DE69033033T2 - Verbesserte kontrollverfahren für stabile blutkoagulation - Google Patents

Verbesserte kontrollverfahren für stabile blutkoagulation

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf die Blutkoagulation und insbesondere auf verbesserte Blutkoagulationskontrollmittel, welche eine ausgezeichnete Stabilität und des weiteren Sensitivität bezüglich der Variation von in den Koagulationstests verwendeten Reagenzien zeigen.
  • Der Bedarf für stabile und zuverlässige Blutkoagulationsmittel ist gut dokumentiert. Die fortgesetzte und erhöhte Verwendung von oralen Antikoagulationsmitteln zur Behandlung und zum Management von unterschiedlichen thrombo-embolytischen Bedingungen ist heutzutage mehr denn je eine Antriebskraft für deren Entwicklung. Wie bekannt ist, kann eine Überdosierung von Antikoagulationsmitteln, üblicherweise von Cumann-Derivaten, zu ernsthaften Komplikationen, einschließlich Blutungen von Magengeschwüren sowie von anderen gastrointestinalen Komplikationen führen. Auf der anderen Seite reduziert oder eliminiert die Aufrechterhaltung eines zu geringen Levels von Antikoagulationsmitteln die Wirksamkeit der vorbeschriebenen Behandlung.
  • Es ist daher extrem wichtig, daß die Niveaus von Antikoagulationsmitteln zuverlässig angezeigt werden und dementsprechend hat ein ausgedehnter Wissenschaftskörper dokumentierende Versuche derjenigen dieses Gebietes entwickelt, um stabile und zuverlässige Kontrollmittel sowie auch von Reagenzien zur Unterstützung der Anzeige der Aktivität der Antikoagulationsmittel zu erzeugen.
  • Beispielsweise offenbart das US-Patent Nr. 3,947,378 von Babson ein Verfahren zur Erzeugung eines Kontrollplasmas mit einem Mangel der Faktoren II, VII, IX, X, welches die Behandlung des Plasmas mit 20 bis 22 Gew.-% von Bariumsulfat bei Umgebungstemperatur und anschließender Entfernung des Adsorbtionsmittels von dem adsorbierten Plasma einschließt. Das Babson-Patent berichtet, daß abnormale Kontrollplasmen, die durch Mischen des derart adsorbierten Plasmas mit normalem Plasma hergestellt wurden, nach einer Rekonstituierung stabiler sind und gleichmäßigere Ergebnisse in dem aktivierten Partial-Thromboplastinzeit (APTT)-Verfahren nach einer Lagerung von bis zu acht Stunden oder mehr ergaben.
  • S. Zucker, M.H. Cathey und B. West, Preparation of Quality Control Specimens for Coagulation, Amer. J. Clin. Path., Juni 1970, Vol. 53, Seiten 924 bis 927, berichtet über ein Verfahren zur Herstellung lyophilisierter Plasmaproben zur Verwendung als Qualitätskontrollmittel in Koagulationstestverfahren. Zucker et al. berichten über die Pufferung der Plasmaproben mit N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES), über welche berichtet wurde, daß sie eine pH- und Enzymstabilität für Prothrombinzeiten von acht Stunden bei 25ºC bereitstellt. In einem Artikel von M. Brozovic, D.J. Howarth, L.P. von Halem Visser und E.A. Loeliger, Stability of Freeze-Dried Plasma Prepared from Patients on Oral Anticoagulants, Journal of Clinical Pathology, 1973, Vol. 26, Seiten 857 bis 963, wird über die Eignung von gefriergetrockneten Plasmen von Patienten in oralen Antikoagulationsmitteln, um als Referenzmaterial bei der Kalibrierung von Thromboplastinen, die bei der Kontrolle von oralen Antikoagulationsmittelbehandlungen verwendet werden, zu dienen. Die Autoren untersuchten Plasmas aus verschiedenen Plasmaquellen, die dadurch entwickelt wurden, daß von jedem Patienten 4,5 ml Blut in 0,5 ml einer Lösung gesammelt wurde, die durch Kombination von 44,62 g von HEPES-Puffer, 38,00 g Trinatriumcitrat (2H&sub2;O) und 0,5 ml Aprotinin TRASYLOL (1000 u/ml) hergestellt wurde und dann mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt wurde. Einzelne Proben sowie auch die nachfolgend bereitgestellten Proben wurden zentrifugiert, wonach 1 ml von 10%igen Natriumazid je Liter Plasma zugegeben wurde. Proben der hergestellten Plasmen wurden dann entweder gefroren oder gefriergetrocknet. Die Autoren berichteten, daß die gefriergetrockneten Plasmen von Patienten mit oralen Antikoagulationsmitteln verwendet werden konnten, um Thromboplastine zu kalibrieren, vorausgesetzt, daß diese unmittelbar nach der vollständigen Rekonstituierung verwendet wurden oder bei 4ºC zur Verwendung innerhalb von vier bis sechs Stunden der Rekonstituierung gehalten wurden. Die Autoren berichteten des weiteren, daß deren Plasmaproben im allgemeinen unterschiedliche Niveaus und Typen von Instabilität nach der Rekonstituierung und Lagerung bei 4ºC, 22ºC und 37ºC zeigten. Es wurde allgemein berichtet, daß diese Instabilität nach ungefähr 24 Stunden bei den beiden tieferen Temperaturen und nach ungefähr vier bis sechs Stunden bei der höheren Temperatur von 37ºC auftraten.
  • Das US-Patent Nr. 4,007,008 von Becker et al. beschreibt ein Verfahren zur Reduzierung der Enzymaktivitäten in tierischem Serum oder Plasma, beinhaltend die Schritte der Erhöhung des pH-Wertes von diesem auf ein Niveau von ungefähr dem von normalem Serum durch Zugabe einer Base und anschließenden Abbruch der Reaktion oder Reduktion der Enzymaktivitäten durch Neutralisierung des Serums oder Plasmas mit einem sauren Medium.
