DE69632904T2

DE69632904T2 - Kopräzipitat und methode zur extraktion von nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69632904T2
Application number: DE1996632904
Authority: DE
Inventors: Mitsugu Usui; Mari Yamaguchi; Motohito Kaneshima; Akiji Aoki
Original assignee: Palma Bee'Z Research Institute Co Ltd
Current assignee: Palma Bee'Z Research Institute Co Ltd
Priority date: 1995-08-21
Filing date: 1996-08-09
Publication date: 2004-11-18
Anticipated expiration: 2016-08-10
Also published as: EP0792932A4; JP3108105B2; EP0792932B1; WO1997007207A1; DE69632904D1; US6815541B1; EP0792932A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Kopräzipitat und auf ein Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren unter Verwendung des Kopräzipitats. Das Kopräzipitat reagiert in der gleichen Weise wie Nukleinsäuren bei alkoholischer Behandlung zur Gewinnung von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien und/oder Testproben wie beispielsweise Blut, Urin, medullarer Flüssigkeit, Phlegma oder Sputum, Samen, Zellen, Gewebe und Biopsieproben. Das Kopräzipitat kann aus der Auftrennung mittels Zentrifugation ein sichtbares Präzipitat der Nukleinsäuren und dabei die Nukleinsäuren mit einer hohen Extraktionseffizienz und guten Reproduzierbarkeit bereitstellen.
Hintergrund
Kürzlich haben Studien oder Diagnosen unter Verwendung von Nukleinsäuresonden einen beachtlichen Fortschritt erfahren. Es ist daher wichtig eine Vereinfachung bei der Handhabung der Testproben zu erreichen und Nukleinsäuren hoher Reinheit durch die Entfernung von anderen Verunreinigungen als Nukleinsäuren aufzureinigen.
Falls die Aufreinigung von DNA-Proben ungenügend ist, tendiert Protein im Falle der Hybridisierung von Nukleinsäuren beispielsweise dazu, an DNA gebunden zu werden, und falls die Probe Kohlenwasserstoffe enthält, wird der DNA-Verdau durch ein Restriktionsenzym in einer solchen Weise inhibiert, dass es unmöglich ist die Basensequenz des Restriktionsenzyms zu erkennen; verwertbare Ergebnisse können nicht erhalten werden. Im Falle der Hybridisierung von Nukleinsäuren unter Verwendung von RNA-Proben kann eine ungenügende Aufreinigung der RNA-Proben ebenfalls in einer ungenügenden Hybridisierung von Nukleinsäuren resultieren. Es ist daher essentiell, vorher und ausreichend die DNA-Proben für die Nukleinsäurehybridisierung oder für den Verdau von DNA durch Restriktionsenzyme aufzureinigen.
Im Falle der Detektion von Sonden durch nicht-radioaktive Markierungsverfahren wird darüber hinaus, falls Testsonden verwendet werden, die Unreinheiten enthalten, ein als Reagenz verwendeter Antikörper oder Avidin nicht-spezifisch an die Unreinheiten binden und dadurch Fehler in der Analyse verursachen.
Es ist daher grundsätzlich notwendig, die folgenden vier Verfahrensschritte zur Herstellung aufgereinigter DNA oder RNA durchzuführen: (1) Lyse der Zellen, (2) Deproteinisierung und Decarbohydratisierung, (3) Auftrennung und Konzentrierung und (4) Waschen und Aufreinigung.

(1) Während der Lyse der Zellen wird lytisches Enzym, beispielsweise Lysozym und Achromopeptidase, proteolytisches Enzym wie beispielsweise Proteinase K, und Lösungsmittel wie beispielsweise Alkali und SDS verwendet, um die Zellstruktur zu lysieren. Im Falle von Mikroben, wie beispielsweise dem Tuberkel-Bazillus und Staphylokokkus, welche stabile Zellwände besitzen, werden die Zellen physikalisch unter Verwendung von Beads oder Ultraschallwellen gebrochen. Optional kann zusammen mit solchen physikalischen Mitteln lytisches Enzym und proteolytisches Enzym eingesetzt werden, oder Alkali und Lösungsmittel können zugegeben werden.
(2) Während der Deproteinisierung und Decarbohydratisierung wird die Extraktion zumeist vorher in Übereinstimmung mit dem konventionellen Phenol-Chloroform-Verfahren durchgeführt. Gleichwohl ist dieses Phenol-Chloroform-Verfahren unvorteilhaft unhandlich, da es von einer starken Toxizität begleitet ist und viel Laborplatz benötigt. Insbesondere im Phenol-Chloroform Verfahren kommt DNA in einer wässrig flüssigen Phase (eine obere Phase) vor, und denaturiertes Protein bildet eine Baumwoll-ähnliche weiße Phase in einer intermediären Phase zwischen der wässrigen flüssigen Phase und einer organischen flüssigen Phase (eine untere Phase). Es ist daher notwendig ein so problembehaftetes Verfahren wie das langsame Aufsaugen der DNA-Phase allein unter Verwendung einer Pipette mit großem Querschnitt durchzuführen und dabei verhindem, dass die weiße Phase aufgesogen wird und anschließend die so extrahierte DNA-Phase in ein neues Mikroröhrchen zu überführen. Da das oben erwähnte Verfahren viel Zeit in Anspruch nimmt und viel Erfahrung benötigt, erscheint die Reproduzierbarkeit der DNA-Gewinnung vermindert zu sein und darüber hinaus ist ein aufwendiges Verfahren schwierig.
(3) Im Verfahren der Auftrennung und Konzentrierung nach Verfahren (2) werden die Nukleinsäuren (DNA oder RNA) aus der wässrigen Flüssigkeit, welche die Nukleinsäuren enthält, unter Verwendung von 100% Isopropylalkohol oder 100% Ethanol gefällt und dadurch aufgetrennt und konzentriert. Auf Grund dessen, dass die Salzkonzentration in der wässrigen Flüssigkeit, welche die Nukleinsäuren enthält, im konventionellen Auftrennungs- und Konzentrierungsverfahren verhältnismäßig hoch ist, ist in diesem Stadium das Präzipitat der Nukleinsäuren gleichwohl farblos und transparent, wenn Isopropylalkohol (ultimative Konzentration: 50%) oder Ethanol (ultimative Konzentration: 70%) zugegeben wird, so dass es mit den Augen nicht erkannt werden kann. Aufgrund dessen wurde das Präzipitat verworfen und die Nukleinsäuren in nicht ausreichender Menge gewonnen. Die Effektivität und Genauigkeit der Nukleinsäureextraktion hängt in erster Linie von der Anreicherung der Nukleinsäuren und des Kopräzipitats ohne Verlust während des Schrittes der Auftrennung und Konzentrierung ab.
(4) Während des Schrittes des Waschens und der Aufreinigung wird gewöhnlicher Weise 70 %iger Ethanol verwendet, um Unreinheiten von den abgetrennten und konzentrierten Nukleinsäuren zu entfernen.

Zur Vereinfachung und besseren Effizienz des Extraktionsverfahrens wurde das Phenol-Chloroform-Verfahren dahingehend verbessert und es wurden verschiedene, nicht auf dem Phenol-Chloroform-Verfahren beruhende Verfahren entwickelt, um die von Phenol ausgehenden Gefahren zu vermeiden.
