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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung bezieht sich auf eine Technik, die auf wirkungsvolle Weise
die Menge und Qualität
der in die Synovialflüssigkeit
abgegebenen Bestandteile der Knorpelmatrix als wichtige Informationsquelle über den
Metabolismus der Matrix nutzt. Die Erfindung bezieht sich auf die
biochemische Diagnose von Gelenkerkrankungen auf dem Gebiet der
Orthopädie.
Konkret gesprochen bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren und
auf eine Messausrüstung
bzw. Mess-Kit zur Bestimmung von normalem Aggrecan und auf ein Verfahren zur
Beurteilung von Informationen über
das Gelenk.
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Genauer
gesagt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Bestimmung
von normalem Aggrecan, das nur normales, in der Probe vorhandenes
Aggrecan ermittelt bzw. nachweist, auf eine Messausrüstung (measurement
kit), die für
die Bestimmung verwendet wird, und auf ein Verfahren zur Beurteilung
von Informationen über
das Gelenk, mit dem beurteilt werden kann, ob das Gelenk erkrankt
oder normal ist, und das, basierend auf der Abwesenheit oder dem
Vorhandensein eines signifikanten Unterschiedes zwischen der Menge des
normalen Aggrecan und der des gesamten Proteoglycans in der Probe
und den entsprechenden Mengen in einer Synovialflüssigkeit,
die aus einem normalen Gelenk erhalten wurde, die Art des kranken
Gelenkes bestimmen kann.
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In
der Erfindung ist mit dem Begriff "normales Aggrecan" Aggrecan gemeint, das zur Bindung von
Hyaluronan geeignet ist.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Es
ist gut bekannt, dass in einem normalen Gelenkknorpel zwischen der
Synthese und dem Abbau der Knorpelmatrix ein gutes Gleichgewicht
aufrechterhalten wird, wohingegen in einem krankhaften Gelenkknorpel der
Abbau der Knorpelmatrix ungeachtet der Art der Läsion bzw. Schädigung beschleunigt
abläuft.
Abbauprodukte der Knorpelmatrix werden zunächst in die Synovialflüssigkeit
abgegeben, dann in das Blut verteilt und metabolisiert. Somit ist
die Menge und Qualität
eines jeden Bestandteils der Knorpelmatrix, der in die Synovialflüssigkeit
abgegeben wird, eine wichtige Quelle der Information über den
Metabolismus der Matrix. Proteoglycan, der Hauptbestandteil der
Knorpelmatrix, ist dadurch gekennzeichnet, dass es geeignet ist,
mit Hyaluronan ein Aggregat zu bilden, um zusammen mit dem Typ II-Kollagen
in der Knorpelmatrix die riesige Masse der Matrixstruktur aufzubauen.
Die Menge und Qualität
des Aggrecans, des Hauptproteoglycans in der Knorpelmatrix, und
seiner Zuckerkette, Glycosaminoglycan, ist ein Anhaltspunkt, um
zu entscheiden, ob der Abbau der Knorpelmatrix beschleunigt erfolgt.
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Ein
herkömmliches
Verfahren zum Nachweis bzw. Bestimmung von normalem Aggrecan besteht
in der Messung der Menge des Hyaluronan-Aggrecan-Aggregats, das
mittels Ultrazentrifugation (Heinegard, D., et al., J. Biol. Chem.,
249, 4250 (1974)) und Gelchromatografie (Iwata, H., Shin Seikagaku
Jikken Koza, Bd. 3, Kohlenhydrate II, S. 452–455, 15. April 1991, von Tokyo
Kagaku Dojin Kabushiki Kaisha herausgegeben) isoliert wird. Das
Verfahren ist zeitaufwändig
und erfordert eine große
Probenmenge. Kalpaxis, D. L. (Int. J. Biochem. 17, S. 61–66, (1989))
offenbart eine Untersuchung über
Aggrecan, in der aggregierte und deaggregierte Formen voneinander
getrennt werden.
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Deshalb
ist nun ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung von normalem Aggrecan
erforderlich; d.h. ein Verfahren, das eine kürzere Zeitdauer und eine kleinere
Probenmenge erfordert. Es besteht auch Bedarf nach einem Verfahren,
das die quantitative Beziehung zwischen einer Änderung des normalen Aggrecans
und dem pathologischen Zustand eines Gelenkes klärt, um als Grundlage einer
Arthritis-Diagnose oder der Entscheidung für einen therapeutischen Plan
zu beurteilen, ob es sich um ein krankes oder normales Gelenk handelt,
und die Art des kranken Gelenkes zu identifizieren.
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Wie
vorstehend beschrieben ist Proteoglycan in der Synovialflüssigkeit
als Markermolekül
für eine
Arthritisdiagnose nützlich,
obwohl bei einigen Arthritisarten die Konzentration des Proteoglycans
kleiner als diejenige beim normalen Gelenk ist; somit weist eine
erhöhte
Konzentration an Proteoglycan nicht immer darauf hin, dass das Gelenk
erkrankt ist.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung beabsichtigt ein Verfahren zur Bestimmung eines neuen
Markermoleküls
für die
Unterscheidung eines pathologischen Gelenks von einem normalen Gelenk
zur Verfügung
zu stellen. Darüberhinaus
beabsichtigt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines Markermoleküls, das
verschiedene Arthritisarten mit unterschiedlichen Charakteristiken
unterscheiden kann, zur Verfügung
zu stellen.
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Genauer
gesagt beabsichtigt die Erfindung ein praktisches und sehr empfindliches
Verfahren und eine Messausrüstung
für den
Nachweis von normalem Aggrecan in einer Probe, insbesondere in Körperflüssigkeiten,
zur Verfügung
zu stellen, und sie beabsichtigt ein Verfahren zur Beurteilung von
Informationen bezüglich des
Gelenks unter Anwendung des Verfahrens und der Ausrüstung zur
Verfügung
zu stellen.
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Noch
genauer beabsichtigt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von
normalem Aggrecan, das nur normales, in der Probe vorhandenes Aggrecan
nachweisen kann, eine Ausrüstung
für den
Nachweis, und ein Verfahren zur Beurteilung von Informationen bezüglich eines
Gelenks zur Verfügung
zu stellen, mit dem basierend auf der Abwesenheit oder dem Vorhandensein
eines signifikanten Unterschiedes zwischen der Menge des normalen
Aggrecans und der des gesamten Proteoglycans in der Probe und den
Mengen in der Synovialflüssigkeit,
die aus einem normalen Gelenk erhalten wurde, beurteilt werden kann,
ob das Gelenk krankhaft oder normal ist.
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Außerdem beabsichtigt
die Erfindung ein Verfahren zur Beurteilung von Informationen bezüglich eines Gelenks
zur Verfügung
zu stellen, das verschiedene Arten von kranken Gelenken unterscheiden
kann.
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Ein
Bestandteil, der für
den Knorpel spezifisch ist und die Empfindlichkeit des Metabolismus
der Matrix widerspiegelt, ist als Markermolekül eines kranken Gelenkes nützlich.
Aggrecan, das Hauptproteoglycan in der Knorpelmatrix, und seine
Zuckerkette; Glycosaminoglycane (manchmal nachstehend als GAGs abgekürzt) befinden
sich unter den Bestandteilen der Knorpelmatrix, die die Eigenschaften
aufweisen, die für
die Markermoleküle
erforderlich sind.
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Proteoglycan
wird nachstehend charakterisiert:
Proteoglycan ist ein allgemeiner
Ausdruck, der auf Substanzen angewandt wird, die aus einem Protein,
genannt Kernprotein, und Glycosaminoglycanen bestehen, die kovalent
an das Protein gebunden sind, und im Bindegewebe, der Zellmembran
und ähnlichem
auftreten, und jeweils eine eigene einzigartige Funktion aufweisen.
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Das
Hauptproteoglycan in dem Knorpel wird Aggrecan genannt, bei dessen
Glycosaminoglycan-Ketten es sich um Chondroitinsulfat und Keratansulfat
handelt.