  • Ein weiterer allgemeiner Stand der Technik ist in dem US-Patent Nr. 3,799,885 von Dennis et al. zu finden, welches ein Calciumchloridtestreagenz offenbart, das mit HEPES-Puffer gepuffert ist und welches speziell für die Verwendung bei der Überwachung der Heparintherapie angepaßt ist; in dem US-Patent Nr. 4,301,028 von Bartl et al., welches über ein Kontrollreagenz zur Bestimmung der Heparinaktivität berichtet; in dem US-Patent Nr. 4,116,336 von Sorenson et al., welches eine Packung, enthaltend eine synthetische Referenzflüssigkeit zur Qualitätskontrolle und/oder Kalibrierung von Blutgas-Meßeinrichtungen betrifft; und in P.S. Roberts, H.N. Hughes und P.B. Fleming, The Effects of Hepes Buffer on Clotting Tests. Assay of Factors V and VIII and on the Hydrolysis of Esters by Thrombin and Thrombokinase, Thrombos, Haemostas, (Stuttg.), 1976, Band 35, Seite 202, worin die Autoren über die schnel lere Gerinnung bei Anwesenheit von 50 mM HEPES-Puffer berichten.
  • Ein anderer Aspekt der vorbekannten Kontrollplasmen ist, daß die Mehrzahl von diesen, insbesondere der kommerziell verfügbaren, aus Plasma von Primaten bestehen oder dieses auf andere Weise enthalten, am meisten üblich menschliches Plasma. Diese Plasmen weisen Nachteile dahingehend auf, daß sie instabile Human-Faktoren enthalten, insbesondere die Faktoren V und VIII, und ebenso für den Hersteller oder Verwender der Kontrollmittel ein größeres Risiko darstellen, da sie aktive Aids- oder Hepatitisviren enthalten können.
  • EP-A-0005243 (HOFFMANN-LA ROCHE AG) offenbart ein Kontrollplasma, welches aus dem Blut von Tieren, wie zum Beispiel Schafen, welche mit Antikoagulationsmitteln vorbehandelt wurden, erzeugt ist.
  • EP-A-0014349 (BOEHRINGER MANNHEIM GMBH) offenbart einen Standard für die Bestimmung der Heparinaktivität enthaltend Heparin, Antithrombin III, Serumalbumin, EDTA, Sucrose, Aprotinin und einen Puffer.
  • US-A-4056484 (BEHRINGER AG) offenbart ein gefriergetrocknetes Blutplasma enthaltend ein Antikoagulationsmittel, welches unter wenigstens 5º Kohlendioxid luftdicht verschlossen ist.
  • Angesichts der umfangreichen Literatur und anderen Arbeiten, die Plasmen zur Kontrolle der Koagulation betreffen, besteht nach wie vor ein Bedarf für ein Koagulationskontrollverfahren, welches eine erhöhte Stabilität hinsichtlich der einstufigen Prothrombin-Zeiten (PT), aktivierten partiellen Thromboplastin-Zeiten (APTT) und Faktor V- und VIII-Aktivitätswerten sowie eine erhöhte Empfindlichkeit bezüglich Veränderungen in den angewandten Gerinnungstestreagenzien zeigen. Gewisse Formen von verbesserten Kontrollverfahren würden ebenso signifikant das Risiko einer Aids- oder Hepatitiskontraktion der jeweiligen Hersteller oder Anwender eliminieren.
  • Die Erfindung des Anmelders in ihren unterschiedlichen Aspekten bezieht sich auf diese Sachverhalte.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Dementsprechend bezieht sich eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung des Anmelders auf ein stabiles Koagulationskontrollplasma enthaltend ein Blutplasma eines Nicht-Primaten und wirksame Gehalte von (a) eines Puffers zur Aufrechterhaltung eines physiologischen pH-Wertes, (b) einen Proteaseinhibitor und (c) ein geeignetes stabilisierendes Kohlenhydrat. Gemäß einem bevorzugten Gesichtspunkt weist das Kontrollmittel eine Gesamtplasmakomponente auf, die im wesentlichen aus Nicht-Primatenplasma besteht.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung des Anmelders bezieht sich auf ein Koagulationskontrollplasma mit hohen stabilisierten Gehalten von Faktor V und VIII. Dieses Kontrollplasma enthält Nicht-Primatenplasma und wenigstens ca. 2 Gew.-% eines geeigneten Kohlenhydrates. Das Plasma dieser Ausführungsform wird aus Blut erhalten, welches direkt aus einer tierischen Quelle in einer Lösung aufgefangen wurde, die einen Puffer zur Aufrechterhaltung eines physiologischen pH- Wertes, einen Proteaseinhibitor und Citrat enthält. Das Kohlenhydrat in dem Kontrollmittel wird nach der Entfernung der roten Blutkörperchen aus dem Blut zugegeben.
  • Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung des Anmelders bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen Koagulationskontrollplasmas. Dieses Verfahren beinhaltet die nacheinanderfolgenden Schritten des Auffangens des Blutes, aus welchem das Plasma erhalten wird, direkt aus einer tierischen Quelle eines Nicht-Primaten in eine Lösung enthaltend einen Puffer zur Aufrechterhaltung eines physiologischen pH-Wertes, einen Proteaseinhibitor und Citrat; Entfernen der roten Blutkörperchen aus dem Blut und Zugabe eines geeigneten stabilisierenden Kohlenhydrates.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen Koagulationskontrollmittels, welches beinhaltet die Schritte der Zurverfügungstellung von Blutplasma von Nicht-Primaten und der Zugabe von wenigstens einem gereinigten und stabilisierten Koagulationsfaktor zu dem Blutplasma.
  • Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindungen
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung des Anmelders bezieht sich auf ein stabiles Koagulationskontrollplasma, welches Blutplasma von einem Nicht-Primaten enthält sowie wirksame Gehalte von (a) einem Puffer zur Aufrechterhaltung eines physiologischen pH-wertes, (b) einen Proteaseinhibitor und (c) ein geeignetes stabilisierendes Kohlenhydrat. Es ist anzumerken, daß ein Kohlenhydrat, wie es hier eingesetzt wird, H-O-Verhältnisse von 2 : 1 aufweisen würde, wie es allgemein verstanden wird.
