DE69830422T2

DE69830422T2 - Zyklische nukleotid-vermittelte ionenkanal verbindungen aus hirn und herz sowie deren verwendungen

Info

Publication number: DE69830422T2
Application number: DE69830422T
Authority: DE
Inventors: R. Eric KANDEL; Bina Santoro; Dusan Bartsch; Stephen Siegelbaum; Gareth Tibbs; Seth Grant
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 1997-12-23
Filing date: 1998-12-23
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2018-12-24
Also published as: US20040142421A1; AU2016099A; EP1042460A4; EP1042460A1; CA2315891A1; US6703485B2; JP2002508930A; EP1042460B1; EP1609856A2; DE69830422D1; WO1999032615A1; ATE296880T1; MXPA00006306A; EP1609856A3; US20030118988A1

Description

Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der US-Seriennr. 09/086,436, eingereicht am 28. Mai 1998, welche eine Continuation-in-part der US-Seriennr. 08/997,685, eingereicht am 23. Dezember 1997, ist, deren Inhalt hiermit durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeschlossen wird.
Im Verlauf dieser Anmeldung wird auf verschiedene Publikationen durch Angabe von Autor und Datum Bezug genommen. Vollständige Zitate für diese Publikationen können alphabetisch aufgelistet am Ende der Beschreibung, dem Sequenzprotokoll und den Ansprüchen unmittelbar vorangestellt, gefunden werden. Die Offenbarungsgehalte dieser Publikationen werden in ihren Gesamtheiten hiermit durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeschlossen, um den Stand der Technik vollständiger darzustellen.
Hintergrund der Erfindung
Einleitung
Ionenkanäle sind eine mannigfaltige Gruppe von Proteinen, die den Ionenfluss durch zelluläre Membranen regeln. Im Nervensystem hat sich Ionenkanalaktivität zu einem schnellen und präzisen System zur interzellulären Kommunikation entwickelt. Die Charakteristika der elektrischen Erregbarkeit jedes Neurons ist teilweise durch den Satz von Kanälen, den es exprimiert, bestimmt. Jedoch sind Zellen ebenso in der Lage, die Aktivität einzelner Kanäle in Antwort auf physiologische oder entwicklungsbedingte Ereignisse zu regulieren und Nachweise mehren sich, dass Ionenkanäle die Integrationsstelle multipler elektrischer und biochemischer Pfade sein können.
Ionenkanäle scheinen in vivo multimere Proteine zu sein, die mehrere verschiedene Genfamilien beinhalten, die für Kanäle mit verschiedenen strukturellen und funktionalen Eigenschaften kodieren. Innerhalb einer Genfamilie ergibt sich das Potential für Heterogenität aus der kombinatorischen Anordnung von verschiedenen Poren formenden und Hilfs-Untereinheiten (Greene, et al., 1995). Kanaleigenschaften können durch Second-Messenger-Kaskaden moduliert werden und können intrazelluläre Proteine wie beispielsweise Kinasen direkt binden, wodurch angedeutet wird, dass dies ein wichtiger Weg sein kann, um die Signalkaskade effizient auf ihr Effektormolekül zu richten. Die elektrischen Eigenschaften jedes Neurons sind teilweise durch den Satz an Ionenkanälen, die es exprimiert, bestimmt. Jedoch sind Zellen zudem in der Lage, die Aktivität der einzelnen Kanäle in Antwort auf physiologische oder entwicklungsbedingte Ereignisse zu regulieren; Poren-formende (α)-Untereinheiten können mit einer Vielfalt an intrazellulären Proteinen, einschließlich Hilfs(β)-Untereinheiten, Zytoskelett-assoziierten Proteinen und Proteinkinasen interagieren (Greene, et al., 1995). Neben Hilfs-(β)-Untereinheiten können Poren-formende Einheiten mit einer Vielfalt an intrazellulären Proteinen und Second-Messenger-Molekülen, sich selbst einschließend G-Proteine, Zytoskelett-assoziierten Proteinen und Proteinkinasen interagieren (Adelman, et al., 1995).
Mehrere Klassen von Ionenkanälen binden direkt und sind reguliert durch Second-Messenger-Moleküle wie beispielsweise zyklische Nukleotide (Zagotta, et al., 1996; Bruggemann, et al., 1993; und Hoshi, et al., 1995) oder Ca⁺² (Adelman, et al., 1992; Kohler, et al., 1996). Kanäle mit dieser Eigenschaft können Schlüsselelemente in der Kontrolle neuronaler Signalgebung sein, indem sie biochemische Kaskaden direkt mit elektrischer Aktivität koppeln. Zyklisch-Nukleotid-gesteuerte Kanäle (CNG), spielen eine ausgeprägte Rolle sowohl bei der visuellen als auch bei der olfaktorischen Signaltransduktion; ihre kürzliche Identifizierung im Hippocampus und in anderen Regionen des Gehirns, in denen cAMP und cGMP dafür bekannt sind, dass sie verschiedene Formen der synaptischen Plastizität vermitteln (Krapivinisky, et al., 1995; Frey, et al., 1993; Bolshakov, et al., 1997; und Arancio, et al., 1995), deutet an, dass CNG-Kanäle ebenso zur Regulierung der Erregbarkeit in zentralen Neuronen beitragen kann (Kingston, et al., 1996 und Bradley, et al., 1997).
Das erste strukturelle Gen für einen K⁺-Kanal, das isoliert wurde, war das Gen, das durch den Shaker (Sh) Lokus in Drosophila melanogaster kodiert wird (Strong, et al., 1993; Papazian, et al., 1987). Seine Sequenz ist der Prototyp einer großen und nach wie vor wachsenden Familie verwandter Gene (Kamb, et al., 1987; Warmke, et al., 1994). Die Eigenschaften einer Anzahl gut charakterisierter K⁺-Ströme, die immer noch auf eine molekulare Definition warten, sagen voraus, dass andere Mitglieder dieser Familie noch identifiziert werden müssen (Atkinson, et al., 1991).
Obwohl die ersten Mitglieder der K⁺-Kanal-Superfamilie durch chromosomale Lokalisation von Allelen, die für funktionelle Defekte (Sh, eag und slo von Drosophila; (Papazian, et al., 1987; Kamb, et al., 1987; Warmke, et al., 1991; Atkinson, et al., 1991) verantwortlich sind, oder im Anschluss an die Reinigung eines verhältnismäßig reichlich vorkommenden Proteins, wie beispielsweise des cGMP-Kanals aus der bovinen Netzhaut (Liman, et al., 1994) kloniert wurden, erfolgt die am häufigsten verwendete Strategie zum Klonieren neuer Mitglieder der K⁺-Kanal-Superfamilie durch Homologie zu diesen Sequenzen.
Leider ist dieser Ansatz zum Identifizieren stärker divergierender Sequenzen und potenzieller neuer Zweige im phylogenetischen Baum der K⁺-Kanal-Superfamilie nicht gut geeignet. Expressionsklonierung in Xenopus-Oozyten kann dieses Problem umgehen; dies impliziert eine vor-existierende oder leicht detektierbare physiologische Charakterisierung des Kanals.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine isolierte Nukleinsäure bereit, die für ein BCNG-Protein oder einen Teil davon kodiert. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine isolierte Nukleinsäure bereit, die für ein BCNG-verwandtes Protein oder einen Teil davon kodiert. Im Weiteren stellt die vorliegende Erfindung einen Vektor bereit, der cDNA umfasst, die für mBCNG-1 (ATCC Accession No. 209781) kodiert. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein isoliertes BCNG-Protein bereit. Ferner stellt die vorliegende Erfindung auch ein isoliertes BCNG-verwandtes Protein bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich eine Zusammensetzung bereit, die eine Nukleinsäure, die für ein BCNG-Protein oder einen Teil davon oder ein BCNG-verwandtes Protein oder einen Teil davon kodiert sowie einen Trägerstoff umfasst. Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ferner eine Zusammensetzung bereit, die ein BCNG-Protein oder einen Teil davon oder ein BCNG-verwandtes Protein oder einen Teil davon sowie einen Trägerstoff umfasst.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäuresonde bereit, die in der Lage ist, spezifisch mit einer Nukleinsäure, die für ein BCNG-Protein oder BCNG-verwandtes Protein kodiert, zu hybridisieren.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren einer Nukleinsäure in einer Probe bereit, die für ein BCNG-Protein oder ein BCNG-verwandtes Protein kodiert, das umfasst: (a) in Kontakt bringen der Probe mit einer Nukleinsäuresonde, die in der Lage ist, spezifisch mit einer Nukleinsäure, die für ein BCNG-Protein oder ein BCNG-verwandtes Protein kodiert, zu hybridisieren unter Bedingungen, die die Ausformung eines Komplexes zwischen der Nukleinsäuresonde und der Nukleinsäure, die für das BCNG-Protein oder das BCNG-verwandte Protein kodiert, in der Probe erlaubt; (b) Bestimmung der in Schritt (a) geformten Menge an Komplex; und (c) Vergleichen der in Schritt (b) bestimmten Menge an Komplex mit der unter Verwendung einer willkürlichen Sequenz geformten Menge an Komplex, wobei das Ausformen einer größeren Menge an Komplex mit der BCNG-spezifischen Sonde die Anwesenheit einer Nukleinsäure, die für ein BCNG-Protein oder ein BCNG-verwandtes Protein kodiert, in der Probe anzeigt.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zu testen, ob eine Verbindung die Expression eines BCNG-Proteins oder eines BCNG-verwandten Proteins beeinflusst, das umfasst: (a) in Kontakt bringen der Probe, die ein BCNG-Protein oder ein BCNG-verwandtes Protein exprimiert mit einer Verbindung; (b) Bestimmen der Menge an Expression von BCNG-Protein oder BCNG-verwandtem Protein in der Probe; und (c) Vergleichen der in Schritt (b) bestimmten Expressionsmenge von BCNG-Protein oder BCNG-verwandtem Protein mit der Menge, die in der Abwesenheit der Verbindung bestimmt wurde.
Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung bereit, die in der Lage ist, mit einem BCNG-Protein oder einem BCNG-verwandten Protein zu interagieren, das umfasst: (a) in Kontakt bringen einer Probe, die ein BCNG-Protein oder ein BCNG-verwandtes Protein exprimiert, mit einer Verbindung unter Bedingungen, die die Ausformung eines Komplexes zwischen der Verbindung und dem BCNG-Protein oder dem BCNG-verwandten Protein erlauben; (b) Bestimmen der Menge an Komplex, der zwischen der Verbindung und dem BCNG-Protein oder dem BCNG-verwandten Protein geformt wird; (c) Vergleichen der in Schritt (b) geformten Menge an Komplex mit der in der Abwesenheit der Verbindung geformten Menge, wobei eine größere Menge an Komplex, die in der Anwesenheit der Verbindung geformt wurde, die Anwesenheit einer Verbindung anzeigt, die in der Lage ist, mit einem BCNG-Protein oder einem BCNG-verwandten Protein zu interagieren.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren einer Komponente bereit, die in der Lage ist, die Aktivität von BCNG-Protein oder BCNG-verwandtem Protein zu modulieren, die umfasst: (a) in Kontakt bringen einer Probe, die in BCNG-Protein oder ein BCNG-verwandtes Protein exprimiert, mit einer Verbindung; (b) Bestimmen der Menge an Aktivität des BCNG-Proteins oder BCNG-verwandten Proteins in der Probe; und (c) Vergleichen der in Schritt (b) bestimmten Menge an Aktivität des BCNG-Proteins oder des BCNG-verwandten Proteins mit der in der Abwesenheit der Verbindung bestimmten Menge, wobei eine Zu- oder Abnahme der Aktivität die Anwesenheit einer Verbindung anzeigt, die in der Lage ist, die Aktivität des BCNG-Proteins oder des BCNG-verwandten Proteins zu modulieren.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Behandeln eines Zustands in einem Subjekt bereit, das das Verabreichen einer Menge der bereitgestellten Verbindung an das Subjekt umfasst, die wirksam ist, den Zustand zu behandeln.
Schließlich stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die die bereitgestellte Verbindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Kurze Beschreibung der Figuren
1A-1D. Primärstruktur von mBCNG-1. 1A. Abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2), kodiert durch die mBCNG-1 cDNA. Die sieben hydrophoben Domänen, die zu den sechs Transmembrandomänen (S1-S6) und der Pore (P) von K⁺-Kanäle homolog sind, sind angezeigt (___). Die mutmaßliche zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle (CNBs) ist durch ein (- - -) gekennzeichnet, C-terminale Proline (. . .) der Konsensus-N-Glykosylierungsstelle mit vermutlich extrazellulärer Lokalisation (*) sind ebenfalls gekennzeichnet. 1B. Kyte-und-Doolittle-Hydrophobizitätsplot der vorhergesagten Aminosäuresequenz von mBCNG-1. Das Profil wurde mittels des Kyte-und-Dolittle-Verfahrens mit einer Fenstergröße von 7 Aminosäuren erstellt. Die Zahlen auf der oberen Linie bezeichnen die Position in der mBCNG-1-Sequenz. Hydrophobe Bereiche, die dem S1 bis einschließlich S6 und dem P-Bereich entsprechen, liegen unterhalb der Nulllinie, während sich die N-Glykosylierungsstelle (*) in einem hydrophilen Bereich zwischen S5 und P befindet. Die Nummerierung (obere Linie) zeigt die Position in der mBCNG-1-Sequenz an. Profile wurden mit einer Fenstergröße von 7 Resten erstellt. 1C. Mehrfaches Alignment des mutmaßlichen P-Bereichs von mBCNG-1 mit den P-Bereichen von Drosophila-Eag (DEAG), Maus-Eag (MEAG), humanem Erg (HERG), α-Untereinheit des bovinen Netzhaut CNG-Kanals (BRET-1) und β-Untereinheit des humanen Netzhaut CNG-Kanals (HRET-2). Pfeilspitzen kennzeichnen die Reste 344 und 352 (siehe Beispiel 1). 1D. Alignment der (CNBs) von BCNG-1 mit der entsprechenden Stelle im Ratten olfaktorischen CNG-Kanal (ROLF-1), bovinen cGMP-abhängigen Proteinkinase (PKG), bovinen cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA), und Katabolitaktivatorprotein von E, coli (CAP).
Durchgehende Linien kennzeichnen α-helikale (α) und β-Strang-(β) Elemente der sekundären Strukturelemente von CAP, während Sterne spezifische Aminosäuren, die anscheinend dicht am cAMP-Molekül in der CAP-Kristallstruktur liegen, anzeigen.
2A-2D. mBCNG-1 ist ein 132 kDA glykosyliertes Protein. 2A. Western Blot Analyse von BCNG-1-Protein in einem Mäusegehirnextrakt. Pro Streifen wurden zehn μg eines Gesamtgehirn-SDS-Extrakts geladen, anschließend mit αq1 (1) oder αq2 (3) Antiserum oder Streifen 2 mit αq1 (2) oder αq2 (4) Antiserum, das mit GST-d5-Fusionsprotein vorabsorbiert wurde, inkubiert. Der Pfeil kennzeichnet die Position des spezifischen Signals, das dem nativen mBCNG-1-Protein entspricht. 2B. Western Blot unter Verwendung des αq1-Antiserums gegen: Gesamtgehirnextrakt (1), Gesamtgehirnextrakt, vorbehandelt mit N-Glykosidase F (2) und in vitro translatiertes mBCNG-1-Protein (3). Die Positionen des Molekulargewichtsstandards sind auf der linken Seite dargestellt. Ferner ist ein Western Blot dargestellt, der je 10 μg Protein jedes der angegebenen Gehirngewebe enthält, der mit einem Antiserum gegen mBCNG-1 getestet wurde und weitverbreitete Expression des mBCNG-1-Proteins in Mäusegehirn zeigt. 2C. zeigt Reaktivität mit αq1 an. 2D. zeigt Reaktivität mit αq2 an.
3. Northern Blot Analyse der mBCNG-1-Expression in verschiedenen Mausgeweben. Je zwei μg Poly(A)⁺-RNA von jedem der folgenden Gewebe wurden verwendet: Herz (H), Gehirn (B), Milz (S), Lunge (Lu), Leber (Li), Skelettmuskel (M), Niere (K) und Hoden (T) wurden geladen. Der Filter wurde mit einem DNA-Fragment, das für die Aminosäuren 6-131 der mBCNG-1-Sequenz kodiert, untersucht. Eine Sonde, die den Aminosäuren 594-720 entspricht, erkannte dieselben Bande und bestätigt dadurch, dass die cDNA-Fragmente, die aus den λgt10- und pJG4-5-Bibliotheken isoliert wurden, von einer zusammenhängenden mRNA-Sequenz stammen. Die Positionen der Molekulargewichtsstandards sind auf der linken Seite dargestellt.
4. In situ-Hybridisierungsanalyse von mBCNG1-Expression im Gehirn. Parasagittaler Schnitt durch ein Mäusegehirn, der mit einem Gegenstrang Antisense-Oligonukleotid inkubiert wurde, das gegen den mRNA-Bereich, der den Aminosäuren 648-657 der mBCNG-1-Sequenz entspricht, gerichtet ist. Abkürzungen: nCtx, Neocortex; Hp, Hippocampus; Crb, Cerebellum; BrSt, Stammhirn.
5A-5F: Immunhistochemische Analyse der mBCNG-1-Expression im Gehirn. Parasagittale Schnitte eines Mäusegehirns wurden mit αq1- und αq2-Antiseren gefärbt. Die Muster der mBCNG-1-Expression, die mit den zwei verschiedenen Antiseren detektiert wurden, waren identisch, und in beiden Fällen wurde die Färbung durch Voradsorption der Seren mit dem GST-d5-Fusionsprotein vollständig verhindert. mBCNG-1-Immunreaktivität im Cortex cerebralis. 5C-5D. mBCNG-1-Immunreaktivität im Hippocampus. In 5C zeigt der Pfeil die Position der hippocampalen Fissuren; Bereiche CA₁, CA₃ und Gyrus dentatus (DG) sind gekennzeichnet. 5D zeigt ein Detail des Stratum pyramidale von Bereich CA₃. 5E-5F. mBCNG-1-Immunreaktivität im Cerebellum. (5A, 5C, 5E: 60×; 5B, 5D, 5F: 100×) Vergrößerung.
6A-6B. Southern Blot Analyse von genomischer Maus-DNA. 4 μg genomischer Maus-DNA wurden nach Verdau mit Eco RI (1), Hind III (2), Bam HI (3), Pst I (4) oder Bgl II (5) auf jede Spur geladen. Der Filter wurde mit einem DNA-Fragment, das die Aminosäuren 269-462 der BCNG-1-Sequenz kodieren, bei hoher (6A) und niedriger (6B) Stringenz untersucht. Die Positionen der Molekulargewichtsstandards sind auf der linken Seite dargestellt.
7A-7C. Schematische Darstellung der Maus- und Mensch-BCNG-Klone. 7A-7B. Vorhergesagte Struktur von mBCNG-1 (Santoro et al., 1997) mit sechs Transmembrandomänen (S1-S6), Porenregion (P), zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle (CNBs) und langem C-terminalem Schwanz, einschließlich eines Polyglutaminstretches (Q). Die vorhergesagten Sequenzen, kodiert durch die partiellen cDNA Klone von drei anderen Maus- und zwei humanen BCNG-Genen, sind in einem provisorischen Alignment zu mBCNG-1 dargestellt. Linien mit zweiköpfigen Pfeilen über der Sequenz zeigen an, ob das Fragment von einer cDNA-Bibliothek (λgt10 oder pJG4-5), RT-PCR-Reaktion oder EST-Datenbank erhalten wurde. Gestrichelte Linien mit doppelköpfigen Pfeilen unterhalb der Sequenz zeigen die Position der hierin verwendeten Sonden an (siehe Beispiele 1-5 im Abschnitt Experimentelle Details). Die unterteilte Box im 5'-Bereich von mBCNG-4 zeigt die Position des möglichen Introns in dem M28-EST-Klon an. 7C. Prozent Sequenzähnlichkeit zwischen BCNG-Genen von Maus und Mensch. Die Alignments wurden durchgeführt, indem ausschließlich die Kernbereiche der Proteine, die den Aminosäuren 111-419 (Nummerierung gemäß mBCNG-1, siehe 8), unter Einbeziehung der Transmembrandomänen Sl-S6, verglichen wurden.
8A bis 8B. Alignments des BCNG-Proteins von Maus und Mensch. Provisorische Alignments der vorhergesagten Aminosäuresequenzen für die vier Maus- (mBCNG-1, 2, 3 und 4) und die zwei humanen Gene (hBCNG-1 und 2). Die vorgeschlagenen strukturellen Eigenschaften des Proteins (die mutmaßliche Transmembranregion, der Porenbereich und die zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle) sind angezeigt (siehe ebenso 5). (-) zeigt die Reste an, die identisch zu mBCNG-1 sind; abweichende Reste sind anderweitig gekennzeichnet. (.) zeigt eine Lücke (oder Deletion) in den gegenübergestellten Sequenzen an. (*) am Ende der Sequenz zeigt ein Stoppkodon an. (*) über Position 327 kennzeichnet die N-Glykosylierungsstelle von mBCNG-1. Der Pfeil kennzeichnet die einzelne Konsensus-PKA-Phosphorylierungsstelle in BCNG-1 und BCNG-2.
9A-9D. Northern Blot Analyse der BCNG-Genexpression in Maus. Multiple Gewebe Northern Blot mit verschiedenen Geweben, der je 2 μg PolyA⁺-RNA von jedem der folgenden Mausgewebe beinhaltet: Herz (He), Gehirn (Br), Milz (Sp), Lunge (Lu), Leber (Li), Skelettmuskel (Mu), Niere (Ki) und Hoden (Te) wurden mit DNA-Fragmenten, die den angezeigten BCNG-Genen entsprechen, hybridisiert. Die molekularen Größenmarker sind auf der linken Seite angezeigt.
10A-10D. Northern Blot Analyse der humanen BCNG-Genexpression. 10A-10B. Multiple Humangewebe Northern Blot mit verschiedenen humanen Geweben, der je 2 mg polyA⁺-RNA von jedem der folgenden Gewebe beinhaltet: Herz (He), Gehirn (Br), Plazenta (Pl), Lunge (Lu), Leber (Li), Skelettmuskel (Mu), Niere (Ki) und Bauchspeicheldrüse (Pa) wurden mit DNA-Fragmenten, die den angegebenen BCNG-Genen entsprechen, hybridisiert. 10C-10D. Die gleichen Fragmente wurden verwendet, um einen multiplen Gewebe-Blot des humanen Gehirns, der 2 μg polyA⁺-RNA von jedem der angegebenen Gewebe beinhaltet zu untersuchen: Amygdala (Am), Nucleus caudate (Cn), Corpus callosum (CC), Hippocampus (Hi), Gesamthirn (Br), Substantia nigra (SN), Nucleus subthalamicus (Sn) und Thalamus (Th). Die Molekulargewichtsmarker sind auf der linken Seite angezeigt.
11. Schematische Darstellung der gewöhnlichen Architektur des BCNG-Kanalproteins, basierend auf der Homologie zu den spannungsabhängigen K⁺-Kanälen und den zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanälen.
12. Alignment der spannungsabtastenden S4-Bereiche des prototypischen spannungsabhängigen K⁺-Kanals Shaker und des zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanals bRET1 mit der S4-Sequenz von mBCNG-1 (SEQ ID NO: 2). Umrahmte Reste sind positiv geladene Aminosäuren in einer oder mehreren der S4-Sequenzen. Die Sterne zeigen die Position der in der bRET1-Sequenz vorkommenden Aminosäuren mit negativ geladenen sauren Seitenketten an.
