DE4243648A1 - Verfahren zur Bestimmung von Herzmuskelnekrosen mittels Antikörper gegen das N-terminale Troponin I-Peptid - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung von Herzmuskelnekrosen mittels Antikörper gegen das N-terminale Troponin I-PeptidInfo
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Description
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von
Herzmuskelnekrosen mittels Antikörper gegen das N-terminale
Troponin I-Peptid, bei dem man eine Blutprobe mit einem Anti
körper gegen das N-terminale Troponin I-Peptid versetzt und
den sich bildenden Komplex nachweist sowie die in diesem Ver
fahren verwendeten Antikörper und ein Verfahren zur Herstel
lung solcher Antikörper.
Die Myofibrillen des quergestreiften Muskels bestehen aus
zwei zusammenwirkenden Proteinfilamenten, den dicken Fila
menten mit Myosin als Hauptbestandteil und den dünnen Fila
menten, die Actin, Tropomyosin und Troponine enthalten.
Troponin ist in den Zellen als regulatives Strukturprotein zu
einem Komplex zusammengelagert und besteht aus drei ver
schiedenen Proteinen:
Troponon C : bindet Calciumionen
Troponin I : eine Actin-bindende Untereinheit
Troponin T : lagert sich an Tropomyosin an.
Troponin I : eine Actin-bindende Untereinheit
Troponin T : lagert sich an Tropomyosin an.
Die vergleichbare Nomenklatur hat historische Gründe, da ur
sprünglich der Komplex als solcher gereinigt und als ein
Protein angesehen und mit Troponin benannt wurde.
Von Troponin I sind drei Isoformen bekannt entsprechend ihrem
Auftreten im Herzmuskel (TnIc), langsamen Skelettmuskeln
(TnIs) und schnellen Skelettmuskeln (TnIf). Kardiales
Troponin I unterscheidet sich von skelettärem Troponin I
hauptsächlich durch eine zusätzliche N-terminale Sequenz aus
30 Aminosäuren.
Kardiales Troponin I wird nach einem akuten Myokardinfarkt
freigesetzt und kann im Blutplasma nachgewiesen werden. Es
stellt somit einen Marker für Herzmuskelzellnekrosen dar.
Cummins, J. Mol. Cell. Card. 19 (1987), 999-1010 und Cummins
and Cummins, Clin. Invest. 113 (1987), 1333-1344 konnten
nachweisen, daß TnIc im Serum normalerweise in Konzentra
tionen in der Höhe von 10 ng/ml auftritt. Es zeigte sich, daß
beim transmuralen Infarkt eine erhöhte Serumkonzentration zu
beobachten ist. TnIc war von der 4. bis 168. Stunde nach
Schmerzbeginn bei 37 Patienten mit akutem transmuralen
Infarkt erhöht. Ähnliche Ergebnisse wurden im Tiermodell er
halten. Danach ergibt sich als Zeitintervall für die absolute
diagnostische Sensitivität für TnIc die 10-50. Stunde nach
dem Infarktereignis.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es ein Bestimmungs
verfahren zu entwickeln, das geeignet ist einen akuten
Myokardinfarkt möglichst schnell innerhalb der ersten Stunden
nach dem Infarktereignis nachzuweisen.
Gelöst wurde die Aufgabe durch die in den Ansprüchen näher
charakterisierte Erfindung. Insbesondere durch ein Verfahren
zur immunologischen Bestimmung von Herzmuskelnekrosen, da
durch gekennzeichnet, daß man eine Probe mit mindestens einem
Antikörper, der das N-terminale Peptid von kardialem Troponin
I erkennt und erhältlich ist durch Immunisierung mit einem
Immunogen, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 oder Teil
seguenzen davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält,
und Isolierung des polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers
aus dem Serum bzw. den immortalisierten und klonierten Milz
zellen der immunisierten Tiere nach bekannten Verfahren, ver
setzt und den sich bildenden Komplex in geeigneter Weise
nachweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Antikörper, der
das N-terminale Peptid von kardialem Troponin I erkennt und
erhältlich ist durch Immurisierung mit einem Immunogen, das
die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 oder Teilsequenzen davon
mit mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält und Isolierung des
Antikörpers aus dem Serum der immunisierten Tiere nach be
kannten Verfahren sowie ein monoklonaler Antikörper, der das
N-terminale Peptid von kardialem Troponin I erkennt und er
hältlich ist durch Immunisierung mit einem Immunogen, das die
Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 oder Teilsequenzen davon mit
mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, Immortalisierung der
Milzzellen der immunisierten Tiere, Klonierung derjenigen
immortalisierten Zellen, die den gewünschten Antikörper pro
duzieren und Isolierung des Antikörpers aus den klonierten
Zellen nach bekannten Verfahren.
