JP4836795B2 - 核酸プロセシング方法、キット、及び装置 - Google Patents
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Description
本発明は、1つ又は複数の核酸分子、即ち、DNA又はRNAのいずれかを、結合タンパク質から遊離されており且つその後の、検出、修飾、及び/又は前記核酸分子内の配列の介在的な増幅をともなう又はともなわない操作を含む用途のために利用可能な鋳型として調製することに関する。
細胞性試料と非細胞性試料の両方に存在する核酸分子、即ち、RNA及びDNAは、しばしば、タンパク質または他の高分子と会合しており、その結合は、核酸の検出又は酵素的操作を妨害する。この理由で、核酸を検出又は利用するために設計された多くのプロトコルは、1つ又は複数の精製及び/又は単離ステップから開始されるのであり、そのステップは、特定の標的配列の増幅やレポーター配列の複製のような後続の操作に先立って行われる。
本発明は、核酸を変性タンパク質から物理的に単離すること又は一方のタイプの核酸(デオキシリボ核酸(DNA)及びリボ核酸(RNA)分子)を他方から物理的に単離することなく、増幅及び検出又は他の酵素的プロセシングのためにDNAおよびRNA分子を調製するための方法、装置及び試薬を含む。本発明の調製方法は、試料含有材料のいかなる移動も伴わずに、単一の容器内で行うことができる。増幅及び検出のようなさらなるプロセシングは、試料含有材料のいかなる移動も伴わずに、上記調製された核酸を保持する容器内で行うことができる。本発明による方法は、単一の容器内、例えば、現行のサーマルサイクリング機器とともに使用することに適した200μlチューブ内、での核酸の調製、増幅及び検出を含む。本発明による方法は、核酸の移動、洗浄及び再懸濁を低減する又は無くすことによって核酸の剪断を低減又は最小限にし、以て、増幅反応、特にポリメラーゼ連鎖反応を利用した増幅におけるミスプライミングの問題を軽減する。
図1は、本発明にしたがって調製した複製核酸試料について実行された第1の標的配列についてのPCRアッセイの結果のグラフである。
本発明による破壊試薬は、カオトロピック剤、例えば、グアニジンイソチオシアネート又は塩酸グアニジンのようなグアニジウム塩、又はヨウ化カリウムを含む。水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムをDNA単独の調製についてのみ同等物として代用してもよい。なぜならば、その試薬はRNAを破壊するからである。本発明者らの好むカオトロピック剤であるグアニジンイソチオシアネートは、低温では、約2M以上の濃度で沈殿する傾向がある。試薬とピペットのような分取装置とを加熱するのではなく、ジメチルスルホキシド(DMSO)のような、プロセシング中に蒸発する非水性の水混和性溶媒を、破壊試薬中に少量、例えば1%(体積/体積)含めて、分取中の試薬液を保つようにすることができる。破壊試薬は、試料供給源が無傷の細胞を含みうる場合には、追加的に細胞溶解試薬を含有する。本発明者らは、0.25%サルコシル界面活性剤を利用するが、当業者に理解されるように、他のものを用いてもよい。追加的成分は、随意に破壊試薬に含めてもよい。示すように、本発明者らの現在の好ましい破壊試薬は、100mM還元剤、具体的にはβメルカプトエタノール、0.01M中性バッファー、具体的にはクエン酸ナトリウム、pH=7.0を含む。
試料の調製を本発明にしたがって行い、その後に、リアルタイム多重PCRアッセイを行ったが、全て単一のチューブ内で行った。調製の後の、すなわち第2ステップに続くプロセシングには、Hartshorn,C.ら(2002年),Developmentally-Regulated changes of Xist RNA Levels in Single Preimplantation Mouse Embryos,as Revealed by Quantitative Real-Time PCR,Mol.Reprod.Dev.61:425〜436頁;及びHartshorn,C.ら(2003年),Differential Patterns of Xist RNA Accumulation in Single Blastomeres Isolated from 8-Cell Stage Mouse Embryos Following Laser Zona Drilling,Mol.Reprod.Dev.64:41〜51頁に報告されたアッセイ材料及び方法を利用した。上記文献は両方ともその全体がここに組み込まれる。6個のマウス胚を、上に引用した第1の論文に詳説されたように、上記胚盤胞段階まで生育させた。全ての実験手順は、上記両方の引用論文に説明されたように環境性のRNアーゼ汚染を回避又は破壊することを目的とした防止策に厳格にしたがって行った。リゾドットを、胚の収集の数日前に、破壊試薬の20nlアリコートを反応チューブの蓋に分配することによって調製した。液滴サイズの正確な測定値は、Wangh (Wangh,L.J.(1989年),Injection of Xenopus Eggs Before Activation,Achieved by Control of Extracellular Factors,Improves Plasmid DNA Replication after Activation,J.Cell Sci.93:1〜8頁)によって先に説明された方法にしたがって得た。破壊試薬組成は:
0.25%サルコシル
2Mグアニジンイソチオシアネート
100mM βメルカプトエタノール
1%(体積/体積)ジメチルスルホキシド
0.01M酢酸ナトリウム=pH7.0
であった。