13A-13B. 13A. Sequenzalignment der funktionellen zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle von Katabolitaktivatorprotein (CAP, Aiba et al., 1982; Cossart & Gicquel, 1982), A- und B-Stellen von rekombinanten bovinen R1α- (PKAa und PKAb, Titani et al., 1984), bovinen Netzhaut-Kanal α-Untereinheit (bRET1, Kaupp et al., 1989) und die Wels-olfaktorische α-Untereinheit (fOLF1, Goulding et al., 1992) zusammen mit den mutmaßlichen zyklisch-Nukleotid-Bindungsstellen von Drosophila Ether-a-gogo (dEAG, Warmke et al., 1991), Arabidopsis Thaliana K-Transportprotein (KAT1, Anderson et al., 1992) und mBCNG-1 (SEQ ID NO: 2) (hierin beschrieben). Die sechs Reste, die vollständig innerhalb der Bindungsstellen konserviert sind, deren funktionale Kompetenz eindeutig bestätigt wurde, sind durch Sterne gekennzeichnet. Das konservierte Arginin, das eine ionische Bindung mit dem zyklischen Nukleotid eingeht, ist durch ein mit Pfeil markiertes R559 gekennzeichnet. Der Rest in der dritten (C) α-Helix, für den gezeigt werden konnte, dass sie die Kopplung der Aktivierung zu cAMP- versus cGMP-Bindung beeinflusst, ist durch ein mit Pfeil markiertes D604 gekennzeichnet (die cGMP-selektive Substitution in bRET1). 13B. Schematische Darstellung der zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle von bRET1, die die kritischen Interaktionen zwischen der Bindungsstelle und dem zyklischen Nukleotid zeigt. Dieses Modell der Bindungstasche basiert auf der Kristallstruktur von CAP und bovinem R1α. Das cGMP ist gebunden in einer verlängerten – oder Anti-Form mit dem zyklisierten Phosphat, das eine Ionenbindung mit Arginin559 (bRET1-Nummerierung) eingeht und dem Purinring, der günstige Kontakte mit D604 in diesem cGMP-selektiven Kanal ausformt, gezeigt.
14. Alignment der "P-Loop" porenformenden Bereiche des prototypischen spannungsabhängigen K⁺-Kanals Shaker und des zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanals bRET1 mit der S4-Sequenz von mBCNG-1. Die gegenübergestellten Kanäle sind mBCNG-1 (SEQ ID NO: 2), Shaker (SHAK, Papazian et al, 1987; Kamb et al., 1988), SHAW, Wei, et al., 1990), Kalzium-aktivierter K-Kanal (MSLO, Pallanck und Ganetzky, 1994) der pflanzlichen Einwärtsgleichrichter (AKT, Sentenac et al., 1992), Drosophila- und Maus-ether-a-gogo's (DEAG, Warmke et al., 1991; MEAG, Warmke und Ganetzky, 1994) humanes ether-a-gogo-verwandtes Gen (HERG, Warmke und Ganetzky, 1994), bovine Netzhaut α-Untereinheit (bRET1, Kaupp et al., 1989) und humane Netzhaut β-Untereinheit (HRET-2, Chen et al., 1993). Die Pfeile kennzeichnen die Positionen, wo die BCNG-Kanäle bekannte und potenziell wichtige Sequenzänderungen gegenüber dem normalen Motiv zeigen, das in K-selektiven Kanälen gesehen wird.
15A-15B. Schematische Darstellung des repetitiven Auslösens eines Schrittmacherneurons und seine Beteiligung an der Erzeugung und Regulierung von rhythmischen Auslösungsmustern. 15A. Zeigt, dass Ih-Aktivierung nach Hyperpolarisation einem Aktionspotential folgt. Da dies ein nicht-selektiver kationischer Strom ist, trägt dies einen Einwärtsstrom zu diesen Potentialen, was zur Depolarisation der Zelle zurück zur Schwelle für die Auslösung des nächsten Aktionspotentials führt. 15B. Zeigt die Aktion der sympathischen und den Vagus betreffenden Stimulation auf der Aktivität von Kardiozyten vom Sinusknoten – dem Schrittmacherareal des Herzens. Norepinephrin (NE) führt zu einer Verlagerung in der Aktivierung von Ih zu mehr depolarisierten Potentialen, die die Rückkehr zum Aktionspotential-Auslösungsschwellenwert beschleunigen, und führt infolgedessen zu einer Beschleunigung der Auslösungsfrequenz. Im Gegensatz dazu verlagert Acetylcholin (ACh) die Aktivierung von Ih zu mehr hyperpolarisierten Potentialen. Dadurch wird sich der Strom während der Polarisationsphase später einschalten, wodurch sich die Rückkehr zum Schwellenwert verzögert – die Auslösungsfrequenz der Zelle wird daher verlangsamt. Von diesen Änderungen in den Aktivierungseigenschaften von Ih wird angenommen, dass sie auf Änderungen in der Konzentration von cAMP zurückzuführen sind, wobei ACh die Konzentration verringert und NE die Konzentration erhöht, wodurch nachweislich die Aktivierungseigenschaften von Ih modifiziert werden ("Principles of Neural Science" von Kandel, Schwartz und Jessell 1991).
16-16F. mBCNG-1-Expression führt zu einem Hyperpolarisations-aktivierten Strom, der dem nativen neuronalen Schrittmacherstrom gleicht. 16A. Ströme, ausgelöst durch 3-s-Hyperpolarisationen von einem Haltepotential von –40 mV zu Potentialen, die sich von –60 bis –130 mV in Schrittgrößen von 5 mV erstrecken. 16B. Verhältnis zwischen stationärem Strom am Ende des hyperpolarisierenden Schrittes und "Patch"-Spannung. 16C. Schweifströme, aufgenommen nach Rückkehr zu –40 mV, folgend auf Hyperpolarisationen zu verschiedenen Testspannungen. Die Aufzeichnungen wurden anhand einer erweiterten Zeitskala dargestellt, um die Schweifströme hervorzuheben. 16D. Mittleres Verhältnis zwischen Schweifstromamplitude und Spannung während des hyperpolarisierenden Schrittes. Für jeden Patch wurden die Schweifstromdaten normiert auf die maximale Schweifstromamplitude, die von einer Anpassung der Boltzmann-Gleichung erhalten wurde (siehe Beispiel 4, im Abschnitt Experimentelle Details). Normierte Schweifströme wurden anschließend für 5 Patches gemittelt. Mittlerer V1/2 = –100,0 mV, Steigung = 5,8 mV. 16E. Aktivierungszeitkurve von mBCNG-1-Strömen. Die Daten wurden bei 5 kHz erhoben und nach Berücksichtigung einer initialen Verzögerung wurden die Ströme während der Spannungsschritte zwischen –105 und 130 mV durch einzelne Exponentialfunktionen angepasst (glatte Linien). 16F. Verhältnis zwischen mittleren Zeitkonstanten von Aktivierung und Spannung. In den oberen Experimenten war die extrazelluläre Lösung KCl/NaCl-CaCl₂, und die intrazelluläre Lösung war KCl/NaCl-EGTA (siehe Beispiel 4, Experimentelle Verfahren).
17A-17C. mBCNG-1 ist ein Kationenkanal, der Kalium gegenüber Natrium geringfügig bevorzugt. 17A. Schweifströme, die auf depolarisierende Stufen zu verschiedenen Testpotentialen erhalten wurden, die auf einen 0,3-Sek.-Schritt zu –130 mV folgten, um den mBCNG-1-Strom zu aktivieren. Testpotentiale, die von –60 bis +20 mV in 5 mV Schrittgröße reichen (neben den alternierenden Stromspuren angegeben). Die extrazelluläre Lösung war NaCl-EGTA, während die intrazelluläre Lösung KCl-EGTA war. 17B. Ein gleichartiges Schweifstromprotokoll wurde verwendet, um ein Umkehrpotential nach Umschalten auf die niedrige Cl, KAspartat-EGTA-Lösung in dem Bad zu messen. 17C. Schweifstromamplitude als eine Funktion der Membranspannung während des Schweifs. Die offenen Symbole repräsentieren die Stromamplituden, die mit der KCl-EGTA-Lösung in dem Bad bestimmt wurden (o, initiale Messung, E_rev = –32,8 ± 2,5, n = 3; ☐, folgend dem Auswaschen der KAspartat-EGTA-Lösung, E_rev = –31,2 ± 1,6, n = 3). Die ausgefüllten Kreise repräsentieren die Messungen, die in der Anwesenheit der K-Aspartat-Lösung gemacht wurden (E_rev = –28,2 ± 1,6, n = 4). In allen drei Schaltfeldern ist der Nullstrom-Schwellenwert durch eine horizontale gestrichelte Linie angezeigt.
18A-18C. Der mBCNG-1-Kanal wird durch externes Cs, aber nicht durch externes Ba blockiert, ähnlich wie bei nativen Schrittmacherkanälen. mBCNG-1-Stromaufzeichnungen von einem "Outside-out-Patch". In 18A-18C sind der Strom am Haltepotential (–40 mV) und in Antwort auf eine Hyperpolarisation zu –130 mV überlagert. 18A und 18B. mBCNG-1-Stromaufzeichnungen von einem Outside-out-Patch. Ströme am Haltepotential (–40 mV) und in Antwort auf einen Schritt zu –130 mV sind überlagert. Die sequenziellen Aufzeichnungen wurden erzielt, als die extrazelluläre Oberfläche der KCl/NaCl-CaCl₂-Lösung (Kontrolle) oder Lösungen, in denen 2 mM CsCl isoosmotisch das NaCl oder 1 mM BaCl₂ das CaCl₂ ersetzten, exponiert war. Die intrazelluläre Lösung war KCl/NaCl-EGTA. 18C. Verhältnis der Dosisantwort für die Inhibierung des mBCNG-1-Stroms durch Cs. Die Messdaten sind der Mittelwert von 6 Patches (nicht jeder davon bei jeder Konzentration bestimmt). Die durchgehende Linie zeigt eine Anpassung der Hill-Gleichung, I/Imax = 1/{1+(IC₅₀/[Cs])ⁿ}, wobei [Cs] die Cs-Konzentration, IC₅₀ die halbmaximale inhibitorische Konzentration von Cs, n der Hill-Koeffizient, I der Strom in der Anwesenheit von Cs und Imax der nichtinhibierte Strom ist. Die Anpassung führt zu einem IC₅₀ von 201 μM und einem Hill-Koeffizienten von 1,08.
19A-19C. Der mBCNG-1-Kanal wird direkt durch zytoplasmatisches cAMP reguliert. 19A. mBCNG-1-Stromaufzeichnung von einem "Inside-out-Patch" in Antwort auf eine Hyperpolarisation zu –100 mV in der Abwesenheit oder Anwesenheit von 1 μM cAMP in der intrazellulären Lösung (KCl-EGTA). Die extrazelluläre Lösung war KCl-CaCl₂. 19B. Aufzeichnung von einem anderen Patch in der Abwesenheit oder Anwesenheit von 30 μM cAMP (die gleichen Lösungen wie in A). 19C. (Linke Abbildung) Schweifstromaktivierungskurve in der Abwesenheit und Anwesenheit von 1 μM cAMP für den Patch, der in A dargestellt ist. Die Messdaten wurden analysiert und aufgezeichnet wie in 1D beschrieben. Kurvenanpassung durch Boltzmann-Relation mit folgenden Parametern: 0 μM cAMP: V_1/2 = –100 mV, Steigung = 5,4 mV und I_{Schweif, max} = –33,8 pA; 1 μM cAMP: V_1/2 = –98 mV, Steigung = 5,3 und I_{Schweif, max} = –33,7 pA. (Rechte Abbildung) Mittlere Schweifstromaktivierungskurven für Patches in Abwesenheit (ausgefüllte Kreise) und Anwesenheit (offene Kreise) von cAMP.
Messdatendurchschnitt von 5 Patches. cAMP-Konzentrationen reichten von 1 – 3000 μM, für cAMP, V_1/2 = 98,3 mV, Steigung = 6 mV.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine isolierte Nukleinsäure, die ein BCNG-Protein oder einen Teil davon kodiert, bereit. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine isolierte Nukleinsäure, die ein BCNG-verwandtes Protein oder einen Teil davon kodiert, bereit.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung wird das BCNG-Protein von der in mBCNG-1 (ATCC Accession No. 209781) (SEQ ID NO: 1) dargestellten Sequenz kodiert. Gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung ist die Nukleinsäure DNA oder RNA. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Nukleinsäure cDNA. Gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung hat die cDNA die in SEQ ID NO: 1 für mBCNG-1 (ATCC Accession No. 209781) dargestellte Nukleotidsequenz. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, umfassend die Nukleinsäure. Gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung umfasst der Vektor virale oder Plasmid-DNA. Eine Ausführungsform dieser Erfindung umfasst die Nukleinsäure und regulatorische Elemente. Eine Ausführungsform dieser Erfindung ist ein Wirt-Vektor-System, das den bereitgestellten Expressionsvektor in einem geeigneten Wirt umfasst.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung einen Vektor bereit, der cDNA umfasst, die für mBCNG-1 kodiert (ATCC Accession No. 209781).
In einer Ausführungsform dieser Erfindung ist der geeignete Wirt eine bakterielle Zelle, eine eukaryotische Zelle, eine Säugerzelle oder eine Insektenzelle.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein isoliertes BCNG-Protein bereit. Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes BCNG-verwandtes Protein bereit.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung hat das BCNG-Protein die in SEQ ID NO: 2 für mBCNG-1 dargestellte Aminosäuresequenz (8A-8B). Gemäß einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung hat das BCNG-verwandte Protein eine Aminosäuresequenz mit wesentlicher Homologie zu der in SEQ ID NO: 2 für mBCNG-1 dargestellten Aminosäuresequenz (8A-8B).
Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich eine Zusammensetzung bereit, die eine Nukleinsäure, die ein BCNG-Protein oder einen Teil davon oder ein BCNG-verwandtes Protein oder einen Teil davon kodiert sowie einen Träger umfasst. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Nukleinsäure im Wesentlichen dieselben kodierenden Sequenzen wie die in SEQ ID NO: 1 für mBCNG-1 dargestellte kodierende Sequenz oder einen Teil einer solchen kodierenden Sequenz.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung weiterhin eine Zusammensetzung bereit, die ein BCNG-Protein oder einen Teil davon oder ein BCNG-verwandtes Protein oder einen Teil davon sowie einen Träger umfasst.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung umfasst das BCNG-Protein die in SEQ ID NO: 2 mBCNG-1 dargestellte Aminosäuresequenz (8A-8B).
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäuresonde bereit, die in der Lage ist, spezifisch mit einer Nukleinsäure, die für ein BCNG-Protein oder BCNG-verwandtes Protein kodiert, zu hybridisieren. Eine Ausführungsform dieser Erfindung ist eine Nukleinsäuresonde, die in der Lage ist, spezifisch mit der bereitgestellten Nukleinsäure zu hybridisieren. Gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung ist die Sonde in der Lage, spezifisch mit der Nukleinsäuresequenz, die in SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 dargestellt ist, zu hybridisieren.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren einer Nukleinsäure in einer Probe bereit, die ein BCNG-Protein oder ein BCNG-verwandtes Protein kodiert, das umfasst: (a) in Kontakt bringen der Probe mit einer Nukleinsäuresonde, die in der Lage ist, spezifisch mit der Nukleinsäure, die für ein BCNG-Protein oder ein BCNG-verwandtes Protein kodiert, zu hybridisieren unter Bedingungen, die die Ausformung eines Komplexes zwischen der Nukleinsäuresonde und der Nukleinsäure, die für das BCNG-Protein oder das BCNG-verwandte Protein kodiert, in der Probe erlauben; (b) Bestimmen der in Schritt (a) geformten Menge an Komplex; und (c) Vergleichen der in Schritt (b) bestimmten Menge an Komplex mit der unter Verwendung einer beliebigen Sequenz geformten Menge an Komplex, wobei eine größere Menge an Komplex, die mit der BCNG-spezifischen Sonde geformt wurde, die Anwesenheit einer Nukleinsäure in der Probe anzeigt, die für ein BCNG-Protein oder ein BCNG-verwandtes Protein kodiert.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung umfasst Schritt (a) weiterhin das Amplifizieren der Nukleinsäuremoleküle, die für das BCNG-Protein oder das BCNG-verwandte Protein kodieren. Gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung umfasst die Amplifizierung das in Kontakt bringen der Nukleinsäuremoleküle von der Probe mit mindestens einem Amplifikationsprimer, der in der Lage ist, spezifisch mit mBCNG-1 (SEQ ID NO: 1) zu hybridisieren unter Bedingungen, die für die Polymerasekettenreaktion geeignet sind. In einer Ausführungsform dieser Erfindung wird das amplifizierte Nukleinsäuremolekül, das für das BCNG-Protein oder das BCNG-verwandte Protein kodiert, durch Größenfraktionierung detektiert. Eine Ausführungsform dieser Erfindung umfasst weiterhin das Isolieren des Komplexes durch Größenfraktionierung. Gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung wird die Nukleinsäuresonde mit einem detektierbaren Marker markiert. In einer Ausführungsform dieser Erfindung ist der detektierbare Marker ein radioaktivmarkiertes Molekül, ein fluoreszierendes Molekül, ein Enzym, ein Ligand oder ein magnetisches Bead. Gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung umfasst die Sonde die in SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14. SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 dargestellte Nukleotidsequenz. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Nukleinsäuresonde in der Lage, spezifisch mit einer Nukleinsäure zu hybridisieren, die für mBCNG-1 (SEQ ID NO: 1) kodiert. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine vormals unbekannte isolierte Nukleinsäure bereit, die durch die bereitgestellte Amplifikationsmethode identifiziert wurde. In einer Ausführungsform umfasst die Probe Zellen oder Zellextrakt oder Zelllysat oder eine Gewebeprobe oder eine Probe eines biologischen Fluids.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Testen bereit, ob eine Verbindung die Expression eines BCNG-Proteins oder eines BCNG-verwandten Proteins moduliert, das umfasst: (a) in Kontakt bringen der Probe, die ein BCNG-Protein oder ein BCNG-verwandtes Protein exprimiert mit einer Verbindung; (b) Bestimmen der Menge an Expression von BCNG-Protein oder BCNG-verwandtem Protein in der Probe; und (c) Vergleichen der in Schritt (b) bestimmten Expressionsmenge von BCNG-Protein oder BCNG-verwandtem Protein mit der Menge, die in der Abwesenheit der Verbindung bestimmt wurde, dabei bestimmend, ob die Verbindung die BCNG-Protein-Expression oder BCNG-verwandtes Protein-Expression moduliert. Die vorliegende Erfindung stellt eine solche Methode zum Screenen einer großen Anzahl von Verbindungen bereit, um zu bestimmen, ob eine oder mehr dieser Verbindungen die Aktivität eines BCNG-Proteins oder eines BCNG-verwandten Proteins moduliert oder die Expression der Nukleinsäure moduliert, die entweder für ein BCNG-Protein oder ein BCNG-verwandtes Protein kodiert.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung weiterhin ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung bereit, die in der Lage ist, mit einem BCNG-Protein oder einem BCNG-verwandten Protein zu interagieren, das umfasst: (a) in Kontakt bringen der Probe, die ein BCNG-Protein oder ein BCNG-verwandtes Protein exprimiert, mit einer Verbindung unter Bedingungen, die die Ausformung eines Komplexes zwischen der Verbindung und dem BCNG-Protein oder dem BCNG-verwandten Protein erlauben; (b) Bestimmen der Menge an Komplex, die zwischen der Verbindung und dem BCNG-Protein oder dem BCNG-verwandten Protein geformt wird; (c) Vergleichen der in Schritt (b) geformten Menge an Komplex mit der Menge, die in der Abwesenheit der Verbindung geformt wird, wobei eine größere Menge an Komplex, die in der Anwesenheit der Verbindung geformt wird, die Anwesenheit einer Verbindung anzeigt, die in der Lage ist, mit einem BCNG-Protein oder einem BCNG-verwandten Protein zu interagieren.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung bereit, die in der Lage ist, die Aktivität von BCNG-Protein oder BCNG-verwandtem Protein zu modulieren, das umfasst: (a) das in Kontakt bringen einer Probe, die ein BCNG-Protein oder ein BCNG-verwandtes Protein exprimiert, mit einer Verbindung; (b) Bestimmen der Menge an Aktivität des BCNG-Proteins oder BCNG-verwandten Proteins in der Probe; und (c) Vergleichen der in Schritt (b) bestimmten Menge an Aktivität des BCNG-Proteins oder des BCNG-verwandten Proteins mit der Menge, die in der Abwesenheit der Verbindung bestimmt wird, wobei eine Zu- oder Abnahme in der Aktivität die Anwesenheit einer Verbindung anzeigt, die in der Lage ist, die Aktivität des BCNG-Proteins oder des BCNG-verwandten Proteins zu modulieren.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verbindungen oder Zusammensetzungen bereit, die durch die hierin beschriebenen Verbindungs-Screeningverfahren als zum Modulieren der Aktivität oder Expression von BCNG-Protein oder BCNG-verwandten Protein in der Lage zu sein identifiziert wurden.
Eine Ausführungsform dieser Erfindung ist Schritt (a), umfassend zuerst das Einbringen der Nukleinsäure, die für ein BCNG-Protein oder ein BCNG-verwandtes Protein kodiert, in ein Expressionssystem und Veranlassen des Expressionssystems, die Nukleinsäure zu exprimieren unter Bedingungen, unter denen ein BCNG-Protein oder ein BCNG-verwandtes Protein produziert wird. Eine andere Ausführungsform dieser Erfindung ist, wobei Schritt (b) das Messen des elektrischen Kanalstroms oder des intrazellulären Kalziumspiegels in der Anwesenheit der Verbindung umfasst. In einer weiteren anderen Ausführungsform dieser Erfindung umfasst das Expressionssystem eine kultivierte Wirtszelle.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung umfasst das BCNG-Protein die Aminosäuresequenz von mBCNG-1 (SEQ ID NO: 2) oder einen Teil davon. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Probe eine Zelle, Zelllysat oder zellfreie Translation. In einer anderen Ausführungsform ist die Zelle eine Herzzelle, eine Nierenzelle, eine Leberzelle, eine Atemwegsepithelzelle, eine Muskelzelle, eine neuronale Zelle, eine Gliazelle, eine Mikrogliazelle, eine Endothelzelle, eine mononukleäre Zelle, eine Tumorzelle, eine Säugerzelle, eine Insektenzelle oder eine Xenopus-Oozyte.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine bisher unbekannte Verbindung bereit, die durch die Screeningverfahren hierin identifiziert wurde. Gemäß einer Ausführungsform ist die Verbindung ein Peptid, ein Peptidomimetikum, eine Nukleinsäure, ein Polymer oder ein Small Molecule. Das Small Molecule kann ein organisches oder anorganisches Molekül sein. Das Small Molecule kann ein gegenüber einem BCNG-Protein geringeres Molekulargewicht aufweisen. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung an einen festen Untergrund gebunden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das BCNG-Protein oder das BCNG-verwandte Protein ein Ionenkanalprotein oder ein Protein, das eine Untereinheit eines Ionenkanaluntereinheitenproteins ist. In einer Ausführungsform ist das BCNG-verwandte Protein eine Komponente, die für die Erzeugung eines Schrittmacherstroms in und unter Zellen benötigt wird. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung ein Agonist oder Antagonist der Ionenkanalaktivität.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Modulation zunehmende Ionendurchflussrate oder abnehmende Ionendurchflussrate. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist die Modulation zunehmende Ionendurchlässigkeit oder abnehmende Ionendurchlässigkeit.