Die Durchführung des immunologischen Bestimmungsverfahrens
von Herzmuskelnekrosen erfolgt mit dem Fachmann geläufigen
Methoden. Beispielsweise kann die Bestimmung in Proben, das
heißt Körperflüssigkeiten wie beispielsweise Blut, Plasma
oder Serum, durch einen Radio-Immunoassay, Enzym-Immunoassay
oder durch Immunfluoreszenz erfolgen. Als Verfahrensvariante
sind alle bekannten Verfahren wie kompetitive Immunoassays,
Sandwich-Immunoassays und IEMA-Verfahren oder homogene
Immunoassays wie CEDIA® anwendbar. Es ist möglich den Test in
Form eines Naßtestes oder Trockentestes durchzuführen.
Bei den heterogenen Verfahren wird der TnIc-spezifische Anti
körper an eine Festphase immobilisiert. Die Immobilisierung
kann adsorptiv, kovalent oder über ein spezifisches Bindepaar
wie Biotin/ Streptavidin, Antikörper/Antigen oder Zucker/
Lectin erfolgen. Dabei wird der erfindungsgemäße TnIc
spezifische Antikörper an einen dieser Bindepartner gebunden.
Der andere Bindepartner ist an die Festphase gebunden.
Methoden zur adsorptiven oder kovalenten Kopplung sind dem
Fachmann bekannt.
Als Festphase bei einem Naßtest können Materialien verwendet
werden, wie z. B. Röhrchen (tubes), Kunststoffküvetten,
Mikrotiterplatten, Kugeln oder Mikrocarrier aus Kunststoffen
wie Polystyrol, Vinylpolymeren, Polypropylen, Polycarbonat,
Polysaccariden, Silikone, Gummi oder behandeltes Glas (vgl.
beispielsweise E.T. Maggio, Enzyme Immunoassays, CAC. Press,
Florida (1980), insbesondere Seiten 175-178, EP-A-0 063 064,
Bioengineering 16 (1974), 997-1003, C.J. Senderson und D.V.
Wilson, Immunology 20 (1971), 1061-1065). Insbesondere wird
als Festphase ein mit Avidin oder Streptavidin beschichtetes
Trägermaterial, insbesondere Polystyrol, vorzugsweise herge
stellt wie in EP-A-0 269 092 beschrieben, verwendet. Als
Festphase bei einem Trockentest sind die hierbei üblichen
Vliese wie Cellulose- oder Glasfaservliese als auch Membranen
zu verwenden.
Besonders zweckmäßig hat sich der Sandwich-Test erwiesen.
Hierbei wird ein immobilisierter Antikörper, der das N-termi
nale Peptid von kardialen Troponin I erkennt, in Kombination
mit einem zweiten TnIc-spezifischen Antikörper, an den eine
bestimmbare Gruppe gekoppelt ist, eingesetzt. Als bestimmbare
Gruppe können alle gängigen Markierungsgruppen wie Enzyme
oder fluoreszierende oder lumineszierende Reste eingesetzt
werden. Der zweite Antikörper, der ebenfalls das N-terminale
Peptid von TnIc erkennt, wird so ausgewählt, daß er nicht
oder nur unwesentlich die Bindung des ersten Antikörpers an
diesem Peptid stört. Beide Antikörper sind also gegen ver
schiedene Epitope am N-terminalen Peptid von TnIc gerichtet.
Die Testführung kann sowohl sukzessiv, d. h. ein Antikörper
wird zunächst mit der Probe inkubiert bevor der zweite Anti
körper zugegeben wird, als auch simultan, d. h. alle Reak
tionspartner werden im Test gleichzeitig zugegeben,
erfolgen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist der kompetitive
Test. Dabei wird ein vor oder während der Bestimmung immo
bilisierter Antikörper gegen das N-terminale Peptid von TnIc
und ein Konjugat aus TnIc oder dem Antigen, das die Amino
säuresequenz SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequenz davon mit
mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, und einer bestimm
baren Gruppe verwendet. Werden lediglich Teilsequenzen der
Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 verwendet, so muß der ver
wendete Antikörper mit diesem Teil spezifisch bindefähig
sein.
Die kompetitive Testführung ist insbesondere bei homogenen
Immunoassays geeignet. Bevorzugt ist der TINIA, der turbidi
metrische Inhibierungs-Immunoassay. Eine Probe wird mit einem
Polyhapten, das aus einem Mikropartikel, beispielsweise einem
Latexpartikel oder Dextran und daran gebundenen N-terminalen
TnI-Peptiden, besteht und den erfindungsgemäßen Antikörpern
inkubiert. Es bilden sich Immunkomplexe aus Polyhapten oder
TnIc und Antikörpern. Die Bindung der Antikörper an das Poly
hapten führt zu Aggregaten, die durch Zunahme der Trübung ge
messen werden können. Die Bindung von Antikörpern an den
freien Analyten führt hingegen zu keinen größeren und damit
Trübungsverursachenden Aggregaten, da die von den erfindungs
gemäßen Antikörpern erkannten Epitope nur einmal auf dem
Analyt vorkommen. Die Agglutination des Polyhaptens wird so
mit teilweise inhibiert. Der genaue Gehalt einer Probe an
Analyt kann über eine Standardkurve bestimmt werden.
