DE69334201T2 - Dominant-negativer Membran-gebundener Flk-1 Rezeptor des vaskulären Endothelzellen-Wachstumsfaktors VEGF - Google Patents

Dominant-negativer Membran-gebundener Flk-1 Rezeptor des vaskulären Endothelzellen-Wachstumsfaktors VEGF Download PDF

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Description

  • 1. Einführung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Liganden für den Flk-1-Rezeptor für die Modulierung der Angiogenese und Vaskulogenese. Die Erfindung beruht zum Teil auf der Demonstration, dass Flk-Tyrosinkinaserezeptor-Expression mit Endothelzellen assoziiert ist, und der Identifizierung von vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) als dem Hochaffinitätsliganden von Flk-1. Diese Ergebnisse zeigen eine wichtige Rolle für Flk-1 im Signalsystem während Vaskulogenese und Angiogenese. Manipulation von Wirtszellen, die Flk-1 exprimieren, und die Verwendungen von exprimierter Flk-1 zum Evaluieren und Screenen von Wirkstoffen und Analogen von VEGF, die in der Flk-1-Modulierung durch entweder Agonisten- oder Antagonistenaktivitäten involviert sind, wird beschrieben.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Flk-1-Liganden, einschließlich VEGF-Agonisten und -Antagonisten, für die Behandlung von Erkrankungen, einschließlich Krebs, durch Modulierung der Vaskulogenese und Angiogenese.
  • 2. Hintergrund der Erfindung
  • Rezeptortyrosinkinasen umfassen eine große Familie von Transmembranrezeptoren für Polypeptid-Wachstumsfaktoren mit verschiedenen biologischen Aktivitäten. Ihre intrinsische Tyrosinkinase-funktion wird durch Ligandenbindung aktiviert, was in einer Phosphorylierung des Rezeptors und verschiedener zellulärer Substrate und anschließend in einer Vielzahl von zellulären Antworten resultiert (Ullrich A. and Schlessinger, J., 1990, Cell 61: 203–212).
  • Eine Rezeptortyrosinkinase-cDNA, die als fötale Leberkinase 1 (Flk-1) bezeichnet wird, wurde von Mauszellpopulationen cloniert, die auf hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen angereichert wurden. Es wurde vorgeschlagen, dass der Rezeptor in hämatopoetischer Stammzellerneuerung involviert ist (Matthews et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9026–9030). Sequenzanalyse des Flk-1-Clons zeigte erhebliche Homologie mit der c-Kit-Unterfamilie von Rezeptorkinasen und insbesondere zu dem F/t-Genprodukt. Diese Rezeptoren haben alle eine extrazelluläre Domäne, die immunglobulinartige Strukturen enthält, gemeinsam.
  • Die Bildung und Ausbreitung von Blutgefäßen oder Vaskulogenese bzw. Angiogenese spielt bei einer Vielzahl von physiologischen Prozessen, wie beispielsweise embryonale Entwicklung, Wundheilung, Organregeneration und weibliche reproduktive Prozesse wie Follikelentwicklung in dem Corpus luteum während der Ovulation und plazentales Wachstum nach Schwangerschaft, wichtige Rollen. Unkontrollierte Angiogenese kann pathologisch sein, wie beispielsweise bei dem Wachstum von festen Tumoren, die auf eine Vaskularisierung zum Wachstum angewiesen sind.
  • Angiogenese schließt die Proliferation, Migration und Infiltration von vaskulären Endothelzellen ein und wird wahrscheinlich durch Polypetid-Wachstumsfaktoren reguliert. Verschiedene Polypeptide mit in vitro wachstumsfördernder Aktivität für Endothelzellen wurden identifiziert. Beispiele umfassen den sauren und basischen fibroblastischen Wachstumsfaktor, den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor und den plazentalen Wachstumsfaktor. Obwohl vier verschiedene Rezeptoren für die verschiedenen Mitglieder der FGF-Familie charakterisiert wurden, wurde von keinem von diesen bisher berichtet, dass er in Blutgefässen in vivo exprimiert wird.
  • Während die FGFs Mitogene für eine große Anzahl von verschiedenen Zelltypen zu sein scheinen, wurde kürzlich berichtet, dass VEGF ein für Endothelzellen spezifiches Mitogen ist (Ferrara, N. and Henzel, W. J., 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 161: 851–858). Kürzlich wurde gezeigt, dass der fms-artige Tyrosinrezeptor fit Affinität für VEGF hat (DeVries, C. et al., 1992, Science 255: 989–991).
  • 3. Zusammenfassung der Erfindung
  • Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist in den Ansprüchen definiert. Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Entdeckung, dass der Flk-1-Tyrosinkinaserezeptor auf der Oberfläche von Endothelzellen exprimiert wird, und der Identifizierung von vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) als dem Hochaffinitätsliganden von Flk-1. Die Rolle von Endothelzellproliferation und -Migration während Angiogenese und Vaskulogenese zeigt eine wichtige Rolle von Flk-1 in diesen Prozessen. Die Erfindung wird beispielhaft für den murinen Flk-1 beschrieben, aber die Prinzipien können auf andere Spezies, einschließlich Menschen, angewandt werden.
  • Pharmazeutische Reagenzien, die die Flk-1-VEGF-Interaktion inhibieren sollen, können für die Inhibierung von Tumorwachstum nützlich sein. VEGF und/oder VEGF-Agonisten können verwendet werden, um die Wundheilung zu fördern. Manipulierte Zelllinien, die Flk-1 auf ihrer Oberfläche exprimieren, können vorteilhafterweise verwendet werden, um VEGF-Agonisten und -Antagonisten zu screenen und zu identifizieren.
  • 4. Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1. Vergleich der Flk-1-Aminosäuresequenz mit verwandten RTKs. Aminosäuresequenzvergleich von Flk-1 mit humanem KDR und Ratten-TKr-C. Ein Abschnitt der Sequenz, welcher für alle drei Rezeptoren bekannt ist, wird verglichen, und nur Unterschiede zu der Flk-1-Sequenz sind gezeigt.
  • 2. Northernblot-Analyse der Flk-1-Genexpression. (A) Expression von Flk-1-RNA in Hausembryonen von Tag 9,5–Tag 18,5. Proben (10 μg) von Gesamt-RNA von ganzen Hausembryonen wurden in jeder Spur analysiert. Die Positionen von 28S und 18S ribosomalen RNAs sind markiert. (B) Expression von Flk-1-mRNA in postnatalem Tag 4- und adultem Gehirn im Vergleich mit kapillaren Fragmenten von postnatalem Tag 4-Gehirn. 1 μg poly(A+)-RNA wurde auf jede Spur geladen. Die 5' 2619 bp der Flk-1-cDNA wurden als eine Sonde benutzt. Kontrollhybridisierung mit einer GAPDH-cDNA-Probe ist im unteren Abschnitt gezeigt.
  • 3. Abundante Flk-1-Genexpression in embryonalen Geweben. In situ-Hybridisierungsanalyse von der Flk-1-Expression in einem Tag 14,5-Hausembryo. (A) Hellfeld-Ausleuchtung von einem parasagittalen Schnitt durch den gesamten Embryo, der mit einer 35S-markierten Antisensesonde (5' 2619 bp) hybridisiert wurde. (B) Dunkelfeld-Ausleuchtung desselben Schnitts. (C) Kontrollhybridisierung eines angrenzenden Schnitts mit einer Sensesonde. Abkürzungen: Ao, Aorta; At, Atrium; L, Lunge; Li, Leber; Ma, Mandibula; Mn, Hirnhaut, Ms, Mesencephalon; T, Telencephalon; V, Ventrikel; Vt, Wirbel.
  • 4. Eine Expression von Flk-1-RNA in embryonalen Organen ist auf spezifische Zellen beschränkt. Expression von Flk-1-RNA in einem Tag 14,5-Mausembryo bei höherer Vergrößerung. (A) Die Herzregion wurde mit einer 35S-markierten Antisensesonde sondiert. (B) Angrenzender Schnitt, der mit der Sensesonde hybridisiert wurde. (C) Teil der Aortawand, gezeigt auf der zellulären Ebene. Die Endothelzellschicht ist durch einen Pfeil angezeigt. (D) Die Lunge, die mit der Flk-1 Antisenseprobe sondiert wurde. (E) Kontrollhybridisierung von einem angrenzenden Schnitt, der mit der Sensesonde hybridisiert wurde. Abkürzungen: At, Atrium; B, Bronchie; Ed, Endothelzellschicht; En, Endocardium; L, Lunge; Li, Leber; Lu, Lumina der Aorta; Ml, muskulär; My, Myocardium.
  • 5. Flk-1-Genexpression in dem Gehirn der sich entwickelnden Maus. In situ-Hybridisierungsanalyse der Flk-1-Genexpression in dem Gehirn bei verschiedenen Entwicklungsstadien. Alle Schnitte wurden mit der Flk-1-Antisensesonde sondiert. (A) Sagittaler Schnitt des Telencephalon eines Tag 11,5-Mausembryos. Ein einzelnes Blutgefäß, welches Flk-1 exprimiert und welches von der Hirnhaut in das Neuroektoderm sprießt, ist durch einen Pfeil angezeigt. (B) Sagittale Schnitte des Gehirns eines Embryos von Tag 14,5 und (C) von postnatalem Tag 4. Gezeigt sind Regionen des Mesencephalon. Verzweigte Kapillaren und Blutgefäße, die Flk-1 exprimieren, sind durch einen Pfeil angezeigt. (D) Sagittale Schnitte eines adulten Gehirns; eine Region des Mesencephalon ist gezeigt. Zellen, die Flk-1 exprimieren, sind durch einen Pfeil angezeigt. Abkürzungen: M, Hirnhaut; V, Ventrikel.
  • 6. Expression von Flk-1 in dem choroiden Plexus des adulten Gehirns. (A) Dunkelfeld-Ausleuchtung des choroiden Plexus eines adulten Mausgehirns, welches mit einer Flk-1-Antisensesonde hybridisiert wurde. (B) Choroider Plexus, gezeigt bei einer höheren Vergrößerung. Pfeile zeigen einzelne Zellen an, die eine starke Expression von Flk-1 zeigen. Abkürzungen: CP, choroider Plexus; E, Ependym; Ep, Epithelzellen; V, Ventrikel.
  • 7. Flk-1 wird in den Glomeruli der Niere exprimiert. (A) Parasagittaler Schnitt einer Niere vom postnatalen Tag 4, der mit der Flk-1-Antisensesonde hybridisiert wurde. Das Hybridisierungssignal akkumuliert in den Glomeruli, wie durch Pfeilköpfe angezeigt. (B) Kontrollhybridisierung von einem angrenzenden Schnitt mit der Sensesonde. (C) Sagittaler Schnitt einer adulten Niere, die mit Flk-1 sondiert wurde. Pfeilköpfe zeigen Glomeruli an. (D) Glomerulus einer adulten Niere bei einer höheren Vergrößerung. Die Pfeile in (A) und (D) zeigen Zellen an, die in Strängen in der juxtaglomulären Region ausgerichtet sind, die Flk-1 exprimiert.
  • 8. In situ-Hybridisierungsanalyse der Flk-1-Expression in frühen Embryonen und extraembryonalen Geweben. (A) Sagittaler Schnitt von einem Tag 8,5-Mausembryo im maternalen Deciduum, sondiert mit Flk-1. (B) Höhere Vergrößerung des Deciduums. Pfeilköpfe zeigen das Endothelium von maternalen Blutgefäßen an, welche Flk-1-RNA stark exprimieren. (C) Hohe Vergrößerung des Dottersacks und des Trophoektoderms eines Tag 9,5-Mausembryos. (D) Hohe Vergrößerung einer Blutinsel. Abkürzungen: A, Allantois; Bi, Blutinsel; Bv, maternales Blutgefäß; D, Deciduum; En, endodermale Schicht des Dottersacks; M, Mesenchym; Ms, mesodermale Schicht des Dottersacks; NF, Neuralfalte; T, Trophoblast; Y, Dottersack.
  • 9. Flk-1 ist ein Rezeptor für VEGF. (A) Quervernetzen von 125I-VEGF mit COS-Zellen, die den Flk-1-Rezeptor transient exprimieren, und Kontrollzellen wurden mit 125I-VEGF bei 4°C über Nacht inkubiert, dann zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und 0,5 mM des Quervernetzungs-Agens DSS in PBS eine Stunde bei 4°C ausgesetzt. Die Zellen wurden lysiert, der Flk-1-Rezeptor wurde immunpräzipitiert und durch Polyacrylamidgelelektrophorese, gefolgt von Autoradiographie, analysiert. Molekulare Größenmarker sind in Kilodalton angezeigt. (B) Spefizische Bindung von 125I-VEGF an COS-Zellen, die Flk-1 exprimieren. COS-Zellen, die Flk-1 transient exprimieren, wurden von der Platte entfernt und in Bindungsmedium (DMEM, 25 mM Hepes, 0,15% Gelatine) resuspendiert. Die Bindung wurde bei 15°C 90 Minuten in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml, welches 2×105 Zellen, 15.000 ZpM 125I-VEGF und die angezeigten Konzentrationen von unmarkiertem Liganden enthielt, durchgeführt. Die Zellen wurden zweimal mit PBS/0,1% BSA gewaschen und in einem Gammazähler gezählt.