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Das
Molekulargewicht des Kernproteins von normalem Aggrecan liegt in
einem Bereich von 200.000 bis 300.000 und enthält zwei kugelförmige Domänen an der
terminalen Aminogruppe (G1 und G2-Domänen der endständigen Position)
und eine kugelförmige
Domäne
an der terminalen Carboxylgruppe (G3-Domäne). In der Knorpelmatrix ist
normales Aggrecan an der G1-Domäne
an Hyaluronan gebunden und bildet ein riesiges Aggregat. Dieses
Aggregat wird durch das Vorhandensein eines Glycoproteins, das sogenannte
Verknüpfungsprotein
(link protein) stabilisiert (Molekulargewicht: 40.000 bis 50.000),
das sowohl an normales Aggrecan als auch an Hyaluronan gebunden
sein kann. Es existiert ein GAGs-gebundener Bereich zwischen den G2-
und G3-Domänen,
in dem eine Anzahl Chondroitinsulfat- und Keratansulfat-Reste als auch N-
oder O-gebundene Oligosaccharide gebunden sind.
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Chondroitinsulfat
besteht aus Wiederholungseinheiten eines Dissaccharids, das aus
N-Acetylgalactosamin und Glucuronsäure besteht, und es sind mehrere
Disaccharidstrukturen mit unterschiedlichen Positionen des Sulfatrestes
bekannt; wobei der Sulfatrest in ungefähr 90% des menschlichen Aggrecans
an der 6-Position des N-Acetylgalactosamins (C6S) gebunden ist,
und Strukturen, in denen der Sulfatrest an der 4-Position (C4S)
gebunden ist, und Strukturen ohne Sulfatrest (C0S) werden in dieser
Reihenfolge mit abnehmender Häufigkeit
gefunden. Diese Strukturen treten nicht getrennt in verschiedenen
Molekülen
des Chondroitinsulfats auf, sondern werden in demselben Chondroitinsulfatmolekül gefunden.
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Keratansulfat
besteht aus Wiederholungseinheiten eines Disaccharids, das aus N-Acetylglucosamin und
Galactose besteht. Zwei Strukturtypen sind bekannt: eine Monosulfatstruktur,
die den Sulfatrest an der 6-Position des N-Acetylglucosamins enthält, und
eine Disulfatstruktur, die die Sulfatreste an der 6-Position des N-Acetylglucosamins
und derjenigen der Galactose enthält. Die Disulfatstruktur tritt
im Aggrecan häufiger
auf.
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Da
das Chondroitinsulfat wie vorstehend beschrieben eine Carboxylgruppe
und eine Sulfatgruppe enthält,
und das Keratansulfat eine Sulfatgruppe enthält, kann das Aggrecan eine
große
Menge an Wasser zurückhalten.
Außerdem
tritt wegen der gegenseitigen Abstoßung dieser negativen Ladungen
die Tendenz auf, dass die Glycosaminoglycankette eine lockere Spulenform
annimmt. Bei dem Aggrecan handelt es sich, selbst wenn es alleine
auftritt, um ein hydratisiertes Molekül, das wegen der Eigenschaften
seiner Glycosaminoglycankette einen großen Raum einnimmt, und in der
Knorpelmatrix mit Hyaluronan, begleitet von dem Verknüpfungsprotein,
aggregiert und ein riesiges hydratisiertes Gel bildet. Dieses Aggregat
füllt den
Zwischenraum des Typ II-Kollagenskeletts, so dass der Knorpel als
charakteristischer elastischer Körper
fungieren kann.
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Es
wurde berichtet, das die mit Arthritis verbundene Knorpelzerstörung mit
dem Abbau von Aggrecan beginnt, und dass die Abspaltung von Aggrecan
ungeachtet der Art der Arthritis hauptsächlich in dem Bereich zwischen
den G1- und G2-Domänen
stattfindet. Abgebautes Aggrecan, dem das G1 entzogen wurde, ist
ungeeignet, Hyaluronan in der Matrix zu binden, und weist deshalb
die Voraussetzungen auf, aus dem aufgelockerten Knorpel in die Synovialflüssigkeit
abgegeben zu werden. Somit ist die Menge und Qualität des Aggrecans
und seiner Abbauprodukte eine wichtige Quelle der Information über die
Knorpelzerstörung.
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Hyaluronan
wird nachstehend charakterisiert:
Hyaluronan ist ein Glycosaminoglycan,
das aus Wiederholungseinheiten eines Disaccharids besteht, das aus N-Acetylglucosamin
und Glucuronsäure
besteht, und obwohl seine Konzentration in der Knorpelmatrix gering ist,
kommt ihm bei der Bildung von Proteoglycanaggregat, wie vorstehend
beschrieben, eine wichtige Funktion zu. In der Synovialflüssigkeit
bildet es einen Hauptbestandteil, der in einer Konzentration von
2 bis 3 mg/ml vorhanden ist, und von den Synovialzellen produziert
wird. Das Molekulargewicht des Hyaluronans in der Synovialflüssigkeit
ist groß,
nämlich
mehrere Millionen, so dass das Hyaluronan einen größeren Raum
als die anderen Bestandteile einnimmt und eine große Menge
an Wasser im Inneren des Moleküls
zurückhält. Bei
der in der Synovialflüssigkeit
vorliegenden Konzentration überlappen
die Hyaluronanmoleküle
miteinander, was zu der Viskosität
beiträgt,
die für
die Synovialflüssigkeit
notwendig ist. D.h. das Molekulargewicht und die Konzentration des
Hyaluronans in der Synovialflüssigkeit
stehen in enger Beziehung zu der charakteristischen Viskosität der Synovialflüssigkeit.
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Unter
diesen Gesichtspunkten wurde die Beziehung zwischen der Konzentration
an Aggrecan oder Glycosaminoglycan in einer Körperflüssigkeit, wie der Synovialflüssigkeit
und das Blut, und die Art der Gelenkerkrankung untersucht. Die Konzentration
solch eines Markermoleküls
in der Synovialflüssigkeit
ist bei einigen Arthritisarten merklich erhöht, wie Gicht-Arthritis oder traumatischer
Arthritis (TA), wo die Knorpelzerstörung rasch voranschreitet,
wohingegen die Änderung
der Konzentration des Markermoleküls in der Synovialflüssigkeit
oder dem Blut bei anderen Arten von Arthritis, wie Osteoarthritis
(OA) und rheumatoide Arthritis, nicht sehr ausgeprägt ist,
wo die Knorpelzerstörung
langsam voranschreitet, so dass die Bestandteile der Knorpelmatrix
allmählich
freigesetzt werden.
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Dies
kann wie nachstehend erklärt
werden:
Die Konzentration und die gesamte Menge (Konzentration
multipliziert mit der Menge der Synovialflüssigkeit) eines Markermoleküls in der
Synovialflüssigkeit
variiert nicht nur entsprechend dem Ausmaß der Knorpelzerstörung, sondern
auch entsprechend der Knorpelmenge, der Geschwindigkeit der Beseitigung
der Abbauprodukte aus der Gelenkhöhle, und der Menge der Plasmabestandteile,
die in die Synovialflüssigkeit
transportiert wurden. Ein extremes Beispiel ist der Fall der rheumatoiden
Arthritis in der Endstufe, in der wenig Gelenkknorpel existiert.
Es verwundert nicht, dass die Konzentration des Aggrecan oder Glycosaminoglycans
in der Synovialflüssigkeit
in solch einem Fall kleiner als diejenige in der Synovialflüssigkeit
in einem normalen Gelenk ist.
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Um
die Wirkung dieser Faktoren auszuschließen und den Krankheitszustand
der Arthritis so genau wie möglich
zu erkennen, ist es wesentlich, das Ausmaß des Abbaus oder der Denaturierung
der Markermoleküle
in der Synovialflüssigkeit
oder im Serum zu ermitteln. Die Erfinder fanden, dass ein normales
Gelenk und ein krankes Gelenk basierend auf dem Anteil von normalen
Aggrecan, das geeignet ist, mit Hyaluronan ein Aggregat zu bilden,
im Vergleich zu demjenigen anderer Proteoglycane, voneinander unterschieden
werden können,
und dass die Art der Arthritis basierend auf einen Vergleich des
Anteils von normalem Aggrecan zu demjenigen anderer Proteoglycane
identifiziert werden kann.
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Normales
Aggrecan, das die Hyaluronan-Bindungsregion (G1-Domäne) enthält, bildet
mit Hyaluronan in der Synovialflüssigkeit
ein Aggregat, und diese Eignung zur Bildung eines Aggregats ist
ein nützlicher
Hinweis auf das Ausmaß des
Abbaus oder der Denaturierung von Aggrecan, da der Anteil an normalem
Aggrecan (aggregierende Form) im gesamten Proteoglycan kaum von
einem anderen Faktor als dem Abbau des Aggrecans beeinflusst wird.