Geeignet ist auch ein homogener Immunoassay, bevorzugt ein
CEDIA® (vergleiche Henderson et al., Clin. Chem. 32 (1986)
1637-1641). Das Peptidantigen, das die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequenz davon mit mindestens 6
Aminosäuren Länge enthält, wird an ED gekoppelt.
Unter einem Antikörper im Sinne der Erfindung ist ein
kompletter Antikörper oder bi- oder monovalente Fragmente
hiervon zu verstehen. Die Antikörper können sowohl monoklonal
als auch polyklonal sein. Bevorzugt ist die Verwendung von
monoklonalen Antikörpern.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur
Herstellung von polyklonalen Antikörpern, die das N-terminale
Peptid von kardialem Troponin I erkennen. Das Verfahren be
steht darin, daß man Versuchstiere, vorzugsweise Schafe, mit
einem Immunogen, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO 1
oder eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren
Länge enthält, in Kombination mit einem Adjuvans, über
mehrere Monate (vorzugsweise 4-6 Monate) mindestens vier
mal in vier- bis sechs-wöchigem Abstand immunisiert, Roh
serum gewinnt und dieses mit dem Fachmann bekannten Methoden
reinigt. Zur Immunadsorption werden Adsorber verwendet, die
ein Peptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO 1 oder
eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge
kovalent gebunden haben.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur
Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die das N-terminale
Peptid von kardialem Troponin I erkennen. Das Verfahren be
steht darin, daß man Versuchstiere, vorzugsweise Inzucht-
Mäuse, mit einem Immunogen, das die Aminosäuresequenz gemäß
SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequenz davon mit mindestens 6
Aminosäuren Länge enthält, in Kombination mit einem Adjuvans,
über mehrere Monate mit mindestens vier Immunisierungen in
vier- bis sechswöchigem Abstand intraperitoneal immunisiert,
Milzzellen gewinnt und mit einer permanenten Myelom-Zellinie
fusioniert, die Klone isoliert und hieraus die Antikörper ge
winnt.
Bevorzugt wird als Adjuvans Aluminiumhydroxid zusammen mit
Bordetella pertussis oder Freund′schem Adjuvans eingesetzt.
Das Immunogen, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO 1
oder eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren
Länge enthält, kann an ein Trägerprotein zur Erhöhung der
Antigenität gekoppelt werden.
Die bei der Fusionierung nach dem bekannten Verfahren von
Köhler und Milstein (Nature 256 (1975), 495-497) gewonnenen
Primär-Kulturen von Hybridzellen, werden in üblicher Weise,
zum Beispiel unter Verwendung eines handelsüblichen Zell
sorters oder durch "limiting dilution" kloniert. Es werden
jeweils die Kulturen weiterverarbeitet, die positiv gegenüber
dem N-terminalen Peptid von kardialem Troponin I reagieren.
Man erhält auf diese Weise Hybridoma-Zellinien, die die
erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper produzieren. Nach
bekannten Methoden können diese Zellinien kultiviert und die
von ihnen produzierten monoklonalen Antikörper isoliert
werden.
Die erfindungsgemäßen polyklonalen oder monoklonalen Anti
körper eignen sich hervorragend dazu, in einer Probe, bei
spielsweise Serum oder Plasma, sehr schnell nach dem Infarkt-
Ereignis Herzmuskelnekrosen spezifisch zu bestimmen. Für
diese Bestimmungsverfahren können die Antikörper als solche
oder Fragmente hiervon, welche die entsprechenden immuno
logischen Eigenschaften aufweisen, beispielsweise Fab-Frag
mente verwendet werden. Unter dem Begriff Antikörper werden
daher sowohl vollständige Antikörper als auch deren Fragmente
verstanden.
Als Immunogen, Screeningreagenz bei der Auswahl der mono
klonalen Antikörper, Standardmaterial im Immunoassay und
Polyhapten beim TINIA-Test wird ein Antigen eingesetzt, das
die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO 1: MADGSSDAAREPRPAPAPIRRRSSNYRAYA
oder eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren
Länge enthält.