Im Falle der Extraktion von DNA aus Blutproben zur Untersuchung von HIV-1 oder EB-Virus, welche auf Lymphozyten infektiös wirken, ist ein Verfahren bekannt, bei dem Blut, das über das Heparinblut-Sammelverfahren erhalten wurde, mit Triton X-100 behandelt wird und wobei nach dessen Auftrennung mittels Zentrifugation zum abgetrennten Präzipitat Guanidiniumisothiocyanat zugegeben wurde, sich die DNA durch Zugabe von Isopropanol absetzte und anschließend die DNA mit Ethanol gewaschen wurde. Gemäß diesem Verfahren kann die DNA innerhalb von zwei Stunden extrahiert werden.
Dieses Verfahren ist sehr einfach, jedoch nicht allgemein verwendbar, da die Art der zu untersuchenden Proben nicht auf Blut allein begrenzt ist.
Es gibt ebenfalls ein Verfahren, welches eine Säule zur Nukleinsäureextraktion für die schnelle Auftrennung und Extraktion von Nukleinsäuren verwendet, welches jedoch sehr teuer ist und hohe Kosten verursacht. Dieses Verfahren ist daher nicht für die allgemeine Anwendung geeignet.
Kürzlich wurde von einem Verfahren unter Verwendung der Bindungsfähigkeit von kationischen Tensiden, wie beispielsweise CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid) an DNA, als Verfahren zur schnellen Extraktion von Nukleinsäuren bei geringen Kosten berichtet (japanische Offenlegungsschrift Nr. 2-31696).
In diesem Verfahren wird nach Vorbehandlung mittels Zelllyse ein Komplex aus Nukleinsäuren und CTAB durch Zugabe von CTAB in einem organischen Lösungsmittel gebildet und anschließend werden die DNA und CTAB durch Lyse des Komplexes in einer wässrigen Lösung mit hoher Salzkonzentration lysiert und die DNA wird anschließend mittels Ethanol oder Isopropanol isoliert. Obwohl dieses Verfahren nicht das gefährliche Phenol verwendet, erfordert es immer noch viel Arbeit auf Grund vieler Schritte von Zentrifugations- und Waschoperation.
Um dieses Problem zu lösen, wurde bereits das sogenannte Agglutinierungs-/Verteilungsverfahren vorgeschlagen (japanische Offenlegungsschrift Nr. 4-220738). Dieses Verfahren ist ebenfalls auf die Dekantierung oder reverse Auftrennung zur schnellen und einfachen Extraktion und zur Aufreinigung von Nukleinsäuren mit hoher Reinheit anwendbar. In diesem Verfahren wird zunächst eine Vorbehandlung zur Elution von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien durchgeführt und die vorbehandelten Materialien durch Zugabe einer wässrigen Flüssigkeit und einer nicht-hydrophilen organischen Flüssigkeit, welche ein hohes spezifisches Gewicht besitzt und ein thixotorpes Verdickungsargents enthält, in eine Mischung überführt. Nach Auftrennung der Mischung mittels Zentrifugation wird eine nichtfließfähige agglutinierte Phase in der Phasengrenzschicht zwischen den oberen und den unteren Phasen gebildet und die in der oberen Phase vorkommenden Nukleinsäuren werden durch Abtrennung extrahiert.
Andererseits ermöglicht es die kürzliche Entwicklung der Polymerase-Kettenreaktion (im folgenden als „PCR" bezeichnet) und der reversen Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (im folgenden als „RT-PCR" bezeichnet), eine sehr kleine Menge an Nukleinsäuren zu amplifizieren und zu detektieren. Bei der Nukleinsäuredetektion gemäß dem PCR oder RT-PCR-Verfahren wird das zu untersuchende spezifische Gen amplifiziert und die DNA des amplifizierten Gens wird anschließend mittels Agarosegelelektrophorese oder einem Hybridisierungsverfahren detektiert. Eine verlässliche Bestimmung hängt jedoch im großen Maße von der Effektivität der Extraktion von Nukleinsäuren aus den Testproben ab, sowie von den zu verwendenden Primern in der nachfolgenden cDNA-Synthese und der PCR.
Bei der Extraktion sehr geringer Mengen von Nukleinsäuren wird insbesondere ein Verfahren benötigt, bei dem die Nukleinsäuren mit hoher Reinheit und hohen Ausbeuten extrahiert werden und ohne Einfluss der Qualitätsänderung von Probenbestandteilen auf Grund der quantitativen Änderung der Nukleinsäuren mit dem Fortschreiten der Krankheit.
Gegenwärtig wird ein Verfahren unter Verwendung von Guanidiniumthiocyanat, Phenol und Chloroform (im allgemeinen „AGPC-Verfahren") in Kombination für die vorhergehende Extraktion von Nukleinsäuren verwendet. Der wichtigste Punkt bei der Extraktion einer sehr kleinen Menge an Nukleinsäuren über dieses Verfahren ist die verlässliche Gewinnung von Nukleinsäuren bei einer alkoholischen Fällung unter Verwendung von Isopropylalkohol, Ethanol oder ähnlichem nach Deproteinisierung.
Wenn die Menge an Nukleinsäuren in Testproben sehr gering ist, wird im allgemeinen ribosomale RNA oder Transfer-RNA, die aus verschiedenen biologischen Materialien stammt, als Kopräzipitat beim Fällungsvorgang mittels Alkohol zugegeben. Da die Amplifizierungsreaktion gemäß dem PCR-Verfahren nach der Transformation der extrahierten RNA zu DNA mittels reverser Transkription durchgeführt wird, gibt es im Fall, dass die zu fällende Nukleinsäure RNA ist, das Problem, dass das Kopräzipitat eine solche reverse Transkription inhibiert. Weiterhin ist es schwierig eine sehr kleine Menge an Nukleinsäuren zu extrahieren, falls Glykogen oder ähnliches als Kopräzipitat zugegeben wird, da diese Agenzien eine niedrige Affinität zu extrahierten Nukleinsäuren besitzen und das erhaltene Präzipitat unsichtbar oder nicht erkennbar sein wird.
DE 43 33 805 A1 offenbart ein Extraktionsverfahren für Nukleinsäuren, wobei Glykogen, Carboxymethylzellulose und Dextran als Kopräzipitate verwendet werden, welche gemeinsam mit den Nukleinsäuren ausfallen, wenn diese mit Alkohol gefällt werden.
Dieses Dokument stellt ein Verfahren zur Aufreinigung geringer Mengen an Nukleinsäuren bereit, welche schwierig zu detektieren sind, wenn sie als klares oder farbloses Kopräzipitat mitgefällt werden.
Die vorliegende Erfindung wurde mit Hinblick auf das vorherbeschriebene Problem ausgehend vom Stand der Technik geplant und besitzt als Aufgabe die Bereitstellung eines Kopräziptiats in einem Verfahren zur Auftrennung und Konzentrierung von Nukleinsäuren durch Fällung mittels Alkohol, wie beispielsweise Isopropylalkohol, Ethanol oder ähnlichem aus einer nukleinsäurehaltigen wässrigen Lösung, wobei das Kopräzipitat eine Affinität zu Nukleinsäuren besitzt, sowie keine kompetitive Inhibition der reversen Transkription und keine Inhibition der PCR-Reaktion aufweist und ein sichtbares weißes oder blaues Präzipitat bereitstellen kann, um das Auftreten von technischen Fehler mit einer ausreichend hohen Sammelausbeute zu unterdrücken, sowie ein Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren unter Verwendung des Kopräzipitats.