Die Erfinder fanden ebenfalls ein praktisches und genaues Verfahren
zur Bestimmung von normalem Aggrecan, das geeignet ist, mit Hyaluronan
ein Aggregat zu bilden.
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Die
Erfindung nutzt, basierend auf der Tatsache, dass der Anteil des
normalen Aggrecans in dem gesamten Proteoglycan von kaum einem anderen
Faktor als dem Aggrecan-Abbau beeinflusst wird, und der Tatsache,
dass normales Aggrecan, das die Hyaluronanbindungsregion enthält, auch
in der Synovialflüssigkeit mit
Hyaluronan ein Aggregat bilden kann, die Eignung des Aggrecans zur
Bildung eines Aggregats als Nachweisansatz.
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Als
erstes stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von normalem
Aggrecan, das Hyaluronan binden kann, zur Verfügung. Das Machweisverfahren
in der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass nur normales Aggrecan
nach der Abtrennung von normalem Aggrecan, das zur Bindung von Hyaluronan
geeignet ist, von Proteoglycanen, die zur Bindung von Hyaluronan
ungeeignet sind, nachgewiesen wird.
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Die
vorstehend erwähnte
Abtrennung von normalem Aggrecan, das zur Bindung von Hyaluronan
geeignet ist, von Proteoglycanen, die zur Bindung von Hyaluronan
ungeeignet sind, besteht aus dem nachstehend beschriebenen Verfahren
A und dem nachstehend beschriebenen Verfahren B.
Verfahren
A: ein Verfahren zum Abbau oder zur Entfernung sowohl von an normalem
Aggrecan gebundenem Hyaluronan als auch von freiem Hyaluronan in
der Probe der Körperflüssigkeit.
Verfahren
B: ein Verfahren zur Abtrennung von normalem Aggrecan von anderen
Proteoglycanen als dem normalen Aggrecan, wobei die in dem Verfahren
A behandelte Probe in Kontakt mit einer festen Phase gebracht, die
geeignet ist, normales Aggrecan zu binden oder zu absorbieren, so
dass nur normales Aggrecan in der Probe an die feste Phase gebunden
oder von der festen Phase adsorbiert werden kann.
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Die
Entfernung des Hyaluronans in der Probe in dem Verfahren A ist notwendig,
da das Nachweisverfahren in der Erfindung auf der Eignung zur Hyaluronanbindung
von normalem Aggrecan beruht, das in der Probe an Hyaluronan bindet.
Für die
Entfernung des Hyaluronans in der Probe werden Enzyme, die das Hyaluronan
spezifisch abbauen können,
oder Mittel zur Denaturierung von Proteinen verwendet.
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Enzyme,
die Hyaluronan abbauen können,
schließen
hyaluronan-abbauende
Hyaluronidasen und die Chondroitinase ABC ("Tosa Kogaku", S. 282–315, 1. August 1992, von Sangyo
Chosakai Kabushiki Kaisha veröffentlicht)
ein.
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Hyaluronidasen
schließen
ein Enzym, das aus einem Streptomyces-Mikroorganismus stammt (z.B. Streptomyces
hyalurolyticus) (EC4.2.2.1), ein Enzym, das aus dem Echten Blutegel
(EC3.2.1.36) stammt, ein Enzym, das aus dem Rinderhoden stammt (EC3.2.1.35),
und ein Enzym ein, das aus einem Streptococcus-Mikroorganismus (z.B.
Streptococcus dysgalactie) stammt, die alle im Handel von Seikagaku
Corporation erhältlich
sind.
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Chondroitinase
ABC (EC4.2.2.4) wird durch ein Enzym veranschaulicht, das aus einem
Proteus-Mikroorganismus stammt (z.B. Proteus vulgaris) (von Seikagaku
Corporation vermarktet). Mittel zur Denaturierung von Proteinen
schließen
4 M Guanidinhydrochlorid und 7 M Harnstoff ein.
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Für die Bedingungen
der Behandlung in dem Verfahren A gibt es keine Einschränkungen,
obwohl die Behandlung, wenn ein Enzym verwendet wird, unter Bedingungen
erfolgt, die die optimale Temperatur und den optimalen pH-Wert für das Enzym
berücksichtigen.
Die Verwendung von Hyaluronidase ist für die anschließende Behandlung
bevorzugt.
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Wenn
ein Mittel zur Denaturierung von Proteinen verwendet wird, kann
ein zusätzliches
Verfahren zur Abtrennung von normalem Aggrecan von Hyaluronan, wie
eine Dichtegradienten-Ultrazentrifugation
unter Verwendung von Cäsiumchlorid
oder Glycerol oder einer anderen Substanz, oder ein anderes geeignetes
Verfahren (siehe Zoku Seikagaku Jikken Koza, Bd. 1, Approach on
Complex Carbohydrates, Glycolipid and Proteoglycan, 16. Januar 1986,
von Tokyo Kagaku Dojin Kabushiki Kaisha, S. 253–263) erforderlich sein. Wenn
Harnstoff als Mittel zur Denaturierung von Proteinen verwendet wird,
kann als optionales Verfahren eine Anionenaustauschchromatografie
(siehe dort, S. 265–275)
angewandt werden. Anschließend
wird die so abgetrennte Fraktion an normalem Aggrecan einer Verdünnung oder
Dialyse zur Verringerung der Konzentration des gleichzeitig vorhandenen
Mittels zur Denaturierung von Proteinen unterzogen, oder das Mittel
zur Denaturierung von Proteinen wird entfernt. Eine Verringerung
der Konzentration unter einen Wert von 0,4 M für das Guanidinhydrochlorid
und unter einen Wert von 1,0 M für
den Harnstoff reicht aus, um im Verfahren B normales Aggrecan an
die feste Phase zu binden.
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Die
in dem Verfahren B verwendete feste Phase sollte geeignet sein,
normales Aggrecan, das zur Bindung von Hyaluronan geeignet ist,
spezifisch zu binden oder zu adsorbieren. Solch eine feste Phase
wird beispielhaft durch eine feste Phase wiedergegeben, auf der
Hyaluronan immobilisiert worden ist. Genauer gesagt kann Hyaluronan
mittels eines allgemeinen Verfahrens zur Herstellung eines immobilisierten
Enzyms, wie einem kovalenten Bindungsverfahren, einem physikalischen
Adsorptionsverfahren und ähnlichem
[siehe "Koteika
Koso", 20. März 1975,
von Kodansha Kabushiki Kaisha veröffentlicht, S. 9–75] immobilisiert
werden.
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Beispielsweise
kann Hyaluronan durch eine kovalente Bindung zwischen den funktionellen
Gruppen des Hyaluronans (Hydroxylgruppen und Carboxylgruppen) und
denjenigen der festen Phase (Hydroxylgruppen, Carboxylgruppen, Aminogruppen
und ähnliches)
in Gegenwart eines Kondensationsmittels (z.B. eines wasserlöslichen
Carbodiimids (WSC), wie 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, oder
Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder ähnlichem) immobilisiert werden.
Als die feste Phase sind Träger
bevorzugt, die aus Polystyrol, Cellulose, Glas und ähnlichem
mit funktionellen Gruppen, wie einer Aminogruppe, bestehen (Mikroplatte
für den
immunologischen Nachweis, für
Chromatografie verwendeter Träger
und ähnliches).
Eine Mikroplatte für
den immunologischen Nachweis ist in Hinblick auf eine einfache Praktikabilität und die
hohe Empfindlichkeit bevorzugter.
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In
dem Verfahren B wird die Probe, die wie in dem Verfahren A beschrieben
behandelt wurde, zunächst
in Kontakt mit der vorstehend. erwähnten festen Phase gebracht,
gefolgt von einer Abtrennung der Probe von der festen Phase (Dekantation,
Filtration, Zentrifugation und ähnliches)
und einem, falls erforderlich, Waschen, so dass andere Proteoglycane
als normales Aggrecan von der festen Phase entfernt werden, und normales
Aggrecan, das an die feste Phase gebunden wurde, wird nachgewiesen.
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Es
ist bevorzugt, dass gleichzeitig ein Reagens zur Stabilisierung
der Bindung oder Adsorption von normalem Aggrecan an Hyaluronan
verwendet wird, wenn die Probe in Kontakt mit der vorstehend erwähnten festen
Phase gebracht wird. Die Reagentien zur Stabilisierung schließen ein
Verknüpfungsprotein
und ähnliches
ein, das bevorzugt in einer Konzentration von 100 ng/ml bis 100 μg/ml vorhanden
ist.
