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Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Isolierung
von Nukleinsäuren
(sowohl RNA als auch DNA) und Proteinen aus biologischen Materialien.
Insbesondere betrifft die Erfindung Nukleinsäure- und Protein-Isolierungsverfahren,
die nichttoxische chaotrope Mittel einsetzen.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die
kontinuierlichen Fortschritte in der Molekularbiologie, Biotechnologie
und klinischen Forschung haben zu einer weiterhin ansteigenden Zahl von
Verwendungen für
DNA, RNA und Proteinen geführt.
Zum Beispiel hat die Polymerasekettenreaktions(PCR)-Technologie
die Verwendung von DNA und RNA in der Grundlagenforschung, in der
klinischen Diagnostik wie beispielsweise der Detektion von Boten-RNA
(mRNA) durch Reverstranskriptions-PCR und der Verwendung von PCR
bei der Detektion von genetischen Defekten dramatisch ausgeweitet.
Auf dem Gebiet der Proteine ist die Identifikation von Proteinen
durch Western-Blotting ein wichtiges Hilfsmittel zum Studium der
Genexpression in der Grundlagenforschung und bei der Identifikation spezifischer
Proteine für
diagnostische Zwecke, beispielsweise durch die Detektion viraler
Proteine, geworden.
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Die
verstärkte
Verwendung von RNA, DNA und Proteinen hat ein Bedürfnis für schnelle,
einfache und zuverlässige
Verfahren und Reagenzien zur Isolierung von DNA, RNA und Proteinen
erzeugt. Bei vielen Anwendungen würde die Sammlung von Proben biologischen
Materials und die anschließende Analyse
davon wesentlich vereinfacht werden, wenn die drei Zellbestandteile
(RNA, DNA und Proteine) gleichzeitig aus einer einzigen Probe isoliert
werden könnten.
Die gleichzeitige Isolierung ist besonders wichtig, wenn die Probengröße, beispielsweise
bei einer Biopsie, so klein ist, daß sie die Auftrennung in kleinere
Proben zur Durchführung
getrennter Isolationsschritte für
DNA, RNA und Proteine ausschließt.
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Es
existieren bekannte Verfahren zur Isolierung von DNA, RNA und Proteinen
aus einer einzigen Probe biologischen Materials. Ein solches Verfahren
ist in Coombs, L. M., et al.: "Simultaneous
Isolation of DNA, RNA and Antigenic Protein Exhibiting Kinase Activity
from Small Tumor Samples Using Guanidine Isothiocyanate", Anal. Biochem.,
188, 338–343
(1990), beschrieben. Das Verfahren nach Coombs et al. basiert auf
der Ultrazentrifugation des Probenhomogenats in einer Guanidin-Cäsiumchlord-Lösung. Die
Probe wird in 4 M Guanidinthiocyanat homogenisiert und anschließend mit
einer Cäsiumchlorid(CsCl)-Lösung überschichtet
und für
etwa 18 Stunden bei > 100.000
g zentrifugiert. Im Anschluß an
die Zentrifugation werden DNA, RNA und Proteine getrennt und über die
folgenden 12–24 Stunden
gereinigt. Dieses Verfahren weist mehrere Beschränkungen oder Nachteile auf,
einschließlich der
verlängerten
Zeit, die für
die Isolierung benötigt wird,
und der begrenzten Probenanzahl und -größe, die mit einer Ultrazentrifuge
verarbeitet werden kann. Auch die hohen Kosten für eine Ultrazentrifuge können unter
bestimmten Umständen
hindernd sein.
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Ein
anderes Verfahren zur gleichzeitigen Isolierung von DNA, RNA und
Proteinen aus einer einzigen Probe biologischen Materials ist Gegenstand meines
früheren
US-Patents Nr. 5,346,994 (das '994-Patent).
Das Verfahren beruht auf einer Flüssigphasen-Trennung unter Verwendung
von Phenol und Guanidinthiocyanat. Eine biologische Probe wird in der
wäßrigen Lösung aus
Phenol und Guanidinthiocyanat homogenisiert und das Homogenat wird
anschließend
mit Chloroform gemischt. Im Anschluß an die Zentrifugation trennt
sich das Homogenat in eine organische Phase, eine Zwischenphase
und eine wäßrige Phase.
Proteine sind in der organischen Phase, DNA ist in der Zwischenphase
und RNA in der wässrigen
Phase konzentriert. Als nächstes
wird jeder Bestandteil aus der entsprechenden Phase unter Verwendung
von Ethanol ausgefällt
und wird anschließend
gewaschen. Die ganze Prozedur kann innerhalb von etwa 2–3 Stunden
abgeschlossen werden und ist insbesondere geeignet zur Isolierung hochqualitativer
RNA aus verschiedenen Quellen. Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht
in der Verwendung von hochtoxischem Phenol.
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Es
gibt viele verfahren zur getrennten Isolierung von DNA, RNA und
Proteinen aus biologischem Material, d. h. Protokolle zur Isolierung
einer einzelnen dieser Komponente aus einer Probe. Bei typischen
DNA-Isolationsverfahren wird eine biologische Probe in einer lysierenden
Lösung
lysiert, und die DNA wird anschließend nach irgendeinem eine Mehrzahl
von Schritten umfassenden Protokoll aus dem Lysat isoliert, was
bis zur Vervollständigung
eine Stunden bis mehrere Tage in Anspruch nehmen kann. Häufig empfohlene
DNA-Isolationsverfahren beinhalten die Verwendung von toxischem
Phenol. Siehe Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning", Bd. 2, S. 9.14–9.23, Cold Spring Harbor Laboratroy
Press (1989) und Ausubel, Frederick M. et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Vol. 1, S. 2.2.1–2.4.5, John
Wiley & Sons,
Inc. (1994). Üblicherweise
wird eine biologische Probe in einer Detergenzlösung lysiert und der Proteinbestandteil
des Lysats wird mit Proteinase für
12–18
Stunden verdaut. Anschließend wird
das Lysat mit Phenol extrahiert, um den Großteil der zellulären Bestandteile
zu entfernen, und die verbleibende wäßrige Phase wird weiter behandelt,
um die DNA zu isolieren. Bei einem anderen Verfahren, beschrieben
in van Ness et al., U.S.-Patent 5,130,423, werden nichtkorrosive
Phenol-Derivate zur Isolierung von Nukleinsäuren verwendet. Die erhaltene
Zubereitung ist eine Mischung aus RNA und DNA.