Als besonders geeignet haben sich die Antigene erwiesen, die
die Aminosäuresequenzen
SEQ ID NO 2: MADGSSDAAR
SEQ ID NO 3: SDAAREPRPA
SEQ ID NO 4: EPRPAPAPIR
SEQ ID NO 5: PAPIRRRSSNY
SEQ ID NO 6: MADGSSDAAREPRPAPAPIRRRSSNY
SEQ ID NO 7: APAPIRRRSSNY
SEQ ID NO 8: PAPIRRRSSNY
SEQ ID NO 3: SDAAREPRPA
SEQ ID NO 4: EPRPAPAPIR
SEQ ID NO 5: PAPIRRRSSNY
SEQ ID NO 6: MADGSSDAAREPRPAPAPIRRRSSNY
SEQ ID NO 7: APAPIRRRSSNY
SEQ ID NO 8: PAPIRRRSSNY
enthalten.
Die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 entspricht den 30 N-termi
nalen Aminosäuren des humanen cardialen TnI. Die Sequenz von
humanem TnIc ist aus Vallins et al., FEBS Letters 270 (1990)
57-61 bekannt. Es war allerdings überraschend, daß durch die
Verwendung von Antikörpern, die mittels Peptidimmunogenen
hergestellt wurden, die die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1
oder eine Teilsequenz davon mit mindestens 6 Aminosäuren
Länge enthalten, Herzmuskelnekrosen schon kurz nach dem
Infarktereignis nachgewiesen werden konnten. In einigen
Fällen gelingt es, erhöhte Serumwerte mit dem erfindungs
gemäßen Verfahren schon 30 bis 45 Minuten nach Beginn von
Thoraxschmerzen mit Herzbeteiligung festzustellen. Mit den
bisher üblichen Immunoassays konnten Herzmuskelnekrosen erst
mit Sicherheit 10 Stunden nach dem Infarktereignis nachge
wiesen werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gelingt
dieser Nachweis schon erheblich früher.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Testkit zur
Bestimmung von Herzmuskelnekrosen, der in einem Behältnis
mindestens einen erfindungsgemäßen polyklonalen oder mono
klonalen Antikörper enthält. In mindestens einem weiteren
Behältnis sind die übrigen zur Durchführung des erfindungs
gemäßen Verfahrens notwendigen Komponenten und Reagenzien,
wie beispielsweise die Festphase, die mit Streptavidin be
schichtet sein kann, weitere einfindungsgemäße Antikörper,
die markiert sein können, Polyhaptene, Hilfsstoffe, wie
Puffer oder Entstörreagenzien, enthalten.
Anhand der nachfolgenden Beispiele soll die Erfindung ver
deutlicht werden:
Das Peptid wurde an 180 mg 4-(2′,4′-Dimethoxyphenyl-Fmoc
aminomethyl)-phenoxy Harz mit einer Beladung von 0.45 mMol/g
synthetisiert. Die Sequenz wurde mit einer Kombination von
Fmoc als temporärer und Pmc/tBu/Trt als permanente Schutz
gruppen aufgebaut. Dazu wurden 16 Äquivalente folgender
Aminosäure-Derivate verwendet:
Fmoc-Cys(-Acm)-OH
Fmoc-ε-Aminocapronsäure
2×Fmoc-Pro-OH
Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Ile-OH
3×Fmoc-Arg(-Pmc)-OH
2×Fmoc-Ser(-tBu)-OH
Fmoc-Asn(-Trt)-OH
Fmoc-Tyr(-tBu)-OH.
Fmoc-ε-Aminocapronsäure
2×Fmoc-Pro-OH
Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Ile-OH
3×Fmoc-Arg(-Pmc)-OH
2×Fmoc-Ser(-tBu)-OH
Fmoc-Asn(-Trt)-OH
Fmoc-Tyr(-tBu)-OH.
Die Kopplungsreaktionen erfolgten mit 1.1 Äquivalenten Diiso
propylcarbodiimid/H-Hydrobenzotriazol in Bezug auf die Amino
säurederivate als Aktivierungsreagenzien. Die Kopplungszeiten
betrugen 90 Minuten und wurden mit je 8 äquivalenten Amino
säure-Derivaten zweimal durchgeführt. Die temporäre Schutz
gruppe wurde mittels Piperidin innerhalb von 20 Minuten
abgespalten. Die Reaktionen wurden in Dimethylformamid durch
geführt, für die Waschschritte, die nach den Reaktions
schritten erfolgten, wurde das gleiche Lösungsmittel
verwendet. Die Synthese wurde vollautomatisch an einem
Zinsser SMPS 350 durchgeführt. Die Freisetzung des Peptides
unter Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen, außer Acm,
erfolgte mit einem Gemisch aus 95% Trifluoressigsäure, 3%
Ethandithiol und 2% Anisol innerhalb von 90 Minuten. Die
Abspaltlösung wurde abfiltriert, mit der 10fachen Menge
Diisopropylether versetzt und der Niederschlag abfiltriert.