  • Bezüglich der Plasmaarten, welche für diese Ausführungsform geeignet sind, werden Nicht-Primatenplasmen verwendet. Primatenplasma kann mit Nicht-Primatenplasma kombiniert werden.
  • Derzeit bevorzugte Plasmen sind menschliches, Rinder-, Schweine-, Pferde- und Kaninchenplasmen, obwohl andere Plasmen einschließlich zum Beispiel Ziegen- und Schafplasmen verwendet werden können. Des weiteren können in dieser Ausführungsform der Erfindung diese Plasmen in jeder geeigneten bekannten Art und Weise gesammelt werden.
  • Bezüglich der Zusammensetzung des Blutplasmas in dem Kontrollmittel können verschiedene tierische Plasmen einzeln oder in Kombination, adsorbiert oder nicht adsorbiert, verwendet werden. In den meisten Fällen hat der Anmelder derzeit jedoch bevorzugt, die Plasmen von zwei oder mehr Tierarten zu kombinieren. Da verschiedene Tiere verschiedene Level und verschiedene Stabilitäten der jeweiligen Koagulationsfaktoren haben, können unterschiedliche Tierplasmen ausgewählt und kombiniert werden, um die Verhältnisse der Koagulationsfaktoren in dem Kontrollmittel einzustellen und damit ebenso die Stabilität des Kontrollmittels und die Gerinnungszeiten der PT, APTT und anderer Tests einzustellen.
  • So wird beispielsweise infolge der jeweiligen besonderen Gehalte an Koagulationsbestandteilen Kaninchenplasma verwendet, um PT-werte zu verkürzen, Schweineplasma wird verwendet, um APTT-Werte nicht aber PT-Werte zu verkürzen, Rinderplasma wird verwendet, um hohe Gehalte von Faktor V zu liefern, und Pferdeplasma wird verwendet, um den APTT-Wert zu verlängern, nicht aber den PT-Wert. Unter Anwendung dieser Prinzipien war der Anmelder dazu in der Lage, wie gewünscht, Kontrollplasmen herzustellen, die besondere Bereiche (zum Beispiel normal oder abnormal) von PT- und APTT-Werten zeigten. Die Gerinnungszeiten können daher präzise entsprechend den Arten und Verhältnissen der verwendeten Plasmen eingestellt werden.
  • Von den bevorzugten Kontrollplasmen, welche bisher hergestellt wurden, zeigte es sich, daß vier mehr bevorzugt waren. Das erste zeigt PT- und APTT-Werte im normalen Bereich und hat eine Gesamtplasmakomponente bestehend aus Schweine-, Rinder- und Kaninchenplasma in einem Volumenverhältnis von ungefähr 1 : 6 : 3. Das zweite hat PT- und APTT-werte im abnormalen Bereich und hat eine Gesamtplasmakomponente bestehend aus Schweineplasma adsorbiert mit Aluminiumhydroxidgel und Rinderplasma in einem Volumenverhältnis von ungefähr 35 : 1. Das dritte Plasma zeigt ebenfalls PT- und APTT-Zeiten im abnormalen Bereich und hat eine Gesamtplasmakomponente bestehend aus Schweineplasma absorbiert mit Aluminiumhydroxidgel.
  • Diese drei ersten mehr bevorzugten Plasmen haben den Vorteil, daß sie das Risiko von HIV- oder Hepatitis-Virusinfektionen von denen, die diese herstellen und/oder verwenden, signifikant reduzieren, da die einschlägigen Viren in den Nicht-Primatenplasmen nicht anwesend sind. Weitere Vorteile beziehen sich auf die hohen und stabilen Gehalte an Koagula tionsfaktoren, die diese Plasmen zur Verfügung stellten. In dieser Hinsicht versteht sich, daß ähnliche Vorteile so lange erhalten werden können wie das Nicht-Primatenplasma wenigstens einen wesentlichen Anteil an der Gesamtplasmakomponente des Kontrollmittels darstellt und somit sind derartige Kontrollplasmen auch ein bevorzugter Aspekt dieser Erfindung, sowie auch Kontrollmittel, deren Plasmakomponenten im wesentlichen aus Nicht-Primatenplasmen bestehen.
  • Das vierte mehr bevorzugte Kontrollmittel weist eine Plasmakomponente bestehend aus normalen menschlichen-, Rinder- und Kaninchenplasma in einem jeweiligen Volumenverhältnis von ca. 2 : 2 : 1 auf.
  • Bezüglich des Puffers wurde bisher HEPES-Puffer bevorzugt obwohl viele andere Puffer, zum Beispiel TRIS, bekannt und geeignet sind. Der bevorzugte HEPES-Puffer war Heminatrium HEPES, welches vorzugsweise in dem Kontrollmittel in einem Gehalt von wenigstens ca. 0,08 M und vorzugsweise in Gehalten über 0,05 anwesend ist.
  • Bezüglich der Gehalte und Arten von Proteaseinhibitoren und Kohlenhydraten war es bisher bevorzugt, daß der Inhibitor und das Kohlenhydrat in dem Kontrollmittel in Gehalten von wenigstens ca. 0,5 U/ml und 2 Gew.-% anwesend war. Der bevorzugte Proteaseinhibitor war Aprotinin, obwohl andere derartige Proteaseinhibitoren, zum Beispiel Sojabohnen-Trypsin-Inhibitoren, bekannt und geeignet sind. Die bis heute bevorzugten stabilisierenden Kohlenhydrate waren Saccharide, insbesondere Sucrose, obwohl andere gut bekannte Kohlenhydrate ebenso verwendet werden können. Des weiteren war es bisher mehr bevorzugt, daß die in dem Kontrollmittel anwesende Sucrose in einem Gehalt von ca. 5 Gew.-% anwesend ist.
  • Bezüglich der weiteren Komponenten des Kontrollplasmas dieser bevorzugten Ausführungsform war es ebenfalls bevorzugt, daß das Kontrollplasma Thimerosal in einem Gehalt von vorzugsweise wenigstens ca. 0,02 Gew.-% und/oder Natriumazid in einem Ge halt von vorzugsweise wenigstens ca. 0,08 Gew.-% enthält.