Offenbarung der Erfindung
Um die vorher genannten Probleme zu lösen, reagiert ein Kopräzipitat der vorliegenden Erfindung bei der Extraktion von Nukleinsäuren mittels Auftrennung über Zentrifugation aus biologischen Materialien und/oder Testproben in der gleichen Weise wie Nukleinsäuren und besitzt die Fähigkeit, als sichtbares weißes oder blaues Präzipitats auszufällen, wenn es mittels Alkohol abgetrennt und aufkonzentriert wird. Als Alkohol kann Isopropylalkohol, Ethanol oder ähnliches verwendet werden. In der Auftrennung mittels Zentrifugation unter Verwendung eines Mikroröhrchens oder ähnlichem haftet das Präzipitat auf dem Boden des Mikroröhrchens.
Als Kopräzipitat kann Stärke, Amylose oder Amylopektin verwendet werden, welches aus Stärke oder Derivaten davon besteht und bei der alkoholischen Fällung von Nukleinsäuren ein Präzipitat mit sichtbarer weißer oder blauer Farbe bilden können. Bevorzugt als Kopräzipitat gemäß dieser Erfindung verwendete Materialien sind langkettige an Glukose gebundene Polysaccharide und pigmentmodifizierte langkettige an Glukose gebundene Polysaccharide oder Derivate davon.
Als Beispiele für die langkettigen an Glukose gebundenen Polysaccharide des Kopräzipitats gemäß der vorliegenden Erfindung können lösliche Stärke, Maisstärke, Kartoffelstärke, lösliche Kartoffelstärke, Weizenstärke und Azurstärke erwähnt werden, welche Stärkearten oder Derivate von Stärke darstellen.
Bevorzugt wird Amylopektin aus Mais, Amylopektin aus Kartoffel, Amylopektin-Anthranilat, Amylopectin azure, unlösliches Amylopektin aus Mais, lösliches Amylopektin aus Kartoffel, Amylose aus Mais, Amylose aus Kartoffel und Amylose azure verwendet, welche Zusammensetzungen von Stärke oder Derivate davon darstellen.
Als Pigmente zur Herstellung der Pigment modifizierten langkettigen glukosegebundenen Polysaccharide kann Azur erwähnt werden. Als Azur können Remazol Brilliant Blue R, Remazol Brilliant Blue, Remazol Brilliant Blue R-_D-Xylan, Remazol Brilliant Violet 5R verwendet werden.
Als wässrige Lösung zur Auflösung des Kopräzipitats kann destilliertes Wasser erwähnt werden, sowie Puffer wie beispielsweise T. E.-Puffer [im allgemeinen als eine Mischung von 50 mM Puffer aus Tris(hydroxymethyl)Aminoethan-Hydrochlorige Säure, pH 8,0, 0,20 mM, EDTA], und Lösungen anorganischer Salze wie beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, Natriumazetat, Amoniumchlorid, Amoniumazetat und Amoniumsulfat oder Mischungen davon, welche gewöhnlich in einem Bereich von 0,1 M bis 10,0 M verwendet werden. Weiterhin beträgt die Konzentration des Kopräzipitats der vorliegenden Erfindung 0,5 bis 100 μg/ml, bevorzugt 5 bis 50 μg/ml.
Gemäß dem ersten Aspekt eines Verfahrens zur Extraktion von Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, wobei das oben genannte Kopräzipitat als ein Kopräzipitat verwendet wird, welches zusammen mit Nukleinsäuren in einem Verfahren zur Extraktion der Nukleinsäuren ausfällt, welches die Schritte umfasst: Vorbehandlung zur Lyse von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien und/oder Testproben; Deproteinisierung der vorbehandelten biologischen Materialien und/oder Testproben; Auftrennung einer wässrigen Flüssigkeit, enthaltend Nukleinsäuren aus deproteinisierten biologischen Materialien und/oder Testproben; Mischung der wässrigen Flüssigkeit, welche die Nukleinsäuren enthält, durch Zugabe von Alkohol zu dieser Lösung; und Abtrennung und Konzentrierung der Nukleinsäuren durch Auftrennung mittels Zentrifugation.
Während des Deproteinisierungsvorgangs des oben genannten Verfahrens kann eine Extraktion mittels Phasen Trennung über Phenol, die Auflösung von Protein mittels chaotropen Reagenzien, die Bildung eines Nukleinsäurekomplexes durch kationische Tenside, das Einfangen von Nukleinsäuren über einen Glasfilter oder das Einfangen von Nukleinsäuren durch magnetische Beads angewendet werden.
Gemäß dem zweiten Aspekt eines Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, wobei das oben erwähnte Kopräzipitat als Kopräzipitat verwendet wird, welches gemeinsam mit Nukleinsäuren in einem Verfahren zur Extraktion der Nukleinsäuren ausfällt, welches die folgenden Schritte umfaßt: Vorbehandlung zur Elution von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien und/oder Testproben; Zugabe einer wässrigen Flüssigkeit und einer nicht-hydrophilen organischen Flüssigkeit, welches ein hohes spezifisches Gewicht besitzt und ein thixotropes Verdickungsagens enthält, zu den vorbehandelten biologischen Materialien und/oder Testproben; Mischung dieser Bestandteile; Auftrennung der Bestandteile mittels Zentrifugation; einfache Abtrennung der oberen Phase, welche die Nukleinsäuren enthält, durch die Bildung einer nicht-fließfähigen agglutinierten Phase in einer Phasengrenzschicht zwischen den oberen und unteren Phasen; und Mischung der wässrigen Flüssigkeit, welche die Nukleinsäure enthält, durch Zugabe von Alkohol; Auftrennung und Konzentrierung der Nukleinsäuren durch Abtrennung mittels Zentrifugation; im allgemeinen wird dieses Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren als Agglutinierung-/Verteilungsverfahren bezeichnet.
Die biologischen Materialien und/oder Testproben, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, schließen Blut, Urin, medullare Flüssigkeit, Phlegma oder Sputum, Samen, Zellen, Gewebe, biologische Proben, Hefe, Eumyzates oder Fungus, Bakterien, Viren, kultivierte Zellen, etc. mit ein.
Als thixotropes Verdickungsagens zur Bildung der agglutinierten Phase in einer Phasengrenzschicht zwischen den oberen und unteren Phasen wird ein Verdickungsagens verwendet, welches eine Bindungsfähigkeit für Verunreinigungen wie beispielsweise Protein oder ähnlichem aufweist und sowie ein Dispersionsvermögen in einer organischen Flüssigkeit mit hohem spezifischem Gewicht.
Bevorzugt werden organische Bentonitderivate als thixotrope Verdickungsagentien in der vorliegenden Erfindung verwendet.
Die organischen Bentonitderivate schließen organische Derivate aus Smektit-Lehm, organischen Derivaten von Hektorit-Lehm, organisch modifizierten Materialien von Montmorrillonit-Lehm, verfeinertem Smektit-Lehm, besonders behandeltem Smektit-Lehm, verfeinertem organischem mineralischem Lehm, etc. mit ein.
Als thixotrope Verdickungsagentien dieser Erfindung verwendete organische Derivate von Smektit-Lehm können BENTONE 27 (hergestellt durch N. L. Industries Inc., Handelsname von thixotropem und gelierendem Agens) genannt werden, sowie BENTONE 34 (hergestellt durch N. L. Industries Inc., Handelsname von thixotropem und gelierendem Agens), BENTONE 38 (hergestellt durch N. L. Industries Inc., Handelsname von thixotropem und gelierendem Agens), BENTONE SD-1 (hergestellt durch N. L. Industries Inc., Handelsname von thixotropem und gelierendem Agenss), BENTONE SD-2 (hergestellt durch N. L. Industries Inc., Handelsname von thixotropem und gelierendem Agens), BENTONE SD-3 (hergestellt durch N. L. Industries Inc., Handelsname von thixotropem und gelierendem Agens) und ähnlichen Materialien.