  • 10. VEGF-induzierte Autophosphorylierung von Flk-1. COS-Zellen, die den Flk-1-Rezeptor transient exprimieren, und Kontrollzellen wurden 24 Stunden in DMEM, welches 0,5% fötales Kälberserum enthielt, ausgehungert und dann mit VEGF 10 Minuten wie angezeigt stimuliert. Die Zellen wurden solubilisiert, der Flk-1-Rezeptor wurde mit einem polyclonalen Antikörper gegen seinen C-Terminus immunpräzipitiert, durch Polyacrylamidgelelektrophorese abgetrennt und auf Nitrozellulose transferiert. Der Blot wurde mit Antiphosphotyrosin-Antikörpern (5B2) sondiert. Die Proteinbanden wurden durch Verwendung eines Meerrettichperoxidase gekoppelten zweiten Antikörpers und eines BCLTM (Amersham)-Detektionstests sichtbar gemacht.
  • 11. Nucleotidsequenz von murinem Flk-1.
  • 12. Plasmidkarten von retroviralen Vektorkonstrukten. pLXSN Flk-1 TM Cl.1 und pLXSN Flk-1 TM cl. 3 enthalten Flk-1-Aminosäuren 1 bis 806. pNTK-cfms-TM enthält die 541 N-terminalen Aminosäuren von c-fms.
  • 13. Inhibierung von C6-Glioblastoma-Tumorwachstum durch transdominantnegative Inhibierung von Flk-1. C6-Zellen wurden entweder allein implantiert oder mit Virus-produzierenden Zellen koimplantiert. Die Zellanzahlen waren, wie in jedem Abschnitt angezeigt. Zwei verschiedene Virus-produzierende Zelllinien wurden benutzt: eine, die die Flk-1 TM (transdominant-negative)-Mutante exprimiert und als eine Kontrolle eine, die eine transdominant-negative c-fms-Mutante (c-fms TM) exprimiert. Beginnend zu der Zeit, als die ersten Tumore erschienen, wurden Tumorvolumina alle 2 bis 3 Tage gemessen, um eine Wachstumskurve zu erhalten. Jede Gruppe wird durch vier Mäuse repräsentiert.
  • 14. Inhibierung von C6-Glioblastoma-Tumorwachstum durch transdominantnegative Inhibierung von Flk-1. C6-Zellen wurden entweder allein implantiert oder mit Virus-produzierenden Zellen koimplantiert. Die Zellzahlen waren, wie in jedem Abschnitt angezeigt. Zwei verschiedene Virus-produzierende Zelllinien wurden benutzt: eine, die die Flk-1 TM (transdominant-negative)-Mutante exprimiert, und als eine Kontrolle eine, die eine transdominant-negative c-fms-Mutante (cfms TM) exprimiert. Beginnend mit der Zeit, als der erste Tumor erschien, wurden Tumorvolumina alle 2 bis 3 Tage gemessen, um eine Wachstumskurve zu erhalten. Jede Gruppe wird durch vier Mäuse repräsentiert.
  • 5. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung basiert zum Teil auf Ergebnissen von in situ-Hybridisierung und Northernblot-Analysen, die anzeigen, dass Flk-1 eine Endothelzell-spezifische RTK ist. Zusätzlich haben Quervernetzungs-Versuche gezeigt, dass Flk-1 ein Hochaffinitätsrezeptor für vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) ist; dies zeigt an, dass Flk-1 eine entscheidende Rolle in der Entwicklung und Differenzierung von Hämangioblasten und in nachfolgendem Endothelzellwachstum während Vaskulogenese und Angiogenese spielt.
  • Die Erfindung basiert auch auf der Entdeckung, dass eine Expression einer transdominant-negativen mutierten Form des Flk-1-Moleküls die biologische Aktivität der endogenen Wildtyp-Flk-1 inhibieren kann. Es werden hierin Versuche beschrieben, in welchen Tumorzellen und Zellen, die ein rekombinantes Retrovirus produzieren, der einen verkürzten Flk-1-Rezeptor codiert, gemischt werden und in Mäuse injiziert werden. Es wurde eine Inhibierung von Vaskulogenese und Wachstum der injizierten Tumorzellen in Mäusen beobachtet, die die verkürzte Form des Flk-1-Rezeptors exprimierten. Eine Expression von transdominant-negativen Formen des Flk-1-Moleküls kann für eine Behandlung von Krankheiten, die aus anomaler Proliferation von Blutgefäßen resultieren, wie beispielsweise rheumatoide Arthritis, Retinopathien und Wachstum von festen Tumoren, nützlich sein.
  • Wie in den Ausführungsbeispielen unten erklärt, wurde die Polymerasekettenreaktion (PCR)-Methode benutzt, um neue Rezeptortyrosinkinasen zu isolieren, die spezifisch in post-Implantationsembryonen und Endothelzellen exprimiert werden. Es wurde gefunden, dass ein solcher Clon eine RTK codiert, die fast identische Sequenzhomologie mit dem kürzlich identifizierten c-DNA-Clon hatte, der aus Zellpopulationen isoliert wurde, die auf hämatopoetische Zellen angereichert waren, und als fötale Leberkinase-1 (Flk-1) bezeichnet wurde (Mattheros et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9026–9030) (11).
  • Für die Klarheit der Diskussion wird die Erfindung in den folgenden Unterabschnitten beispielhaft für die murine Flk-1 beschrieben. Die Prinzipien können jedoch analog angewendet werden, um die Flk-1 von anderen Spezies, einschließlich Menschen, zu clonieren und zu exprimieren.
  • 5.1 Die Flk-1 codierende Sequenz
  • Die codierende Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des murinen Flk-1-Gens ist in 11 (SEQ. ID NO. 1) dargestellt und wurde kürzlich in Mattheros et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9026–9030 beschrieben. Die Nucleotidsequenz des Flk-1-Proteins oder dessen funktionale Äquivalente in Säugern, einschließlich Menschen, kann benutzt werden, um rekombinante Moleküle zu generieren, welche die Expression von Flk-1 leiten: nachstehend wird dieser Rezeptor als „Flk-1" bezeichnet, unabhängig von der Spezies, von welcher er abgeleitet ist.
  • Das murine Flk-1-Gen wurde durch Durchführen einer Polymerasekettenreaktion (PCR) isoliert, wobei zwei degenerierte Oligonucleotid-Primerpools benutzt wurden, die auf der Basis von hochkonservierten Sequenzen innerhalb der Kinasedomäne von Rezeptortyrosinkinasen (Ranks et al., 1988) entworfen wurden. Als eine Matrize wurde DNA von einer λgt10-cDNA-Bibliothek verwendet, die aus Tag 8,5-Mausembryonen hergestellt worden war. In einem parallelen Ansatz wurden ähnliche Primer benutzt, um RTK-cDNA-Sequenzen von Kapillar-Endothelzellen zu amplifizieren, die von den Gehirnen von postnatalen Tag 4-8-Mäusen isoliert worden waren. Dies ist eine Zeit, zu der die Endothelzell-Proliferation im Gehirn maximal ist. Beide Ansätze ergaben cDNA-Sequenzen, die die kürzlich beschriebene fötale Leber-RTK, Flk-1 (Matthews et al., 1991), codieren. Basierend auf Aminosäurehomologie ist dieser Rezeptor ein Mitglied der Typ III-Unterklasse von RTKs (Ullrich and Schlessinger), welche in ihren extrazellulären Domänen immunglobulinartige Wiederholungen enthalten (1).
  • Beschrieben werden auch Flk-1-Gene, die von anderen Spezies, einschließlich Menschen, in welchen Flk-1-Aktivität existiert, isoliert wurden. Mitglieder der Flk-1-Familie werden hier als solche Rezeptoren definiert, die VEGF oder Fragmente von diesem Peptid binden. Solche Rezeptoren können auf der Aminosäureebene etwa 80% Homologie in wesentlichen Teilen der DNA-Sequenz zeigen. Eine cDNA-Bibliothek aus Bakteriophagen kann unter Bedingungen von reduzierter Stringenz gescreent werden, wobei ein radioaktiv markiertes Fragment des Flk-1-Clons aus der Maus verwendet wird. Alternativ dazu kann die Flk-1-Sequenz aus der Maus verwendet werden, um degenerierte oder völlig degenerierte Oligonucleotidsonden zu entwerfen, welche als PCR-Sonden oder zum Screenen von cDNA-Bibliotheken aus Bakteriophagen benutzt werden können. Eine Strategie, die auf einer Polymerasekettenreaktion (PCR) basiert, kann benutzt werden, um humane Flk-1 zu clonieren. Zwei Pools von degenerierten Oligonucleotiden, die mit konservierten Motiven zwischen dem Flk-1 aus der Maus und Rezeptortyrosinkinasen korrespondieren, können entworfen werden, um als Primer in einer PCR-Reaktion zu dienen. Die Matrize für die Reaktion is cDNA, welche durch reverse Transkription von mRNA erhalten wird, welche aus Zelllinien oder Gewebe hergestellt wird, welche dafür bekannt sind, humane Flk-1 zu exprimieren. Das PCR-Produkt kann subcloniert und sequenziert werden, um sicherzustellen, dass die amplifizierten Sequenzen die Flk-1-Sequenzen repräsentieren. Das PCR-Fragment kann verwendet werden, um durch radioaktives Markieren des amplifizierten Fragments und Screenen einer cDNA-Bibliothek aus Bakteriophagen einen Flk-1-cDNA-Clon voller Länge zu isolieren. Alternativ dazu kann das markierte Fragement verwendet werden, um eine genomische Bibliothek zu screenen. Für einen Überblick über Clonierungsstrategien, welche verwendet werden können, siehe z. B. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laborstory Mandal, Cold Springs Harbor Press, N. Y.; und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y.).
  • Eine Isolierung einer humanen Flk-1-cDNA kann auch durch Konstruktion einer cDNA-Bibliothek in einem Säuger-Expressionsvektor, wie beispielsweise pcDNA1, erreicht werden, der SV40-Replikationsursprungssequenzen enthält, die eine Expression von Plasmiden in hoher Kopienanzahl erlauben, wenn sie in COS-Zellen transferiert werden. Die Expression von Flk-1 auf der Oberfläche von transfizierten COS-Zellen kann in einer Anzahl von Wegen detektiert werden, einschließlich der Verwendung eines markierten Liganden, wie beispielsweise VEGF oder eines VEGF-Agonisten, der mit einem Radiolabel, fluoreszierendem Label oder einem Enzym markiert ist. Zellen, die die humane Flk-1 exprimieren, können angereichert werden, indem transfizierte Zellen einer FACS-Sortierung (Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer) unterzogen werden.
  • Flk-1-Nucleotidsequenzen, welche Flk-1, Peptidfragmente von Flk-1, Flk-1-Fusionsproteine oder funktionale Äquivalente davon codieren, können benutzt werden, um rekombinante DNA-Moleküle, die die Expression des Flk-1-Proteins oder eines funktionellen Äquivalents davon steuern, in geeigneten Wirtszellen zu generieren. Alternativ dazu können Nucleotidsequenzen, welche mit Teilen der Flk-1-Sequenz hybridisieren, auch in Nucleinsäure-Hybridisierungstests, Southern- und Northernblot-Analysen etc. verwendet werden.
  • Wegen der inhärenten Degeneration des genetischen Codes können andere DNA-Sequenzen, welche im Wesentlichen die gleiche oder eine funktional äquivalente Aminosäuresequenz codieren, für die Clonierung und Expression des Flk-1-Proteins benutzt werden. Derartige DNA-Sequenzen umfassen solche, welche in der Lage sind, mit der murinen Flk-1-Sequenz unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren.
  • Veränderte DNA-Sequenzen, welche benutzt werden können, umfassen Deletionen, Additionen oder Substitutionen von verschiedenen Nucleotidresten, was in einer Sequenz resultiert, die das gleiche oder ein funktional äquivalentes Genprodukt codiert. Das Genprodukt selbst kann Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb der Flk-1-Sequenz aufweisen, was in einem stillen Austausch resultiert und damit eine funktional äquivalente Flk-1 produziert. Derartige Aminosäuresubstitutionen können auf der Basis von Ähnlichkeit in Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie und/oder der amphipatischen Natur der involvierten Reste gemacht werden. Zum Beispiel umfassen negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren umfassen Lysin und Arginin; Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen, die ähnliche Hydrophiliewerte haben, umfassen die folgenden: Leucin, Isoleucin, Valin; Glycin, Alanin; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Phenylalanin, Tyrosin. Wie hier verwendet, bezieht sich eine funktional äquivalente Flk-1 auf einen Rezeptor, welcher an VEGF oder Fragmente, aber nicht notwendigerweise mit derselben Bindungsaffinität von seinem Gegenstück, der nativen Flk-1, bindet.
  • Die DNA-Sequenzen der Erfindung können gestaltet werden, um die Flk-1 codierende Sequenz für eine Vielzahl von Zwecken zu verändern, dies umfasst Veränderungen, welche ein Prozessieren und eine Expression des Genprodukts modifizieren, ist aber nicht darauf beschränkt.
  • Zum Beispiel können Mutationen unter Verwendung von Techniken, die in dem Fachgebiet wohlbekannt sind, eingeführt werden, z. B. ortsgerichtete Mutagenese, um neue Restriktionsstellen einzuführen, um Glycosylierungsmuster, Phosphorylierung etc. zu verändern. Zum Beispiel können in bestimmten Expressionssystemen, wie beispielsweise Hefe, Wirtszellen das Genprodukt überglycosylieren. Bei Verwendung solcher Expressionssysteme kann es bevorzugt sein, die Flk-1 codierende Sequenz zu verändern, um jede N-verknüpfte Glycosylierungsstelle zu eliminieren.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Flk-1-Sequenz oder eine modifizierte Flk-1-Sequenz an eine heterologe Sequenz gebunden werden, um ein Fusionsprotein zu codieren. Zum Beispiel kann es zum Durchmustern einer Peptidbibliothek nützlich sein, ein chimäres Flk-1-Protein zu codieren, das ein heterologes Epitop exprimiert, das von einen im Handel erhältlichen Antikörper erkannt wird. Ein Fusionsprotein kann auch so hergestellt sein, dass es eine zwischen der Flk-1-Sequenz und der heterologen Proteinsequenz gelegene Spaltstelle enthält, so dass die Flk1 vom heterologen Teil abgetrennt werden kann.