  • Um eine Charge des Kontrollplasmas zu formulieren, wurden ungefähr ein Teil (Volumenteile) der von dem Anmelder bevorzugten puffernden und konservierenden Lösung, welche im untenstehenden Beispiel 1 beschreiben ist, mit ca. 9 Teilen Plasma kombiniert. Bisher mehr bevorzugt war, ungefähr 1 Teil der von dem Anmelder bevorzugten puffernden Konservierungslösung mit ca. 9 Teilen des gemischten oder unvermischten tierischen Nicht-Primatenplasmas zu kombinieren.
  • Weitere Details der Herstellung der Kontrollplasmen nach dieser bevorzugten Ausführungsform sowie Details bezüglich deren Stabilität sind in den untenstehenden Beispielen 1 bis 6 und den Tabellen 1 bis 3 zu finden. Insgesamt sind die Kontrollplasmen dieser Ausführungsform im allgemeinen bewiesenermaßen stabil, was bedeutet, daß die APTT- und PT-Analysen sich nicht um mehr als 10% für wenigstens ca. drei Tage bei Raumtemperatur oder wenigstens ca. acht Stunden bei 37ºC veränderten.
  • Des weiteren haben die Koagulationskontrollverfahren dieser bevorzugten Ausführungsform, wie insbesondere detailliert in dem untenstehenden Beispiel 6 dargestellt ist, eine erhöhte Empfindlichkeit auf Änderungen in den in den Gerinnungszeittests verwendeten Reagenzien gezeigt. Beispiel 6 zeigt detailliert Experimente, in welchen eine entsprechend dieser Ausführungsform hergestellte Koagulationskontrollprobe gegen ein kommerziell erhältliches Plasma, Citrol I, und frisches normales menschliches Plasma bezüglich der Empfindlichkeit auf Verdünnungen des Thromboplastinreagenzes in dem PT-Test getestet wurde. Wie die mitgeteilten Ergebnisse zeigen, zeigt das gemäß der Erfindung des Anmelders hergestellte Kontrollmittel hierbei eine erhöhte Empfindlichkeit auf die variierenden Verdünnungen von Thromboplastinen.
  • Wie ausgeführt, beinhaltet eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Koagulationskontrollplasma mit hohen stabilisierten Levels von Faktor V und VIII. Dieses Kontrollplasma enthält Plasmen, die aus Blut erhalten wurden, welches direkt aus einer tierischen Quelle eines Nicht-Primaten in eine Auffanglösung enthaltend einen Puffer zur Aufrechterhaltung eines physiologischen pH-Wertes, einen Proteaseinhibitor und Citrat enthält, und zu welcher nach Entfernung der roten Blutkörperchen wenigstens ca. 2 Gew.-% eines geeigneten stabilisierten Kohlenhydrates zugefügt wurden.
  • Obwohl andere verwendet werden können, ist bisher der bevorzugte Puffer, in welchem das Blut aufgefangen wurde, HEPES- Heminatrium, und der bevorzugte Proteaseinhibitor war Abrotinin. Es war ebenso bevorzugt, daß das HEPES-Heminatrium und das Aprotinin in der Auffanglösung in jeweiligen Gehalten von wenigstens ca. 0,25 M und 5 U/ml anwesend waren. Citrat kann in der Auffanglösung in geeigneten Mengen vorliegen, wie dies bekannt ist. Bisher jedoch war es bevorzugt, daß Natriumcitrat in einem Gehalt von ca. 3 Gew.-% vorlag. Wenn diese bevorzugten Gehalte von HEPES-Heminatrium, Aprotinin und Citrat verwendet wurden, wurden vorzugsweise ca. neun Teile (Volumenteile) in ca. einem Teil der Auffanglösung aufgefangen.
  • Das Kohlenhydrat kann in fester Form oder in Lösung zugefügt werden. Das bevorzugte Kohlenhydrat war wiederum Sucrose, welches nach der Entfernung der roten Blutkörperchen von dem Plasma durch Zentrifugieren oder andere geeignete Verfahren entfernt wurde. Des weiteren war es mehr bevorzugt, Sucrose bis zu einem Gehalt von ca. 5 Gew.-% in dem Kontrollmittel zuzugeben. Falls gewünscht, kann ein zusätzlicher physiologischer pH-Puffer ebenfalls zugegeben werden (als Feststoff oder in Lösung), um einen gewünschten Gehalt in dem endgültigen Kontrollmittel zu bewirken. Vorzugsweise enthielt das endgültige Kontrollmittel Thimerosal (vorzugsweise wenigstens ca. 0,02 Gew.-%) und Natriumazid (vorzugsweise wenigstens ca. 0,08 Gew.-%). Thimerosal und/oder Natriumazid können in der Auffanglösung anfänglich zugegen sein oder können später als Feststoff oder in Lösung zugegeben werden.
  • Der Anmelder hat entdeckt, daß gemäß dieser Ausführungsform hergestellte bevorzugte Plasmen sehr hohe Gehalte an Faktor V und VIII enthielten. Des weiteren wurde vom Anmelder gefunden, daß die derart produzierten Faktor V- und Faktor VIII-Gehalte sowohl bei Raumtemperatur (für wenigstens ca. drei Tage) und bei ca. 37ºC (für wenigstens ca. acht Stunden) hochstabil waren.
  • Plasmen, welche für diese Ausführungsform der Erfindung geeignet sind, schließen Primaten- und Nicht-Primatenplasmen ein, wobei bevorzugte Plasmen Rinder-, Schweine-, Kaninchen-, Pferde- und menschliche Plasmen sind. Das Primatenplasma wird in Kombination mit Nicht-Primatenplasma eingesetzt. Weitere Details der Herstellung der Kontrollplasmen nach dieser Ausführungsform können in den untenstehenden Beispielen 7 bis 11 gefunden werden.