Die vorliegende Erfindung stellt auch weiterhin ein Verfahren zum Modulieren der BCNG-Protein Aktivität oder BCNG-verwandtes Protein Aktivität in einer Probe bereit, das das in Kontakt bringen der Probe mit der bereitgestellten Verbindung umfasst.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung weiterhin ein Verfahren zum Behandeln eines Zustands in einem Subjekt bereit, das das Verabreichen einer Menge der bereitgestellten Verbindung an das Subjekt umfasst, die wirksam ist, den Zustand zu behandeln. Der Zustand umfasst einen abnormalen Zustand. Der abnormale Zustand kann Gedächtnisschwund, ein das Herz betreffender Zustand, ein die Leber betreffender Zustand, ein Problem mit zellulären Sekretionen, ein die Bauchspeicheldrüse betreffender Zustand, ein Schrittmacherzustand im Gehirn oder ein Schrittmacherzustand in nicht-neuronalen Zellen sein.
Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die die bereitgestellte Verbindung sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. In einer Ausführungsform dieser Erfindung ist der Träger ein Verdünnungsmittel, ein Aerosol, ein topischer Träger, eine wässrige Lösung, eine nicht-wässrige Lösung oder ein fester Träger.
Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich auch ein Verfahren zum Behandeln eines Zustands in einem Subjekt bereit, das das Verabreichen einer Menge der bereitgestellten pharmazeutischen Zusammensetzung an das Subjekt umfasst, die wirksam ist, den Zustand im Subjekt zu behandeln.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Zustand ein neurologischer, ein die Nieren betreffender, die Lunge betreffender, die Leber betreffender oder kardiovaskulärer Zustand. Gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung ist der Zustand Epilepsie, Alzheimer-Krankheit, Parkinsonsche Krankheit, Long-QT-Syndrom, Sick-Sinus-Syndrom, altersabhängiger Gedächtnisverlust, zystische Fibrose, Sudden-death-Syndrom, Hyperalgesie, ventrikuläre oder atriale Arrhythmien, familiengebundene Sinusknotenerkrankung oder eine Schrittmacherrhythmusdysfunktion. In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung ist das Subjekt ein Mensch. Bestimmte zusätzliche Verfahren zum Behandeln von Erkrankungen in einem Subjekt werden im Folgenden hierin diskutiert. Die Long-QT-Erkrankung ist eine kardiale Erkrankung, wobei Aktionspotentiale länger andauern als sie normalerweise sollten. Das Sick-Sinus-Syndrom ist eine erworbene Erkrankung (z. B. nach Vorhofflimmern), wobei der Sinusknoten nicht normal funktioniert.
Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich auch einen Antikörper bereit, der spezifisch an ein BCNG-Protein oder an ein BCNG-verwandtes Protein bindet. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine Zelle bereit, die in der Lage ist, den Antikörper zu produzieren. Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich ein Verfahren zum Identifizieren eines BCNG-Proteins oder eines BCNG-verwandten Proteins in einer Probe bereit, das umfasst: (a) in Kontakt bringen der Probe mit einem Antikörper unter Bedingungen, die das Ausformen eines Komplexes zwischen dem Antikörper und dem Protein erlauben; (b) Bestimmen der Menge an geformten Komplex; und (c) Vergleichen der in Schritt (b) geformten Menge an Komplex mit der in der Abwesenheit des Antikörpers geformten Menge an Komplex, wobei die Anwesenheit einer erhöhten Menge an Komplex, die in der Anwesenheit des Antikörpers geformt wird, die Identifikation des Proteins in der Probe anzeigt.
Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff "BCNG-Protein" ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen ähnlich zu oder identisch mit mBCNG-1 ist. Ein Beispiel eines BCNG-Proteins ist mBCNG-1. Ein BCNG-Protein kann ein Homolog von mBCNG-1 in einer anderen Spezies als Maus oder Mensch, sein. Alternativ kann ein BCNG-Protein ein anderes Mitglied der Familie von BCNG-Proteinen in Maus, Mensch oder anderen Säuger- oder Nicht-Säugerspezies sein. Ein BCNG-Protein kann als eine integrale Komponente oder Untereinheit eines Ionenkanals fungieren. Ein BCNG-Protein kann ein akzessorisches Protein oder ein nicht-funktionales Protein sein, das mit einem Ionenkanal assoziiert ist.
Der Begriff "BCNG-verwandtes Protein" umfasst ein Protein, das eine wesentliche Homologie zu mindestens einer funktionalen Domäne eines BCNG-Proteins wie hierin beschrieben aufweist. (siehe Beispiel 3, 11 und 13). Eine solche Domäne ist beispielsweise der hydrophobe Kern (siehe Beispiel 3, Unterabschnitt "Der hydrophobe Kern"). Ein anderes Beispiel einer funktionalen Domäne ist die S4- Spannungsabtastende Domäne (siehe Beispiel 3, Unterabschnitt "Der S4- Spannungsabtastende Domäne"). Ein weiteres anderes Beispiel einer funktionalen Domäne ist die zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle (siehe Beispiel 3, Unterabschnitt "Die zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle"). Noch ein anderes Beispiel ist die Porendomäne (siehe Beispiel 3, Unterabschnitt "Die Pore"). Ein BCNG-verwandtes Protein kann demnach als eine integrale Komponente oder Untereinheit eines Ionenkanals fungieren. Ein BCNG-verwandtes Protein kann ein akzessorisches Protein oder in nicht-funktionales Protein sein, das mit einem Ionenkanal assoziiert ist. Ein BCNG-verwandtes Protein ist definiert durch eine Sequenz- oder strukturelle Homologie zu einem BCNG-Protein oder zu einem Teil davon. Folglich ist ein BCNG-Protein ein BCNG-verwandtes Protein, jedoch ist ein BCNG-verwandtes Protein nicht beschränkt auf BCNG-Proteine.
Die Aminosäuresequenz von m-BCNG-1 ist dargestellt als SEQ ID NO: 2. Diese Sequenz wurde in der GenBank Datenbank hinterlegt und ihr die GenBank Accession Number AF028737 zugeteilt.
Ein BCNG-Protein weist eine wesentliche Sequenzähnlichkeit zu mBCNG-1 auf. Ein BCNG-verwandtes Protein weist eine wesentliche Homologie oder funktionale Verwandtschaft zu mBCNG-1 auf. Wesentliche Sequenzhomologie beinhaltet die Berücksichtigung konservierter Aminosäureaustausche, wie diese von einem Fachmann verstanden werden. Funktionale Verwandtschaft kann anhand von Domänen oder Sequenzbereichen ermittelt werden, die Ähnlichkeiten aufweisen, welche durch Bereiche ohne ersichtliche Homologie getrennt sind.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die ein BCNG-Protein oder einen Teil davon, ein BCNG-verwandtes Protein oder einen Teil davon, eine Nukleinsäure, die für ein BCNG-Protein oder einen Teil davon kodiert, eine Nukleinsäure, die für ein BCNG-verwandtes Protein oder einen Teil davon kodiert, einen Antikörper gegen ein BCNG-Protein oder einen Teil davon, einen Antikörper gegen ein BCNG-verwandtes Protein oder einen Teil davon, eine Nukleinsäure mit einer Sequenz antisense zu einem Teil von entweder einem BCNG-Protein oder einem BCNG-verwandten Protein oder jede andere beschriebene Verbindung der vorliegenden Erfindung umfasst. Die Zusammensetzung kann weiterhin einen Träger umfassen. Der Träger kann ein pharmzeutisch verträglicher Träger sein.
Wie hierin verwendet, ist ein "Teil davon" eine Sequenz (beispielsweise eine Aminosäuresequenz oder eine Nukleotidsequenz), die weniger als die gesamte Sequenz umfasst. Beispielsweise stellen in Bezug auf SEQ ID NO: 2 die Aminosäuren 35-45 einen Teil davon dar.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "spezifisch hybridisieren", dass eine Nukleinsäuresonde mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die eine wesentliche Homologie mit der der Sonde aufweist. Die Sequenz muss nicht identisch oder einzigartig sein. Dennoch muss die Sequenz eine strukturelle oder funktionale Beziehung zwischen den Sequenzen anzeigen, wie dies im Stand der Technik verstanden wird.
Die Hybridisierung kann zwischen eng verwandten und weitläufig verwandten Mitgliedern einer Genfamilie unterscheiden. Die Reaktionsbedingungen können angepasst werden, um die Hybridisierung der einen Spezies zu optimieren und die Hybridisierung der anderen zu minimieren.
Für ein schlecht passendes Hybrid ist die Hybridisierung geringer und die Hybridisierungskurve ist gegen niedrigere Temperaturen verschoben. Wenn das Verhältnis der Frequenzkonstanten (Diskriminierungsverhältnis) für Kreuzhybridisierung und für Selbsthybridisierung gegen die Reaktionstemperatur aufgetragen wird, erhält man eine sigmoidale Kurve. Bei niedrigeren Temperaturen ist der Quotient groß, während sich bei höheren Temperaturen (näherungsweise T_m – 20 °C für perfekt passende Hybride) der Quotient an Null annähert. Das Verhältnis ist nützlich, indem es voraussagt, dass es durch Inkubieren bei niedrigeren Temperaturen einfacher sein sollte, zwischen weitläufig verwandten Sequenzen zu unterscheiden, während es durch Hybridisieren bei hohen Temperaturen einfacher sein sollte, zwischen eng verwandten Sequenzen zu unterscheiden.
Um zwischen eng verwandten Mitgliedern einer Sequenzfamilie zu unterscheiden, sollte die Hybridisierung unter einem toleranteren (entspannten) Kriterium stattfinden. Um eng verwandte Mitglieder zu detektieren, sollte die Hybridisierung unter einem stringenten Kriterium stattfinden. Ein einzelnes Kompromisskriterium wird nicht wirksam sein, weil verschiedene Mitglieder der Familie möglicherweise verschiedene Diskriminierungs-versus-Temperatur-Kurven aufweisen. Hybridisierung bei einem entspannten Kriterium, auf die ein Waschen unter stufenweise stringenteren Bedingungen folgt, kann zum Detektieren weitläufig verwandter Mitglieder einer Familie nützlich sein, ist jedoch zum Identifizieren eng verwandter Mitglieder nicht geeignet. Dies hängt möglicherweise damit zusammen, dass Hybridisierung und Waschen von verschiedenen Parametern abhängen. Hybridisierung hängt von der Nukleationsfrequenz ab, während das Waschen von der thermischen Stabilität (T_M) der Hybride abhängt. Demnach ist eine stringente Hybridisierung, gefolgt von einer stringenten Waschung, besser zum Detektieren eng verwandter Mitglieder einer Familie geeignet als tolerante Hybridisierung und ein stringentes Waschen.
Der Grad der Hybridisierung hängt vom Grad der Komplementarität, der Länge der zu hybridisierenden Nukleinsäuremoleküle und der Stringenzbedingungen in einem Reaktionsgemisch ab. Stringente Bedingungen werden durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die Temperatur, Salzkonzentration, Konzentration der Nukleinsäuren, Länge der Nukleinsäuren, Sequenz der Nukleinsäuren und Viskosität des Reaktionsgemisches. Stringentere Bedingungen erfordern eine größere Komplementarität zwischen den Nukleinsäuren um eine effektive Hybridisierung zu erzielen.
Ein bevorzugtes Verfahren der Hybridisierung ist die Blot-Hybridisierung. Siehe für zusätzliche Details betreffend die Blot-Hybridisierung Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.
Wie hierin verwendet, ist eine Nukleinsäuresonde eine Nukleinsäure, die spezifisch mit einer bestimmten Nukleinsäuresequenz hybridisiert. Die Sonde kann unspezifisch an eine feste Matrix gebunden sein. Die Nukleinsäure kann DNA oder RNA sein und mit einem detektierbaren Marker markiert sein. Solche Markierungstechniken beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf radioaktive Markierung, Digoxygenin-Markierung und Biotin-Markierung. Ein sehr bekanntes Verfahren zum Markieren von DNA ist ³²P unter Verwendung von DNA-Polymerase, Klenow-Enzym oder Polynukleotidkinase. Zusätzlich sind nicht-radioaktive Techniken zur Signalamplifikation bekannt, die Verfahren zum Anfügen chemischer Reste an Pyrimidin- und Purinringen beinhalten (Dale, R.N.K. et al., 1973, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 2238-42), Verfahren, die die Detektion durch Chemilumineszenz erlauben (Barton, S.K. et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. 114: 8736-40) und Verfahren, die biotinylierte Nukleinsäuresonden verwenden (Johnson, T.K. et al., 1983 Anal. Biochem. 133: 125-131; Erickson, P.F. et al., 1982 J. Immunol. Methods 51: 241-49; Matthaei, F.S. et al., 1986 Anal. Biochem. 157: 123-28) sowie Verfahren, die die Detektion durch Fluoreszenz, unter Verwendung kommerziell erhältlicher Produkte erlauben. Nicht-radioaktive Markierungskits sind ebenso kommerziell erhältlich.
Die Nukleinsäureamplifikation ist in Mullis, US-Patent Nr. 4,683,202 beschrieben, das hierin durch Bezugnahme eingeschlossen wird.
In einer Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet eine Amplifikationsreaktion eine Matrizennukleinsäure, die in einer Probe enthalten ist, die ein oder mehr Sonden ("Primer") sowie induzierende Agenzien verwenden kann.
Enzyme, die zum Bewerkstelligen von Amplifikation, insbesondere Verlängerung, geeignet sind beinhalten beispielsweise E. coli DNA-Polymerase I, thermostabile Taq DNA-Polymerase, Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase I, T4 DNA-Polymerase, andere erhältliche DNA-Polymerasen, reverse Transkriptase und andere Enzyme, die die kovalente Bindung der Nukleotide an Polynukleotide, die die Amplifikationsprodukte bilden, fördern. Oligonukleotidsonden (Primer) können durch automatisierte Apparaturen synthetisiert werden, die von einer Reihe von Herstellern verkauft werden oder können kommerziell hergestellt werden.
Feste Matrizes stehen dem Fachmann zur Verfügung. Eine feste Matrix kann Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Polycarbonat oder jedes feste Kunststoffmaterial in der Form von Teströhrchen, Beads, Mikropartikeln, Dip-Sticks, Platten oder dergleichen beinhalten. Zusätzliche Matrizes beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf Membranen, 96-Well- Mikrotiterplatten, Teströhrchen und Eppendorf-Reaktionsgefäße. Feste Phasen beinhalten ebenso Glasbeads, Glasteströhrchen und jede andere geeignete aus Glas hergestellte Form. Eine funktionalisierte feste Phase wie beispielsweise Kunststoff oder Glas, die derart modifiziert worden ist, dass die Oberfläche Carboxyl-, Amino-, Hydrazid- oder Aldehydgruppen trägt, kann ebenso verwendet werden. Generell umfassen solche Matrizes jede Oberfläche, woran ein Ligand-bindendes Agens angefügt werden kann oder eine Oberfläche, die selbst eine Ligandanheftungsstelle bereitstellt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Modulation" hinsichtlich der Modulation von Proteinaktivität oder Ionenkanalaktivität auf die Hochregulierung oder Herunterregulierung der Aktivität. Hochregulierung beinhaltet, ist jedoch nicht beschränkt auf zunehmenden Ionendurchfluss im Falle einer Ionenkanals. Die Herunterregulierung beinhaltet, ist jedoch nicht beschränkt auf abnehmenden Ionendurchfluss im Falle eines Ionenkanals. Eine Form der Modulation der Aktivität ist beispielsweise ein Kanal-blockierendes Protein oder eine Verbindung, die den Ionendurchfluss durch den Kanal inhibiert und dadurch die Aktivität verringert. Alternativ ist eine andere Form der Modulation ein Kanal-öffnendes Protein oder eine Verbindung, die den Durchfluss durch den Kanal erleichtert und dadurch die Aktivität erhöht. Zusätzlich kann die Art des Ionendurchflusses durch den Kanal moduliert werden. Zum Beispiel können Proteine oder Verbindungen einen Kanal zu Kaliumdurchfluss hin verändern, um für Kaliumdurchfluss zusätzlich zu oder anstelle von anderen Ionen durchlässig zu werden. Der Begriff Modulation wird ebenso verwendet, um die Zunahme oder Abnahme der Genexpression zu beschreiben.
In der Anwendung jeglichen Verfahrens der Erfindung oder in der Herstellung jeglicher pharmazeutischer Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ist eine "therapeutisch wirksame Menge" eine Menge, die in der Lage ist, die Aktivität oder Funktion eines BCNG-verwandten Proteins zu modulieren. Entsprechend variiert die wirksame Menge mit dem zu behandelnden Subjekt sowie mit dem zu behandelnden Zustand. Die Verfahren zum Verabreichen können beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf kutane, subkutane, intravenöse, parenterale, orale, topische Verabreichung oder durch Aerosol.
Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff "geeigneter pharmazeutisch verträglicher Träger" jeden gewöhnlichen pharmazeutisch verträglichen Träger wie beispielsweise Phosphat-gepufferte Salinelösung, Wasser, Emulsionen wie beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen oder Triglyzerid-Emulsionen, verschiedene Arten von benetzenden Agenzien, Tabletten, beschichtete Tabletten und Kapseln. Ein Beispiel für eine verträgliche Triglyzerid-Emulsion, die zur intravenösen oder intraperitonealen Verabreichung der Verbindungen nutzbar ist, ist die kommerziell als Intralipid^® bekannte Triglyzerid-Emulsion.
Typischerweise beinhalten solche Träger Hilfsstoffe wie beispielsweise Stärke, Milch, Zucker, bestimmte Arten von Tonerde, Gelatine, Stearinsäure, Talkum, pflanzliche Fette oder Öle, Gummi, Glykole oder andere bekannte Hilfsstoffe. Solche Träger können ebenso Duft- oder Farbadditive oder andere Inhaltsstoffe beinhalten.
Diese Erfindung stellt ebenso pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung, zusammen mit geeigneten Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Lösungsmitteln, Emulgatoren, Adjuvantien und/oder Trägern. Solche Zusammensetzungen sind Flüssigkeiten oder lyophilisierte oder anderweitig getrocknete Formulierungen und beinhalten Verdünnungsmittel mit verschiedenartigem Puffergehalt (zum Beispiel Tris-HCl., Azetat, Phosphat), pH und Ionenfeldstärke, Additive wie beispielsweise Albumin oder Gelatine, um Absorption durch Oberflächen zu vermeiden, Detergentien (z. B. Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, Salze der Gallensäure), solubilisierende Agenzien (z. B. Glyzerin, Polyethylenglyzerin), Antioxidantien (z. B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Konservierungsmittel (z. B. Thimerosal, Benzylalkohol, Parabene), quellende Substanzen oder Tonizitätsmodifizierer (z. B. Laktose, Mannitol), kovalentes Anheften von Polymeren wie beispielsweise Polyethylenglykol an die Verbindung, Komplexierung mit Metallionen oder Inkorporierung der Verbindung in oder auf partikuläre Präparate polymerer Verbindungen wie beispielsweise Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Hydrogele, etc., oder auf Liposome, Mikroemulsionen, Mizellen, unilamellare oder multilamellare Vesikel, Erythrozytenghosts oder Sphäroplasten. Solche Zusammensetzungen werden den physikalischen Zustand, Löslichkeit, Stabilität, in vivo Freisetzungsrate und in vivo Klärungsrate der Verbindung oder Zusammensetzung beeinflussen.
Zusammensetzungen der kontrollierten oder aufrechterhaltenen Freisetzung beinhalten Formulierungen in lipophilen Depots (z. B. Fettsäuren, Wachse, Öle). In der Erfindung sind ebenso inbegriffen partikuläre Zusammensetzungen, die mit Polymeren beschichtet sind (z. B. Poloxamere oder Poloxamine) und an Antikörper, die gegen gewebespezifische Rezeptoren gerichtet sind, an Liganden oder an Antigene oder an Liganden gewebespezifischer Rezeptoren gebundene Verbindungen inbegriffen. Andere Ausführungsformen der Zusammensetzungen der Erfindung beinhalten partikuläre Formen protektiver Beschichtungen, Proteaseinhibitoren oder Permeationsverstärker für verschiedene Wege der Verabreichung, einschließlich der parenteralen, pulmonaren, nasalen und oralen.
Bei Verabreichung werden die Verbindungen häufig schnell aus dem Blutkreislauf entfernt und können daher eine verhältnismäßig kurzlebige pharmakologische Aktivität zur Folge haben. Infolgedessen können, um eine therapeutische Wirksamkeit aufrecht zu erhalten, regelmäßige Injektionen verhältnismäßig hoher Dosen der bioaktiven Verbindungen erforderlich sein. Verbindungen, die durch die kovalente Anlagerung von wasserlöslichen Polymeren wie beispielsweise Polyethylenglykol, Copolymeren von Polyethylenglykol und Polypropylenglykol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon oder Polyprolin modifiziert werden, sind dafür bekannt, dass sie gegenüber korrespondierenden nicht-modifizierten Verbindungen wesentlich längere Halbwertszeiten im Blut nach intravenöser Injektion aufweisen (Abuchowski et al., 1981; Newmark et al., 1982; und Katre et al., 1987). Solche Modifikationen können ebenso die Löslichkeit der Verbindung in wässriger Lösung erhöhen, Aggregation verhindern, die physikalische und chemische Stabilität der Verbindung erhöhen sowie die Immunogenität und Reaktivität der Verbindung stark reduzieren. Infolgedessen kann die gewünschte biologische in vivo Aktivität durch die gegenüber nicht-modifizierten Verbindungen weniger regelmäßig oder in geringeren Dosen erfolgende Verabreichung solcher Polymer-Verbindungsaddukte erreicht werden.
Die Anlagerung von Polyethylenglykol (PEG) an Verbindungen ist besonders nützlich, da PEG eine sehr geringe Toxizität in Säugern aufweist (Carpenter et al., 1971). So wurde beispielsweise in den Vereinigten Staaten ein PEG-Addukt von Adenosindeaminase zur Verwendung in Menschen für die Behandlung von schwerem kombiniertem Immundefekt (SCID) zugelassen. Ein zweiter Vorteil, der durch die Konjugation von PEG ermöglicht wird, ist der der wirksamen Reduzierung der Immunogenität und Antigenizität wirksam reduziert werden. So kann beispielsweise ein PEG-Addukt eines humanen Proteins zur Behandlung einer Erkrankung in anderen Säugerspezies nützlich sein, ohne das Risiko, eine schwere Immunantwort auszulösen. Der Träger beinhaltet eine mikroverkapselte Vorrichtung, um eine Wirt-Immunantwort gegen die Verbindung oder gegen Zellen, die die Verbindung herstellen, zu reduzieren oder zu vermeiden. Die Verbindung der vorliegenden Erfindung kann ebenso mikroverkapselt in einer Membran, wie beispielsweise einem Liposom, abgegeben werden.
Polymere wie beispielsweise PEG können in geeigneter Weise angelagert werden an eine oder mehrere reaktive Aminosäurereste in einem Protein wie beispielsweise die Alpha-Aminogruppe der aminoterminalen Aminosäure, der Epsilon-Aminogruppe von Lysinseitenketten, der Sulfhydrylgruppen von Cysteinseitenketten, der Carboxylgruppen von Aspartyl- und Glutamylseitenketten, der Alpha-Carboxylgruppe der carboxyterminalen Aminosäure, Tyrosinseitenketten, oder an aktivierte Derivate der Glycosylketten, die an bestimmte Asparagin-, Serin- oder Threoninreste angelagert sind.
Zahlreiche aktivierte Formen von PEG, die für die direkte Reaktion mit Proteinen geeignet sind, wurden beschrieben. Nützliche PEG-Reagenzien zur Reaktion mit Proteinaminogruppen beinhalten aktive Ester von Carbonsäure oder Carbonatderivaten, insbesondere diese, in welchen die austretenden Gruppen N-Hydroxysuccinimid, p-Nitrophenol, Imidazol oder 1-Hydroxy-2-nitrobenzen-4-sulfonat ist. PEG-Derivate, die Maleinimid- oder Haloacetylgruppen beinhalten, sind nützliche Reagenzien für die Modifizierung von proteinfreien Sulfhydrylgruppen. Gleichermaßen sind PEG-Reagenzien, die Aminohydracin- oder Hydracidgruppen beinhalten, nützlich zur Reaktion mit Aldehyden, die bei Periodatoxidation von Carbohydratgruppen in Proteinen gebildet wurden.