  • Die codierende Sequenz von Flk-1 kann unter Verwendung von chemischen Methoden, die im Fachgebiet wohlbekannt sind, im Ganzen oder in Teilen synthetisiert werden. Siehe z. B. Caruthers, et al., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7: 215–233; Crea and Horn, 180, Nuc. Acids Res. 9(10): 2331; Matteucci and Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21: 719; und Chow and Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9(12): 2807–2817. Alternativ dazu könnte das Protein selbst unter Verwendung chemischer Methoden produziert werden, um die Flk-1-Aminosäuresequenz im Ganzen oder in Teilen zu synthetisieren. Zum Beispiel können Peptide durch Festphasentechniken synthetisiert, von dem Harz gespalten und durch präparative Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt werden (siehe zum Beispiel Creighton, 1983, Proteins Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., N. Y. S. 50–60). Die Zusammensetzung der synthetischen Peptide kann durch Aminosäureanalyse oder Sequenzieren bestätigt werden (z. B. die Edman-Abbau-Methode; siehe Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., N. Y., S. 34–49).
  • 5.2. Expression von Flk-1-Rezeptor und Generierung von Zelllinien, die Flk-1 exprimieren
  • Um eine biologisch aktive Flk-1 zu exprimieren, wird die Nucleotidsequenz, die Flk-1 codiert, oder ein funktionales Äquivalent, wie in Abschnitt 5.1 oben beschrieben, in einen geeigneten Expressionsvektor, z. B. einen Vektor, welcher die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der inserierten codierenden Sequenz aufweist, inseriert. Sowohl die Flk-1-Genprodukte als auch Wirtszellen oder Zelllinien, die mit rekombinanten Flk-1-Expressionsvektoren transfiziert oder transformiert sind, können für eine Vielzahl von Zwecken benutzt werden. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt darauf, das Herstellen von Antikörpern (z. B. monoclonal oder polyclonal), die an den Rezeptor binden, einschließlich solcher, die ein Binden von VEGF kompetitiv inhibieren und die Aktivität von Flk-1 „neutralisieren", und das Screenen und Selektieren von VEGF-Analogen oder Wirkstoffen, die über den Flk-1-Rezeptor wirken; etc.
  • 5.2.1. Expressionssysteme
  • Methoden, die Fachleuten wohl bekannt sind, können verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die die Flk-1 codierende Sequenz und geeignete transkriptionale/translationale Kontrollsignale aufweisen. Diese Methoden umfassen rekombinante in vitro-DNA-Techniken, synthetische Techniken und in vivo-Rekombination/genetische Rekombination. Siehe z. B. die Techniken, die in Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, N. Y. und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y., beschrieben sind.
  • Eine Vielzahl von Wirt-Expressionsvektorsystemen kann verwendet werden, um die Flk-1 codierende Sequenz zu exprimieren. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt darauf, Mikroorganismen, wie beispielsweise Bakterien, die mit rekombinanten Bakteriophagen-DNA-, Plasmid-DNA- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren, die die Flk-1 codierende Sequenz enthalten, transformiert sind; Hefe, die mit rekombinanten Hefeexpressionsvektoren transformiert ist, die die Flk-1 codierende Sequenz enthalten; Insektenzellsysteme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren infiziert sind (z. B. Baculovirus), die die Flk-1 codierende Sequenz enthalten; Pflanzenzellsysteme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren infiziert sind (z. B. Blumenkohl-Mosaikvirus, CaMV; Tabak-Mosaikvirus, TMV) oder mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren (z. B. Ti-Plasmid) transformiert sind, die die Flk-1 codierende Sequenz enthalten; oder tierische Zellsysteme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren infiziert sind (z. B. Adenovirus, Vaccinia-Virus), einschließlich Zelllinien, die so gestaltet sind, dass sie multiple Kopien der Flk-1-DNA entweder stabil amplifiziert (CHO/dhfr) oder instabil amplifiziert in „douple-minute"-Chromosomen (z. B. murine Zelllinien) enthalten.
  • Die Expressionselemente dieser Systeme variieren in ihrer Stärke und ihren Spezifitäten. Abhängig von dem verwendeten Wirt/Vektorsystem kann jedes von einer Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen, einschließlich konstitutiver und induzierbarer Promotoren, in dem Expressionsvektor verwendet werden. Zum Beispiel können beim Clonieren in bakteriellen Systemen induzierbare Promotoren wie beispielsweise pL des Bakteriophagen λ, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac Hybrid-Promotor) und dergleichen verwendet werden; beim Clonieren in Insektenzellsystemen können Promotoren wie der Baculovirus-Polyhedrinpromotor verwendet werden; beim Clonieren in Pflanzenzellsystemen können Promotoren, die vom Genom von Pflanzenzellen abgeleitet sind (z. B. Hitzeschockpromotoren; der Promotor für die kleine Untereinheit von RUBISCO; der Promoter für das Chlorophyll a/b-Bindungsprotein) oder von Pflanzenviren (z. B. der 35S-RNA-Promotor von CaMV; der Hüllprotein-Promotor von TMV) benutzt werden; beim Clonieren in Säugerzellsystemen können Promotoren, die vom Genom von Säugerzellen (z. B. Metallothionein-Promotor) oder von Säuger-Viren (z. B. der späte Adenovirus-Promotor; der Vaccinia-Virus-7,5K-Promotor) stammen, benutzt werden; beim Generieren von Zelllinien, die multiple Kopien der Flk-1-DNA enthalten, können SV40-, BPV- und EBV-basierten Vektoren mit einem geeigneten selektierbaren Marker benutzt werden.
  • In bakteriellen Systemen können eine Anzahl von Expressionsvektoren vorteilhafterweise selektiert werden, abhängig von der beabsichtigten Verwendung für die exprimierte Flk-1. Wenn z. B. große Quantitäten von Flk-1 für die Generierung von Antikörpern oder zum Screenen von Peptid-Bibliotheken zu produzieren sind, können Vektoren, welche die Expression von hohen Spiegeln von Fusionsprotein-Produkten steuern, die leicht zu reinigen sind, gewünscht sein. Solche Vektoren umfassen, sind aber nicht beschränkt darauf, den E. coli-Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), in welchem die Flk-1 codierende Sequenz in den Vektor im Rahmen mit der lac Z codierenden Region ligiert sein kann, so dass ein hybrides AS-lac Z-Protein produziert wird; pIN-Vektoren (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic acids Res. 13: 3101–3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503–5509); und ähnliche. pGEX-Vektoren können auch verwendet werden, um fremde Polypeptide, wie beispielsweise Fusionsproteine mit Glutathion 5-Transferase (GST), zu exprimieren. Im Allgemeinen sind solche Fusionsproteine löslich und können leicht von lysierten Zellen durch Adsorption an Glutathion-Agarosekügelchen, gefolgt von einer Flution in der Gegenwart von freien Glutathion, gereinigt werden. Die pGEX-Vektoren sind so gestaltet, dass sie Thrombin- oder Faktor Xa-Protease-Spaltungsstellen umfassen, so dass das clonierte Polypeptid von Interesse von dem GST-Rest freigesetzt werden kann.
  • In Hefe kann eine Anzahl von Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, verwendet werden. Für einen Überblick siehe Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 2, 1988, Eds. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, K. 13; Grant et al., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, 1987, Acad. Press. N. Y., Vol. 153, S. 516–544; Glover, 1986, DNA Cloning, Bd. II, IRL Press, Wash., D. C., K. 3; und Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press. N. Y., Bd. 152, S. 673–684; und The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Hrsg. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Bd. I und II.
  • In Fällen, wo Pflanzenexpressionsvektoren benutzt werden, kann die Expression der Flk-1 codierenden Sequenz von irgendeinem von einer Anzahl von Promotoren gesteuert werden. Zum Beispiel können virale Promotoren, wie beispielsweise die 35S-RNA- und 19S-RNA-Promotoren von CaMV (Brisson et al., 1984, Nature 310: 511–514), oder der Hüllprotein-Promotor von TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6: 307–311) benutzt werden; alternativ dazu können Pflanzenpromotoren wie die kleine Untereinheit von RUBISCO (Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3: 1671–1680; Broglie et al., 1984, Science 224: 838–843) oder Hitzeschockpromotoren, z. B. hsp17.5-E oder hsp17.3-B aus Sojabohne (Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 559–565) benutzt werden. Diese Konstrukte können in Pflanzenzellen unter Verwendung von Ti-Plasmiden, Ri-Plasmiden, Pflanzen-Virusvektoren, direkter DNA-Transformation, Mikroinjektion, Elektroporation etc. eingeführt werden. Als Übersichtartikel für diese Techniken siehe z. B. Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Abschnitt VIII, S. 421–463 und Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2. Aufl., Blackie, London, K. 7–9.
  • Ein alternatives Expressionssystem, welches zum Exprimieren von Flk-1 benutzt werden kann, ist ein Insektensystem. In einem solchen System wird das nukleare Polyeder-Virus aus Autographs californica (AcNPV) als ein Vektor zum Exprimieren fremder Gene benutzt. Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Die Flk-1 codierende Sequenz kann in nicht-essentielle Regionen (z. B. das Polyhedrin-Gen) des Virus cloniert werden und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors (z. B. der Polyhedrinpromotor) gestellt werden. Eine erfolgreiche Insertion der Flk-1 codierenden Sequenz wird in einer Inaktivierung des Polyhedrin-Gens und einer Produktion eines nicht eingeschlossenen recombinanten Virus (z. B. eines Virus, dem die proteinöse Hülle fehlt, die durch das Polyhedrin-Gen codiert wird) resultieren. Diese rekombinanten Viren werden dann benutzt, um Spodoptera frugiperda-Zellen zu infizieren, in welchen das inserierte Gen exprimiert wird (siehe z. B. Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, US-Patent Nr. 4,215,051 ).
  • In Säuger-Wirtszellen kann eine Anzahl von auf Viren basierenden Expressionssystemen benutzt werden. In Fällen, in welchen ein Adenovirus als ein Expressionsvektor benutzt wird, kann die Flk-1 codierende Sequenz an einen Adenovirus-Transkriptions/Translations-Kontrollkomplex ligiert werden, z. B. die späte Promotor und Tripartit-Leadersequenz. Dieses chimäre Gen kann dann in das Adenovirus-Genom durch in vitro- oder in vivo-Rekombination inseriert werden. Eine Insertion in eine nicht-essentielle Region des viralen Genoms (z. B. Region E1 oder E3) wird in einem rekombinanten Virus resultieren, das lebensfähig ist und in der Lage ist, Flk-1 in infizierten Wirten zu exprimieren (siehe z. B. Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 3655–3659). Alternativ dazu kann der Vaccinia-7,5K-Promotor benutzt werden (siehe z. B. Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 7415–7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49: 857–864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 4927–4931).
  • Spezifische Initierungssignale können ebenso für eine effiziente Translation von inserierten Flk-1 codierenden Sequenzen benötigt werden. Diese Signale umfassen das ATG-Initiationscodon und angrenzende Sequenzen. In Fällen, in welchen das gesamte Flk-1-Gen, einschließlich dessen eigenen Initiationscodons und angrenzende Sequenzen, in den geeigneten Expressionsvektor inseriert wird, werden möglicherweise keine weiteren Translations-Kontrollsignale benötigt. Dennoch müssen in Fällen, in welchen nur ein Teil der Flk-1 codierenden Sequenz inseriert wird, exogene Translations-Kontrollsignale, einschließlich des ATG-Initiationscodons, bereitgestellt werden. Weiterhin muss das Initiationscodon in Phase mit dem Leserahmen der Flk-1 codierenden Sequenz sein, um eine Translation der gesamten Insertion zu gewährleisten. Diese exogenen Translations-Kontrollsignale und Initiationscodons können viele Ursprünge haben, sowohl natürliche als auch synthetische. Die Effizienz der Expression kann durch den Einschluss von geeigneten Transkriptions-Enhancerelementen, Transkriptions-Terminatoren etc. verstärkt werden (siehe Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516–544).
