CN107537026A - Vegf‑b的应用 - Google Patents

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李春植
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Abstract

本发明公开了VEGF‑B在制备抑制新生血管形成、肿瘤和其它增生性疾病的药物中的应用以及含有VEGF‑B的药物。本发明中的VEGF‑B能够与FGF2的受体FGFR1和FGFR2结合，诱导FGFR1/VEGFR1或FGFR2/VEGFR1复合物形成，抑制FGFR1和FGFR2的作用，上调Spry4表达，抑制FGF2对Erk的活化作用，继而抑制新生血管形成和肿瘤生长。

Description

VEGF-B的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是VEGF-B在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。
背景技术
血管内皮生长因子-B(Vascular endothelial growth factor B,VEGF-B)是VEGF家族的成员并在多种细胞中表达。但有关其在血管***中的作用的研究甚少。目前关于VEGF-B在新生血管发生中的功能及机制尚不清楚。1996年，VEGF-B被发现。VEGF-B的氨基酸序列与VEGF家族的其他成员VEGF165和PIGF的同源性分别是47％和37％。VEGF-B在大多数组织和器官都有表达，以分泌性同源二聚体的形式存在。成熟的VEGF-B有2个亚型：VEGF-B167和VEGF-B186。VEGF-B167在其羧基端有一个肝素结合位点，分泌后与细胞表面的肝素蛋白多糖(HSPGs)相结合。VEGF-B186没有肝素结合位点，因此分泌出细胞后分布较分散。VEGF-B可与受体VEGFR1和NRP-1结合。
VEGFR1作为VEGF-B的受体在多种细胞，包括血管内皮细胞及平滑肌细胞中均有表达。关于VEGFR1在血管中作用的研究提示其具有双面性：在特定环境下VEGFR1既可表现为促新生血管作用，也可以表现为抗新生血管作用。一些研究模型中VEGFR1敲除促进新生血管形成，VEGFR1在血管细胞及非血管细胞中能够抑制Erk活化。然而关于VEGFR1抑制Erk活化及新生血管的作用机制尚不清楚，作为VEGFR1的配体，VEGF-B是否参与该作用，目前尚不明确。
成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)及其受体FGFR1和FGFR2在机体内广泛表达，具有强大的促新生血管作用。过表达FGF2能够显著诱导新生血管发生，FGF2缺失导致心脏血管密度降低。FGF2敲除不仅能影响血管形成，更能导致血管退化。FGF/FGFR通路上配体或受体的突变及功能异常均可导致多种器官的肿瘤发生，如乳腺、膀胱、肺和头颈部的鳞状细胞癌，FGF/FGFR在多种肿瘤细胞高表达。因此，如何平衡/抑制FGF/FGFR的功能对抑制肿瘤发生至关重要。目前为止，对于FGF2和FGFR1/2活性的抑制因素知之甚少。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可抑制FGF2和FGFR1/2的活性的药物，从而抑制肿瘤发生。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
作为本发明的第一个方面，本发明提供了VEGF-B在制备抑制新生血管形成的药物中的应用。本申请的发明人经多次实验发现，当组织中VEGF-B的浓度为10～300ng/ml时，抑制新生血管形成的效果较佳。
作为本发明的第二个方面，本发明提供了VEGF-B在制备治疗增生性疾病的药物中的应用。
作为本发明的第三个方面，本发明提供了VEGF-B在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。
作为本发明的第四个方面，本发明提供了VEGF-B在制备治疗癌症的药物中的应用。