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DNA-Isolationsverfahren,
die nicht nichtkorrosive chaotrope Mittel verwenden, sind ebenfalls entwickelt
worden. Diese Verfahren, die auf der Verwendung von Guanidinsalzen,
Harnstoff und Natriumiodid basieren, beinhalten die Lyse einer biologischen
Probe in einer chaotropen wäßrigen Lösung und
die anschließende
Ausfüllung
der Roh-DNA-Fraktion mit einem niederen Alkohol. Die endgültige Reinigung
der ausgefällten Roh-DNA-Fraktion
kann erreicht werden durch eines von verschiedenen Verfahren, einschließlich Säulenchromatographie,
wie beschrieben in "RapidPrepTM Genomic DNA Isolation Kits For Cells and
Tissue: Versatility at Your Fingertips!", Analects, Bd. 22, Nr. 4, Pharmacia
Biotech, 1994, oder Exposition der Roh-DNA gegenüber einem polyanionhaltigen
Protein wie in Koller, U.S. Pat. Nr. 5,128,247, beschrieben.
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Ein
weiteres Verfahren zur DNA-Isolation, das in Botwell, D. D. L., "Rapid Isolation of
Eukaryotic DNA",
Anal. Biochem. 162, 463–465
(1987), beschrieben ist, beinhaltet das Lysieren von Zellen in 6 M
Guanidinhydrochlorid, Ausfällen
von DNA aus dem Lysat bei saurem pH durch Zugabe von 2,5 Volumina Ethanol,
und Waschen der DNA mit Ethanol. Es wird jedoch angenommen, daß die erhaltene
DNA mit einem Material von niedrigem Molekulargewicht, wie beispielsweise
RNA und Pigmenten, kontaminiert sein kann. Diese Schlußfolgerung
befindet sich in Übereinstimmung
mit der wohlbekannten Beschreibung, wonach unter vergleichbaren
Bedingungen RNA aus Zellen oder Gewebelysat ausgefällt werden kann.
Siehe Chirgwin, J. M. et al., "Isolation
of Biologically Active Ribonucleic Acid from Sources Enriched in
Ribonuclease", Abt.
für Biochemie
und Biophysik, Univ. Kalifornien, Bd. 18, Nr. 24, S. 5294–5299 (1979).
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Natriumiodid,
ein anderes chaotropes Mittel, ist zur DNA-Isolierung verwendet worden, jedoch
erfordert seine Verwendung einen zusätzlichen Reinigungsschritt,
bestehend aus der Adsorption der isolierten DNA an Glasperlen. Obwohl
dieses Verfahren relativ einfach ist, führt es zu einem niedrigen Ertrag an
isolierter DNA.
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Bei
einem weiteren Ansatz wird der Großteil von zytoplasmatischem
Protein und RNA durch Lyse von Zellproben in einer Detergenzlösung entfernt. Das
Lysat wird anschließend
in Kern- und Cytoplasmafraktionen fraktioniert. Danach wird die
DNA durch Lösen
der Kernfraktion in einer chaotropen Lösung, Ausfällen und Waschen mit Ethanol
gereinigt. Dieses Verfahren, beschrieben in Ciulla, T. A. et al., "A Simple Method for
DNA Purification from Peripheral Blood", Anal. Biochem. 174, 485–488 (1988),
kann innerhalb von 2 Stunden durchgeführt werden und ist geeignet
zur Isolierung von DNA aus Vollblut.
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Bekannte
Techniken zur Isolierung von RNA verwenden typischerweise entweder
Guanidinsalze oder Phenolextraktion, wie zum Beispiel in Sambrook,
J. et al., "Molecular
Cloning", Bd. 1,
S. 7.3–7.24,
Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) und Ausubel, F. M. et
al., "Current Protocols
in Molecular Biology",
Bd. 1, S. 4.0.3–4.4.7,
John Wiley & Sons,
Inc. (1994) beschrieben. Phenolbasierte Techniken sind Mehrschritt-Verfahren,
die mehrere Stunden oder Tage bis zum Abschluß benötigen. Die guanidinbasierten
RNA-Isolationsverfahren
benötigen
gleichermaßen
mindestens mehrere Stunden oder erfordern viele Schritte zum Abschluß. In meinem
früheren
US-Patent Nr. 4,843,155 wurden Phenol- und Guanidinverfahren einzigartig
kombiniert, was zu einem einfachen Verfahren zur Isolierung von Gesamt-RNA
führte,
das innerhalb von 3 Stunden abgeschlossen werden kann. Das Verfahren
des '155-Patents
wurde weiter in meinem '994-Patent verbessert,
das die Vervollständigung
der RNA-Isolation in etwa 1 Stunde ermöglicht.
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Es
existieren auch bekannte Techniken zur gleichzeitigen Isolation
von DNA und RNA, wie in meinem früheren '994-Patent referenziert, dessen Offenbarung
hier durch Inbezugnahme aufgenommen wird. All diese Techniken verwenden
Phenolextraktion als einen notwendigen Schritte zur Isolierung von
RNA und DNA, die frei ist von Proteinkontamination.