Das oben bezeichnete, durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte Plasmid, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20108-0971, USA gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt.
Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen in einem Subjekt
Die Verbindungen oder Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können an ein Subjekt verabreicht werden, um eine Erkrankung oder einen Zustand, der mit der Schrittmacherfunktion assoziiert ist, zu behandeln. Die Verbindungen oder Zusammensetzungen umfassen nicht nur BCNG-Proteine oder BCNG-verwandte Proteine und Nukleinsäuren, die dieselben oder Teile davon kodieren, sondern ebenso Verbindungen, die durch die Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden. Zum Beispiel kann eine Verbindung, die in der vorliegenden Erfindung nützlich ist, ein Peptid, ein Small Molecule (organisch oder anorganisch), ein Peptidomimetikum oder eine andere Verbindung, wie hierin oben beschrieben, sein.
Beispielsweise können die Verbindungen oder Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung nützlich zum Behandeln von Gedächtnisdefiziten oder -störungen sein. Solche Gedächtnisstörungen oder -defizite können eine abnormale Schrittmacherfunktion in den Zellen des Gehirns oder des zentralen Nervensystems beinhalten. Die Gedächtnisstörung oder das -defizit kann infolge der Alzheimer-Krankheit, der Parkinsonschen Erkrankung oder eines altersbedingten Gedächtnisverlustes auftreten.
Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zum Behandeln einer Wahrnehmungsstörung in einem Subjekt vor, das die Verabreichung von Verbindungen oder Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung an das Subjekt umfasst. Derartige Wahrnehmungsstörungen umfassen Wahrnehmungsstörungen der Augen (Blindheit, Verlust der Sehkraft), der Nase (Verlust des Geruchssinns), des Tastsinns (Taubheitsgefühl) und des Geschmacks (fehlende Fähigkeit zu schmecken).
In einem anderen Beispiel sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Behandeln eines Subjekts vor, das an einer das Gehör betreffenden Störung leidet, die das Verabreichen einer Menge der Verbindungen oder Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfasst. Es ist hierin unten gezeigt, dass BCNG-Isoformen in den Geweben des Gehörsystems in signifikanten Mengen exprimiert werden. Es kann möglich sein, die Antworteigenschaften der Zellen des Gehörsystems durch Regulierung des BCNG-Gens in diesen das Gehör betreffenden Geweben und Zellen zu verändern. Somit würde die Verabreichung von Nukleinsäuren oder Proteinen an das Subjekt (zum Beispiel mittels eines lokalisierten Virusvektors oder mittels eines Liposomträgerproteins) eine derartige, das Gehör betreffende Störung behandeln. Die Störung des Gehörs kann Taubheit oder Verlust des Gehörs sein.
In einer anderen Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Behandeln eines Subjekts vor, das an einer respiratorischen Störung, die entweder auf Defekte in ZNS- (zentrales Nervensystem) Bereichen, die die Atmung kontrollieren, oder auf Defekte in der Lunge zurückzuführen sind, die das Verabreichen einer Menge einer Verbindung oder Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an das Subjekt umfasst. Die Verbindung umfasst vorzugsweise die BCNG-Isoform oder eine Verbindung (z. B. ein Small Molecule), das mit der BCNG-Isoform interagiert, die normalerweise im Lungengewebe und/oder Zellkernen des Gehirns, die für die Atmungskontrolle wichtig sind, exprimiert werden. Die respiratorischen Störungen können plötzlicher Kindstod oder jedwede Schwierigkeit bei regulärer Atmung (z. B. Kurzatmigkeit) sein. Die respiratorische Störung kann Asthma sein.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Behandlung von Dyslexie in einem Subjekt bereit, die das Verabreichen der Verbindung oder Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an das Subjekt in einer Menge umfasst, die wirksam ist, die Dyslexie in dem Subjekt zu behandeln. Die vorliegende Erfindung stellt ebenso Verfahren zur Behandlung von Aufmerksamkeitsdefizitsyndrom oder Lernunvermögen bereit. Das Lernen betreffende Störungen können von abnormalem Funktionieren (entweder erhöhte oder verringerte) der im Thalamus vorhandenen Ionenkanäle resultieren. Diese Region des Gehirns gilt als involviert in Wachsamkeit, Aufmerksamkeit und Arousal. Störungen, die abnormale Zustände solcher Funktionen beinhalten, können unter Verwendung der Verbindungen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung behandelbar sein.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Behandeln vom Symptomen der Drogenabhängigkeit in einem Subjekt bereit, die das Verabreichen einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an das Subjekt umfasst, um dabei die Ionenkanalfunktion in dem Subjekt zu modulieren und die Symptome der Drogenabhängigkeit in dem Subjekt zu behandeln.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Regulieren der Sekretion einer normalerweise Sekret-produzierenden Zelle in einem Subjekt bereit, das an abnormaler Sekretion oder an Mangel an Sekretion leidet, welches das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindung oder Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an das Subjekt umfasst, um die Sekretion der Zelle zu regulieren. Die Verbindung oder Zusammensetzung kann die Ruhephase oder die Sekretionsphase der Zelle regulieren, um zu regulieren, wenn die Zelle Sekrete produziert. Die Zelle kann eine Bauchspeicheldrüsenzelle, eine Leberzelle oder eine Milzzelle sein.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Regulieren von Erholungserregung in Nicht-Schrittmacherzellen bereit.
Die BCNG-Proteine sind nützliche Targets zum Screenen von Arzneimitteln, die in der Kontrolle von Schmerz und Hyperalgesie wirksam sind. Schrittmachertypkanäle mit Eigenschaften, ähnlich denen des exprimierten BCNG-1-Proteins, wurden in direkten afferenten sensorischen Neuronen identifiziert, wo die Kanäle durch Prostaglandin E2, ein Hyperalgesie-induzierendes Agens, das während Entzündung freigesetzt wird, aktiviert werden (Ingram and Williams, 1996). Es wird angenommen, dass die Kanäle eine Rolle in Schmerzperzeption und Hypersensitivität gegenüber schmerzhaften Stimuli spielen. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Behandeln von Schmerz in einem Subjekt bereit, das das Verabreichen einer Menge der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an das Subjekt umfasst.
Die BCNG-Kanal-Isoformen, einschließlich BCNG-2, die in kardialen ventrikulären Muskeln exprimiert werden, sind nützliche Targets für Screens von Arzneimitteln, die beim Behandeln ventrikulärer und/oder atrialer Arrhythmien infolge abnormaler Schrittmacheraktivität in diesen Geweben wirksam sind. Schrittmacherkanäle mit abnormalen Aktivierungseigenschaften werden in Nicht-Schrittmacherbereichen des Herzens, einschließlich der Ventrikel, während einer Herzinsuffizienz detektiert (Cerbai et al., 1994, 1997).
Die BCNG-Gen-Isoformen, die im sinuatrialen Knoten exprimiert werden, können einen nützlichen genetischen Screen für vererbliche Erkrankungen der kardialen Schrittmacherfunktion, wie beispielsweise familiäre Sinusknotenerkrankung bereitstellen. Von bestimmten familiären, vererblichen kardialen Erkrankungen wird angenommen, dass sie Defekte in der Schrittmacherkanalfunktion der sinuatrialen Knoten involvieren (Spellberg, 1971).
Die BCNG-Isoformen, die im Herzen exprimiert werden, sind nützlich zum Screenen verbesserter Arzneimittel, die die Herzmuskelschädigung während Ischämieepisoden verringern. Für eine Schrittmacherkanalblockade mit der Verbindung ZD 7288 wurde gezeigt, dass die Infarktgröße während einer myokardialen Ischämie reduziert wurde (Schlack et al., 1998).
Die BCNG-Kanal-Isoformen werden als ein Screen für Arzneimittel nützlich sein, die die Funktion der Bauchspeicheldrüse verändern, einschließlich Verbindungen, die die Insulinausschüttung stimulieren oder inhibieren. Es wurde gezeigt, dass das humane BCNG-1-Protein in der Bauchspeicheldrüse exprimiert wird (Santoro et al., 1998).
Die BCNG-Kanal-Isoformen werden zum Screenen von Arzneimitteln nützlich sein, die die Funktion von Niere und Leber verändern. BCNG-Isoformen werden in diesen Geweben exprimiert, wo sie zu Hormonausschüttungs- und Ionentransportfunktionen beitragen können. Für renale Epithelzellen wurde eine zyklisch-Nukleotid- (cGMP) stimulierte Aktivität von einem 1 pS Kanal, ähnlich zu der Leitfähigkeit des Schrittmacherkanals berichtet (Marunada et al, 1991). Für Leberzellen wurde gezeigt, dass sie kationendurchlässige Kanäle, die an zelluläre Metabolismen gekoppelt sind, aufweisen (Lidofsky et al. 1997).
Die Erfindung wird im folgenden Abschnitt Experimentelle Details illustriert. Diese Abschnitte sind dargelegt, um zum Verständnis der Erfindung beizutragen, wobei jedwede Beschränkung der in den nachfolgenden Ansprüchen dargelegen Erfindung, weder beabsichtigt ist, noch daraufhin ausgelegt werden sollen.
EXPERIMENTELLE DETAILS
Beispiel 1: Interaktives Klonieren mit der SH3-Domäne der N-src identifiziert ein neues Gehirn-spezifisches Ionenkanalprotein mit Homologie zu zyklisch-Nukleotidgesteuerten Kanälen.
Beim Durchmustern von Molekülen, die mit der neuronalen Form von Src-Tyrosinkinase interagieren, wurde eine neue cDNA isoliert, die eine neue Klasse von Ionenkanälen darzustellen scheint. Das kodierte Polypeptid, mBCNG-1, ist entfernt verwandt mit Proteinen in der Familie der zyklisch-Nukleotidgesteuerten Kanäle und der spannungsabhängigen Kanäle, Eag und H-erg. mBCNG-1 wird ausschließlich im Gehirn als glykosyliertes Protein von näherungsweise 132 kD exprimiert. Die immunohistochemische Analyse zeigt, dass mBCNG-1 bevorzugt in spezifischen Untergruppen von Neuronen im Neocortex, Hippocampus und Cerebellum exprimiert wird, besonders in pyramidalen Neuronen und Korbzellen. Innerhalb individueller Neuronen ist, abhängig vom Zelltyp, das mBCNG-1-Protein entweder an den Dendriten oder den Axonendstücken lokalisiert.
Die Southern Blot Analyse zeigt, dass mehrere andere BCNG-verwandte Sequenzen im Maus-Genom vorhanden sind, wodurch das Aufkommen einer gänzlich neuen Unterfamilie von Genen, die für Ionenkanäle kodiert, angezeigt wird. Diese Erkenntnisse deuten die Existenz einer neuen Klasse von Ionenkanälen an, die möglicherweise in der Lage ist, Membran-Erregbarkeit im Gehirn zu modulieren und die auf Regulierung durch zyklische Nukleotide anspricht.
Das Definieren von Signaltransduktionspfaden, die zur Kontrolle der synaptischen Feldstärke im Gehirn beitragen, ist ein wichtiges und langverfolgtes Ziel. Im Zuge der Identifizierung der biochemischen Targets von Src-Familie Tyrosinkinasen im zentralen Nervensystem wurde das Hefe two-hybrid System zum Klonieren von Proteinen verwendet, die mit der SH3-Domäne der nervenspezifischen Form der Src-Kinase interagieren (Brugge, et al., 1985; Martinez, et al., 1987). Infolge dieses Screenings wurde ein neues Protein, mBCNG-1 (mouse Brain Cyclic Nucleotide Gated-1) identifiziert und isoliert.
mBCNG-1 wurde identifiziert und charakterisiert als ein Ionenkanalprotein und zeigt Sequenzhomologie zu spannungsabhängigen Kaliumkanälen, CNG-Kanälen und Pflanzen Einwärtsgleichrichter. Southern Blot Analyse deutet an, dass dies das erste Mitglied einer neuen Familie von Proteinen ist. mBCNG-1 wird ausschließlich im Gehirn exprimiert und ist vorzugsweise in den Fortsätzen der Untergruppen von Neuronen im Neocortex, Cortex cerebellaris und Hippocampus lokalisiert. Die spezifischen Lokalisationsmuster von mBCNG-1 und die Möglichkeit für eine direkte Interaktion mit zyklischen Nukleotiden deuten an, dass es ein neues gehirnspezifisches Ionenkanalprotein darstellt, welches eine wichtige Komponente in der Expression der interzellulären und intrazellulären Signalgebung ist.
Ergebnisse
Isolierung von mBCNG-1. mBCNG-1, eine neue cDNA mit Homologie zu CNG-verwandten und Eag-verwandten Ionenkanälen wurde ursprünglich isoliert und identifiziert durch interaktives Klonieren mit der N-src SH3-Domäne in einem Hefe two-hybrid Screen. Das src-Gen exprimiert eine alternativ gespleisste Form (N-src oder pp60^src-c(⁺), die spezifisch für neuronale Zellen ist und eine erhöhte Kinaseaktivität aufweist (Brugge, et al., 1985). Das N-src-Protein unterscheidet sich von der nicht-neuronalen Form (c-src oder pp60^src-c) durch eine Insertion von sechs Aminosäuren in der Region, die der Src-Homologie 3 (SH3)-Domäne des Proteins entspricht (Martinez et al. 1987). SH3-Domänen kommen als Module für Protein-Protein-Interaktion in Betracht (Pawson, et al., 1995). Hierzu wurde der Hefe two-hybrid Screen (Fields, et al., 1989; Zervos, et al., 1993) verwendet, um gehirnspezifische Proteine zu identifizieren, die selektiv mit der N-src SH3-Domäne interagieren würden.
Das Screenen von 5 × 10⁵ unabhängigen Klonen mit dem N-src SH3-"Bait" resultierte in der Isolierung eines einzelnen positiv reagierenden Fusionsprodukts (pJG-d5). Dieser Klon kodierte ein Protein, das eine starke Interaktion mit der N-src SH3-Domäne, jedoch keine signifikante Interaktion mit der c-src, fyn oder abl SH3-Domäne zeigte, wodurch ein spezifisches Erkennen der N-src SH3-Domäne im Hefe two-hybrid System angezeigt wird. Die Sequenzanalyse von pJG-d5 zeigte, dass es den C-terminalen Teil eines größeren Proteins kodiert. Deshalb wurden aus einer λgt10-Bibliothek überlappende cDNA-Klone isoliert und ein offener Leserahmen (ORF) wurde identifiziert, der für ein 910 Aminosäurepolypeptid mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 104 kDa kodiert (1A) aufweist. Das pJG-d5-insert entspricht seinen C-terminalen Aminosäuren 404-910.
Der N-terminale Teil des vorhergesagten Proteins beinhaltet einen hydrophoben Kern, der sieben hydrophobe Domänen umfasst (1B). Diese Domänen zeigen signifikante Homologie zu den sechs Transmembran-Domänen (S1-S6) und der Porenregion (P) von spannungsabhängigen K⁺-Kanälen (1C). Zusätzlich zu dem hydrophoben Kern, ist eine mutmaßliche zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle (CNBs) in der C-terminalen Hälfte des Proteins vorhanden (Aminosäuren 472-602, 1A und 1D). Diese zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle ist am engsten mit dem korrespondierenden Bereich in zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanälen verwandt (30% Ähnlichkeit). Die Aminosäuren, die im bakteriellen Katabolitaktivatorprotein (CAP) nahe dem gebundenen zyklischen Nukleotid liegen, sind im N-src-interagierenden Protein konserviert, was andeutet, dass das CNBs funktional ist (Weber et al., 1989). Auf der Basis dieser Merkmale wurde das neu identifizierte Protein als mBCNG-1 bezeichnet (Mouse Brain Cyclic Nucleotide Gated-1).
Unter all den bekannten K⁺-Kanal-Superfamilie-Genen, weist die Kernregion von mBCNG-1 die höchste Aminosäureähnlichkeit (22%) zu den korrespondierenden Bereichen im Maus Eag-Protein auf, wobei die Sequenzähnlichkeit zu zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanälen in diesem Bereich nur 17% beträgt (Abstände wurden durch das MegAlign Programm von DNASTAR bestimmt). Die S4 Domäne von mBCNG-1 weist insgesamt acht positiv geladene Reste auf (zwei Gruppen von vier, getrennt durch ein Serin), das sie wiederum ähnlicher zu spannungsabhängigen K⁺-Kanälen (Sh und eag Familien) als zu zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanälen macht.
Der mutmaßliche porenformende Bereich des mBCNG-1-Proteins (1C) ist ebenfalls sehr eng mit dem korrespondierenden Bereich in Shaker- und in Eag-verwandten Kanälen verwandt (30% Sequenzähnlichkeit in jedem Fall). Trotzdem beinhaltet es signifikante Substitutionen in zwei Positionen die andererseits in spannungsabhängigen K⁺-Kanälen hoch konserviert sind: Der Aspartatrest, der dem GYG-Triplet folgt, ist durch ein Alanin (Position 352) ersetzt und der Serin/Threoninrest bei –8 von dieser Position ist durch ein Histidin (Position 344) ersetzt. Ähnliche Substitutionen wurden in der β-Untereinheit des retinalen CNG-Kanals gefunden, wo die Position, die dem Aspartat entspricht, durch ein Leucin besetzt ist und ein Lysin bei –8 von dieser Position gefunden wird (Chen, et al., 1993). Dies deutet an, dass das mBCNG-1-Protein per se unfähig sein könnte Strom zu leiten, jedoch in Kombination mit einem zweiten, noch nicht identifizierten Polypeptid zusammen wirkt, um einen funktionalen heteromultimeren Ionenkanal zu formen.
mBCNG-1 ist ein 132 kDa Glykoprotein. Um das Protein, das durch die mBCNG-1 cDNA (ATCC Accession No. 209781) (SEQ ID NO: 1) kodiert wird, zu charakterisieren, wurden Antikörper gegen zwei unabhängige Domänen in dem vorhergesagten zytoplasmatischen Schwanz erzeugt: Aminosäuren 594-720 (Fusionsprotein GST-q1; Antiserum αq1) und Aminosäuren 777-910 (Fusionsprotein GST-q2; Antiserum αq2). Beide Antiseren immunopräzipitierten spezifisch das in vitro Translationsprodukt der klonierten mBCNG-1 Sequenz.
In Western blots von Mausgehirnextrakten, erkannten sowohl das αq1 als auch das αq2 Antiserum eine diffuse Bande mit einer apparenten molekularen Masse von 132 kDa (2A). Die vollständige Verhinderung der Markierung durch Präadsorbieren der Antiseren mit einem GST-Fusionsprotein, das beide antigenischen Domänen (GST-d5, Aminosäuren 404-910) beinhaltet, zeigt an, dass sie die native mBCNG-1 Untereinheit repräsentiert. Die Behandlung von Gehirnextrakt mit N-Glykosidase F vor dem Western Blotting resultiert in einer wesentlichen Reduktion des Molekulargewichts der beobachteten Bande, die jetzt mit dem in vitro translatierten BCNG-1 Produkt co-migriert (2B).
Die Sequenzanalyse zeigt an, dass drei N-Glykosylierung-Konsensusstellen im mBCNG-1-Protein vorhanden sind. Unter diesen, wird für Asn 327 vorhergesagt, dass es zwischen der Transmembrandomäne 55 und der Pore (P) auf der extrazellulären Seite der Plasmamembran liegt (1A und 1B). Diese Stelle entspricht dem Asn 327 des c-GMP-gesteuerten Kanals des bovinen Stäbchenzellen Photorezeptors, wobei gezeigt wurde, dass dies die einzige Glykosylierungsstelle ist (Wohlfart et al., 1992). Insgesamt deuten diese Daten an, dass die klonierte cDNA Sequenz für das "full length"-Produkt des mBCNG-1-Gens kodiert und dass mBCNG-1 ein N-gebundenes Glykoprotein ist.
mBCNG-1 wird in Neuronen exprimiert. Northern Blot Analysen zeigen die Anwesenheit von multiplen mBCNG-1 Transkripten in Poly(A)⁺ RNA vom Gehirn, wobei die am häufigsten vorhandene Spezies 3,4, 4,4, 5,8 und 8,2 kb lang waren (3). Das 3,4 kb Transkript entspricht in der Größe der klonierten cDNA. Keine Expression wurde in Herz, Milz, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere oder Hoden detektiert. Die spezifische Expression des mBCNG-1-Proteins wurde durch Western Blot Analyse bestätigt.
Die zelluläre Lokalisation von mBCNG-1 innerhalb des Gehirns wurde durch in situ Hybridisierung (4) und durch immunhistochemisches Färben (5A-5F) untersucht. In beiden Fällen wurde der höchste Grad an mBCNG-1 Expression im Cortex cerebralis, im Hippocampus und im Cerebellum detektiert.
Eine in situ Hybridisierung zeigt im Cortex cerebralis eine starke Expression von der mBCNG-1 mRNA Schicht V pyramidaler Neuronenzellkörper die in einer kontinuierlichen Linie entlang des Neocortex verteilt sind (4). Eine immunhistochemische Analyse zeigt eine strikte subzelluläre Lokalisation des mBCNG-1-Proteins innerhalb dieser Zellen. Das Färben der apikalen Dendriten (5A) dehnt sich in die terminalen Verästelungen dieser Fasern aus und ist in Schicht I, die den terminalen dendritischen Plexus der pyramidalen Neurone beinhaltet, besonders intensiv (5B).
Ein ähnliches Expressionsmuster kann im Hippocampus erkannt werden. Dort zeigt die in situ Hybridisierung eine starke mBCNG-1 mRNA Expression in der pyramidalen Zellkörperschicht der Bereiche CA1 und CA3 (4). Die Markierung im Bereich CA3 ist geringfügig weniger prominent als die Markierung im Bereich CR1. Auf Proteinebene wird die intensivste mBCNG-1 Immunomarkierung entlang der hippocampalen Fissuren beobachtet, in der Schicht, die dem Stratum lacunosummoleculare entspricht (5C). Die Schicht beinhaltet die terminalen Verästelungen der apikalen Dendriten der pyramidalen Neurone im Bereich CA1 (Raismann, 1965). Weitere mBCNG-1 Immunoreaktivität wird innerhalb des Stratum pyramidale der Bereiche CA1 und CA3 detektiert; die Färbung, obwohl abwesend in den pyramidalen Zellkörpern, ist vielmehr in den umgebenden Fasern präsent (5D). Diese Fasern stellen hauptsächlich den Korbzell-Plexus, der mit pyramidalen Neuronen assoziiert dar.
Die Immunfärbung im Cerebellum zeigt weiterhin ein für Korbzell-Expression charakteristisches Muster. Korbzell-Nervenendungen verzweigen sich im Cortex cerebralis und kontaktieren das initiale Segment des Purkinje Zellaxons in einer klaren Struktur, die als "pinceau" bekannt ist (Palay, et al., 1974). Wie in 5E und 5F dargestellt, sind diese Strukturen durch die αq1- und αq2-Antiseren intensiv markiert, während die Färbung die Purkinje Zellkörper ausschließt. Demnach scheint in Korbzellen das mBCNG-1-Protein selektiv in Axonen lokalisiert zu sein und ist insbesondere in den Nervenendungen angereichert. Eine intensive Markierung einiger Hirnstammkerne wurde durch in situ Hybridisierung (4) beobachtet und Bereiche von Immunoreaktivität wurde in anderen Gehirnregionen, einschließlich des Riechkolbens, detektiert.
mBCNG-1 definiert eine neue Unterfamilie von K⁺-Kanal-Genen. Die meisten der bislang charakterisierten Ionenkanalsequenzen sind Mitglieder evolutionär verwandter Multigenfamilien. Um zu untersuchen, ob mehrere Sequenzen, die mBCNG-1 zuzuordnen sind existieren, wurden Southern Blots von genomischer Maus-DNA unter unterschiedlich stringenten Bedingungen analysiert (6).