作为本发明的第五个方面，本发明提供了VEGF-B和FGF2的受体抑制剂的联合使用在制备抑制新生血管形成的药物中的应用。在本申请中，发明人综合运用各种模型及实验方法，首次发现VEGF-B是FGF2/FGFR信号通路的重要负调控因子；同时，首次发现VEGF-B能够与FGF2的受体FGFR1和FGFR2结合，诱导FGFR1/VEGFR1或FGFR2/VEGFR1复合物形成，上调Spry4表达，抑制FGF2对Erk的活化作用，继而抑制新生血管形成和肿瘤生长。
优选地，所述VEGF-B为VEGF-B167或/和VEGF-B186。
作为本发明的第六个方面，本发明提供了VEGF-B和FGF2的受体抑制剂的联合使用在制备治疗增生性疾病的药物中的应用。
优选地，所述VEGF-B为修饰过的VEGF-B，其中，所述修饰过的VEGF-B为环化、磷酸化或/和甲基化的VEGF-B；或者所述VEGF-B为相比VEGF-B少或多1～5个氨基酸的重组蛋白或多肽。
作为本发明的第七个方面，本发明提供了VEGF-B和FGF2的受体抑制剂的联合使用在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。
作为本发明的第八个方面，本发明提供了VEGF-B和FGF2的受体抑制剂的联合使用在制备治疗癌症的药物中的应用。
优选地，所述癌症为鳞状细胞癌。
优选地，所述癌症为子宫内膜癌、乳腺癌、膀胱癌或直肠癌。
优选地，所述FGF2的受体为FGFR1和/或FGFR2。
作为本发明的第九个方面，本发明提供了表达VEGF-B的质粒、病毒和细胞在制备抑制新生血管形成、治疗增生性疾病、抑制肿瘤生长或治疗癌症的药物中的应用。优选地，所述VEGF-B为VEGF-B167或/和VEGF-B186。
作为本发明的第十个方面，本发明提供了一种抑制新生血管形成的药物，所述药物包含VEGF-B。或者，所述药物含有表达VEGF-B的质粒、病毒或细胞。
作为本发明的第十一个方面，本发明提供了一种治疗增生性疾病的药物，所述药物包含VEGF-B。或者，所述药物含有表达VEGF-B的质粒、病毒或细胞。
作为本发明的第十二个方面，本发明提供了一种抑制肿瘤生长的药物，所述药物包含VEGF-B。或者，所述药物含有表达VEGF-B的质粒、病毒或细胞。
作为本发明的第十三个方面，本发明提供了一种治疗癌症的药物，所述药物包含VEGF-B。或者，所述药物含有表达VEGF-B的质粒、病毒或细胞。
优选地，所述药物还包括FGF2的受体抑制剂。
更优选地，所述FGF2的受体为FGFR1和/或FGFR2。
优选地，所述癌症为鳞状细胞癌。
优选地，所述癌症为子宫内膜癌、乳腺癌、膀胱癌或直肠癌。
综上所述，本发明的有益效果为：
VEGF-B能够与FGF2的受体FGFR1和FGFR2结合，诱导FGFR1/VEGFR1或FGFR2/VEGFR1复合物形成，上调Spry4表达，抑制FGF2对Erk的活化作用，继而抑制新生血管形成、肿瘤生长以及其他细胞、组织的增生。
附图说明
图1为本发明的实施例1的实验结果图；
图2为本发明的实施例2的实验结果图；
图3为本发明的实施例3的实验结果图；
图4为本发明的实施例4的实验结果图；
图5为本发明的实施例5的实验结果图；
图6为本发明的实施例6的实验结果图；
图7为本发明的实施例7的实验结果图；
图8为本发明的实施例8的实验结果图；
图9为本发明的实施例9的实验结果图；
图10为本发明的实施例10的实验结果图；
图11为本发明的实施例11的实验结果图；
图12为本发明的实施例12的实验结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1VEGF-B167与FGFR1结合并激活FGFR1
实验材料：HREC(人视网膜内皮细胞)和HUVSMC(人脐静脉平滑肌细胞)；
实验方法：
免疫印迹检测(Western blot):HREC和HUVSMC常规培养，分别加入FGF2(50ng/ml)或VEGF-B(100ng/ml)刺激15或30分钟后收集蛋白，SDS-PAGE胶电泳，分别检测磷酸化FGFR1(pFGFR1)和总的FGFR1(tFGFR1)。