  • Eine andere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen Koagulationskontrollmittels. Wie oben ausgeführt, beinhaltet dieses Verfahren die nacheinander folgenden Schritte von (a) Sammeln des Blutes enthaltend das in dem Kontrollmittel zu verwendende Plasma direkt von einer tierischen Nicht-Primatenquelle in eine Lösung enthaltend einen Puffer, der wirksam ist, einen physiologischen pH-Wert aufrechtzuerhalten, einen Proteaseinhibitor und Citrat, (b) Entfernen der roten Blutkörperchen aus dem Blut und (c) Zugabe von wenigstens ca. 2 Gew.- % eines geeigneten stabilisierenden Kohlehydrates. Weitere Details dieses bevorzugten Verfahrens sind analog zu denen, die in dem gerade oben diskutierten Ausführungsbeispiel diskutiert wurden und können des weiteren den untenstehenden Beispielen 7 bis 11 entnommen werden.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen Koagulationskontrollplasmas, wobei das Verfahren den Schritt der Bereitstellung von Blutplasma von einem Nicht-Primaten und der Zugabe von wenigstens einem stabilen gereinigten Koagu lationsfaktor zu dem Plasma beinhaltet, um den Gehalt der zu dem Plasma zugegebenen Faktoren zu erhöhen. Wie weiter in dem untenstehenden Beispiel 12 ausgeführt ist, werden besondere Faktoren von unterschiedlichen im Stand der Technik bekannten Tierplasmen gereinigt. Diese gereinigten Faktoren werden dann zu dem Plasma zugegeben, um den Gehalt der zugegebenen Faktoren in dem Plasma zu erhöhen und um die PT- und/oder APTT- Werte einzustellen. Bevorzugte Verfahren beinhalten auch die Zugabe von stabilem gereinigtem Faktor V oder VIII von Rindern oder Schweinen zu Pferde- oder menschlichem Plasma. Des weiteren erwies sich gereinigter aus Pferden stammender Faktor II als besonders stabil und kann zu anderen Plasmen als eine Quelle von stabilem Faktor II zugegeben werden. Insgesamt zeigten die Plasmen, zu welchen die stabilen gereinigten Faktoren zugegeben wurden, eine erhöhte Stabilität bezüglich ähnlicher Plasmen ohne die hinzugegebenen Faktoren.
  • Es wird nun auf einzelne Beispiele und Tabellen Bezug genommen, um die Merkmale der von dem Anmelder bevorzugten Ausführungsformen sowie deren Vorteile und Verbesserungen gegenüber dem Stand der Technik zu beschreiben und zu verstehen. Es versteht sich, daß diese Beispiele lediglich stellvertretend angeführt sind und daß solche zusätzlichen Ausführungsformen und Verbesserungen derselben innerhalb des Griffbereichs und Schutzumfangs der Erfindung des Anmelders sind, wie sie sich dem Durchschnittsfachmann auf diesem Fachgebiet darstellen würden.
  • Die in den folgenden Beispielen wiedergegebenen Faktor V- und VIII-Aktivitätswerte wurden in der herkömmlichen Art und Weise gegen eine aus Verdünnungen von normalem menschlichen Plasma erzeugte Standardkurve berechnet. PT bedeutet die einstufige Prothrombinzeit, APTT bedeutet die aktivierte Partialthromboplastinzeit. Die PT- und APTT-Versuche, über die berichtet wird, wurden in der üblichen Art und Weise durchgeführt.
  • Beispiel 1 Herstellung der bevorzugten Konservierungslösung
  • 100 ml der von dem Anmelder bevorzugten Konservierungslösung wurden durch Mischen von 500 U Aprotinin, ca. 12,5 g HEPES Heminatrium, 0,1 g Thimerosal, 0,5 g NaN&sub3; und 25 g Sucrose und anschließende Zugabe von destilliertem Wasser auf 100 ml hergestellt. Diese Herstellung ergab 100 ml einer Konservierungslösung, welche bestand aus:
  • (a) 0,5 M HEPES Heminatrium;
  • (b) 0,1% Thimerosal;
  • (c) 25% Sucrose;
  • (d) 0,5% Natriumazid; und
  • (e) 500 U Aprotinin.
  • Beispiel 2 Normalbereichskontrollmittel auf Nicht-Primatenbasis (Level 1)
  • Ein Versuchtsansatz (nachfolgend als P1 bezeichnet) von einem Kontrollmittel auf Nicht-Primatenbasis wurde hergestellt, welches PT- und APTT-Werte im normalen Bereich zeigte. Insbesondere wurden 54 ml Rinderplasma, 9 ml Schweineplasma und 27 ml Kaninchenplasma mit 10 ml der bevorzugten Konservierungslösung nach Beispiel 1 versetzt. Die ursprünglichen PT- und APTT-Werte betrugen 11,0 und 24,1 Sekunden. Der Versuchsansatz wurde in 1,0 ml-Portionen geteilt, welche in einzelne Ampullen gegeben und auf herkömmliche Art und Weise lyophilisiert wurden. Eine Ampulle des P1-Kontrollplasmas wurde am nächsten Tag mit destilliertem Wasser rekonstituiert, wonach sie einen PT-Wert von 11,0 Sekunden und einen APTT-Wert von 24,1 Sekunden zeigte. Ähnlich rekonstituierte P1-Ampullen wurden bei Raumtemperatur (ca. 25ºC) für bis zu fünf Tage belassen, wobei jeden Tag jeweils eine hinsichtlich der PT- und APTT-Werte untersucht wurde. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 dargestellt und zeigen eine ausge zeichnete Stabilität. Tabelle 1
  • Entsprechend überraschende Stabilitäten für Faktoren V und VIII zeigten sich in den P1-Proben. Unmittelbar nach der Rekonstitution zeigten P1-Proben Faktor V- und VIII-Werte von ca. 1000% und 110% der in normalen menschlichen Plasmapools gefundenen Gehalte. Nachdem die rekonstituierten Proben für fünf Tage bei Raumtemperatur belassen wurden, zeigten sie einen Faktor V-Wert von ca. 1100% und einen Faktor VIII-Wert von ca. 90%.