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Die
US 5,128,247 betrifft ein
Verfahren zur Nukleinsäureisolierung
unter Verwendung chaotroper Zusammensetzungen wie beispielsweise
Guanidinisothiocyanat in Kombination mit polyanionischen Zusammensetzungen
und unter Verwendung von etwa 70% Ethanol oder 50% Isopropanol.
Gleichermaßen
ist in J. Microbiol. Methods (1994), 19 (3), 167–172, ein Verfahren zur Extraktion
von DNA unter Verwendung eines chaotropen Mittels, wie beispielsweise
NaI, zusammen mit 40%–50%
Isopropanol und 70% Ethanol offenbart. Die
US 5,162,507 betrifft ein Verfahren
zum Erlangen von reinem rekombinanten IL-2 aus zerstörten Zellen.
Die Extraktion wird unter Verwendung von Guanidinhydrochlorid mit
einem Reduktionsmittel durchgeführt.
Organische Lösungsmittel
sind nicht zugegen. Die WO 92/00983 betrifft ein Verfahren zur Extraktion
von Nukleinsäuren
unter Verwendung einer Extraktionslösung enthaltend mindestens
eine organische Verbindung wie 4-Hexylresorcin, Resorcin, Benzylalkohol,
2-Methyl-Benzylalkohol
etc. Die Probe kann vor der Kombination mit der organischen Verbindung
mit einem lysierenden Mittel, wie beispielsweise Guanidinhydrochlorid,
zusammengebracht werden. Schließlich
wird die Nukleinsäurefraktion
durch Zugabe von vier Volumen Ethanol oder einem Volumen Isopropanol
ausgefällt.
Die
EP 0554034 betrifft
ein Verfahren zur Isolierung von RNA, DNA und Proteinen unter Verwendung
einer Lösung
umfassend eine Phenol- und eine Guanidinverbindung. Der Gesamtgehalt
organischen Lösungsmittels
(d. h. Phenol und Glycerin) beträgt
etwa 33%–60%.
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Vordem
war die Ansicht allgemein anerkannt, daß die Ausfällung von Nukleinsäuren aus chaotropen
Lösungsmitteln
nicht zu reinen Nukleinsäure-Zubereitungen
führt.
Im Gegensatz zu dieser Ansicht hat der vorliegenden Erfinder jedoch
gefunden, das unter bestimmten Bedingungen, die hier in aller Ausführlichkeit
beschrieben werden, die Verwendung von chaotropen Mitteln allein
zur Isolierung von testfertiger, hochqualitativer DNA und RNA führt. Dieser
unerwartete Befund führte
zur Entwicklung eines sehr einfachen, wirksamen Verfahrens und Produktes
zur gleichzeitigen Isolation von DNA, RNA und Proteinen aus einer
einzelnen Probe zur anschließenden
Verwendung in der Molekularbiologie, Biotechnologie, klinischen
Forschung und anderen Anwendungen.
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Zusammenfassende
Darstellung der Erfindung
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Die
Produkte und Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung stellen ein hochwirksames, einfaches Mittel zur Extraktion
von DNA, RNA und Proteinen aus einer einzigen Probe biologischen
Materials, wie beispielsweise Zellen, Geweben und biologischen Flüssigkeiten,
bereit. Vorteilhafterweise können
diese Ergebnisse ohne die Verwendung von toxischen oder korrosiven
Reagenzien und ohne den Einsatz einer teuren Ultrazentrifugen-Ausstattung
erreicht werden. Genomische DNA und Gesamt-RNA kann unter Verwendung
der erfindungsgemäßen Produkte
und Verfahren in 20 Minuten und Proteine in 30 Minuten isoliert
werden. Diese Ergebnisse sind wesentlich schneller als bestehende
Verfahren zur gleichzeitigen Isolierung von DNA, RNA und Proteinen.
Die Erfindung ist auch anwendbar zur separaten Isolierung von RNA
allein, DNA allein, Proteinen allein oder jeder Kombination von
zweien dieser Zellbestandteile. Die erhaltene genomische DNA und Gesamt-RNA,
die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Produkte
isoliert wurden, sind von hoher Qualität, die zur Verwendung in der Forschung,
Biotechnologie, etc. geeignet ist. Die Erfindung beruht teilweise
auf dem unerwarteten Befund, daß bei
Verwendung der erfindungsgemäßen Produkte
RNA vor DNA ausgefällt
wird, was im Gegensatz zu den Verfahren gemäß dem Stand der Technik steht.
Insbesondere befindet sich der Befund, wonach die Lösungsmittellösung der
vorliegenden Erfindung RNA vor DNA ausfällt, in starkem Gegensatz zum
Stand der Technik, wie beispielsweise Koller, US-Patent Nr. 5,128,247,
worin beschrieben ist, daß DNA
eine geringere Löslichkeit
als RNA zeigt und offenbar leichter als RNA ausgefällt werden kann.
Darüber
hinaus sind wesentlich geringere Mengen von organischen Lösungsmitteln
erforderlich, um die Ausfällung
der Zellbestandteile zu bewirken.
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In
ihrem breitesten Aspekte umfaßt
die Erfindung Lösungen
zur Isolierung im wesentlichen reiner und unabgebauter RNA, DNA
und Proteine aus biologischen Materialien, einschließlich Geweben,
Zellen und Flüssigkeiten.
Die Lösung
beinhaltet wirksame Mengen eines chaotropen Mittels (chaotroper Mittel),
Puffer, Reduktionsmittel und Wasser (mit oder ohne organische(s)
Lösungsmittel).
Das (die) chaotrope(n) Mittel bewirken die Trennung von Proteinen von
Nukleinsäuren
(RNA und DNA) und hemmen die Aktivität von nukleinsäureabbauenden
Enzymen. Die Wirkungen der Chaotrope werden durch das in der Lösungsmittellösung anwesende
Reduktionsmittel potenziert. Die Lösung beinhaltet ein organisches
Lösungsmittel,
dessen Gegenwart die Solubilisierung von RNA verhindert, wodurch
es die Entfernung von RNA aus dem bei der Homogenisierung der Gewebeprobe
in der Lösungsmittellösung gebildeten
Homogenat durch einen kurzen Zentrifugationsschritt ermöglicht.