Der Niederschlag wurde mit Diisopropylether gewaschen, in 20-
%iger Essigsäure gelöst und lyophilisiert. Es fielen 107 mg
weißes Lyophilisat an. Die Reinheit wurde mittels HPLC kon
trolliert (92% Area), die Identität mittels Massenspektro
skopie (MH+: 1603) geprüft.
Abkürzungen:
Abkürzungen:
Abkürzungen: | |
Fmoc-: | |
Fluorenylmethyloxycarbonly- | |
-tBU: | tertiär Butyl- |
Trt-: | Trityl- |
Acm-: | Acetamidomethyl- |
HPLC: | Hochdruckflüssigkeitschromatographie |
Pmc-: | Pentamethylchroman- |
5 Peptidimmunogene, die die Aminosäuren 1-10, 6-15, 11-20,
16-26 und 1-30 des N-terminalen Troponin I umfassen, wurden
unter Verwendung der folgenden Peptide hergestellt:
Peptid 1:
TropI, H(1-10) Cys(-Acm)-NH2 (MADGSSDAARZC)
[Entspricht SEQ ID NO 2]
TropI, H(1-10) Cys(-Acm)-NH2 (MADGSSDAARZC)
[Entspricht SEQ ID NO 2]
Peptid 2:
TropI, Cys(-Acm) 6-15-NH2 (CZSDAAREPRPA)
[Enspricht SEQ ID NO 3)
TropI, Cys(-Acm) 6-15-NH2 (CZSDAAREPRPA)
[Enspricht SEQ ID NO 3)
Peptid 3:
TropI, Cys(-Acm) 11-20) NH₂ (CZEPRPAPAPIR)
[Entspricht SEQ ID NO 4]
TropI, Cys(-Acm) 11-20) NH₂ (CZEPRPAPAPIR)
[Entspricht SEQ ID NO 4]
Peptid 4:
TropI, Cys(-Acm) 16-26-NH2 (CZPAPIRRRSSNY)
[Entspricht SEQ ID NO 5]
TropI, Cys(-Acm) 16-26-NH2 (CZPAPIRRRSSNY)
[Entspricht SEQ ID NO 5]
Peptid 5:
TropI, H (1-30) Cys-NH2 (MADGSSDAAREPRPAPAPIRRRSSNYRAYAC)
[Entspricht SEQ ID NO 1]
TropI, H (1-30) Cys-NH2 (MADGSSDAAREPRPAPAPIRRRSSNYRAYAC)
[Entspricht SEQ ID NO 1]
C: Cys(-Acm)-OH
Z: ε-AHS-OH.
Z: ε-AHS-OH.
Die Synthese wird am Beispiel von TropI, H(1-10)Cys-NH2 mit
der Aminosäuresequenz MADGSSDAARZC beschrieben.
Als Trägerprotein wird Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), das
mit Maleimido-hexanoyl-N-hydroxysuccinimid aktiviert wurde
(KLH-MH, Boehringer Mannheim Biochemica), verwendet.
Alle Lösungen werden vor Gebrauch mit Argon gespült, da die
Acm-Schutzgruppe unter Ausschluß von Sauerstoff abgespalten
wird. 35,4 mg (28 µmol) des Peptids 1 werden in 20 ml 50-
%iger Essigsäure (v/v, pH = 4) gelöst. Dazu gibt man 117 mg
(0,7 mmol) Silberacetat und rührt die Lösung unter Argon im
Dunkeln für 20 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird
für 15 Minuten Argongas eingeleitet, danach 30 Minuten lang
H2S (g). Das restliche H2S-Gas wird durch nochmaliges Ein
leiten vor Argon (10 Minuten) ausgetrieben. Man zentrifugiert
bei 4000 U/min den schwarzen Niederschlag ab und filtriert
die Lösung über einen 0,45 µm Filter. Die Lösung wird 1 : 1 mit
bidest. Wasser verdünnt und lyophilisiert. Die Freisetzung
der SH-Gruppe wird durch Reversed-Phase-HPLC überprüft. Dazu
wird das Peptid mit 6-Maleinimidohexansäure derivatisiert,
Acm-geschütztes und MH-derivatisiertes Peptid lassen sich
dann aufgrund unterschiedlicher Retensionszeit auf der HPLC
unterscheiden (Vydac C18, 5 µm, 300 A, 4,6×250 mm; 0-45% B
in 30 Minuten; A: 0,1% TFA in H2O; B: 0,1% TFA in
Acetonitril/H2O 65 : 35).
Eine Quantifizierung der Sulfhydrylgruppe wurde nach Ellman,
G.L. (1959) Arch. Biochem. Biophys. 82, 70-77 durchgeführt.
