die Bindung von Fibrinogen oder des von-Willebrand-Faktors an GP IIb-IIIa inhibieren, die Blutplättchen-Aggregation und können für die Inhibierung der Thrombusbildung in vivo Kandidaten sein.
Blutplättchen GP IIb-IIIa ist nun als ein Mitglied der Familie von Struktur-verwandten Adhäsionsproteinrezeptoren bekannt, die gemeinsam als "Integrine" bekannt sind. Wie das GP IIb-IIIa sind alle zur Zeit bekannten Integrine aus zwei Untereinheiten mit einer größeren alpha-Untereinheit (z.B. GP IIb) und einer kleineren beta-Untereinheit (z.B. GP IIIa) aufgebaut. Es besteht ein hoher Grad an Homologie zwischen den bekannten Sequenzen der Integrin-Untereinheiten. Dies deutet darauf hin, daß die Integrine von einem gemeinsamen Vorläufer abstammen. Integrine wirken bei einer Vielzahl von zellulären Adhäsionen und sind gefunden worden in Leukozyten, endothelialen Zellen, glatten Muskelzellen und anderen Zellen des Gefäßsystems. Da Integrine weit verbreitet sind, wohingegen GP IIb-IIIa auf Blutplättchen beschränkt ist, würde ein bevorzugtes Antiaggregationsmittel im Gegensatz zu anderen Integrinen selektiv GP IIb-IIIa inhibieren.
Mehrere Klassen von Peptiden sind beschrieben worden, die die Bindung von adhäsiven Proteinen zur Aktivierung von Blutplättchen blockieren und die Blutplättchen-Aggregation inhibieren (Gawiger et al., US-PS 4,661,471 und Rouslahti et al., US-PSen 4,614,517, 4,578,079, 4,792,525 und GB-A-2,207,922). In einer Klasse von Peptiden ist die Sequenz RGD kritisch und die Tetrapeptidsequenzen RGDS, RGDT, RGDC sind spezifisch verwendet worden. Die Aminosäuresequenz RGDX wird in einer Vielzahl von adhäsiven Proteinen, einschließlich Fg, Vn, vWF und Fn gefunden. Es ist gezeigt worden, daß diese Sequenz eine wichtige Rolle bei der Interaktion von adhäsiven Proteinen mit adhäsiven Proteinrezeptoren spielt, da Peptide, die diese Sequenz enthalten, die Bindung von adhäsiven Proteinen blockieren (Pierschbacher, M. D. et al., J. Biol. Chem., 262, 1987, 17294–17298, Ruggeri et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83, 1986, 5708–5712 und Rouslahti et al., Cell, 44, 1986, 517–518. Eine Übersicht über Zelladhäsionsprozesse einschließlich einer Übersicht über adhäsive Proteine, die das Tripeptid RGD als ihre Zellerkennungsstelle enthalten, kann gefunden werden bei Rouslahti et al., Science, 238, 1987, 491–491. Tetrapeptide, die diese Sequenz enthalten, sind beschrieben worden in EP-A-319,506. Homoarginin-basierende Pentapeptide, die Homoarginin anstelle von Arginin in der Sequenz RGD enthalten, sind beschrieben worden in der PCT-Anmeldung WO 89/07609. Es wurde berichtet, dass kurze Peptide, die ein Lysin oder ein Glutamin sowie ein Arginin in der Sequenz RGD enthalten, eine Aktivität als Tumornekrosefaktor-Antagonisten aufweisen (WO 90/06943).
Die strukturellen Variationen, die in RGD-enthaltenden Peptiden möglich sind, sind erforscht worden durch Pierschbacher, M. D. et al., J. Biol. Chem., supra. In diesen Studien ist festgestellt worden, daß das Manipulieren der RGD-enthaltenden Sequenz nicht nur die Aktivität der Inhibierung der Bindung von Fibronectin oder Vitronectin an das Substrat betrifft, sondern ebenfalls die Differenzierung zwischen der Bindung der zwei Liganden betreffen kann. Die Peptidsequenz GRGDSPC, die von der Zellanheftungsdomäne von Fibronectin stammt, ist als Modellpeptid verwendet worden. Gewisse Substitutionen, wie das Ersetzen von L-Arg durch D-Arg, scheinen keinen Effekt für die Bindung von beiden Liganden zu haben. Allerdings zerstörte das Ersetzen von Gly durch D-Ala oder von L-Asp durch D-Asp die inhibitorische Aktivität. Während das Substituieren von L-Ser durch D-Ser die Inhibierung der Vitronectin-Interaktion mit dem Vitronectin-Rezeptor reduziert, wurde nur ein geringer Effekt auf die Fibronectin-Interaktion mit dem Fibronectin-Rezeptor gefunden. Die Ersetzung von Ser durch Asn resultiert in ein Peptid, das eine erhöhte Inhibierung der Fibronectin-Bindung und einen reduzierten Effekt auf die Vitronectin-Bindung zeigt. Andere Substitutionen des Ser-Restes besaßen andere Effekte. Die Ersetzung von Ser durch Threonin ergab ein Peptid mit gesteigerter Inhibierung der Bindung an den Vitronectin-Rezeptor. Die Ersetzung von L-Pro führte zu einem inaktiven Peptid. Es wurde ebenfalls ein cyclisches Peptid hergestellt mit der Sequenz Gly-Pen-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys-Ala, wobei "Pen" Penicillamin ist und eine Disulfidbrücke zwischen den Pen- und Cys-Resten gebildet wurde. Nach Meinung der Autoren hat Penicillamin die Funktion, die Konformationseinschränkung des Rings zu steigern, wohingegen das N-terminale Gly und das Carboxy-terminale Ala hinzugefügt wurden, um die freie Amino- und Carboxylgruppe weit von dem Ring zu entfernen. Dieses cyclische Peptid war in der Lage, die Vitronectin-Bindung stärker zu hemmen, als das gleiche Peptid vor der Cyclisierung. Es war jedoch bezüglich der Hemmung der Fibronectin-Bindung inaktiv.
Kürzlich ist ein antithrombotisches Peptid mit einer Modifizierung der RGD-Sequenz beschrieben worden, bei der der "R"-Rest alkyliert worden ist (Samanen, J. et al., J. Cell. Biochem., Suppl. 14A: A229, 1990. Eine Übersicht über Struktur-Aktivitäts-Beziehungen in RGD-enthaltenden Peptiden ist publiziert worden von Ali, F. E. et al., in Proc. 11th Am. Peptide Symp., Marshall et al., ed. ESCOM Leiden, 1990.
EP-A-341,915 beschreibt zwei Gruppen von Peptiden, lineare und cyclische, die den Blutplättchen GP IIb-IIIa-Rezeptor binden und so seine Fähigkeit vWF, Fibronectin und Fibrinogen-Fibrin zu binden, hemmen. Es werden keine Daten bereitgestellt, die sich auf die Spezifität der Bindung dieser Peptide beziehen. Die Gruppe der cyclischen Peptide schließt Modifizierungen der RGD-Sequenz ein, wobei das R substituiert ist durch D- oder L-Homoarginin, Dimethyl- oder Diethyl-Arginin, Lysin oder ein alpha-alkyliertes Derivat von diesen Resten. Die minimalen cyclischen Strukturen umfassen einfach die "R" GD-Sequenz, eingeklammert zwischen den zwei Resten, die die Disulfidbrücke bilden.
Eine separate Klasse von inhibitorischen Peptiden nutzt Peptidsequenzen, gestaltet nach der Carboxy-terminalen Sequenz abgeleitet von der gamma-Kette von Fibrinogen, dem Dodecapeptid HHLGGAQKAGDV (Kloczewiak et al., Biochemistry, 28, 1989, 2915–2919, Timmons et al., Ibid, 2919–2923 US-PS 4,661,471, supra, EP-A-298,820). Obgleich diese Sequenz die Bindung von Fg und vWF an GP IIb-IIIa inhibiert und die nachfolgende Blutplättchen-Aggregation, ist die Nützlichkeit dieses Peptids beschränkt, da es eine niedrige Affinität der Wechselwirkung mit den Blutplättchen-Rezeptoren hat (IC₅₀ = 10–100 μM).
Kürzlich haben mehrere Gruppen eine neue Klasse von Polypeptid-Faktoren von Schlangengift, die ein niedriges Molekulargewicht haben, isoliert und charakterisiert, die eine extrem hohe Affinität für den GP IIb-IIIa-Komplex haben. Huang, T.-F. et al., J. Biol. Chem., 262, 1987, 16157–16163, Huang, T.-F. et al., Biochemistry, 28, 1989, 661–666, beschreiben die primäre Struktur von Trigramin, einem 72 Aminosäuren-Peptid, enthaltend RGD und 6 Disulfid-Brücken, isoliert von Trimeresurus gramineus. Gan, Z.-R. et al., J. Biol. Chem., 263, 1988, 19827–19832, beschreiben die Eigenschaften und die Struktur von Echistatin, einem 49 Aminosäuren-Peptid, das ebenfalls RGD enthält und 4 mögliche Disulfid-Brücken, das iso liert wurde von Echis carinatus. Williams, J. A. et al., FASEB Journal, 1989, 3:A310, Abstr. Nr. 487m, beschreibt die Sequenz und Eigenschaften der verwandten Peptide Elegantin, Albolabrin und Flavoviridin. Zusätzlich ist die Charakterisierung von Bitistatin beschrieben worden von Shebuski, R. J. et al., J. Biol. Chem., 264, 1989, 21550–21556 und das PAI von Agkistrodon piscivorus piscivorus ist beschrieben worden von Chao, B. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1989, 8050–8054. Die Sequenz und Aktivität von einem PAI von Agkistrodon rhodostoma, Kistrin und verschiedenen Varianten von natürlich vorkommenden Kistrin-Polypeptiden ist beschrieben worden in WO 90/15072. Die Beziehung zwischen verschiedenen GP IIb-IIIa-Antagonisten von Schlangengiften ist beschrieben worden von Dennis, M. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 1989, 2471–2475.
Eingeschlossen in dieser Gruppe von inhibitorischen Peptiden von Schlangengiften sind Albolabrin, isoliert von Trimeresurus albolabris, Elegantin, isoliert von T. elegans, Flavoviridin, isoliert von T. flavoviridis, Batroxostatin, isoliert von Bothrops atrox, Bitistatin, isoliert von Bitis arietans, beschrieben von Niewiarowski, S. et al., Thromb. Haemostas., 62, 1989, 319 (Abstr. SY-XIV-5). Zusätzlich ist Applaggin gereinigt worden von Agkistrodon p. piscivorus und beschrieben worden von Chao, B. et al., Thromb. Haemostas., 62, 1989, 50 (Abstr. 120) und Halysin, gereinigt von Agkistridon halys, das beschrieben wurde von Huang, T. F. et al., Thromb. Haemostas., 62, 1989, 48 (Abstr. 112). Alle diese Peptide zeigen einen hohen Grad an Sequenzhomologie. Zusätzlich enthalten alle diese Peptide von Schlangengiften, die die Bindung von adhäsiven Proteinen an Integrin-Rezeptoren hemmen, die RGD-Sequenz. Obwohl diese beschriebenen Schlangengift-Faktoren potentielle Blutplättchen-Aggregationsinhibitoren in vitro sind, binden diese Peptide ebenfalls mit hoher Affinität an andere Mitglieder der adhäsiven Protein-Rezeptoren, wie Vitronectin- und Fibronectin-Rezeptoren (Knudsen, K. A. et al., Exp. Cell Res., 179, 1988, 42–49, Rucinski, B. et al., Thromb. Haemostas., 62, 1989, 50 (Abstr. 120). Dieses Fehlen der Spezifität der Schlangengift-Faktoren für GP IIb-IIIa ist eine unerwünschte Eigenschaft für die therapeutische Verwendung als Inhibitoren der Thrombus-Bildung, da sie das Potential haben, die Adhäsionseigenschaften von anderen Zellen im Gefäßsystem, insbesondere solcher Adhäsionen, die durch Integrine vermittelt werden, zu beeinflussen.
Ein anderer Ansatz, entwickelt zur Erzeugung von Blutplättchen-Aggregationsinhibitoren, hat Maus anti-GP IIb-IIIa monoklonale Antikörper verwendet, die die Bindung der adhäsiven Proteine an stimulierte Blutplättchen blockiert. Diese monoklonalen Antikörper sind verwendet worden, um einen Wiederverschluß der Koronararterie nach Reperfusion mit Gewebe-Plasminigen-Aktivator in Hunden zu verhindern (Yasuda, T. et al., J. Clin. Invest., 81, 1988, 1284–1291) und um die Reduktion des Blutflusses in verletzten Koronararterien von Kaninchen mit einem hohen Grad an Stenose zu verhindern. Potentielle Nebenwirkung der Verwen dung dieser monoklonalen Antikörper im Menschen können resultieren von ihren lang anhaltenden Wirkungen und ihrem Potential, Immunität zu erzeugen.
Zusätzliche therapeutische Behandlungsmaßnahmen werden zum Vorbeugen oder wenigstens zur Linderung unerwünschter Thrombus-Bildung benötigt. Insbesondere therapeutische Mittel, die zur Blockierung oder Inhibierung der Thrombus-Bildung an spezifischen Stellen ohne Gefährdung der Blutstillung und ohne Beeinflussung anderer zellulärer Adhäsionen fähig sind, wären von großem therapeutischen Nutzen. Idealerweise sollten diese Mittel spezifisch an GP IIb-IIIa binden und für die meisten Patienten keine Immunität erzeugen. Sie sollten darüberhinaus leicht zu verabreichen, stabil und ökonomisch herzustellen sein. Ferner sollten diese Mittel vorübergehend wirken und fähig sein zu frühen Stadien der Thrombus-Bildung zu wirken, ohne die Langzeit-Blutstillung zu beeinflussen. Diese technischen Probleme werden durch die vorliegende Erfindung, wie in den Ansprüchen dargelegt, gelöst.
Mittels eines einfachen Screening-Verfahrens ist es möglich, PAI-Polypeptide zu identifizieren, die spezifisch die Thrombus-Bildung inhibieren, die durch die Blutplättchen-Aggregation vermittelt wird. Dieses Verfahren nutzt das Wissen, daß die Blutplättchen-Aggregation in erster Linie durch die Bindung von Fibrinogen und/oder vWF an GP IIb-IIIa an der Oberfläche der Blutplättchen bewirkt wird, wenn die Blutplättchen mit geeigneten Stimuli, wie ADP, behandelt werden. Bei Verwendung dieser Kriterien, d.h. durch die Inhibierung der Bindung von Fibrinogen und/oder vWF zur Isolierung des Rezeptors und analoger Kriterien, bezogen auf die Inhibierung der Bindung von Fibronectin (Fn) an Fibronectin-Rezeptor (Fn/FnR-Bindung) und Vitronectin an Vitronectin-Rezeptor (Vn/VnR-Bindung), sowie die Bindung von anderen Faktoren, wie Fn und Vn an GP IIb-IIIa, kann ein spezifisches Profil für den Blutplättchen-Aggregationsinhibitor (PAI) schnell und bequem erhalten werden. Dieser Ansatz ist verwendet worden, um einen umfassenden Panel von Schlangengiften auf das Vorkommen oder das Fehlen von PAI zu screenen und zu charakterisieren, die Spezifität von PAI, die von diesem Panel auf ihre Spezifität der Inhibierung der Bindung an GP IIb-IIIa verglichen zur Inhibierung anderer Integrine identifiziert wurde, zu charakterisieren und um aktive Peptide, die Derivate von diesen PAIs sind, zu identifizieren.
Das Screening-Verfahren auf das Vorliegen oder Fehlen von PAI in einer biologischen Flüssigkeit umfaßt das In-Kontakt-Bringen der Flüssigkeit mit GP IIb-IIIa in einer Testreaktion in Gegenwart von Fibrinogen und den Vergleich der Menge von Fibrinogen, das an GP IIb-IIIa in dieser Testreaktion gebunden ist mit der Menge von Fibrinogen, das an GP IIb-IIIa in einer Kontrollreaktion gebunden ist. Dieses Verfahren schließt ferner Test- und Kontrollreaktionen ein, die das In-Kontakt-Bringen von Fn mit Fn-Rezeptor, Vn mit Vn-Rezeptor, Fn mit GP IIb-IIIa oder vWF mit GP IIb-IIIa, um die Spezifität des PAI zu bestimmen.
PAI kann isoliert werden von Echis colorata, Eristicophis macmahonii, A. hynale, A. acutus, A. piscivoruous leucostoma, A. piscivorus conanti, Bothrops asper, Bothrops cotiara, B. jararaca, B. jararacussu, B. lansbergi, B. medusa, B. nasuta, B. neuwiedi, B. pradoi, B. Schlegli, Crotalus atrox, C. basilicus, C. cerastes cerastes, C. durissus durissus, C durissus totonatacus, C. horridus horridus, C. molossus molossus, C. ruber ruber, C. viridis cereberus, Crotalus v. helleri, Crotalus v. lutosus, Crotalus v. oreganus, Crotalus v. viridis, Lachesis mutas, Sistrurus catenatus tergeminus und Sistrurus milarus barbouri.
Die vorliegende Erfindung betrifft Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptide, die pharmazeutische Zusammensetzung und die Verwendung wie in den Ansprüchen 1 bis 13 beansprucht.
Die Erfindung betrifft ein Blutblättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid, fähig zur stärkeren Inhibierung der Bindung von Fibrinogen (Fg) oder des von Willebrand Factor (vWF) an GP IIb-IIIa als zur Bindung von Vitronectin an Vitronectinrezeptor oder Fibronectin an Fibronectinrezeptor, wobei entweder die prozentuale Inhibierung mindestens 2-fach größer ist für die Inhibierung der Bindung von Fibrinogen (Fg) oder des von Willebrand Factor (vWF) an GP IIb-IIIa als die Inhibierung der Bindung von Vironectin an Vitronectinrezeptor oder Fibronectin an Fibronectinrezeptor, bei einer bestimmten Konzentration von PAI oder die Konzentration von PAI, die 50% Inhibierung verursacht, mindestens 2-fach geringer ist für die Fg oder vWF/GP IIb-IIIa Bindungsinhibierung als für die Bindungsinhibierung von Vironectin an Vitronectinrezeptor oder Fibronectin an Fibronectinrezeptor, wobei der Blutblättchen-Aggregationsinhibitor die allgemeine Formel hat,
worin K* ein Lysylrest der allgemeinen Formel ist,
worin jeder Rest R¹ unabhängig ein Wasserstoffatom, ein C₁ bis C₆ Alkylrest ist oder höchstens ein Rest R¹ ist R²-C=NR³,
worin R² ein Wasserstoffatom, ein C₁ bis C₆ Alkylrest, ein Phenyl- oder Benzylrest oder ein Phenyl- oder Benzylrest substituiert mit einem Alkyl- oder einem Phenylrest oder NR⁴ ₂ ist, wobei jeder Rest R⁴ unabhängig ein Wasserstoffatom oder ein C₁ bis C₆ Alkylrest ist und
R³ ein Wasserstoffatom, ein C₁ bis C₆ Alkylrest, ein Phenyl- oder Benzylrest ist oder R²-C=NR³ ein Rest ist ausgewählt aus:
wobei m eine ganze Zahl von 2–3 ist und jeder Rest R⁵ ist unabhängig ein Wasserstoffatom oder ein C₁ bis C₆ Alkylrest
und worin ein oder zwei CH₂-Reste ersetzt sein können durch O oder S vorbehaltlich, dass O oder S nicht benachbart zu einem anderen Heteroatom ist;
AA₁ ein neutraler, polarer oder nicht polarer Aminosäurerest ist, enthaltend 1–4 Kohlenstoffatome und n1 ist 0 oder eine ganze Zahl von 1–3,
AA₂ ein neutraler, nicht polarer, großer aromatischer oder nicht aromatischer oder ein polar aromatischer Aminosäurerest ist und n2 ist 0 oder eine ganze Zahl von 1–3,
AA₃ ein Prolinrest oder ein modifizierter Prolinrest der allgemeinen Formel ist
wobei ein oder zwei der Methylengruppen ersetzt sein können durch NR, S oder Ound wobei irgendein Stickstoffatom des Rings gegebenenfalls ersetzt sein kann mit einem nicht-interferierenden Substituenten und R ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest ist
und n3 0 oder 1 ist;
AA₄ ein neutraler Aminosäurerest enthaltend 1–4 Kohlenstoffatome oder die N-alkylierte Form hiervon ist und n4 0 oder eine ganze Zahl von 1–3 ist, jeder Rest X₁ und X₂ unabhängig ein Rest ist, fähig zur Bildung einer Bindung zwischen X₁ und X₂, um eine zyklische Komponente wie gezeigt zu bilden und
jeder Rest Y₁ und Y₂ unabhängig ein nicht-interferierender Substituent ist oder abwesend ist,
wobei ein oder mehrere Peptidbindungen gegebenenfalls ersetzt sein können durch einen alternativ bindenden Rest ausgewählt aus -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH- (cis oder trans), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- oder -CH₂SO-Resten mit der Maßgabe, dass, wenn n 0 ist entweder

1) die Summe von n2 und n4 mindestens 2 sein muss; oder
2) K* anders ist als Har (Homoarginin) oder K (Lysin); oder
3) einer oder mehrere Peptidbindungen ersetzt ist (sind) durch alternative Bindungsrest(e).