表面等离子体共振检测：将FGFR1-Fc固定于传感片，再加入FGF2或VEGF-B167,检测它们与FGFR1的结合。
基于表面等离子体共振的竞争结合检测：将FGFR1-Fc固定于传感片，先加入不同浓度(分别为10、50、100、200、500、1000ng/ml)的VEGF-B167或PlGF-1，再加入FGF2,检测前二者对FGF2与FGFR1结合的竞争抑制。
点杂交实验：不同剂量的人VEGF-B167或者FGF2蛋白分别点到膜的上面和中间，下面一行是不同剂量的人FGFR1c-Fc蛋白和658-FR。膜先用BSA封闭后加入1μg/ml的FGFR1c-Fc进行孵育，继而用过氧化物酶标记的人IgG Fcγ孵育并显色。
实验结果：
如图1所示，其中，A图为免疫印迹结果，显示在HREC(人视网膜血管内皮细胞)中，VEGF-B167能激活FGFR1；FGF2作为阳性对照。
B图显示在HUVSMC(人脐静脉平滑肌细胞)中，VEGF-B167能诱导FGFR1磷酸化。
C图为表面等离子体共振分析的结果，显示VEGF-B167能与FGFR1结合，其Kd值为15nM。
D图为结合竞争实验结果，显示VEGF-B167能与FGF2竞争结合至FGFR1，PlGF-1无此作用。
E图为点杂交实验结果：不同剂量的人VEGF-B167或者FGF2蛋白分别点到膜的上面和中间，下面一行是不同剂量的人FGFR1c-Fc蛋白和658-FR。膜先用BSA封闭后加入1μg/ml的FGFR1c-Fc进行孵育，继而用过氧化物酶标记的人IgG Fcγ孵育并显色。实验结果显示VEGF-B167可以与FGFR1结合。
实施例2VEGF-B167抑制FGF2对Erk的激活作用
实验材料：HREC(人视网膜内皮细胞)、HMVEC(人微血管内皮细胞)、Hela(人子***细胞)和8周龄C57Bl6小鼠；
实验方法：
免疫印迹检测(Western blot):HREC和HMVEC常规培养，分别加入FGF2(50ng/ml)或VEGF-B167(100ng/ml)刺激15分钟后收集蛋白，SDS-PAGE胶电泳，分别检测磷酸化Erk(pErk)和总的Erk(tErk)水平。
体内实验：C57小鼠玻璃体分别注射FGF2、VEGF-B等，30分钟后取视网膜提取蛋白，做Western blot检测Erk磷酸化水平。
FGFR1突变体实验：将FGFR1不同位点突变的质粒转染Hela细胞，再用FGF2、VEGF-B167刺激检测Erk磷酸化水平，找到与VEGF-B167发生作用的位点。
实验结果：
如图2所示，A和B图结果显示，在HREC(人视网膜内皮细胞，图A)和HMVEC(人微血管内皮细胞，图B)中，FGF2能引起Erk磷酸化。加VEGF-B167以后，FGF2诱导的Erk磷酸化水平减弱。
在体内实验(C图)，取小鼠视网膜做免疫印迹，小鼠玻璃体腔注射VEGF-B167能抑制FGF2诱导的Erk磷酸化，但对VEGF-A诱导的Erk磷酸化无影响。
从D图可知，FGFR1活化时，FGFR1胞质内段酪氨酸残基磷酸化；转染野生型FGFR1或FGFR1突变体(F766和F654)时，VEGF-B167能抑制FGF2诱导的Erk磷酸化。
E图表明，转染其他FGFR1突变体(F463、F585、F653和F583)时，VEGF-B167抑制FGF2诱导的Erk磷酸化的作用消失。
实施例3VEGF-B167抑制FGF2诱导的新生血管形成
实验材料：8周龄C57Bl6小鼠、Matrigel(356230,BD Bioscience)和Vegf-b基因缺失小鼠；
实验方法：
人工基底膜体内成血管模型实验：0.5ml含有肝素(10μg/ml)及BSA(300ng/ml,Sigma)、FGF2(150ng/ml,PeproTech)、VEGF-B167(300ng/ml,PeproTech)或者FGF2(150ng/ml)+VEGF-B167(300ng/ml)的Matrigel注射入C57Bl6小鼠腹腔皮下，7天后处死小鼠，取出Matrigel用4％PFA固定切片，进行H&E或CD31免疫染色。VEGF-B基因缺失小鼠实验：利用基因敲除技术获得Vegf-b基因缺失小鼠，PCR进行验证。将其视网膜铺片，进行H&E或CD31免疫染色。