Als thixotrope Verdickungsagentien dieser Erfindung verwendete organische modifizierte Materialien von Montomorillonit-Lehm können BENTONE 128 (hergestellt durch N. L. Industries Inc., Handelsname von thixotropem und gelierendem Agens) und BENTONE 500 (hergestellt durch N. L. Industries Inc., Handelsname von thixotropem und gelierendem Agens) erwähnt werden. Weiterhin kann MACALOID als verfeinerter Smektit-Lehm erwähnt werden, BENTONE EW (hergestellt durch N. L. Industries Inc., Handelsname von thixotropem und gelierendem Agens) als besonders behandelter Smektit-Lehm und BENTONE LT (hergestellt durch N. L. Industries Inc., Handelsname von thixotropem und gelierendem Agens) als verfeinerte organische mineralische Lehme.
Als die thixotropen Verdickungsagentien dieser Erfindung verwendeten organischen Derivate von Smektit können BENTONE 34 (hergestellt durch N. L. Industries Inc., Handelsname von thixotropem und gelierendem Agens), BENTONE SD-3 (hergestellt durch N. L. Industries Inc., Handelsname von thixotropem und gelierendem Agens), BENTONE LT (hergestellt durch N. L. Industries Inc., Handelsname von thixotropem und gelierendem Agens), BENTONE EW (hergestellt durch N. L. Industries Inc., Handelsname von thixotropem und gelierendem Agens), MACALOID und ähnliche Materialien erwähnt werden.
Die thixotropen Verdickungsagentien, die in der vorliegenden Verwendung verwendet werden, sind gleichwohl nicht auf die oben erwähnten Agentien beschränkt und es können alle anderen Agentien als die oben erwähnten verwendet werden, falls diese die nicht-fließfähige agglutinierte Phase gemäß dieser Erfindung bilden können.
Die organische Flüssigkeit mit hohem spezifischem Gewicht, die bevorzugt in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist eine organische Flüssigkeit, welche unlöslich oder schlecht löslich in Wasser ist und eine Dichte von mehr als 1,05 gcm^–3 besitzt.
Als organische Flüssigkeit mit hohem spezifischem Gewicht können anorganische Verbindungen wie beispielsweise Kohlenstofftetrachlorid und Kohlenstoffdisulfid, Halogenverbindungen wie beispielsweise Chloroform, 1,2-Dichlorethan, 1,2-Dibromethan, Trichlorethylen, Tetrachlorethylen, Chlorbenzol, Brombenzol und o-Dichlorbenzol, Alkohol wie beispielsweise 2,2,2-Trifluorethanol und Phenol, Aldehyd wie beispielsweise Furfural, Säurederivate wie beispielsweise Propylencarbonat und Triethylphosphat, Nitroverbindungen wie beispielsweise Nitromentan und Nitrobenzol, und Schwefelverbindungen wie beispielsweise Sulfolan erwähnt werden.
Als Alkohol, der als Stabilisationsmittel zur oben erwähnten organischen Flüssigkeit mit hohem spezifischem Gewicht zugegeben werden soll, kann Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, Isoamylalkohol, 1-Butanol, 2-Butanol, Isobutylalkohol, Cyclohexanol, Ethylenglykol, 2-Methoxyethanol und 2-Ethoxyethanol erwähnt werden.
Als wässrige Flüssigkeit zur Elution von Nukleinsäuren in die obere Phase kann Wasser erwähnt werden, sowie eine wässrige Lösung von anorganischen Salzen wie beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, Natriumazetat, Ammoniumchlorid, Ammoniumazetat und Ammoniumsulfat, und wässrige Lösungen von organischen Salzen wie beispielsweise Dimethylaminhydrochlorid und Trimethylaminhydrochlorid, welche bevorzugt in einer Konzentration in einem Bereich von etwa 0,1 M bis 10,0 M verwendet werden. Um die Extraktionseffizienz von Nukleinsäuren zu verstärken kann 0,01 bis 10% an geeigneten anionischen oder nichtionischen Tensiden zur wässrigen Lösung zugegeben werden. Das Verhältnis zwischen der organischen flüssigen Phase mit hohem spezifischem Gewicht und der wässrigen Phase liegt bei etwa 1 : 5 bis 5 : 1. Diese Phasen werden gemischt und anschließend in die niedrigere organische flüssige Phase mit hohem spezifischem Gewicht und die obere wässrige flüssige Phase durch die agglutinierte Phase aufgeteilt, welche in einer Phasengrenzschicht dazwischen durch Auftrennung mittels Zentrifugation gebildet wird. Anschließend wird die wässrige flüssige Phase (obere Phase) mittels Dekantierung isoliert.
Das Kopräzipitat kann alleine oder zusammen mit anderen Kopräzipitaten bei jedem Schritt des Nukleinsäure-Extraktionsverfahrens zugegeben werden. Beispielsweise kann das Kopräzipitat zugegeben werden: (1) direkt zu den biologischen Materialien vor der Nukleinsäureextraktion oder im Elutionsschritt der Nukleinsäuren mittels Lyse der biologischen Materialien (Zelllyse); (2) während der Deproteinisierung; (3) während der Auftrennung und Konzentrierung der Nukleinsäure; oder (4) während des Waschens und der Aufreinigung der Nukleinsäuren.
Die Lyse der biologischen Materialien besteht darin, dass die Materialien in einem Puffer (pH 5 bis 9) vorbehandelt werden, welcher ein gelierendes Agents enthält, und anschließend in üblicher Weise mit membranlytischen Agentien wie beispielsweise anionischen Tensiden oder nicht-ionischen Tensiden behandelt werden, welche eine Konzentration innerhalb des Bereiches von etwa 0,1 Gew.-% bis 10 Gew.-% besitzen und proteindenaturierenden Agentien wie beispielsweise Guanidiniumthiocyanat von etwa 1 M bis 5 M oder Guanidiniumhydrochlorid von etwa 1 M bis 5 M um die Zellmembran oder Zellwand zu lysieren. Optional kann für den oben angegebenen Zweck lytisches Enzym zur Lyse von Zellmembranen oder Zellwänden verwendet werden.
Als lytisches Enzym, das bevorzugt für die Lyse der Zellmembran oder Zellwand verwendet wird, können membranlytische Agentien, wie beispielsweise Lysozym, Achromopeptidase, Lysostaphin, Lytizase und Mutanolysin mit etwa 1 mg/ml bis 50 mg/ml, oder proteindenaturisierende Agentien wie beispielsweise Protease K, Pronase, Pepsin und Papain in einer Konzentration von etwa 10 μg/ml bis 20 mg/ml erwähnt werden.
Mit der oben angeführten Vorbehandlung können die biologischen Materialien in der wässrigen Lösung lysiert werden, welche die oben angegebenen Gelierungsagentien, membranly sierenden Agentien, proteindenaturisierenden Agentien, etc. enthält, und in welcher Nukleinsäuren und verschiedene biologische Materialien aufgelöst sein können.
Das Verfahren zur Deproteinisierung wird allgemein in zwei Gruppen aufgeteilt. Die eine stellt ein Phasenteilungsverfahren unter Verwendung von Phenol oder thixotropen Verdickungsagentien dar, die andere ein Proteinsolubilisierungsverfahren.
In Phasenverteilungsverfahren unter Verwendung von Phenol wird mit Wasser gesättigtes Phenol oder mit Puffer gesättigtes Phenol verwendet, um die Deproteinisierung unter Ausnutzung ihres denaturierenden Effekts durchzuführen und der Eigenschaft, dass Phenol und eine wässrige Lösung in zwei Phasen geteilt wird.