Weiter betrifft die Erfindung ein Blutblättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid ausgewählt aus:
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Inhibierung der Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa durch partiell gereinigte Schlangengifte.
2A, 2B und 2C zeigen die Dosis-abhängige Adhäsionsinhibierung von Centricon-10-Ultrafiltraten von rohem Schlangengift in Fibrinogen/GP IIb-IIIa und Vitronectin/Vitronectin- Rezeptor-Tests. Die Selektivität von Schlangengift-Peptiden in GP IIb-IIIa- und Vitronectin-Rezeptor-Bindungstests ist gezeigt. Sistrurus m. barbouri-Gift ist verwendet in 2A. Crotalus ruber-Gift ist verwendet in 2B. Crotalus basilicus-Gift ist verwendet in 2C.
3 zeigt das HPLC-Profil von rohem PAI aus Eristicophis macmahoni-Gift. Der querschraffierte Bereich enthält die biologisch aktiven Fraktionen.
4 zeigt das langsame Gradienten-HPLC-Profil der PAI-Fraktionen von 3. Der quer-schraffierte Bereich enthält die bioaktiven Fraktionen.
5 zeigt das analytische HPLC-Profil der PAI-Fraktionen aus 4, um gereinigtes PAI aus Eristicophis macmahoni-Gift zu zeigen.
6 zeigt die vollständige Aminosäuresequenzen von Eristicophin, Barbourin, Tergeminin, Cerastin, Ruberin, Lachesin, Cotiarin, Crotatroxin, Horridin, Lutosin, Viridin, Molossin, Basilicin, Durissin, Jararacin, Cereberin und Oreganin, und Enzymverdaufragmente, bestimmt durch den automatischen Edman-Abbau.
7 stellt das HPLC-Profil von PAI, erhalten aus G-50-Fraktionen von rohem Sistrurus c. tergeminus-Gift dar. Die quer-schraffierten Bereiche enthalten die bioaktiven Fraktionen.
8 stellt das HPLC-Profil von PAI-Fraktionen aus 7 dar, um gereinigtes PAI aus Sistrurus catenatus tergeminus-Gift zu zeigen.
9 zeigt die Aktivität von gereinigtem Tergemin PAI aus 8 bezüglich der Inhibierung der Bindung in verschiedenen Rezeptor-Assays.
10 zeigt das HPLC-Profil des Blutplättchen-Aggregations-Inhibitors, erhalten aus G-50-Fraktionen von rohem Sistrurus m. barbouri-Gift. Die quer-schraffierten Bereiche enthalten die bioaktiven Fraktionen.
11 zeigt das HPLC-Profil von aktiven PAI-Fraktionen aus 10, um gereinigtes PAI aus Sistrurus milarus barbouri-Gift zu zeigen.
12 vergleicht die Aminosäuresequenzen von einer Anzahl von Schlangengift-PAIs mit dem von Barbourin.
13 zeigt das HPLC-Profil von rohem PAI aus Lachesis mutas-Gift. Quer-schraffierte Bereiche enthalten die biologisch aktiven Fraktionen.
14 zeigt das langsame Gradienten-HPLC-Profil von PAI-aktiven Fraktionen aus 13. Quer-schraffierte Bereiche enthalten die biologisch aktiven Fraktionen.
15 zeigt das analytische HPLC-Profil von PAI-Fraktionen aus 14 aus Lachesis mutas, um gereinigtes PAI aus Lachesis mutas-Gift zu zeigen.
16 zeigt das HPLC-Profil von rohem PAI aus Crotalus viridis viridis-Gift. Quer-schraffierte Bereiche enthalten die biologisch aktiven Fraktionen.
17 zeigt das HPLC-Profil von den PAI-Fraktionen aus 16, um gereinigtes PAI aus Crotalus viridis viridis-Gift zu zeigen.
18 zeigt die Dosis-abhängigen Effekte von gereinigten Schlangengift-Peptiden, um die Fibrinogen/GP IIb-IIIa-Bindung zu inhibieren, verglichen mit Echistatin.
19A, 19B und 19C zeigen die Dosis-abhängigen Effekte von gereinigten Schlangengift-Peptiden, um die ADP (4 μM) induzierte menschliche Blutplättchen-Aggregation in Plättchen-reichem Plasma (PRP) zu inhibieren, verglichen mit Echistatin. 19A zeigt den Effekt von Sistrurus m. barbouri PAI-Barbourin. 19B zeigt den Effekt von Eristicophus macmahoni PAI-Eristicophin. 19C zeigt den Effekt von Echis carnitus PAI-Echistatin.
20 zeigt das Aktivitätsprofil der HPLC-Fraktionen von C. c. cerastes-Gift. Quer-schraffierte Bereiche enthalten biologisch aktive Fraktionen.
21 zeigt die Ergebnisse der HPLC-Analyse von den aktiven Fraktionen aus 20, um gereinigtes PAI aus Crotalus c. cerastes-Gift zu zeigen.
22 zeigt das Aktivitätsprofil der HPLC-Fraktion von PAI aus C. ruber ruber. Quer-schraffierte Bereiche enthalten die biologisch aktive Fraktion.
23 zeigt das Aktivitätsprofil einer analytischen C-18-Säule von homogenen Peptiden, erhalten aus C. atrox.
24 zeigt das analytische HPLC-Profil der homogenen Peptide, isoliert aus Bothrops cotiara.
25 zeigt die Dosis-abhängigen Effekte von gereinigtem Cotiarin auf die Inhibierung der Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa und die Inhibierung der Bindung von Vitronectin an den Vitronectin-Rezeptor.
26 zeigt die Effekte von gereinigten Schlangengift-Peptiden an der Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa und Vitronectin an den Vitronectin-Rezeptor. Die Werte zeigen die Konzentration von gereinigten Peptiden, die die Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa oder Vitronectin an den Vitronectin-Rezeptor bei 50% (IC₅₀) inhibiert. Das Symbol ">" zeigt, daß der IC₅₀ größer ist als dieser Wert, der die höchste zur Zeit untersuchte Konzentration ist. Man beachte, daß die Substitution des Arginin-Restes in der "RGDW"-Sequenz in Eristicophin durch ein Lysin (KGDW) eine Spezifität für die Inhibierung der Fibrinogenbindung an GP IIb-IIIa im Vergleich zu Vitronectin an den Vitronectin-Rezeptor vermittelt.
27 zeigt die Ergebnisse der Bindungsaktivität für das Analogon #1, [E²⁸L⁴¹C⁶⁴] Barbourin (28-73) hinsichtlich des GP IIb-IIIa und Vitronectin-Rezeptors.
28 zeigt die Fähigkeit des synthetischen Eristicophin-Analogons [K²⁹]-Eristocophin (4-51), die Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa zu inhibieren und die Unfähigkeit, die Bindung von Vitronectin an den Vitronectin-Rezeptor zu inhibieren.
29A und 29B zeigen die Fähigkeit von linearen und cyclischen RGDW-Verbindungen und linearen und cyclischen KGDW-Verbindungen der Inhibierung der Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa.
30A, 30B, 30C, 30D und 30E zeigen die Fähigkeit von verschiedenen KGDW-Analoga, die Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa zu inhibieren und die Bindung von Vitronectin an Vitronectin-Rezeptor zu inhibieren. 30A zeigt das Analogon #7. 30B zeigt das Analogon #8. 30C zeigt das Analogon #4. 30D zeigt das Analogon #5. 30E zeigt das Analogon #6.
31 zeigt die Fähigkeit von verschiedenen nativen und synthetischen Blutplättchen-Aggregationsinhibitoren, das Anlagern von M21 Melanoma-Zellen an Vitronectin zu inhibieren.
32 zeigt die Fähigkeit von RGDS und einer cyclischen RGD-Verbindung, die Anlagerung von M21 Melanoma-Zellen an Vitronectin zu inhibieren und das Fehlen der Fähigkeit von einem cyclischen KDGW-Analogon, die Anlagerung von M21 Melanoma-Zellen an Vitronectin zu inhibieren.
33 zeigt die Aktivität des Analogons Nummer 60, Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH₂ bei der Aggregationsinhibierung von Blutplättchen und Zelladhäsion an Vitronectin.
34 zeigt die Aktivitäten von 33 für das Analogon 19, Mpr-K-G-D-W-P-C-NH₂.
35 zeigt die Initiation der cyclischen Stromreduzierungen (CFRs) in einem offenen Thorax-Hund-Modell von Thrombose.
36 zeigt die Effekte einer 10 mg Bolus-Dosis-Verabreichung an dem CFRs, initiiert in dem offenen Thorax-Hund-Modell der Thrombose.
37 zeigt die Effekte von einer 40 mg Bolus-Dosis-Verabreichung von CFRs, initiiert in dem offenen Thorax-Hund-Modell der Thrombose.
38 zeigt die DNA-Sequenz voller Länge, die die Aminosäuresequenz von Barbourin (1-73) codiert.
39 zeigt die DNA-Sequenz, die [M¹, M⁴¹] Barbourin (1-73), ligiert an eine PhoA-Signalsequenz codiert.
40 zeigt die DNA-Sequenz, die das Analogon #1 [E²⁸, La⁴¹, C⁶⁴] Barbourin (28-73), verbunden mit einer PhoA-Signalsequenz für die Expression in Bakterien codiert.
41A und 41B zeigen Oligonucleotide zur Verwendung in einer PCR-Reaktion, um eine DNA zu erhalten, die das Analogon #1 codiert. Die Aminosäuren, die von dem Analogon per se umfaßt werden, sind in Fettdruck gezeigt.
42 zeigt die Verbindungssequenz von "tandem repeats" der Analog #1-codierenden DNA-Sequenz.
43A und 43B zeigen ein Diagramm des gekürzten Barbourin-Gens als "tandem repeats".
Modi zur Durchführung der Erfindung
Die Erfindung stellt Blutplättchen-Aggregationsinhibitoren (PAI-Verbindungen) bereit, die unter Verwendung von Standard-in vitro-Techniken, wie Festphasen-Peptidsynthese oder unter Verwendung von rekombinanten Verfahren oder Kombinationen von diesen Verfahren synthetisiert worden sind. Einige dieser Inhibitoren sind einzigartig spezifisch für die Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation und inhibieren nicht alternierende Bindungen innerhalb der Integrin-Familie. Andere besitzen verschiedene Bereiche der Spezifität. Die nachstehenden Abschnitte beschreiben die Isolierung von natürlich vorkommenden PAI-Verbindungen aus Schlangengift, das Design von Inhibitoren, die ein wesentlich höheres Potential der Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation zeigen, als eine Inhibierung z.B. von Vitronectin/Vitronectin-Rezeptor-Wechselwirkungen durch Einfügen einer K*GD-Sequenz anstelle von RGD, Verfahren zur Synthese dieser Peptide, Verfahren zur rekombinanten Herstellung, Antikörper, die die erfindungsgemäßen Peptide binden, Testverfahren, die es erlauben, Schlangengifte, die PAI enthalten, zu identifizieren und die Verwendung von den erfindungsgemäßen PAI-Verbindungen als Arzneimittel.
PAI bezeichnet einen Faktor, der in der Lage ist, die Aggregation von stimulierten Blutplättchen in Standard-Tests zu verhindern, z.B. solche, die von Gan, Z.-R. et al., und Huang, T.-F. et al., supra beschrieben sind. In diesen Tests werden gewaschene Blutplättchen kombiniert mit Fibrinogen, Calcium⁺² und dem zu testenden Material. Blutplättchen werden mit ADP (oder anderen bekannten Stimulatoren oder Kombinationen dieser) stimuliert und die Aggregation (oder das Fehlen hiervon) wird unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Aggregometers beobachtet.
Einige der erfindungsgemäßen PAI sind als spezifisch bezüglich der Inhibierung der Bindung von Fibrinogen und/oder vWF an GP IIb-IIIa identifiziert worden. Spezifität wird als Grad der Abstufung verstanden, so daß eine PAI-Verbindung die "spezifisch für die Inhibierung von Fg oder vWF-Bindung an GP IIb-IIIa" ist, diese Bindung wesentlich stärker inhibiert als die Bindung von Fn an FnR oder Vn an VnR. Mit dem Begriff "im wesentlichen stärker" ist gemeint, daß entweder die %-Inhibierung bei einer vorgegebenen Konzentration von PAI mindestens zweifach größer ist oder daß die Konzentration von PAI, die die 50%-Inhibierung bewirkt, für die Fg- oder vWF/GP IIb-IIIa-Bindungsinhibierung mindestens zweifach niedriger ist als für die alternierende Ligand/Rezeptor-Bindung.
Isoliertes natives PAI und Reinigungsverfahren
Die beanspruchten Blutplättchen-Aggregationsinhibitoren (PAI) schließen niedermolekulargewichtige Peptide, die in isolierter Form (wie nachstehend beschrieben) aus Schlangengift, das als "aktiv" identifiziert worden ist, hergestellt werden können, d.h. es ist unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Verfahren gefunden worden, daß es PAI enthält.
Das Verfahren erlaubt eine leichte Identifizierung und Charakterisierung des Vorliegens von einem effektiven PAI in Schlangengift, das selektiv die Bindung an GP IIb-IIIa, verglichen mit anderen Integrinen, inhibiert, z.B. die Bindung an den Vitronectin-Rezeptor und den Fibronectin-Rezeptor, vorausgesetzt, dass solche PAIs von dem Anspruch umfasst sind. Nach dieser Identifizierung und der wahlweisen und optimalen Charakterisierung kann das PAI isoliert und unter Verwendung einer Vielzahl von Standard-Techniken gereinigt werden, die nachstehend und im Stand der Technik beschrieben sind. Zum Beispiel kann eine Kombination von Auftrennungen, basierend auf dem Molekulargewicht (typischerweise Zurückgewinnung von Substanzen < 10 kd), Ionenaustauscherchromatographie und Umkehrphasen-HPLC, verwendet werden. Andere Techniken können ebenfalls eingesetzt werden. Ein Verfahren, das auf PAI aus einem beliebigen aktiven Schlangengift anwendbar ist, ist wie folgt:
Etwa 10–1000 mg Gift wird in verdünnter Essigsäure aufgelöst und auf eine Größenfraktionierungssäule aufgebracht, wie z.B. Sephadex G-50 und mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert. Fraktionen werden unter Verwendung des Fg/GP IIb-IIIa-Bindungstest der Erfindung, eines Standard-Blutplättchen-Aggregationstests (PAA) oder irgendeinem ähnlichen Test, der auf der adhäsiven Proteinbindungsaktivität von GP IIb-IIIa beruht, auf ihre Aktivität untersucht. Alternativ kann die < 10 kd Fraktion der Fraktion des Gifts durch Ultrafiltration wiedergewonnen werden und auf ähnliche Weise getestet werden.
Die Nieder-MW-Fraktion, die durch eines der beiden Verfahren isoliert wurde, wird dann auf eine präparative C-18 HPLC-Säule aufgebracht, wie z.B. eine C-18 Delta-Pak-Umkehrphasen-HPLC-Säule, erhältlich von Waters, präequilibriert in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA)/8% Acetonitril. Das adsorbierte PAI wird danach unter Verwendung eines Gradienten aus 8%–60% Acetonitril in 0,1% TFA eluiert. Das Gefälle des Gradienten und die Fließrate werden unter Verwendung von Routineverfahren optimiert. Aktive Fraktionen werden durch PAA oder durch das erfindungsgemäße Rezeptorbindungsverfahren bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden dann vereinigt, konzentriert und auf ihre Homogenität unter Verwendung der analytischen HPLC oder SDS-PAGE getestet. Weitere Umkehrphasen-HPLC-Gradientenreinigungen werden angewendet, bis das wiedergewonnene PAI homogen ist.
Gereinigte PAIs können unter Verwendung von Standardverfahren sequenziert werden. Dies erlaubt die Synthese unter Verwendung von Standard-Festphasen-Techniken (insbesondere für kürzere Formen von PAIs) oder eine rekombinante Herstellung. Zum Beispiel kann ein Applied Biosystems Sequenator im Anschluß an die Carboxyamido-Methylierung oder Pyridylethylierung der Peptide, wie bei Huang et al., J. Biol. Chem., 262, 1987, 16157–16163 beschrieben, gefolgt von einer Entsalzung der Proben auf einer C-18 Delta Pak-Säule unter Verwendung von 0,1% TFA und Acetonitril, verwendet werden.
Das isolierte PAI, dessen Sequenz bestimmt ist, kann bei der Synthese in vitro durch Sequenzveränderungen modifiziert werden, die die Aktivität nicht zerstören. Im allgemeinen werden diese modifizierten Formen von den nativen Formen um 1-10, vorzugsweise 1-4 Aminosäuresubstitutionen abweichen oder werden verkürzte Formen haben. Zusätzlich können eine oder mehrer Peptidbindungen durch alternierende Bindungen ersetzt werden, wie nachstehend beschrieben. Eine besonders bevorzugte Substitution ist die Ersetzung von RGD durch K*GD, um eine GP IIb-IIIa-Spezifität zu verleihen, wie nachstehend beschrieben.
Das PAI von Sistrurus m. barbouri ist zur Homogenität aufgereinigt und sequenziert worden und als Barbourin bezeichnet worden. Anders als die adhäsiven Proteine von GP IIb-IIIa, die bisher identifiziert worden sind und die Peptide von Schlangengiften, die die GP IIb-IIIa-Funktion blockieren, enthält Barbourin nicht die Standard Arg-Gly-Asp Sequenz der bekannten adhäsiven Proteine. Die scheinbare Bindungssequenz in Barbourin ist Lys-Gly-Asp-(Trp). Das Vorhandensein der KGD-Sequenz in der vermutlichen Bindungsregion dieses Peptids ist besonders überraschend hinsichtlich der Beobachtung, daß das Ersetzen von Arg durch Lys in kleinen synthetischen Peptiden, basierend auf der RGDX-Sequenz, die Fähigkeit dieser Peptide an die Integrin-Rezeptoren stark herabsetzt (Pierschbacher et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 1984, 5985–5988; Williams et al., Thromb. Res., 46, 1987, 457–471; Huang et al., J. Biol. Chem., 262, 1987, 16157–16163). Es wird angenommen, daß diese Substitution teilweise für die Spezifität des Barbourin-Peptids verantwortlich ist, die Fg und vWF-Bindung an GP IIb-IIIa im Gegensatz zur Inhibierung der Vitronectin-Bindung an den Vitronectin-Rezeptor zu inhibieren.
K*GDX-enthaltende Peptide
Die "Barbourin"-Peptide besitzen die Bindungssequenz KDGX im Gegensatz zu der RGDX-Sequenz, die in den bekannten PAI-Verbindungen vorgefunden wird. Das Vorhandensein der KGDX-Sequenz in dieser PAI-Sequenz scheint mit einer bevorzugten Affinität für GP IIb-IIIa, im Gegensatz zu den Vitronectin- oder Fibronectin-Rezeptoren assoziiert zu sein. Der Effekt der Substitution eines Arginin-Restes durch einen Lysyl-Rest in der Sequenz scheint mit einer gesteigerten Länge der Seitenkette zusammen mit einer Beibehaltung der Basiszität des Stickstoffs assoziiert zu sein, wie es weiter nachstehend beschrieben wird. Überraschenderweise zeigt sich, daß nicht der Lysylrest per se für die gesteigerte Aktivität und Spezifität verantwortlich ist, sondern der Abstand, der durch diese homologe Verlängerung durch die Ersetzung des Arginin-Restes bereitgestellt wird. Daher sind die erfindungsgemäßen Peptide, die K*GDX in der Bindungssequenz enthalten, wesentlich stärker in der Lage, die Bindung von Fg oder vWF an GP IIb-IIIa zu inhibieren, verglichen mit ihrer Fähigkeit, die Bindung von Vitronectin an den Vitronectin-Rezeptor und die Bindung an den Fibronectin-Rezeptor zu inhibieren. Wie vorstehend beschrieben bedeutet "wesentlich stärker" zur Inhibierung der bevorzugten Bindung fähig zu sein, daß der Prozentsatz der Inhibierung bei einer gegebenen Konzentration des Inhibitors mindestens zweifach größer ist oder daß die Konzentration von PAI, die 50% Inhibierung verursacht, für die Bindung von Fg oder vWF an GP IIb-IIIa, als für die Bindung von alternativen Liganden an andere Integrine mindestens zweifach niedriger ist.
Wie hierin verwendet bezeichnet K* einen Lysylrest, der unsubstituiert ist oder der Substitutionen der Wasserstoffatome an der Epsilon-Aminogruppe enthält. Diese Substituenten müssen ausreichende Elektronen-Donatoren sein, um die Basiszität des Stickstoffatoms, an dem sie gebunden sind, aufrechtzuerhalten. Daher ist K* ein Lysylrest der allgemeinen Formel (R¹)₂ N(CH₂)₄-CH(NH-)CO-, wobei jeder Rest R¹ unabhängig ein Wasserstoffatom, ein C1-6-Alkylrest ist oder höchstens ein R¹ ist R²-C=NR³, wobei der Rest R² ein Wasserstoffatom, ein C1-6-Alkylrest oder ein substituierter oder unsubstituierter Phenyl- oder Benzylrest ist oder NR⁴ ₂ ist, wobei jeder Rest R⁴ unabhängig ein Wasserstoffatom oder ein C1-6-Alkylrest ist und
R³ ein Wasserstoffatom, ein C1-6-Alkylrest oder ein Phenyl- oder Benzylrest ist oder R²-C=NR³ ein Rest ist, ausgewählt aus
wobei m eine ganze Zahl von 2–3 ist und jeder Rest R⁵ unabhängig ein Wasserstoffatom oder ein C1-6-Alkylrest ist und wobei 1 oder 2 CH₂-Reste ersetzt sind durch O oder S, mit der Maßgabe, daß O oder S nicht benachbart zu einem anderen Heteroatom sind.
"Alkyl" wird konventionell als eine gerade oder verzweigte Kette oder ein Ring von Kohlenwasserstoffresten der angegebenen Anzahl von Kohlenstoffatomen, wie Methyl-, Ethyl-, Isopropyl-, N-Hexyl-, 2-Methylbutyl-, Cyclohexylreste und dergleichen definiert.
Die Benzyl- und Phenylreste, dargestellt durch den Rest R2, können unsubstituiert oder durch nicht-interferrierende Substituenten substituiert sein. Bevorzugte Substitutionsmuster sind solche, in denen nur ein Substituent an den aromatischen Kern gebunden ist, vorzugsweise in der 4-Position. Bevorzugte Substituenten sind Elektronen-Donator-Substituenten wie Alkyl-, insbesondere Ethyl- oder Methyl- oder Phenylreste.
Bevorzugte Ausführungsformen von K* schließen Lysin-, Homoarginin-, Formylhomoarginin-, Ornithin-, Acetimidyllysin-, N^GN^G-Ethylen-Homoarginin- und Phenylimidyllysinreste ein. Der Phenylimidyllysylrest hat beispielsweise die Formel: Ph-C(=NH)-NH(CH₂)₄CH(NH-)CO-.
Da ein wesentliches Merkmal der bevorzugten Inhibierung der Bindung in der Substitution von K* für R in der RGDX-Sequenz zu liegen scheint, umfasst eine Klasse von Peptiden oder Peptid-verwandten Verbindungen der vorliegenden Erfindung natürlich vorkommende Blutplättchen-Aggregationsinhibitoren, die ursprünglich RGDX in der Bindungssequenz enthalten, wobei diese Formen durch die Substituierung von R durch K* in dieser Sequenz modifiziert werden. Eingeschlossen in dieser Erfindung sind native Peptide mit dieser Substitution sowie Fragmente davon, die eine ausreichende Länge haben, um die selektive Inhibierung der Bindung der adhäsiven Proteine an GP IIb-IIIa zu bewirken und Fragmente oder Peptide mit voller Länge, die irrelevante Substitutionen an Positionen des Peptids haben, die deren Aktivität nicht zerstörten. Größtenteils werden die Fragmente Reste enthalten, die einer Länge einer Peptidkette von mindestens 7 Aminosäuren entsprechen, wenn die Konformation, z.B. durch Cyclisierung, kontrolliert wird und sie werden von größerer Länge sein, wenn eine derartige Konformationskontrolle nicht vorliegt. Im allgemeinen werden neben der notwendigen K*GDX-Sequenz 1-10, vorzugsweise 1-4 und besonders bevorzugt 1-3 Aminosäure-Substitutionen in dem Teil des Peptids sein, der nicht die K*GDX-Sequenz enthält. Die PAIs, die in diesem Abschnitt beschrieben sind, sind von der Erfindung eingeschlossen, jedoch nur, wenn sie von den Ansprüchen umfasst sind.
Zusätzlich kann das G von RGDX oder K*GDX ersetzt werden durch einen Sarkosinrest.
Zusätzlich können eine oder mehrere Peptidbindungen durch alternative Bindungen optional ersetzt werden, wie z.B. solche, die durch Reduktion oder Eliminierung erhalten werden. Da her können eine oder mehrere der -CONH-Peptidbindungen mittels bekannter Verfahren durch andere Arten von Resten ersetzt werden, wie -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH- (cis und trans), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- und -CH₂SO-. Die folgenden Referenzen beschreiben die Herstellung von Peptidanaloga, die diese alternativen Bindungsreste enthalten: Spatola, A. F., Vega Data (März 1983), Vol. 1, Band 3, "Peptide Backbone Modifications" (Übersichtsartikel); Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins", B. Weinstein, Ed., Marcel Dekker, New York, Seite 267 (1983) (Übersichtsartikel); Morley, J. S., Trends Pharm. Sci. (1980), Seiten 463–468 (Übersichtsartikel); Hudson, D. et al., Int. J. Pept. Prot. Res., 14, 1979, 177–185 (-CH₂NH-, CH₂CH₂-); Spatola, A. F. et al., Life Sci., 38, 1986, 1243–1249 (-CH₂-S); Hann, M. M., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I., 1982, 307–314 (-CH-CH-, cis und trans); Ahnquist, R. G. et al., J. Med. Chem, 23, 1980, 1392–1398 (-COCH₂-); Jennings-White, C. et al., Tetrahedron Lett., 23, 1982, 2533 (-COCH₂-); Szelke, M. et al., EP-A-45665 CA: 97: 39405 (1982) (-CH(OH)CH₂-); Holladay, M. W. et al., Tetrahedron Lett., 24, 1983, 4401–4404 (-C(OH)CH₂-) und Hruby, V. J., Life Sci., 31, 1982, 189–199 (-CH₂-S-). Insbesondere bevorzugt ist -CH₂NH-.
Beispiele von Fragmenten und/oder modifizierten Formen des natürlich vorkommenden Schlangengift-PAIs schließen ein [E²⁸, L⁴¹, C⁶⁴] Barbourin (28-73) der Sequenz
und [K²⁹] Eristicophin (4-51) der Sequenz
In dieser Bezeichnung ist die Größe des Fragments in runden Klammern nach dem Namen durch die Zahl der Aminosäuren angegeben, die in diesem Fragment eingeschlossen sind und die in eckigen Klammern stehenden Buchstaben und Zahlen geben die Aminossäure-Substitutionen an den bezeichneten Positionen in dem nativen Peptid der vollen Länge an. Das heißt für das vorstehende Barbourin-Fragment, daß die Länge des Fragments die Reste 28-73 der nativen Sequenz umspannt und daß die Aminosäuren ursprünglich an den Positionen 28, 41 und 64 der nativen Sequenz durch Glu (E), Leu (L) und Cys (C) ersetzt worden sind.
Als zusätzliche Beispiele kann der Argininrest der RGD-Sequenz, der in Trigramin, Elegantin, Albolabrin, Crotatroxin, Flavoviridin, Echistatin, Bitistatin, Viridin, Molossin, Luto sin, Basilicin, Applagin, Halysin, Horridin, Tergeminin, Lachesin, Cotiarin, Cereberin, Jararacin, Kistrin, Eristicophin, Bitan-a und Ruberin/Oreganin vorkommt, durch einen K*-Rest ersetzt werden, um spezifisch aktive PAIs mit einer bevorzugten Affinität für GP IIb-IIIa bereitzustellen. Zusätzlich können gekürzte Formen dieser Peptide, enthaltend mindestens 20, vorzugsweise mindestens 30 und insbesondere bevorzugt mindestens 40 Aminosäuren von den nativen Peptiden oder in dieser modifizierten Form hergestellt werden. Zusätzlich oder alternativ können 1-10, vorzugsweise 1-4 Aminosäuren unabhängig von der RGD/K*GD-Sequenz substituiert oder modifiziert werden, vorzugsweise durch konservative Aminosäure-Substitutionen. Unter konservativen Aminosäure-Substitutionen wird beispielsweise die Substitution eines sauren Aminosäurerestes für einen sauren Aminosäurerest, einen neutralen für einen neutralen, einen basischen für einen basischen, etc., verstanden, wie nachstehend weiter beschrieben. Die PAIs, die in diesem Abschnitt beschrieben sind, sind von der Erfindung eingeschlossen, jedoch nur, wenn sie von den Ansprüchen umfasst sind.
Eine weitere Gruppe von Beispielen schließt solche ein, bei denen der Glycylrest von RGD oder K*GD durch einen Sarkosylrest bei Beibehaltung der Aktivität ersetzt werden kann. Daher können die aktiven PAIs, die isoliert und/oder modifiziert worden sind, auf anderem Wege, wie vorstehend beschrieben, weiter durch diese Substitution modifiziert werden.
Während Fragmente und/oder modifizierte PAIs aus Schlangengift, vorausgesetzt sie sind von den Ansprüchen umfasst, Fg/vWF/GP IIb-IIIa-bindungsspezifische Verbindungen der Erfindung durch Ersetzen von RGD durch K*GD sind, basieren spezifisch aktive Peptide in weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsformen auf kompatiblen Verlängerungen der K*DG-Sequenz per se, vorausgesetzt sie sind von den Ansprüchen umfasst. In dieser Hinsicht ist eine bevorzugte Gruppe von Peptiden oder Peptid-verwandten Verbindungen der Erfindung cyclische Peptide der allgemeinen Formel:
worin K* ein substituierter oder unsubstituierter Lysylrest, wie in Anspruch 10 definiert, ist;
AA₁ ein kleiner, neutraler (polarer oder nicht polarer) Aminosäurerest ist und n1 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist;
AA₂ ein neutraler, nicht polarer, großer (aromatischer oder nicht aromatischer) oder ein polararomatischer Aminosäurerest ist und n2 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist;
AA₃ ein Prolinrest oder ein modifizierter Prolinrest und n3 Null oder 1 ist;
AA₄ ein neutraler, kleiner Aminosäurerest ist oder die N-alkylierte Form hiervon ist und n4 Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist;
jeder Rest X₁ und X₂ unabhängig ein Rest ist, der zur Bildung einer Bindung zwischen X₁ und X₂ fähig ist, um eine cyclische Komponente, wie gezeigt, zu bilden;
und jeder Rest Y₁ und Y₂ unabhängig ein nicht-interferierender Substituent ist oder abwesend ist;
wobei eine oder mehrere Peptidbindungen gegebenenfalls ersetzt sein können durch einen alternativ bindenden Rest, ausgewählt aus -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH- (cis und trans), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- und -CH₂SO-Resten, mit der Maßgabe, daß, wenn n3 Null ist, entweder:

1) die Summe von n2 und n4 mindestens 2 sein muß; oder
2) K* anders ist als Har oder K; oder
3) einer oder mehrere Peptidbindungen ersetzt ist (sind) durch alternative Bindungsrest(e).

Y₁ und Y₂ können Peptidverlängerungen von 0-25 Aminosäureresten sein und können derivatisiert sein. Die Y₁ N-terminalen Verlängerungen können z.B. acetyliert oder auf andere Weise acyliert sein, die Y₂ C-terminale Verlängerung kann amidiert sein mit NH₂ oder mit einem primären oder sekundären Amin der allgemeinen Formel R-NH₂ oder R₂NH, wobei jeder Rest R unabhängig ein Niederalkylrest mit 1-4 C-Atomen, wie ein Methyl-, n-Butyl- oder t-Butylrest ist. Y₁ kann ebenfalls ein Wasserstoffatom oder ein Acylrest sein, Y₂ kann eine OH-Gruppe, oder ein NH₂-Rest oder ein Amin, wie vorstehend beschrieben, sein. Wenn die Verbindung der allgemeinen Formel (1) ein einfaches cyclisches Peptid ist, fehlen Y₁ und Y₂.
X₁ und X₂ sind typische Aminosäurereste, die zur Cyclisierung fähig sind, wie z.B. und besonders bevorzugt, Cystinreste, die fähig sind einen Disulfidring zu bilden. Jedoch können andere Reste, die fähig sind, Disulfid- oder andere Bindungen zu bilden, ebenfalls verwendet werden, z.B. der Pen (Penicillamin)-Rest, beschrieben von Pierschbacher et al., supra, oder der Mpr (Mercaptopropionyl)- oder Mvl (Mercaptovaleryl)-Rest. Andere Arten von kovalenten Bindungen zur Cyclisierung, die ebenfalls in Betracht gezogen werden, schließen Peptidbindungen ein, die beispielsweise ein Amid, gebildet zwischen den Seitenketten der Aminogruppe eines Lysylrestes, mit einer Seiten-Carboxylgruppe eines Glutamylrestes und Esterbindungen, wie die, die gebildet werden zwischen Seitenketten -OH-Gruppe eines Threoninrestes mit einer Seitenketten-Carboxylgruppe eines Aspartylrestes. Jeder kompatible Rest, der zur Bildung von Peptidbrücken mit dem verbleibenden Teil der Kette (oder modifizierte Peptidbindungen, wie vorstehend beschrieben) und zur Bildung von kovalenten Bindungen, um eine Cyclisierung zu bewirken, fähig ist, kann verwendet werden. Dieses umfasst z.B. einfache cyclische Peptide, wobei eine Peptidbindung direkt gebildet wird zwischen dem NH₂-Rest des N-Terminus und der COOH-Gruppe am C-Terminus.
Wie vorstehend beschrieben können eine oder mehrere der angegebenen Peptidbindungen ersetzt werden durch eine substituierte Bindung, wie -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH- (cis und trans), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- und -CH₂SO-.
In der Bezeichnung der vorstehenden Aminosäurereste AA₁-AA₄ ist Bezug genommen worden auf eine Klassifizierungsmethode, bei der die Aminosäurereste in vier große Unterklassen eingeteilt werden. Diese Klassifizierung ist schematisch nachstehend gezeigt.
Sauer: Der Rest hat eine negative Ladung aufgrund der Abgabe eines Wasserstoffions bei physiologischem pH und der Rest wird angezogen von einer wäßrigen Lösung, so daß er die Oberflächenpositionen in der Konformation eines Peptids, in der er enthalten ist, einnimmt, wenn das Peptid in wäßrigem Medium bei physiologischem pH vorliegt.
Basisch: Der Rest hat eine positive Ladung aufgrund der Anlagerung eines Wasserstoffions bei physiologischem pH-Wert und der Rest wird angezogen von einer wäßrigen Lösung, so daß er die Oberflächenpositionen in der Konformation eines Peptids einnimmt, in der er enthalten ist, wenn das Peptid in einem wäßrigen Medium bei physiologischem pH vorliegt.
Neutral/nicht-polar: Die Reste sind nicht geladen bei einem physiologischen pH und der Rest wird durch eine wäßrige Lösung abgestoßen, so daß er die inneren Positionen in der Konformation eines Peptids, in dem er enthalten ist, einnimmt, wenn das Peptid in einem wäßrigen Medium vorliegt. Diese Reste werden hier auch als "hydrophob" bezeichnet.
Neutral/polar: Die Reste sind nicht geladen bei einem physiologischen pH, aber der Rest wird angezogen durch eine wäßrige Lösung, so daß er die äußeren Positionen in der Konformation eines Peptids, in dem er enthalten ist, einnimmt, wenn das Peptid in einem wäßrigen Medium vorliegt.
Es wird davon ausgegangen, daß in einer statistischen Sammlung von individuellen Resten einige Moleküle geladen und einige nicht geladen sind und es wird eine Anziehung oder Abstoßung von dem wäßrigen Medium in einem größeren oder schwächeren Ausmaß geben. Die Definition "geladen" bedeutet einen signifikanten Prozentsatz (mindestens etwa 25%) der individuellen Moleküle, die bei physiologischem pH geladen sind. Der Grad der Anziehung oder Abstoßung, der für die Klassifizierung in polar oder nicht-polar erforderlich ist, ist willkürlich und daher sind die spezifisch in Betracht gezogenen Aminosäuren der Erfindung der einen oder anderen Klasse zugeordnet worden. Die meisten nicht spezifisch aufgeführten Aminosäuren können in bekannter Art klassifiziert werden.
Aminosäurereste können ferner als cyclisch oder nicht-cyclisch und aromatisch oder nicht-aromatisch, selbsterklärende Klassifizierung hinsichtlich der Seitenketten-Substitutionsgruppen der Reste und als klein oder groß subklassifiziert werden. Ein Rest wird als klein betrachtet, wenn er eine Gesamtzahl von 4 Kohlenstoffatomen oder weniger enthält, einschließlich des Carboxyl-Kohlenstoffs. Kleine Aminosäuren sind immer nicht-aromatisch. Für die natürlich vorkommenden Protein-Aminosäuren ist die Subklassifikation entsprechend dem vorstehenden Schema wie folgt (siehe auch das nachstehende Diagramm).