  • Beispiel 3 Abnormales Bereichskontrollmittel auf Nicht-Primatenbasis (Level 2)
  • Ein zweiter Versuchsansatz (P2) von Kontrollplasma wurde durch Kombination von 175 ml adsorbiertem Schweineplasma, 5 ml Rinderplasma und 20 ml der von dem Anmelder bevorzugten, wie in Beispiel 1, oben, hergestellten Konservierungslösung erzeugt. Dieser Ansatz wurde so hergestellt, daß dieser abnormale Gerinnungszeiten mit ursprünglichen PT- und APTT-Werten von 21,1 und 40,8 aufwies. Der P2-Ansatz wurde geteilt und in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 2, oben, beschrieben, der P1-Ansatz geteilt und lyophilisiert. Nach der Rekonstitution mit destilliertem Wasser ergab eine Ampulle des P2-Ansatzes einen PT-Wert von 20,1 und einen APTT-Wert von 41,4 Sekunden.
  • Analog zu den Stabilitätstests der rekonstituierten Proben nach Beispiel 2 wurden verschiedene rekonstituierte P2-Ampullen bei Raumtemperatur für bis zu fünf Tage stehengelassen, wobei jeden Tag jeweils eine bezüglich der PT- und APTT-Werte untersucht wurde. Tabelle 2, unten, führt die Ergebnisse weiter fort, welche wieder eine erhöhte Stabilität zeigen. Tabelle 2
  • Beispiel 4 Kontrollmittel im abnormalen Bereich auf Nicht-Primatenbasis (Level 3)
  • Ein dritter Versuchsansatz (P3) von Kontrollplasma wurde durch Kombination von 90 ml adsorbierten (mit Aluminiumhydroxidgel) Schweineplasma mit 10 ml der von dem Anmelder bevorzugten, entsprechend Beispiel 1, oben, hergestellten Konservierungslösung hergestellt.
  • Anfängliche PT- und APTT-Werte von 41,3 und 69,6 wurden für dieses P3-Material beobachtet. Das P3-Material wurde dann geteilt und wie die P1- und P2-Versuchsmaterialien der Beispiele 2 und 3, oben, lyophylisiert. Nach der Rekonstitution und Aufbewahrung bei Raumtemperatur für ca. einen Tag wurde eine Ampulle von P3-Material analysiert. Die PT- und APTT- Werte für dieses rekonstituierte P3-Plasma waren 38,1 und 64,1 und zeigten somit eine gute Stabilität.
  • Beispiel 5 Human/Nicht-Primaten-Bereichskontrollmittel
  • 36 ml normales Humanplasma und 36 ml Rinderplasma wurden mit 18 ml Kaninchenplasma und 10 ml der Konservierungslösung nach Beispiel 1 kombiniert, um einen vierten Versuchsansatz (P4) von Kontrollmaterial zu ergeben. Anfängliche PT- und APTT- Werte waren im normalen Bereich bei 11,4 und 25,7. Auch dieses P4-Plasma zeigte eine gute Stabilität. Bei einer rekonstitu ierten Probe, die für sieben Tage bei Raumtemperatur stehengelassen wurde, wurde ein PT-Wert von 11,5 und APTT-Wert von 29,7 gefunden.
  • Beispiel 6 Empfindlichkeit auf Reagenzienveränderungen
  • In diesem Beispiel wurde die Empfindlichkeit der von dem Anmelder bevorzugten Kontrollplasmen auf Veränderung von Gerinnungszeitreagenzien mit der von frischem, normalem Plasma und der von Citrol I, einem kommerziell erhältlichen und von American Dade vertriebenem Kontrollplasma, verglichen. Der PT- Test wurde bei dieser Bestimmung verwendet. Um die Untersuchung durchzuführen, wurden Reagenzien, bestehend aus 100, 80, 60, 40, 20 und 10% Thromboplastin durch Verdünnen des Thromboplastins unter Verwendung von 0,025 M HEPES-Puffer, pH 7,35, enthaltend 0,154 M Natriumclorid, hergestellt. Diese Reagenzverdünnungen wurden dann verwendet, um die PT-Werte für die drei Testplasmen zu bewerten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3, unten, wiedergegeben. Wie zu sehen ist, zeigt das P1- Kontrollplasmamaterial des Anmelders eine signifikant größere Variation in den PT-Werten, was aus einer größeren Empfindlichkeit auf die Thromboplastinverdünnungen resultiert. Dieser Anstieg in der Empfindlichkeit ermöglicht daher eine wesentlich schnellere Feststellung fehlerhafter Reagenzien als selbst frische Plasmen. Tabelle 3
  • Beispiel 7 Bevorzugte Auffanglösung
  • 100 ml der vom Anmelder bevorzugten Auffanglösung wurden durch Mischen von 500 U Aprotinin, ca. 6,25 g HEPES-Heminatrium und 2,94 g Natriumcitrat und Zugabe von destilliertem Wasser auf 100 ml hergestellt. Diese Herstellung ergab 100 ml der Auffanglösung, welche enthielt:
  • (a) 0,25 M HEPES-Heminatrium
  • (b) 2,94 gm Natriumcitrat
  • (c) 500 U Aprotinin
  • Vorzugsweise ca. 9 Volumenteile Blut wurden in ca. ein Volumenteil dieser bevorzugten Auffanglösung aufgefangen.
  • Beispiele 8 bis 11 Direktes Auffangen in Auffanglösung
  • Um ein Kontrollplasma zu erhalten, welches hohe und stabile Gehalte von Koagulationsfaktoren, insbesondere den Faktoren V und VIII enthalten, wurden die Beispiele 2 bis 6 wiederholt, mit der Ausnahme, daß das verwendete Plasma aus Blut erhalten wurde, welches direkt aus der tierischen Quelle in die von dem Anmelder bevorzugte Auffanglösung nach Beispiel 7 aufgefangen wurde und, nach Entfernung der roten Blutkörperchen, wurden Sucrose, zusätzliches HEPES-Heminatrium sowie Thiomersal und Natriumazid in Mengen zugegeben, um die jeweils gleichen Gehalte wie in den Beispielen 2 bis 6 zu erzielen. Die anfänglichen Faktor V- und VIII-Aktivitätswerte wurden untersucht und besonders hoch verglichen mit Plasmen gefunden, welche in einfache herkömmliche Citrat-versetzte Antikoagulationslösungen aufgefangen wurden. Des weiteren waren die Faktor V- und VIII-Werte durch die pufferende und konservierende Lösung stabilisiert, wie sich in den hohen Faktor V- und VIII-Werten zeigt, die nach der Lyophylisiereung und Rekonstituierung, und nachdem die rekonstituierten Kontrollplasmaproben bei 37ºC für acht Stunden und bei Raumtemperatur für ca. drei Tage stehengelassen wurden, erhalten wurden. PT- und APTT-Werte waren bei Tests ähnlich stabil, nachdem die rekonstituierten Kontrollplasmen diesen Temperatur-/Zeitbedingungen ausgesetzt waren.