Bei der Deproteinisierung mittels eines thixotropen Verdickungsagents wird eine organische Flüssigkeit mit hohem spezifischem Gewicht oder eine Mischung organischer Flüssigkeiten mit hohem spezifischem Gewicht, die thixotorpe Verdickungsagentien enthalten, oder eine Mischung solcher organischer Flüssigkeiten und Alkohol, und eine wässrige Flüssigkeit zur Extraktion von Nukleinsäuren in eine obere Phase zugegeben und in solubilisierten biologischen Materialien gemischt. Anschließend wird die Mischung einer Auftrennung mittels Zentrifugation unterzogen. In diesem Fall wird das thixotrope Verdickungsagens, welches an Verunreinigungen gebunden ist, wie beispielsweise an Protein, in einer intermediären Phase (Phasengrenzschicht) auf Grund der Zentrifugalkräfte durch die Auftrennung mittels Zentrifugation und durch den Auftrieb der organischen Flüssigkeit mit hohem spezifischem Gewicht gesammelt.
Als Ergebnis wird eine nicht-fließfähige agglutinierte Phase durch die Änderung der Viskosität mittels des Verdickungseffekts auf Grund der angestiegenen Konzentration des thixotropen Verdickungsagents gebildet, und die Deproteinisierung wird mittels Dekantierung durchgeführt.
Im Proteinsolubilisierungsverfahren, welches chaotrope Ionen, wie beispielsweise Iodidionen (I^–) oder Trifluoressigsäureionen (CF₃COO^–) verwendet, welche univalente Anionen darstellen und einen relativ großen Ionenradius besitzen, und die Deproteinisierung wird durch einen Anstieg der Solubilität der hydrophoben Moleküle durchgeführt, wie beispielsweise Protein, um die hydrophile Bindung dieser Moleküle zu schwächen.
Im oben erwähnten Verfahren (3) zur Auftrennung und Konzentrierung von Nukleinsäuren mit Alkohol kann beispielsweise 100% Isopropanol (höchste Konzentration: 50%) und in der gleichen Menge oder 100% Ethanol (ultimative Konzentration: 70%) in der zweifachen Menge zu einer wässrigen Menge zugegeben werden, die Nukleinsäuren enthält, wodurch die Nukleinsäuren aufgetrennt und konzentriert werden.
Im oben erwähnten Verfahren (4) zur Waschung und Aufreinigung von Nukleinsäuren mittels Alkohol kann 70% Ethanol verwendet werden, um die Nukleinsäuren zu waschen und aufzureinigen.
Die vorliegende Erfindung ist insbesondere bei der Extraktion von HCV-RNA effektiv, welches die Nukleinsäure des Virus ist, von dem vermutet wird, dass er C-Typ-Hepatitis, Leberkrebs, etc. verursacht.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt den ersten Verfahrensschritt zur Auftrennung einer wässrigen flüssigen Phase, welche Nukleinsäuren enthält, mittels des reversen Auftrennungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, in welchem die oberen und unteren Phasen in einem Mikroröhrchen getrennt werden.
2 zeigt den zweiten Schritt des Verfahrens zur Auftrennung der wässrigen flüssigen Phase, welche die Nukleinsäuren enthält, mittels des reversen Auftrennungsverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, in welchem eine nicht-fließfähige agglutinierte Phase in der Grenzschicht zwischen den oberen und unteren Phasen in einem Mikroröhrchen gebildet wird.
3 zeigt den dritten Schritt des Verfahrens zur Auftrennung der wässrigen flüssigen Phase, welche die Nukleinsäuren enthält, mittels des reversen Auftrennungsverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, in welchem die obere Phase in ein neues Mikroröhrchen mittels des reversen Abtrennungsverfahrens überführt wird.
4 zeigt den vierten Schritt des Verfahrens zur Auftrennung und Konzentrierung der wässrigen flüssigen Phase gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die wässrige flüssige Phase Nukleinsäuren enthält, und Alkohol zur wässrigen flüssigen Phase zugegeben wird, die die Nukleinsäuren enthält.
5 zeigt den fünften Schritt des Verfahrens zur Auftrennung und Konzentrieren der wässrigen flüssigen Phase gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die wässrige flüssige Phase die Nukleinsäuren enthält, und in welcher ein Präzipitat aus einem Kopräzipitat und den Nukleinsäuren gebildet wird.
6 zeigt den sechsten Schritt des Verfahrens zur Auftrennung und Konzentrierung der wässrigen flüssigen Phase gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die wässrige flüssige Phase die Nukleinsäuren enthält, in welchem eine gemischte Flüssigkeit von dem in 5 gezeigten Zustand entfernt wird.
Beste Art zur Ausführung der Erfindung
Im folgenden wird die Erfindung mit Bezug auf verschiedene Ausführungsformen beschrieben.
Beispiel 1
100 μl einer Probe, welche 10¹ bis 10⁴ Kopien/100 μl an HCV-RNA enthält, welche mittels Klonierung der 5'-nicht-kodierenden Region des C-Typs Hepatitis-Virus synthetisiert wurde und 10 μg an Amylopectin azure (SIGMA Produkt Nr. A4640) als Kopräzipitat wurden in ein sterilisiertes 1,5 ml Mikroröhrchen gegeben. Weiterhin wurden 300 μl Reagenz I (enthaltend Glykogen als Kopräzipitat) von SepaGene-RV (ein von SANKO JUNYAKU Co., Ltd. hergestelltes Nukleinsäureextraktionsreagenz) zum Mikroröhrchen zugegeben und das erhaltene System wurde einheitlich gemischt. Anschließend wurden 300 μl Reagenz II von SepaGene-RV (ein von SANKO JUNYAKU Co., Ltd. hergestelltes Nukleinsäureextraktionsreagenz) und 600 μl an Reagenz III von SepaGene-RV (ein von SANKO JUNYAKU Co., Ltd. hergestelltes Nukleinsäureextraktionsreagenz) zusätzlich zugegeben und die Mischung im Mikroröhrchen wurde geschüttelt und vertikal und kräftig für 10 Minuten gemischt. Die Mischung wurde bei 0°C (in Eiswasser) für 15 Minuten ruhen gelassen, und anschließend einer Auftrennung mit tels Zentrifugation bei 12.000 rpm für 15 Minuten (4°C) unterworfen. Anschließend wurde die obere Phase (wässrige flüssige Phase), welche HCV-RNA enthielt, in ein anderes Mikroröhrchen mittels Dekantieren überführt. Zu der wässrigen Flüssigkeit Phase, welche HCV-RNA enthält, wurden 100% Isopropylalkohol der gleichen Menge wie die oberen Phase (wässrige flüssige Phase) zugegeben. Die Mischung wurde durch Umdrehung des Mikroröhrchens gemischt und bei –20°C für 45 Minuten ruhen gelassen, um HCV-RNA absetzen zu lassen. Anschließend wurde das System im Mikroröhrchen einer Auftrennung mittels Zentrifugation bei 12.000 rpm für 15 Minuten (4°C) unterworfen. Nach Entfernung des flüssigen Überstandes wurden 70% Ethanol zugegeben und mit dem Pellet gemischt (HCV-RNA kann mit den Augen als blaues Präzipitat erkannt werden), welches am Boden des Mikroröhrchens haftet. Die Mischung wurde weiterhin einer Auftrennung mittels Zentrifugation bei 12.000 rpm für 10 Minuten (4°C) unterworfen und der flüssige Überstand wurde anschließend entfernt (HCV-RNA kann mit den Augen als blaues Präzipitat erkannt werden). Der erhaltene Rest wurde unter verminderten Druck für etwa 5 Minuten getrocknet und anschließend in sterilisierten redestillierten Wasser aufgelöst. Nach der cDNA Synthesereaktionen wurde unter Verwendung der Lösung ein zweistufiges PCR-Verfahren durchgeführt. Das amplifizierte PCR-Produkt wurde anschließend einer Elektrophorese auf einem 2%igen Agarosegel unterworfen und mit Ethidiumbromid angefärbt, um die Effektivität der Extraktion durch Feststellung der Vorhandenseins von spezifischen Banden zu bewerten. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.