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Bevorzugte
chaotrope Mittel für
die Lösung beinhalten
Guanidinthiocyanat, Guanidinhydrochlorid und Mischungen davon. Diese
Bestandteile können
mit anderen Chaotropen wie beispielsweise Harnstoff oder Natriumiodid
versetzt sein. Bevorzugte Konzentrationen von Chaotropen in der
Lösung
liegen im Bereich von etwa 2 M–7
M. Vorzugsweise ist das Reduktionsmittel nicht toxisch, wie beispielsweise
2-Aminoethanthiol.
Falls erforderlich, kann dieses durch 2-Mercaptoethanol ersetzt werden; dies
ist jedoch eine toxische Zusammensetzung. Das Reduktionsmittel erleichtert
die Denaturierung der RNase durch die Chaotrope und erleichtert
die Isolierung von unabgebauter RNA.
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Die
erfindungsgemäße Lösung enthält eine ausreichende
Menge Puffer, um den pH der Lösung oberhalb
von etwa 6 zu halten. Für
die gleichzeitige Isolierung von RNA, DNA und Proteinen sollte der
pH im Bereich von etwa 6–7,5
gehalten werden. Für
die Isolierung von DNA allein kann der wirksame pH-Bereich etwa
6–12 betragen.
Die bevorzugten Puffer zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Lösungen beinhalten
Tris-Salzsäure,
Natriumphosphat, Natriumactetat, Natriumborat-Borsäure und
Glycin-Natriumhydroxid.
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Wie
angegeben, enthält
die Lösung
ein organisches Lösungsmittel.
Die bevorzugten Lösungsmittel
sind niedere Alkohole wie beispielsweise Methanol, Ethanol und Isopropanol.
Andere wassermischbare Lösungsmittel,
die die gewünschte
Wirkung erreichen, wie beispielsweise Aceton, Polyethylenglykol
und Dimethylsulfoxid, oder Mischungen der vorstehenden Verbindungen,
können
jedoch verwendet werden. Die wirksame Konzentration von organischen
Lösungsmitteln
in dem erfindungsgemäßen Produkt
liegt im Bereich von etwa 15–30
Volumen-%.
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Die
erfindungsgemäße Lösung kann
zusätzliche
Bestandteile enthalten, einschließlich organischer und anorganischer
Salze wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumchlorid, Natriumphosphat, Natriumacetat,
Natriumnitrit, Lithiumchlorid und Natriumbromid. Darüber hinaus
können
kompatible Detergenzien wie Sarkosine und Polyoxyethylensorbitan
und chelatbildende Mittel wie Ethylendiamintetraessigsäure und
Zitronensäure
zur Förderung
der Gewebe-Solubilsierung und Ausfällung von Nukleinsäuren verwendet
werden.
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In
einem anderen Aspekte umfaßt
die Erfindung Verfahren zur Isolierung im wesentlichen reiner RNA,
DNA und Proteine aus Proben biologischen Materials. Unter Verwendung
der erfindungsgemäßen Lösungen und
insbesondere denjenigen, bei denen die Lösung ein organisches Lösungsmittel
enthält,
beinhaltet das Verfahren einen anfänglichen Schritt des Homogenisierens
einer Probe biologischen Materials in der Lösung zur Bildung eines Homogenats.
Die Anwesenheit des organischen Lösungsmittels verhindert die
Solubilisierung von RNA, wodurch es die Entfernung von RNA aus dem
Homogenat durch kurze Zentrifugation (Sedimentation) ermöglicht.
Anschließend
wird die DNA aus dem verbliebenen Homogenat durch Zugabe einer wirksamen
Menge eines organischen Lösungsmittels
und Gewinnen der gefällten
DNA durch kurze Zentrifugation (Sedimentation) ausgefällt. Schließlich präzipitiert
die Zugabe einer wirksamen Menge eines organischen Lösungsmittels
zu dem verbliebenen Homogenat Proteine daraus. Die aufeinanderfolgende
Zugabe von organischen Lösungsmitteln,
um genomische DNA und Proteine aus dem Nach-RNA-Homogenat auszufällen, erfordert
eine begrenzte Menge des organischen Lösungsmittels. Im Anschluß an eine
Waschung mit Ethanol sind die drei Zellbestandteile jeweils separat
und vollständig
zur Verwendung in der Molekularbiologie, Biotechnologie und in klinischen
Forschungsanwendungen fertig. Vorzugsweise wird das organische Lösungsmittel,
das zur Ausfällung
von DNA verwendet wird, in einem Verhältnis von etwa 0,15–0,3 Volumen
Lösungsmittel
pro einem Volumen anfänglichen
Homogenats zugegeben. Das organische Lösungsmittel, das zur Ausfällung von Proteinen
zugegeben wird, wird vorzugsweise im Verhältnis von etwa 3–4 Volumen
Lösungsmittel
pro einem Volumen anfänglichen
Homogenats zugegeben. Ein für
diesen Zweck bevorzugtes organisches Lösungsmittel ist Isopropanol,
obwohl andere geeignete organische Lösungsmittel verwendet werden können.