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Ein
mittels eines Verfahrens vom Stand der Technik erhaltenes Verknüpfungsprotein
kann verwendet werden: solch ein Ver fahren vom Stand der Technik
wird beispielhaft durch eine Cäsiumchlorid-Sedimentationsgleichgewichtszentrigfugation
veranschaulicht, die in Zoku Seikagaku Jikken Koza, Bd. 4, Approach
on Complex Carbohydrates, II, S. 253–263, 16. Januar 1986, von
Tokyo Kagaku Dojin Kabushiki Kaisha veröffentlicht, beschrieben ist.
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Die
Abtrennung des vorstehend erwähnten,
normalen Aggrecans, das zur Bindung von Hyaluronan geeignet ist,
von Proteoglycanen, die zur Bindung von Hyaluronan ungeeignet sind,
erfolgt auch durch eine auf dem Unterschied im Molekulargewicht
beruhende Abtrennung des Aggregats von normalem Aggrecan, das in der
Probe an Hyaluronan gebunden wurde, von den Proteoglycanen, die
zur Bindung von Hyaluronan ungeeignet sind. Für die auf dem Unterschied im
Molekulargewicht basierende Abtrennung kann ein Filtergerät, das mit
einem Membranfilter ausgestattet ist, und das Aggregat aus dem an
Hyaluronan gebundenen normalem Aggrecan mittels Filtration gewinnen
kann, oder eine Gerät
für die
Gelfiltration verwendet werden.
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Wenn
es sich bei der Probe um Synovialflüssigkeit handelt, die aus einem
Gelenk gewonnen wurde, das untersucht werden soll, ist normales
Aggrecan in der Probe an Hyaluronan gebunden und bildet ein riesiges
Molekül
mit einem Molekulargewicht von einigen Millionen oder mehr. Solch
ein riesiges Molekül
kann auf einem Membranfilter mit geeigneter Porengröße (0,1
bis 0,45 μm,
bevorzugt ungefähr
0,2 μm)
zurückgehalten werden,
wohingegen Aggrecan, das zur Bindung von Hyaluronan ungeeignet ist,
den Membranfilter passiert. Verschiedene Membranfilter können zu
diesem Zweck verwendet werden, und Membranfilter mit wenig nicht-spezifischer
Adsorption, wie diejenigen, die aus Teflon gefertigt sind, sind
bevorzugt.
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Solch
ein Membranfilter wird in einem geeigneten Filtergerät angeordnet,
wo die Probe einer Druckfiltration oder einer Zentrifugalfiltration
unterzogen wird. Wenn es sich bei der Probe um eine andere Körperflüssigkeit
als die Synovialflüssigkeit
handelt, ist eine Zugabe von Hyaluronan mit einem Molekulargewicht
von einigen Hunderttausend zu der Probe zur Bildung eines Aggregats
aus normalem Aggrecan, das an Hyaluronan gebunden ist (nachstehend
manchmal als Hyaluronan-Aggrecan-Aggregat
bezeichnet) erforderlich.
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In
dem Nachweisverfahren der Erfindung wird so abgetrenntes, normales
Aggrecan mittels einer Maßnahme
zur Bestimmung von Proteoglycan nachgewiesen. Bei der Maßnahme,
die zum Nachweis von Proteoglycan eingesetzt wird, handelt es sich
um Maßnahmen
zum spezifischen Nachweis von Keratansulfat oder Chondroitinsulfat,
das an normales Aggrecan oder an das Kernprotein von normalem Aggrecan
gebunden ist.
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D.h.
die Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung von normalem Aggrecan
(nachstehend als "Nachweisverfahren
1" bezeichnet) zur
Verfügung,
das aus den nachstehend beschriebenen Verfahren A, B und C besteht.
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Nachweisverfahren 1
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- Verfahren A: ein Verfahren zum Abbau oder zur Entfernung
sowohl von Hyaluronan, das an normales Aggrecan gebunden ist, als
auch von freiem Hyaluronan in der Probe.
- Verfahren B: ein Verfahren zur Abtrennung von normalem Aggrecan
von anderen Proteoglycanen als dem normalen Aggrecan, wobei die
in dem Verfahren A behandelte Probe in Kontakt mit einer festen
Phase gebracht wird, die geeignet ist, normales Aggrecan zu binden
oder zu adsorbieren, so dass nur normales Aggrecan in der Probe
an die feste Phase gebunden oder adsorbiert werden kann, und
- Verfahren C: ein Verfahren zur Bestimmung von normalem Aggrecan,
das an die feste Phase gebunden oder adsorbiert ist.
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Es
ist bevorzugt, gleichzeitig ein Reagens zur Stabilisierung der Adsorption
von normalem Aggrecan an die feste Phase zu verwenden, wenn die
Probe in Kontakt mit der festen Phase in dem Verfahren B gebracht wird.
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Normales
Aggrecan wird auf der festen Phase mittels der Hyaluronan-Bindungsregion
(G1-Domäne) an
Hyaluronan gebunden. Normales Aggrecan, das mittels Hyaluronan an
die feste Phase gebunden oder darauf adsorbiert ist, wird mittels
verschiedener Maßnahmen
zum Nachweis von Proteoglycan nachgewiesen. Zum Beispiel wird es
durch Anfärben
des an normalem Aggrecan gebundenen, sulfatisierten Glycosaminoglycans
mit einem Farbstoff, wie 1,9-Dimethylmethylenblau, nachgewiesen.
Es wird auch durch eine immunologische Quantifizierung (Immunoassay)
oder eine immunologische Färbung
(staining) mit einem Antikörper,
der spezifisch gegen sulfatisiertes Glycosaminoglycan gerichtet
ist, das an normalem Aggrecan gebunden ist, wie Chondroitinsulfat
oder Keratansulfat, oder mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatografie nachgewiesen.
Es können
auch Antikörper
verwendet werden, die gegen das Kernprotein von normalem Aggrecan
gerichtet sind.
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Mit
der Erfindung wird eine quantitative Bestimmung von normalem Aggrecan
beabsichtigt, das noch mindestens die Hyaluronan-Bindungsregion
(G1-Domäne),
die G2-Domäne
und Glycosaminoglycan besitzt. Deshalb ist zur Bestimmung von normalem
Aggrecan, das mittels der Hyaluronan-Bindungsregion an die feste Phase
gebunden oder darauf adsorbiert ist, ein Verfahren zum Nachweis
von Glycosaminoglycan, wie Keratansulfat oder Chondroitinsulfat,
bevorzugt. Die Verwendung eines gegen Chondroitinsulfat oder Keratansulfat gerichteten
Antikörpers
ist bevorzugt, um eine einfache Praktikabilität und eine ausreichende Empfindlichkeit zu
gewährleisten.
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Als
Antikörper,
der gegen Chondroitinsulfat oder Keratansulfat gerichtet ist, kann
jeder spezifisch gegen solch ein sulfatisiertes Glycosaminglycan,
das an normalem Aggrecan gebunden ist, gerichtete Antikörper verwendet
werden.
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Verschiedene
gegen Chondroitinsulfat gerichtete monoklonale Antikörper sind
bekannt, einige davon sind allgemein verfügbar (Shin Seikagaku Jikken
Koza, Bd. 3, Carbohydrates II, S. 385–391, 15. April 1991, von Tokyo
Kagaku Dojin Kabushiki Kaisha veröffentlicht; Antikörper mit
den Namen CS-56, MO-225, MC21C, S54C, 3B3).
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Darunter
ist MO-225 ("Anti-Chondroitinsulfat
(Typ-D)") im Handel
von Seikagaku Corporation erhältlich (veröffentlichte
ungeprüfte
japanische Patentanmeldung (KOKAI TOKKYO KOHO) Nr. 137695/88).
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Gegen
Keratansulfat gerichtete monoklonale Antikörper sind bekannt und allgemein
erhältlich
(Shin Seikagaku Jikken Koza, Bd. 3, Carbohydrates II, S. 391–393, 15.
April 1991, von Tokyo Kagaku Dojin Kabushiki Kaisha veröffentlicht;
Antikörper
mit dem Namen 1/20/5D4 oder 5D4). Der Antikörper 5D4 ist im Handel von
Seikagaku Corporation erhältlich
(J. Biol. Chem., 258, 8848 (1983), veröffentlichte ungeprüfte japanische Patentanmeldung
(KOKAI TOKKYO KOHO) Nr. 224065/85).