In der oben aufgeführten cDNA Synthesereaktion wurde ein vorher hergestellter Master Mix (3,75 μl sterilisiertes destilliertes Wasser, 2 μl 5 × Puffer für den ersten Strang, 2 μl 2,5 mM dNTP Mischung, 1 μl 0,1 MDTT, 0,5 μl 10 pmol antisense-Primer) zu dem HCR-RNA Extrakt zugegeben und die Mischung wurde 1 Minute bei 70°C umgesetzt und anschließend 1 Minute bei 55°C. Nach schnellem Abkühlen wurde 0,5 μl RNasin (hergestellt durch PROMEGA CO., Ltd.) und 0,25 μl MMLV-reverse Transkriptase (hergestellt durch BRL Co., Ltd.) zur Mischung zugegeben, und die reverse Transkription wurde für 30 Minuten bei 37°C durchgeführt und anschließend für 5 Minuten bei 95°C.
Im oben erwähnten zweistufigen PCR-Verfahren wird die erste PCR durchgeführt durch die Zugabe von 2,5 μl 10 × Reaktionspuffer, 2 μl 2,5 mM dNTP Mischung, 10,2 μl sterilisiertes destilliertes Wasser, 0,25 μl 10 pmol sense-Primer und 5 U/μl Taq DNA Polymerase (hergestellt durch TAKARA SHUZO CO., Ltd.) zum Gesamtvolumen (10 μl) der synthetisierten cDNA und Umsetzung der Mischung für 30 Zyklen mit je 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 55 °C und 1 Minute bei 72°C. Anschließend wurde die zweite PCR durch Zugabe von 1 μl des Produktes der ersten PCR zu einer Mischung von 5 μl 10 × Reaktionspuffer, 1 μl 2,5 mM dNTP Mischung, 41,9 μl sterilisiertem destilliertem Wasser, den inineren 10 pmol Primern (0,5 μl sense-Primer und 0,5 μl antisense-Primer) und 0,1 μl 5 U/μl Taq DNA Polymerase und Umsetzung der Mischung für 30 Zyklen von je 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 55°C und 1 Minute bei 72°C. Der in der obigen PCR verwendete Primer ist ein Primer, der ausgehend von der 5'-nicht-kodierenden Region von HCV-RNA stromaufwärts positioniert ist.
Während der HCV-RNA-Extraktion dieser Ausführungsform kann HCV-RNA als ein blaues Präzipitat mittels Kopräzipitierung mit Isopropylalkohol erkannt werden. In Bezug auf die Effektivität der Extraktion dieses Verfahrens können 10¹ Kopien der synthetisierten HCV-RNA mit Sicherheit extrahiert werden, wie in Tabelle 1 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 1
Dieses Beispiel wurde in der gleichen Weise durchgeführt, wie Beispiel 1 mit einer Ausnahme, dass das Kopräzipitat der vorliegenden Erfindung (Amylopectin azure) nicht verwendet wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. In diesem Vergleichsbeispiel konnte die Nukleinsäure und während des Schrittes der Auftrennung und Konzentrierung mittels Isopropylalkohol mit den Augen nicht erkannt werden.
Tabelle 1 Test des Extraktionslimits mittels Serum-Verdünnung synthetisierter HCV-RNA Anzahl an Kopien synthetisierter HCV-RNA
Beispiel 2
HCV-RNA-Extraktion wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt mit der Ausnahme, dass ein 2,2 ml Mikroröhrchen an Stelle des 1,5 ml Mikroröhrchens verwendet wurde, sowie 1.200 μl 100% Ethanol an Stelle von 600 μl 100% Isopropylalkohol.
In diesem Beispiel konnte HCV-RNA mit den Augen als blaues Präzipitat durch Kopräzipitation mit 100% Ethanol erkannt werden. Im Bezug auf die Effektivität der Extraktion konnten 10¹ Kopien HCV-RNA extrahiert werden (Tabelle 2).
Tabelle 2 Test des Extraktionslimits mittels Serumverdünnung synthetisierter HCV-RNA Anzahl an Kopien synthetisierter HCV-RNA
Beispiel 3
100 μl einer Testprobe, welche durch Verdünnung eines Serums eines Patienten mit C-Typ Hepatitis mit HCV negativem und frischem humanem normalem Serum bei einem Verdünnungsverhältnis von 10¹ bis 10⁷ hergestellt wurde, wurden in ein sterilisiertes 1,5 ml Mikroröhrchen gegeben. 300 μl Reagenz I (enthält Glykogen als Kopräzipitat) von SepaGene-RV (ein nukleinsäureextrahierendes Reagenz, hergestellt von SANKO JUNYAKU CO., Ltd.) wurde zur Probe zugegeben. Nach einheitlichen Vermischen der Mischung wurden weiterhin 300 μl Reagenz II von SepaGene-RV (ein nukleinsäureextrahierendes Reagenz, hergestellt von SANKO JUNYAKU CO., Ltd.) und 600 μl Reagenz III von SepaGene-RV (ein nukleinsäureextrahierendes Reagenz, hergestellt von SANKO JUNYAKU CO., Ltd.) zugegeben, und die Mischung im Mikroröhrchen wurde geschüttelt und vertikal und kräftig für 10 Minuten gemischt. Die Mischung wurde bei 0°C (in Eiswasser) für 15 Minuten ruhen gelassen, und anschließend einer Auftrennung mittels Zentrifugation bei 12.000 rpm für 15 Minuten (4°C) unterworfen, und die obere Phase (wässrige flüssige Phase), welche HCV-RNA enthielt, wurde in ein anderes Mikroröhrchen mittels Dekantierung überführt. Zur oberen Phase (wässrige flüssige Phase) wurden 30 μg Amylopectin azure (SIGMA Produkt Nr. A4640) als Kopräzipitat und 600 μl Isopropylalkohol zugegeben und die Mischung wurde durch Umdrehen des Mikroröhrchens vermischt. Anschließend wurde die Mischung für 45 Minuten bei –20°C ruhen gelassen, um HCV-RNA absetzen zu lassen. Nach Auftrennung mittels Zentrifugation bei 12.000 rpm für 15 Minuten (4°C) wurde der Überstand vom Mikroröhrchen entfernt. Zu dem am Boden des Mikroröhrchens haftenden Pellet (HCV-RNA kann mit den Augen als blaues Präzipitat erkannt werden) wurden 70% Ethanol zugegeben und damit gemischt. Nach einer weiteren Auftrennung mittels Zentrifugation bei 12.000 rpm für 10 Minuten (4°C) wurde der Überstand entfernt (HCV-RNA konnte mit den Augen als blaues Präzipitat erkannt werden). Als nächstes wurde der erhaltene Rest unter vermindertem Druck für etwa 5 Minuten getrocknet und in sterilisiertem redestilliertem Wasser aufgelöst. Unter Verwendung der erhaltenen Lösung wurde eine cDNA-Synthesereaktion in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt. Anschließend wurde das zweistufige PCR-Verfahren durchgeführt. Das amplifizierte PCR-Produkt wurde einer Elektrophorese auf einem 2%igen Agarosegel unterworfen und anschließend mit Etitiumbromid eingefärbt, um die Effektivität der Extraktion durch die Existenz von spezifischen Banden zu bewerten.