Sauer: Asparaginsäure und Glutaminsäure;
Basisch/nicht-cyclisch: Arginin, Lysin;
Basisch/cyclisch: Histidin;
Neutral/polar/klein: Glycin, Serin und Cystein;
Neutral/polar/groß/nicht-aromatisch: Threonin, Asparagin, Glutamin;
Neutral/polar/groß/aromatisch: Tyrosin;
Neutral/nicht-polar/klein: Alanin;
Neutral/nicht-polar/groß/nicht-aromatisch: Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin;
Neutral/nicht-polar/groß/aromatisch: Phenylalanin und Tryptophan.

Die Aminosäure Prolin, obgleich formal innerhalb der Gruppe neutral/nicht-polar/groß/cyclisch und nicht-aromatisch, ist ein spezieller Fall hinsichtlich ihres bekannten Effekts auf die sekundäre Konformation der Peptidketten und ist daher nicht in diese definierten Gruppen eingeschlossen, sondern wird separat klassifiziert. AA₃ ist ein Prolinrest oder ein "modifizierter Prolinrest". Prolin ist ein 5-gliedriger Stickstoff Heteroring mit einer Carboxylgruppe in der 2-Position. Modifizierte Prolinreste sind alle 5- oder 6-gliedrige Stickstoff-enthaltende Heteroringe mit Carboxylgruppen in der Position alpha zu dem Stickstoff. Zusätzliche heterocyclische Atome können ebenfalls in den Ring eingeschlossen sein. Daher schließen modifizierte Prolinreste von Reste von Pipecolinsäure (Piperidin-2-carbonsäure, Abkürzung Pip) und Thiazolidin (Thz) ein. Prolin oder modifizierte Prolinreste haben die allgemeine Formel
wobei eine oder zwei der Methylengruppen ersetzt sein können durch NR, S oder O und
wobei irgendein Stickstoffatom des Rings gegebenenfalls ersetzt sein kann mit einem nicht-interferierenden Substituenten und R ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest ist.
Bestimmte allgemein auftretende Aminosäuren, die nicht durch den genetischen Code codiert werden, schließen z.B. ein beta-Alanin (beta-Ala) oder andere omega-Aminosäuren, wie 3-Aminopropionsäure, 4-Aminobutyrsäure, und so weiter, alpha-Aminoisobutyrsäure (Aib), Sarkosin (Sar), Ornithin (Orn), Zitrullin (Cit), Homoarginin (Har), t-Butylalanin (t-BuA), t-Butylglycin (t-BuG), N-Methylisoleucin (N-MeIle), Phenylglycin (Phg) und Cyclohexylalanin (Cha), Norleucin (Nle), Cysteinsäure (Cya), Pipecolinsäure (Pip), Thiazolidin (Thz), 2-Naphthylalanin (2-Nal) und Methioninsulfoxid (MSO). Diese werden ebenfalls in bestimmte Kategorien eingeordnet.
Basierend auf der vorstehenden Definition sind
Sar und Beta-ala neutral/nicht-polar/klein;
t-BuA, t-BuG, N-MeIle, Nle und Cha sind neutral/nicht-polar/groß/nicht-aromatisch;
Har und Orn sind basisch/nicht-cyclisch;
Cya ist sauer;
Cit, Acetyl Lys und MSO sind neutral/polar/groß/nicht-aromatisch;
2-Nal und Phg sind neutral/nicht-polar/groß/aromatisch; und
Pip und Thz sind modifizierte Prolinreste.
Das Vorstehende ist im folgenden graphisch dargestellt:
Aminosäure-Klassifikationsschema
Die verschiedenen Omega-Aminosäuren sind entsprechend der Größe als neutral/nicht-polar/klein (beta-ala, d.h. 3-Aminopropionsäure, 4-Aminobuttersäure) oder große (alle anderen) klassifiziert.
Andere Aminosäuresubstitutionen für solche, die genetisch codiert sind, können ebenfalls in die erfindungsgemäßen Peptidverbindungen eingeschlossen werden und können gemäß diesem allgemeinen Schema klassifiziert werden.

In den Formeln, die ausgewählte spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen, haben die Amino- und Carboxy-terminalen Gruppen, obwohl es nicht immer angegeben ist, die Form, die sie bei physiologischen pH-Werten haben, wenn es nicht anders angegeben ist. Daher ist der Amino-Terminus und der Carboxy-Terminus bei einem physiologischen pH geladen und ist vorhanden, obwohl er nicht notwendigerweise spezifiziert und gezeigt ist, sowohl in spezifischen Beispielen, als auch in allgemeinen Formeln. Die basischen und sauren Additionssalze einschließlich derer, die bei nicht-physiologischen pH-Werten gebildet werden, sind ebenfalls in den erfindungsgemäßen Verbindungen eingeschlossen. Wenn nicht anders vermerkt, sind die Reste in der L-Form. In den allgemeinen Formeln können die spezifischen Reste entweder in der L- oder D-Form vorliegen. Im allgemeinen haben die erfindungsgemäßen Peptide 0, 1 oder 2 D-Reste eingeschlossen, bevorzugt 0 oder 1 und besonders bevorzugt 0. In den gezeigten Peptiden ist jeder codierte Rest im Ein-Buchstaben-Code dargestellt, entsprechend der konventionellen nachstehenden Liste:

Aminsäuren	Ein-Buchstaben-Code
Alanin	A
Arginin	R
Asparagin	N
Asparaginsäure	D
Cystein	C
Glutamin	Q
Glutaminsäure	E
Glycin	G
Histidin	H
Isoleucin	I
Leucin	L
Lysin	K
Methionin	M
Phenylalanin	F

Prolin	P
Serin	S
Threonin	T
Tryptophan	W
Tyrosin	Y
Valin	V
Pyroglutaminsäure	Z

Die Aminosäuren, die nicht genetisch codiert werden, werden abgekürzt, wie vorstehend angegeben.
In den spezifischen Peptiden, die in der vorliegenden Anmeldung dargestellt sind, ist die L-Form jedes Aminosäurerestes mit einem optischen Isomer gemeint, soweit es nicht ausdrücklich anders durch ein hochgestelltes Kreuz (T) angegeben ist. Während die Reste der erfindungsgemäßen Peptide normalerweise in der natürlichen L-Form der optischen Isomere vorkommen, können eine oder zwei, bevorzugt eine Aminosäure ersetzt werden durch die D-Form der optischen Isomere.
Frei funktionelle Gruppen einschließlich der an dem Carboxy- oder Amino-Terminus können ebenfalls durch Amidierung, Acylierung oder andere Substitutionen modifiziert werden, die z.B. die Löslichkeit der Verbindungen verändern, ohne ihre Aktivität zu beeinflussen.
Bei der Bildung von amidierten Peptiden der vorliegenden Erfindung können die Analog-Verbindungen direkt synthetisiert werden, z.B. unter Verwendung von Boc-AA_x-pMBHA-Harz oder Boc-AA_x-BHA-Harz, wobei AA_x die ausgewählte Carboxy-terminale Aminosäure des gewünschten Peptids ist, wie nachstehend beschrieben. Alternativ können die erfindungsgemäßen Peptide auch chemisch oder enzymatisch amidiert werden nach der Peptidsynthese unter Verwendung von bekannten Mitteln oder hergestellt werden durch Standard-Lösungs-Phasen-Peptidsynthese-Protokolle.
Gewisse Ausführungsformen der de novo-Peptide der Erfindung sind bevorzugt. In der K*(G/Sar)D-Sequenz ist G/Sar bevorzugt G. AA₁ und AA₄ sind bevorzugt Gly, Ala oder Ser; n1 ist bevorzugt 0-2, n4 ist bevorzugt 1-2. Bevorzugt für AA₂ sind neutrale/nicht-polare/aromatische Aminosäuren, insbesondere Tryptophan, Phenylalanin, Leucin, Thyrosin oder Valin, insbesondere Tryptophan; n2 ist bevorzugt 1. X₁ und X₂ sind bevorzugt Cys, Mpr oder Pen (Penicillamin)-Reste. Y₁ ist bevorzugt H, Acetyl oder Gly; Y₂ ist bevorzugt -NH₂ oder -A-NH₂. Ebenfalls bevorzugt sind im allgemeinen C-terminale amidierte Formen von Y₂.
Somit sind bevorzugte PAI-Analoga der Erfindung Peptide der folgenden Formeln ein. Obgleich alle diese in der Lage sind, durch Bildung von Disulfid-Bindungen in cyclischer Form vorzuliegen, sind diese Bindungen nicht im einzelnen angegeben. Andere cyclische Formen sind durch "cyclo" angegeben.
Bevorzutge Peptide
Besonders bevorzugt sind Peptide der Formeln
Chemische Synthese von erfindungsgemäßen Peptiden
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch bekannte Verfahren chemisch synthetisiert werden, z.B. durch Festphasen-Peptidsynthese. Die Synthese beginnt am Carboxy-terminalen Ende des Peptids unter Verwendung einer alpha-Amino-geschützten Aminosäure. Es können t-Butyloxycarbonyl (Boc)-Schutzgruppen für alle Aminogruppen verwendet werden, obgleich andere Schutzgruppen, wie Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) ebenfalls geeignet sind. Zum Beispiel können Boc-Gly-OH, Boc-Ala-OH, Boc-His (Tos)-OH, (d.h. ausgewählte Carboxy-terminale Aminosäuren) verestert werden mit Chlor-methyliertem Polystyrol-Trägerharzen, p-Methylbenzhydrylamin (pMBHA) oder PAM-Harzen. Das Polystyrol-Trägerharz ist bevorzugt ein Copolymer von Styrol mit etwa 0,5 bis 2% Divinylbenzen als quervernetzendes Mittel, das das Polystyrolpolymer in bestimmten organischen Lösungsmitteln vollständig unlöslich macht, Stewart, et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, 1969, W. H. Freeman Co., San Francisco und Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, 1963, 2149–2154. Diese und andere Verfahren der Peptidsynthese sind ebenfalls veranschaulicht in US-PSen 3,862,925, 3,842,067, 3,972,859 und 4,105,602.
Die Synthese kann manuelle Synthesetechniken verwenden oder automatisch ausgeführt werden, z.B. an einem Applied Biosystems 430A oder 431A-Peptid-Synthesizer (Foster City, Kalifornien), entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Die Abspaltung der Peptide von dem Harz kann durchgeführt werden unter Verwendung des "low-high" HF-Protokolls zum Abspalten der Schutzgruppen, wie beschrieben in Lu, G.-S. et al., Int. J. Peptide & Protein Res., 29, 1987, 545–557. Die Rückfaltung der Analoga von Schlangengift-PAIs kann durchgeführt werden unter Verwendung des Verfahrens, beschrieben bei Garsky, V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1989, 4022–4026, die die Festphasensynthese von Echistatin beschreiben.
Die cyclischen Peptide dieser Erfindung, die keine Disulfidbindungen haben, können herkömmlich hergestellt werden durch Kombination der Festphasensynthese und der Bildung der cyclischen Ringstruktur in Lösung unter Verwendung der allgemeinen Verfahren, die beschrieben sind in der US-PS 4,612,366. Somit können lineare Peptide, hergestellt nach Standard-Merrifield-Harz gespalten werden von dem Harz mit Hydrazin, gefolgt von der Cyclisierung des entsprechenden Azids, um cyclische Peptide zu bilden.
Rekombinante Herstellung der erfidungsgemäßen Peptide
Alternativ können ausgewählte erfindungsgemäße Verbindungen hergestellt werden durch Expression von rekombinanten DNA-Konstrukten, die gemäß bekannten Verfahren hergestellt wurden. Diese Herstellung kann wünschenswert sein, um große Mengen oder alternative Ausführungsformen dieser Verbindungen bereitzustellen. Da die Peptidsequenzen relativ kurz sind, ist die rekombinante Herstellung erleichtert. Jedoch ist die rekombinante Herstellung besonders bevorzugt über die Standard-Festphasen-Peptidsynthese für Peptide mit mindestens 8 Aminosäureresten.
Die DNA, die das sequenzierte PAI codiert, ist vorzugsweise hergestellt unter Verwendung kommerziell verfügbarer Nucleinsäure-Syntheseverfahren. Verfahren zur Konstruktion von Expressionssystemen für die Herstellung von PAI in Wirten sind bekannt.
Die Expression kann sowohl in prokaryontischen als auch in eukaryontischen Wirten durchgeführt werden. Bei den Prokaryonten handelt es sich meistens um verschiedene Stämme von E.coli. Jedoch können ebenfalls andere mikrobiologische Stämme verwendet werden, wie Bazillus, z.B. Bacillus subtilis, verschiedene Arten von Pseudomonas oder andere bakterielle Stämme. In diesen prokaryontischen Systemen werden Plasmid-Vektoren verwendet, die Replikationsorte und Kontrollsequenzen enthalten, die von einer Art abgeleitet sind, die kompatibel mit dem Wirt ist. Zum Beispiel ist pBR322 und seine Derivate ein Arbeits-Vektor für E. coli. Im allgemeinen verwendete prokaryontische Kontrollsequenzen, die Promotoren für die Transkriptionsinitiation, gegebenenfalls mit einem Operator, zusammen mit ribosomen Bindungesstellen-Sequenzen, schließen allgemein verwendete Promotoren, wie das beta-Lactamase-(Penicillinase) und Lactase (lac) Promotorsysteme, das Tryptophan (Trp) Promotorsystem und den von Lambda-abgeleiteten P_L-Promotor und die N-Gen-Ribosom-Bindungsstelle ein. Jedoch kann jedes erhältliche Promotorsystem, das mit den Prokarioten kompatibel ist, verwendet werden.
Expressionssysteme, die in eukaryontischen Wirten verwendbar sind, umfassen Promotoren, abgeleitet von geeigneten eukaryontischen Genen. Eine Klasse von Promotoren, die in Hefe verwendbar ist, umfasst z.B. Promotoren für die Synthese von glycolytischen Enzymen, z.B. die für 3-Phosphoglyceratkinase. Andere Hefe-Promotoren umfassen solche des Enolase-Gens oder des Leu2-Gens, erhalten aus YEp13.
Geeignete Säuger-Promotoren umfassen die frühen und späten Promotoren des SV40 oder anderer viraler Promotoren wie der, abgeleitet von Polyoma, Adenovirus II, Rinder-Papillomavirus oder Vogel-Sarkomaviren. Geeignete virale und Säuger-Enhancer sind vorstehend genannt. Falls Pflanzenzellen als Expressionssystem verwendet werden, ist z.B. der Nopalin-Synthese-Promotor geeignet.
Die Expressionssysteme werden unter Verwendung bekannter Restriktions- und Ligationstechniken konstruiert und werden in geeignete Wirte transformiert.
Die Transformation wird unter Verwendung von Standard-Techniken durchgeführt, die für die jeweiligen Zellen geeignet sind. Die Zellen, die die Expressionssysteme enthalten, werden unter geeigneten Bedingungen zur Herstellung von PAI kultiviert. Danach wird das PAI gewonnen und gereinigt.
Antikörper
Verfügbarkeit von erfindungsgemäßem gereinigtem PAI erlaubt ebenfalls die Herstellung von Antikörpern, die spezifisch immunoreaktiv sind mit diesen Formen der aktiven Peptide.
Die Verbindungen, die gereinigtes PAI, isoliert aus Schlangengift oder auf andere Weise synthetisiert, enthalten, können verwendet werden, um die Produktion von Antikörpern zu stimulieren, die immunoreaktiv für das PAI-Peptid sind. Standard-Immunosierungsprotokolle, die die Verabreichung von PAI an verschiedene Vertebraten wie Kaninchen, Ratten, Mäuse, Schafe und Hühner beinhalten, führen zu Antisera, die immunoreaktiv für das gereinigte Peptid sind. PAI kann vorteilhaft an einen geeigneten antigenisch-neutralen Träger konjugiert werden, wie ein geeignetes Serumalbumin oder keyhole limpet hemocyanin, um die Immunogenität zu erhöhen. Zusätzlich kann das freie Peptid als eine Alternative zur Konjugation zusammen mit methyliertem BSA injiziiert werden. Darüberhinaus können die Antikörperproduzierenden Zellen des immunisierten Säugers unsterblich gemacht werden, um monoklonale Antikörper-Panels zu erzeugen, die dann bezüglich der Reaktivität mit PAI gescreent werden können.
Die resultierenden polyklonalen oder monoklonalen Antikörper-Zubereitungen sind nützlich in Tests für die Menge des korrespondierenden PAI in biologischen Proben unter Verwendung von Standard-Immuno-Assays.
Test auf Bindung von Fibrinogen an den GP IIb-IIIa-Komplex in vitro
Die Identifizierung von Schlangengift-Ausgangsmaterial, das aktives PAI enthält und welches PAI bekannte Spezifität aufweist, wird durch den hier beschriebenen Test ermöglicht. Der Test stützt sich auf die Beobachtung, daß Verbindungen, die die Bindung von Fibrinogen an den GP IIb-IIIa-Komplex in vitro blockieren, ebenfalls in der Lage sind, die Thrombin oder ADP-induzierte Aggregation von menschlichen Blutplättchen und die Bildung von Blutplättchen-Thromben in vivo zu inhibieren. Diese Beobachtung stellt die Basis bereit, um potente PAI zu erhalten durch Abschätzen der Fähigkeit des Testmaterials, die Fibrinogen-GP IIb-IIIa-Interaktionen zu stören.
In dem Test wird ein fester Träger, wie Perlen, Teströhrchen oder Mikrotiterplatten mit dem GP IIb-IIIa in gereingter Form hergestellt, wie bei Fitzgerald, L. A., et al., Anal. Biochem., 151, 1985, 169–177 beschrieben. Der beschichtete Träger wird danach in Kontakt gebracht mit Fibrinogen und dem Testmaterial und für eine ausreichende Zeit inkubiert, um eine maximale Bindung von Fibrinogen an das immobilisierte GP IIb-IIIa zu ermöglichen. Fibrinogen wird typischerweise mit einer Konzentration von etwa 5–50 nM bereitgestellt und das Testmaterial kann, wenn gewünscht, nach einer Serie von Verdünnungen hinzugegeben werden. Typische Inkubationen werden für 2–4 Stunden bei 35°C durchgeführt. Die Zeit und die Temperatur sind voneinander abhängig.
Nach der Inkubation wird die Lösung, enthaltend das Fibrinogen und das Testmaterial, entfernt und der Level der Bindung von Fibrinogen gemessen durch die Quantifizierung des an GP IIb-IIIa gebundenen Fibrinogens. Jedes geeignete Mittel zum Nachweis kann verwendet werden, aber es ist üblich, markiertes Fibrinogen zu verwenden, z.B. durch Verwendung von radioaktiven, Fluoreszenz- oder Biotin-Markierungen. Solche Verfahren sind bekannt und brauchen nicht erläutert werden.
Die Bestimmung der Ergebnisse wird unterstützt durch das Verwenden einer Kontrollprobe, die gewöhnlich identisch mit der Testprobe ist, mit der Ausnahme, daß Testsubstanz fehlt. In diesem Fall kann der Prozentsatz der Inhibierung halbiert werden unter Verwendung der Menge von Fg, gebunden in der Kontrolle als Bezugsgröße, so daß
Andere Maßstäbe für die Wirksamkeit der Inhibierung, wie IC₅₀, können ebenfalls verwendet werden.
Die Testsysteme schließen weiterhin die Charakterisierung der PAI-Spezifität ein durch Bindungs-Inhibierungs-Tests, identisch zu dem vorstehenden, wobei andere adhäsive Proteine für Fg und andere Rezeptoren für GP IIb-IIIa eingesetzt werden. Insbesondere kann die Inhibierung der Bindung von Vitronectin an den Vitronectin-Rezeptor, von Fibronectin an den Fibronectin-Rezeptor, von Fibronectin an GP IIb-IIIa und Fibrinogen und/oder vWF an GP IIb-IIIa bestimmt werden. Die adhäsiven Proteine und Rezeptoren für diese Tests sind erhältlich.
Andere Tests
Zusätzlich zu den hier beschriebenen Plattentests sind andere Tests für die Aktivität der Blutplättchen-Aggregationsinhibierung und verwandter Aktivitäten ebenfalls erhältlich, wie vorstehend beschrieben. Zusammengefaßt gibt es folgende allgemein verwendete Tests:

1. Die Plattentests, die spezifische Rezeptoren verwenden, wie in den vorstehenden Absätzen beschrieben;
2. Standard-Tests, die direkt auf die Blutplättchen-Aggregation angewendet werden, wie die, beschrieben bei Gann, Z.-R. et al., J. Biol. Chem., 263, 1988, 19827–19832; Huang, T. F. et al., J. Biol. Chem., 262, 1987, 16157–16163; Biochemistry, 28, 1989, 661–666, vorstehend zitiert und hier eingeschlossen;
3. Ein in vivo-Thrombose-Modell in Hunden, wie nachstehend in Beispiel 1 und bei Folts, J. D. et al., Circulation, 54, 1976, 365 beschrieben; und
4. Die Wirkung auf die Zelladhäsion unter Verwendung von S35 Methionin-markierten Zellen, wie nachstehend in Beispiel 19 beschrieben.

Die erfindungsgemäßen PAIs sind therapeutisch nützlich, um die Thrombus-Bildung zu verhindern. Indikationen, für die diese Behandlung geeignet ist, schließen, ohne eine Limitierung darzustellen, ein, Atherosclerose und Arteriosclerose, akuter Herzinfarkt, chronische unstabile Angina, vorübergehende ischemische Attacken und Anfälle, periphere vaskuläre Krankheiten, arterielle Thrombose, Präklampsia, Embolie, Restenose und/oder Thrombose im Anschluß an Angioplastie, Carotis-Endarteriektomie, Anastomose von vaskulären Verschlüssen und chronische kardiovaskuläre Vorrichtungen (z.B. Verweil-Katheter oder Ableitungen-"extracorporale Kreislaufvorrichtungen"). Diese Syndrome stellen eine Vielzahl von stenotischen und okklusiven vaskulären Störungen dar, von denen angenommen wird, daß sie durch Blutplättchen-Aktivierung an den Gefäßwänden ausgelöst werden.
Die PAIs können verwendet werden zum Vorbeugen oder zur Unterbrechung der arteriellen Thrombus-Bildung bei unstabiler Angina und arterieller Embolie oder Thrombose genauso, wie zur Behandlung oder zum Vorbeugen eines Mykardialinfarkts (MI) und der muralen Thrombus-Bildung nach einem MI. Bei den Hirn-verwandten Störungen sind die Behandlung oder Vorbeugung von vorübergehenden ischemischen Attacken und die Behandlung von thrombotischen Schlaganfällen oder Schlaganfällen in der Entwicklung eingeschlossen.
Die PAIs können ebenfalls verwendet werden zur Vorbeugung der Blutplättchen-Aggregation, Embolisierung oder der Aufzehrung in extrakorporalen Kreisläufen, einschließlich der Verbesserung der renalen Dialyse, bei kardiopulmonalen By-Pässen, Hämoperfusionen und Plasmapherese.
PAIs verhindern Blutplättchen-Aggregation, Embolisierung oder die Aufzehrung, soziiert mit intravaskulären Geräten und die Verabreichung resultiert in einer verwässerten Nützlichkeit von intraaortalen Ballonpumpen, ventrikularen Hilfsgeräten und arteriellen Kathetern.
Die PAIs sind ebenfalls nützlich bei der Behandlung oder der Vorbeugung von venösen Thrombosen tiefvenöser Thrombose IVC, renalen Venalen- oder portalen Venen-Thrombosen und pulmonalen venösen Thrombosen.
Verschiedene Störungen, die eine Blutplättchen-Aufzehrung betreffen, wie eine thrombotische Werlhofsche Purpura, sind ebenfalls behandelbar.
Zusätzlich können die erfindungsgemäßen PAIs verwendet werden in einer Anzahl von nicht-therapeutischen Anwendungen, bei denen eine Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation erwünscht ist. Zum Beispiel die Verbesserung von Blutplättchen und die Lagerung von Vollblut kann erreicht werden durch Zusatz in ausreichenden Mengen der Peptide, wobei die Menge abhängt von der Länge der Lagerungszeit, den Bedingungen der Lagerung, der letztendlichen Verwendung des gelagerten Materials, etc.
Die PAI-Dosierung kann in einem weiten Bereich variieren, abhängig von den gewünschten Effekten und der therapeutischen Aufgabe. Typische Dosierung liegen zwischen etwa 0,01 und 10 mg/kg, bevorzugt zwischen etwa 0,01 bis 0,1 mg/kg Körpergewicht. Die Verabreichung ist vorzugsweise parenteral, wie intravenös auf einer täglichen Basis bis zu einer Woche oder bis zu ein oder zwei Monaten oder mehr, wobei es je nach Peptidgröße variiert. Wenn die Peptide ausreichend klein sind (d.h. kleiner als 8-10 Aminosäurereste), können andere Routen der Verabreichung genutzt werden, wie intranasal, sublingual oder dergleichen.
Injizierbare pharmazeutische Zusammensetzungen können hergestellt werden in konventionellen Formen, entweder als Flüssigkeitslösungen oder Suspensionen, festen Formen, geeignet für Lösungen oder Suspensionen in Flüssigkeiten vor der Injektion oder als Emulsionen.
Geeignete Exzipiens sind z.B. Wasser, Salzlösung, Dextrose, Mannitol, Lactose, Lecithin, Albumin, Natriumglutamat, Cysteinhydrochlorid, oder dergleichen. Zusätzlich können, wenn gewünscht, injizierbare pharmazeutische Zusammensetzungen kleinere Mengen von nichttoxischen Hilfssubstanzen enthalten, wie Benetzungsmittel, pH-Puffersubstanzen, und dergleichen. Falls gewünscht, können Absorptions-erhöhende Präparationen (z.B. Liposome) verwendet werden. Ausführungsformen in den folgenden Beispielen, die nicht von den Ansprüchen umfasst sind, dienen lediglich Veranschaulichungszwecken.
Beispiel 1
Test für Schlangengift-Blutplättchen-Adhäsions-Inhibitoren
A. Beschreibung der Assays (Plattentests)
Gereinigter Blutplättchen-GP IIb-IIIa-Rezeptor wurde hergestellt, wie beschrieben bei Fitzgerald, L. A. et al., Anal. Biochem., 151, 1985, 169–177. Vitronectin-Rezeptor wurde hergestellt, wie beschrieben bei Smith, J. W., J. Biol. Chem., 263, 1988, 18726–18731. Nach der Reinigung wurden die Rezeptoren gelagert in 0,1% Triton X-100 bei 0,1–1,0 mg/ml.
Die Rezeptoren wurden auf die Näpfchen einer 96-Näpfchen-Flach-Boden ELISA-Platten (Linbro EIA-Plus-Mikrotiterplatte, Flow Laboratories) nach Verdünnung 1:200 mit einer Lösung von 20 mM Tris-HCl, 150 mM Natriumchlorid, 1 mM CaCl₂, pH 7,4, um die Triton X-100 Konzentration unter der kritischen mizellaren Konzentration zu reduzieren, aufgebracht und ein Aliquot von 100 μl wurde zu jedem Näpfchen hinzugefügt. Die Näpfchen wurden über Nacht bei 4°C inkubiert und danach bis zur Trockenheit aspiriert.
Zusätzliche Stellen wurden blockiert durch die Zugabe von 35 mg/ml von Rinderserumalbumin (BSA) in den vorstehenden Puffer für 2 Stunden bei 30°C, um nicht-spezifische Bindung zu verhindern. Die Näpfchen wurden danach einmal gewaschen mit Bindungspuffer (50 nM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mg/ml BSA).
Die entsprechenden Liganden (Fibrinogen, von-Willebrand-Faktor oder Vitronectin) wurden mit ¹²⁵I markiert oder mit Biotin konjugiert unter Verwendung von käuflich erhältlichen Reagenzien und Standard-Verfahren. Die markierten Liganden wurden zu den Rezeptorbeschichteten Näpfchen zu einer Endkonzentration von 10 nM (100 μl/Näpfchen) gegeben und für 3 Stunden bei 30°C in der Gegenwart oder dem Fehlen der Testproben inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Näpfchen bis zur Trockenheit aspiriert und die Ligandbindung quantifiziert.
Bei ¹²⁵I-markierten Liganden wird das Protein mit 250 μl SDS gelöst. Bei Biotin-markierten Liganden wird das gebundene Protein nachgewiesen durch die Zugabe von Antibiotin-Antikörper, konjugiert an alkalischer Phosphatase, gefolgt von der Zugabe des Substrats (p-Nitrophenylphosphat) und der Bestimmung der optischen Dichte von jedem Näpfchen bei 405 nm. Eine verminderte Farbentwicklung oder ein verminderter ¹²⁵I-Gehalt wird beobachtet in Näpfchen, die mit Testproben inkubiert werden, die die Bindung des Liganden an den Rezeptor inhibieren.
B. Bestimmung der Adhäsionsinhibierung in Roh-Gift
68 rohe, lyophylisierte Schlangengift, erhalten entweder von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) oder Miami Serpentarium Labs (Salt Lake City, UT), wurden bei 1 mg/ml aufgelöst in Puffer (50 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,02% Azid, 2 mM CaCl₂). Ein ml Aliquot der Lösungen wurde der Ultrafiltration durch Centrocon^R-10 (YM-Membran) Mikrokonzentrierer (Amicon, Danvers, MA) unterzogen. Die Filtrate wurden als Testproben in dem Rezeptor/Ligand-Test des Abschnitts A unter Verwendung des GP IIb-IIIa/Fibrinogen-Systems eingesetzt und die Bindung wurde nachgewiesen unter Verwendung von Biotin-markiertem Fibrinogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Wie dargestellt, ist die Aktivität vorhanden bei einigen, aber nicht allen Arten von Viperinae, aber sie fehlt in allen getesteten Arten von Elapidae.
1 zeigt die Ergebnisse von verschiedenen Verdünnungen der Filtrate für vier Arten. Selbst bei der größten Verdünnung (25 μl/0,5 ml) zeigen drei aktive Gifte maximale Inhibierung.
C. Bestimmung der Aktivität von Peptiden in einem in vivo-Modell der Thrombose
Gereinigte Peptide wurden auf ihre Fähigkeit getestet, Thrombus-Bildung in Koronararterien des Hundes in dem von Folts beschriebenen Modell zu inhibieren (Folts J. D. et al., Circulation, 54, 1976, 365). In diesem Modell wurde gezeigt, daß die Fließreduzierung in einer zusammengezogenen Koronararterie auf die Bildung von Blutplättchen-Aggregaten zurückgeht. Weiter ist gezeigt worden, daß Mittel, die die Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa blockieren, diese Fließreduzierung verhindern (Coller B. S. et al., Blood, 68, 1986, 783). Die Peptide wurden aufgelöst in normaler Salzlösung und in eine periphere Vene als eine Einzelgabe verabreicht.
TABELLE 1 Centrocon^R-10 gereinigte Gifte, gescreent in IIb-IIIa Plattentest
D. Effekte von gereinigten Schlangengift-Peptiden auf die Zellanlagerung an adhäsive Proteine
M21 Melanoma-Zellen, die große Mengen des Vitronectin-Rezeptors exprimieren, wurden metabolisch mit ³⁵S-Methionin markiert und dann zu 24-Näpfchen-Gewebekulturplatten gegeben, die mit Vitronectin beschichtet waren. Zur Anlagerung wurde eine Inkubationsperiode von 1 Stunde bei 37°C gewählt. Danach wurden nicht-festgehaltene Zellen durch eine Waschung entfernt. Nach dem Waschen wurden die festgehaltenen Zellen gelöst und die Überstände in einen Flüssigkeits-Scintillationszähler gegeben. Die Fraktion von Zellen, die festgehalten wurde, wurde kalkuliert durch Teilen des cpm in den gelösten Überständen durch den cpm in der Gesamtzahl von Zellen, die zu jedem Näpfchen hinzugegeben wurden. Die Wirkungen von gereinigten Schlangengift-Peptiden und synthetischen cyclischen Peptiden auf die Zelladhäsion wurde bestimmt durch Zugabe dieser zu den M21-Zellen während der Inkubationsperiode.
E. Spezifität der Adhäsionsinhibierung
Ultrafiltrate von drei Arten von Schlangengift, Sistrurus m. barbouri, Crotalus ruber ruber und Crotalus basilicus wurden in dem Fibrinogen/GP IIb-IIIa und Vitronectin/Vitronectin-Rezeptor-Test des Abschnitts A getestet. Die Ergebnisse wurden bei verschiedenen Verdünnungen bestimmt. Wie in 2A gezeigt, inhibiert das Gift von Sistrurus m. barbouri bevorzugt die Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa, das Gift von Crotalus ruber ruber inhibiert sowohl die Bindung in beiden Systemen etwa gleichermaßen, wie in 2B gezeigt, und das Gift von Crotalus basilicus inhibiert bevorzugt die Vitronectin/Vitronectin-Rezeptor-Bindung, wie in 2C gezeigt.
Bei den Reinigungen, die in den Beispielen 2–6 und 8–12 beschrieben sind, wurde PAI-Aktivität bestimmt durch eine direkte Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation. Blutplättchen-reiches Plasma (PRP) wurde erhalten von einem gesunden menschlichen Freiwilligen. Die Aggregation wurde induziert durch die Zugabe von 4 μM ADP zu 0,5 ml PRP in einem Aggregometer (Chrono-log Corp.).
Eine Tabelle, die die Ergebnisse der Aminosäure-Zusammensetzungs-Analyse von gereinigtem PAI der Beispiele 2–6 darstellt, ist nach dem Beispiel 6 abgebildet. Eine entsprechende Tabelle, die die Ergebnisse für die Beispiele 8–11 zeigt, findet sich im Anschluß an Beispiel 8.
Diese Analyse wurde durchgeführt durch die Hydrolyse der Peptide mit 6 N HCl und der Analysierung der Hydrolysate unter Verwendung eines Beckman 121 HC-Analysators, ausgestattet mit einem Modell 126 Datensystem. Cysteinsäure wurde nach dem Verfahren von Moore, J. Biol. Chem., 230, 1969, 235–237 bestimmt. Triptophan wurde nicht bestimmt.
Beispiel 2
Reinigung von Blutplättchen-Aggregationsinhibitor (PAI) von Eristocophis macmahoni Gift
Eine Lösung von 45 mg von Eristocophis macmahoni Gift (Miami Serpentarium Labs, Lot #EM23SZ) in 1,0 ml von 0,5% Trifluoressigsäure (TFA) wurde für 20 Minuten auf Eis gekühlt, bei 14.000 rpm für 3 Minuten zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen und auf eine 3,9 mm × 30 cm C-18 Delta Pak, Umkehrphasen-HPLC-Säule (Waters, Milford, MA) equilibriert mit 5% Acetonitril, enthaltend 1% TFA, geladen. Ein Gradient von 5% bis 15% Acetonitril über 5 Minuten (2%/Minute) gefolgt von einem Gradienten von 15% bis 30% Acetonitril über 35 Minuten und einem Gradienten von 50% Acetonitril über 20 Minuten wurde unter Verwendung eines Waters 600 E Flüssigkeitschromatographen verwendet. Eine Flußrate von 1,5 ml/Minute wurde aufrechterhalten und die Säulenelution wurde in 2 Minuten-Fraktionen in Polypropylen-Röhren gesammelt.
Der Säulenausfluß wurde überwacht bei 220 nm/2,5 absorbance units full scale (AUFS).
Die Fraktionen wurden auf die Hälfte ihres ursprünglichen Volumens konzentriert unter Verwendung eines Speed-Vac, Konzentrierers (Savant). Danach wurden diese lyophylisiert. Die Proben wurden danach in 1 ml destilliertem Wasser wiederaufgenommen und Aliquots (10–50 μl) wurden auf ihre Fähigkeit, die menschliche Blutplättchen-Aggregation zu inhibieren in Blutplättchen-reichem Plasma induziert durch 20 μM ADP unter Verwendung eines Vollblut-Aggregometers (Chrono-log Corp., Havertown, PA).
Wie in 3 gezeigt, wurde die Aktivität in den Fraktionen gefunden, die bei einer Acetonitrilkonzentration von 21–25% eluieren. Diese Fraktionen wurden dann lyophylisiert und über eine C-18 HPLC-Säule laufengelassen unter Verwendung des folgenden flachen Acetonitril-Gradienten: Die anfänglichen Bedingungen bestehen aus 8% Acetonitril, gefolgt von einem Gradienten von 25% Acetonitril über 68 Minuten (0,25%/Minute), gefolgt von 60% Acetonitril über 10 Minuten. Ein-Minuten-Fraktionen wurden gesammelt, getrocknet und bezüglich der inhibitorischen Aktivität bei der Blutplättchen-Aggregation von menschlichen Blutplättchen untersucht, wie vorstehend beschrieben.
Wie in 4 gezeigt, eluiert die aktive Fraktion bei 24% Acetonitril. Die aktiven Fraktionen wurden danach der analytischen HPLC bei einem Nachweis bei 220 nm unterzogen und eluiert als eine einzelne symmetrische bioaktive Komponente, wie in 5 gezeigt. Die Aminosäure-Analyse von HPLC-gereinigtem Material zeigt, daß das Peptid 49 Reste einschließlich 1-8 Cysteine enthält, wie in Tabelle 2 gezeigt.
Die Versuche eines automatischen Edman-Abbaus der Carboxyamido-methylierten Peptide führtem zu keinem Erfolg. Daher wurde dieses Material mit Lys-C- und Asp-N-Endoproteinasen abgebaut und die Fragmente sequenziert, wie in 6 gezeigt. Diese Analyse führte zu einer Sequenz von 48 Resten. Da jedoch zwei Tryptophanreste bei dieser Sequenzanalyse bestimmt wurden, die nicht in der Aminosäure-Zusammensetzung bestimmt wurden, enthält das intakte Peptid 51 Aminosäurereste. Zwei Glx-Reste und ein Arg-Rest, die an der bestimmten Sequenz fehlen, sind wahrscheinlich an dem blockierten Amino-Terminus des Peptids vorhanden. Da es sehr wahrscheinlich ist, daß einer der Glx-Reste ein Pyroglutamylrest an dem Amino-Terminus ist, der zur Blockierung des intakten Peptids führt, wurde diese Gruppe von dem intakten Carboxyamido-methylierten Peptid entfernt mit dem Enzym Pyroglutamylaminopeptidase (L-Pyroglutamylpeptidhydrolase, EC 3.4.11.8, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN). Die bei Podell und Abraham, Biochem. Biophys. Res. Commun., 81, 1978, 176–185, beschriebenen Verfahren wurden durchgeführt. 100 μg des Peptids wurden mit der Peptidase bei einem Substrat zu Enzymverhältnis von 100:1 durchgeführt. Danach wurde eine Umkehrphasen-HPLC-Reinigung des Gemisches auf einer Waters-analytischen C-18-Säule durchgeführt mit einem Material, geeignet für den automatischen Edman-Abbau. Die Ergebnisse dieser Analyse und die Darstellung der ganzen Sequenz dieses Peptids, das "Eristicophin" genannt wurde, ist in 6 gezeigt.
Die gesamte Aminosäuresequenz dieses PAI ist in 6 gezeigt. Dieses Peptid hat die RGD-Sequenz in der Bindungsregion und zeigt starke Homologie zu Echistatin.
Beispiel 3
Reinigung von PAI von Sistrurus catenatus tergeminus Gift
360 mg von Sistrurus c. tergeminus Gift (Miami Serpentarium Labs, Lot #ST6SZ) wurden in 7 ml 0,5 M Essigsäure aufgelöst und auf eine Sephadex, G-50 Säule aufgetragen (Pharmacia, 2,5 × 100 cm), die equilibriert und eluiert wurde mit 0,5 M Essigsäure. Die Säule wurde mit einer Fließrate von etwa 25 ml/h laufengelassen und 5-ml Fraktionen wurden gesammelt. 25 μl von jeder Fraktion wurden vereinigt zu Gruppen von 10 Fraktionen (d.h. Fraktionen 1-10, 11–20, etc.) und für Analyse lyophilisiert. Die getrockneten zusammengelegten Fraktionen wurden in Wasser wieder aufgelöst. Die Aliquots wurden bezüglich der inhibitorischen Akti vität in der ADP-stimulierten Aggregation von menschlichen Blutplättchen untersucht. Die aktiven Fraktionen (31-40) wurden vereinigt und lyophilisiert.
Dieses Material wurde aufgelöst in 2 ml 10,5% TFA und auf eine 19 mm × 30 cm C-18 Delta Pak, Umkehrphasen-HPLC-Säule (Waters), equilibriert mit 8% Acetonitril, enthaltend 0,1% TFA, aufgetragen. Ein Gradient von 8% bis 30% Acetonitril über 30 Minuten und ein 60% Gradient von Acetonitril über 20 Minuten bei einer Fließrate von 18 ml/Min. wurde verwendet. Der Säulenausfluß wurde in Polypropylen-Röhrchen in 0,2 Minuten Fraktionen gesammelt und bei 220 nm/2.2 AUFS überwacht. Die Fraktionen wurden mit einem Speed-Vac, -Konzentrierer (Savant) konzentriert, lyophilisiert und bezüglich der Anti-Aggregationsaktivität mit menschlichen Blutplättchen getestet, wie vorstehend beschrieben. 7 zeigt, daß die PAI-enthaltende Fraktion bei einer 24–25% Acetonitril-Konzentration eluiert. Die Analyse von diesen aktiven Fraktionen unter Verwendung der HPLC mit einem Nachweis bei 220 nm zeigt eine symmetrische bioaktive Komponente, wie in 8 gezeigt. Die Aminosäure-Analyse von diesem Material zeigt ein Peptid von 71-72 Resten, einschließlich 12 Cysteinen, wie in Tabelle 2 gezeigt.