  • Weiterhin kann ein Wirtszellstamm gewählt werden, welcher die Expression der inserierten Sequenzen moduliert oder der das Genprodukt in der spezifischen gewünschten Art modifziert und prozessiert. Solche Modifikationen (z. B. Glycosylierung) und Prozessierung (z. B. Spaltung) von Proteinprodukten kann für die Funktion des Proteins wichtig sein. Verschiedene Wirtszellen haben charakteristische und spezifische Mechanismen für das post-translationale Prozessieren und Modifizieren von Proteinen. Geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme können gewählt werden, um die korrekte Modifizierung und Prozessierung des fremden exprimierten Proteins zu gewährleisten. Zu diesem Zweck, können eukaryotische Wirtszellen, welche die zelluläre Maschinerie für eine korrekte Prozessierung des primären Transkripts, Glycosylierung und Phosphorylierung des Genprodukts besitzen, benutzt werden. Solche Säuger-Wirtszellen umfassen CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, WI38, etc., sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Für eine Langzeitproduktion mit hoher Ausbeute von rekombinanten Proteinen ist eine stabile Expression bevorzugt. Zum Beispiel können Zelllinien, welche die Flk-1 stabil exprimieren, hergestellt werden. Eher als dass Expressionsvektoren benutzt werden, die virale Replikationsursprünge enthalten, können Wirtszellen mit der Flk-1-DNA, die durch geeignete Expressionskontrollelemente (z. B. Promotor, Enhancersequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylisierungsstellen etc.) gesteuert wird, und einem selektierbaren Marker transformiert werden. Im Anschluss an die Einführung von fremder DNA können die manipulierten Zellen für ein bis zwei Tage in einem angereicherten Medium kultiviert werden und dann auf ein selektives Medium umgestellt werden. Der selektierbare Marker in dem rekombinanten Plasmid verleiht eine Resistenz für die Selektion und erlaubt den Zellen, das Plasmid in ihre Chromosomen stabil zu integrieren und zu wachsen, um Foci zu bilden, welche wiederum cloniert und zu Zelllinien expandiert werden können. Dieses Verfahren kann mit Vorteil eingesetzt werden, um Zelllinien herzustellen, welche die Flk-1 auf der Zelloberfläche exprimieren und welche auf VEGF-vermittelte Signaltransduktion reagieren. Solche hergestellten Zelllinien sind insbesondere beim Screening von VEGF-Analogen nützlich.
  • Eine Anzahl von Selektionssystemen kann benutzt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt darauf, können die Gene für Herpes Simplex Virus-Thymidin-Kinase (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), Hypoxanthinguanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) und Adenin-Phosphoribosyltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) in tK–-, hgprt–- bzw. aprt–-Zellen eingesetzt werden. Antimetabolit-Resistenzen können ebenfalls als die Basis einer Selektion für die Gene dhfr, welches eine Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, welches eine Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, welches eine Resistenz gegen das Aminoglycosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1) und hygro, welches eine Resistenz gegen Hygromycin verleiht (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147), benutzt werden. Kürzlich wurden weitere selektierbare Gene beschrieben, und zwar trpB, welches den Zellen ermöglicht, Indol anstatt Tryptophan zu verwerten; hisD, welches den Zellen ermöglicht, Histinol anstatt Histidin zu verwerten (Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047), und ODC (Ornithin-Decarboxylase), welches eine Resistenz gegen den Ornithin-Decarboxylase-Inhibitor, 2-(Difluormethyl)-DL-Ornithin, DFMO (McConlogue L., 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laborstory ed.), verleiht.
  • 5.2.2. Identifizierung von Transfektanten oder Transformanten, die Flk-1 exprimieren
  • Die Wirtszellen, welche die codierende Sequenz enthalten und welche das biologisch aktive Genprodukt exprimieren, können durch zumindest vier allgemeine Ansätze identifiziert werden; (a) DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung; (b) die Gegenwart oder Abwesenheit von „Marker"-Genfunktionen; (c) Feststellen des Transkriptionslevels, wie er durch die Expression von Flk-1-mRNA-Transkripten in der Wirtszelle gemessen wird; und (d) Detektion des Genprodukts, wie es durch einen Immuntest oder durch dessen biologische Aktivität gemessen wird.
  • In dem ersten Ansatz kann die Gegenwart der Flk-1 codierenden Sequenz, die in den Expressionsvektor inseriert ist, durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung bei Verwendung von Sonden, die Nucleotidsequenzen umfassen, die homolog zu der Flk-1 codierenden Sequenz bzw. Teilen oder Derivaten davon sind, detektiert werden.
  • In dem zweiten Ansatz kann das rekombinante Vektor/Wirts-Expressionssystem auf der Basis der Gegenwart oder Abwesenheit von bestimmten „Marker"-Genfunktionen (z. B. Thymidin-Kinaseaktivität, Resistenz gegen Antibiotika, Resistenz gegen Methotrexat, Transformationsphänotyp, Einschlusskörperbildung in Baculovirus etc.) identifiziert und selektiert werden. Zum Beispiel können, wenn die Flk-1 codierende Sequenz innerhalb einer Markergensequenz des Vektors inseriert ist, Rekombinante, die die Flk-1 codierende Sequenz enthalten, durch die Abwesenheit der Marker-Genfunktion identifiziert werden. Alternativ dazu kann ein Markergen in Tandemanordnung mit der Flk-1-Sequenz unter der Kontrolle desselben oder eines anderen Promotors platziert werden, der benutzt wird, um die Expression der Flk-1 codierenden Sequenz zu steuern. Eine Expression des Markers als Antwort auf eine Induktion oder Selektion indiziert eine Expression der Flk-1 codierenden Sequenz.
  • In dem dritten Ansatz kann eine transkriptionale Aktivität für die Flk-1 codierende Region durch Hybridisierungstests bewertet werden. Zum Beispiel kann RNA isoliert und durch Northernblot unter Verwendung einer Sonde, die homolog zu der Flk-1 codierenden Sequenz oder bestimmten Teilen davon ist, analysiert werden. Alternativ dazu können die gesamten Nucleinsäuren der Wirtszelle extrahiert und auf eine Hybridisierung mit solchen Sonden getestet werden.
  • In dem vierten Ansatz kann die Expression des Flk-1-Proteinprodukts immunologisch bewertet werden, z. B. durch Westernblots, Immuntests, wie beispielsweise Radioimmunpräzipitation, enzymverknüpfte Immuntests und derartiges. Der endgültige Test des Erfolgs des Expressionssystems umfasst jedoch die Detektion des biologisch aktiven Flk-1-Genprodukts. Eine Anzahl von Tests kann eingesetzt werden, um eine Rezeptoraktivität zu detektieren, einschließlich, aber nicht beschränkt darauf, VEGF-Bindungstests und biologische VEGF-Tests unter Verwendung von manipulierten Zelllinien als das Testsubstrat.
  • 5.3 Verwendung des Flk-1-Rezeptors und manipulierter Zelllinien
  • Angiogenese, das Wachstum von neuen Blutkapillargefäßen, wird für eine Anzahl von physiologischen Prozessen benötigt, die von Wundheilung, Gewebe- und Organregeneration, Plazentabildung nach Schwangerschaft bis zur embryonalen Entwicklung reichen. Eine anomale Proliferation von Blutgefäßen ist eine wichtige Komponente bei einer Vielzahl von Krankheiten, wie beispielsweise rheumatoide Arthritis, Retinopathien und Psoriasis. Angiogenese ist ebenfalls ein wichtiger Faktor beim Wachstum und der metastatischen Aktivität von festen Tumoren, die auf eine Vaskularisierung angewiesen sind. Daher können Inhibitoren der Angiogenese therapeutisch für die Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die aus anomalem Wachstum von Blutgefäßen resultieren oder davon begleitet sind, und für Behandlungen von malignen Erkrankungen, die ein Wachstum und Ausbreiten von festen Tumoren mit sich bringen.
  • Der Flk-1-Rezeptor und/oder Zelllinien, die den Flk-1-Rezeptor exprimieren, können verwendet werden, um auf Antikörper, Peptide oder andere Liganden zu screenen, die als Agonisten oder Antagonisten der durch den Flk-1-Rezeptor vermittelten Angiogenese oder Vaskulogenese agieren. Zum Beispiel können anti-Flk-1-Antikörper, die in der Lage sind die Aktivität von VEGF zu neutralisieren, verwendet werden, um die Flk-1-Funktion zu inhibieren Zudem können anti-Flk-1-Antikörper, die die VEGF-Aktivität nachahmen, für die Wundheilung selektiert werden. Alternativ kann es für die Identifikation von therapeutischen Molekülen, die ihre Funktion durch Inhibierung der biologischen Aktivität von Flk-1 ausüben, nützlich sein, Peptidbibliotheken mit rekombinant exprimiertem, löslichem Flk-1-Protein oder Zelllinien, die das Flk-1-Protein exprimieren, zu durchmustern.
  • Manipulierte Zelllinien, die die gesamte Flk-1 codierende Region oder ihre Ligandenbindungsdomäne exprimieren, können zum Durchmustern und Identifizieren von VEGF-Antagonisten und Agonisten verwendet werden. Synthetische Verbindungen, natürliche Produkte und andere Quellen von potenziell biologisch aktiven Materialien können auf verschiedene Weise durchmustert werden. Die Fähigkeit einer Testverbindung, das Binden von VEGF an Flk-1 zu inhibieren, kann durch Verwendung von gängigen Rezeptorbindungstechniken, wie die in Abschnitt 6.1.9. beschriebenen, gemessen werden. Die Fähigkeit von Agenzien, die Wirkung der VEGF-Bindung auf Signaltransduktionreaktionen auf Flk-1 exprimierenden Zellen zu verhindern oder nachzuahmen, kann gemessen werden. Zum Beispiel können Reaktionen wie Aktivierung von Flk-1-Kinaseaktivität, Modulation der Herstellung zweiter Botenstoffe oder Veränderungen im Zellstoffwechsel überwacht werden. Diese Tests können durch Verwendung üblicher Techniken durchgeführt werden, die für diese Zwecke entwickelt wurden.
  • 5.3.1. Durchmustern der Peptidbibliothek mit Flk-1-Protein oder manipulierten Zelllinien
  • Randomisierte Peptidbibliotheken, die aus allen möglichen Kombinationen von Aminosäuren bestehen, die auf einem Festphasenträger angebracht sind, können verwendet werden, um Peptide zu identifizieren, die in der Lage sind, an die Ligandenbindungsstelle eines gegebenen Rezeptors oder von anderen funktionalen Domänen eines Rezeptors wie die Kinasedomänen zu binden (Lam, K. S. et al., 1991, Nature 354: 82–84). Das Durchmustern der Peptidbibliotheken kann durch die Entdeckung von pharmazeutischen Agenzien, die biologische Aktivität von Rezeptoren durch ihre Interaktion mit dem gegebenen Rezeptor zu inhibieren, einen therapeutischen Wert haben.
  • Die Idenitfikation von Molekülen, die in der Lage sind, an die Flk-1 zu binden, kann durch Screenen einer Peptidbibliotheken mit rekombinantem, löslichem Flk-1-Protein erreicht werden. Die Methoden für die Expression und Reinigung von Flk-1 sind in Abschnitt 5.2.1 beschrieben und können angewandt werden, rekombinante Gesamtlängen-Flk-1 oder Fragmente von Flk-1 zu exprimieren, je nach funktionalen Domänen von Interesse. Zum Beispiel können die Kinase- und extrazelluläre Ligandenbindungsdomäne von Flk-1 separat exprimiert und zum Durchmustern von Peptidbibliotheken verwendet werden.
  • Zur Identifikation und Isolation des Peptid-/Festphasenträgers, der mit Flk-1 interagiert und damit einen Komplex bildet, ist es notwendig, das Flk-1-Molekül zu markieren oder einen „Tag" anzubringen. Das Flk-1-Protein kann mit Enzymen wie alkalische Phosphatase oder Meerettichperoxidase oder mit anderen Reagenzien wie fluoreszierenden Markierungen verbunden werden, die Fluoresceinisothiocynat (FITC), Phycoerythrin (PE) oder Rhodamin einschließen können. Konjugation einer beliebigen Markierung mit Flk-1 können durch Techniken durchgeführt werden, die im Stand der Technik Routine sind. Alternativ können Flk-1-Expressionsvektoren manipuliert werden, um ein chimäres Flk-1-Protein zu exprimieren, das ein Epitop enthält, für das ein im Handel erhältlicher Antikörper existiert. Der epitopspezifische Antikörper kann durch Methoden markiert werden, die im Stand der Technik bekannt sind, einschließlich Markieren mit Enzymen, fluoreszierenden Farbstoffen oder mit gefärbten oder magnetischen Kügelchen.
  • Das „markierte" Flk-1-Konjugat wird mit der randomisierten Peptidbibliothek 30 Minuten bis eine Stunde bei 22°C inkubiert, um eine Komplexbildung zwischen Flk-1 und einer Peptidart in der Bibliothek zu ermöglichen. Die Bibliothek wird dann gewaschen, um jegliches ungebundenes Flk-1-Protein zu entfernen. Wenn Flk-1 an die alkalische Phosphatase oder Meerettichperoxidase gebunden hat, wird die ganze Bibliothek in eine Petrischale geschüttet, die Substrate für entweder alkalische Phosphatase oder Peroxidase, zum Beispiel, 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) bzw. 3,3',4,4''-diaminobenzidin (DAB) enthält. Nach Inkubation von einigen Minuten ändert der Peptid-/Festphasen-Flk-1-Komplex seine Farbe und kann unter einem Präpariermikroskop mit einem Mikromanipulator leicht identifiziert und physikalisch isoliert werden. Wenn ein fluoreszenz-markiertes Flk-1-Molekül verwendet wurde, können die Komplexe durch fluoreszenzaktiviertes Sortieren isoliert werden. Wenn ein chimäres Flk-1-Protein verwendet wurde, das ein heterologes Epitop exprimiert, kann der Nachweis des Peptid-/Flk-1-Komplexes durch Verwendung eines markierten eptiopspezifischen Antikörpers erfolgen. Nach der Isolierung kann die Identität des am Festphasenträger angebrachten Peptids durch Peptidsequenzierung bestimmt werden.