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweis von normalem Aggrecan
zur Verfügung,
das wie nachstehend beschrieben aus dem Verfahren A und dem Verfahren
B besteht (nachstehend als "Nachweisverfahren
2" bezeichnet).
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Nachweisverfahren 2
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- Verfahren A: ein auf dem Unterschied des Molekulargewichts
basierendes Verfahren zur Abtrennung des Aggregats von normalem
Aggrecan, das an Hyaluronan gebunden ist, von Proteoglycan, das
zur Bindung von Hyaluronan ungeeignet ist, in der Probe.
- Verfahren B: ein Verfahren zur Bestimmung des Hyaluronan-Aggrecan-Aggregats,
das auf dem Membran-Filter gewonnen wurde.
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Das
vorstehend erwähnte
Hyaluronan-Aggrecan-Aggregat, das von dem Membranfilter zurückgehalten
worden war, wurde mit verschiedenen Maßnahmen nachgewiesen. Beispielsweise
wird sulfatisiertes Glycosaminoglycan mit 1,9-Dimethylmethylenblau
auf ähnliche
Weise wie vorstehend beschrieben nachgewiesen.
-
Sulfatisiertes
Glycosaminoglycan, wie Chondroitinsulfat oder Keratansulfat, wird
auch unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers oder mittels Hochleistungsflüssigchromatografie
nachgewiesen. Außerdem
kann auch ein gegen das Kernprotein von normalem Aggrecan gerichteter
Antikörper
verwendet werden.
-
Die
Erfindung beabsichtigt, normales Aggrecan, das mindestens die Hyaluronan-Bindungsregion (G1-Domäne), die
G2-Domäne
und Glycosaminoglycan besitzt, quantitativ zu bestimmen. Deshalb
ist zum Nachweis von normalem Aggrecan, das mittels der Hyaluronan-Bindungsregion
an der festen Phase gebunden oder adsorbiert ist, ein Verfahren
zum Nachweis von Glycosaminoglycan bevorzugt. Die Verwendung eines
gegen Chondroitinsulfat oder Keratansulfat gerichteten Antikörpers ist
bevorzugt, um eine einfache Praktikabilität und eine ausreichende Empfindlichkeit
zu gewährleisten.
-
Für die Probe
gibt es keine Einschränkungen,
aber bevorzugt handelt es dabei um Synovialflüssigkeit aus dem zu untersuchenden
Gelenk.
-
Nachstehend
wird das Verfahren erklärt,
das in der Erfindung unter Verwendung eines gegen Chondroitinsulfat
oder Keratansulfat gerichteten Antikörpers zum Nachweis von normalem
Aggrecan, das mittels der Hyualuronan-Bindungsregion an die feste
Phase gebunden oder darauf adsorbiert ist, eingesetzt wird.
-
Das
Kernprotein von normalem Aggrecan weist die Hyaluronan-Bindungsregion auf,
die Hyaluronan spezifisch und reversibel bindet. Keratansulfat ist
ein Glycosaminoglycan, das an mehreren Stellen kovalent an das Kernprotein
von normalem Aggrecan gebunden ist und konzentriert in der KS-reichen
Region nahe der Hyaluronan-Bindungsregion vorliegt.
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Verschiedene
Verfahren für
einen Immunassay unter Verwendung der vorstehend erwähnten Antikörper, um
Chondroitinsulfat und Keratansulfat in einer biologischen Probe
quantitativ zu bestimmen, sind bekannt.
-
In
der Literatur "Quantification
of Keratan Sulfate in Blood as a Marker of Cartilage Catabolism
in the Arthritis and Rheumatism" (Thonar
et al, 1985, Bd. 28, S. 1367–1376)
ist ein Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay-Immuntest (ELISA) unter
Verwendung eines Anti-Keratansulfat-spezifischen monoklonalen Antikörpers für die quantitative
Bestimmung von Keratansulfat in Serum menschlicher Erwachsener beschrieben.
-
Das
vorstehend erwähnte
Verfahren für
die quantitative Bestimmung von Keratansulfat wird nachstehend an
Hand eines Beispiels erklärt.
Verfahren
a: Hyaluronan wird an eine feste Phase gebunden, um eine hyaluronan-immobilisierte
feste Phase herzustellen,
Verfahren b: die in einem Verfahren
zum Abbau oder zur Entfernung sowohl von an normalem Aggrecan gebundenen
Hyaluronan oder von freiem Hyaluronan in der Probe behandelte Probe
und das Verknüpfungsprotein
werden in Kontakt mit der festen Phase gebracht, die in dem Verfahren
a erhalten wurde, gefolgt von einer Inkubation, so dass freies normales
Aggrecan an Hyaluronan gebunden wird, das an die vorstehend erwähnte feste
Phase gebunden wurde,
Verfahren c: das Produkt des Verfahrens
b wird so in Kontakt mit einem keratansulfat-reaktiven Antikörper gebracht,
dass der Antikörper
an das Keratansulfat von normalem Aggrecan gebunden wird, das an
Hyaluronan gebunden wurde, das an die vorstehend erwähnte feste
Phase gebunden worden war,
Verfahren d: der vorstehend erwähnte Antikörper, der
an das vorstehend erwähnte
Keratansulfat gebunden wurde, wird nachgewiesen, und
Verfahren
e: die Menge des an dem vorstehend erwähnten Keratansulfat gebundenen
Antikörpers
wird in die Menge an normalem Aggrecan in der Probe umgerechnet.
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Der
Anti-Keratansulfat-Antikörper,
der in dem Verfahren c an die feste Phase (Mikroplatte und ähnliches)
gebunden worden war, kann in dem Verfahren d unter Verwendung eines
zweiten Antikörpers
nachgewiesen werden, der gegenüber
dem nachzuweisenden Antikörper
reaktiv ist und mit einer geeigneten Markierungssubstanz, wie einem
Enzym, einem Radioisotop, einer fluoreszierenden Substanz, Biotin,
Avidin und ähnlichem,
markiert worden ist.
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Wenn
der erste Antikörper
beispielsweise ein monoklonaler Anti-Keratansulfat-Antikörper der
Maus ist, kann der markierte zweite Antikörper ein Anti-Mausimmunoglobin-Antikörper sein,
der an eine Markierungssubstanz gebunden ist. Beispielsweise sind
diese zweiten Antikörper,
die spezifisch gegen Immunoglobuline verschiedener Tierarten gerichtet
sind und mit Peroxidase, alkalischer Phosphatase, Fluoresceinisothiocyanat
(FITC), 7-Amino-4-methylcumarin-3-acetat (AMCA), Biotin oder ähnlichem
markiert wurden, von Jackson Co. im Handel leicht von Seikagaku
Corporation erhältlich.
-
Wenn
der zweite Antikörper
ein peroxidase-markierter Antikörper
ist, wird die Bindung zwischen dem ersten Antikörper, der an der festen Phase
gebunden ist, und dem zweiten Antikörper üblicherweise mittels einer
Farbreaktion mit Peroxidase nachgewiesen.
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D.h.
Wasserstoffperoxid, das Substrat der Peroxidase, und eine färbende Substanz
(o-Phenylendiamin, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin)
werden für
diese Umsetzung verwendet, in der die Farbintensität der Menge
der. Peroxidase proportional ist, die an die feste Phase gebunden
ist, und die Extinktion wird bei einer Wellenlänge bestimmt, die für die verwendete
färbende
Substanz geeignet ist. Wenn es sich bei der festen Phase um eine
Mikroplatte handelt, wird die Extinktion mit einem Mikroplatten-Leser
[z.B. Wellreader SK601 (Seikagaku Corporation), MR600 (Dynatec Co.)
und ähnliches]
ermittelt.
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Das
vorstehend erwähnte
Nachweisverfahren unter Verwendung des Anti-Keratansulfat-Antikörpers ist
auch für
einen Nachweis unter Verwendung des Anti-Chondroitinsulfat-Antikörpers einsetzbar.
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Die
Erfindung stellt Messausrüstungen
zur Verfügung,
die in dem Nachweisverfahren für
normales Aggrecan verwendet werden. Solche Ausrüstungen werden beispielhaft
durch eine Ausrüstung
veranschaulicht, die in dem vorstehend beschriebenen Nachweisverfahren
1 (nachstehend als "Messausrüstung 1" abgekürzt) eingesetzt
wird und aus den Reagentien A, B und C mit der nachstehenden Zusammensetzung
besteht.