In dieser Ausführungsform konnte HCV-RNA mit den Augen als blaues Präzipitat durch Kopräzipitation mit Isopropylalkohol erkannt werden. In Bezug auf die Effektivität der Extraktion konnte HCV-RNA weiterhin aus dem 10⁵-fach verdünnten Serum (Tabelle 3) extrahiert werden.
Tabelle 3 Test des Extraktionslimits unter Verwendung eines verdünnten Serums eines Patienten mit C-Typ Hepatitis Verdünnungsverhältnis des HCV-Patientenserums
Beispiel 4
Die HCV-RNA Extraktion wurde unter Verwendung des gleichen HCV-RNA Patientenserums in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt mit der Ausnahme, dass ein 2,2 ml Mikroröhrchens an Stelle des 1,5 ml Mikroröhrchens verwendet wurde und 1200 μl 100% Ethanol an Stelle von 600 μl 100% Isopropylalkohol.
In diesem Beispiel konnte HCV-RNA mit den Augen als blaues Präzipitat durch Kopräzipitierung mit 100% Ethanol erkannt werden. In Bezug auf die Effektivität der Extraktion konnte HCV-RNA aus dem 10⁵-fach verdünnten Patientenserum extrahiert werden (Tabelle 4).
Tabelle 4 Test des Extraktionslimits unter Verwendung eines verdünnten Serums eines Patienten mit C-Type Hepatitis Verdünnungsverhältnis des HCV-Patientenserums
Beispiel 5
In diesem Beispiel wurde ein Kopräzipitat der vorliegenden Erfindung dem bekannten AGPC-Verfahren zugegeben. 100 μl einer Testprobe, die durch Verdünnung eines Serums eines Patienten mit C-Type Hepatitis mit HCV negativem und frischem humanem normalem Serum bei einem Verdünnungsverhältnis von 10¹ bis 10⁷ hergestellt wurde, wurde in ein 1,5 ml sterilisiertes Mikroröhrchen gegeben. 200 μl einer Lösung (4M Guanidiniumthiocyanat, 2-Mercaptoethanol) und 5 μl tRNA aus Hefe (4 mg/ml) als Kopräzipitat wurden zugegeben und in der Probe aufgelöst. Weiterhin wurden 200 μl mit Wasser gesättigtes Phenol, 17 μl 2M Natriumazetat und 40 μl Chloroform-Isoamylalkohol (49 : 1) zugegeben und darin gemischt. Nach dem die Mischung bei 4°C für 15 Minuten ruhen gelassen wurde, wurde sie anschließend einer Auftrennung mittels Zentrifugation bei 12.000 rpm für 15 Minuten (4°C) unterworfen und die obere Phase (wässrige flüssige Phase), welche HCV-RNA enthält wurde in ein anderes Mikroröhrchen überführt. Zur oberen Phase (wässrige flüssige Phase), wurde das gleiche Volumen wie die Mischung aus 100% Isopropylalkohol zugegeben und die Mischung wurde durch Umkehrung des Mikroröhrchen gemischt. Anschließend wurde die Mischung über Nacht bei –20°C ruhen gelassen um HCV-RNA absetzen zu lassen. Nach Auftrennung mittels Zentrifugation bei 12.000 rpm für 15 Minuten (4°C) wurde der Überstand aus dem Mikroröhrchen entfernt. Zu dem auf dem Boden haftenden Pellet wurden 30 μg Amylopectin azure (SIGMA, Produktnummer A 4640) und 70% Ethanol zugefügt und damit gemischt. Nach Auftrennung mittels Zentrifugation bei 12.000 rpm für 10 Minuten (4°C) wurde der Überstand entfernt (HCV-RNA konnte mit den Augen als blaues Präzipitat erkannt werden). Anschließend wurde der erhaltene Rest unter verminderten Druck für etwa 5 Minuten (bei Raumtemperatur) getrocknet und anschließend mit sterilisierten redestillierten Wasser aufgelöst. Unter Verwendung der erhaltenen Lösung wurde eine cDNA Synthesereaktion und das zweistufige PCR-Verfahren in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt. Das amplifizierte PCR-Produkt wurde einer Gelelektrophorese auf einem 2%igen Agarosegel unterworfen.
In dieser Ausführungsform konnte HCV-RNA mit den Augen als blaues Präzipitat durch Kopräzipitierung mit Isopropylalkohol erkannt werden. Weiterhin war in Bezug auf die Effektivität der Extraktion das Ergebnis gleich oder besser als das des AGPC-Verfahrens aus dem Vergleichsbeispiel 2 (Tabelle 5).
Vergleichsbeispiel 2
Die HCV-RNA Extraktion wurde unter der gleichen Bedingung wie in Beispiel 5 durchgeführt mit der Ausnahme, dass das Kopräzipitat (Amylopectin azure) nicht verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt. In diesem Fall konnte das Präzipitat nicht mit den Augen erkannt werden.
Tabelle 5 Test des Extraktionslimits unter Verwendung eines verdünnten Serums eines Patienten mit C-Type Hepatitis Verdünnungsverhältnis des HCV-Patientenserums
Beispiel 6
Die HCV-RNA Extraktion wurde in der gleichen Weise durchgeführt wie in Beispiel 5, mit der Ausnahme das Amylopektin an Stelle von Amylopectin azure verwendet wurde. HCV-RNA wurde als weißes Präzipitat aus der Abtrennung und Konzentrierung unter Verwendung von 100% Isopropylalkohol abgelagert. Die Effektivität der Extraktion war zu der in Beispiel 5 äquivalent.
Im Folgenden wird die Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung in Bezug auf die beigefügten Figuren beschrieben.
1 zeigt einen Zustand, in dem sich eine wässrige Lösung 11, in welcher sich Nukleinsäuren und andere Verunreinigungen als Nukleinsäuren verteilen, welche durch das Denaturieren von Proteinverunreinigung und die Lyse von biologischem Material erzeugt wurden, und eine organische Flüssigkeit 12 mit hohem spezifischen Gewicht oder eine Mischung 12 aus organischen Flüssigkeiten mit hohem spezifischen Gewicht oder eine Mischung 12 dieser Flüssigkeit mit hohem spezifischen Gewicht und Alkohol in einem Mikroröhrchen T1 auftrennen. Die organische Flüssigkeit mit hohem spezifischen Gewicht enthält ein thixotropes Verdickungsagens, welche eine Bindungsfähigkeit für die Verunreinigungen im biologischen Material besitzt, um eine nicht-fließfähige agglutinierte Phase an einer Grenzfläche zwischen den oberen und unteren Phasen in der Phasenverteilungsextraktion zu bilden, und dadurch die Isolierung der Nukleinsäure mittels Dekantierung oder reverser Auftrennung zu ermöglichen.
2 zeigt ein Stadium, in welchem eine obere Phase 13 einer wässrigen Flüssigkeit, welche DNA enthält, sowie eine nicht-fließfähige agglutinierte Phase 14 und eine untere Phase 15 einer organischen Flüssigkeit mit hohem spezifischen Gewicht, welche Verunreinigungen wie beispielsweise Protein enthält, eine Mischung einer organischen Flüssigkeit mit hohem spezifischen Gewicht oder eine Mischung dieser organischen Flüssigkeit mit hohem spezifischem Gewicht und Alkohol im Mikroröhrchen aufgetrennt werden. Die nicht-fließfähige agglutinierte Phase 14 wird durch die Änderung der Viskosität durch den ansteigenden Verdickungseffekt gebildet auf Grund dessen, dass das an das Protein oder ähnlichem gebundene thixotrope Verdickungsagens sich in der intermediären Phase (Phasengrenzschicht) durch die Zentrifugalkraft der Auftrennung mittels Zentrifugation und durch den Auftrieb in der organischen Flüssigkeit mit hohem spezifischen Gewicht sammelt und die Konzentration des thixotropen Agens gesteigert wird.