Ein Teil des gereinigten Peptids wurde reduziert und alkyliert mit Iodacetamid und gereinigt auf einer C-18 Umkehrphasen-HPLC-Säule. N-terminale Sequenzanalyse von diesem Material zeigt die folgende Aminosäuresequenz nach 23 Cyclen des Edman-Abbaus: Glu-Ala-Gly-Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-Pro-Cys-Cys-Asp-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu.
Die vollständige Aminosäuresequenz für dieses PAI, das "Tergeminin" genannt wurde, ist in 6 gezeigt.
Das gereinigte Peptid wurde in dem Rezeptor-basierenden Tests, beschrieben in Beispiel 1, Abschnitt A, getestet. Konzentrationen des gereinigten Peptids von weniger als 100 nM inhibierten die Bindung von Fg und vWF an GP IIb-IIIa und von Vn und vWF an den Vitronectin-Rezeptor, wie in 9 gezeigt.
Beispiel 4
Reinigung von Blutplättchen-Aggregationsinhibitor von Sistrurus milarus barbouri Gift
200 mg von Sistrurus m. barbouri Gift (Miami Serpentarium Labs, Lot #SM13SZ) wurden aufgelöst in 7,0 ml 0,5 M Essigsäure und auf eine Sephadex, G-50 Säule (Pharmacia, 2,5 × 100 cm) equilibriert und eluiert mit 0,5 M Essigsäure, aufgebracht. Die Säule wurde mit einer Fließrate von 26 ml/h laufengelassen und 5 ml Fraktionen wurden gesammelt und analysiert bezüglich der Anti-Blutplättchen-Aggregationsaktivität, wie vorstehend beschrieben. Aktive Fraktionen (41-50) wurden vereinigt und lyophilisiert. Dieses Material wurde aufgelöst in 2,0 ml 0,5% TFA und auf eine präparative C-18 HPLC Säule geladen, wie in Beispiel 3 beschrieben, und eluiert unter Verwendung der gleichen Gradienten-Bedingungen. Zwei 10-Minuten-Fraktionen der Säule wurden gesammelt in Polypropylen-Röhrchen, konzentriert, lyophilisiert und analysiert bezüglich der Blutplättchen-Aggregations-inhibitorischen Aktivität.
10 zeigt das Aktivitätsprofil dieser HPLC-Säule. Die aktiven Fraktionen wurden der analytischen HPLC unterzogen, die mehrere Fraktionen (45-47) zeigten, die mehr als 90% homogen waren. Das Peptid der Fraktion 46 (150 μg) wurde bis zur Homogenität auf einer analytischen C-18 Säule gereinigt mit einer manuellen Sammlung des symmetrischen Peaks, wie in 11 gezeigt. Die Aminosäure-Analyse dieses Materials zeigte ein Peptid von 71-72 Aminosäuren, einschließlich 12 Cysteinresten, wie in Tabelle 2 gezeigt.
Das gereinigte Peptid (150 μg) wurde aufgelöst in 300 μl Reaktionspuffer (6 M Guanidin-HCl, 0,25 M Tris -HCl, 20 mM EDTA, 20 mM Dithiothreitol (DTT), pH 7,5) für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur, um das Peptid zu reduzieren. Danach folgte die Reaktion von 3 μl 4-Vinylpyridin (Aldrich) bei Raumtemperatur für eine weitere Stunde. Die Reaktion wurde beendet durch Zugabe von 200 μl 1% TFA und auf eine analytische C-18 HPLC-Säule geladen und mit einem Acetonitril-Gradienten in Wasser, enthaltend 0,1 % TFA, beginnend mit 8% Acetonitril und 25% Acetonitril über 20 Minuten und 60% Acetonitril über 10 Minuten eluiert.
Ein Teil dieses Pyridyl-ethylierten Materials wurde der N-terminalen Sequenzanalyse unterzogen, wie vorstehend beschrieben. Eine vollständige proteolytische Spaltung des reduzierten alkylierten Peptids wurde durchgeführt unter Verwendung der Endoproteinase Lys-C und der Endoproteinase Asp-N mit Peptid-Fragmenten isoliert, entweder auf einer C-3 oder einer C-18 Umkehrphasen-HPLC-Säule unter Verwendung einer Acetonitril-Wasser-TFA-Gradienten-Elution. Die Aminosäuresequenz des N-Terminus des intakten Peptids und der isolierten proteolytischen Fragmente wurde bestimmt wie beschrieben bei Yarden, Y. et al., Nature, 323, 1986, 226, unter Verwendung des automatischen Edman-Abbaus auf einem Gasphasen-Sequenzer.
Die vollständige Aminosäuresequenz dieses isolierten Peptids, das als "Barbourin" bezeichnet wurde, ist in 6 zusammen mit den Sequenzen für die proteolytischen Fragmente gezeigt. Ein Vergleich dieser Sequenz mit denen von anderen Schlangengift-Adhäsionsinhibitoren ist in 12 gezeigt.
Beispiel 5
Reinigung von PAI von Lachesis mutas Gift
99 mg von Lachesis mutas Gift (Miami Serpentarium Labs, Lot #LM15FZ) wurden aufgelöst in 2 ml 0,5% Trifluoressigsäure und auf Eis gekühlt für 20 Minuten, bei 14.000 rpm für 3 Minuten zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen und auf eine 3,9 mm × 30 cm C-18 Delta Pak, Umkehrphasen-HPLC-Säule (Waters), equilibriert mit 5% Acetonitril, enthaltend 0,1% Trifluoressigsäure, gegeben. Ein Gradient von 5% bis 15% Acetonitril über 5 Minuten und nachfolgend ein Gradient von 30% über 35 Minuten (2%/Min.) gefolgt von einem Gradienten von 60% Acetonitril über 20 Minuten wurde über die Säule gegeben. Die Fließrate von 1,5 ml/Min. wurde aufrechterhalten und der Säulenausfluß wurde bei 220 nm/3.0 AUFS überwacht. Zwei-Minuten-Fraktionen wurden gesammelt, in einer Speed-Vac konzentriert und lyophilisiert. Die Fraktionen wurden untersucht auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation.
13 zeigt die aktiven Fraktionen, die bei 18% Acetonitril eluieren. Diese Fraktionen wurden erneut über eine C-18 Säule gegeben unter Verwendung eines flachen Gradienten, bestehend aus einem 40-minütigen Gradienten von 5–28% Acetonitril. Ein-Minuten-Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert, lyophilisiert und auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation untersucht. Die Ergebnisse sind in 14 gezeigt. Diese aktiven Fraktionen wurden über eine analytische C-18 Säule gegeben und die eluierte zentrale Peak-Fraktion per Hand gesammelt. Das eluierte Material, das, wie in 15 gezeigt, aus einem einzelnen symmetrischen Peak besteht, wurde der Aminosäure-Analyse unterzogen und zeigte ein Peptid von 72-73 Aminosäuren, enthaltend 12 Cysteine, wie in Tabelle 2 gezeigt.
Die vollständige Aminosäuresequenz dieses PAIs, das "Lachesin" bezeichnet wurde, ist in 6 gezeigt.
Beispiel 6
Reinigung von PAI von Crotalus viridis viridis Gift
47 mg von Crotalus viridis viridis Gift (Sigma Chemical Co., Lot #24F-0534) wurde aufgelöst in 1 ml 0,5% Trifluoressigsäure, auf Eis für 20 Minuten gekühlt, bei 14.000 rpm für 3 Minuten zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen und auf eine 3,9 mm × 30 cm C-18 Delta Pak, Umkehrphasen-HPLC-Säule (Waters), equilibriert mit 5% Acetonitril, enthaltend 0,1% Trifluoressigsäure, geladen. Ein Gradient von 5% bis 15% Acetonitril über 5 Minuten (2%/Min.), gefolgt von einem Gradienten von 15% bis 30% Acetonitril über 35 Minuten und nachfolgend von einem Gradienten von 60% Acetontritril über 60 Minuten wurde über die Säule gegeben. Eine Fließrate von 1,5 ml/Min. wurde über den Gradienten aufrechterhalten und der Säulenausfluß wurde gesammelt in Polypropylen-Röhrchen in 2-Minuten-Fraktionen. Der Säulenausfluß wurde bei 220 nm/3.0 AUFS überwacht. Die Fraktionen wurden konzentriert, lyophilisiert und auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation untersucht.
Die aktiven Fraktionen, die in 16 bei 18–19% Acetonitril gezeigt sind, wurden eine C-18 HPLC-Säule gegeben unter Verwendung eines Gradienten von 8%–20% Acetonitril über 48 Minuten (0,25%/Min.).
Die Fraktionen wurden konzentriert und lyophilisiert und auf ihre Aktivität getestet. Die aktiven Fraktionen wurden über eine C-18 Säule gegeben unter Verwendung von 8–16% Acetonitril über 10 Minuten, 16–20% Acetonitril über 15 Minuten und nachfolgend von 60% über 10 Minuten.
Der Ausfluß wurde bei 220 nm überwacht, wobei individuelle Peaks per Hand in Polypropylen-Röhrchen gesammelt wurden. Die weitere Analyse des aktiven Peaks auf einer analytischen HPLC-Säule zeigte die in 17 dargestellten Ergebnisse. Die Aminosäureanalyse dieses Peaks zeigte ein 72-73 Reste enthaltendes Peptid, enthaltend 12 Cysteine, wie in Tabelle 2 gezeigt. Die vollständige Aminosäuresequenz von diesem PAI, das "Viridin" genannt wurde, ist in 6 gezeigt und verglichen mit den anderen PAIs in 12.
Tabelle 2 Aminosäure-Zusammensetzung von gereinigten Peptiden
Beispiel 7
Vergleich von gereinigtem PAI mit Echistatin
Die Peptide Eristicophin und Barbourin, die wie in den Beispielen 2 und 4 beschrieben gereinigt wurden, wurden verglichen mit dem 49 Reste enthaltenden Peptid Echistatin bezüglich der Inhibierung der Fibrinogenbindung an GP IIb-IIIa, wie in Beispiel 1, Abschnitt A, beschrieben. 18 zeigt, daß diese gereinigten PAIs zwei- bis dreimal wirksamer in diesem Test sind als das Standard-Echistatin.
Die bis zur Homogenität gereinigten Peptide von Echis carinatus, Sistrurus m. barbouri und Eristicophis macmahoni Giften wurden mit Echistatin in dem ADP-stimulierten Blutplättchen-Aggregationstest verglichen. Ansteigende Konzentrationen von gereinigten Schlangengift-Peptiden wurden ohne vorherige Präinkubation mit den angegebenen Konzentrationen hinzugefügt (19A, 19B und 19C). Schlangengift-Peptide von Eristicophis macmahoni und Sistrurus m. barbouri waren mindestens zweifach wirksamer als Echistatin bezüglich ihrer Fähigkeit, die beobachtet wurde für die Inhibierung der Fibrinogenbindung an GP IIb-IIIa, wie vorstehend beschrieben.
Beispiel 8
Reinigung von PAI von Crotalus cerastes cerastes Gift
1 g von Crotalus c. cerastes Gift (Miami Serpentarium Labs, Lot #CE4SZ) wurde aufgelöst in 7 ml 0,5 M Essigsäure und auf eine Sephadex, G-50 Säule (Pharmacia, 2,5 × 100 cm), equilibriert und eluiert mit 0,5 M Essigsäure, aufgebracht. Die Säule wurde mit einer Fließrate von 25 ml/h laufengelassen, wobei 5 ml-Fraktionen in Polypropylen-Röhrchen gesammelt wurden. Aliquots dieser Fraktionen wurden auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation, wie vorstehend beschrieben, untersucht. Aktive Fraktionen (71-80) wurden vereinigt und lyophilisiert. Das getrocknete Material wurde in 2,0 ml 0,5% TFA resuspendiert. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation entfernt. Danach wurde dieses Material auf eine präparative C-18 Waters HPLC-Säule, wie vorstehend in Beispiel 3 beschrieben, geladen und eluiert unter Anlegen der Gradienten-Elutionsbedingungen, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Fraktionen von der Säule wurden gesammelt in Polypropylen-Röhrchen, konzentriert und auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation untersucht. 20 zeigt das Aktivitätsprofil von dieser HPLC-Fraktionierung.
Aktive Fraktionen mit inhibitorischer Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation wurden vereinigt und lyophilisiert und auf eine präparative C-18 HPLC-Säule gegeben, eluiert mit dem gleichen Gradienten. Fraktionenen wurden per Hand in Polypropylen-Röhrchen gesammelt und wiederum auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation, wie vorstehend beschrieben, untersucht. Aktive Fraktionen wurden auf einer analytischen C-18-Säule analysiert unter Verwendung der in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen und homogene Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert. Die analytische HPLC-Analyse von diesem Material ist in 21 gezeigt.
Gereinigte Peptide wurden der Aminosäureanalyse unterzogen, die ein Peptid von 73-74 Aminosäuren zeigte, enthaltend 12 Cysteinreste, wie in Tabelle 3 gezeigt.
450 μg des gereinigten Peptids wurden in 750 μl Reaktionspuffer (6 M Guanidin-HCl, 0,25 M Tris-HCl, 20 mM EDTA, 20 mM Dithiothreitol (DTT), pH 7,50) für 1,5 h bei Raumtermperatur aufgelöst, um das Peptid vollständig zu reduzieren. Danach folgte eine Reaktion bei Rauntemperatur für 1 Stunde mit einem Überschuß von Iodacetamid (Fluka, 16 mg). Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von 500 μl 1% TFA gestoppt und auf eine analytische C-18 HPLC-Säule geladen. Diese wurde mit einem Gradienten von 8% bis 25% Acetonitril über 20 Minuten, danach von 60% Acetonitril über 10 Minuten eluiert. Der UV-absorbierende Peak wurde per Hand in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gesammelt und getrocknet.
Ein Teil dieses Carboxyamido-methylierten Peptids wurde der N-terminalen Sequenzanalyse unterzogen. Die vollständige proteolytische Spaltung des Carboxyamido-methylierten Peptids wurde durchgeführt unter Verwendung der Endoproteinase Lys-C und der Endoproteinase Asp-N. Peptid-Fragmente von diesen Verdauungen wurden entweder über eine C-3 oder eine C-18 Umkehrphasen-HPLC-Säule mit Acetonitril/Wasser/TFA Elutionsgradientenbedingungen isoliert. Die Aminosäuresequenz wurde bestimmt, wie in Beispiel 4 beschrieben. Die vollständige Aminosäuresequenz, die für "Cerastin" bestimmt wurde, ist in 6 gezeigt. Diese ist mit den anderen PAI in 12 verglichen.
Beispiel 9
Reinigung von PAI von Crotalus ruber ruber Gift
1 g von Crotalus ruber ruber Gift (Miami Serpentarium Labs, Lot #CF17SZ) wurde in 8 ml 0,5 molarer Essigsäure aufgelöst und auf eine Sephadex, G-50 Säule (Pharmacia, 2,5 × 100 cm) aufgetragen, equilibriert bei Raumtemperatur und eluiert mit 0,5 M Essigsäure. Die Säule wurde laufengelassen mit einer Fließrate von 25 ml/h, wobei 5 ml-Fraktionen in Polypropylen-Röhrchen gesammelt wurden. Aliquots von diesen Fraktionen wurden bezüglich ihrer inhibitorischen Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation, wie beschrieben, untersucht. Aktive Fraktionen (61-70) wurden vereinigt und lyophilisiert. Das getrocknete Material wurde in 2 ml 0,5% TFA resuspendiert. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation entfernt. Das Material wurde auf eine präparative C-18 Waters HPLC-Säule, wie beschrieben, aufgebracht und eluiert mit den Gradientenbedingungen, die in Beispiel 3 beschrieben wurden. Die Fraktionen wurden in Polypropylen-Röhrchen gesammelt, mit einem Speed-Vac-Konzentrierer konzentriert und auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation untersucht.
22 zeigt das Aktivitätsprofil für diese HPLC-Fraktionierung. Einzelne aktive Fraktionen wurden lyophilisiert. Fraktionen 49 und 50 wurden vereinigt und auf eine analytische C-18 Umkehrphasen-Säule geladen und eluiert mit den in Beispiel 4 beschriebenen Bedingungen, bestehend aus einem Acetonitril-Gradienten von 8% Acetonitril bis 25% in 25 Minuten, gefolgt von 69% Acetonitril über 10 Minuten, um homogene Peptide zu erhalten, die als "Ruberin" bezeichnet wurden. Der automatische Edman-Abbau der Carboxyamido-methylierten Peptide gab die in 6 gezeigte Sequenz.
Beispiel 10
Reinigung von PAI von Crotalus atrox
1 g von Crotalus atrox Gift (Miami Serpentarium Labs, Lot #CX16AZ) wurde aufgelöst in 10 ml 0,5 molarer Essigsäure und auf eine Sephadex, G-50 Säule (Pharmacia, 2,5 × 110 cm) aufgebracht. Die Säule wurde equilibriert und bei Raumtemperatur mit 0,5 molarer Essigsäure laufengelassen. Die Säule wurde mit einer Fließrate von 25 ml/h laufengelassen, wobei 5 ml-Fraktionen in Polypropylen-Röhrchen gesammelt wurden. Aliquots der Fraktionen wurden auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation, wie vorstehend beschrieben, getestet. Aktive Fraktionen (81-100) wurden vereinigt und lyophilisiert. Das getrocknete Material wurde in 2 ml 0,5% TFA aufgelöst und auf eine präparative C-18 HPLC-Säule aufgetragen und laufengelassen, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Fraktionen wurden in Polypropylen-Röhrchen gesammelt, mit einem Speed-Vac, -Konzentrierer konzentriert und auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation, wie vorstehend beschrieben, getestet. Aktive Fraktionen wurden nochmals über eine analytische C-18-Säule gegeben, um homogene Peptide zu erhalten (23). Die Aminosäureanalyse dieses Materials zeigte, daß das Peptid 72 Aminosäuren enthält, einschließlich 12 Cysteinresten, wie in Tabelle 3 gezeigt. Die Aminosäuresequenz des isolierten Peptids, Crotatroxin, ist in 6 gezeigt.
Beispiel 11
Reinigung von PAI von Bothrops cotiara
680 mg von Bothrops cotiara Gift (Miami Serpentarium Labs Lot #BO5SZ) wurden in 10 ml 0,5 M Essigsäure aufgelöst und auf eine Sephadex, G-50 Säule (Pharmacia, 2,5 × 110 cm) geladen, die equilibriert und eluiert wurde mit 0,5 M Essigsäure. Die Säule wurde mit einer Fließrate von 25 ml/h laufengelassen, wobei 5 ml-Fraktionen in Polypropylen-Röhrchen gesammelt wurden. Aliquots der Fraktionen wurden auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation, wie vorstehend beschrieben, getestet. Aktive Fraktionen (71-90) wurden vereinigt und lyophilisiert. Das getrocknete Material wurde resuspendiert in 2 ml 0,5% TFA und auf eine präparative C-18-Umkehrphasen-Säule (Waters) aufgebracht. Die Säule wurde eluiert unter Verwendung der in Beispiel 3 beschriebenen Bedingungen. Die Fraktionen wurden in Polypropylen-Röhrchen gesammelt, konzentriert mit einem Speed-Vac, -Konzentrierer und auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation getestet. Aktive Fraktionen wurden einzeln lyophilisiert. Mehrere Peak-Fraktionen wurden erneut über eine analytische C-18-Säule gegeben, wie in Beispiel 4 beschrieben. Das analytische HPLC-Profil des homogenen Peptids ist in 24 gezeigt. Die Aminosäureanalyse dieses Materials zeigte, daß dieses Peptid 72 Aminosäuren enthält, einschließlich 12 Cysteinresten, wie in Tabelle 3 gezeigt. Die vollständige Aminosäuresequenz dieses Peptids, das "Cotiarin" bezeichnet wurde, ist in 6 und 12 gezeigt.
Das gereinigte Peptid wurde in den in Beispiel 1 beschriebenen Rezeptor-Tests getestet. Die Anfangsbestimmungen zeigten, daß niedrige Konzentrationen von Cotiarin (1-4 nM selektiv die Vitronectin-Bindung an den Vitronectin-Rezeptor inhibieren, wohingegen die gleichen Konzentrationen signifikant niedrigere inhibitorische Aktivität hatten bezüglich der Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa, wie in 25 gezeigt. Jedoch konnten nachfolgende Experimente dieses Ergebnis nicht bestätigen.
Beispiel 12
Reinigung von PAI von Crotalus viridis lutosus