Die Sonde (B1-T) wurde im hydrophoben Kernbereich von mBCNG-1, der die Transmembrandomänen S5, P und S6 einschließt, konstruiert; die Repeat-Region im C-terminalen Teil des Proteins wurde ausgeschlossen. Reduzieren der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen von 8°C unterhalb der Schmelztemperatur der B1-T Sonde (6A) auf 33°C unterhalb der Schmelztemperatur (6B) resultierte in dem Nachweis einer Reihe zusätzlicher Hybridisierungssignale in jeder Spur des Blots. Keine der bekannten Sequenzen in der K⁺-Kanal-Superfamilie wies ausreichende Homologie zu mBCNG-1 auf, um unter diese Bedingungen zu hybridisieren. Diese Ergebnisse deuteten an, dass mBCNG-1 das erste bekannte Mitglied einer größeren Gruppe von verwandten Genen ist, die einen neuen Zweig in der spannungsabhängigen K⁺-Kanal-Superfamilie repräsentieren.
Diskussion
Spannungsabhängige Kalium (VGK) Kanäle bilden eine große und nach wie vor expandierende Superfamilie von verwandten Genen (Strong, et al., 1993; Warmke und Gonetzky, 1994). Die am weitesten verbreitete Strategie zum Klonieren neuer Gene in der VGK-Familie war die durch Homologie zu einer kleinen Anzahl ursprünglicher Mitglieder (Sh, eag, und slo von Drosophila (Papazian, et al., 1987; Kamb, et al., 1987; Warmke, et al., 1991; Atkinson, et al., 1991); zu cGMP-Kanälen von boviner Netzhaut (Kaupp, et al., 1989). Unglücklicherweise ist dieser Ansatz zum Identifizieren stärker divergierender Sequenzen nicht besonders geeignet. Exressionsklonierung in Xenopus-Oozyten kann dieses Problem umgehen, wobei dies jedoch eine bereits bestehende oder leicht nachweisbare physiologische Charakterisierung des Kanals voraussetzt.
Eine alternative Klonierungsstrategie, die kein a priori Wissen der Struktur oder Aktivität des Targetproteins erfordert, ist das Screenen von K⁺-Kanälen mittels Protein-Protein-Interaktionen. Unter Verwendung der SH3 Domäne von N-src als ein Bait wurde ein Protein, mBCNG-1, erhalten, welches einen neuen Zweig der K⁺-Kanal-Superfamilie zu bilden scheint. mBCNG-1 zeigt die Motive eines spannungsabhängigen K⁺-Kanals (sechs Transmembran durchspannenden Domänen, einen hoch basischen S4-, und einen P-Bereich) (Strong, et al., 1993, Warmke, et al., 1994 und 1A-1D). mBCNG-1 zeigt, abgesehen von seiner Ähnlichkeit zu Mitgliedern der spannungsabhängigen K⁺-Kanal-Superfamilie, die durch die Anwesenheit von sechs Transmembrandomänen und einem porenähnlichen Bereich definiert sind (Warmke, et al., 1994), erhebliche Divergenz zu allen anderen bekannten Sequenzen. Obwohl die zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle von mBCNG-1 höchst ähnlich zu der in CNG-Kanälen vorkommenden Stelle ist (30%), sind die S4 und vorherigen sehr eng mit den korrespondierenden Bereichen in Shaker und Eag verwandt. Insgesamt besteht die höchste Ähnlichkeit im hydrophoben Kernbereich zu Maus-Eag-Protein (22%). Demnach scheint mBCNG-1 einen neuen Zweig der K⁺-Kanal-Superfamilie zu bilden.
Die Fusion zwischen einem angestammten K⁺-Kanal und einer angestammten zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle erfolgte wahrscheinlich vor der evolutionären Separation zwischen Pflanzen und Tieren (Warmke, et al., 1994). Divergenz von diesem gemeinsamen Vorläufer würde einerseits zu Eag-verwandten Kanälen und Pflanzen Einwärtsgleichrichtern (die mehrere Merkmale der spannungsabhängigen K⁺-Kanäle beinhalten, während sie eine fortschreitende Abweichung von der ursprünglichen CNBs Sequenz aufweisen) und andererseits zu CNG-Kanälen (welche eine höhere evolutionäre Gebundenheit an die zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle zeigen, während sie die Spannungsaktivierung und K⁺-Selektivität verloren haben) geführt haben. Die Merkmale von mBCNG-1 deuten an, dass es enger an dem angestammten Molekül verblieben zu sein scheint, welches das evolutionäre Bindeglied zwischen spannungsabhängigen K⁺-Kanälen und zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanälen darstellt.
Die aufkommenden Muster für olfaktorische und retinale CNG-Kanäle und die Nicht-konsensus-Sequenz des mutmaßlichen porenformenden Bereichs von mBCNG-1 deutet an, dass der Mangel an detektierbarem elektrischem Strom in Anschluss an mBCNG-1 Expression in Xenopus-Oozyten, darauf zurückzuführen ist, dass mBCNG-1 eine β-Untereinheit eines heteromultimeren Kanals darstellt (Chen, et al., 1993; Liman, et al., 1994; Bradley, et al., 1994). In der Tat zeigen die Daten die Existenz einer Anzahl von mBCNG-1 verwandten Sequenzen im Mausgenom und eines oder mehrere dieser Gene können zusätzliche Untereinheiten kodieren, die für die Ausformung eines aktiven Kanals erforderlich sind.
Das mBCNG-1-Protein wird nur im Gehirn und insbesondere in zwei der Hauptklassen von Neuronen innerhalb der cerebralen, hippocampalen und cerebellaren Kortexes exprimiert: pyramidale Neuronen und Korbzellen. Diese Verteilung würde übereinstimmen mit einer in vivo Interaktion von mBCNG-1 mit N-src, das ebenso in cerebralen und hippocampalen pyramidalen Neuronen exprimiert wird (Sugrue, et al., 1990). Die beobachtete Interaktion zwischen mBCNG-1 und der N-src SH3 Domäne ist aufgrund ihrer physiologischen Relevanz und der Rolle der prolinreichen Bereiche verblüffend. Die Möglichkeit, dass sich andere Faktoren auf die prolinreichen Bereiche von mBCNG-1 richten war ebenso in Betracht zu ziehen, insbesondere hinsichtlich der kürzlich entdeckten WW-Domänen (Sudol, et al., 1996; Staub, et al., 1996).
Die verschiedene subzelluläre Lokalisation von mBCNG-1 (dendritisch in pyramidalen Zellen und axonal in Korbzellen) deutet an, dass mBCNG-1 unterschiedliche Rollen in verschiedenen Populationen von Neuronen spielen kann, vielleicht durch Regulieren präsynaptischer oder postsynaptischer Membranerregbarkeit, abhängig vom Zelltyp. Eine ähnliche Verteilung wurde für die K⁺-Kanaluntereinheit Kv 1.2 gezeigt (Sheng, et al., 1994; Wang, et al., 1994). Kv 1.2 formt heteromultimere K⁺-Kanäle mit mehreren anderen Shaker-Typ-Untereinheiten, die ein überlappendes, dennoch unterschiedliches Expressionsmuster aufweisen, die eine Auswahl an Leitfähigkeiten mit verschiedenartigen funktionalen Eigenschaften begründen.
Die Anwesenheit von mBCNG-1 in den Dendriten der hippocampalen Pyramidenzellen ist besonders verblüffend; für cAMP wurde gezeigt, dass es für die Etablierung von einigen Formen langfristiger synaptischer Potenzierungen in diesen Zellen wichtig ist (Frey, et al., 1993, Bolshakov, et al., 1997; Thomas, et al., 1996). Die strukturellen Merkmale von mBCNG-1 sagen eine K⁺-leitende Aktivität voraus, die direkt durch zyklisch-Nukleotid-Bindung moduliert wird. Interessanterweise wurde ein Strom mit ähnlichen Eigenschaften in den hippocampalen pyramidalen Neuronen des Bereichs CA₁ beschrieben (Pedarzani, et al., 1995), wo mBCNG-1 stark exprimiert wird. Von diesem Strom (I_Q) wird angenommen, dass er zu der noradrenergen Modulation der hippocampalen Aktivität durch Regulieren neuronaler Erregbarkeit in Antwort auf cAMP-Pegel beiträgt. mBCNG-1 könnte in der Bildung der Kanäle, die für diese Art von Strom verantwortlich ist, beteiligt sein.
Experimentelle Verfahren
Hefe two-hybrid-Interaktionsklonieren von mBCNG-1. Der two-hybrid Screen wurde in Anlehnung an publizierte Verfahren durchgeführt (Zervos, et al., 1993); die verwendeten Reagenzien beinhalten die Plasmide pEG202, pJG4-5, pJK103 und Saccharomyces cerevisiae Stamm EGY48; (MATa trp1 ura3 his3 LEU2: :pLexAop6-LEU2).
Der Bait wurde durch Subklonieren der SH3-Domäne von N-src in dem Plasmid pEG202 erzeugt, und beinhaltet Aminosäuren 83-147 der Maus-N-src-Sequenz (Martinez, et al., 1987). Die cDNA-Fusionsbibliothek wurde im Plasmid pJG4-5 unter Verwendung von poly(A)⁺ RNA des gesamten Gehirns einer adulten männlichen C57BL/6 Maus erzeugt; die cDNA wurde unter Verwendung willkürlicher Hexamere und des GIBCO-BRL SuperScript II Synthesekits gemäß den Anleitungen des Herstellers synthetisiert. Nur die Bibliothek die von den zwei Fraktionen mit einer mittleren cDNA Größe von > 1.5 kb hergestellt wurde (insgesamt 1 × 10⁶ unabhängige Klone), wurde im two-hybride Screen verwendet. Die Amplifikation der Bibliothek wurde in 0,3% SeaPrep Agarose (FMC) durchgeführt, um Änderungen in der Komplexität zu vermeiden.
Zum Screenen der Bibliothek wurde Saccharomyces cerevisiae Stamm EGY48 zuerst mit dem Baitplasmid pEG202-Nsrc und dem Reporterplasmid pJK103 cotransformiert. Die resultierenden Stämme wurden unter Selektion auf die HIS3- und URA3-Marker erhalten, und anschließend mit der Mausgehirn-cDNA-Bibliothek im Plasmid pJG4-5 transformiert. Diese Beschreibung ist, wenngleich sehr exakt und sollte durch den Transformationsmix, der für zwei Tage in Ura^– HIS^– Trp^–-Glukosemedium, das 0,3% SeaPrep Agarose (FMC) enthält, ersetzt werden; die Zellen wurden anschließend geerntet und auf Ura^– His^– Trp^– LEU^– -Galaktose plattiert. Leu⁺-Kolonien wurden unter Verwendung eines Filter-Lift-Assays auf β-Galaktosidaseaktivität gescreent (Breede and Nasmith, 1985). Positiv reagierende Fusionsprodukte wurden isoliert und nach Retransformation in einen unabhängigen Hefestamm auf Spezifität getestet. Das Fusionsprodukt pJGd5 entspricht dem C-terminalen Teil von mBCNG-1 (Aminosäuren 404-910; siehe 8).
"Full length"-Klonierun von mBCNG-1. Für die Isolierung des Bereichs des 5'-Endes der mBCNG-1 cDNA wurden zwei PCR-Durchgänge mit der pJG4-5 Bibliothek unter Verwendung von "nested" Oligonukleotiden, die von der pJG-d5-Sequenz abgeleitet wurden, durchgeführt. Die Downstream-Primer im ersten Durchgang waren: 5'-AGAGGCATAGTAGCCACCAGTTTCC-3' (SEQ ID NO: 13) (d5.RL, entspricht den Aminosäuren 456-463 der mBCNG-1 Sequenz; siehe 8). Die Downstream-Primer im zweiten Durchgang waren: 5'-CCGCTCGAGGCCTTGGTATCGGTGCTCATAG-3' (SEQ ID NO: 14) (d5.N2), entspricht den Aminosäuren 424-430 von mBCNG-1 und einer hinzufügten XhoI-Stelle). Der Upstream-Primer war eines von zwei Oligonukleotiden, die in der pJG4-5-Vektorsequenz konzipiert wurden: 5'-GAAGCGGATGTTAACGATACCAGCC-3' (SEQ ID NO: 15) (B42), das 5' zu der EcoRI-Stelle in dem B42 sauren Patch lokalisiert ist, oder: 5'-GACAAGCCGACAACCTTGATTGGAG-3' (SEQ ID NO: 16) (ter), das 3' zu der EcoRI-Stelle in dem ADH-Terminator lokalisiert ist.
PCR Cycling wurde wie folgt durchgeführt: 1 × (2 Minuten, 94°C);
25 × (45 Sekunden, 94°C; 30 Sekunden, 58°C; 3 Minuten, 72°C); 1 × (10 Minuten, 72°C).
Das längste Amplifikationsprodukt, das von diesen Reaktionsabfolgen erhalten wurde, war ein 700 bp DNA-Fragment, das die Aminosäuren 204-430 der mBCNG-1 Sequenz enthielt (siehe 8). Dieses Fragment wurde subkloniert, wieder aufgereinigt und als Sonde zum Screenen einer Mausgehirn-cDNA-Bibliothek in λgt10 verwendet (CLONTECH, Katalog Nr. ML3000a) unter hohen Stringenzbedingungen (Hydridisierung über Nacht bei 65°C in 50% Formamid, 5× SSC (1× SSC = 0,15 M Natriumchlorid/0,015 Natriumcitrat, pH 7), 5× Denhardt's (1× Denhardt's = 0,02% Ficoll/0.02% Polyvinylpirrolidon/0,02% Rinderserumalbumin), 0,5% SDS, 100 mg/ml Lachssperma-DNA. Das Waschen: 10 Minuten, Raumtemperatur in 2× SSC/0,1% SDS, gefolgt von zweimal 30 Minuten bei 65°C in 0,2× SSC/0,1% SDS.
Positiv reagierende Klone wurden weiter unter Verwendung des Oligonukleotids d5.RL (SEQ ID NO: 13) als ein Downstream-Primer mittels PCR gescreent. Der Upstream-Primer war entweder eines der zwei folgenden Vektoroligonukleotide: 5'-GAGCAAGTTCAGCCTGGTTAAGTCC-3' (SEQ ID NO: 17) (15'.N2), das 5' von der EcoRI Stelle in der λgt10 Sequenz lokalisiert ist, oder 5'-GTGGCTTATGAGTATTTCTTCCAGGG-3' (SEQ ID NO: 18) (13'.N2), das 3' von der EcoRI Stelle lokalsisiert ist. PCR Cycling wurde wie oben beschrieben durchgeführt.
Die resultierenden Produkte wurden subkloniert und sequenziert. Die längsten Verlängerungsprodukte beinhalteten Aminosäuren 1-463 der mBCNG-1-Sequenz (siehe 8); der überlappende Bereich dieses Inserts mit dem Insert das im Klon pJG-d5 (Aminosäuren 405-463) enthalten ist, schließt eine Bgl II Stelle ein, die verwendet wurde um die 5'- und 3'-Fragmente der mBCNG-1 cDNA in Plasmid pSD64TF für Expressionsstudien aneinander zu fügen.
In vitro Transkription (MESSAGE MACHINE, Ambion, Austin, TX) und in vitro Translation Express, Stratagene.
Northern/Southern Blot Hybridisierung
PCR-generierte cDNA Fragmente, die den angezeigten Aminosäuren 6-131 (λgt10-abgeleitete) 5'-Sequenz) und 594-720 (pJG-5-abgeleitete 3'-Sequenz) wurden verwendet, um einen "Multiple Tissue Northern Blot" (CLONTECH, 7762-1) zu untersuchen.
Für Southern Blots, wurde ein "Maus Geno-Blot" (CLONTECH, 7650-1) unter Verwendung eines PCR-generierten cDNA Fragments (B1-T), das den Aminosäuren 270-463 der mBCNG-1 Sequenz entspricht, wie beschrieben untersucht (Sambrook, 1989). Die Blots wurden bei 65° hybridisiert (5× Standardsalinecitrat 1× SSC = 0,15 M Natriumchlorid/0,015 M Natriumcitrat, pH 7-Puffer in wässriger Lösung) und gewaschen wie in den Abbildungslegenden beschrieben. Die Waschungsbedingungen waren wie angezeigt. Die Schmelztemperatur (TM) für die B1-T Sonde wurde gemäß der Formel Tm = 81,5°C + 16,6 (logM) + 0,41 (%GC) – (675/L) berechnet, wobei M die Kationenkonzentration und L die Sondenlänge in Basenpaaren ist.
Antikörperproduktion, Extrakte und Immunochemie und in situ Hybridisierung. Die Glutathion S-Transferase (GST)- Fusionsproteine wurden durch Subklonieren der q1 (entspricht den Aminosäuren 594-720 des mBCNG-1-Proteins), oder q2 (entspricht den Aminosäuren 777-910 des mBCNG-1-Proteins) (siehe 1A) im Plasmid pGEX-lombole (Pharmacia) erzeugt, Induktion und Aufreinigung erfolgten, wie im Wesentlichen beschrieben (Frangioni und Neel, 1993). Fusionsproteine wurden in phosphatgepufferter Saline (PBS) eluiert und als 1:1 Lösung mit Freudschem Adjuvans (Pierce) in Kaninchen injiziert. Antiseren wurden im Wesentlichen präpariert und getestet wie beschrieben (Grant, et al., 1995).
Für Western Blot Analysen, wurde Mausgehirnextrakt auf einem 10%igen SDS-PAGE aufgetrennt und auf PVDF-Membranen (Immobilon-P, Millipore) "elektrogeblottet" wie beschrieben (Grant, 1995). Blockieren und Antikörperinkubation wurde in TBST (10mM Tris pH 7,5, 150mM NaCl, 0,1% Tween-20) + 2% BSA durchgeführt. Die αq1- und αq2-Antiseren wurden als 1:1000 Verdünnung verwendet. Sekundäre Anti-Kaninchenantikörper, die an alkaline Phosphatase (Bio-Rad) gekoppelt waren, wurde als 1:5000 Verdünnung verwendet, und die Banden wurden durch Inkubation in NBT/BCIP (Boehringer Mannheim) visualisiert. Gesamt Gehirnextrakte wurden präpariert wie beschrieben (Grant, 1995). Für die N-Glycosidasebehandlung wurde 2% SDS zum Extrakt zugegeben und die Proteine durch 10 minütiges Kochen denaturiert; Reaktionen wurden in 50 mM NaP (pH 7,2), 25 mM EDTA, 0,5% Triton-X100, 0,2% SDS, 1 mg/ml Protein und 20 E/ml N-Glykosidase F (Boehringer) für 1 Stunde bei 37°C durchgeführt.
Für Immunohistochemie wurden 20 μm Kryostatschnitte von Mäusegehirn (fixiert in 4% Paraformaldehyd/PBS), gequenscht in 50 mM NH₄Cl/PBS, geblockt (10% Ziegenserum, 0,1% Ziegenserum, 0,1% Saponin in PBS) und anschließend den αg1- oder αq2- Anitseren ausgesetzt (1:400 verdünnt in Blocking-Lösung. Nach dem Waschen in PBS + 0,1% Saponin wurden die Schnitte mit 1:200 in Blocking-Lösung verdünnten Cy3-konjugierten Ziegen-anti-Kaninchen F(ab')2-Fragmenten (Jackson Immunoresearch Labs) inkubiert.
In situ Hybridisierung wurde im Wesentlichen wie beschrieben (Mayford et al., 1995) unter Verwendung von Oligonukleotidsonden, die durch 3'-"tailing" unter Verwendung von (³⁵S) thio-dATP und terminaler Transferase (Boehringer Mannheim) zu einer spezifischen Aktivität von 5 × 10⁸ cpm/μg markiert wurden. Hybridisierungen wurden bei 37°C durchgeführt. Die Objektträger wurden bei 60°C in 0.2 × SSC gewaschen und für zwei Wochen einem Film exponiert.
Beispiel 3 Physiologische und pharmakologische Bedeutung der BCNG-Kanalgene von Maus und Mensch.
Einleitung
Die einzigartigen strukturellen Merkmale und die Gewebeverteilung der vorhergesagten Proteine der BCNG Genfamilie deuten an, dass sie den Schrittmacherstrom (wechselnd bezeichnet als Ih, If oder Iq) des Herzens und des Gehirns kodieren. Alternativ wurde vorgeschlagen, dass es eine Verbindung eines anderen (anderer) – vielleicht nicht identifizierten – ionischen Stromes (ionischer Ströme) sein könnte, der (die) in kardialer renaler, hepatischer und zentraler Nervensystemfunktion wichtig ist (sind).
Die einzigartigen strukturellen Merkmale der vorhergesagten BCNG-Proteine (die unübliche ionenleitende Poren (P) Domäne, die hoch konservierte zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle (CNB) und der hoch konservierte und stark geladene S4 Spannungssensor) zeigt an, dass sie für multiple Arzneimittel- Interventions-Strategien empfänglich sein können, die sich auf die Pore, die zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle und den spannungsabhängigen Vermittlungsapparat richten.
Analyse und vorhergesagte Struktur und allgemeine Merkmale der BCNG-Gene. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz der BCNG-Gene zeigt, dass sie Mitglieder der spannungsabhängigen Ionenkanalsuperfamilie sind. Im Besonderen zeigen die BCNG-Proteine Ähnlichkeiten zu der Superfamilie von Kanälen, die die spannungsabhängigen K⁺-Kanäle (Pongs, et al., 1995) und die zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanäle, nicht-selektive Kationenkanäle die für Na, K⁺ und Ca durchlässig sind (Zagotta und Siegelbaum, 1996) beinhalten. Wie in 11 schematisch dargestellt, wird für die BCNG-Proteine vorhergesagt, dass sie sechs Transmembran-durchspannende α-Helices mit zytoplasmatischen N- und C-Termini, eine hoch basische vierte Transmembrandomäne (S4) und eine Porenregion (p) aufweisen. Jedes dieser Motive findet sich in den Mitgliedern der spannungsabhängigen K⁺-Familie. Ferner weisen die BCNG-Proteine eine stark konservierte zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle im C-Terminus auf. Obwohl sich ein homologes Motiv in einigen der spannungsabhängigen K⁺-Kanäle findet, sind die zyklisch-Nukleotid-Bindungsstellen in diesen Kanälen nicht stark konserviert und es gibt nur wenige Nachweise, dass die Bindungsstellen funktional sind. In der Tat ist die zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle des BCNG-Kanals äußerst homolog zu den Stellen, die in zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanälen gefunden werden, die die Bindung von zyklischen Nukleotiden benutzen um ihre Aktivierung anzutreiben. Ferner, während die P-Loops der BCNG-Kanäle homolog zu denen in spannungsabhängigen K⁺-Kanälen und zyklisch-Nukleotidgesteuerten Kanälen sind, sind dort mehrere nicht-konservative Austausche in der Aminosäuresequenz die wahrscheinlich zu Eigenschaften des Ionenleitvermögens führen, die für BCNG-Kanäle einzigartig sind. Demnach scheinen sich BCNG-Kanäle in verschiedener Weise von allen bisher identifizierten Kanälen zu unterscheiden, wodurch angedeutet wird, dass sie verschiedene physiologische und pharmakologische Eigenschaften aufweisen. Diese Ähnlichkeiten und Unähnlichkeiten in den Sequenzen der spannungsabhängigen K⁺-Kanäle, der zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanäle und der BCNG-Kanäle und der vorhergesagten Konsequenzen für die funktionalen Eigenschaften der BCNG-Kanäle werden im folgenden weitergehend diskutiert.