Man erhielt 35 mg (97% d. Th.) ungeschütztes Peptid.
Als Trägerprotein wird Maleimidohexanoyl aktiviertes Keyhole
Limpet Hemocyanin (KLH-MH, Boehringer Mannheim Biochemica)
verwendet. Unmittelbar vor der Peptidkopplung wird die
Proteinkonzentration durch BCA-Proteinbestimmung (Bicin
choninic acid, Pierce Company, Rockford, IL, USA) und der MH-
Gehalt von KLH-MH anhand es Ellman′s Testes bestimmt. Zu 16,7
mg (5,4 nmol) KLH-MH mit einer Beladung von 547 MH-Gruppen
pro Äquivalent KLH in 6,6 ml Phosphatpuffer (20 mM K2HPO4, 20
mM KH2PO4, 10 mM CaCl, 0,2% Saccharose, pH7) werden tropfen
weise 10,5 mg (8,8 µmol) des entschützten Peptids in 3 ml
Phosphatpuffer gegeben. Der pH-Wert wird mit verdünnter NaOH
auf 6-7 eingestellt. Die Reaktionsmischung wird über Nacht
bei Raumtemperatur langsam geschüttelt. Zur Abtrennung des
überschüssigen Peptids wird der Reaktionsansatz auf eine Gel
filtrationssäule geladen (AcA 202, 24×4 cm, IBF Bio
technics) und das Protein/Peptid-Konjugat mit oben erwähntem
Phosphatpuffer eluiert.
Die Proteinkonzentration wird wiederum durch BCA bestimmt,
die Peptidkopplungseffizienz mittels Ellman′s Test. Man er
hielt 14,8 mg (72% d. Th.) des Immunogens mit einer Beladung
von 547 Peptid/KLH-MH.
Analog dieser Vorschrift wurden auch alle anderen Peptid-
Immunogene hergestellt.
Balb/c-Mäuse, 8-12 Wochen alt, wurden mit je 100 µg Peptid-
Immunogenen aus dem Beispiel 2, mit komplettem Freund′schem
Adjuvans, intraperitoneal immunisiert. Nach 6 Wochen wurden
drei weitere Immunisierungen in 4wöchigem Abstand durchge
führt. Dabei wurden jeweils 50 µg Immunogen, an Aluminium
hydroxid und Bordetella pertussis adsorbiert, intraperitoneal
verabreicht. Eine Woche nach der letzten Immunisierung er
folgte eine Blutentnahme und die Bestimmung des Antikörper
titers im Serum der Versuchstiere. Bei positivem Verlauf der
Immunisierung wurde fusioniert. Vier Tage vor der Fusionie
rung wurde jeweils noch einmal mit 50 µg Immunogen in
phosphat-gepufferter Kochsalzlösung intravenös immunisiert.
In Anlehnung an Galfre, (Methods in Enyzmology, 73 (1981) und
Köhler, Milstein, Nature 256 (1975), s. 495-497) wurden 1×
108 Milzzellen einer immunisierten Maus mit 2×107 Myelom
zellen (P3x63Ag8-653, ATCC-CRL 8375) gemischt und mit PEG-
Lösung fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden mit 5×104
Zellen pro Vertiefung in 24well-Platten ausplattiert und in
Selektionsmedium kultiviert. Nach 7-10 Tagen, wenn Klon
wachstum sichtbar war, wurde der Kulturüberstand der Primär
kulturen auf Spezifität im ELISA-Verfahren getestet. Die
Primärkulturen, die antigen-spezifische Antikörper ent
hielten, gehen mit Hilfe eines fluoreszenzaktivierenden Zell
sorters (FACS) in die Einzelzellablage. Die erhaltenen Klone
wurden kultiviert und auf Spezifität im ELISA-Verfahren ge
testet. Aus positiven Klonen wurden Hybridoma-Zellinien
etabliert und größere Mengen an Antikörpern, mittels Zell
fermenter beziehungsweise Aszitesproduktion hergestellt.
Für die Bestimmung der Spezifität der Antikörper wurde ein
ELISA-Verfahren als Testprinzip verwendet.
Mikrotiterplatten (Firma Nunc) wurden mit T-RSA (thermisch
aggregiertes RSA) beschichtet und mit 1µg/ml biotinyliertem
Peptid beladen. Nach einem Waschschritt erfolgte die Inkuba
tion der Antikörperprobe. Nach einem erneuten Waschschritt
erfolgte die Inkubation des Nachweisantikörpers, mit poly
klonalem Schaf-anti-Maus-Fcg, Fab-Peroxidase-Konjugat. Nach
einem weiteren Waschschritt wurde die Peroxidaseaktivität mit
Farbsubstrat (ABTS) bestimmt.