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Messausrüstung 1
-
- A: Ein Reagens zum Abbau oder zur Entfernung
sowohl von an normalem Aggrecan gebundenem Hyaluronan als auch von
freiem Hyaluronan in der Probe,
- B: eine feste Phase zur spezifischen Bindung oder Adsorption
von normalem Aggrecan, und
- C: ein Reagens zum Nachweis von normalem Aggrecan, das an die
in B beschriebene feste Phase gebunden oder adsorbiert ist.
-
In
der Messausrüstung
1 kann zur Stabilisierung der Bindung zwischen normalem Aggrecan
und Hyaluronan oder zur Stabilisierung der Adsorption ein zusätzliches
Reagens verwendet werden.
-
Das
vorstehend erwähnte
B ist eine feste Phase, um normales Aggrecan in der Probe dadurch
zu binden oder adsorbieren, dass die mit dem vorstehend erwähnten A
behandelte Probe in Kontakt mit der festen Phase gebracht wird,
die geeignet ist, normales Aggrecan zu binden oder zu adsorbieren.
Bei der festen Phase kann es sich um Mikroplatten und Träger für die Chromatografie
handeln, in denen Hyaluronan kovalent gebunden oder physikalisch
adsorbiert wurde, so dass normales Aggrecan in der Probe, das geeignet
ist, Hyaluronan zu binden, selektiv gebunden oder adsorbiert werden
kann. Mikroplatten für
einen Immunassay, wie diejenigen für den Enzyme-Linked-Immunosorbend-Assay-Immuntest
(ELISA), sind in Hinblick auf eine einfache Praktikabilität und eine
hohe Empfindlichkeit erwünscht.
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Die
vorstehend erwähnten
Reagentien zur Stabilisierung schließen ein Verknüpfungsprotein
und ähnliches
ein.
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Das
vorstehend erwähnte
Reagens C ist ein Reagens zum spezifischen Nachweis von an normalem Aggrecan
oder an das Kernprotein von normalem Aggrecan gebundenem Keratansulfat
oder Chondroitinsulfat.
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Die
Erfindung stellt eine Messausrüstung
zur Verfügung,
die in dem Nachweisverfahren 2 (nachstehend als "Mess-Kit 2" abgekürzt) verwendet wird, und aus
dem nachstehend beschriebenen Gerät A und dem nachstehend beschriebenen
Reagens B besteht.
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Messausrüstung 2
-
- Gerät
A: ein Gerät,
das zu einer auf dem Molekulargewicht beruhenden Fraktionierung
zur Trennung des Aggregats aus an Hyaluronan gebundenem normalem
Aggrecan von Proteoglycan, das zur Bindung von Hyaluronan ungeeignet
ist, geeignet ist, und
- Reagens B: ein Reagens zum Nachweis von normalem Aggrecan, das
in Form eines Aggregats aus Hyaluronan und normalem Aggrecan abgetrennt
wurde.
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Bei
dem vorstehend erwähnten
Gerät A
handelt es sich um ein Filtergerät,
das mit einem Membranfilter ausgestattet ist, mit dem das Aggregat
aus an Hyaluronan gebundenem normalem Aggrecan gewonnen werden kann.
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Bei
dem vorstehend erwähnten
Reagens B handelt es sich um ein Reagens zum spezifischen Nachweis
von an normalem Aggrecan oder dem Kernprotein von normalem Aggrecan
gebundenem Keratansulfat oder Chondroitinsulfat.
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Bei
der Probe handelt es sich bevorzugt um Synovialflüssigkeit
aus dem zu untersuchenden Gelenk.
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Das
Gerät A
besteht aus einem Membranfilter und einem Filtergerät zur Gewinnung
von in der Probe an Hyaluronan gebundenem normalem Aggrecan (Hyaluronan-Aggrecan-Aggregat)
auf dem Membranfilter. Normales Aggrecan in der Probe ist an Hyaluronan
gebunden und bildet ein Makromolekül mit einem Molekulargewicht
von einigen Millionen oder mehr. Dieses Makromolekül kann auf
einem Membranfilter mit geeigneter Porengröße (0,1 bis 0,45 μm, bevorzugt
ungefähr
0,2 μm)
zurückgehalten
werden, wohingegen Aggrecan, das zur Bindung von Hyaluronan ungeeignet
ist, den Membranfilter passiert. Verschiedene Arten von Membranfilter
können
zu diesem Zweck verwendet werden, und diejenigen mit geringer nicht-spezifischer
Adsorption, wie diejenigen, die aus Teflon gefertigt sind, sind
bevorzugt. Solch ein Membranfilter wird in einem geeigneten Filtergerät angeordnet
und eine Probe wird unter geeignetem Druck oder mittels Zentrifugalkraft
durch den Membranfilter filtriert. Zur Filtration einer anderen
Körperflüssigkeit
als der Synovialflüssigkeit
ist eine Zugabe von Hyaluronan mit einem Molekulargewicht von einigen
Hunderttausend oder mehr zu der Probe erforderlich, damit sich ein
Hyaluronan-Aggrecan-Aggregat
bilden kann.
-
Die
Erfindung stellt dadurch, dass sie die vorstehend erwähnten Nachweisverfahren
und Messausrüstungen
verwendet, ein Verfahren zur Beurteilung von Informationen über ein
Gelenk zur Verfügung.
Wenn es sich bei der Probe um Synovialflüssigkeit handelt, liefert die
Erfindung Informationen über
den Metabolismus der Gelenkknorpelmatrix.
-
Die
in normaler Synovialflüssigkeit
auftretenden Proteoglycane, in denen normales Aggrecan, das zur Bindung
von Hyaluronan geeignet ist, ungefähr 38% ausmacht, werden nicht
in großem
Ausmaß abgebaut.
Im Krankheitszustand, wie bei Osteoarthritis und rheumatoider Arthritis
macht normales Aggrecan, das zur Aggregatbildung geeignet ist, nur
ungefähr
18% der Proteoglycane in der Synovialflüssigkeit aus. Der Unterschied
im Prozentsatz spiegelt genau den Unterschied im Ausmaß des Abbaus
der Knorpelmatrix wieder.
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Die
absolute Menge und der Prozentsatz von normalem Aggrecan und anderen
Proteoglycanen wurde in Synovialflüssigkeit von normalen Subjekten
und von Patienten mit Osteoarthritis, rheumatoider Arthritis und traumatischer
Arthritis (TA) bestimmt: die so erhaltenen Werte stellen auf charakteristische
Weise den Krankheitszustand dar, und deshalb wird vermutet, dass
diese Moleküle
nützliche
biochemische diagnostische Marker für den Krankheitszustand sind.
Genauer gesagt sind die Konzentration von normalem Aggrecan und
der Prozentsatz an normalem Aggrecan im gesamten Proteoglycan nützlich zur
Unterscheidung von normalen Gelenken von kranken Gelenken, zum Verständnis der
Krankheitszustände,
wie der Art der Gelenkkrankheit, und der Erstellung der Prognose
und der Beurteilung der Wirksamkeit der Therapien.
-
Nachstehend
wird die Beziehung zwischen Arthritis und Glycosaminoglycan und
den Proteoglycanen in der Synovialflüssigkeit und im Serum beschrieben.
-
Wie
vorstehend beschrieben, werden Abbauprodukte von Proteoglycan aus
der Knorpelmatrix in die Synovialflüssigkeit und dann ins Blut
freigesetzt, wenn der Knorpel durch die Arthritis zerstört wird.
Neueren Berichten zufolge über
Glycosaminoglycan, einem Proteoglycan, dessen Menge sich mit dem
Fortschreiten der Arthritis verändert,
bestehen die Markermoleküle,
die nachgewiesen werden, aus Keratansulfat, Chondroitinsulfat und
sulfatisiertem Glycosaminoglycan (S-GAG), das die Summe der ersten
beiden darstellt, und auch aus Proteoglycanfragmenten. Nachstehend
sind die Veränderungen
der Markermoleküle,
d.h. Keratansulfat, Chondroitinsulfat, S-GAG und Proteoglycanfragmente,
dargestellt.