小鼠主动脉环实验：分离C57Bl6小鼠和VEGF-B167基因缺失小鼠的主动脉，小心去除外面的脂肪和***，剪成1.0mm长的动脉环，放入无血清培养基中，37℃5％CO2培养箱饥饿过夜，第二天将动脉环接种到Matrigel并加入FGF2(20ng/ml)，隔天换液，14天后采集图片，进行血管定量。
实验结果：
如图3所示，利用人工基底膜体内成血管模型实验(A图)，发现VEGF-B167抑制FGF2诱导的新生血管形成。
基因敲除策略示意图(B图)显示LacZ表达框替换Vegf-b基因的外显子2至6基因组片段。利用PCR验证基因敲除纯合子(-/-)、杂合子(+/-)及野生型(+/+)小鼠的基因型。
视网膜铺片染色(C图)显示VEGF-B167基因缺失小鼠视网膜血管区密度增加。
免疫荧光检测(D图)内皮细胞标志蛋白，结果显示VEGF-B167基因缺失小鼠大脑血管密度增加。
小鼠主动脉环实验(E图)结果显示VEGF-B167基因缺失的主动脉环中，FGF2诱导的新生血管明显增加，说明VEGF-B167抑制FGF2诱导的新生血管发生；VEGF-B167缺失可致新生血管增加。
实施例4VEGF-B167抑制肿瘤生长及新生血管发生以及肿瘤组织中VEGF-B167蛋白表达下降
实验材料：VEGF-B167腺病毒表达载体、B16(黑色素瘤细胞)、肝癌、子宫内膜癌、乳腺癌、膀胱癌、直肠癌肿瘤组织标本和8周龄C57Bl6小鼠；
实验方法：
皮下成瘤实验：VEGF-B167腺病毒表达载体(对照组用GFP表达载体)与B16细胞共同孵育1小时，C57Bl6小鼠皮下接种106个细胞，接种后13-17天测量肿瘤大小，17天时处死小鼠，取肿瘤组织切片CD31染色。
免疫印迹检测：肝癌、子宫内膜癌、乳腺癌、膀胱癌、直肠癌肿瘤组织标本匀浆，取上清进行蛋白定量，做免疫印迹检测VEGF-B167表达。
实验结果：
如图4所示，利用腺病毒表达载体在黑色素瘤细胞B16中过表达VEGF-B167，免疫印迹检测结果(A图)揭示VEGF-B167在B16细胞中过表达。
皮下成瘤实验结果(B图)显示过表达VEGF-B167可抑制B16肿瘤生长。
免疫荧光染色检测(C图)血管标志蛋白CD31，结果显示VEGF-B167可显著减少肿瘤血管数量。D图为C图结果中血管密度的统计分析散点图。
免疫印迹检测(E图)肝癌临床样本中VEGF-B167、FGFR1和FGFR2蛋白表达水平，结果显示肝癌发病样本中VEGF-B167蛋白表达水平明显低于正常样本，并且与FGFR1和FGFR2表达水平呈负相关关系。
免疫印迹检测(F图)显示，与正常组织相比，子宫内膜癌、乳腺癌、膀胱癌、直肠癌等肿瘤组织中VEGF-B167蛋白表达降低。
实施例5VEGF-B167诱导VEGFR1与FGFR1形成复合体以及VEGF-B上调Spry4表达
实验材料：8周龄C57Bl6小鼠、HREC和DuolinkII PLA kit(Sigma,DUO92007)；
实验方法：
免疫共沉淀实验(Co-immunoprecipitation)：分离C57Bl6小鼠的脑组织和视网膜，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液进行匀浆离心取上清，蛋白定量后与抗FGFR1抗体4℃孵育过夜，之后加入结合了A/G蛋白的磁珠，将抗体复合物捕获，进行10％PAGE胶电泳，转PVDF膜，再用抗VEGFR1、VEGFR2或者FGFR1的一抗孵育，用HRP标记的二抗孵育后加ECL发光液显色。
为明确VEGF-B167的作用，小鼠玻璃体内注射VEGF-B(500ng/眼)、FGF2(100ng/眼)或者BSA(500ng/眼)，1小时后取小鼠视网膜做免疫共沉淀。
基于邻位连接技术的生物检测(In situ proximity ligation assay)：按DuolinkII PLA kit(Sigma,DUO92007)说明书操作。HREC细胞用VEGF-B167或者PlGF刺激后用4％PFA固定，加入抗FGFR1和抗VEGF-B167抗体，用试剂盒的Duolink II抗小鼠plus和Duolink II抗兔minus二抗孵育后显色拍照。