  • Zusätzlich zu der Verwendung löslicher Flk-1-Moleküle ist es möglich, Peptide nachzuweisen, die an Zelloberflächenrezeptoren binden, die intakte Zellen verwenden. Die Verwendung von intakten Zellen wird für die Verwendung mit Rezeptoren bevorzugt, die multi-Untereinheiten oder labil sind, oder mit Rezeptoren, für die eine funktionelle Lipiddomäne der Zellmembran erforderlich ist. Verfahren zur Erzeugung von Zelllinien, die Flk-1 exprimieren, sind in den Abschnitten 5.2.1. und 5.2.2. beschrieben. Die bei dieser Technik verwendeten Zellen sind entweder lebende oder fixierte Zellen. Die Zellen werden mit der randomisierten Peptidbibliothek inkubiert und werden an bestimmte Peptide in der Bibliothek binden, um eine „Rosette" zwischen den Zielzellen und dem relevanten Festphasenträger/peptid zu bilden. Die Rosette kann danach durch differenzielle Zentrifugation isoliert oder unter einem Präpariermikroskop physikalisch entfernt werden.
  • Als Alternative zum Ganzzelltest für membrangebundene Rezeptoren oder Rezeptoren, für die eine funktionelle Lipiddomäne der Zellmembran erforderlich ist, können die Rezeptormoleküle in Liposome rekonstituiert werden, wo eine Markierung oder ein „Tag" angebracht werden kann.
  • 5.3.2 Herstellung und Durchmustern von Antikörpern
  • Für die Herstellung von Antikörpern zu Epitopen des rekombinant hergestellten Flk-1-Rezeptors können verschiedene, im Stand der Technik bekannte Verfahren verwendet werden. Solche Antikörper schließen polyclonale, monoclonale, chimäre Antikörper, Einzelketten, Fab-Fragmente und Fragmente ein, die durch eine Fab-Expressionsbibliothek hergestellt wurden, sind aber nicht auf diese beschränkt. Neutralisierende Antikörper, d. h. solche, die um die VEGF-Bindungsstelle des Rezeptors konkurrieren, sind für die Diagnose und Therapie besonders bevorzugt.
  • Monoclonale Antikörper, die Flk-1 binden, können radioaktiv markiert sein, wodurch ihre Lokalisation und Verteilung im Körper nach Injektion verfolgt werden kann. Radioaktiv markierte Antikörper können als nicht nicht-invasives diagnostisches Mittel für die Abbildung von de novo-Vaskularisierung verwendet werden, die mit einer Anzahl von Erkrankungen einschließlich rheumatoider Arthritis, Makuladegeneration und Tumor- und Metastasenbildung, assoziiert ist.
  • Es können auch Immuntoxine entworfen werden, die cytotoxische Agenzien zu spezifischen Stellen im Körper lenken. Zum Beispiel können hochaffine monoclonale Antikörper, die spezifisch für Fik-1 sind, kovalent mit Bakterien- oder Pflanzentoxinen komplexiert werden, wie zum Beispiel Diphtherietoxin, Abrin oder Ricin. Ein generelles Verfahren zur Herstellung von Antikörper-/Hybridmolekülen kann die Verwendung von Thiol-Quervernetzungsreagenzien wie SPDP einschließen, die die primären Aminogruppen auf dem Antikörper angreifen und das Toxin durch Disulfidaustausch an den Antikörper binden. Die Hybridantikörper können verwendet werden, um spezifisch Flk-1 exprimierende Endothelzellen zu eliminieren.
  • Zur Herstellung von Antikörpern können verschiedene Wirtstiere, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Kaninchen, Mäuse, Ratten usw., durch Injektion mit dem Flk-1-Protein immunisiert werden. Abhängig von der Art des Wirts können zur Erhöhung der Immunantwort verschiedene Adjuvanzien verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Freundsches Adjuvans (komplettes und inkomplettes), Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, grenzflächenaktive Stoffe wie Lysolecithin, Piuronic-Polyole, Polyanione, Peptide, Ölemulsionen, KLH („keyhole limpet hemocyanin"), Dinitrophenol und potenziell nützliche menschliche Adjuvanzien wie BCG (Bacillus Calmette Gutirin) und Corynebacterium parvum.
  • Monoclonale Antikörper für Flk-1 können mittels jedes Verfahrens hergestellt werden, das die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Kultur von Zelllinien ermöglicht. Diese schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die ursprünglich von Köhler und Milstein (Nature, 1975, 256: 495–497) beschriebene Hybridomtechnik, die Human-B-Zellen-Hybridomtechnik (Kosbor et al., 1983, Immunology Today, 4: 72; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., 80: 2026–2030) und die EBV-Hybridomtechnik (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96). Zusätzlich können Verfahren angewendet werden, die für die Herstellung von „chimären Antikörpern" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851–6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604–608; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452–454) entwickelt wurden, wobei Gene von einem Mausantikörpermolekül mit der geeigneten Antigenspezifität zusammen mit Genen von einem menschlichen Antikörpermolekül mit geeigneter biologischer Aktivität gespleißt werden. Alternativ können Verfahren, die für die Herstellung von Einzelkettenantikörpern ( US-Patent 4,946,778 ) beschrieben werden, angepasst werden, um Flk-1-spezifische Einzelkettenantikörper herzustellen.
  • Antikörperfragmente, die spezifische Flk-1-Bindungsstellen enthalten, können mit bekannten Verfahren hergestellt werden. Solche Fragmente schließen zum Beispiel ein, sind aber nicht beschränkt auf: die F(ab')2-Fragmente, die durch Pepsinverdau des Antikörpermoleküls hergestellt werden können, und die Fab-Fragmente, die durch Reduzierung der Disulfidbrücken der F(ab')2-Fragmente hergestellt werden können. Alternativ dazu können Fab-Expressionsbibliotheken konstruiert werden (Huse et al., 1989, Science, 246: 1275–1281), um eine schnelle und einfache Identifizierung der monoclonalen Fab-Fragmente mit der gewünschten Spezifität für Flk-1 zu erlauben.
  • 5.4 Verwendung der Flk-1 codierenden Sequenz
  • Die Flk-1 codierende Sequenz kann für diagnostische Zwecke zum Nachweis einer Flk-1-Expression verwendet werden. Auch beschrieben werden Oligoribonucleotidsequenzen, die Antisense-RNA- und -DNA-Moleküle und Ribozyme umfassen, die die Inhibierung der Flk-1-Translation bewirken. Zusätzlich können mutierte Formen von Flk-1 mit einer dominant negativen Wirkung in Zielzellpopopulationen exprimiert werden, um die Aktivität von endogen exprimierter Wildtyp-Flk-1 zu inhibieren.
  • 5.4.1 Verwendung der Flk-1 codierenden Sequenz in Diagnose und Therapie
  • Die Flk-1-DNA kann bei der Diagnose von Erkrankungen aufgrund abweichender Flk-1-Expression auf verschiedene Weise verwendet werden. Zum Beispiel kann die Flk-1-DNA-Sequenz in Biopsie- oder Autopsie-Hybridisierungstests für die Diagnose von anomaler Flk-1-Expression verwendet werden; z. B. Southern- oder Northern-Analyse, einschließlich in situ-Hybridisierungstest.
  • Die Flk-1-cDNA kann als Sonde verwendet werden, um die Expression von Flk-1-mRNA nachzuweisen. In einem spezifischen, hierin beschriebenen Beispiel wurde die Expression von Flk-1-mRNA in Mausembryos verschiedener Entwicklungsstadien analysiert. Die Northern-Blot-Analyse zeigte reichliche Expression 5.5 kb großen Haupt-mRNA zwischen Tag 9.5 und Tag 18.5 mit einem offensichtlichen Abfall gegen Ende der Trächtigkeit (2A). Am postnatalen Tag 4–8 wurde festgestellt, dass die Flk-1-mRNA der Hirnkapillaren im Vergleich zu RNA des Gesamtgehirns stark angereichert war (2B), was nahe legt, dass Flk-1 eine Rolle bei der Proliferation der Endothelzellen spielt.
  • Um detailiertere Informationen hinsichtlich der Flk-1-Expression während der Embryonenentwicklung und während der frühen Stadien der Gefäßentwicklung zu erhalten, wurden in situ-Hybridisierungsversuche, wie in Abschnitt 6.1.4 beschrieben, durchgeführt. In situ-Hybridisierungen zeigten, dass die in vivo-Flk-1-Expression während der Entwicklung der Mausembryonen weitgehend auf Endothelzellen und ihre Vorläufer beschränkt ist (3 und 4). Flk-1 wird in Endothelzellen während physiologischer Prozesse exprimiert, die durch Proliferation von Endothelzellen gekennzeichnet sind, und die im Embryonengehirn gefundenen zeitlichen und räumlichen Expressionsmuster korrelieren genau mit der Entwicklung des neuralen Gefäßsystems, wie von Bar (1980) beschrieben. Gefäßsprosse, die vom perineuralen Plexus ausgehen, wachsen radial in das Neuroektoderm und verzweigen sich dort; und es wurde festgestellt, dass diese Sprosse hohe Mengen an Flk-1-mRNA exprimieren (5) In den frühen postnatalen Stadien ist die Proliferation der Endothelzellen noch evident und Flk-1 wird exprimiert, während im erwachsenen Organismus nach Vollendung des Prozesses der Vaskulierung der Rückgang der Proliferation von Endotzelzellen mit dem Rückgang der Flk-1-Expression parallel verläuft.
  • Ebenfalls beschrieben sind Oligoribonucleotidsequenzen, die Antisense-RNA- und -DNA-Moleküle und Ribozyme umfassen, die die Inhibierung der Translation von Flk-1-mRNA bewirken. Antisense-RNA- und -DNA-Moleküle wirken so, dass sie die mRNA-Translation direkt blockieren, indem sie an die Ziel-mRNA binden und die Proteintranslation verhindern. In Bezug auf Antisense-DNA sind Oligodesoxyribonucleotide bevorzugt, die von der Initiationsstelle der Translation stammen, z. B. Regionen zwischen –10 und +10 der Flk-1-Nucleotidsequenz.
  • Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die in der Lage sind die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Der Mechanismus der Ribozymwirkung schließt die sequenzspezifische Hybridisierung des Ribozymmoleküls an komplementäre Ziel-RNA ein, gefolgt von einer endonucleolytischen Spaltung. Im Umfang der Erfindung werden Hammerkopfmotiv-Ribozymmoleküle hergestellt, die spezifisch und wirksam die endonucelolytische Spaltung von Flk-1-RNA-Sequenzen katalysieren.
  • Spezifische Ribozymspaltstellen innerhalb einer potenziellen Ziel-RNA werden zu Anfang durch Scannen des Zielmoleküls auf Ribozymspaltstellen identifiziert, die die folgenden Sequenzen GUA, GUU und GUC einschließen. Sobald sie identifiziert sind, können kurze RNA-Sequenzen von zwischen 15 und 20 Ribonucleotiden, die der die Spaltstelle enthaltenden Region des Zielgens entsprechen, auf vorhergesagte strukturelle Merkmale hin untersucht werden, wie sekundäre Strukturen, die die Oligonucleotidsequenz ungeeignet machen können. Die Eignung von Zielkandidaten kann auch ermittelt werden, indem ihre Eignung zur Hybridisierung mit komplementären Oligonucleotiden mittels Ribonucelase-Schutztests getestet wird.
  • Sowohl Antisense-RNA- als auch -DNA-Moleküle und Ribozyme können mit jedem für die Synthese von RNA-Molekülen bekannten Verfahren des Standes der Technik hergestellt werden. Diese Verfahren schließen im Stand der Technik bekannte Verfahren für die chemische Synthese von Oligodesoxyribonucleotiden ein, wie zum Beispiel die chemische Festphasen-Phosphoramidit-Synthese. Alternativ können RNA-Moleküle durch in vitro- und in vivo-Transkription von DNA-Sequenzen, die das Antisense-RNA-Molekül codieren, hergestellt werden. Solche DNA-Sequenzen können in die verschiedensten Vektoren eingebaut werden, die geeignete RNA-Polymerase-Promotoren wie die T7- oder SP6-Polymerase-Promotoren enthalten. Alternativ können Antisense-cDNA-Konstrukte, die Antisense-RNA konstitutiv oder durch Induzieren in Abhängigkeit von dem verwendeten Promotor synthetisieren, stabil in Zelllinien eingeführt werden.
  • Die DNA-Molküle können zum Zweck der Erhöhung von intrazellulärer Stabilität und Halbwertszeit verschiedenen Modifikationen unterzogen werden. Mögliche Modifikationen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf das Anfügen von flankierenden Sequenzen von Ribo- oder Desoxynucleotiden an die 5'- und/oder 3'-Enden der Moleküle oder die Verwendung von Phosphorothioat- oder 2'-O-Methylanstelle von Phosphodiesterase-Bindungen im Oligodesoxyribonucleotid-Gerüst.
  • 5.4.2 Verwendung von dominant-negativen Flk-1 Mutanten in der Gentherapie
  • Es wird überlegt, dass Rezeptordimerisierung, die durch Liganden induziert ist, ein aliosterisches regulatorisches Signal bereitstellt, das so funktioniert, dass eine Ligandenbindung mit einer Stimulierung von Kinaseaktivität gekoppelt wird. Fehlerhafte Rezeptoren können die Funktion von dominant-negativen Mutationen haben, indem die Aktivierung und Antwort von normalen Rezeptoren durch Bildung von unproduktiven Heterodimeren unterdrückt wird. Daher können fehlerhafte Rezeptoren in rekombinante virale Vektoren eingefügt werden und in einer Gentherapie in Individuen verwendet werden, die Flk-1 unangemessen exprimieren.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung können mutierte Formen des Flk-1-Moleküls, die einen dominant-negativen Effekt aufweisen, durch Expression in selektierten Zellen identifiziert werden. Deletions- oder Unsinn-Mutanten von Flk-1, die die Fähigkeit zum Formen von Dimeren mit dem Wildtyp-Flk-1-Protein beibehalten haben, aber nicht in der Signaltransduktion funktionieren können, können verwendet werden, um die biologische Aktivität des endogenen Wildtyp-Flk-1 zu inhibieren. Zum Beispiel kann die zytoplasmatische Kinasedomäne von Flk-1 deletiert werden, was in einem verkürzten Flk-1-Molekül resultiert, das immer noch in der Lage ist, sich einer Dimerisierung mit endogenen Wildtyp-Rezeptoren zu unterziehen, aber nicht in der Lage ist, ein Signal weiterzuleiten.