Claims (61)

1. Ein stabiles Koagulationskontrollplasma, enthaltend:
ein Blutplasma und
wirksame Gehalte von
- einem Puffer zur Aufrechterhaltung eines physiologischen pH-Wertes,
- einen Proteaseinhibitor, und
- ein geeignetes stabilisierendes Kohlenhydrat,
wobei das aus Blut erhaltene Plasma Nicht-Primatenplasma ist.
2. Kontrollplasma nach Anspruch 1, wobei der Proteaseinhibitor Aprotinin ist.
3. Kontrollplasma nach Anspruch 2, wobei der Puffer HEPES- Puffer ist.
4. Kontrollplasma nach Anspruch 3, wobei das Kohlenhydrat Sucrose ist.
5. Kontrollplasma nach Anspruch 4, zusätzlich enthaltend Natriumazid.
6. Kontrollplasma nach Anspruch 5, zusätzlich enthaltend Thimerosal.
7. Kontrollplasma nach Anspruch 6, wobei der HEPES-Puffer HEPES-Heminatrium ist und der HEPES-Puffer, Aprotinin, Sucrose, Thimerosal und Natriumazid jeweils in Gehalten von wenigstens ca. 0,08 M, 0,5 U/ml, 2 Gew.-%, 0,02 Gew.-% und 0,08 Gew.-% vorhanden sind.
8. Kontrollplasma nach einem der Ansprüche 1, 4 oder 7, bei welchem das Blutplasma Schweine-, Kaninchen-, Rinder-, Pferde-, Schaf- oder Ziegenplasma enthält.
9. Kontrollplasma nach Anspruch 8, bei welchem das Plasma Pferdeplasma enthält.
10. Kontrollplasma nach Anspruch 8, bei welchem das Plasma Kaninchenplasma enthält.
11. Kontrollplasma nach Anspruch 8, bei welchem das Plasma Rinderplasma enthält.
12. Kontrollplasma nach Anspruch 11, bei welchem das Plasma zusätzlich menschliches Plasma enthält.
13. Kontrollplasma nach Anspruch 11, bei welchem das Plasma zusätzlich Kaninchenplasma enthält.
14. Kontrollplasma nach Anspruch 13, bei welchem das Plasma zusätzlich menschliches Plasma enthält.
15. Kontrollplasma nach Anspruch 14, bei welchem die Gesamtblutplasmakomponente des Kontrollmittels wenigstens im wesentlichen aus Kaninchen-, Rinder- und Humanplasma zusammengesetzt ist.
16. Kontrollplasma nach Anspruch 15, bei welchem die Gesamtblutplasmakomponente des Kontrollmittels aus Kaninchen-, Rinder- und Humanplasma besteht.
17. Kontrollplasma nach Anspruch 16, bei welchem das Kaninchen-, Rinder- und Humanplasma in einem Volumenverhältnis von ca. 1 : 2 : 2 vorliegen.
18. Kontrollplasma nach Anspruch 8, bei welchem das Plasma Schweineplasma enthält.
19. Kontrollplasma nach Anspruch 18, bei welchem das Schweineplasma mit Aluminiumhydroxidgel absorbiert und bei welchem die Gesamtblutplasmakomponente des Kontrollmittels zumindest im wesentlichen aus Schweineplasma zusammengesetzt ist.
20. Kontrollplasma nach Anspruch 19, bei welchem die Gesamtblutplasmakomponente des Kontrollmittels aus Schweineplasma besteht.
21. Kontrollplasma nach Anspruch 18, bei welchem das Plasma zusätzlich Rinderplasma enthält.
22. Kontrollplasma nach Anspruch 21, bei welchem die Gesamtblutplasmakomponente des Kontrollmittels zumindest im wesentlichen aus Schweine- und Rinderplasma zusammengesetzt ist.
23. Kontrollplasma nach Anspruch 22, bei welchem die Gesamtblutplasmakomponente des Kontrollmittels aus Schweine- und Rinderplasma besteht.
24. Kontrollplasma nach Anspruch 23, bei welchem das Schweineplasma mit Aluminiumhydroxidgel absorbiert ist und das Schweine- und Rinderplasma in einem Volumenverhältnis von ca. 35 : 1 vorliegen.
25. Kontrollplasma nach Anspruch 18, bei welchem das Plasma zusätzlich Kaninchenplasma enthält.
26. Kontrollplasma nach Anspruch 25, bei welchem das Plasma zusätzlich Rinderplasma enthält.
27. Kontrollplasma nach Anspruch 26, bei welchem die gesamte Blutplasmakomponente des Kontrollmittels zumindest im wesentlichen aus Schweine-, Rinder- und Kaninchenplasma zusammengesetzt ist.
28. Kontrollplasma nach Anspruch 27, bei welchem die gesamte Blutplasmakomponente des Kontrollmittels aus Schweine-, Rinder- und Kaninchenplasma besteht.
29. Kontrollplasma nach Anspruch 28, bei welchem das Schweine-, Rinder- und Kaninchenplasma in einem Volumenverhältnis von ca. 1 : 6 : 3 vorliegen.
30. Koagulationskontrollplasma mit hohen stabilisierten Gehalten von Faktor V und VIII, enthaltend:
Blutplasma, erhalten aus Blut, welches direkt aus einer tierischen Quelle in eine Lösung enthaltend einen Puffer zur Aufrechterhaltung eines physiologischen pH-Wertes, einen Proteaseinhibitor und Citrat gesammelt wird, und
wenigstens ca. 2 Gew.-% eines geeigneten Kohlenhydrates,
wobei das Kohlenhydrat nach Entfernung der roten Blutkörperchen aus dem Blut zugegeben wird und das Blutplasma aus Nicht-Primatenblut erhalten wird.