实时荧光定量PCR检测：用TRIZOL裂解HREC细胞提取总RNA，取3ug RNA进行反转录，所得的cDNA作为模板进行PCR反应，检测Spry4的表达。
实验结果：
如图5所示，免疫沉淀实验(图A)显示在小鼠视网膜和脑组织中FGFR1与VEGFR1结合形成复合物，与VEGFR2无相互结合作用。
利用免疫沉淀实验(图B)揭示小鼠玻璃体腔注射VEGF-B167可增强视网膜中FGFR1与VEGFR1的相互结合作用。
基于邻位连接技术的生物检测(图C)结果揭示VEGF-B167可诱导人视网膜内皮细胞(HREC)中形成FGFR1/VEGFR1复合物；PlGF对该复合物形成无明显诱导作用，说明VEGF-B167对此诱导作用具特异性。
实时荧光定量PCR检测(图D)结果显示VEGF-B167作用于HREC上调Spry4表达。
免疫印迹检测(图E)结果证明小鼠玻璃体腔注射VEGF-B167可上调视网膜中Spry4表达。
基因芯片检测(图F)显示VEGF-B上调Spry4的表达(4倍)但不影响Spry1的表达。
体内实验也证实了这一点。小鼠眼玻璃体注射VEGF-B167后，提取视网膜RNA做real-time PCR检测，显示Spry4表达增加(图G)。
实施例6VEGF-B167通过FGFR1、Flt1及Spry4抑制FGF2的促新生血管及其促生长作用
实验材料：Fgfr1flox/flox小鼠、Flt1flox/flox小鼠、Spry4基因敲除小鼠(Spry4-/-)、同窝野生型小鼠(Spry4+/+)和表达Cre酶的腺病毒(Cre-Ad)；
实验方法：
小鼠原代内皮细胞(EC)提取：取4只小鼠的心脏剪碎，加入胶原酶I溶液37℃消化45分钟，吹打成单细胞悬液，加入结合CD31的磁珠室温孵育15分钟，洗涤后将结合在磁珠上的细胞加到明胶包被的培养皿里，用含ECGS的ECM培养基培养。
用表达Cre酶的腺病毒(Cre-Ad)敲除flox/flox基因：用表达Cre酶的腺病毒(Cre-Ad)感染来自Fgfr1flox/flox或Flt1flox/flox小鼠的原代内皮细胞48小时，可使flox/flox基因敲除。
实验结果：
如图6所示，从图A可知，在野生型(FGFR1表达正常)原代培养的小鼠血管内皮细胞，VEGF-B167可抑制FGF2对ERK的活化作用，PlGF1无此抑制作用，说明VEGF-B167可特异性抑制FGF2活化ERK；利用腺病毒载体表达Cre并敲除内皮细胞中FGFR1，可阻断VEGF-B167的这种抑制作用。
B图显示，在野生型(Flt1表达正常)原代培养的小鼠血管内皮细胞，VEGF-B167可抑制FGF2对ERK的活化作用，PlGF1无此抑制作用，说明VEGF-B167可特异性抑制FGF2活化ERK；利用腺病毒载体表达Cre并敲除内皮细胞中Flt1，可阻断VEGF-B167的这种抑制作用。
C图显示，在野生型(Spry4+/+)小鼠玻璃体腔中注射VEGF-B167可抑制FGF2对小鼠视网膜中ERK的活化作用；在Spry4基因缺失型(Spry4-/-)小鼠建立同样的实验模型，VEGF-B167没有这种抑制作用。
综上，VEGF-B/FGFR1信号通路可促进Sprouty4表达上调，并拮抗FGF2的促新生血管作用(如图D所示)。因此VEGF-B167对FGF2的促新生血管活性具有重要的抑制作用。
实施例7VEGF-B167与FGFR2结合
实验材料：HUVSMC(人脐静脉平滑肌细胞)、FGFR2-Fc和COS-7细胞；
实验方法：
Pull-down实验：0.5ug人FGFR2-Fc加入20ul结合蛋白G的琼脂糖珠，4℃孵育过夜，洗涤后加入不同剂量的VEGF-B或FGF2 37℃孵育3小时，珠子用PBS洗涤后行SDS-PAGE电泳，检测蛋白表达。
FGFR2碱性磷酸酶检测：COS-7细胞转染表达FGFR2-AP(碱性磷酸酶)的质粒，随后加入BSA、FGF2、VEGF-B167或PlGF刺激，3天后收集细胞上清做碱性磷酸酶活性检测。
实验结果：
如图7所示，利用表面等离子共振技术检测(图A)显示VEGF-B167与FGFR2结合,其Kd值是112nM。
Pull-down实验(图B)也表明VEGF-B167与FGFR2结合。