A. 1 g von Crotalus viridis lutosus Gift (Miami Serpentarium Labs Lot #CL18SZ) wurden in 8 ml 0,5 M Essigsäure aufgelöst und auf eine Sephadex, G-50 Säule (Pharmacia, 2,5 × 110 cm) aufgetragen, die equilibriert und eluiert wurde mit 0,5 M Essigsäure. Die Säule wurde mit einer Fließrate von 25 ml/h laufengelassen und 5 ml-Fraktionen wurden in Polypropylen-Röhrchen gesammelt. Aliquots der Fraktionen wurden auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation getestet. Die Fraktionen 71-100 wurden vereinigt und lyophilisiert. Das getrocknete Material wurde in 2 ml 0,5% TFA resuspendiert. Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugation entfernt. Danach wurde das Material auf eine präparative C-18-Umkehrphasen-Säule (Waters) aufgebracht und eluiert mit den Gradienten-Elutionsbedingungen, die in Beispiel 3 beschrieben wurden. Die Fraktionen der Säule wurden in Polypropylen-Röhrchen gesammelt, konzentriert mit einem Speed-Vac, -Konzentrierer und auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation getestet. Aktive Fraktionen wurden in ihren jeweiligen Röhrchen lyophilisiert. Fraktionen mit Peak-Aktivität wurden erneut über eine analytische C-18-Säule (Waters) gegeben unter Verwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Acetonitril-Gradienten. Die Fraktionen wurden per Hand in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gesammelt. Homogene Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert. Die analytische HPLC dieses Materials zeigte einen einzelnen symmetrischen Peak. Die vollständige analytische Aminosäuresequenz dieses Peptids, das "Lutosin" genannt wurde, ist in 6 und 12 gezeigt.
B. In gleicher Weise, wie im vorstehenden Abschnitt A beschrieben, wurden die PAIs von B. jararacussu, C. basilicus, C. durissus durissus, C. v. oreganus, C. h. horridus, C. v. helleri, C. durissus totonactus und von C. m. molossus isoliert und gereinigt. Die Aminosäure-Zusammensetzungen für mehrere dieser Peptide sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Aminosäuresequenzen der PAIs von C. h. horridus, C. basilicus, C. m. molossus, C. v. oreganus und C. d. durissus, die als Horridin, Basilicin, Molossin, Oreganin und Durissin bezeichnet wurden, sind in 6 gezeigt. Die Rezeptor-Bindungsdaten für die gereinigten Peptide der Beispiele 1–12 sind in 26 gezeigt.

In den nachstehenden Beispielen 13–16 wurden die Peptide durch Festphasen-Technik an einem Applied Biosystems 431A-Peptid-Synthesegerät synthetisiert unter Verwendung von t-Boc Aminosäuren, aktiviert als HOBt-aktivierte Ester gemäß den Angaben des Herstellers, die nachfolgend für die Herstellung von Boc-AA1...AA(n-1)-AA(n)-O-PAM-Polystyrolhart kurz zusammengefaßt sind.
1,5 mM von ausgewählten Boc-AA(n)-O-PAM-Polystyrolharz wird für den Einbau von Boc-AA(n-1)-OH gemäß dem folgenden Plan behandelt:

1) TFA-Abspaltung der Schutzgruppen: 30% TFA in DCM, 3 Minuten, 50% TFA in DCM, 16 Minuten.
2) Waschen und Neutralisieren: 5 × DCM-Waschen für je 3 Minuten, 2 Minuten 5% DIEA in DCM, 2 Minuten 5% DIEA in NMP, 6 × NMP-Waschen für je 5 Minuten.
3) Kopplung: 4 Äquivalente Poc-AA-HOBt-Ester in NMP (voraktiviert 55 Minuten), 38 Minuten, DMSO, um 15% DMSO/85% NMP herzustellen, 16 Minuten, 3,8 Äquivalente DIEA, 5 Minuten.
4) Waschen und Harzen der Probe: 3 Minuten NMP-Waschen.
5) Versehen mit Schutzgruppen: 10% Essigsäureanhydrid, 5% DIEA in NMP, 8 Minuten.
6) Waschen: 6 × DCM-Waschen für je 4 Minuten.