  • Eine anomale Proliferation von Blutgefäßen ist eine wichtige Komponente einer Vielzahl von pathogenen Funktionsstörungen, wie beispielsweise rheumatoider Arthritis, Retinopathien und Psoriasis. Eine unkontrollierte Angiogenese ist ebenfalls ein wichtiger Faktor bei dem Wachstum und bei Metastasen von festen Tumoren. Rekombinante Viren können hergestellt werden, um dominant-negative Formen von Flk-1 zu exprimieren, welche verwendet werden können, um die Aktivität des endogenen Wildtyp-Flk-1 zu inhibieren. Diese Viren können therapeutisch für eine Behandlung von Krankheiten benutzt werden, die aus einer abweichenden Expression oder Aktivität von Flk-1 resultieren.
  • Expressionsvektoren, die von Viren wie beispielsweise Retroviren, Vaccinia-Virus, Adeno-assoziiertem Virus, Herpes-Viren oder Rinder Papilloma-Virus abstammen, können für eine Abgabe von rekombinantem Flk-1 in die Zielzellpopulation benutzt werden. Verfahren, die Fachleuten wohl bekannt sind, können verwendet werden, um rekombinante virale Vektoren, die eine Flk-1 codierende Sequenz enthalten, zu konstruieren. Siehe z. B. die Techniken, die in Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, N. Y. und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. Alternativ dazu können rekombinante Flk-1-Moleküle zur Abgabe in Zielzellen in Liposomen rekonstituiert werden.
  • In einer bestimmten Ausführungsform der Erfindung wurde eine Deletionsmutante des Flk-1-Rezeptors in einen rekombinanten retroviralen Vektor eingefügt. Zwei clonale Isolate, bezeichnet als pLXSN Flk-1 TM cl.1 und pLXSN Flk-1 TM cl.3, enthalten einen verkürzten Flk-1-Rezeptor, dem die 561 COOH-terminalen Aminosäuren fehlen. Um Virus-produzierende Zelllinien zu erhalten, wurden PA37-Zellen mit den rekombinanten Vektoren transfiziert und anschließend wurden konditionierte Medien, welche Viren enthielten, zum Infizieren von GPE-Zellen benutzt.
  • Um zu testen, ob eine Expression von in der Signalgebung defekten Mutanten endogene Flk-1-Rezeptoraktivität inhibiert, wurden C6-Glioblastomazellen aus der Ratte (Tumorzellen) und Mauszellen, die die rekombinanten Retroviren produzierten, gemischt und subkutan in nackte Mäuse injiziert. Normalerweise würde eine Injektion von Tumorzellen in nackte Mäuse in einer Proliferation der Tumorzellen und einer Vaskularisierung der resultierenden Tumormasse resultieren. Da angenommen wird, dass Flk-1 für die Bildung von Blutgefäßen essentiell ist, könnte ein Blockieren von Flk-1-Aktivität durch Expression eines verkürzten Rezeptors so wirken, dass eine Vaskularisierung des sich entwickelnden Tumors inhibiert und dabei dessen Wachstum inhibiert würde. Wie in den 13 und 14 dargestellt, inhibiert eine Koinjektion von Virus-produzierenden Zellen, die einen trunkierten Flk-1-Rezeptor exprimieren, signifikant das Wachstum des Tumors verglichen mit Kontrollen, die nur Tumorzellen erhielten.
  • 5.5 Verwendung von Flk-1-Rezeptoren oder Liganden
  • Es wird angenommen, dass die Rezeptor/Liganden-Interaktion zwischen Flk-1 und VEGF eine wichtige Rolle im Signalsystem während der Vaskularisierung und der Angiogenese spielt. Bei einer Reihe von Krankheiten stellt das anomale Wachstum von Blutgefäßen eine wichtige Komponente dar.
  • Die Flk-1-RNA-Expression korreliert mit der Entwicklung des Gehirns und mit der Proliferation von Endothelzellen, was nahelegt, dass Flk-1 ein Rezeptor sein könnte, der an der Übermittlung von Signalereignissen im Prozess der Vaskularisierung beteiligt ist. Es wurde gezeigt, dass VEGF eine mitogener Wachstumsfaktor ist, der bekanntermaßen ausschließlich auf Endothelzellen einwirkt (Ferrara, N. und Henzel, W. J., 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 161: 851–858). Quervernetzungs- und Ligandenbindungsversuche wurden, wie in Abschnitt 6.1.9 bzw. 6.1.10 beschrieben, durchgeführt, um zu bestimmen, ob VEGF ein Ligand für Flk-1 ist, und die Ergebnisse zeigen, dass Flk-1 ein echter Hochaffinitäts-VEGF-Rezeptor ist (9).
  • Liganden für Flk-1, der Flk-1-Rezeptor selbst oder ein Fragment, das seine VEGF-Bindungsstelle enthält, könnten in vivo verabreicht werden, um die Angiogenese und/oder Vaskulogenese zu modulieren. Zum Beispiel könnten die Verabreichung des Flk-1-Rezeptors oder eines Fragments, das die VEGF-Bindungsstelle enthält, um die Bindung an VEGF konkurrieren und seine Interaktion mit dem nativen Flk-1-Rezeptor in vivo inhibieren, um so die Angiogenese und die Vaskulogenese zu inhibieren. Alternativ können Liganden für Flk-1, einschließlich anti-Flk-1-Antikörper oder Fragmente davon, verwendet werden, um die Angiogenese und/oder Vaskulogenese zu modulieren. Agonisten der VEGF-Aktivität können verwendet werden, um die Wundheilung zu fördern, während Antagonisten der VEGF-Aktivität verwendet werden können, um Tumorwachstum zu hemmen.
  • Abhängig von den spezifischen Zuständen, die behandelt werden, können diese Agenzien systemisch oder lokal formuliert und verabreicht werden. Verfahren für die Formulierung und Verabreichung sind in „Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Esston, PA, neueste Auflage zu finden. Geeignete Verabreichungsarten können orale, rektale, transmukosale oder intestinale Verabreichung, parenterale Verabreichung, einschließlich intramuskulärer, subkutaner, intermedullärer Injektionen, ebenso wie intrathekale, direkte intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale, intranasale oder intraokulare Injektionen einschließen, um nur einige zu nennen. Für die Injektion können die Agenzien der Erfindung in wässrigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffern wie Hank-Lösung, Ringer-Lösung oder physiologischen Salz-Puffer formuliert werden. Für solch transmukosale Verabreichung werden Penetrationsstoffe, die für die zu durchdringende Barriere geeignet sind, in der Formulation verwendet. Solche Penetrationsstoffe sind im Allgemeinen im Stand der Technik bekannt.
  • 6. BEISPIEL: Clonierung und Expressionsmuster von Flk-1, ein Hochaffinitätsrezeptor für VEGF
  • Der Unterabschnitt unten beschreibt das Clonieren und eine Charakterisierung des Flk-1-cDNA-Clons. Northernblot- und in situ-Hybridisierungsanalysen zeigen, dass Flk-1 in Endothelzellen exprimiert wird. Quervernetzungs- und Ligandenbindungsversuche zeigen weiterhin, dass Flk-1 ein Hochaffinitätsrezeptor für VEGF ist.
  • 6.1. Material und Methoden
  • 6.1.1. cDNA-Clonierung von Flk-1
  • DNA, die aus einer λgt10-cDNA-Bibliothek von Tag 8,5-Mausembryonen (Fahrner et al., 1987, EMBO. J. 6: 1497–1508) extrahiert wurde, wurde als Matrize für eine Polymerasekettenreaktion (PCR; Saiki, R. K. et al., 1985, Science 230: 1350–1354) benutzt. In einem unabhängigen Ansatz wurde cDNA von kapillaren Endothelzellen, die aus dem Gehirn von postnatalen Tag 4-8-Mäusen isoliert worden war, für eine Amplifikation benutzt (Risau, W., 1990 In: Development of the Vascular System. Issues Biomed. Basel Karger 58–68 und Schnürch et al., unveröffentlicht). Degenerierte Primer wurden auf der Basis von hohen Aminosäurehomologien innerhalb der Kinasedomäne entworfen, die von allen RTKs geteilt wird (Wilks, A. F., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1603–1607).
  • cDNA-Clone von Flk-1 voller Länge wurden von einer anderen Tag 8,5-MausembryocDNA-Bibliotek, welche gemäß dem Verfahren von Okayama und Berg (1983) präpariert worden war, und von einer Tag 11,5-Mausembryo-λgt11-Bibliothek (Clonetech) unter Verwendung des 32P-markierten 210 bp-PCR-Fragments (Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. 1983 Anal. Biochem. 132: 6–13) isoliert.
  • 6.1.2. Mausembryonen
  • Balb/c-Mäuse wurden über Nacht gepaart und der Morgen des Nachweises des Vaginalpfropfens wurde als 1/2 Tag der Trächtigkeit definiert. Für Northernblot-Analysen wurden die gefrorenen Embryonen in 5 M Guanidiniumthiocyanat homogenisiert, und RNA wurde, wie beschrieben, isoliert (Ullrich, A. et al., 1985, Nature 313: 756–561). Für eine in situ-Hybridisierung wurden die Embryonen in Tissue-Tek (Miles) eingebettet, an der Oberfläche von flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –70°C vor der Verwendung gelagert.
  • 6.1.3. Präparation von Sonden
  • Die 5'-lokalisierten 2619 bp der Rezeptor-cDNA wurden in den pGem3Z-Vektor (Promega) als ein EcoRl/BamHl-Fragment subcloniert. Die Sonde für Northernblot-Hybridisierung wurde durch Markieren des cDNA-Fragments mit α-32P-dATP (Amersham) durch zufälliges Hexanucleotid-Priming (Boehringer; Feinberg, A. P. and Vogelstein, B., 1983 Anal. Biochem. 132: 6–13) hergestellt.
  • Für eine in situ-Hybridisierung wurde eine einzelsträngige Antisense-DNA-Sonde, wie von Schnürch und Risau (Development, 1991 111: 1143–54) beschrieben, hergestellt. Das Plasmid wurde an dem 3'-Ende der cDNA linearisiert, und ein Sense-Transkript wurde unter Verwendung von SP6 RNA-Polymerase (Boehringer) synthetisiert. Die DNA wurde unter Verwendung von DNAase (RNAase-freie Präparation, Boehringer Mannheim) degradiert. Mit dem Transkript wurde eine zufällig geprimte cDNA-Synthese mit α-35S-dATP (Amersham) durch reverse Transkription mit reverser MMLV-Transkriptase (BRL) durchgeführt. Um kleine cDNA-Fragmente von etwa 100 bp im Durchschnitt zu erhalten, die für eine in situ-Hybridisierung geeignet sind, wurde ein hoher Überschuss an Primer benutzt. Anschließend wurde das RNA-Transkript partiell in 100 mM NaOH 20 Minuten bei 70°C hydrolysiert, und die Sonde wurde mit derselben Menge von HCl neutralisiert und mit einer Sephadex C50-Säule gereinigt. Nach Ethanolfällung wurde die Sonde mit einer finalen spezifischen Aktivität von 5×105 ZpM aufgelöst. Für eine Kontrollhybridisierung wurde eine Sensesonde mit der gleichen Methode präpariert.
  • 6.1.4. RNA-Extraktion und Northern-Analyse
  • Gesamte zytoplasmatische RNA wurde gemäß der sauren Phenol-Methode von Chromczynski und Sacchi (1987) isoliert. Aliquots von Poly(A+)-RNA wurden einer Elektrophorese in 1,2% Agaroseformaldehydgelen (Sambrook, J. et al., 1989 Molecular Cloning: A Laborstory Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Laborstory Press) unterzogen und auf Nitrozellulosemembranen (Schleicher & Schuell) übertragen, Hybridisierungen wurden über Nacht in 50% Formamid, 5 × SSC (750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat), 5 × Denhardt (0,1% Ficoll 400, 0,1% Polyvinylpyrollidon, 0,1% BSA) und –0,5% SDS bei 42°C mit 1 – 3 × 106 ZpM-ml–1 von mit zufällig geprimter 32P-DNA-Sonde durchgeführt, gefolgt von hochstringenten Waschgängen in 0,2 × SSC, 0,5% SDS bei 52°C. Die Filter wurden für 4 bis 8 Tage exponiert.
  • 6.1.5. In situ-Hybridisierung
  • Fixierung nach der Subclonierung und Hybridisierung wurden im Wesentlichen gemäß Hogan et al. (1986) durchgeführt. 10 μm dicke Schnitte wurden bei –18°C auf einem Leitz-Cryostat geschnitten. Für eine Prähybridisierungsbehandlung wurde keine Inkubation mit 0,2 M HCl zum Entfernen der basischen Proteine durchgeführt. Die Schnitte wurden mit der 35S-cDNA-Sonde (5×104ZpM/μl) bei 52°C in einem Puffer inkubiert, der 50% Formamid, 300 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM NaPO4 (pH 6,8), 5 mM EDTA, 0,02% Ficoll 400, 0,01% Polyvinylprolidon, 0,02% BSA 10 m/ml Hefe-RNA, 10% Dextransulfat und 10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM NaPO4 (pH 6,8), 5 mM EDTA, 10 mM DTT (bei 52°C) enthielt. Für eine Autoradiographie wurden Objekträger mit Kodak-NTB2-Filmemulsion beschichtet und für acht Tage exponiert. Nach der Entwicklung wurden die Schnitte mit Toluidinblau oder May-Grinwald gegengefärbt.