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In
einer alternativen Methodik, bei der die Lösung keine organischen Lösungsmittelbestandteile enthält, wird
das Homogenat gebildet und ein anfänglicher Zentrifugationsschritt
wird ausgeführt,
um jegliches nicht homogenisiertes Gewebe zu entfernen. Danach wird
eine wirksame Menge des organischen Lösungsmittels zugegeben, um
die Solubilisierung der Gesamt-RNA zu verhindern. Dies ermöglicht es, die
RNA aus dem Homogenat durch eine kurze Zentrifugation (Sedimentation)
zu gewinnen. Vorzugsweise wird das organische Lösungsmittel, das zur Ausfällung der
RNA zugegeben wird, in einem Verhältnis von etwa 0,15–0,3 Volumen
Lösungsmittel
pro einem Volumen anfänglichen
Homogenats zugegeben. Einmal getrennt, wird die RNA mit Ethanol
gewaschen, und der RNA-Niederschlag kann in Formamid gelöst und bei –20°C aufbewahrt
werden. Die Verwendung von Formamid als ein Solubilisierungsmittel
ist vorteilhaft, da es die RNA vor dem Abbau durch RNase schützt, die
anderenfalls die isolierte Nukleinsäure kontaminieren kann.
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Im
Anschluß an
die Ausfällung
der RNA wird die DNA durch Zugabe von zusätzlichen 0,15–0,3 Volumen
organischen Lösungsmittels
pro einem Volumen des anfänglichen
Homogenats ausgefällt.
Der DNA-Niederschlag wird durch Aufspulen oder kurze Zentrifugation
(Sedimentation) aus dem Homogenat entfernt. Proteine und andere
Zellbestandteile bleiben in dem Homogenat zurück und der Proteinbestandteil
wird durch Zugabe von 3–4
Volumen eines organischen Lösungsmittels
pro einem Volumen des anfänglichen
Homogenats ausgefällt.
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Insgesamt
und im Vergleich mit anderen bekannten Methodiken wird die Ausfällung von
Nukleinsäuren
gemäß der vorliegenden
Erfindung mit einer wesentlich reduzierten Menge organischer Lösungsmittel
durchgeführt.
Beispielsweise erfordert die Ausfällung von RNA in Sambrook,
J. et al., "Molecular Cloning", Bd. 1, S. 7.3–7.24, Cold
Spring Harbor Press (1989), die Zugabe von 0,5–2,5 Volumen eines niederen
Alkohols zu einem Volumen der chaotropen Lösung. Darüber hinaus wurde die RNA-Präzipitation für mehrere
Stunden bei –20–4°C durchgeführt. Im Gegensatz
dazu ist die Ausfällung
von RNA gemäß dem vorliegenden
Verfahren in etwa 3–5
Minuten abgeschlossen und wird bei Raumtemperatur durchgeführt. Hinsichtlich
der DNA-Ausfällung
beschreibt Botwell, D. D. L. "Rapid
Isolation of Eukaryotic DNA", Anal.
Biochem. 162, 463–465
(1987), die Ausfällung aus
chaotropen Lösungen,
die mit 2–2,5
Volumen Ethanol durchgeführt
werden. Gleichermaßen
sind hohe Volumina von Alkohol für
die wirksame DNA-Ausfällung
aus nicht-chaotropen Lösungen, beispielsweise
in Ausubel, F. M. et al., "Current
Protocols in Molecular Biology",
Vol. 1, pp. 221–245, John
Wiley & Sons,
Inc. (1994), empfohlen worden.
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Die
unerwartet niedrige Konzentration von organischen Lösungsmitteln,
die zur Ausfällung
von RNA und DNA aus den erfindungsgemäßen chaotropen Lösungen erforderlich
sind, macht es möglich, RNA
und DNA in hochreiner Form zur Verwendung in der Molekularbiologie
und Biotechnologie sowie für klinische
Forschungs- und andere Anwendungen zu erhalten.
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Diese
und andere Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung
werden beim Studium der hier gegebenen ausführlichen Beschreibung und Ausführungsbeispiele
ersichtlich werden.
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Kurze Beschreibung der
Figuren
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1A zeigt
die elektrophoretische Analyse von Nukleinsäuren, die gemäß Beispiel
1 isoliert wurden;
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1B zeigt
die Eignung der Gesamt-RNA für
die RT-PCT;
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1C zeigt
die Eignung der genomischen DNA für PCR;
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1D zeigt
die Ergebnisse der Proteinanalyse durch Western-Blotting;
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2A zeigt
die elektrophoretische Analyse von Nukleinsäuren, die gemäß Beispiele
2 isoliert wurden;
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2B zeigt
die Ergebnisse der Gesamt-RNA-Analyse durch Northern-Blotting;
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2C zeigt
die Ergebnisse der Analyse genomischer DNA durch Southern-Blotting;
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2D zeigt
die Ergebnisse der Proteinanalyse durch Western-Blotting; und
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3 zeigt
die Ergebnisse der Analyse genomischer DNA durch Elektrophorese
wie isoliert in Beispiel 5.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Bevorzugte
Lösungen
und Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung werden in den folgenden Ausführungsbeispielen beschrieben.
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Beispiel 1 – Gleichzeitige
Isolierung von DNA, RNA und Proteinen aus Zellen
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Ein
erfindungsgemäße Verfahren
wurde verwendet, um DNA, RNA und Proteine aus somatomammotrophen
P0-Rattenzellen zu isolieren. Etwa 108 P0-Zellen
wurden in 10 ml erfindungsgemäßer Lösung lysiert
(homogenisiert), die folgendes enthielt: 4 M Guanidinthiocyanat
(Amresco, Inc., Solon, Ohio), 17% Isopropanol, 0,1 M Natriumacetat,
0,1 M 2-Aminoethanthiolhydrochlorid
(Sigma, St. Louis, Mo.) und 0,2% Sarkosyl in Wasser. Die Lösung wurde
mit Salzsäure
auf pH 7,0 eingestellt. Sofern nichts anderes angegeben, wurden
die chemischen Reagenzien von Fisher Scientific (Pittsburgh, Pa.)
erhalten. Anschließend
wurden 0,6-ml-Teilmengen des Lysats (Homogenats) eingefroren oder
sofort für
die Isolation verwendet. Die 0,6-ml-Teilmengen, die wie unten beschrieben
verwendet wurden, enthielten 37,3 μg DNA, wie durch die Diphenylamin-Reaktion festgestellt
wurde.