Beispiel 13
Herstellung des Analogon #1
[E²⁸L⁴¹C⁶⁴] Barbourin (28-73):
E-C-A-D-G-L-C-C-D-Q-C-R-F-L-K-K-G-T-V-C-R-V-A-K-G-D-W-N-D-D-T-C-T-G-Q-S-C-D-C-P-R-N-G-L-Y-G
1,5 mM von PAM-Gly-Harz (0,6 meq/g, Applied Biosystems, Foster City, CA) wurden Verfahren A unterzogen mit den erforderlichen Aminosäuren (in der entsprechenden Reihenfolge eingeführt). Die Boc-geschützten Aminosäuren hatten die folgenden Seitenketten-Schutzgruppen: Arg(Tos), Asp(OcHex), Cys(4-MeBzl), Glu(OcHex), Lyse(Cl-Z), Thr(OBzI), Trp(CHO) und Tyr(Br-Z). Nach dem Zusammenbau der vollständigen geschützten Peptid-Harzkette wurde die Amino-terminale Boc-Gruppe mit TFA entfernt und das Harz als TFA-Salz getrocknet. 1,3 g des Harzes wurden dem "low-high"-HF-Verfahren zum Abspalten der Schuztgruppen" unterzogen, gefolgt durch das Entfernen von HF unter verimindertem Druck. Das getrocknete Peptid-Harzgemisch wurde auf einen Frittentrichter (grob) mit Ethylether transferriert und mehrmals abwechselnd gewaschen mit Ether und Chloroform, um die organischen Schutzgruppen und Überreste der Abspaltung der Schutzgruppen zu entfernen.
Das Peptidgemisch wurde in 2 l 0,4% Essigsäure eingebracht und der pH-Wert wurde mit konzentrierter NH₄OH auf 7,99 eingestellt. Das Harz wurde aus dieser Lösung filtriert und die Lösung wurde für 20 Stunden ohne Rühren bei 4°C stehengelassen. Danach wurde die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt und erneut 3 Tage ohne Rühren stehengelassen. Das abgesetzte Material wurde durch Filtration entfernt und der Überstand wurde mit Essigsäure auf den pH-Wert von 3,0 gebracht und lyophilisiert.
Das rohe Material wurde in 8,0 ml 0,5 M Essigsäure aufgelöst und auf eine Sephadex, G-50 Säule (2,5 × 100 cm) aufgebracht, die mit 0,5 M Essigsäure equilibriert worden ist. Die Säule wurde mit 20 ml/h laufengelassen und 4 ml-Fraktionen wurden in Polypropylen-Röhrchen gesammelt. Aliquots der Fraktionen wurden getrocknet, in Wasser resuspendiert und auf ihre inhibitorische Aktivität für die Blutplättchen-Aggregation, wie vorstehend beschrieben, getestet. Die aktiven Fraktionen (71-90) wurden vereinigt und lyophilisiert.
Das getrocknete Material (66 mg) wurde in 2,0 ml 0,1 M Essigsäure aufgelöst und auf eine präparative C-18 Säule (Waters) aufgebracht, die mit 8% Acetonitril, enthaltend 0,1% TFA, equilibriert worden war. Ein Gradient von 8% Acetonitril bis 20% über 10 Minuten, gefolgt von einem langsamen Gradienten bis zu 30% Acetonitril über 40 Minuten wurde durchgeführt. Die Säule wurde mit 18 ml/Min,. eluiert und 12 Sekunden-Fraktionen wurden in Polypropylen-Röhrchen gesammelt. Die Fraktionen wurden auf einem Speed-Vac-Konzentrierer auf 1,0 ml Volumen konzentriert und 10 μl Aliquots wurden in dem Blutplättchen-Aggregationstest getestet.
Aktive Fraktionen (29-32) wurden einzeln lyophilisiert und auf einer analytischen C-18 HPLC-Säule mit einem 8–30% Acetonitril-Gradienten analysiert. Die Fraktionen 29 und 30 wurden vereinigt und auf eine analytische Säule mit 1 ml 0,5% TFA aufgetragen. Der größte Peak wurde manuell gesammelt und lyophilisiert, um 1,6 mg eines reinen Peptids zu erhalten. Die Aminosäureanalyse dieses Materials bestätigt die Identität des Peptids. Der Test dieses Materials auf die Fähigkeit, die Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa und Vitronectin an VnR zu inhibieren, ist in den 26 und 27 gezeigt. Diese Daten zeigen die hohe Affinität dieses Analogons für GP IIb-IIIa und das relative Fehlen der Affinität für VnR bei Konzentrationen bis zu 1 μM.
Beispiel 14
Herstellung des Analogons #2, [K²⁹] Eristicophin (4-51):
E-E-P-C-A-T-G-P-C-C-R-R-C-R-F-K-R-A-G-K-V-C-R-V-A-K-G-D-W-N-N-D-Y-C-T-G-R-S-C-D-C-P-R-N-P-W-N-G
1,5 mM von PAM-Gly-Harz (0,6 meq/g, Applied Biosystems, Foster City, CA) wurden dem Verfahren mit den erforderlichen Aminosäuren unterzogen (eingeführt in der entsprechenden Reihenfolge). Die Boc-geschützten Aminosäuren hatten die folgenden Seitenketten-Schutzgruppen: Arg(Tos), Asp(OcHex), Cys(4-MeBzl), Glu(O-cHex), Lys(Cl-Z), Ser(OBzl), Thr(OBzl), Trp(CHO) und Tyr(Br-Z). Die Spaltung, Zurückfaltung und Reinigung dieses Peptids wurde wie in den vorstehenden Beispielen durchgeführt. Die Rezeptor-Bindungsdaten dieses Analogons sind in den 26 und 28 gezeigt.
Beispiel 15
Herstellung des Analogons #3:
G-C-G-K-G-D-W-P-C-A-NH₂
1,5 mM von pMBHA-Harz (0,72 meq/g, Applied Biosystems, Foster City, CA) wurden dem Verfahren A mit den erforderlichen Aminosäuren (eingeführt in der entsprechenden Reihenfolge) unterzogen. Die Boc-geschützten Aminosäuren hatten die folgenden Seitenketten-Schutzgruppen: Asp(O-cHex), Cys(4-MeBzl) und Lys(Cl-Z). Nach dem vollständigen Zusammenbau des geschützten Peptidharzes wurde die Amino-terminale Boc-Gruppe mit TFA entfernt und das Harz als TFA-Salz getrocknet. 1,54 g des Harzes wurden mit wasserfreiem Fluorwasserstoff (HF), enthaltend 10% Anisol, 2% Ethylmethylsulfid, für 30 Minuten bei –10°C und weiteren 30 Minuten bei 0°C behandelt. Das HF wurde unter reduziertem Druck entfernt und das Peptid/Harzgemisch wurde in Diethylether suspendiert, gefolgt von abwechselnden Waschungen mit Chloroform und 3 × Ether. Nach einem letzten Ether-Waschschritt wurde das Peptid von dem Harz mit 2,0 M Essigsäure extrahiert, mit destilliertem Wasser verdünnt und lyophilisiert.
370 mg des rohen Peptids wurden in deoxygenierten 10 mM NH₄OAc, pH 8, aufgelöst zu einer Konzentration von 0,5 mg/ml und durch tropfenweise Zugabe eines leichten Überschusses von 0,01 M Kaliumferricyanid (K₃Fe(CN)₆)-Lösung oxidiert, für weitere 20 Minuten gerührt und mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 5 gebracht. Die Peptidlösung wurde mit DOWEX, AG3x4 Anionenaustauscherharz für 15 Minuten unter Rühren behandelt, das Harz wurde filtriert, mit H₂O verdünnt und lyophilisiert, um das rohe cyclisierte Peptid zu erhalten. Das rohe cyclisierte Peptid (392 mg) wurde durch entsalzen auf einer Sephadex, G- 25F-Säule unter Verwendung von 0,5 M Essigsäure als Elutionsmittel gereinigt. Danach wurde eine Ionenaustauscherchromatographie an einer CM-Sepharose, (Pharmacia)-Säule unter Verwendung eines Elutionsgradienten, erzeugt durch die Zugabe von 100 mM Ammonium OAc zu einer Lösung von 10 mM Ammonium OAc, pH 4,5, gereinigt. Die Fraktionen, die eine Mindestreinheit von 90% bei der HPLC-Analyse hatten, wurden vereinigt und das Wasser durch mehrmaliges lyophilisieren entfernt, um 175 mg zu erhalten. Die letzte Reinigung bestand aus einer präparativen HPLC-Reinigung auf einer C-18-Umkehrphasen-Säule (Waters) mit einem Acetonitril/Wasser/TFA-Gradienten, um ein gereinigtes Peptid zu erhalten. Die Rezeptor-Bindungsdaten für dieses Analogon sind in den 26, 29B und 30 gezeigt.
Beispiel 16
Herstellung von zusätzlichen Analoga
Die folgenden Analoga wurden in den meisten Fällen in gleicher Weise synthetisiert, wie in Beispiel 15 vorstehend beschrieben.
Jedoch wurde das nachfolgend gezeigt Analogon 60 in einer Lösung hergestellt über eine Guanidierung der Seitenkette des Lysinrestes des Analogons #19 unter Verwendung des Verfahrens von Bajusz, S., et al., FEBS Letts., 110, 1980, 85–87.
1 mg des Analogons #19 wurde umgesetzt mit 1 mg von 1-Amidino-3,5-dimethylpyrazolnitrat (Aldrich) in 1 ml absolutem Ethanol in Gegenwart von Diisopropylethylamin (DIEA) bei Raumtemperatur für 4 Tage. Das resultierende Analogon 60 wurde von überschüssigen Reagenzien und Startmaterialien durch Umkehrphasen-HPLC an einer C-18-Säule unter Verwendung eines Gradienten von Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure gereinigt. 900 μg dieses Materials wurden in gereinigter Form isoliert.
Beispiel 17
PAI-Aktivität der Peptide
In den vorstehend beschriebenen Standard-Aggregationsinhibierungstests zeigten die Analoga #3-5 IC₅₀-Werte von 5 μM bezüglich ihrer Fähigkeit, die ADP-induzierte Aggregation menschlicher Blutplättchen zu inhibieren. Jedoch hatte das Analogon #6 einen IC₅₀ von mehr als 200 μM und das Analogon #7 zeigte einen Wert von 100 μM. Die IC₅₀-Werte für die erfindungsgemäßen Analoga in diesem Test sind wie folgt:
Beispiel 18
Aktivität der linearen Peptide im Vergleich zu cyclischen Peptiden
Bei dem Test auf die Inhibierung der Fibrinogenbindung an GP IIb-IIIa im Plattentest zeigte das lineare RGDW-NH₂ eine sehr ähnliche Aktivität wie das cyclische Peptid GCGRGDWPCA-NH₂ (29A). Im Gegensatz dazu zeigte das lineare Peptid KGDW-NH₂ eine sehr viel niedrigere Aktivität als das cyclische Peptid GCGKGDWPCA-NH₂ (29B). Bei den KGDW-Verbindungen zeigte sich im Gegensatz zu den RGDW-Verbindungen durch die Cyclisierung ein auffallender Anstieg der Fähigkeit des Peptids, die Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa zu inhibieren.
Beispiel 19
Ergebnisse der Platten-Bindungstests für synthetische Peptide
Die in Beispiel 17 synthetisierten Peptide wurden zusätzlich zu dem Test bezüglich der Fähigkeit, die Blutplättchen-Aggregation direkt zu inhibieren, in den erfindungsgemäßen Plattentests, wie vorstehend beschrieben, getestet. Die Ergebnisse für die Analoga 4 bis 8 sind in den 30C, 30D, 30E, 30A und 30B gezeigt. Wie in den Figuren gezeigt, waren diese Analoga unterschiedlich in ihrer Fähigkeit, die Bindung von Fibrinogen an GP IIb-IIIa zu inhibieren, verglichen mit der Inhibierung der Bindung von Fibrinogen an den Vitronectin-Rezeptor. Das Analogon #4 zeigte in der Gruppe die größten Unterschiede. Die Analoga #7 und #5 auf der anderen Seite waren ebenfalls sehr spezifisch und hatten ausgezeichnete inhibitorische Aktivitäten für die Blutplättchen-Aggregation.
Beispiel 20
Wirkungen der gereinigten Peptide auf die Zell-Adhäsion
M21 Melanoma-Zellen wurden mit ³⁵S-Methionin markiert und dann auf Vitronectinbeschichtete Platten in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen von gereinigten Schlangengift-Peptiden gegeben. Die Zellbindung wurde gemessen durch Lösen der Zellen, die nach einer Inkubation und Waschung, wie in Abschnitt C auf Seite 40 beschrieben, zurückgeblieben waren. Wie in 31 gezeigt, hatte weder Barbourin noch Peptid 1 (gekürztes Barbourin) einen signifikanten Effekt auf die Zell-Adhäsion an Vitronectin, obgleich beide starke Inhibitoren der Blutplättchen-Aggregation waren, wie in den Beispielen 2 und 3 gezeigt. Im Gegensatz dazu war Cotiarin, das ein starker Inhibitor der Vitronectin-Bindung an den Vitronectin-Rezeptor ist, sehr wirksam in der Inhibierung der Zellbindung an Vitronectin. In einem ähnlichen Experiment wurden Peptid #3, Peptid #3, bei dem K ersetzt war durch R (GCGRGDWPCA-NH₂) und RGDS, untersucht auf M21 Zellbindung an Vitronectin. Wie in 32 gezeigt, sind RGDS und GCGRGDWPCA-NH₂ starke Inhibitoren der Zellbindung, wohingegen GCGKGDWPCA-NH₂ bis zu einer Konzentration von 60 μM unwirksam war.
Beispiel 21
Vergleich der Analoga 60 und 19
Die vorstehend beschriebenen Analoga 60 und 19 sind erfindungsgemäße Peptide, die die Sequenz K*GDX enthalten und mit Ausnahme der Ausführungsform des K* identisch sind. Das Analogon 60 hat die folgende Formel: Mpr-(Har)-G-D-W-P-C-NH₂.
Das Analogon 19 hat die folgende Formel: Mpr-K-G-D-W-P-C-NH₂.
Diese Analoga wurden in Standard-Blutplättchen-Aggregationinhibierungstests und unter Verwendung des in Beispiel 20 beschriebenen Zell-Adhäsionstests getestet. Die Ergebnisse sind in den 33 und 34 gezeigt. Wie in 33 gezeigt, ist das Analogon #60 bei verschwindend kleinen Konzentrationen zur Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation wirksam und ist relativ weniger wirksam bei der Verhinderung der Zell-Adhäsion an Vitronectin. 34 zeigt die gute inhibitorische Aktivität der Blutplättchen-Aggregation und die Spezifität des Analogons #19. Jedoch ist es weniger aktiv in dem Test auf Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation, als das Analogon #60. Das Analogon #60 zeigt einen IC₅₀-Wert bei der Blutplättchen-Aggregation von etwa 0,15 μM. Das Analogon #19 zeigt einen IC₅₀-Wert von etwa 1 μM.
Beispiel 22
Folts Modell der Thrombose in der Koronararterie des Hundes
A. Initiierung der zyklischen Flußreduktionen (CFRs) in einem Hund mit offenem Thorax
Ein Verschluß wurde auf der linken vorderen absteigenden Koronararterie eines 20 kg Hundes wie vorstehend beschrieben plaziert. Die phasischen und mittleren Blutflüsse, gemessen durch eine elektromagnetische (EM) Flußprobe und eine Doppler-Flußprobe sind in 35 gezeigt.
B. Wirkung des zyklischen Peptids GCGKGDWPCA-NH₂ (Analogon #3) auf die CFRs in dem offenen Thorax-Hund.
Eine Dosis von 10 mg dieses Peptids wurde in eine periphere Vene im Hund gegeben. In 36 sind die Blutflußmuster in der LAD wie vorstehend beschrieben gezeigt. Man beachte das partielle Ableiten der CFRs, wie durch das absteigende Gefälle der Flußreduzierungen dargestellt. Man beachte ebenfalls, daß der Fluß nicht genauso stark reduziert ist, wie in der Kontrolle (A).
C.
Eine zweite Infusion von 40 mg des Analogons #3 wurde in eine periphere Vene gegeben. Wie in 37 gezeigt, deutet die vollständige Ableitung der CFRs an, daß der vollständige Fluß in der LAD wiederhergestellt ist.
Beispiel 23
Konstruktion von Expressionsvektoren für Barbourin-Peptide
Ein Gen, das die volle Länge des [L⁴¹] Barbourin-Peptids (1-73) codiert, wurde zusammengebaut aus synthetischen Oligonucleotiden, wie in 38 gezeigt, die durch Kinasebehandlung phosphoryliert wurden, annealed und ligiert wurden in Eco-RI-HindIII-gespaltenen M13mp18 unter Verwendung von Standard-Verfahren. Die Signalsequenz (Watson, M.E.E., Nucleic Acids Research, 12, 1984, 5145) des bakteriellen alkalischen Phosphatase-Gens (phoA) wurde zu dem Barbourin-Konstrukt hinzugefügt durch Ligation synthetischer Oligonucleotide in die EcoRI/NcoI-Stellen des [L⁴¹] Barbourin (1-73) Konstrukts, wie in 39 gezeigt. Die Nucleotidsequenzen aller Konstrukte wurden durch das Dideoxy-Kettenterminations-Verfahren von Sanger überprüft.
Eine gekürzte Version dieses Peptids wurde ebenfalls konstruiert von synthetischen Oligonucleotiden, die nur Aminosäuren 28-73 des Vollängen-Moleküls codieren würden. Zwei Änderungen, Q⁸ zu E²⁸ und A⁶⁴ zu C⁶⁴, wurden eingefügt unter Verwendung der site directed mutagenesis, wie bei Kunkel et al., Meth. Enzymol. 154, 1987, 367, beschrieben. Die phoA-Signalsequenz wurde zu der gekürzten Version hinzugefügt, wie vorstehend beschrieben (40). Zusätzlich wurde die Signalsequenz für das E.coli hitzestabile Enterotoxin II (Picken, R. W. et al., Infect. Immun., 42, 1983, 269) zur gekürzten Version hinzugegeben unter Verwendung von synthetischen Oligonucleotiden mit EcoRI und NcoI kompatiblen Enden. Alle bakteriellen Sekretionskonstrukte wurden subkloniert in den bakteriellen Expressionsvektor pPROK-1 (Brosius, J., Gene, 27, 1984, 151, 161), erhältlich von CLONTECH Lab, Inc. unter Verwendung von EcoRI und HindIII Restriktionsendonucleasen.
Ein Gen, das Tandem-Repeats des gewünschten Peptids codiert, wurde hergestellt unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktin (PCR), um die mulitmere Einheit des Vollängen-Barbourin-Peptids 1-73, enthaltend L41 und C64, herzustellen.
Die 41A und 41B zeigen die für die PCR-Synthese verwendeten Oligonucleotide. Die PCR-Reaktion wurde durchgeführt gemäß dem Verfahren von Saiki, R. K. et al., Science, 239, 1988, 487. Die resultierende Polymer-Verbindung enthält Methionine an jedem Ende der Sequenz, wie in 42 gezeigt, und stellt die gewünschten Restriktionsstellen für das Konstrukt bereit.
Die Tandem-Repeats werden gebildet von individuellen Multimer-bildenden Verbindungen, z.B. durch Ligation eines EcoRI/BamHI-Fragments an ein BglII/HindIII-Fragment in eine M13mp18-Vektorschnittstelle mit EcoRI/HindIII, um ein Dimer zu bilden. Das resultierende Dimer wird mit EcoRI und BamHI ausgeschnitten und in ein BglII/HindIII-Fragment ligiert, um ein Trimer zu bilden usw., bis die gewünschte Größe erhalten wird. Diese Konstruktion ist in den 43A und 43B gezeigt.
Das Multimer wurde dann in den E.coli-Vektor pKK233-2 (Amann, E. et al., Ge3ne, 40, 1985, 183, erhältlich von Clontech) ligiert durch Verdau des Vektors mit NcoI/HindIII und Ligation eines Monomer-Subfragments von NcoI/BamHI und eines Multimer-Subfragments von BglII/HindIII.
Für die Expression eines Fusionsproteins wurde der vorstehend verdaute Vektor zusammen mit einem NcoI-EcoRI-Subfragments, enthaltend einen leicht modifizierten Amino-terminalen Teil (Aminosäuren 1-72) des Chloramphenicolacetyltransferase-Gens (Chang, C. N. et al., Gene, 55, 1987, 189) und EcoRI-HindIII-Subfragmente der multimeren Konstruktionen verwendet.
Beispiel 24
Expression der rekombinanten Gene
Die Proteinexpression von allen rekombinanten Plasmiden, die vorstehend beschrieben sind, wird induziert gemäß Kanamari et al., Gene, 66, 1988, 295, nach Transfektion in geeignete E.coli-Wirtsstämme. Die Produkte werden charakterisiert durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese und durch ihre Fähigkeit, die ADP-induzierte Blutplättchen-Aggregation in Blutplättchen-reichem Plasma zu inhibieren. Nach der Reinigung werden die multimeren Proteine in die monomeren Einheiten umgewandelt durch Cyanobromid-Spaltung und die Produkte wurden, wie vorstehend beschrieben, getestet.

Claims

Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid, fähig zur stärkeren Inhibierung der Bindung von Fibrinogen (Fg) oder des von Willebrand Faktors (vWF) an GP IIb-IIIa als zur Bindung von Vitronectin an Vitronectinrezeptor oder Fibronectin an Fibronectinrezeptor, wobei entweder die prozentuale Inhibierung mindestens 2-fach größer ist für die Inhibierung der Bindung von Fibrinogen (Fg) oder des von Willebrand Faktors (vWF) an GP IIb-IIIa als die Inhibierung der Bindung von Vitronectin an Vitronectinrezeptor oder Fibronectin an Fibronectinrezeptor, bei einer bestimmten Konzentration von PAI oder die Konzentration von PAI, die 50% Inhibierung verursacht, mindestens 2-fach geringer ist für die Fg oder vWF/GP IIb-IIIa Bindungsinhibierung als für die Bindungsinhibierung von Vitronectin an Vitronectinrezeptor oder Fibronectin an Fibronectinrezeptor, wobei der Blutplättchen-Aggregationsinhibitor die allgemeine Formel hat,
worin K* ein Lysylrest der allgemeinen Formel ist,
worin jeder Rest R¹ unabhängig ein Wasserstoffatom, ein C₁ bis C₆ Alkylrest ist oder höchstens ein Rest R¹ R²-C=NR³ ist, worin R² ein Wasserstoffatom, ein C₁ bis C₆ Alkylrest, ein Phenyl- oder Benzylrest oder ein Phenyl- oder Benzylrest substituiert mit einem Alkyl- oder einem Phenylrest oder NR⁴ ₂ ist, wobei jeder Rest R⁴ unabhängig ein Wasserstoffatom oder ein C₁ bis C₆ Alkylrest ist und R³ ein Wasserstoffatom, ein C₁ bis C₆ Alkylrest, ein Phenyl- oder Benzylrest ist oder R²-C=NR³ ein Rest ist ausgewählt aus:
wobei m eine ganze Zahl von 2–3 ist und jeder Rest R⁵ unabhängig ein Wasserstoffatom oder ein C₁ bis C₆ Alkylrest ist u nd worin ein oder zwei -CH₂--Reste ersetzt sein können durch O oder S vorbehaltlich, dass O oder S nicht benachbart zu einem anderen Heteroatom ist; AA₁ ein neutraler, polarer oder nicht polarer Aminosäurerest ist, enthaltend 1-4 Kohlenstoffatome und n1 0 oder eine ganze Zahl von 1–3 ist, AA₂ ein neutraler, nicht polarer, großer aromatischer oder nicht aromatischer oder ein polarer aromatischer Aminosäurerest ist und n2 0 oder eine ganze Zahl von 1–3 ist, AA₃ ein Prolinrest oder ein modifizierter Prolinrest der allgemeinen Formel ist
wobei ein oder zwei der Methylengruppen ersetzt sein können durch NR, S oder O und wobei irgendein Stickstoffatom des Rings gegebenenfalls ersetzt sein kann mit einem nicht-interferierenden Substituenten und R ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest ist und n3 0 oder 1 ist; AA₄ ein neutraler Aminosäurerest enthaltend 1-4 Kohlenstoffatome oder die N-alkylierte Form hiervon ist und n4 0 oder eine ganze Zahl von 1–3 ist, jeder Rest X₁ und X₂ unabhängig ein Rest ist, fähig zur Bildung einer Bindung zwischen X₁ und X₂, um eine zyklische Verbindung wie gezeigt zu bilden und jeder Rest Y₁ und Y₂ unabhängig ein nicht-interferierender Substituent ist oder abwesend ist, wobei ein oder mehrere Peptidbindungen gegebenenfalls ersetzt sein können durch einen alternativen bindenden Rest ausgewählt aus -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH- (cis oder trans), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- oder -CH₂SO-Resten mit der Maßgabe, dass, wenn n3 0 ist entweder 1) die Summe von n2 und n4 mindestens 2 sein muss; oder 2) K* anders ist als Har (Homoarginin) oder K (Lysin); oder 3) eine oder mehrere Peptidbindungen ersetzt ist (sind) durch den alternativen Bindungsrest.
Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 1, worin Y₁ ein Wasserstoffatom, ein Acylrest oder ein Peptidrest oder eine derivatisierte Form hiervon ist oder fehlt und Y₂ ein OH-, NH₂-Rest oder ein Peptidrest oder eine derivatisierte Form hiervon ist oder fehlt.
Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 2, worin Y₂ ein -NH₂-, -A-NH₂-Rest ist oder fehlt.
Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 2, worin Y₁ ein Wasserstoffatom, ein Acetylrest, Glycin (G) ist oder fehlt.
Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 1, worin X₁ und X₂ Cystein- (C), Mercaptopropionyl- (Mpr) oder Penicillamin- (Pen) Reste sind.
Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 1, worin AA₁ ein Glycin (G) ist und n₁ 0 oder 1 ist.
Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 1, worin AA₂ ausgewählt ist aus einem Tryptophan- (W), Phenylalanin- (F), Leucin- (L), Tyrosin- (Y) oder Valin- (V) Rest.
Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 7, worin AA₂ ein Tryptophanrest (W) ist.
Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach Anspruch 1, worin K* ein Lysin- (K), Homoarginin- (Har), Acetimidyl-Lys- oder Phenylimidyl-Lys-Rest ist.
Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid ausgewählt aus:
Polypeptid nach Anspruch 1, worin das Polypeptid weniger als 10 Aminsäuren enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
Verwendung des Blutplättchen-Aggregationsinhibitor-Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Arzneimittels geeignet zur Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation und Behandlung oder Vorbeugung von Blutplättchen-assoziierten ischämischen Störungen.