  • 6.1.6 Herstellung von Antiseren
  • Das 3'-geprimte EcoRV/HindII-Fragment, das die 128 C-terminalen Aminosäuren von Flk-1 umfasst, wurde in den Fusionprotein-Expressionsvektor pGEX3X (Smith, D. B. and Johnson, K. S., 1990 Gene. 67: 31–40; Pharmacia) subcloniert. Das Fusionsprotein wurde, wie beschrieben, gereinigt und zum Immunisieren von Kaninchen benutzt. Nach dem zweiten Auffrischung wurden die Kaninchen ausgeblutet und das Antiserum wurde für eine Immunpräzipitation benutzt.
  • 6.1.7 Transiente Expression von Flk-1 in COS-1-Zellen
  • Eine Transfektion von COS-1-Zellen wurde, im Wesentlichen wie von Chen und Okayama (1987 Mol. Cell. Biol. 7: 2745–2752) und Gorman et al. (1989 Virology 171: 377–385) beschrieben, durchgeführt. Kurz dargestellt wurden Zellen bei einer Dichte von 1,0 × 106 pro 10 cm-Schale ausgesät und über Nacht in DMEM, enthaltend 10% fötales Kälberserum (Gibco), inkubiert. 20 μg von Rezeptor-cDNA, die in einen Expressionsvektor unter der Führung eines Cytomegalievirus-Promotors cloniert war, wurde in 0,5 ml 0,25 M CaCa2, 0,5 ml 2 × BBS (280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4, 50 mM BES, pH 6,96) gemischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Calciumphosphat/DNA-Lösung wurde dann zu den Zellen gegeben, vorsichtig verwirbelt und 18 Stunden bei 37°C und 3% CO2 inkubiert. Für Ligandenbindungsversuche wurden die Zellen von der Platte entfernt und, wie unten beschrieben, behandelt.
  • Um VEGF-konditionierte Medien zu erhalten, wurden Zellen in 15 cm-Schalen transfiziert. Medium wurde nach 48 Stunden gesammelt, und VEGF wurde durch Affinitätschromotographie unter Verwendung von Heparin High Trap TM-Säulen (Pharmacia) teilweise gereinigt und durch Ultrafiltration (Ferrara, N. and Henzel, W. J. 1989 Biochem. Biophys. Res. Comm. 161: 851–858) konzentriert. Die Konzentration von VEGF wurde durch einen Ligandenkompetitionstest mit Rinder-Aortaendotheizellen bestimmt.
  • Für Autophosphorylierungstests wurden Zellen in 6-Lochplatten (2×105 Zellen pro Loch) ausgesät, wie oben beschrieben transfiziert und 24 Stunden in DMEM, enthaltend 0,5% fötales Kälberserum, ausgehungert. Die Zellen wurden dann mit 500 pM VEGF 10 Minuten bei 37°C behandelt oder unbehandelt gelassen und wurden anschließend, wie von Kris et al. (1985) beschrieben, lysiert. Flk-1 wurde mit einem Antiserum immunpräzipitiert, welches in Kaninchen gegen den C-Terminus des Rezeptors erzeugt worden war. Die Immunpräzipitate wurden auf einem 7,5% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt, auf Nitrozellulose übertragen und mit einem monoclonalen Antikörper aus der Maus, der gegen Phosphotyrosin gerichtet ist (5E2; Fendly, B. M. et al., 1990 Cancer Research 50: 1550–1558), inkubiert. Proteinbanden wurden unter Verwendung von mit Merrettichperoxidase-gekoppeltem Ziege-anti-Maus-Antikörper und dem ECLTM(Amersham)-Detektionsystem sichtbar gemacht.
  • 6.1.8 Radioiodierung von VEGF
  • Rekombinanter humaner VEGF (5 μg; großzügigerweise von Dr. H. Weich zur Verfügung gestellt) wurde in 110 μl Natriumphosphat-Puffer pH 7,6 gelöst und nach dem Verfahren von Hunter und Greenwood (1962) iodiert. Diese Reaktionsprodukte wurden von dem markierten Protein durch eine Passage über eine Sephadex G50-Säule, die mit phosphatgepufferte Kochsalzösung (PBS), enthaltend 0,7% Rinder-Serumalbumin (BSA), voräquilibriert war, getrennt, und Aliquots von den gesammelten Fraktionen wurden vor und nach Präzipitation mit 20% Trichloressigsäure gezählt. Die Reinheit des iodierten Produktes wurde höher als 90% eingeschätzt, wie durch Gelelektrophorese bestimmt wurde, und die spezifische Aktivität war 77000 ZpM/ng. Die Bioaktivität des iodierten VEGF wurde durch Vergleich mit den Bioaktivitäten von nativem VEGF unter Verwendung des Gewebefaktor-Einführungstest, wie von Clauss, M. et al. (1990 J. Exp. Med. 172: 1535–1545) beschrieben, bestätigt.
  • 6.1.9. Quervernetzung von VEGF an Flk-1
  • COS-1-Zellen, die Flk-1 transient exprimieren, und nicht transfizierte COS-1-Zellen wurden mit 200 pM 125I-VEGF bei 4°C über Nacht inkubiert, dann zweimal mit PBS gewaschen und 0,5 mM Disuccinimidylsuberat (DSS) in PBS eine Stunde bei 4°C ausgesetzt. Die Zellen wurden lysiert, Flk-1 immunpräzipitiert und durch Elektrophorese auf einem 7% Polyacrylamidgel gefolgt von Autoradiographie analysiert.
  • 6.1.10. VEGF-Bindung
  • Ligandenbindungversuche wurden, wie früher beschrieben (Schumacher, R. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 19288–19295), durchgeführt, COS-1-Zellen wurden in einer 15 cm-Kulturschale in DMEM 48 Stunden nach Transfektion kultiviert. Die Zellen wurden dann sorgfältig mit PBS gewaschen und mit 5 ml 25 mM EDTA in PBS 10 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dann von der Platte entfernt, einmal mit Bindungspuffer (DMEM, 25 mM HEPES, pH 7,5, 0,15% Gelatine) gewaschen und in 5 ml Bindungspuffer zum Bestimmen der Zellzahl resuspendiert. In einem Gesamtvolumen von 500 μl wurde diese Zellsuspension 90 Minuten bei 15°C mit 10 pM 125I-VEGF und ansteigender Konzentration von nicht markiertem Liganden (von 0 bis 7 × 10–9) inkubiert, welcher aus konditionierten Medien von COS-1-Zellen, die transient VEGF exprimierten (164 Aminosäureform; Breier et al., 1992), teilweise gereinigt wurde. Nach Inkubation wurden die Zellen mit PBS 0,1% PBS in der Kälte gewaschen. Freie Liganden wurden durch wiederholte Zentrifugation und Resuspension in Bindungspuffer entfernt. Schließlich wurde die 125I-Radioaktivität, die an die Zellen gebunden war, in einem Gammazähler (Risstar) bestimmt. Erhaltene Daten wurden durch das Verfahren von Munson, P. J. und Rodbard, D. (1980 Anal. Biochem. 107: 220–235) analysiert.
  • 6.1.11. Retrovirale Vektoren, die transdominant-negative Mutanten von Flk-1 codieren
  • Rekombinante retrovirale Vectoren, die die codierende Region für die Aminosäuren 1 bis 806 des Flk-1-Rezeptors (pLX Flk-1 cl.1 und cl.3, 12) enthalten, wurden konstruiert. Ein rekombinantes Virus, das eine verkürzte c-fms-Rezeptormutante (pNTK cfms TM cl. 7) enthielt, wurde als eine Kontrolle verwendet. Um Virus produzierende Zellen zu erhalten, wurden GPE-Zellen aus der Maus mit amphotrophen, Virus enthaltenden konditionierten Medien von PA317-Zellen, die mit rekombinanter retroviraler DNA transfiziert worden waren, infiziert. C6-Glioblastoma-Tumorzellen wurden in nackte Mäuse entweder allein implantiert oder mit Virusproduzierenden Zellen koimplantiert. Die Anzahl der injizierten Zellen für die beiden Versuchsansätze sind jeweils unten angezeigt. Beginnend mit der Zeit, als die ersten Tumoren erschienen, wurden alle 2 bis 3 Tage Tumorvolumina gemessen, um eine Wachstumskurve zu erhalten. Versuch Nr. 1
    Anzahl von Mäusen Anzahl von C6-Zellen Virus-Produktions Zelllinie Anzahl von Viruszellen
    4 5 × 105 pLXSN Flk-1 TM cl.3 1 × 107
    4 5 × 105 keine 0
    4 5 × 105 pNTX cfms TM cl.7 5 × 106
    Versuch Nr. 2
    Anzahl von Mäusen Anzahl von C6-Zellen Virus-Produktions Zelllinie Anzahl von Viruszellen
    4 2 × 106 pLXSN Flk-1 TM cl.1 2 × 107
    4 2 × 106 pLXSN Flk-1 TM cl.3 2 × 107
    4 2 × 106 keine 0
    4 2 × 106 pNTK cfms TM cl.7 2 × 107
  • 6.2. Ergebnisse
  • 6.2.1. Isolierung von Flk-1
  • Um RTKs zu identifizieren, die während der Mausentwicklung exprimiert werden, wurden PCR-Tests unter Verwendung von zwei degenerierten Oligonucleotidprimer-Pools durchgeführt, die auf der Basis von hochkonservierten Sequenzen innerhalb der Kinasedomäne von RTKs entworfen worden waren (Ranks, S. K. et al., 1988, Science 241: 42–52). DNA, die von einer λgt10-cDNA-Bibliothek von Tag 8,5-Mausembryonen (Fahrner, K. et al., 1987, EMBO. J., 6: 1497–1508) extrahiert worden war, ein Stadium in der Mausentwicklung, bei welchem viele Differenzierungsprozesse beginnen, wurde als eine Matrize in den PCR-Tests verwendet. In einem parallelen Ansatz mit dem Ziel, RTKs zu identifizieren, die Angiogenese regulieren, wurden ähnliche Primer für die Amplifizierung von RTKcDNA-Sequenzen aus Kapillar-Endothelzellen benutzt, die von den Gehirnen von postnatalen Tag 4–8-Mäusen isoliert worden waren, einer Zeit, zu welcher die Proliferation von Endothelzellen im Gehirn maximal ist (Robertson, P. L. et al., 1985, Devel, Brain Res. 23: 219–223). Beide Ansätze ergaben cDNA-Sequenzen (11, SEQ. ID No:), die die kürzlich beschriebene fötale Leber-RTK, Flk-1 (Matthews, W. et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 90269–9030), codieren. Basierend auf Aminosäurehomologie ist dieser Rezeptor ein Mitglied der Typ-III-Unterklasse von RTKs (Ullrich, A. and Schlessinger, J. 1990, Cell 61: 203–212), und ist nahe verwandt mit humanem fit, welches ebenfalls sieben immunglobinartige Wiederholungen in seiner extrazellulären Domäne im Gegensatz zu anderen RTKs dieser Unterfamilie enthält, welche nur fünf solcher Wiederholungsstrukturen enthalten (Matthews, W. et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 88: 9026–9030). Sequenzvergleiche von Flk-1 mit KDR (Terman, B. I. et al., 1991, Oncogene 6: 1677–1683) und TKr-C (Sarzani, R. et al., 1992, Biochem, Biophys. Res. Comm. 186: 706–714) weisen darauf hin, dass diese die humanen Homologe bzw. Homologe aus der Ratte von Flk-1 sind (1).
  • 6.2.2. Expression von Flk-1-mRNA während der embryonalen Entwicklung
  • Als ein erster Schritt zur Aufklärung der biologischen Funktion von Flk-1 wurde die Expression von Flk-1-mRNA in Mausembryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien analysiert. Northern-Blot-Hybridisierungsversuche zeigten eine abundante Expression einer 5,5 kb-Haupt mRNA zwischen Tag 9,5 und Tag 18,5 mit einer offensichtlichen Abnahme zum Ende der Trächtigkeit hin (2A). Es wurde festgestellt, dass Flk-1-mRNA in postnatalen Tag 4–8-Kapillargefäßen des Gehirns verglichen mit der gesamten mRNA des Gehirns hoch angereichert ist (2B).
  • In situ-Hybridisierungsversuche wurden durchgeführt, um detailliertere Information über die Expression von Flk-1 während verschiedener embryonaler Stadien zu erhalten. Eine einzelsträngige Antisense-DNA-Sonde von 2619 Nucleotiden Länge, die die extrazelluläre Flk-1-Domaine umfasst, wurde als eine Sonde verwendet, da sie die am meisten spezifischen Hybridisierungssignale ergab. Als ein Beispiel ist ein parasagittaler Schnitt von einem Tag 14,5-Embryo in 3 gezeigt. Hohe Grade der Hybridisierung wurden in den Ventrikeln des Herzens, in der Lunge und der Hirnhaut nachgewiesen; andere Gewebe wie beispielsweise Gehirn, Leber und Mandibula schienen weniger Zellen zu enthalten, die Flk-1-mRNA exprimieren. Dünne Stränge von Flk-1-Expression wurden auch in den intersegmentalen Regionen der Wirbel und an der inneren Oberfläche des Atriums und der Aorta beobachtet. Eine höhere Vergrößerung zeigte, dass die Expression von Flk-1 auf Kapillaren und Blutgefäße beschränkt zu sein scheint. Eine nähere Untersuchung des Herzens z. B. zeigte nur in den ventrikulären Kapillaren und in der endothelialen Auskleidung des Atriums positive Signale (4A). In der Lunge wurde eine Flk-1-Expression in peribronchialen Kapillaren nachgewiesen, war aber in bronchialem Epithelium abwesend (4D). Die Aorta zeigte eine starke Hybridisierung in Endothelzellen, aber nicht in der muskulären Schicht (4C).