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RNA-Isolierung
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Das
Lysat (0,6 ml) wurde für
8 Minuten bei 10.000 g bei Raumtemperatur zentrifugiert, um die Gesamt-RNA
zu sedimentieren. Das Post-RNA-Lysat wurde in ein frisches Reaktionsgefäß transferiert und
für die
unten beschriebene DNA- und Protein-Isolierung aufbewahrt. Der Niederschlag
wurde mit 1 ml 95% Ethanol durch Vortexen und Abpipettieren des
Ethanols gewaschen. Schließlich
wurde die RNA in Formamid gelöst
und bei –20°C aufbewahrt.
Die Isolation der Gesamt-RNA
war innerhalb von 11 Minuten abgeschlossen. Die isolierte RNA zeigt
ein 260/280-Verhältnis
von 1,79 ± 0,05,
mit einem Ertrag von 49,2 ± 2,8 μg RNA (Mittelwert ± SD, n
= 3). Northern-Blotting der isolierten RNA-Präparate zeigte ein nicht abgebautes
Muster von mRNA bei Testung auf Wachstumshormon-, Prolaktin-, β-Aktin- und GAPDH-mRNAs.
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Für die Verwendung
in der Reverstranskriptions-PCR (RT-PCR) wurde eine Teilmenge des RNA-solubilisierten
Formamids mit 3 Volumen Ethanol gefällt. Der Niederschlag wurde
in Wasser gelöst und
für die
RT-PCR verwendet.
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Es
wurde gefunden, das spektralphotometrische Messungen zur Bestimmung
der optischen Dichte von RNA und DNA wesentlich verbessert werden,
wenn sie in einer Lösung
durchgeführt
werden, die Konzentrationen von chelatbildenden Mitteln enthalten,
die höher
als üblich
sind. Für
diesen Zweck sollte die Konzentration der (des) chelatbildenden Mittel(s)
höher sein
als 5 mM, mit einem Optimum für Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
bei 10 mM und für
Citrat bei 30 mM. Dies ist ein neuer und unerwarteter Befund. Üblicherweise
werden Messungen der optischen Dichte von RNA und DNA in Wasser
oder 1 mM EDTA durchgeführt.
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Bei
einer höheren
Konzentrationen von chelatbildenden Mitteln sind die Messungen der
optischen Dichte reproduzierbarer und führen zu einem höheren 260/280-Verhältnis. Beispielsweise
wies die in Beispiel 1 beschriebene RNA-Zubereitung ein 260/280-Verhältnis von
1,79 ± 0,05
bei Messung in Wasser und ein Verhältnis von 1,97 ± 0,01
bei Messung in 10 mM EDTA auf.
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DNA-Isolierung
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DNA
wurde aus dem Nach-RNA-Lysat durch Zugabe von 0,15 ml Isopropanol
ausgefällt.
Der flotierende DNA-Niederschlag wurde auf die Pipettenspitze aufgedreht
(aufgespult) und in ein neues Reaktionsgefäß transferiert. Das verbliebene Nach- DNA-Lysat wurde für die unten
beschriebene Proteinisolierung aufbewahrt. Die DNA wurde durch Mischen
mit 1 ml 95% Ethanol und Abpipettieren des Ethanolwaschmittels gewaschen.
Die endgültige DNA-Zubereitung
wurde durch sanftes Pipettieren in 8 mM NaOH gelöst, gefolgt von einer Neutralisierung der
Lösung
mit N-[2-hydroxyethyl]piperazin-N-[2-ethansulfonsäure] (HEPES,
freie Säure). Die
Isolation war in weniger als 14 Minuten abgeschlossen. Die isolierte
DNA zeigte ein 260/280-Verhältnis
von 1,81 ± 0,02
(SD, n = 3), was das Fehlen einer Proteinkontamination anzeigt.
Der durchschnittliche Ertrag bei drei Isolierungen betrug 33,9 ± 2,9 (SD,
n = 3) μg
DNA. Im Vergleich zur ursprünglichen
Menge DNA im Lysat, bestimmt durch Diphenylalanin-Reaktion, stellt
das erfindungsgemäße Verfahren
eine 91%ige Wiederfindung von DNA bereit.
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Proteinisolierung
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Proteine
wurden durch die Zugabe von 1,8 ml Isopropanol und Zentrifugation
bei 10.000 g für
5 Minuten aus dem Nach-DNA-Lysat
ausgefällt.
Der Niederschlag wurde mit 90% Ethanol. gewaschen und in 1 N Essigsäure gelöst. Alternativ
konnte der Niederschlag in 0,1% Natriumdodecylsulfat oder in Wasser
gelöst
werden. Die Protein-Isolierung war in 22 Minuten abgeschlossen.
Die isolierte Protein-Zubereitung wurde durch Western-Blotting unter
Verwendung eines spezifischen Anti-Ratten-Prolaktin-Antikörpers getestet.
Die Anwesenheit der prolaktinspezifischen Bande im Western-Blot
zeigt die gute Qualität
der isolierten Protein-Zubereitung an.