Ergebnisse
Der hydrophobe Kern. Für den Kern der BCNG-Kanäle wird vorhergesagt, dass er sechs Transmembran- (α-helikale Sequenzen (S1-S6) und einen porenformenden P-Loop aufweist. Diese Zuordnung ist homolog zu einer einzelnen Untereinheit der tetrameren K⁺-Kanäle (und tetrameren zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanäle) oder einer einzelnen Wiederholung in den pseudotetrameren Na- und Ca-Kanälen. Diese Homologie deutet an, dass die BCNG-Kanäle Mitglieder der spannungsabhängigen K⁺-Kanal-Superfamilie sind (die ebenso die spannungsunabhängigen aber strukturell homologen zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanälen einschließen). Es ist wahrscheinlich, dass BCNG-Kanäle aus vier solcher Polypeptide in einer hetero- oder homomultimeren Struktur zusammengesetzt wird, wie dies für die spannungsabhängigen K⁺-Kanäle und die zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanäle gezeigt wurde (Chen et al., 1993; Bradley et al., 1994; Liman und Back, 1994; Lin et al., 1996). Trotzdem zeigt mBCNG-1 eine beträchtliche Abweichung von allen anderen bekannten K⁺-Kanal- und zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanalsequenzen. Wie oben erwähnt, besteht die höchste Homologie im hydrophoben Kernbereich zu Maus Eag (22% Aminosäureähnlichkeit) – einem spannungsabhängigen K⁺-Kanal, der eine degenerierte und möglicherweise nicht funktionale zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle, Warimke und Gancleky aufweist. Über diesen Kernbereich hinaus zeigt mBCNG-1 17% Identität zu den spannungsunabhängigen zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanälen.
Dagegen zeigen Proteine, für die vorhergesagt wird, dass sie durch die BCNG-Gene kodiert werden, hohe Homologie zueinander (> 80%, siehe Beispiele 1 und 2). In der Tat sind Maus BCNG-1 und humanes BCNG-1 im Kernbereich identisch. Ähnlicherweise sind mBCNG-2 und hBCNG-2 im Kernbereich zu 98% identisch. Demnach scheint die BCNG-Familie von Genen einen neuen Zweig der K⁺-Kanal-Superfamilie darzustellen, der durch zyklisch-Nukleotid-Bindung reguliert werden kann. Die Anwesenheit einer Genfamilie mit Mitgliedern, die eine derartige Sequenzkonservierung aufweist, deutet stark auf eine wichtige biologische Funktion hin.
Die S4-Spannungsabtastende Domäne. Die Anwesenheit positiv geladender Arginin- und Lysinreste an jeder dritten Position in der vierten Transmembranhelix ist eine charakteristische Signatursequenz spannungsabhängiger Vermittlung (Hille, 1992; Catterall, 1992, siehe 12). Demgegenüber ist in den spannungsunabhängigen zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanälen die S4 degeneriert mit einigen der positiv geladenen Reste, die durch negativ geladene saure Aminosäuren ersetzt wurden oder aus dem "triad repeat frame" fallen. Diese Änderungen haben die positive Nettoladung in der S4 der zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanäle auf 3-4 reduziert. Diese Einführung von negativ geladenen Resten kann der Ursache zugrunde liegen, dass die zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanäle nicht länger auf Spannung ansprechen. Jedoch ist es ebenso möglich, dass Spannungssensitivität als eine Folge einiger anderer struktureller Änderungen in den zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanälen verloren gegangen sein könnte und die Divergenz in der S4-Struktur einfach den Verlust des evolutionären Drucks widerspiegelt, positive Ladungen zu bewahren.
Die S4 der BCNG-Kanäle sind meist eng, wenn auch schwach verwandt mit den entsprechenden Bereichen in den spannungsabhängigen K⁺-Kanälen Shaker und eag (mBCNG-1 ist 30% homolog zu der S4 von Shaker und eag). Trotz einer Unterbrechung durch die Einlagerung eines Serins anstelle eines Arginins in der S4 der BCNG-Kanäle, enthält die BCNG-Sequenz mehr positiv geladene Reste als jedes andere Mitglied der spannungsabhängigen K⁺-Kanal-Superfamilie (siehe 12). Die S4-Domäne von BCNG-1 hat bis zu neun positiv geladene Reste (eine Gruppe von fünf und eine Gruppe von vier, getrennt durch ein Serin anstelle eines anderen Arginins), was sie wiederum ähnlicher den spannungsabhängigen K⁺-Kanäle (Sh und eag Familien) als den zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanälen macht. Die Beibehaltung eines solchen stark geladenen 54 deutet stark an, dass das "Gating" dieser Kanäle spannungssensitiv ist.
Die zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle. Zyklische Nukleotide regulieren die Aktivität einer verschiedenartigen Familie von Proteinen, die in zelluläre Signalgebung involviert sind. Diese beinhalten einen Transkriptionsfaktor (das bakterielle Katabolitaktivatorprotein, CAP), die cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinasen (PKA und PKG) und die zyklisch-Nukleotid-gesteuerten (CNG) Ionenkanäle, die in visuelle und olfaktorische Signaltransduktion involviert sind (Shabb und Corbin, 1992; Zagotta und Siegelbaum, 1996). Trotz offensichtlicher Abweichung zwischen den Effektor-Domänen dieser Proteine scheinen sich die zyklisch-Nukleotid-Bindungsstellen eine gemeinsame Architektur zu teilen. Lösung der Kristallstrukturen von CAP (Weber und Steitz, 1987) und einer rekombinanten bovinen PKA R1α Untereinheit (Su, et al., 1995) hat gezeigt, dass deren zyklisch-Nukleotid-Bindungsstellen von einer α-Helix (A-Helix) gebildet wird, einer achtsträngigen β-Rolle, und zwei weiteren α-Helices (B und C), wobei die C-Helix die Rückseite der Bindungstasche formt. Von den näherungsweise 120 Aminosäuren, die eine dieser zyklisch-Nukleotid-Bindungsstellen beinhaltet, sind sechs invariant in allen CAP, PKA, PKG und zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanälen. Folglich wurde vorgeschlagen, dass die invarianten Reste eine wichtige und konservierte Rolle in der Faltung und/oder Funktion der CNB-Stellen dieser unterschiedlichen Proteine spielt (Shabb und Corbin, 1992; Zagotta und Siegelbaum, 1996; Weber und Steitz, 1987; Su, et al., 1995; Kumar und Weber, 1992; Scott, et al., 1996). In der Tat zeigen die Kristallstruktur von CAP (Weber und Steitz, 1987) und die regulatorische Untereinheit des rekombinanten bovinen R1α (Su, et al., 1995), dass die Glycine bei Drehungen innerhalb der β-Rolle vorkommen, während die Glutamate und die Asparagine Brücken mit dem Ribosephosphat der Nukleotide ausbilden.
Interessanterweise scheinen nur drei dieser Reste – zwei Glycine und das Arginin – innerhalb der weiter entfernt verwandten spannungsabhängigen Kanäle konserviert zu sein die das CNB-Stellenmotiv hervorbringen, deren Gating jedoch NICHT signifikant durch direkte Bindung von zyklischem Nukleotid (KAT1 (Hoshi, 1995) und Drosophila EAG (dEAG) (Bruggeman, et al., 1993) moduliert werden kann (siehe 11).
Demnach ist im Pflanzenkanal, KAT1, das erste Glycin zu einem Asparagin mutiert und das Alanin ist in ein Threonin gewechselt. In dEAG ist das Glutamat in ein Aspartat gewechselt. Ferner ist das Alignment von dEAG zu der hoch konservierten RXA-Sequenz in β-7 ungewiss. Häufig wird die SAA-Sequenz innerhalb von dEAG β-7 mit der RXA-Konsensussequenz "aligned", wodurch angedeutet wird, dass das Arginin verloren gegangen ist und durch ein Serin ersetzt wurde. RAL wird aligned mit der RXA-Konsensussequenz, wodurch angezeigt würde, dass das Arginin erhalten blieb aber das Alanin durch ein Leucin ersetzt wird. Ungeachtet welches der Alignments betrachtet wird, ist es klar, dass die Bindungsstellensequenz von KAT1, dEAG und verwandten Kanälen alle Abweichungen vom Konsensusmotiv für eine funktionale zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle aufweisen. In Übereinstimmung mit dieser strukturellen Divergenz, gibt es nur einen Bericht, dass irgendein kloniertes EAG sensitiv gegenüber direkter zyklisch-Nukleotid-Bindung ist (Bruggermann et al., 1993). Dieses Ergebnis wurde jedoch nicht bestätigt und wird jetzt als Artefakt angesehen. Es gibt einige Nachweise, dass das Gating des Planzenkanals KAT1, schwach sensitiv gegenüber zyklisch-Nukleotid-Modulation ist (Hoshi, 1995).
13 zeigt eine schematische Darstellung der zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle von bRET1, die eine entscheidende Interaktion zwischen der Bindungsstelle und dem zyklischen Nukleotid zeigt.
Neuerliche Nachweise haben gezeigt, dass die dritte (oder C) α-Helix sich nach Kanalaktivierung relativ zum Agonisten bewegt und dabei zusätzliche vorteilhafte Kontakte mit dem Purinring bildet. In der Tat ist die selektive Aktivierung von bRET1 durch cGMP relativ zu cAMP weitgehend durch einen Rest in der C α-Helix, D604 bestimmt (Varnum et al., 1995). Von diesem sauren Rest wird angenommen, dass er zwei Wasserstoffbrückenbindungen mit den Wasserstoffen an einem ringförmig gebundenen Stickstoff und einer Aminogruppe des cGMP-Purinrings ausbildet. Im Gegensatz zu dem cGMP-selektiven bRET1-Kanals haben zyklisch-Nukleotid-gesteuerte Kanäle, die gleichermaßen gut durch cAMP oder cGMP aktiviert werden (fOLFl, Goulding et al., 1992; Goulding et al., 1994), oder welche Aktivierung durch cAMP begünstigen, (rOLF2, das coexprimiert wird mit cOLF1, Liman & Buck, 1994; Bradley et al., 1994) hier keine sauren Reste, sondern eher polare oder hydrophobe Aminosäuren (siehe Varnum, et al., 1995). Neutralisierung von D604 resultiert in einem Verlust der Fähigkeit, die begünstigte Wasserstoffbrückenbindung mit cGMP zu formen und dem Verlust der ungünstigen Interaktion mit dem einzelnen Elektronenpaar an dem Purinring von cAMP, somit Verantwortung tragend für die Kanäle, die einen hydrophoben oder polaren Rest an dieser Position tragen und nicht-selektiv zwischen cAMP und cGMP oder wenn nicht sogar selektiv für cAMP werden.
Der C-Terminus der BCNG-Proteine weist eine Sequenz von näherungsweise 120 Aminosäuren auf, die homolog zu diesen zyklisch-Nukleotid-Bindungsstellen ist. Markanterweise sind die sechs Reste, für die gezeigt werden konnte, dass sie in allen funktionalen zyklisch-Nukleotid-Bindungsstellen vollständig konserviert sind, in allen der identifizierten BCNG-Proteine konserviert. Die zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle der BCNG-Kanäle gleicht am meisten der funktionalen Stelle, die in den spannungsunabhängigen zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanälen vorkommen (30 %). Wenn die zyklisch-Nukleotid-Bindungsstellen, die in Kanalgenen gefunden wurden, mit denjenigen in Proteinkinasen verglichen werden, sind die BCNG-Kanalstellen viel ähnlicher (25 Ähnlichkeit zu Hefe cAMP-abhängigen Proteinkinasen) als jene eines jeden anderen Ionenkanals. Diese Daten deuten stark darauf hin, dass die BCNG-Gene Proteine kodieren, deren Aktivität durch direkte Bindung von zyklischen Nukleotiden moduliert wird. Des Weiteren haben alle BCNG-Kanäle einen Isoleucinrest in der Position, wo D604 in dem cGMP-selektiven bRET1-Kanal gefunden wurde. Demnach wird von BCNG angenommen, dass es cAMP-selektiv ist.
Die Pore. Ungeachtet der funktionalen Divergenz, die Na-, Ca- oder K-selektive Familien sowie die Anwesenheit von Kanälen innerhalb dieser Familien, deren Leitfähigkeiten durch 1-2 Größenordnungsgrade variieren, hervorgerufen hat, sind die Poren aller Mitglieder der spannungsabhängigen Superfamilie verwandt (siehe Itillic 1992; zum Beispiel siehe 14). Über die Reste, die zu den Ionendurchlässigkeitseigenschaften der Kanäle beitragen, ist viel bekannt und dies erlaubt Vorhersagen über die Durchlässigkeitseigenschaften der BCNG-Proteine (Mackinnon, 1991; Heginbothem et al., 1994).
Insgesamt ist die P-Region von mBCNG-1 am meisten eng, wenn auch schwach (30 %) verwandt zu den korrespondierenden Bereichen in den K-selektiven Shaker und eag-Kanälen. Basierend auf der Anwesenheit eines GYG-Motivs in dem P-Loop werden die BCNA-Gene als K-selektiv erachtet. Allerdings beinhalten die P-Loops Substitutionen in mehreren Positionen, die andererseits in anderen spannungsabhängigen K⁺-Kanälen hoch konserviert sind. Diese Substitutionen können in 14 betrachtet werden (welche ein Alignment von mBCNG-1 gegen Kanäle von allen anderen bedeutenden K-Kanal-Familien darstellt) und 8 (welche das Alignment aller derzeit klonierten BCNG-Sequenzen darstellt). Der Aspartatrest, der dem GYG-Triplet folgt, ist in Maus- und Mensch-BCNG-1 durch ein Alanin (Position 352) ersetzt und in den anderen, bislang identifizierten BCNG-Kanälen durch Arginin. Der Serin/Threoninrest, 8 Reste N-terminal von dieser Position (Rest 344 in mBCNG-1) ist in allen BCNG-Sequenzen durch Histidin ersetzt. 6 Reste N-terminal von dem Aspartat ist ein hydrophober Leucinrest anstelle eines polaren Restes eingefügt. Darüber hinaus ist bei Position –12 von dem Aspartat, eine Stelle, die in allen anderen Kanälen, die in 14 aligned wurden, durch einen aromatischen Rest belegt ist, ein Lysinrest in allen BCNG-Sequenzen eingefügt (8 und 14).
Obwohl die Aminosäuresubstitutionen, die in der P-Region der BCNG-Untereinheit gesehen wurden, nicht zwangsläufig anzeigen, dass die Kanäle ihre K-Selektivität verloren haben (zum Beispiel ist ein Lysin in der P-Region des K-selektiven Shaw-Kanals anwesend, siehe 14), deuten die substantiellen Abweichungen von der K-Kanal-Konsensussequenz an, dass die BCNG-Proteine eine Familie von Kanälen generiert haben, die nicht gut zwischen Na und K auswählt – übereinstimmend mit der Hypothese, dass die BCNG-Kanäle den nicht-selektiven Ih- Schrittmacherstrom kodieren.
Diskussion
Bedeutung der BCNG-Struktur. Die Anwesenheit von zyklisch-Nukleotid-Bindungsstellen auf einer Anzahl von K⁺-Kanälen, die sowohl in pflanzlichen als auch tierischen Ordnungen vorkommen, deutet an, dass die Fusion zwischen einem angestammten K⁺-Kanal und einer angestammten zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle wahrscheinlich vor der evolutionären Separation zwischen Pflanzen und Tieren erfolgte (Warmke und Ganetzky, 1994). Die Feststellung, dass viele dieser Stellen degeneriert und nicht funktional sind, unterstützt in der Tat diese Interpretation. Divergenz von diesem gemeinsamen Vorläufer würde einerseits zu Eag-verwandten Kanälen (EAG, ERG, ELK) (Warmke und Ganetsky, 1994) und pflanzlichen Einwärtsgleichrichtern (AKT und KAT), welche viele der Eigenschaften von spannungsabhängigen K⁺-Kanälen, die eine fortschreitende Abweichung von der originalen zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle zeigen, beibehalten und andererseits zu CNG-Kanälen (welche eine höhere evolutionäre Gebundenheit an die zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle zeigen, während sie die Spannungsaktivierung und K⁺-Selektivität verloren haben) (Anderson, et al., 1992; Sentenac, et al., 1992) geführt haben. Die Eigenschaften von BCNG-1 deuten an, dass es enger an das angestammte Molekül, das das evolutionäre Bindeglied zwischen spannungsabhängigen K⁺-Kanälen und zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanälen darstellt, verblieben sein könnte. Dies wird gestützt durch die Beobachtungen, dass die zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle von mBCNG-1 die engste Homologie zu Bindungsstellen, die in Proteinkinasen vorkommen, zeigt, insbesondere in Hefe-cAMP-abhängigen Proteinkinasen (25 %), während die Kanaldomänen meistens eng verwandt mit den spannungsabhängigen Kanälen sind, die durch das Shaker-Gen kodiert sind, das über keine zylische Nukleotidbindungssstelle verfügt, und demnach vermutlich vor dem Genfusionsereignis entstanden ist. Die zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle von mBCNG-1 ist äußerst homolog zu der in zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanälen vorkommenden Stelle (30 %), was wiederum zeigt, dass diese vermutlich von einem gemeinsamen Vorläufer abstammten und in beiden ein Druck vorherrschte, die zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle beizubehalten, weil sie zu der Funktion des Proteins beitrug. Folglich scheint BCNG-1 einen neuen Zweig der K⁺-Kanal-Superfamilie zu begründen.
Physiologische Bedeutung. Ionenkanäle sind zentrale Bestandteile, die der elektrischen Aktivität aller erregbaren Zellen zugrunde liegen und wichtige Transportfunktionen in nicht-erregbaren Zellen erfüllen. Mitglieder der neuen BCNG-Familie von Ionenkanälen werden sowohl im Gehirn als auch im Herzmuskel sowie in Skelettmuskel, Lunge, Leber, Bauchspeicheldrüse und Niere exprimiert. Gemäß ihrer Aminosäuresequenz haben Mitglieder der BCNG-Kanal-Genfamilie wahrscheinlich wichtige, neue Rollen in der elektrophysiologischen Aktivität des Gehirns und des Herzens und anderer Gewebe inne. Diese Sichtweise basiert erstens auf der Feststellung, dass mRNA, die für ein BCNG-Kanal-Protein kodiert, sowohl in Herz als auch im Gehirn exprimiert wird. Zweitens zeigt die abgeleitete primäre Aminosäuresequenz der BCNG-Kanäle an, dass diese Mitglieder der spannungsabhängigen Kanal-Familie sind, doch anders als die meisten spannungsabhängigen Kanäle beinhalten die BCNG-Kanäle in ihrem Carboxy-Terminus etwas, das eine funktionale zyklisch-Nukleotid-Bindungsstellendomäne zu sein scheint.
Northern Blots der vier Maus-BCNG-Kanal-Gene zeigen interessante Unterschiede in Expressionsmustern (siehe 3, 9 und 10). mBCNG-1 wird selektiv im Gehirn exprimiert. Western Blot Analysen bestätigen, dass mBCNG-1 ebenso auf Proteinebene stark exprimiert wird und dass diese Expression weitverbreitet durch das Mausgehirn erfolgt (vgl. 2). Folglich wird hBCNG-1 selektiv im Gehirn exprimiert (mit schwächerer Hybridisierung in der Bauchspeicheldrüse). Im Gehirn wird hBCNG-1 stärker im Hippocampus und der Amygdala als in anderen Hirnregionen exprimiert.
Basierend auf der BCNG-Aminosäuresequenz und der Gewebeverteilung wurde angenommen, dass die Kanäle entweder einen spannungsabhängigen Kaliumkanal kodieren, der durch Membrandepolarisation aktiviert wird und moduliert wird durch die direkte Bindung von zyklischen Nukleotiden oder den Hyperpolarisations-aktivierten Schrittmacherkanal, der der spontanen elektrischen Aktivität im Herzen (DiFrancesco und Torta, 1991) und in verschiedenen Regionen des Gehirns (Steride et al., 1993) zugrunde liegt. Letztere Hypothese basiert auf der Feststellung, dass die Schrittmacherkanäle, ähnlich den BCNG-Genen, sowohl im Gehirn als auch im Herz exprimiert werden. Ferner sind Schrittmacherkanäle dafür bekannt, nicht-selektive Kationenkanäle zu sein, die sowohl durch Spannung als auch durch die direkte Bindung von zyklischen Nukleotiden an eine zytoplasmatische Stelle des Kanals "gegatet" werden (DiFrancesco und Torta, 1991; Pedarzani und Storm, 1995 Larkman und Kelly, 1997, McCormick und Page, 1990). Bis dato liegt keine biochemische oder molekularbiologische Information bezüglich der Beschaffenheit der Schrittmacherkanäle vor. Trotzdem deuteten die Ähnlichkeit in der Gewebeverteilung und der vorgeschlagenen Gating-Mechanismus zwischen den Schrittmacherkanälen und den BCNG-Kanälen an, dass die BCNG-Gene für eine oder mehrere Untereinheiten kodieren, die die Schrittmacherkanäle umfassen.
Schrittmacherkanäle wurden auf elektrophysiologischem Niveau sowohl in Herzgewebe als auch in zentralen Neuronen untersucht. In beiden Fällen sind die Kanäle aktiviert wenn die Zellmembranspannung stärker negativ als –40 mV gemacht wird. Diese nicht-selektiven Kanäle sind durchlässig sowohl für Na- als auch für K⁺-Ionen. Trotzdem ist bei dem negativen Membranpotentialbereich, über welchen sich diese Kanäle öffnen, ihr Haupteffekt, es dem positiv geladenen Natrium zu erlauben, die Zelle von der extrazellulären Umgebung her zu betreten, was dazu führt, dass die Zellmembran positiver wird. Dies führt möglicherweise dazu, dass die Membranspannung einen Schwellenwert erreicht und die Zelle ein Aktionspotential auslöst. (siehe 15). Zyklisches AMP (cAMP) ist bekannt, das Verhältnis zwischen Membranspannung und Kanalaktivierung zu verschieben, was dazu führt, dass die Kanäle sich schneller anschalten, wenn die Membran depolarisiert wird. Dies erhöht die Frequenz der Schrittmacherdepolarisation, wobei die Frequenz der spontanen Aktionspotentialauslösungen erhöht wird. Es handelt sich hierbei um den Effekt, der der Fähigkeit von Epinephrin (Adrenalin) zugrundeliegt, das Herz zu veranlassen, schneller zu schlagen. Die Auswirkungen von cAMP auf den Schrittmacherstrom scheinen durch zwei getrennte molekulare Mechanismen zu erfolgen. Erstens aktiviert cAMP das Enzym, cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA), was zu einer Erhöhung in den Leveln der Proteinphosphorylierung führt. Zweitens wird von cAMP angenommen, dass es direkt an eine zytoplasmatische Region des Schrittmacherkanals bindet und dadurch eine Wirkung, ähnlich derjenigen, die mit Proteinphosphorylierung gesehen wird, erzeugt. Solche direkten Aktionen von cAMP wurden sowohl im Herzen als auch im Gehirn berichtet (DiFrancesco und Torta, 1991; Pedarzani und Storm, 1995).