  • 6.2.3. Expression von Flk-1 während Organangiogenese
  • Das Neuroektoderm in dem Telencephalon von einem Tag 11,5-Mausembryo ist weitgehend avaskulär; die ersten vaskulären Sprosse beginnen, ausgehend vom perineuralen vaskulären Plexus, radial in das Organ einzudringen (Bär, J., 1980, Adv. Anat. Embryol. Cell. Biol. 59: 1–62; Risau, W. and Lemmon, V. 1988, Dev. Biol. 125: 441–450). In diesem Stadium war die Expression von Flk-1 im perineuralen vaskulären Plexus und in eindringenden vaskulären Sprossen hoch, wie in 5A gezeigt. Diese in situ-Hybridisierungsanalysen zeigen, dass die proliferierenden Endothelzellen eines angiogenen Sprosses die Flk-1-mRNA exprimierten. Am Tag 14,5, wenn das Neuroektoderm bereits hoch vaskularisiert ist, enthielten zahlreiche radiale Gefäße sowie auch abzweigende Gefäße des intraneuralen Plexus große Mengen an Flk-1-mRNA (5B). Am postnatalen Tag 4, wenn Sprossung und Endothelzellproliferation an ihrem höchsten Punkt ist, wurde eine starke Expression von Flk-1-mRNA in Endothelzellen beobachtet (5C). Umgekehrt war die Flk-1- Expression im adulten Gehirn, wenn die Angionese beendet ist, sehr niedrig (5D) und schien hauptsächlich auf den choroiden Plexus beschränkt zu sein (6). Im choroiden Plexus exprimierten Zellen in der inneren vaskulären Schicht Flk-1-mRNA, während Epithelzellen dies nicht taten (6A, B).
  • Die embryonale Niere wird durch einen angiogenen Prozess vaskularisiert (Ekblom, P. et al., 1982, Cell Diff. 11: 35–39). Glomeruläre und peritubuläre Kapillaren entwickeln sich synchron mit der epithelialen Morphogenese. In der Niere des postnatalen Tages 4 wurde zusätzlich zu anderen Kapillaren eine deutliche Expression von Flk-1 in den mutmaßlichen glomerulären Kapillaren beobachtet (7A). Diese Expression dauerte in der adulten Niere an (7C und D) und schien dann im Vergleich mit der frühen postnatalen Niere mehr auf die glomerulären Kapillaren begrenzt zu sein.
  • 6.2.4. Flk-1-Expression in Endothelzellvorläufern
  • Um die mögliche Beteiligung von Flk-1 in den frühen Stadien der vaskulären Entwicklung zu untersuchen, wurden Analysen von Embryonen in verschiedenen Stadien während der Blutinselbildung durchgeführt. In einem sagittalen Schnitt des Deciduums von einem Tag 8,5-Mausembryo wurde eine Flk-1-Expression auf maternalen Blutgefäßen in dem Deciduum, im Dottersack und im Trophoektoterm nachgewiesen. Flk-1-mRNA wurde ebenfalls in der Allantois und innerhalb des Embryos gefunden, wobei sie hauptsächlich in dem Teil lokalisiert war, in dem Mesenchym gefunden wird (8A). Bei einer höheren Vergrößerung des maternalen Deciduums wurden hohe Grade von Flk-1-mRNA-Expression in der inneren Auskleidung von Blutgefäßen gefunden, welche aus Endothelzellen besteht (8B). Im Dottersack waren die Hybridisierungssignale auf die mesodermale Schicht begrenzt, in welcher die Hämangioblasten differenzieren (8C). 8D zeigt eine Blutinsel bei höherer Vergrößerung, in welcher die peripheren Angioblasten einen hohen Spiegel von Flk-1-mRNA exprimierten.
  • 6.2.5. Flk-1 ist ein Hochaffinitätsrezeptor für VEGF
  • Eine detaillierte Untersuchung von in situ-Hybridisierungsergebnissen und Vergleich mit denen für VEGF, die kürzlich von Breier, G. et al. (1992, Development 114: 521–532) berichtet wurden, zeigte eine bemerkenswerte Ähnlichkeit in den Expressionsmustern. Weiterhin ergab eine Flk-1-Expression in dem glomerulären Endothelium und die Expression von VEGF in den umgebenden Epithelzellen (Breier, G. et al., 1992, Development 114: 521–532) die Möglichkeit einer parakrinen Beziehung zwischen diesen Zelltypen und wies daher auf eine Liganden-Rezeptorbeziehung für VEGF bzw. Flk-1 hin. Um diese Hypothese zu testen, wurde die Flk-1-cDNA voller Länge in den Säuger-Expressionsvektor pCMV cloniert, der transkriptionale Kontrollelemente des humanen Cytomegalievirus (Gorman, C. M. et al., 1989, Virology 171: 377–385) enthält. Für eine transiente Expression des Rezeptors wurde dann das Flk-1 exprimierende Plasmid in COS-1-Fibroblasten transfiziert.
  • Eine spezifische Bindung von VEGF an die Flk-1-RTK wurde durch Quervernetzungs- und Kompetitionsbindungsversuche gezeigt. Gereinigter 125I-markierter VEGF wurde mit COS-1-Zellen inkubiert, die mit dem pCMV-Flk-1-Expressionsvektor transfiziert worden waren. Quervernetzen mit DSS und anschließende Analyse von Immunopräzipitation, PAGE und Autoradiographie zeigten eine etwa 220 kD-Bande, welche in dem Kontrollversuch mit nicht transfizierten COS-1-Zellen nicht nachgewiesen wurde und wahrscheinlich den VEGF/Flk-1-Rezeptorkomplex repräsentiert (9A). Zusätzlich konkurrierte VEGF mit 125I-VEGF um Bindung an Flk-1 exprimierende COS-1-Zellen (9B), während nicht transfizierte COS-1-Zellen 125I-VEGF nicht banden. Die Interaktion von VEGF mit dem Rezeptor auf transfizierten Zellen war spezifisch, da PDGF-BB nicht mit einer Bindung von 125I-VEGF konkurrierte. Eine Analyse der Bindungsdaten zeigte einen Kd von etwa 10–10 M, was darauf hindeutet, dass Flk-1 ein Hochaffinitätsrezeptor für VEGF ist. Dieser Befund zusammen mit den in situ-Hybridisierungsergebnissen von Flk-1 und VEGF zeigt deutlich, dass Flk-1 ein physiologisch relevanter Rezeptor für VEGF ist.
  • Ein Autophosphorylierungstest wurde durchgeführt, um die biologische Relevanz einer VEGF-Bindung an den Flk-1-Rezeptor zu bestätigen. COS-1-Zellen, die Flk-1 transient exprimierten, wurden in DMEM, enthaltend 0,5% fötales Kälberserum, 24 Stunden ausgehungert, mit 0,5 mM VEGF stimuliert und lysiert. Die Rezeptoren wurden mit dem für Flk-1 spezifischen polyclonalen Antikörper CT128 immunpräzipitiert und dann durch SDS-PAGE und anschließendes Immunblotten unter Verwendung des Antiphosphotyrosin-Antikörpers 5E2 (Fendly, B. M. et al., 1990, Cancer Research 50: 1550–1558) analysiert. Wie in 10 gezeigt, führte eine VEGF-Stimulierung von Flk-1 exprimierenden Zellen zu einer signifikanten Induktion einer Tyrosinphosphorylierung des 180 kD-Flk-1-Rezeptors.
  • 6.2.6. Inhibierung von Tumorwachstum durch transdominant-negative Inhibierung von Flk-1
  • Es wird angenommen, dass der Flk-1-Rezeptor eine wichtige Rolle in der Vaskulogenese und Angiogenese spielt. Daher kann möglicherweise eine Inhibierung von Flk-1-Aktivität eine Vaskulogenese eines sich entwickelnden Tumors inhibieren und dessen Wachstum hemmen. Um diese Hypothese zu testen, wurden Tumorzellen (C6-Glioblastoma aus der Ratte) und Mauszellen, die ein rekombinantes Retrovirus produzieren, das einen verkürzten Flk-1-Rezeptor codiert, gemischt und subkutan in Nacktmäuse implantiert. Die implantierten C6-Glioblastomazellen sezernieren VEGF, welcher an die Flk-1-Rezeptoren, die an der Oberfläche von Mausendothelzellen exprimiert werden, binden wird und diese aktivieren wird. In der Abwesenheit von beliebigen Inhibitoren der Vaskulogenese werden die Endothelzellen proliferieren und in Richtung der Tumorzellen migrieren. Alternativ dazu, wenn zum Injektionszeitpunkt die Tumorzellen mit Zellen koinjiziert werden, die rekombinantes Retrovirus, das die dominant-negative Flk-1 codiert, produzieren, werden die Endothelzellen, die in Richtung der implantierten Tumorzellen wachsen, mit rekombinantem Retrovirus infiziert werden, was in einer dominant-negativen Flk-1-Mutantenexpression und Inhibierung von endogener Flk-1-Signalgebung resultieren kann. Eine Unterdrückung der Endothelzellproliferation und -migration führt dazu, dass die Vaskulierung der implantierten Tumorzellen nicht erfolgreich ist, was zu einer Inhibierung des Tumorwachstums führt. Wie in 12 und 13 gezeigt, wird das Tumorwachstum in Mäusen, die Implantationen von Zellen erhalten haben, die verkürzte Flk-1 produzieren, signifikant gehemmt, was zeigt, dass Expression eines verkürzten Flk-1-Rezeptors in dominant-negativer Weise wirken kann, so dass die Aktivität von endogenem Wildtyp-Flk-1 inhibiert wird.
  • Die vorliegende Erfindung ist im Umfang nicht durch die beispielhaften Ausführungsformen beschränkt, die der Veranschaulichung von einzelnen Aspekten der Erfindung dienen sollen, und alle beliebigen Clone, DNA- oder Aminosäuresequenzen, die funktional äquivalent sind, sind vom Umfang der Erfindung umfasst. Tatsächlich erschließen sich dem Fachmann aus der vorangehenden Beschreibung und den begleitenden Zeichnungen verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den hier beschriebenen. Solche Modifikationen fallen bestimmungsgemäß in den Umfang der angefügten Ansprüche.
  • Es ist ebenfalls so zu verstehen, dass alle Basenpaargrößen, die für Nucleotide angegeben sind, Näherungswerte sind und für Zwecke der Beschreibung verwendet werden. SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (9)

  1. Membrangebundener Flk-1-Rezeptor, der eine Deletionsmutation in der cytoplasmatischen Kinase-Domäne des Flk-1-Rezeptors hat, wobei der Flk-1-Rezeptor dominant negative Aktivität hat, die die zellulären Effekte des Bindens von VEGF hemmt.
  2. Membrangebundener Flk-1-Rezeptor nach Anspruch 1, wobei die C-terminale cytoplasmatische Kinase-Domäne des Rezeptors fehlt.
  3. Rezeptor nach Anspruch 2, enthaltend Aminosäuren 1 bis 806 von Flk-1, aber nicht Aminosäuren 807 bis 1367 von Flk-1.
  4. Nucleotidsequenz, die einen membrangebundenen Fik-1-Rezeptor codiert, der eine Deletionsmutation in der cytoplasmatischen Kinase-Domäne des Flk-1-Rezeptors hat, wobei der Flk-1-Rezeptor dominant negative Aktivität hat, die die zellulären Effekte des Bindens von VEGF hemmt.
  5. Nucleotidsequenz nach Anspruch 4, wobei die C-terminale cytoplasmatische Kinase-Domäne des Rezeptors fehlt.
  6. Nucleotidsequenz nach Anspruch 5, enthaltend eine Nucleotidsequenz, die Aminsäuren 1 bis 806 von Flk-1 codiert, aber nicht Aminosäuren 807 bis 1367 von Flk-1.
  7. Verfahren zum Herstellen des rekombinanten Flk-1 nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend: (a) Züchten einer Wirtszelle, die mit einem rekombinanten DNA-Expressionsvektor transformiert ist, der die Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 4 bis 6 umfasst und Flk-1 exprimiert; und (b) Gewinnen des Flk-1-Genprodukts aus der. Zellkultur.
  8. Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Flk-1-Fusionsproteins, umfassend den Flk-1-Rezeptor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Verfahren umfasst: (a) Züchten einer Wirtszelle, die mit einem rekombinanten DNA-Expressionsvektor transformiert ist, der die Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 4 bis 6 umfasst und das Flk-1-Fusionsprotein exprimiert; und (b) Gewinnen des Flk-1-Fusionsproteins aus der Zellkultur.
  9. Verfahren zum Screenen und Identifizieren eines Flk-1-Rezeptors, der dominant negative Aktivität hat, wobei das Verfahren umfasst: (a) Injizieren von Tumorzellen und Zellen in ein nicht-menschliches Tier, wobei die Zellen einen Flk-1-Test-Rezeptor exprimieren, der eine Deletions- oder Missense-Mutation in der cytoplasmatischen Kinase-Domäne hat; und (b) Messen der Proliferation oder Vaskularisierung der Tumormasse, die aus der Injektion der Zellen resultiert.
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