Das Peptid wurde an 120 mg 4-(2′,4′-Dimethoxyphenyl-Fmoc
aminomethyl)-phenoxy Harz mit einer Beladung von 0.45 mMol/g
synthetisiert. Die Sequenz wurde mit einer Kombination von
Fmoc als temporärer und Pmc/tBU/Trt/OtBu als permanente
Schutzgruppen aufgebaut. Dazu wurden 16 Äquivalente folgender
Fmoc-Aminosäure-Derivate verwendet:
Met
5×Ala
2×Asp(-OtBu)
Gly
4×Ser(tBU)
5×Arg(-Pmc)
Glu(OtBu)
4×Pro
Ile
Asn(-Trt)
Tyr(-tBu).
5×Ala
2×Asp(-OtBu)
Gly
4×Ser(tBU)
5×Arg(-Pmc)
Glu(OtBu)
4×Pro
Ile
Asn(-Trt)
Tyr(-tBu).
Die Kopplungsreaktionen erfolgten mit 1.1 Äquivalenten Diiso
propylcarbodiimid/N-Hydrobenzotriazol in Bezug auf die Amino
säurederivate als Aktivierungsreagenzien. Die Kopplungszeiten
betrugen 90 Minuten und wurden mit je 8 Äquivalenten Amino
säure-Derivat zweimal durchgeführt. Die temporäre Schutz
gruppe wurde mittels Piperidin innerhalb von 30 Minuten
abgespalten. Die Reaktionen wurden in Dimethylformamid durch
geführt, für die Waschschritte, die nach den Reaktions
schritten erfolgten, wurde das gleiche Lösungsmittel
verwendet. Die Synthese wurde vollautomatisch an einem
Zinsser SMPS 350 durchgeführt. Die Freisetzung des Peptides
unter Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen erfolgte mit
einem Gemisch aus 95% Trifluoressigsäure, 3% Ethandithiol
und 2% Anisol innerhalb von 90 Minuten. Die Abspaltlösung
wurde abfiltriert, mit der 10fachen Menge Diisopropylether
versetzt und der Niederschlag abfiltriert. Der Niederschlag
wurde mit Diisopropylether gewaschen, in 20%iger Essigsäure
gelöst und lyophilisiert. Es fielen 29.5 mg weißes Lyo
philisat an. Die Reinheit wurde mittels HPLC kontrolliert (60
% Area). Das Rohpeptid wurde über eine 20 mm×300 mm RP-
HPLC-Säule (Säulenmaterial: C-18, 5µ, 300 A) mit einem
Gradientensystem von 0% B auf 100% B in 100 Minuten (Puffer
A: 0.1% Trifluoressigsäure in Wasser, Puffer B: 0.1%
Trifluoressigsäure in Wasser/Acetonitril 40 : 60) auf eine
Reinheit lt HPLC von 97% gereinigt.
Nach Vereinigung der Hauptfraktionen, Eindampfen im Wasser
strahlvakuum auf 30% und Lyophilisation wurden 9.75 mg
weißes Lyophilisat erhalten. Die Identität wurde mittels
Massenspektroskopie (MH+: 2827) geprüft.
Abkürzungen | |
Fmoc-: | |
Fluorenylmethyloxycarbonyl- | |
-tBU: | tertiär Butyl- |
-Trt: | Trityl- |
-OtBu: | tertiär Buthylester |
HPLC: | Hochdruckflüssigkeitschromatographie |
Pmc-: | Pentamethylchroman- |
Boc-: | tertiär Butyloxycarbonyl. |
Das Peptid wurde an 30 mg 4-(2′,4′-Dimethoxyphenyl-Fmoc
aminomethyl)-phenoxy Harz mit einer Beladung von 0.45 mMol/g
synthetisiert. Die Sequenz wurde mit einer Kombination von
Fmoc als temporärer und Pmc/tBU/Trt/DmTr/Boc als permanente
Schutzgruppen aufgebaut. Dazu wurden 16 Äquivalente folgender
Fmoc-Aminosäure-Derivate verwendet:
DmTR-Biotin
Boc-Lys(-Fmoc)-OH
2×Fmoc-βAla-OH
Fmoc-ε-Aminocapronsäure
2×Fmoc-Ala-OH
2×Fmoc-Pro-OH
Fmoc-Ile-OH
3×Fmoc-Arg(-Pc)-OH
2×Fmoc-Ser(-tBU-OH
Fmoc-lAsn (-Trt)-OH
Fmoc-Tyr(-tBu)-OH.
Boc-Lys(-Fmoc)-OH
2×Fmoc-βAla-OH
Fmoc-ε-Aminocapronsäure
2×Fmoc-Ala-OH
2×Fmoc-Pro-OH
Fmoc-Ile-OH
3×Fmoc-Arg(-Pc)-OH
2×Fmoc-Ser(-tBU-OH
Fmoc-lAsn (-Trt)-OH
Fmoc-Tyr(-tBu)-OH.