Eine alternative Funktion für die BCNG-Kanäle, dass sie für einen neuartigen Spannungsabhängigen und zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kaliumkanal kodieren, wird angedeutet durch den Aminosäurebereich, von dem bekannt ist, dass er die ionenleitende Pore säumt und dadurch die ionische Selektivität des Kanals bestimmt. Dieser "S5-S6 Loop" beinhaltet ein Drei-Aminosäuren-Motiv, GYG, das in fast allen Spannungsabhängigen K⁺-Kanälen konserviert ist (Heginbotham et al., 1994). Der BCNG-Kanal S5-S6 Loop zeigt Aminosäureähnlichkeit mit dem von anderen Kaliumkanälen, einschließlich dem GYG-Motiv. Dies deutet an, dass die BCNG-Kanäle K⁺-selektiv sein könnten. Trotzdem gibt es einige auffällige Unterschiede in den Sequenzen zwischen BCNG und anderen K⁺-Kanälen, die anzeigen könnten, dass die BCNG-Kanäle, verglichen mit anderen K⁺-Kanälen weniger stark K-selektiv sind, übereinstimmend mit der Auffassung, dass die BCNG-Kanäle für die nicht-selektiven Kationenschrittmacherkanäle kodieren, die sowohl für Na als auch für K⁺ durchlässig sind.
Die Anwesenheit von mBCNG-1 in den Dendriten der hippocampalen Pyramidenzellen ist besonders interessant, da für cAMP gezeigt wurde, dass es für die Errichtung einiger Formen der Langzeitsynaptischen Potenzierung in diesen Zellen wichtig ist (Frey, et al., 1993; Boshakov, et al., 1997; Huang und Kandel, 1994; Thomas, et al., 1996). Die strukturellen Merkmale von mBCNG-1 sagen eine K⁺-leitende Aktivität vorher, die durch zyklisch-Nukleotid-Bindung direkt moduliert wird.
Interessanterweise wurde ein Strom mit ähnlichen Eigenschaften in den hippocampalen pyramidalen Neuronen des CA1-Bereichs beschrieben (Warmke, et al., 1991), wo mBCNG-1 stark exprimiert wird. Von diesem Strom (IQ) wird angenommen, dass er zur noradrenergen Modulierung der hippocampalen Aktivität durch Regulierung neuronaler Erregbarkeit in Antwort auf cAMP-Spiegel beiträgt. BCNG-1 kann an der Ausformung des Kanals beteiligt sein, der für diese Typ von Strom verantwortlich ist.
Basierend auf der weitverbreiteten Gewebeverteilung und wahrscheinlich wichtigen physiologischen Rolle der BCNG-Kanäle in elektrischer Signalgebung sind Arzneimittel, die mit diesen Kanälen interagieren, von potenziellem therapeutischem Nutzen in einer Reihe von neurologischen, psychiatrischen und kardialen Erkrankungen sowie für systemische Erkrankungen von Geweben wie beispielsweise Skelettmuskel, Leber und Niere.
Neurologische Erkrankung: Basierend auf der starken Expression dieser Kanäle im Hippocampus und der potenziellen Rolle in spontaner Schrittmacheraktivität können diese nützliche, neue Targets zur Behandlung von Epilepsie sein. Beispielsweise kann es durch Blockieren dieser Kanäle möglich sein, die Schwere von Krämpfen zu verhindern oder zu vermindern. In Erkrankungen, die mit hippocampalem Neuronenverlust wie beispielsweise altersbedingtem Gedächtnisdefizit, Schlaganfall-induziertem Gedächtnisverlust und der Alzheimer-Krankheit assoziiert sind, kann ein Arzneimittel, das die Schrittmacherkanalaktivität verstärkt, von therapeutischem Nutzen durch Erhöhung der neuronalen Aktivität im Hippocampus sein. Da diese Kanäle ebenso in den Basalganglien und im Striatum exprimiert werden, können sie potenzielle Targets in der Parkinsonschen und Huntington-Erkrankung sein. Die BCNG-Kanäle sind ebenso stark im Thalamus exprimiert, wo für Schrittmacherkanäle gezeigt wurde, dass sie im Generieren spontaner Aktionspotentiale wichtig sind, die für Arousal wichtig sind, wichtig sind. Das "Targeting" solcher Kanäle kann helfen, Aufmerksamkeitsdefizitsstörungen zu behandeln.
Psychiatrische Erkrankungen: Ausgehend von den hohen Expressionsleveln von hBCNG-1 in der Amygdala können diese Kanäle Targets für Arzneimittel sein, die in verschiedene affektive Störungen und Angst involviert sind. Ihre starke Expression im limbischen System deutet an, dass sie ebenso von potenziellem Nutzen in der Behandlung von Schizophrenie sein können.
Eine Reihe von Arzneimitteln, Toxinen und endogenen Verbindungen sind bekannt dafür, mit verschiedenen Typen von Ionenkanälen zu interagieren. Diese Arzneimittel haben sich als lokale Anästhetika und in der Behandlung kardialer Arrhythmien, Bluthochdruck, Epilepsie und Angst nützlich erwiesen. Diese Arzneimittel fallen in verschiedene Klassen, einschließlich Porenblocker, allosterische Modulatoren und kompetitive Antagonisten (siehe Tabelle II). Die BCNG-Kanäle weisen einzigartige Merkmale auf, die sie zu sehr attraktiven Arzneimitteln machen.
BCNG kann gehirn- oder herzspezifische Arzneimittel hervorbringen. Zweitens zeigt die Porenregion der BCNG-Kanäle erhebliche Divergenz von denen anderer bekannter Kaliumkanäle. Dies führt somit zu porenblockierenden Arzneimitteln, die selektiv die BCNG-Kanäle verändern, jedoch andere Typen von Spannungsabhängigen K⁺-Kanälen schonen. Drittens erhellt die zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle ein anderes wichtiges Target hinsichtlich der Öffnung der BCNG-Kanäle. Beim Gestalten spezifischer zyklisch-Nukleotid-Analoga sollte es möglich sein, entweder synthetische Agonisten, die die Kanalöffnung erweitern, oder Antagonisten, die die Kanalöffnung verringern, zu konzipieren. Die häufigsten erhältlichen Arzneimittel für Ionenkanäle verringern die Kanalöffnung, relativ wenige erweitern die Kanalöffnung. Die Fähigkeit, die Öffnung von BCNG-Kanälen entweder zu erweitern oder zu verringern, öffnet ein großes Potenzial für therapeutisch wirksame Verbindungen. Zum Beispiel ist in bovinen Photorezeptor-CNG-Kanälen Rp-cGMPS ein Antagonist der Kanalöffnung, während Sp-cGMPS ein Agonist ist (Kramer und Tibbs, 1996). Außerdem zeigt die Aminosäuresequenz der zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle der BCNG-Kanäle eine erhebliche Divergenz zu zyklisch-Nukleotid- Bindungsstellen von Proteinkinasen und den zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanälen der olfaktorischen und photorezeptorischen Neuronen. Demnach sollte es möglich sein, zyklisch-Nukleotid-Analoga zu konzipieren, die spezifisch auf BCNG-Kanäle gerichtet sind.
Tabelle II Ausgewählte Arzneimittel und Toxine, die mit Mitgliedern der Spannungsabhängigen Ionenkanalfamilie interagieren
Nach ihrer Aminosäuresequenz haben diese Kanäle wahrscheinlich drei wichtige physiologische Eigenschaften, die sie a priori zu bedeutenden Targets für die Arzneimittelentwicklung machen. Erstens sollte ihr Gating spannungsabhängig sein und damit sollten sie empfindlich gegenüber der Modulation der Spannungsabhängigen Mechanismen sein. Zweitens besitzen sie eine zyklisch-Nukleotid-Bindungsdomäne in ihrem C-Terminus und es ist wahrscheinlich, dass ihr Gating durch die direkte Bindung von zyklischen Nukleotiden moduliert wird. Drittens sollte die unübliche Sequenz der porenformenden Domäne der BCNG-Kanäle es den Ionenleitfähigkeitseigenschaften des Kanals erlauben, selektiv angesprochen zu werden.
Wenn das Gating der Kanäle sowohl die Spannungssensormaschinerie als auch die zyklisch-Nukleotid-Bindungsstelle umfasst, ist es wahrscheinlich, dass koordinierte Arzneimittelschemata, wie, dass zwei Verbindungen mit niedriger Wirksamkeit und ebenso niedriger Selektivität zusammenwirken können, um die BCNG-Kanäle selektiv anzusprechen. Somit könnte eine Verbindung, die alleine schwache Wirkungen auf viele spannungsabhängige Kanäle ausüben würde, kombiniert mit einer, die eine ebenso schwache Wirkung auf die verschiedenen zyklisch-Nukleotid-Bindungstaschen ausüben würde, zusammen verabreicht werden. Da derzeit keine Molekülklasse bekannt ist, die funktionell BEIDE dieser strukturellen Elemente vereinen – mit der erwartungsgemäßen Ausnahme der BCNG-Kanäle – ist es wahrscheinlich, dass solch ein Therapieschema zu einer hohen Wirksamkeit und einem selektiven Targeting von Kanälen führen würde, die BCNG-Untereinheiten beinhalten. Selektive Intervention gegen BCNG-Unterarten sollte ebenso möglich sein.
Die Regulierung dieser Kanäle durch Arzneimittel stellt eine einzigartige Gelegenheit zum Regulieren elektrischer Aktivität bereit, die mit Erkrankungen assoziiert ist, die so verschiedenartig sind wie Epilepsie und Herzrhythmusstörungen. Außerdem stellt die zyklisch-Nukleotid-Bindungsdomäne dieser Kanäle ein einzigartiges pharmakologisches Target bereit, das verwendet werden kann, um neue, spezifische, zyklisch-Nukleotid-Agonisten oder -antagonisten zu entwickeln, um die Kanalfunktion hoch- oder herunterzuregulieren.
Arzneimittel können spannungsabhängiges Gating – verbunden mit CNG modulieren, um Selektivität zu erreichen.
Zelllinien, die mBCNG-1 exprimieren, bieten die Aussicht auf ein schnelles Screening für Verbindungen, die mit den Kanälen interagieren. Um Arzneimittel zu identifizieren, die mit der zyklisch-Nukleotid-Bindungsdomäne interagieren, kann diese Region selektiv in Bakterien exprimiert und anschließend gereinigt werden. Das gereinigte Proteinfragment kann anschließend in standardisierten Ligandbindungsassays verwendet werden, um diejenigen zyklisch-Nukleotid-Analoga, die mit hoher Affinität binden, zu detektieren.
Funktionale Wirkungen von Arzneimitteln auf die Kanalöffnung oder die Ionendurchlässigkeit durch die Pore werden unter Verwendung von Ganzzell-Patch Clamp von Säugerzelllinien getestet, die die verschiedenen BCNG-Gene exprimieren. Dort wo die BCNG-Kanäle den CNG-Kanälen ähneln, zeigen sie eine signifikante Permeabilität zu Calcium. Dies erlaubt einen High Throughput Screen, in dem die Kanalfunktion durch Abbilden intrazellulärer Calciumkonzentration bewertet wird. Arzneimittel, die die Kanalöffnung erweitern, erhöhen ebenso das interne Calcium.
BEISPIEL 4: Funktionale Expression von mBCNG-1 in Xenopus-Oocyten zeigt einen Hyperpolarisations-aktivierten Calciumstrom ähnlich zu nativem Schrittmacherstrom. [Identifikation eines Gens, das einen Hyperpolarisationsaktivierten "Schrittmacher"-Kanal des Gehirns kodiert.]
Einleitung
Die Generierung von Schrittmacheraktivität in Herz und Gehirn wird durch Hyperpolarisations-aktivierte Kationenkanäle vermittelt, die direkt durch zyklische Nukleotide reguliert werden. Wir haben im Vorfeld ein neues Mitglied der Spannungsabhängigen K-Kanal-Familie aus dem Mausgehirn (mBCNG-1) kloniert, das eine Carboxy-terminale zyklisch-Nukleotid-Bindungsdomäne beinhaltete (Santoro et al. 1997) und es demnach als Kandidaten-Gen für Schrittmacherkanäle vorgeschlagen. Heterologe Expression von mBCNG-1 zeigte, dass es in der Tat für einen Kanal kodiert, dessen Eigenschaften nicht von Schrittmacherkanälen im Gehirn zu unterscheiden sind und denjenigen im Herzen ähnlich sind. Drei zusätzliche Mausgene und zwei humane Gene, die eng mit mBCNG-1 verwandt sind, zeigen eindeutige Muster von mRNA-Expression in verschiedenen Geweben, einschließlich Gehirn und Herz, wodurch demonstriert wird, dass diese Kanäle eine weithin exprimierte Genfamilie begründen.
Die elektrische Aktivität sowohl des Herzens als auch des Gehirns hängt von spezialisierten Zellen ab, die als Schrittmacher wirken, welche das rhythmische, spontane Auslösen von Aktionspotentialen, die Muskelaktivität kontrollieren können, bestimmte rhythmische autonome Funktionen und besondere Verhaltenszustände erzeugen. In normalen Nerven- oder Muskelzellen ist Schrittmacheraktivität durch spontanes Auslösen von Aktionspotentialen gekennzeichnet, das intrinsisch zu der Zelle und unabhängig von synaptischer Versorgung ist. Defekte in der Schrittmacheraktivität können sowohl zu ererbten (Spellberg, 1971) als auch zu erworbenen (Bigger und Reiffel, 1979) kardialen Arrhythmien führen und können ebenso verschiedenen neurologischen Störungen zugrunde liegen.
In vielen dieser Fälle wird die Schrittmacheraktivität durch einen Hyperpolarisations-aktivierten Kanal erzeugt, der sowohl für Natrium als auch für Kalium durchlässig ist und sowohl im Herzen (DiFrancesco, 1993) als auch im Gehirn (Pape, 1996) vorkommt. Solche kationen-durchlässigen Kanäle wurden ursprünglich in kardialen sinuatrialen Knotenzellen beschrieben (Brown et al., 1979; Yanagihara und Irisawa, 1980; Brown und DiFrancesco, 1980; DiFrancesco, 1986), wo sie als I_f oder I_h bezeichnet wurden. Sie sind seitdem in kardialen Purkinje-Fasern (DiFrancesco, 1981), ventrikulären Muskeln (Yu et al., 1993) und sowohl in peripheren (Mayer und Westbrook, 1983) als auch in zentralen Neuronen (Halliwell und Adams, 1982; siehe Pape, 1996 als Review) beschrieben worden, wo sie als I_h oder I_q bezeichnet werden. In sinuatrialen Knotenzellen des Herzens, dem am besten untersuchten Beispiel, treibt dieser Schrittmacherkanal das rhythmische Auslösen und Schlagen der Vorhöfe und Ventrikel (Brown et al., 1979; Yanagihara und Irisawa, 1980; Brown und DiFrancesco, 1980; siehe trotzdem Irisawa et al., 1993). In der Tat bewirkt die Modulation dieses Schrittmacherkanals, dass Acetylcholin und Norepinephrin ihre klassischen Wirkungen auf den Herzrhythmus ausüben.
Im Gehirn ist die Modulation von Schrittmacherkanalaktivität in thalamischen Relaisneuronen wichtig für die Regulierung des Arousal während des Schlaf-Wach-Rhythmus (Pape und McCormick, 1989; McCormick und Bal, 1997). Schrittmacheraktivität in Hirnstammkernen trägt wahrscheinlich zum respiratorischen Rhythmus bei (Johnson und Getting, 1991; Dekin, 1993). Schließlich wird von Schrittmacheraktivität in höheren kortikalen Bereichen angenommen, dass sie zu endogener Oszillation beiträgt, die wichtig zum Synchronisieren der Aktivität neuronaler Populationen ist (Maccaferri und McBain, 1996; Strata et al., 1997), einer Synchronisierung, von der behauptet wird, dass sie die separat analysierten Komponenten einer wahrnehmungsgemäßen Darstellung zusammenbindet (Singer und Gray, 1995). Obwohl die Rolle dieses Kanals in Schrittmacheraktivität seine am besten charakterisierte Wirkung sein könnte, trägt er ebenso zur Loslasserregung, die den hyperpolarisierenden Antworten in Nichtschrittmacherzellen folgt, bei (Fain et al., 1978; Attwell und Wilson, 1980; Wollmuth und Hille, 1992; Halliwell und Adams, 1982; Mayer und Westbrook, 1983) und kann weitere funktionale Rollen innehaben.
Ein auffälliges Merkmal der Schrittmacherkanäle ist, dass ihre Aktivität durch Transmitter und Hormone, die über die Second Messenger cAMP wirken, moduliert werden kann (Tsien, 1974; DiFrancesco und Tortorra, 1991). Erhöhung der cAMP-Spiegel verschiebt die Spannungsabhängigkeit von Schrittmacherkanalaktivierung um 2-10 mV in die positive Richtung. Als ein Ergebnis lösen die Kanäle schneller und vollständiger auf Repolarisation zu einem konstanten, negativen Potential hin aus. In der Tat ist es die Fähigkeit von cAMP, die Aktivierung des Schrittmacherstroms zu modulieren, die weitgehend für die Erhöhung der Herzfrequenz in Antwort auf β-adrenerge Agonisten (Brown et al., 1979) und die Verlangsamung der Herzfrequenz während vaginaler Stimulation (DiFrancesco et al., 1989; Zaza et al., 1996) verantwortlich ist. Verblüffenderweise scheint dieser Effekt von cAMP durch seine direkte Bindung an den Kanal sowohl in sinuatrialen Knotenzellen (DiFrancesco und Tortora, 1991) als auch in Neuronen (Pedarzani und Storm, 1995; Ingram und Williams, 1996) vermittelt zu werden. Im Gegensatz dazu wird I_f durch PKA-abhängige Proteinphosphorylierung in kardialen Purkinje-Zellen reguliert (Chang et al., 1991).
Schrittmacheraktivität ist gekennzeichnet durch spontanes Auslösen von Aktionspotentialen in einer Nerven- oder Muskelzelle, das intrinsisch zu der Zelle und unabhängig von synaptischer Versorgung ist. Dieses spontane Auslösen wird durch eine langsame, Schrittmacherdepolarisation ausgelöst, von der angenommen wird, dass sie das Anschalten des Hyperpolarisations-aktivierten Schrittmacherkanals zur Folge hat (DiFrancesco, 1993). Solche Kationen-durchlässigen Kanäle wurden ursprünglich in kardialen sinuatrialen Knotenzellen beschrieben (Brown et al., 1979; Yanagihara und Irisawa, 1980; Brown und DiFrancesco, 1980; DiFrancesco, 1986), wo sie als I_f oder I_h bezeichnet wurden. Sie sind seither in kardialen Purkinje-Fasern (DiFrancesco, 1981), ventrikulären Muskeln (Yu et al., 1993) und sowohl in peripheren (Mayer und Westbrook, 1983) als auch in zentralen Neuronen beschrieben worden (Halliwell und Adams, 1982; siehe Pape, 1996 zum Review), wo sie als I_h oder I_q bezeichnet wurden.
Die Schrittmacherkanäle sind im Gegensatz zu den meisten spannungsabhängigen Kanälen geschlossen, wenn die Membran während eines Aktionspotentials depolarisiert wird und nur geöffnet, wenn die Membran zu negativen Spannungen repolarisiert. Das Öffnen dieser Kanäle auf Repolarisation des Aktionspotentials erlaubt ein Einströmen von positiv geladenen Natriumionen, die zu der spontanen Schrittmacherdepolarisation beitragen. Wenn diese Depolarisation eine ausreichende Amplitude aufweist, kann es anschließend ein zweites Aktionspotential auslösen, was zu einer repetitiven, rhythmischen elektrischen Aktivität führt. Obwohl es viele Nachweise gibt, die eine Rolle dieser Kanäle im Schrittmachen belegen (DiFrancesco, 1993; 1995; Pape, 1996), verbleibt ihr exakter quantitativer Beitrag kontrovers (Irisawa et al., 1993; Vassalle, 1995).
Ein auffälliges Merkmal der Schrittmacherkanäle ist, dass ihre Aktivität durch Transmitter und Hormone, die über das Second Messenger cAMP wirken, moduliert werden kann (Tsien, 1974; DiFrancesco et al., 1986). Erhöhung der cAMP-Spiegel verschiebt die Spannungsabhängigkeit der Schrittmacherkanalaktivierung um 5-10 mV in die positive Richtung. Als ein Ergebnis lösen die Kanäle schneller und vollständiger auf Repolarisation zu einem konstanten, negativen Potential hin aus. In der Tat ist es die Fähigkeit von cAMP, die Aktivierung des Schrittmacherstroms zu beschleunigen, der weitgehend für die Erhöhung der Herzfrequenz in Antwort auf β-adrenerge Agonisten verantwortlich ist (Brown et al., 1979) und das Verlangsamen der Herzfrequenz während vagaler Stimulation ist, wenn ACh durch Muskarinrezeptorstimulation wirkt, um die cAMP-Spiegel zu vermindern (DiFrancesco et al., 1989; Zaza et al., 1996). Interessanterweise scheint dieser Effekt von cAMP durch seine direkte Bindung an den Kanal sowohl in sinuatrialen Knotenzellen (DiFrancesco und Tortora, 1991; DiFrancesco und Mangoni, 1994; Bois et al., 1997) als auch in Neuronen (Pedarzani und Storm, 1995; Ingram und Williams, 1996) vermittelt zu werden. Im Gegensatz dazu wird I_f durch PKA- abhängige Proteinphosphorylierung in kardialen Purkinje-Zellen reguliert (Chang et al., 1991).
Trotz der intensiven physiologischen Charakterisierung von Schrittmacherfunktion und -mechanismen ist die molekulare Beschaffenheit der Hyperpolarisations-aktivierten Kationenkanäle, die für die Erzeugung der Schrittmacherdepolarisation verantwortlich sind, noch nicht identifiziert worden. Aus mehreren Gründen vermuteten wir, dass ein Kandidaten-Gen für den Schrittmacherkanal mBCNG-1 sein könnte, welches ursprünglich von einer Mausgehirn-cDNA-Bibliothek, basierend auf seiner Interaktion mit der SH3-Domäne einer Neuronen-spezifischen Isoform von Src kloniert wurde (Santoro et al., 1997). Erstens zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz von mBCNG-1 (ursprünglich bezeichnet als BCNG-1 durch Santoro et al.), dass es ein Mitglied der Superfamilie von spannungsabhängigen K-Kanälen ist (Jan und Jan, 1997), jedoch mit einer ungewöhnlichen Pore. Zweitens weist der Carboxy-Terminus eine konservierte zyklisch-Nukleotid-Bindungs(CNB)-Domäne auf, die homolog zu CNB-Domänen von Proteinkinasen (Shabb und Corbin, 1992) und den zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanälen (Zagotta und Siegelbaum, 1996) ist. Dies deutet an, dass sein Gating direkt durch zyklische Nukleotide reguliert werden könnte. Drittens werden sowohl mBCNG-1 mRNA als auch Protein weithin im Gehirn exprimiert.
mBCNG-1 war ein Kandidaten-Gen für Schrittmacherkanäle (Santoro et al., 1997), welches für ein Mitglied der Superfamilie von spannungsabhängigen Kanälen kodiert (Jan und Jan, 1997). Dieser Kanal wurde ursprünglich von einer Mausgehirn-cDNA-Bibliothek, basierend auf seiner Interaktion mit der SH3-Domäne einer nervenspezifischen Isoform von Src (n-Src) kloniert. Das Kanalprotein und die mRNA werden weithin im Gehirn exprimiert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von mBCNG-1 (SEQ ID NO: 2) (ursprünglich bezeichnet als BCNG-1 durch Santoro et al.) beinhaltet eine Carboxy-terminale zyklisch-Nukleotid-Bindungsdomäne, die homolog ist zu CNB-Domänen von Proteinkinasen (Shabb und Corbin, 1992) und den zyklisch-Nukleotid-gesteuerten Kanälen (Zagotta und Siegelbaum, 1996). Basierend auf der Tatsache, dass mBCNG-1 für eine Untereinheit eines spannungsabhängigen Kanals zu kodieren scheint, der direkt durch zyklische Nukleotide reguliert werden könnte, und seine weitverbreitete Verteilung im Gehirn wurde vorgeschlagen, dass mBCNG-1 für eine Untereinheit des Hyperpolarisations-aktivierten Kationenstroms kodieren könnte (Santoro et al., 1997).