オスのマウスのゲノムDNAを減少させた量(10,000個のゲノムから10個のゲノムまで)を含有する対照反応を用いて、ゲノム個数対シグナルがバックグラウンドを超えて検出可能になるサーマルサイクルであるCTの線形プロットを構築した。結果を図3に示す。Xist(曲線31)シグナルとSry(曲線32)シグナルの両方についてのプロットは、実質的に重なる直線上にのっている。CT値が約19である図2の円21の曲線のCT値を図3の標準曲線31と比較し、CT値が約25である円22の曲線を図3の標準曲線31と比較することにより、各胚が約100個のゲノムを含有し、各メスの胚が数千コピーのXistRNA(cDNA)を含有すると計算することができる。これらの結果は、マウス胚からの核酸抽出物に対する伝統的手法に基づく、上記特定した論文で報告した本発明者らの以前の知見と非常によく類似している。
本発明の方法で調製された試料におけるDNアーゼ処理の効率を下記のように試験した。
1μlの、200mMトリス-HCl、pH8.4、20mM MgCl2及び500mM KClを含有する10 x 反応バッファー(Invitrogen,Life Technologies,カリフォルニア州カールスバッド)
0.5μlのDNアーゼI(2U/μl)(Ambion,Inc.,テキサス州オースチン)
8.5μlの、ヌクレアーゼを含まないH2O(Ambion)
0.5μlのDEPC-処理H2O
(実施例1中に説明したように、両試薬はInvitrogenから)
Claims (19)
- 逆転写酵素を用いて生物学的試料中のRNAからcDNAを合成し、そのcDNAの少なくとも1つの選択配列を増幅及び検出するための、単一容器内で行う方法であって、
a) 前記生物学的試料を、タンパク質を変性または分解する少なくとも2Mの濃度を有するカオトロピック塩を含む破壊試薬と混合して、結合タンパク質から遊離したRNAを含有する破壊された試料を生成し、RNA損失を25%以下に保ちながらヌクレアーゼを不活性化する工程、
b) 逆転写酵素を添加する前に、破壊された試料中のカオトロピック塩の濃度を、その破壊された試料を洗浄することなく、少なくとも1つの水性試薬で希釈することにより0.05M未満に低減する工程、
c) 希釈した破壊された試料を、逆転写酵素と共にインキュベートして、前記RNAをcDNAに転写する工程、
d) 前記cDNAの少なくとも1つの選択配列を増幅する工程、及び
e) その少なくとも1つの増幅されたcDNA配列を検出する工程、
を含み、ここで、工程b)〜e)は、分解されたタンパク質又は前記カオトロピック塩から前記RNAを最初に分離することなしに行われる、方法。 - 工程b)において、カオトロピック塩の濃度を0.01M未満に低減する、請求項1に記載の方法。
- 前記破壊試薬が、細胞溶解界面活性剤を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記生物学的試薬が、少なくとも1つの細胞を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 工程a)が、前記生物学的試料と破壊試薬との混合後に、加熱してカオトロピック塩を濃縮する工程をさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- カオトロピック塩の初期濃度が少なくとも2Mである、請求項4に記載の方法。
- 前記加熱は、少なくとも半乾燥の破壊された試料を生成するのに十分なものである、請求項5または請求項6に記載の方法。
- 前記破壊試薬が、カオトロピック塩の沈殿を防ぐための水混和性溶媒を含み、また前記加熱の際に蒸発するものである、請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。
- カオトロピック塩が、生物学的試料に溶解される乾燥試薬である、請求項1に記載の方法。
- 前記溶媒がDMSOである、請求項8に記載の方法。
- 前記生物学的試料がリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記乾燥試薬が、前記単一容器の表面に付着されている、請求項9に記載の方法。
- 前記表面が、チューブ、チューブキャップ、マイクロタイタープレートの壁、又はマイクロタイタープレートカバーの内表面を含む、請求項12に記載の方法。
- 工程b)が、ランダムヘキサマーを含む水で希釈すること、加熱して二本鎖を変性すること、さらに冷却してランダムヘキサマーを前記RNAとアニーリングさせることを含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 工程c)が、逆転写酵素及びRTバッファーを、工程b)由来の希釈した破壊された試料を6倍以上にさらに希釈しない量で添加することを含む、請求項14に記載の方法。
- 工程d)において、増幅が、この工程で添加した増幅バッファー中で行われ、その添加が前記cDNAを少なくとも9倍に希釈するものである、請求項15に記載の方法。
- 工程b)が、以下の3つの水性溶液:DNアーゼを含む第1溶液、キレート剤を含む第2溶液、及びランダムヘキサマーを含む第3溶液、で徐々に希釈することを含み、ここで前記単一容器をキレート剤の添加後に加熱する、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 増幅試薬及び検出試薬を工程c)で添加し、工程c)が希釈した破壊された試料を少なくとも9倍にさらに希釈する、請求項1に記載の方法。
- 変性又は分解された前記タンパク質がヌクレアーゼを含む、請求項1に記載の方法。
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