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Die
Ergebnisse der Tests, die mit der gleichzeitig isolierten RNA, DNA
und Proteinen durchgeführt
wurden, sind in 1 dargestellt. 1A zeigt die
Ergebnisse von Nukleinsäuren, die
einer Elektrophorese in 1% Agarosegel unterzogen wurden und mit
Ethidiumbromid gefärbt
wurden. Die Spuren 1 und 2 zeigen unabgebaute Gesamt-RNA (3 μg/Spur); die
Spuren 3 und 4 zeigen genomische DNA mit hohem Molekulargewicht
(3 μg/Spur);
und die Spuren 5 und 6 zeigen genomische DNA (3 μg), die für 2 Stunden mit EcoR1-Restriktase
verdaut wurde. Wie die Ergebnisse zeigen, gibt es keine detektierbare
DNA in der RNA-Zubereitung und keine detektierbare RNA in der DNA-Zubereitung. Der
vollständige
Abbau von DNA durch EcoR1-Restriktase
zeigt die gute Qualität
der isolierten DNA. Die 1B–D zeigen die Ergebnisse von RT-PCR, PCR
und Western-Blotting, die mit Gesamt-RNA, genomischer DNA bzw. Proteinen
durchgeführt
wurden, die wie oben beschrieben isoliert wurden. Die RT-PCR (1B)
und PCR (1C) wurden unter Verwendung
von Glycerinaldehyde-3-phosphat-Dehydrogenase(GAPDH)-
bzw. Ratten-Wachstumshormon(GH)-Primern durchgeführt, und die Westernblots (1C)
wurden unter Verwendung von Anti-Ratten-Prolaktin-Antikörper durchgeführt. Die
Amplifikation des 374 Basenpaare langen GADPD-DNA-Fragments bei der
RT-PCR und des 686 Basenpaare langen GH-DNA-Fragments bei der PCR zeigt, daß die isolierten
Nukleinsäure-Zubereitungen
(RNA und DNA) angemessen rein für
die PCR-Reaktion sind. Die Anwesenheit einer prolaktinspezifischen
Bande im Westernblot zeigt die hohe Qualität der isolierten Protein-Zubereitung.
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Entsprechende
Ergebnisse für
die gleichzeitige Isolierung von RNA, DNA und Proteinen wurden erhalten,
wenn anstelle von Isopropanol andere wassermischbare organische
Lösungsmittel
wie Ethanol, Methanol, Aceton, Dimethylsulfoxid, Polyethylenglykol
oder Mischungen dieser Lösungsmittel
verwendet werden. Diese wassermischbaren organischen Lösungsmittel
können
als Bestandteile der lysierenden Lösung und/oder als Fällungsmittel
verwendet werden. Alle Lösungsmittel
sind von Unternehmen wie Aldrich Chemical Co., Inc. (Milwaukee,
Wis.) oder Fluka Chemical Corp. (Ronkonkoma, N.Y.) erhältlich.
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Beispiel 2 – Gleichzeitige
Isolierung von RNA, DNA und Proteinen aus Geweben
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Bei
dieser Ausführungsform
des Verfahrens enthält
die Lösung
keinen organischen Lösungsmittelbestandteil.
Dies erlaubt die Entfernung jeglicher nicht homogenisierter Gewebefragmente
aus dem Lysat (Homogenat) durch eine kurze anfängliche Zentrifugation. Danach
wird die RNA durch Zugabe von 0,2–2,3 Volumen eines organischen
Lösungsmittels
aus dem klaren Lysat ausgefällt.
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Eine
gefrorene Probe Ratten-Hypophyse wurde in einem tragbaren Glas-Teflon-Homogenisierer
mit 1 ml einer Lysierungslösung
enthaltend 4 M Guanidinthiocyanat, 0,1 M Natriumactetat, 0,1 M 2-Aminoethanthiolhydrochlorid
und 0,2% Sarkosyl in Wasser homogenisiert. Die Lösung wurde mit Salzsäure auf
pH 7,0 eingestellt. Das Homogenat wurde bei 10.000 g für 5 Minuten
zentrifugiert. Der klare Überstand
wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt, mit
0,3 ml Isopropanol gemischt und für 3 Minuten bei Raumtemperatur
aufbewahrt, um die RNA auszufällen.
Die ausgefällte
RNA wurde durch Zentrifugation bei 10.000 g für 8 Minuten entfernt und in Formamid
gelöst.
Der Nach-RNA-Überstand
wurde weiterverarbeitet, um DNA und Proteine in gleicher Weise wie
in Beispiel 1 beschrieben zu isolieren. Die DNA und Proteine wurden
nacheinander durch Zugabe von 0,5 ml Aceton bzw. 10,75 ml Aceton
aus dem Nach-RNA-Lysat ausgefällt.
Die isolierte RNA zeigte ein 260/280-Verhältnis von 1,74 und der Ertrag
lag bei 0,06 mg. Die DNA zeigte ein 260/280-Verhältnis von 1,78 und der Ertrag
lag bei 0,04 mg. Wie in 2A dargestellt,
war keine detektierbare DNA in der RNA-Zubereitung zugegen und keine
detektierbare RNA in der DNA-Zubereitung anwesend. Wie in 1A,
wurden die Nukleinsäuren
einer Elektrophorese in 1% Agarosegel unterzogen und mit Ethidiumbromid
gefärbt.
Die Spuren 1 und 2, Gesamt-RNA (3 μg/Spur); Spuren 3 und 4, genomische
DNA (3 μg/Spur);
und Spuren 5 und 6, genomische DNA (3 μg), für 2 Stunden verdaut mit EcoR1-Restriktase.
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Die
Zubereitungen der Gesamt-RNA, genomischen DNA und Proteine wurden
durch Northern-, Southern- und Western-Blotting auf Ratten-Wachstumshormon(GH)-mRNA,
GH-Gen bzw. GH getestet. Alle drei Analysen, dargestellt in den 2B–D zeigen, daß das erfindungsgemäße Verfahren
hochqualitative RNA-, DNA- und Protein-Zubereitungen ergab.
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Beispiel 3 – Isolierung
von RNA aus Zellen ohne Zentrifugation des anfänglichen Lysats
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Brusttumor-MCF7-Zellen
wurden in einer Monolayer-Kultur in einer 3,5-cm-Petrischale angezogen.
Am Ende der Kulturperiode wurde das Kulturmedium entfernt und die
Zellen wurden durch Zugabe von 1 ml der lysierenden Lösung direkt
in die Kulturschale lysiert. Die verwendete lysierende Lösung war
die aus Beispiel 1. Das Lysat wurde bei 10.000 g für 5 Minuten
zentrifugiert und der RNA-Niederschlag wurde mit 95% Ethanol gewaschen
und in Formamid gelöst.