Die Kopplungsreaktionen erfolgten mit 1.1 Äquivalenten
Diisopropylcarbodiimid/N-Hydrobenzotriazol in Bezug auf die
Aminosäurederivate als Aktivierungsreagenzien. Die Kopplungs
zeiten betrugen 90 Minuten und wurden mit je 8 Äquivalenten
Aminosäure-Derivat zweimal durchgeführt. Die temporäre
Schutzgruppe wurde mittels Piperidin innerhalb von 20 Minuten
abgespalten. Die Reaktionen wurden in Dimethylformamid durch
geführt, für die Waschschritte, die nach den Reaktions
schritten erfolgten, wurde das gleiche Lösungsmittel
verwendet. Die Synthese wurde vollautomatisch an einem
Zinsser SMPS 350 durchgeführt. Die Freisetzung des Peptides
unter Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen erfolgte mit
einem Gemisch aus 95% Trifluoressigsäure, 3% Ethandithiol
und 2% Anisol innnerhalb von 90 Minuten. Die Abspaltlösung
wurde abfiltriert, mit der 10-fachen Menge Diisopropylether
versetzt und der Niederschlag abfiltriert. Der Niederschlag
wurde mit Diisopropylether gewaschen, in 20%iger Essigsäure
gelöst und lyophilisiert. Es fielen 22,5 mg weißes Lyo
philisat an. Die Reinheit wurde mittels HPLC kontrolliert (82
% Area), die Identität wurde mittels Massenspektroskopie
(MH+: 1996) geprüft.
Abkürzungen | |
Fmoc-: | |
Fluorenylmethyloxycarbonyl- | |
-tBU: | tertiär Butyl- |
-Trt: | Trityl- |
HPLC: | Hochdruckflüssigkeitschromatographie |
DmTr: | Dimethoxyltrityl |
Boc-: | tertiär Butyloxycarbonyl |
Claims (10)
1. Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Herzmuskel
nekrosen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probe mit
mindestens einem Antikörper, der das N-terminale Peptid
von kardialem Troponin I erkennt und erhältlich ist
durch Immunisierung mit einem Immunogen, das die Amino
säuresequenz SEQ ID NO 1 oder Teilsequenzen davon mit
mindestens 6 Aminosäuren Länge enthält, und Isolierung
des polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers aus dem
Serum bzw. den immortalisierten und klonierten Milz
zellen der immunisierten Tiere nach bekannten Verfahren,
versetzt und den sich bildenden Komplex in geeigneter
Weise nachweist.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das Immunogen eine der Aminosäuresequenzen
SEQ ID NO 2-8 enthält.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die immunologische Bestimmung nach dem Prinzip eines
Sandwich-Assays erfolgt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die immunologische Bestimmung nach dem Prinzip eines
kompetitiven Immunoassays erfolgt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die immunologische Bestimmung nach dem Prinzip eines
homogenen Immunoassays, wie beispielsweise einem CEDIA®
erfolgt.
6. Antikörper, der das N-terminale Peptid von kardialem
Troponin I erkennt und erhältlich ist durch Immuni
sierung mit einem Immunogen, das die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO 1 oder Teilsequenzen davon mit mindestens 6
Aminosäuren Länge enthält, und Isolierung des Anti
körpers aus dem Serum der immunisierten Tiere nach
bekannten Verfahren.
7. Monoklonaler Antikörper, der das N-terminale Peptid von
kardialem Troponin I erkennt und erhältlich ist durch
Immunisierung mit einem Immunogen, das die Sequenz SEQ
ID NO 1 oder Teilsequenzen davon mit mindestens 6 Amino
säuren Länge enthält, Immortalisierung der Milzzellen
der immunisierten Tiere, Klonierung derjenigen
immortalisierten Zellen, die den gewünschten Antikörper
produzieren und Isolierung des Antikörpers aus den
klonierten Zellen nach bekannten Verfahren.
8. Verwendung eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 4
oder 5 zur immunologischen Bestimmung von Herzmuskel
nekrosen.
9. Verwendung eines Immunogens, das die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequenz davon mit mindestens 6
Aminosäuren Länge enthält zur Herstellung von poly
klonalen oder monoklonalen Antikörpern, als Standard
material bei Immunoassays oder als Polyphapten in
kompetitiven Immunoassays.
10. Testkit zur Bestimmung von Herzmuskelnekrosen, dadurch
gekennzeichnet, daß in einem Behältnis mindestens ein
Antikörper gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7 und in
mindestens einem weiteren Behältnis die übrigen für den
Immunoassay notwendigen Komponenten enthalten sind.
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Also Published As
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