FGFR2碱性磷酸酶检测(图C)证实VEGF-B167能与FGFR2结合，而PlGF-1无此作用。
点杂交实验(图D)显示VEGF-B167能与FGFR2结合。
邻位链接技术(图E)显示外源性VEGF-B167诱导VEGF-B167/FGFR2复合体形成，而PlGF-1无此作用。
结合动力学实验(图F)结果显示VEGF-B167能够结合FGFR2。
实施例8VEGF-B167诱导FGFR2磷酸化
实验材料：HUVSMC、HREC和HMVEC；
实验方法：不同的细胞用FGF2或VEGF-B167刺激后提取总蛋白，与FGFR2抗体孵育共沉淀，再检测FGFR2磷酸化水平。
实验结果：
如图8所示，磷酸化抗体芯片检测(图A)结果显示VEGF-B167可诱导FGFR2磷酸化，而对FGFR3的磷酸化水平无影响。
免疫沉淀检测显示在HUVSMC(图B)和HREC(图C)中，VEGF-B167可诱导FGFR2磷酸化，其诱导能力与FGF2相当，而PlGF无明显诱导作用。
免疫沉淀实验(图D和E)显示在HUVEC、PAE-FGFR2c、PC3和OVCAR4等多种细胞中，VEGF-B167可激活FGFR2磷酸化，其激活FGFR2磷酸化的能力与FGF2相当。
实施例9VEGF-B167诱导FGFR2和VEGFR1结合
实验材料：8周龄C57Bl6小鼠和小鼠原代平滑肌细胞(SMC)；
实验方法：
小鼠原代平滑肌细胞提取：分离8周龄C57Bl6小鼠的主动脉，用含有175U/ml胶原酶和1.25U/ml弹性蛋白酶的消化液37℃孵育25分钟，体视镜下脱去主动脉的外膜，将光滑的主动脉放入含10％FBS的DMEM培养基，37℃培养箱过夜。第二天，将主动脉放入含175U/ml胶原酶和2.5U/ml弹性蛋白酶的消化液37℃孵育60分钟，轻轻吹打使血管组织破碎成小于1mm的小块，接种入培养皿继续培养。
实验结果：
如图9所示，免疫共沉淀实验(图A)表明在脑组织与视网膜组织中FGFR2能与VEGFR1结合，而不与VEGFR2结合。
小鼠玻璃体注射VEGF-B167后，VEGF-B167能促进视网膜中FGFR2与VEGFR1结合(图B)。
邻位链接技术(图C)显示外源性VEGF-B167诱导FGFR2/VEGFR1复合体形成，而PlGF无此作用。
实施例10VEGF-B167上调Spry4表达
实验材料：HUVSMC、EAhy926、OVCAR4(人卵巢癌细胞)和Fgfr2flox/flox、Flt1flox/flox小鼠原代平滑肌细胞；
实验方法：荧光实时定量PCR和免疫印迹步骤参考前述实施例；
实验结果：
如图10所示，图A显示，在mRNA水平，VEGF-B167激HUVSMC能上调Spry4表达。
图B显示，在蛋白水平，VEGF-B167刺激HUVSMC能上调Spry4表达。
图C显示，在VEGFR1存在情况下，VEGF-B167能上调Spry4表达；当VEGFR1敲低后，VEGF-B167不能上调Spry4表达。
图D显示，在FGFR2存在情况下，VEGF-B167能上调Spry4表达。当FGFR2敲低后，VEGF-B167不能上调Spry4表达。
免疫印迹结果显示VEGF-B167作用于HUVSMC(图E)、内皮细胞EA.Hy926(图F)和卵巢癌细胞OVCAR4(图G)，可上调Spry4表达。
实施例11VEGF-B167通过VEGFR1、FGFR2和Spry4抑制FGF2对Erk的磷酸化
实验材料：HUVSMC、PAE(主动脉内皮细胞)、Fgfr2flox/flox、Flt1flox/flox、Spry4-/-和Flt1-tk-/-小鼠原代平滑肌细胞；
实验方法：在不同的细胞用FGF2或VEGF-B167刺激，免疫印迹法检测其对Erk磷酸化的作用。
实验结果：
如图11所示，在HUVSMC(图A)和小鼠原代SMC(mouse primary SMC，图B)中，FGF2能引起Erk磷酸化；加入VEGF-B167后，FGF2诱导的Erk磷酸化水平减弱；而PlGF-1无此作用。
图C表明，分离自Flt1flox/flox小鼠的血管平滑肌细胞(SMC)，在VEGFR1存在的情况下，VEGF-B167能抑制FGF2诱导的Erk磷酸化，而PlGF-1无此作用；当加入Ad-cre将VEGFR1敲除后，VEGF-B167则不能抑制FGF2诱导的Erk磷酸化。