Die isolierte RNA zeigte ein 260/280-Verhältnis von 1,81 und der Ertrag
lag bei 22 μg
RNA.
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Beispiel 4 – Isolation
von RNA aus Geweben mit Zentrifugation des anfänglichen Lysats zur Entfernung von
Gewebefragmenten
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Rattenniere
(0,95 g) wurde in 19 ml einer lysierenden Lösung mit folgender Zusammensetzung homogenisiert:
4 M Guanidinthiocyanat, 0,1 M Natriumactetat und 0,2% Sarkosyl in
Wasser. Die Lösung wurde
mit Salzsäure
auf pH 7,0 eingestellt. Das Homogenat wurde zur Entfernung ungelösten Materials bei
10.000 g für
5 Minuten zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde in ein neues
Reaktionsgefäß überführt und
die RNA wurde aus dem Überstand
durch Zugabe von 3,8 ml (0,3 Volumen) Isopropanol ausgefällt und
bei 10.000 g für
8 Minuten zentrifugiert. Der RNA-Niederschlag wurde in Formamid
gelöst
und bei –20°C aufbewahrt.
Die RNA-Zubereitung
zeigte ein 260/280-Verhältnis
von 1,77 und der Ertrag lag bei 3,9 mg RNA.
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Beispiel 5 – Isolierung
von DNA aus Zellen ohne Zentrifugation
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Die
lysierende Lösung,
die für
diese DNA-Isolierung verwendet wurde, enthielt die folgenden Bestandteile:
4 M Guanidinthiocyanat, 0,1 M Natriumactetat, 17% Isopropanol, 0,2%
Sarkosyl in Wasser. Die lysierende Lösung wurde durch Zugabe von
0,4 M NaOH auf pH 9 eingestellt.
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Ratten-Hypophyse-P0-Zellen
wurden durch wiederholtes Pipettieren in der lysierenden Lösung lysiert.
Das Lysat wurde mit 0,4 Volumen Ethanol gemischt und die ausgefällte DNA
wurde auf eine Pipettenspitze aufgedreht und zweimal mit 95% Ethanol gewaschen.
Die erhaltene DNA wurde in 8 mM NaOH gelöst und auf pH 8,0 mit 0,1 M
HEPES-Puffer neutralisiert.
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Diese
Ausführungsform
der Erfindung verkürzt
das DNA-Isolations-Protokoll
durch Auslassen der Zentrifugation des Lysats. Das Weglassen der Zentrifugation
führt zu
einer nur geringen Kontamination der isolierten DNA mit RNA. Die
Analyse der wie oben beschrieben isolierten genomischen DNA wurde
durch Elektrophorese derselben in 1% Agarosegel und Färbung mit
Ethidiumbromid durchgeführt. Die
Spuren 1 und 2 in 3 sind genomische DNA (3 μg/Spur),
und die Spuren 3 und 4 sind genomische DNA, die für 2 Stunden
mit EcoR1 verdaut wurde. Es ist aus 3 ersichtlich,
daß nur
eine Rückstandsmenge
von RNA im Bereich niedrigen Molekulargewichts des Agarosegels durch
die Ethidiumbromid-Färbung festgestellt
wurde. Offenbar entfernt das Aufwickeln der DNA auf eine Pipettenspitze hauptsächlich DNA,
während
der Großteil
der teilweise hydrolysierten RNA (wie durch deren geringes Molekulargewicht
gezeigt wird) in dem Lysat verbleibt. Die Anwesenheit eines Reduktionsmittels
ist für
die Isolierung von DNA nicht erforderlich und die lysierende Lösung kann
einen pH im Bereich von 6–12
aufweisen. Der alkalische pH kann mit NaOH, KOH oder anderen organischen
oder anorganischen alkalischen Reagenzien eingestellt werden. Es
wird angenommen, daß die
besten Ergebnisse erhalten werden, wenn das Lysat einen pH zwischen
8–9 aufweist.
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Die
unerwartete und rasche Hydrolyse von RNA, die bei pH 8–pH 9 auftritt,
kann auf die Anwesenheit des chaotropen Mittels zurückgeführt werden.
Dieser neue Befund ermöglicht
die Isolation von DNA guter Qualität in einem einfachen Ein-Schritt-Verfahren.
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Das
Protokoll für
die DNA-Isolation ohne Zentrifugation kann in weniger als 10 Minuten
abgeschlossen werden. Es wird angenommen, daß dies das schnellste und einfachste
Verfahren zur Isolierung von genomischer DNA ist. Wichtig ist hierbei, daß die einzige
erforderliche Ausstattung für
dieses Verfahren Reaktionsgefäße und Pipetten
sind. Dies ermöglicht
die Durchführung
der DNA-Isolierung auf einer Exkursion oder anderswo mit einem begrenzten
Zugriff auf Laborausstattung.
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Beispiel 6 – Isolierung
von DNA aus Geweben mit einer Zentrifugation des Lysats
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Ratten-Milz
(147 mg) wurden in einem tragbaren Glas-Teflon-Homogenisierer mit 5 ml der in Beispiel
5 beschriebenen lysierenden Lösung
homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 10.000 g für 5 Minuten
zentrifugiert. Der Überstand
wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und
die DNA wurde ausgefällt
und wie in Beispiel 5 gewaschen. Die isolierte DNA zeigte ein 260/280
Verhältnis
von 1,76 und der Ertrag lag bei 1,93 mg DNA.
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Der
Schutzbereich der vorliegenden Erfindung soll durch die hier beschriebenen
spezifischen Beispiele nicht limitiert werden, sondern soll einen Schutzbereich
zugewiesenen bekommen, der den beigefügten Ansprüchen entspricht.