-
1. Keratansulfat
-
Ein
spezifischer monoklonaler Antikörper
ist im Handel erhältlich,
so dass dieses Markermolekül
ausgiebig mittels ELISA oder einem Radioimmunassay (RIA) untersucht
wurde. Seine Konzentration in der Synovialflüssigkeit nimmt deutlich bei
Gicht oder reaktiver Arthritis zu. Seine Konzentration im Blut soll
laut einigen Berichten bei der Osteoarthritis (OA) und der rheumatoiden
Arthritis (RA) zunehmen oder laut anderen Berichten nur wenig Änderung
zeigen.
-
2. Chondroitinsulfat
-
Über das
Ergebnis einer Bestimmung von ungesättigten Disacchariden mittels
HPLC, die durch Digestion bzw. Aufschließen mit Chondroitinase ABC
erzeugt wurden, wurde berichtet. Die Konzentration von C6S unter
den Chondroitinsulfat-Isomeren ist, ähnlich wie die Konzentration
des Keratansulfats, bei der traumatischen Arthritis bemerkenswert
hoch, was vermutlich die rapide Zerstörung des Knorpels widerspiegelt.
Die C4S-Konzentration in der Synovialflüssigkeit ist bei der rheumatoiden
Arthritis höher
als bei der Osteoarthritis, und das C6S/C4S-Verhältnis ist bei der rheumatoiden
Arthritis kleiner als bei der Osteoarthritis und der traumatischen
Arthritis. C4S kann aus der Synovialmembran oder dem Serum stammen,
was möglicherweise
eine Synovitis bei der rheumatoiden Arthritis widerspiegelt.
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3. Sulfatisiertes Glycosaminoglycan
(S-GAG)
-
Es
kann wohl angenommen werden, dass seine Konzentration die Summe
aus der Konzentration des Chondroitinsulfats und derjenigen des
Keratansulfats in der Synovialflüssigkeit
wiedergibt. Die Konzentration wird praktischerweise mit einem Farbstoff
(1,9-Dimethylmethylenblau: DMB) ermittelt, mit dem die S-GAG-Konzentration
spezifisch bestimmt werden kann. Die Konzentration in der Synovialflüssigkeit
ist bei Gicht und reaktiver Arthritis merklich erhöht, bei
der Osteoarthritis oder der rheumatoiden Arthritis jedoch hingegen
nicht bemerkbar erhöht.
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4. Proteoglycanfragmente
-
Die
Konzentration eines jeden Fragments wird mit einem Antikörper, der
für jedes
Aggrecan-Fragment spezifisch ist, zur Klärung des Metabolismus, des
Abbaus und des Freisetzungsmechanismus des Aggrecans ermittelt.
Die Konzentration des glycosaminoglycan-reichen Fragments in der
Synovialflüssigkeit
kann sich auf gleiche Weise wie diejenige des S-GAG ändern. Die
Konzentration der hyaluronan-bindenden Region ist auf der Anfangsstufe
der rheumatoiden Arthritis niedrig und nimmt mit dem Fortschreiten
der Krankheit zu. Es wird angenommen, dass dies auf die Tatsache
zurückzuführen ist,
dass die hyaluronan-bindende Region in der Gelenkmatrix auf der
Anfangsstufe der Knorpelzerstörung
erhalten bleibt.
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5. Zusammenfassung
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Bei
der Gicht oder der traumatischen Arthritis, bei der die Knorpelzerstörung rasch
voranschreitet, werden deutlich erhöhte Konzentrationen der vorstehend
erwähnten
Markermoleküle
in der Synovialflüssigkeit
beobachtet. Bei der Osteoarthritis oder der rheumatoiden Arthiritis,
bei der die Knorpelzerstörung
langsam voranschreitet, ändern
sich die Konzentrationen der Markermoleküle in der Synovialflüssigkeit
oder dem Serum nicht sehr deutlich, da die Knorpelbestandteile nur
allmählich
bzw. langsam freigesetzt werden.
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Um
den Arthritiszustand so genau wie möglich zu verstehen, ist es
erforderlich, das Ausmaß des
Abbaus oder der Degeneration der Markermoleküle in der Synovialflüssigkeit
oder im Serum zu kennen.
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Das
Verfahren zur Beurteilung der Informationen über ein Gelenk in der Erfindung
ist dadurch gekennzeichnet, dass Information über die Menge an normalem Aggrecan
in der Probe erhalten wird, und die so ermittelte Information wird
dann als Information von einem kranken Gelenk beurteilt, falls ein
deutlicher Unterschied beobachtet wird, und sie wird dann als Information
von einem normalen Gelenk beurteilt, falls kein deutlicher Unterschied
gefunden wird, wenn die Information mit der vorher erhaltenen Information über die
Menge des normalen Aggrecan und der Menge des gesamten Proteoglycans
in der Synovialflüssigkeit
aus einem normalen Gelenk verglichen wird.
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Die
Informationen über
die Menge an normalem Aggrecan in der Probe wird durch die Bestimmung der
Konzentration von normalem Aggrecan in der Probe mittels des vorstehend
erwähnten "Nachweisverfahrens
1" oder des vorstehend
erwähnten "Nachweisverfahrens
2" und die zusätzliche
Bestimmung der Konzentration des gesamten Proteoglycans erhalten,
so dass der Prozentsatz von normalem Aggrecan im gesamten Proteoglycan
berechnet werden kann.
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Das
Auftreten des vorstehend erwähnten
deutlichen Unterschieds bedeutet, dass der berechnete Prozentsatz
an normalem Aggrecan am gesamten Proteoglycan in der Probe merklich
niedriger als der vorher ermittelte Prozentsatz an normalem Aggrecan
am gesamten Proteoglycan in der Synovialflüssigkeit aus einem normalen
Gelenk ist.
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Wenn
solch ein deutlicher Unterschied gefunden wird, wird angenommen,
dass diese Information auf einen Krankheitszustand hinweist, der
aus der Gruppe von Krankheiten ausgewählt ist, die Osteoarthritis, rheumatoide
Arthritis, traumatische Arthritis und Gicht einschließt.
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Die
vorstehend erwähnte
Information über
die Menge an normalem Aggrecan in der Probe wird durch die Bestimmung
der Konzentration von normalem Aggrecan in der Probe mittels des
vorstehend erwähnten Nachweisverfahrens
1 oder des vorstehend erwähnten
Nachweisverfahrens 2 und zusätzlich
durch die Bestimmung der Konzentration des gesamten Proteoglycans
in der Probe, gefolgt von der Berechnung der Konzentration des anderen
Proteoglycans als normales Aggrecan aus dem Unterschied zwischen
der Konzentration des gesamten Proteoglycans und derjenigen des
normalen Aggrecans, ermittelt.
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Das
Auftreten des vorstehend erwähnten
deutlichen Unterschieds bedeutet, dass die Konzentration an normalem
Aggrecan in der Probe merklich geringer als die vorher ermittelte
Konzentration an normalem Aggrecan in der Synovialflüssigkeit
aus einem normalen Gelenk ist und dass gleichzeitig die Konzentration
des anderen Proteoglycans als normales Aggrecan in der Probe sich
nicht merklich von der vorher ermittelten Konzentration des anderen
Proteoglycans als normales Aggrecan in der Synovialflüssigkeit
aus einem normalen Gelenk unterscheidet. Das Auftreten eines merklichen
Unterschieds wird als Hinweis auf eine Osteoarthritis, eine rheumatoide
Arthritis und ähnliches
angesehen, bei der die Knorpelzerstörung langsam voranschreitet, und
das Fehlen eines merklichen Unterschieds wird als Hinweis auf ein
normales Gelenk betrachtet.
-
Der
vorstehend erwähnte
deutliche Unterschied wird bei verschiedenen Zuständen beobachtet.
Beispielsweise wird in Fällen,
in denen die Konzentration von normalem Aggrecan in der Probe sich
nicht von der zuvor ermittelten Konzentration von normalem Aggrecan
in der Synovialflüssigkeit
aus einem normalen Gelenk unterscheidet und gleichzeitig die Konzentration
des anderen Proteoglycans als normales Aggrecan in der Probe deutlich
höher als
die vorher ermittelte Konzentration des anderen Proteoglycans als
normales Aggrecan in der Synovialflüssigkeit aus einem normalen
Gelenk ist, ein merklicher Unterschied gefunden. Das Auftreten des
vorstehend erwähnten
deutlichen Unterschieds wird als Information über eine Art von Arthritis
angesehen, bei der die Knorpelzerstörung rasch voranschreitet,
wie traumatischer Arthritis oder Gicht, während die Abwesenheit eines
deutlichen Unterschieds als Information über ein normales Gelenk betrachtet
wird.