31. Kontrollplasma nach Anspruch 30, wobei der Proteaseinhibitor Aprotinin ist.
32. Kontrollplasma nach Anspruch 31, wobei der Puffer HEPES- Puffer ist.
33. Kontrollplasma nach Anspruch 32, wobei die Lösung HEPES- Heminatrium, Aprotinin und Natriumcitrat in jeweiligen Gehalten von wenigstens ca. 0,25 M, 5 U/ml und 3 Gew.-% enthält.
34. Kontrollplasma nach Anspruch 33, zusätzlich enthaltend:
HEPES Heminatrium-Puffer, und
Aprotinin,
wobei der HEPES-Heminatriumpuffer und Aprotinin in dem Kontrollmittel in Gehalten von wenigstens ca. 0,08 M und 0,5 U/ml vorliegen.
35. Kontrollplasma nach Anspruch 34, wobei das Kohlenhydrat Sucrose ist.
36. Kontrollplasma nach Anspruch 35, zusätzlich enthaltend Natriumazid.
37. Kontrollplasma nach Anspruch 36, zusätzlich enthaltend Thimerosal.
38. Kontrollplasma nach Anspruch 37, bei welchem die Gesamtplasmakomponente des Kontrollmittels im wesentlich aus Nicht-Primatenplasma zusammengesetzt ist.
39. Kontrollplasma nach Anspruch 38, bei welchem das Nicht- Primatenplasma Schweineplasma enthält.
40. Kontrollplasma nach Anspruch 38, bei welchem das Nicht- Primatenplasma Rinderplasma enthält.
41. Kontrollplasma nach Anspruch 38, bei welchem das Nicht- Primatenplasma Kaninchenplasma enthält.
42. Kontrollplasma nach Anspruch 38, bei welchem das Nicht- Primatenplasma Pferdeplasma enthält.
43. Kontrollplasma nach Anspruch 39, bei welchem das Nicht- Primatenplasma zusätzlich Rinderplasma enthält.
44. Kontrollplasma nach Anspruch 43, bei welchem das Nicht- Primatenplasma zusätzlich Kaninchenplasma enthält.
45. Kontrollplasma nach Anspruch 40, bei welchem das Nicht- Primatenplasma zusätzlich Kaninchenplasma enthält.
46. Kontrollplasma nach Anspruch 39 oder 43, bei welchem das Schweineplasma mit Aluminiumhydroxidgel adsorbiert ist.
47. Kontrollplasma nach Anspruch 43, bei welchem das Schweineplasma mit Aluminiumhydroxidgel adsorbiert ist und das Schweine- und Rinderplasma in einem Volumenverhältnis von ca. 35 : 1 vorliegen.
48. Kontrollplasma nach Anspruch 44, bei welchem das Schweine-, Rinder- und Kaninchenplasma in einem Volumenverhältnis von ca. 1 : 6 : 3 vorliegen.
49. Verfahren zur Herstellung eines stabilen Koagulationskontrollplasmas, enthaltend die aufeinanderfolgenden Schritte:
Sammlung des Blutes, enthaltend das in dem Kontrollmittel zu verwendende Plasma direkt aus einer tierischen Quelle in eine Lösung enthaltend einen Puffer, der wirksam ist, einen physiologischen pH-Wert aufrechtzuerhalten, und
wirksame Gehalte eines Proteaseinhibitors,
Entfernen der roten Blutkörperchen aus dem Blut, und wobei das Plasma aus einem Nicht-Primatenblut gesammelt ist und wenigstens ca. 2 Gew.-% eines geeigneten stabilisierenden Kohlenhydrates nach der Entfernung der roten Blutkörperchen aus dem Blut zugefügt wird.
50. Verfahren nach Anspruch 49, in welchem in dem Auffangschritt der Puffer einen HEPES-Puffer enthält, der Proteaseinhibitor Aprotinin enthält und Citrat zusätzlich eingeschlossen ist.
51. Verfahren nach Anspruch 50, in welchem in dem Auffang schritt die Lösung HEPES-Heminatrium, Aprotinin und Natriumcitrat in Gehalten von wenigstens ca. 0,25 M, 5 U/ml und 3 Gew.-% enthält.
52. Verfahren nach Anspruch 50 oder 51, in welchem in dem Zugabeschritt das Kohlenhydrat Sucrose ist.
53. Verfahren nach Anspruch 52, zusätzlich enthaltend den Schritt der Zugabe von Natriumazid in Gehalten zur Erreichung von wenigstens ca. 0,08 Gew.-% Natriumazid in dem Kontrollmittel.
54. Verfahren nach Anspruch 53, zusätzlich enthaltend den Schritt der Zugabe von Thimerosal in Gehalten zur Erreichung von wenigstens ca. 0,02 Gew.-% Thimerosal in dem Kontrollmittel.
55. Verfahren nach Anspruch 49, in welchem in dem Auffangschritt ca. neun Volumenteile des Blutes in ca. einem Volumenteil der Lösung aufgefangen werden.
56. Verfahren zur Herstellung eines stabilen Koagulationskontrollmittels, enthaltend die Schritte:
Zurverfügungstellung eines Blutplasmas, und
Zugabe von wenigstens einem stabilen gereinigten Koagulationsfaktor zu dem Plasma,
wobei das von dem Blut erhaltene Blutplasma Nicht-Primatenplasma ist.
57. Verfahren nach Anspruch 56, wobei der Faktor von einem Rind oder Schwein erhaltener Faktor V oder VIII ist.
58. Verfahren nach Anspruch 57, wobei das Plasma Pferdeplasma ist.
59. Verfahren nach Anspruch 57, wobei der Faktor Faktor V ist.
60. Verfahren nach Anspruch 56, wobei der Faktor von einem Pferd erhaltener Faktor II ist.
61. Verfahren nach Anspruch 56, wobei der Faktor aus einem Blut erhalten wurde, welches direkt von einer tierischen Quelle in einer Lösung enthaltend einen zur Aufrechterhaltung eines physiologischen pH-Wertes wirksamen Puffer, einen Proteaseinhibitor und Citrat aufgefangen wird.
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