图D显示，在VEGFR1酪氨酸激酶存在情况下，VEGF-B167能抑制FGF2诱导的Erk磷酸化，而PlGF-1无此作用；当VEGFR1酪氨酸激酶敲除后，VEGF-B167抑制FGF2诱导的Erk磷酸化的作用消失。
图E表明在FGFR2存在情况下，VEGF-B167能抑制FGF2诱导的Erk磷酸化，而PlGF-1无此作用；当FGFR2敲低后，VEGF-B167抑制FGF2诱导的Erk磷酸化的作用消失。
图F表明在Spry4存在情况下，VEGF-B167能抑制FGF2诱导的Erk磷酸化，而PlGF-1无此作用；当Spry4敲除后，VEGF-B167抑制FGF2诱导的Erk磷酸化的作用消失。
图G显示在过表达FGFR2的PAE细胞中(PAE-FGFR2)中，VEGF-B167可抑制FGF2对ERK的活化作用，PlGF1无此抑制作用，说明VEGF-B167可特异性抑制FGF2活化ERK。
实施例12VEGF-B167抑制FGF2对血管平滑肌细胞的作用及新生血管形成
实验材料：HUVSMC和VEGF-B167 -/-小鼠；
实验方法：
细胞增殖实验：HUVSMC铺96孔板，每孔2000个细胞，无血清DMEM培养基饥饿过夜，第二天孔内分别加入BSA、FGF2、VEGF-B或其他因子，37℃5％CO2培养箱培养48小时后每孔加入20ul MTT溶液，4小时后吸走上清，加入150ul DMSO溶解沉淀，570nm波长测定吸光度。
细胞迁移实验：HUVSMC铺6孔板使其100％汇合，用200ul枪头划痕拍照，分别加入FGF2、VEGF-B167等刺激物，24小时后再拍照，计数迁移细胞的数量。
实验结果：
如图12所示，细胞增殖实验(图A)结果显示VEGF-B167可抑制FGF2诱导的HUVSMC细胞增殖，而PlGF无类似抑制作用。
细胞迁移试验(图B)结果显示VEGF-B167抑制FGF2诱导的HUVSMC细胞迁移。
视网膜切片染色(图C)结果显示VEGF-B167基因缺失小鼠的视网膜血管平滑肌细胞标志蛋白表达增加，血管密度也增加。
视网膜切片染色(图D)结果显示VEGF-B167基因缺失小鼠的视网膜血管周细胞阳性比例增加。
图E表明，VEGF-B167可诱导FGFR2/VEGFR1复合体形成，上调Spry4，抑制ERK活化，抑制FGF2信号通路。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.VEGF-B在制备抑制新生血管形成的药物中的应用。
2.VEGF-B在制备治疗增生性疾病、抑制肿瘤生长或治疗癌症的药物中的应用。
3.VEGF-B和FGF2的受体抑制剂的联合使用在制备抑制新生血管形成、治疗增生性疾病、抑制肿瘤生长或治疗癌症的药物中的应用。
4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述VEGF-B为VEGF-B167或/和VEGF-B186。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述FGF2的受体为FGFR1和/或FGFR2。
6.根据权利要求1、2、3或5所述的应用，其特征在于，所述VEGF-B为修饰过的VEGF-B，其中，所述修饰过的VEGF-B为环化、磷酸化或/和甲基化的VEGF-B；或者所述VEGF-B为相比VEGF-B少或多1～5个氨基酸的重组蛋白或多肽。
7.表达VEGF-B的质粒、病毒和细胞在制备抑制新生血管形成、治疗增生性疾病、抑制肿瘤生长或治疗癌症的药物中的应用。
8.一种抑制新生血管形成、治疗增生性疾病、抑制肿瘤生长或治疗癌症的药物，其特征在于，所述药物包含VEGF-B。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物还包括FGF2的受体抑制剂。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述FGF2的受体为FGFR1和/或FGFR2。
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