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Bei
der vorstehend erwähnten
Probe handelt es sich bevorzugt um Synovialflüssigkeit aus dem zu untersuchenden
Gelenk.
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BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
DER ERFINDUNG
-
Die
Erfindung wird besser unter Bezugnahme auf die nachstehenden Beispiele
beschrieben. Die Erfindung ist in keinster Weise auf diese Beispiele
beschränkt.
-
Beispiel 1
-
Es
wird ein Beispiel für
die Bestimmung der Konzentration von normalem Aggrecan in der Synovialflüssigkeit
mittels des Nachweisverfahrens 1 beschrieben.
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(1) Ein Verfahren zum
Abbau oder zur Entfernung sowohl von an normalem Aggrecan gebundenem
Hyaluronan oder von freiem Hyaluronan in der Probe
-
Ungefähr 10 mg
Synovialflüssigkeit
einer normalen Versuchsperson oder eines Patienten mit Osteoarthritis,
rheumatoider Arthritis oder traumatischer Arthritis wurden genau
eingewogen und 10fach mit destilliertem Wasser verdünnt. Zu
80 μl der
verdünnten
Flüssigkeit
wurden 5 TRU (Turbidity Reducing Unit – Trbungsreduktionseinheit)/50 μl Hyaluronidase,
die von einem Streptomyces sp.-Mikroorganismus stammte (Seikagaku
Corporation), 80 μl
eines 100 mM Natriumacetatpuffers (pH-Wert: 6,0) und 80 μl einer Lösung eines
Proteaseinhibitors (100 mM 6-Aminocapronsäure, 10 mM Natriumethylendiamintetraacetat,
10 mM N-Ethylmaleimid, 10 mM Phenylmethansulfonylfluorid) gegeben,
gefolgt von einer 2stündigen
Digestion bei 40°C.
Mittels dieser Behandlung wurde Hyaluronan in der Probe zu Tetra-
oder Hexasacchariden abgebaut, die die Eignung zur Bindung von normalem
Aggrecan verloren hatten.
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(2) Ein Verfahren, in
dem die wie vorstehend beschrieben behandelte Probe in Kontakt mit
einer festen Phase gebracht wird, die zur Bindung oder zur Adsorption
von normalem Aggrecan geeignet ist, so dass normales Aggrecan in
der Probe an die feste Phase gebunden wird oder von der festen Phase
adsorbiert wird
-
Zu
der behandelten Probe wurde eine geeignete Menge eines Hyaluronidase-Inhibitors
(Quecksilberchlorid, Kaliumhexacyanoferrat(III), und ähnliches)
gegeben und ein Teil der so behandelten Probe wurden auf eine Platte
gegeben, die 96 Vertiefungen bzw. Löcher aufwies (96-well plate,
Mikroplatte), und an die Hyaluronan kovalent gebunden worden war.
In diesem Beispiel wurde eine Aminoplatte verwendet, die von Sumitomo Bakelite
Co. hergestellt worden war, und an die Hyaluronan unter Verwendung
von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbo diimid kovalent gebunden
worden war. Nach einer 4stündigen
Inkubation bei 15°C
wurde die Platte ausreichend mit einem Lochplatten-Reinigungsgerät gewaschen.
-
(3) Ein Verfahren zur
Bestimmung von normalem Aggrecan, das an die feste Phase gebunden
ist oder von der festen Phase adsorbiert wurde.
-
Eine
Lösung
eines monoklonalen Anti-Keratansulfat-Antikörpers (Klon-Name: 5D4, Unterklasse
IgGI, von Seikagaku Corporation hergestellt)
wurde auf die Lochplatte gegeben und zwei Stunden lang bei 4°C stehen
gelassen. Die Lochplatte wurde gewaschen, es wurde peroxidase-markierter
Anti-Maus-IgG-Antikörper (von
Seikagaku Corporation hergestellt) zugegeben, und die Lochplatte
wurde weitere zwei Stunden bei 4°C stehen
gelassen. Nach dem Waschen und dem Anfärben mit o-Phenylendiamin entsprechend
dem herkömmlichen
Verfahren wurde die Extinktion mit einem Lochplatten-Leser (Well-reader
SK60) (Seikagaku Corporation) ermittelt. Die Konzentration an normalem
Aggrecan in der Synovialflüssigkeit
wurde aus einer unabhängig unter
Verwendung von Rinderaggrecan (von Seikagaku Corporation hergestellt)
erstellten Kalibrierungskurve berechnet.
-
Die
Zugabe von 1 μg
eines Verknüpfungsproteins,
das getrennt vorbereitet worden war, zu der Probe, wenn die Probe
in Kontakt mit der vorstehend erwähnten festen Phase gebracht
wurde, mittels eines Verfahrens, das dem vorstehend beschriebenen
Verfahren gleicht, lieferte Ergebnisse, die denjenigen glichen,
die nachstehend beschrieben sind. Die Vorbereitung des verwendeten
Verknüpfungsproteins
erfolgte mittels der in Zoku Seikagaku Jikken Koza, Bd. 4, Approach
on Complex Carbohydrates II, S. 253–263, 16. Jan. 1986, von Tokyo
Kagaku Dojin Kabushiki Kaisha veröffentlicht, beschriebenen Cäsiumchlorid-Sedimentationsgleichgewichtszentrigfugation.
-
(4) Ergebnisse
-
Tabelle
1 listet die Konzentration von normalem Aggrecan, die Konzentration
von anderem Proteoglycan (PG) als normalem Aggrecan, und den Prozentsatz
an normalem Aggrecan im ge samten Proteoglycan in der menschlichen
Synovialflüssigkeit
auf, die mittels der vorstehend erwähnten Verfahren bestimmt wurden.
-
Die
Konzentration des gesamten Proteoglycans wurde unter Verwendung
eines monoklonalen Anti-Keratansulfat-Antikörpers und von Rinderaggrecan
als Standard, entsprechend einem früher berichteten Verfahren (Ratcliffe,
A., et al.: Ann. Rheum. Dis., 47, 826 (1988)) bestimmt. Die Konzentration
an anderem Proteoglycan als normalem Aggrecan wurde durch Subtraktion
der Konzentration von normalem Aggrecan von derjenigen des gesamten
Proteoglycans berechnet. Tabelle
1
- Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung
- Ein Signifikanztest erfolgte bei einem Unterschied zu den Normalwerten
- *: p < 0,05
- **: P < 0,01
-
Obwohl
die Anzahl der Versuchspersonen klein war, nämlich 4 bis 10 betrug, war
der Prozentsatz an normalem Aggrecan in kranken Gelenken deutlich
geringer, was darauf hindeutet, dass Aggrecan in diesen Gelenken
abgebaut worden war. Die Konzentration an normalem Aggrecan war
bei Osteoarthritis (OA) oder rheumatoider Arthritis (RA) deutlich
niedriger, unterschied sich aber nicht bei der traumatischen Arthritis
(TA) im Vergleich zu normalen Versuchspersonen. Die Konzentration
an anderem Proteoglycan als normalem Aggrecan war bei traumatischer
Arthritis (TA) jedoch charakteristisch erhöht. Somit ermöglicht die
Bestimmung der Konzentration und des Prozentsatzes von normalem
Aggrecan eine Unterscheidung der Gelenkerkrankung und liefert Informationen über die
Knorpelzerstörung.
-
Die
Konzentration an C6S, das als Markermolekül angesehen wird, war bei traumatischer
Arthritis deutlich höher
als bei normalen Versuchspersonen, obwohl sie sich bei der Osteoarthritis
nicht von der normaler Versuchspersonen unterschied und bei der
rheumatoiden Arthritis eher niedriger war.
-
Mittels
des Nachweisverfahrens 2 wurden bei den gleichen Proben ebenfalls ähnliche
Ergebnisse erhalten.
-
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
-
Die
Erfindung ist für
die biochemische Diagnose von Gelenkerkrankungen auf dem Gebiet
der Orthopädie
nützlich.
Die Bestimmung der Konzentration von normalem Aggrecan und des Prozentsatzes
an normalem Aggrecan im gesamten Proteoglycan ist für die Unterscheidung
zwischen einem normalen Gelenk und einem kranken Gelenk, zum Verständnis der
Krankheitszustände,
wie der Art der Gelenkerkrankung und der Erstellung der Prognose,
als auch für
die Beurteilung der Wirkung der Therapien nützlich.