3 zeigt einen Zustand, in dem die obere Phase 13 einer DNA-haltigen wässrigen Flüssigkeit in ein neues Mikroröhrchen T2 mittels Dekantierung überführt wird.
4 zeigt einen Zustand, in dem Alkohol 16 zur wässrigen Flüssigkeit 13 zugegeben wird, welche Nukleinsäure (DNA) enthält, und welche in das Mikroröhrchen T2 überführt wurde.
In 4 werden beiderseits Alkohol und flüssige wässrige Phase gemischt um eine gemischte Flüssigkeit 18 zu bilden. Nachdem die gemischte Flüssigkeit 18 einer Auftrennung mittels Zentrifugation unterworfen wurde, haftet ein farbiges Präzipitat (ein Kopräzipitat + Nukleinsäuren) 17 am Boden des Mikroröhrchen T2, wie in 5 gezeigt.
6 zeigt einen Zustand, in dem die gemischte Flüssigkeit 18 verworfen wird und nur das farbige Präzipitat 17 im Mikroröhrchen T2 verbleibt. Im oben dargestellten Verfahren kann das Kopräzipitat der vorliegenden Erfindung in jedem Schritt der 1 bis 5 zugegeben werden.
Gewerbliche Anwendbarkeit in der Industrie
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine sehr geringe Menge an HCV-RNA in einer Testprobe durch Zugabe eines Kopräzipitats bei jedem Schritt des Extraktionsverfahrens extrahiert werden. Weiterhin kann das Vorhandensein der HCV-RNA mit den Augen als blaues Präzipitat durch die Kopräzipitierung mit Isopropylalkohol oder Ethanol erkannt werden. Konventionelle technische Fehler, welche mit dem Extraktionsverfahren zusammenhängen, können daher auf ein Minimum reduziert werden.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verwendung von SepaGene (ein Nukleinsäure extrahierendes Reagenz, hergestellt von SANKO JUNYAKU CO., Ltd.) beschränkt. Es ist weiterhin ebenfalls in anderen Extraktionsverfahren, einschließlich dem oben als Kontrolle beschriebenen AGPC-Verfahren möglich, mit den Augen die Existenz von HCV-RNA als blaues Präzipitat zu erkennen, welches durch Kopräzipitierung mit Isopropylalkohol oder Ethanol erzeugt wurde.
Da sich das Kopräzipitat der vorliegenden Erfindung in jedem Schritt des HCV-RNA-Extraktionsverfahrens in der gleichen Weise wie HCV-RNA verhält, kann die Effektivität der Extraktion gesteigert werden.
Das Kopräzipitat der vorliegenden Erfindung wirkt nicht kompetitiv auf die reverse Transkription oder die PCR-Reaktion und/oder inhibiert diese Reaktion nicht, und übt daher keinen Effekt auf die Sensitivität der Detektion ausgehend von diesen Reaktionen aus.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine nicht-fließfähige agglutinierte Phase als Grenzflächenphase zwischen den oberen und unteren Phasen gebildet, wobei die Grenzflächenphase klar wird und im weiteren die obere Phase der wässrigen Flüssigkeit, welche die Nukleinsäuren enthält, mittels Dekantierung einfach abgetrennt werden kann.

Claims

Zusammensetzung, umfassend ein Pigment-modifiziertes langkettiges an Glukose gebundenes Polysaccharid, eine Nukleinsäure und einen Alkohol, zur Kopräzipitierung der genannten Nukleinsäure und des genannten Polysaccharids.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, charakterisiert dadurch, dass der Alkohol Isopropylalkohol oder Ethanol ist.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, charakterisiert dadurch, dass das Pigment-modifizierte langkettige an Glukose gebundene Polysaccharid aus der Gruppe Azurstärke, Amylopectin azure und Amylose azure ausgewählt wird.
Verwendung eines Pigment-modifizierten langkettigen an Glukose gebundenen Polysaccharids zur Fällung von Nukleinsäuren.
Verwendung gemäß Anspruch 4, charakterisiert dadurch, dass das Pigment modifizierte langkettige Glukose gebundene Polysaccharid aus der Gruppe Azurstärke, Amylopectin azure und Amylose azure ausgewählt wird.
Extraktionsverfahren für Nukleinsäuren, umfassend die Schritte: Vorbehandlung zur Lyse von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien und/oder Testproben; Deproteinisierung der vorbehandelten biologischen Materialien und/oder Testproben; Abtrennung einer Nukleinsäure enthaltenden wässrigen Flüssigkeit von den deproteinisierten biologischen Materialien und/oder Testproben; Mischen der die Nukleinsäuren enthaltenden wässrigen Flüssigkeit durch Zugabe von Alkohol, und Abtrennung und Konzentrierung der Nukleinsäuren durch Abtrennung mittels Zentrifugation, charakterisiert dadurch, dass ein Pigment modifiziertes langkettiges an Glukose gebundenes Polysaccharid als Kopräzipitat verwendet wird, welches gemeinsam mit den Nukleinsäuren in einem Verfahren zur Extraktion der Nukleinsäuren ausfällt.
Extraktionsverfahren gemäß Anspruch 6, charakterisiert dadurch, dass der Schritt der Deproteinisierung eine Extraktion mittels Phasentrennung durch Phenol mit einschließt, sowie die Auflösung des Proteins durch ein chaotropes Agens, die Bildung eines Nukleinsäurekomplexes durch ein kationisches Tensid, das Einfangen von Nukleinsäure durch einen Glasfilter oder das Einfangen von Nukleinsäure durch magnetische Beads.
Extraktionsverfahren für Nukleinsäuren, umfassend die Schritte: Vorbehandlung zur Lyse von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien und/oder Testproben; Zugabe einer wässrigen Flüssigkeit und einer nicht-hydrophilen organischen Flüssigkeit, welche ein hohes spezifisches Gewicht besitzt und ein thixotropes Verdickungsagens enthält, zu den vorbehandelten biologischen Materialien und/oder Testproben; Mischung dieser Bestandteile; Abtrennung mittels Zentrifugation; Abtrennung der oberen Phase, welche die Nukleinsäure enthält, durch Bildung einer nicht-fließfähigen agglutinierten Phase in einer Phasengrenzschicht zwischen den oberen und unteren Phasen; und Mischung der die Nukleinsäure enthaltenden wässrigen Flüssigkeit durch Zugabe von Alkohol; Abtrennung und Konzentrierung der Nukleinsäuren durch Abtrennung mittels Zentrifugation, charakterisiert dadurch, dass ein Pigment modifiziertes langkettiges an Glukose gebundenes Polysaccharid als Kopräzipitat verwendet wird, welches gemeinsam mit Nukleinsäuren in einem Verfahren zur Extraktion der Nukleinsäuren ausfällt.
Extraktionsverfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, charakterisiert dadurch, dass der Alkohol Isopropylalkohol oder Ethanol ist.
Extraktionsverfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9, charakterisiert dadurch, dass die Nukleinsäuren HCV-RNA sind.
Extraktionsverfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 10, charakterisiert dadurch, dass die Konzentration des Pigment modifizierten langkettigen an Glukose gebundenen Polysaccharids 0,5 bis 100 μg/ml beträgt.