An dieser Stelle berichten wir über die funktionale Expression von mBCNG-1 in Xenupus-Oozyten. Patch Clamp Aufzeichnungen zeigen deutlich, dass dieses Gen einen Hyperpolarisationsaktivierten Kationenkanal kodiert, der in seinen vier Schlüsseleigenschaften identisch zu dem Schrittmacherkanal des Gehirns ist und ebenso vergleichbare Ähnlichkeit zu dem des Herzens aufweist.
ERGEBNISSE
Die Lokalisierung und abgeleitete Aminosäuresequenz von mBCNG-1, einem Gen, welches ein neues Mitglied der Superfamilie von spannungsabhängigen K-Kanälen kodiert, zeigte uns an, dass es den im Gehirn vorkommenden Hyperpolarisationsaktivierten Schrittmachertypkanal kodieren könnte. Um diese Idee direkt zu testen, synthetisierten wir mBCNG-1 cRNA, die in Xenopus-Oozyten exprimiert wird, und analysierten die funktionalen Eigenschaften der exprimierten Kanäle in zellfreien Membran-Patches. Der native Gehirn-Schrittmacherkanal hat vier charakteristische Eigenschaften: 1) er ist mit geringer Kinetik durch Hyperpolarisation aktiviert, 2) er ist ein Ionenkanal, der schwach für K relativ zu Na selektiert; 3) er ist durch externes Cs, aber nicht durch Ba blockiert, und 4) er wird direkt moduliert durch intrazelluläres cAMP. Expression von mBCNG-1 erzeugt Kanäle mit jeder dieser vier Eigenschaften, wie untenstehend gezeigt wird.
Funktionale Expression von mBCNG-1 in Xenopus-Oozyten zeigt einen Hyperpolarisations-aktivierten Kationenstrom ähnlich zu nativem neuronalem Schrittmacherstrom.
Patches, erhalten von Oozyten, die mit mBCNG-1 cRNA injiziert wurden, zeigten einen Hyperpolarisations-aktivierten ionischen Strom, der denjenigen, gesehen in nativen neuronalen Schrittmachern, ähnelt (16A-F). Diese Ströme lösen aus, wenn die Membran von einem Haltepotential von –40 mV hyperpolarisiert wird, um Potentiale unter –80 mV zu testen (16A, 16B). Die Einwärtsströme schalten sich bei weniger negativen Potentialen mit einem verhältnismäßig langsamen Zeitverlauf ein, jedoch beschleunigt sich ihre Aktivierung mit steigendem Hyperpolarisationsgrad (16A, 16E, 16F). Auf Rückkehr zum Haltepotential (–40 mV) deaktivieren sich die Ströme verhältnismäßig schnell, wobei sie einen abfallenden Einwärtsschweifstrom erzeugen (16C).
Hyperpolarisierungsschritte von –130 mV lösen unter den >50 verschiedenen Patches, die wir erfasst haben typischerweise Ströme zwischen –20 pA und –200 pA aus (Patches mit einem Strom geringer als 5 pA wurden des Öfteren beobachtet, konnten jedoch nicht analysiert werden). Solche Ströme wurden nicht beobachtet in nicht-injizierten Kontroll-Oozyten oder in Oozyten, die mit cRNA injiziert wurden, die für einen bovinen Stäbchenzellen-Photorezeptor-CNG-Kanal, einen spannungsunabhängigen Kanal, der durch cGMP aktiviert wird, kodieren. Da die einzelne Kanalleitfähigkeit von I_f ungefähr 1 ps beträgt (DiFrancesco, 1986), berechnen wir, dass diese Patches (~ 1-2 μm² Membranfläche) typischerweise 50-1500 mBCNG-1-Kanäle enthalten, wodurch ein stabiles Maß an Expression angezeigt wird. Die Abwesenheit von erkennbaren einzelnen Kanalströmen in Patches, die eine geringere Stromdichte aufweisen (< 2 pA), stimmt mit mBCNG-1-Kanälen überein, die die kleine einzelne Kanalleitfähigkeit der nativen Schrittmacherkanäle anzeigen.
Sowohl der Zeitverlauf der Aktivierung auf Hyperpolarisation als auch der Zeitverlauf der Deaktivierung auf Rückkehr zu dem Haltepotential zeigt eine charakteristische sigmoidale Kinetik (16C, 16E), ähnlich zu derjenigen, die für den I_f-Strom in nativen Zellen berichtet wurde (DiFrancesco, 1984). Im Anschluss an eine initiale Verzögerung kann der Zeitverlauf der Aktivierung durch eine einzelne Exponentialfunktion angenähert werden (16E), wobei sich die Zeitkonstante von 290 ± 37 ms bei –105 mV (Mittelwert ± s.e.m., n=5) zu 98 ± 14 ms (n=5) bei –130 mV verringert (16F, Tabelle III).
TABELLE III Biophysikalische Eigenschaften von mBCNG-1
TABELLE III. ÜBERSICHT ÜBER DIE BIOPHYSIKALISCHEN EIGENSCHAFTEN VON mBCNG-1. Kontrolle. Durchschnittliche Werte für stationäre Aktivierungsparamenter: V_1/2 und Steigung, von Boltzmann-Gleichung auf Schweifstromaktivierungskurven angepasst; mittlere Zeitkonstanten der Aktivierung für Schritte zu –130 und –105 mV. cAMP. Durchschnittseffekt von cAMP auf V_1/2 und Steigung von stationärer Aktivierungskurve. Verschiebung in V_1/2 gemessen bei durchschnittlichen V_1/2-Werten vor cAMP und nach Auswaschen und Abziehen dieses Mittelwertes vom V_1/2-Wert in Anwesenheit von cAMP (1, 30 oder 3000 μM). Steigung gibt mittlere Steigung in Anwesenheit von cAMP an. 2 mM Cs. Durchschnittliche Blockierung von mBCNG-1-Strom durch Cs in Prozent. Zweite und dritte Spalte zeigen Standardfehler sowie Anzahl der Experimente für jede Messung.
Die stationäre Spannungsabhängigkeit der Aktivierung wurde bestimmt durch Hyperpolarisierung der Membran zu verschiedenen Testspannungen (16C). Der relative Betrag des abfallenden Einwärtsschweifstroms auf Rückkehr zu dem Haltepotential von –40 mV liefert eine Messung der fraktionierten Aktivierung des Stroms während der vorhergehenden Hyperpolarisation. Die Spitzenschweifstromamplituden zeigen eine sigmoidale Abhängigkeit zu der Testspannung (16D). Sie beginnen bei Potentialen negativ zu –80 mV auszulösen und erreichen maximale Aktivierung mit Schritten zu zwischen –110 und –120 mV. Anpassung der Boltzmann-Gleichung an dieses Verhältnis (siehe Experimentelle Verfahren) ergibt Schätzwerte der Spannung, bei welcher mBCNG-1 halb-maximal aktiviert wird (V_1/2 = –99,9 ± 0,8 mV, n=5) sowie der Steigung des Verhältnisses zwischen Spannung und Aktivierung (e-facher Wechsel für –6,0 ± 0,7 mV, n=5).
Der mBCNG-1-Strom wird durch K und N geleitet
Native Schrittmacherkanäle sind schwach selektiv für K über Na, wodurch typische Umkehrpotentiale von ungefähr –30 mV unter physiologischen Gradienten von Na und K angezeigt werden. Um zu demonstrieren, dass der mBCNG-1-Strom tatsächlich durch Kationen-leitende Kanäle vermittelt wird, haben wir das Umkehrpotential dieser Ströme unter Bedingungen von symmetrischen Cl-Konzentrationen, jedoch asymmetrischen Konzentrationen von K und Na, die an ihre physiologischen Gradienten heranreichen gemessen (17A, 17C). Wir finden, dass das Umkehrpotential des mBCNG-1-Stroms bei –31,8 ± 1,6 mV (n=4) sehr dicht an dem erwarteten Wert (17A-C) liegt. Da die obigen Messungen in der Abwesenheit von zugesetztem Ca erzielt wurden, untersuchten wir anschließend die Möglichkeit, dass diese Kanäle in der Anwesenheit von externem Ca zu Ca-selektiven Kanälen umgewandelt werden könnten, ähnlich zu spannungsabhängigen Calcium-Kanälen (Hess und Tsien, 1983). Dennoch fanden wir, dass die Zugabe von 1 mM Ca zu der externen NaCl-Lösung keine positive Verschiebung im Umkehrpotential hervorrief (–34,9 ± 3 mV, N=2), was für einen Ca-selektiven Kanal erwartet worden wäre.
Das Umkehrpotential, das wir für den mBCNG-1-Strom bestimmten, ist ebenso deutlich verschieden von dem Wert von 0 mV, der für einen durch Chloridionen geleiteten Strom erwartet würde. Dieser Punkt ist wichtig, da Xenopus-Oozyten endogene Hyperpolarisations-aktivierte Cl-Kanäle beinhalten, deren Expressionsgrad sich auf Expression von cRNAs verändern kann (Tzounopolous et al., 1995). Um eine Rolle von Cl, entweder als einen Ladungsträger durch mBCNG-1-Kanäle oder als einen Strom, der unsere Messungen von mBCNG-1-Strömen kontaminiert weiter auszuschließen, ersetzten wir das interne Cl durch Aspartat, ein Anion, welches die meisten Cl-Kanäle nicht durchdringt. Davon ausgehend wird angenommen, dass dies das Cl-Ausgleichspotential zu –78 mV verschiebt. Obwohl Cl-Austausch die Größenordnung des mBCNG-1-Stroms verändert (ähnlich denen, die vorher für die nativen I_f-Kanäle berichtet wurden – Frace et al., 1992), verursachte dies keine negative Verschiebung in das Umkehrpotential (17B, 17C; dort kann eine kleine positive Spannungsverschiebung vorhanden sein, die auf Veränderungen im flüssigen Kontaktpotential oder auf K-Ionenaktivität zurückzuführen sein könnte). Es wurde demnach gefolgert, dass mBCNG-1 tatsächlich für einen Hyperpolarisations-aktivierten Kationenkanal kodiert, der für K und Na durchlässig ist, ähnlich den nativen I_f- und _hI-Strömen. Basierend auf dem gemessenen Umkehrpotential und der Goldman-Hodgkin-Katz-Gleichung ist der Kanal 4-fach stärker für K gegenüber Na durchlässig, ähnlich dem Verhältnis in nativen Schrittmacherkanälen.
Der mBCNG-1-Strom wird durch externes Cs, jedoch nicht durch externes Ba blockiert
Ein charakteristisches Merkmal des Schrittmacherkanals, das erlaubt, ihn von verschiedenen anderen Arten von Hyperpolarisations-aktivierten Kanälen zu unterscheiden, ist seine Sensitivität, bei verhältnismäßig geringen Konzentrationen von extrazellulärem Cs zu blockieren (DiFrancesco, 1982; Noma et al., 1983). Gleichzeitig sind die Schrittmacherkanäle relativ unempfindlich gegenüber Blockierung durch externes Ba (DiFrancesco, 1982). Wir finden, dass die mBCNG-1-Kanäle in ihrer Sensitivität gegenüber externen Kationen ähnlich den nativen Schrittmacherkanälen sind. Demnach wird der mBCNG-1-Strom fast vollständig durch 2 mM Cs-Ionen blockiert, wenn diese an die extrazelluläre Oberfläche eines Outside-out-Patches appliziert werden (18A-18B; Mittelwert in % Inhibierung = 92,4 ± 2,5, n=6). Dosisantwortkurven für diesen Effekt zeigen, dass das IC₅₀ ungefähr 200 μM mit einem Hill-Koeffizienten von ~1 beträgt (18C). Im Gegensatz zu der blockierenden Aktivität von Cs hatte die Zugabe von 1 mM Ba zu der externen Lösung, welche Einwärtsgleichrichter-K-Kanäle und Hyperpolarisationsaktivierte Cl-Kanäle blockiert, einen geringen Effekt (18A-B; Mittelwertprozentinhibierung = 0 ± 5 %, n=3). Die Tatsache, dass mBCNG-1-Kanäle weitgehend durch Cs blockiert werden, zeigt ebenfalls an, dass unsere Strommessungen in keinem signifikanten Umfang durch endogene Oozyten-Kanäle (Barish, 1983; Tzounopolous et al., 1995) oder "stretch"aktivierte Kationenkanäle (Yang und Sachs, 1990), von denen keiner durch externes Cs blockiert wird, kontaminiert sind.
mBCNG-1-Kanäle werden direkt durch cAMP moduliert
Vorherige Studien an nativen Schrittmacherkanälen haben gezeigt, dass direkte Applikation von cAMP und/oder cGMP zu zellfreien Inside-out Patches die Kapazität des I_f-Stroms, der durch eine submaximale Hyperpolarisation ausgelöst wird, aufgrund einer Verschiebung der Aktivierungskurve zu stärker positiven Potentialen erhöhen kann (DiFrancesco und Tortora, 1991). Wir beobachteten einen quantitativ ähnlichen Effekt mit den mBCNG-1-Kanälen (19A-C). Demnach erfolgt in Antwort auf Bad-Applikation von cAMP zu der internen Oberfläche eines Inside-out-Patches eine reversible Erhöhung der Stärke des Einwärtsstroms während eines Schrittes zu 100 mV. Die Erhöhung im Strom in Antwort auf 1 μM, 30 μM oder 3 mM cAMP wird beobachtet (19A, 19B).
Dieser Effekt von cAMP beruht auf einer geringfügigen, jedoch reproduzierbaren positiven Verschiebung in der stationären Aktivierungskurve von diesen Kanälen von 2 mV (19C; Mittelwert = 1,8 ± 0,3 mV, n=5). Obwohl dieser Effekt von cAMP geringfügig ist, wurde er ständig in 5 von 5 Patches beobachtet und für statistisch signifikant befunden (P<0,001; gepaarter t-Test). Außerdem konnte in den vier Patches, in denen wir vollständige Aktivierungskurven nach Auswaschen von cAMP feststellen konnten, gezeigt werden, dass die Verschiebung reversibel ist. Die Spannungsverschiebung ist ebenso zu beobachten, wenn die individuellen Aktivierungskurven der 5 separaten Experimente gemittelt werden, um die mittleren Aktivierungskurven entweder in Abwesenheit oder Anwesenheit von cAMP zu erhalten (19C). Obwohl das Mittelungsverfahren dazu tendiert, die Effekte von cAMP infolge geringfügiger Variabilität in der Kontrollaktivierungskurve unter verschiedenen Patches zu verschleiern, ist der Unterschied zwischen den Kurven nach wie vor signifikant (p<0,05; zweiseitig bei ANOVA mit einer wiederholten Messung, F(3,6)=11,56). Weiterhin ist die Verschiebung, die wir hier mit cAMP beobachten, annähernd identisch zu der Verschiebung, die für Schrittmacherkanäle im Hippocampus beobachtet wird (Pedarzani und Storm, 1995), einer Region, wo mBCNG-1 stark exprimiert wird (Santoro et al., 1997). Da es dort kein ATP oder GTP in den internen Lösungen gab, wird cAMP wahrscheinlich durch direktes Binden an die Kanäle wirken.
Basierend auf den obigen Beobachtungen kamen wir zu dem Schluss, dass die Hyperpolarisations-aktivierten Ströme, die auf mBCNG-1-Expression beobachtet wurden, die Expression eines Schrittmacherkanals mit Spannungsabhängigkeit, Ionenselektivität, ionischen Blockier-Eigenschaften und Second Messenger Modulation, ähnlich den nativen Gehirnschrittmacherkanälen, darstellen.
Gewebeverteilung von BCNG-mRNA-Expression
Northern Blot Analyse zeigte individuelle Muster von Gewebeverteilung für jeden der identifizierten Klone und eine hohe Übereinstimmung in den Transkript- und Lokalisationsmustern zwischen homologen Maus- und Menschklonen (9A-9D und 10A-10D). Die Expression von mBCNG-1 scheint im Wesentlichen auf das Gehirn beschränkt zu sein (9A-D; Sonde "q1", siehe 7A-7B), wie vorher berichtet unter Verwendung einer bestimmten Aminoterminus-Sonde (Sonde "q0"; Santoro et al., 1997).
Die Auswertung der Verteilung von mBCNG-1 innerhalb des Mausgehirns (Santoro et al., 1997) zeigte, dass die stärkste Expression von mBCNG-1 im Cortex, Hippocampus und Cerebellum erfolgt. Northern Blot Analysen der hBCNG-1 mRNA-Verteilung innerhalb verschiedener Gehirnbereiche zeigten ebenso eine differenzielle Expression des Gens, wobei der höchste Grad in kortikalen Strukturen (Hippocampus und Amygdala; 10A-D) bestand.
DISKUSSION
Identifizierung eines Schrittmacherkanal-Gens für das Gehirn
Die unterschiedlichen Sequenzen und Gewebeverteilungen der identifizierten BCNG-Gene zeigt, dass die BCNG-Produkte eine Familie von Ionenkanalproteinen mit charakteristischen Motiven zum Spannungsabtasten und zyklisch-Nukleotid-Bindung darstellen. Diese Gene sind überwiegend im Herzen und im Gehirn lokalisiert. Wenn sie in Xenopus-Oozyten exprimiert werden, führen die mBCNG-1-Kanäle zu einem Hyperpolarisationsaktivierten Kationenkanal, dessen Eigenschaften stark mit denen des Schrittmacherstroms im Herzen (I_f) übereinstimmen. Obwohl wir keinen direkten Nachweis haben, dass die im Herzen exprimierten Mitglieder der BCNG-Kanal-Familie für einen kardialen Schrittmacherkanal kodieren, deutet die Gewebeverteilung und Sequenzähnlichkeit dieser partiellen cDNA-Klone mit full-length mBCNG-1 an, dass sie sehr wohl für die kardialen Kanäle kodieren können.
Mitglieder der spannungsabhängigen K-Kanal-Familie sind üblicherweise Tetramere, zusammengesetzt aus vier porenformenden Untereinheiten (MacKinnon, 1991). Obwohl mBCNG-1 cRNA für sich allein zur Expression von funktionalen Kanälen führt, deutet die Existenz von multiplen BCNG-Genen an, dass die nativen Kanäle Heteromultimere sein können. Außerdem können die BCNG-Kanal-Untereinheiten mit unterstützenden, nicht-Porenformenden β-Untereinheiten assoziiert sein, die die Funktion der Kanäle modifizieren. Es ist möglich, dass mBCNG-1 potenter durch cAMP moduliert wird, wenn es sich mit zusätzlichen Untereinheiten verknüpft. Alternativ kann es inhärente Unterschiede in der Wirksamkeit, mit welcher cAMP verschiedene Mitglieder der BCNG-Familie moduliert, geben. Zur Unterstützung dieser letztgenannten Möglichkeit beträgt die cAMP-abhängige Verschiebung von Ih in hippocampalen Neuronen, wo BCNG-1 vorwiegend exprimiert wird (10A-D und Santoro et al., 1997) nur 2-3 mV (Pedarzani und Storm, 1995), beinahe identisch mit der hierin beobachteten Verschiebung. Dies sticht von der 10 mV-Verschiebung ab, die für I_f in sinuatrialen Knoten (DiFrancesco und Tortora, 1991) und der 4-6 mV-Verschiebung von I_h in sensorischen Neuronen (Ingram und Williams, 1966) berichtet wurde. Die verhältnismäßig schnelle Aktivierungskinetik von mBCNG-1 macht sie ebenso ähnlicher zu dem rasch aktivierten hippocampalen Kanal (Halliwell und Adams, 1982; Maccaferri et al., 1993; Pedarzani und Storm, 1995) als zu den langsamer aktivierenden kardialen Kanälen. Es ist eine interessante Möglichkeit, dass Unterschiede in cAMP-Wirksamkeit eng mit dem Phosphorylierungszustand der Serinreste in der PKA-Konsensusstelle innerhalb der zyklisch-Nukleotid-Bindungsdomäne der BCNG-1-Untereinheiten in Beziehung stehen kann.
Zwei wichtige Unterschiede von klassischen spannungsabhängigen Kanälen statten den mBCNG-1-Kanal mit seinen charakteristischen Eigenschaften aus
Trotz der Sequenzähnlichkeit zwischen den BCNG-Kanälen und anderen spannungsabhängigen K-Kanälen gibt es zwei wichtige funktionale Unterschiede. Erstens werden die meisten spannungsabhängigen K-Kanäle üblicherweise durch Depolarisation aktiviert. Die entgegengesetzte spannungsabhängige Polarität der mBCNG-1-Kanäle tritt trotz der Anwesenheit einer stark geladenen basischen S4-Spannungsabtastenden Domäne auf. Zweitens, während die meisten Mitglieder der K-Kanal-Familie mindestens 100-fach selektiv für K-Ionen über Na-Ionen sind, sind die mBCNG-1-Kanäle, wie die nativen Schrittmacherkanäle nur vierfach selektiv für Kalium versus Natrium.
Die BCNG-Kanäle beinhalten indes eine P-Region, die ähnlich ist zu P-Regionen anderer K-selektiver Kanäle. Nachfolgend diskutieren wir mögliche Mechanismen dieser Unterschiede.
Wie können die BCNG-Kanäle trotz der Anwesenheit eines S4-Abschnitts eher auf Membranhyperpolarisation als auf Depolarisation auslösen? Eine ähnliche umgekehrte Polarität von spannungsabhängiger Aktivierung ist für die S4 beinhaltenden KAT1 spannungsabhängigen Kaliumkanäle von Pflanzen berichtet worden (Schachtman et al., 1994). Ein verhältnismäßig einfacher Mechanismus, der die spannungsabhängigen Eigenschaften von KAT1- und mBCNG-1-Kanälen erklärt wird durch die Studie von Miller und Aldrich (1996) an Shaker K-Kanälen bereitgestellt, die normalerweise rasch auslösen und anschließend rasch auf Depolarisation inaktivieren. Diese Autoren zeigten, dass S4 Punktmutationen, die die aktivierungsabhängige Reaktion zu sehr negativen Potentialen hin verschiebt (deutlich unter das Ruhepotential) die Shaker K-Kanäle in Hyperpolarisations-aktivierte Kanäle transformierten. Bei Spannungen nahe dem Ruhepotential, auch wenn sich die Aktivierungs-Gates der mutierten Kanäle in der offenen Konfiguration befinden, sind die Kanäle in Folge der Inaktivierungsreaktion geschlossen. Mäßige Hyperpolarisationen, die nicht ausreichend negativ sind, um die Aktivierungs-Gates zu schließen, öffnen die Kanäle indem sie die Inaktivierungs-Gates veranlassen, sich zu öffnen. Das Öffnen der BCNG-Kanäle auf Hyperpolarisation könnte eine ähnliche Aufhebung der Inaktivierung widerspiegeln.
Die geringere K-Selektivität der mBCNG-1-Kanäle könnte die Anwesenheit verschiedener nicht-konservativer Austausche an Schlüsselpositionen in der P-Region widerspiegeln. Demnach, obwohl die Kanäle das GYG-Motiv beinhalten, das den Hauptteil der K-Kanalselektivitätssequenz formt, ist ein konservierter Threoninrest zwei Reste N-terminal zu dem GYG-Triplett in den BCNG-Kanälen durch ein Cystein ausgetauscht. Für dieses konservierte Threonin wurde in der Röntgenkristallstruktur des bakteriellen kcsa-Kanals gezeigt, dass es einen Teil des K-Selektivitätsfilters formt (Doyle et al., 1998). Außerdem ist ein hoch konserviertes Aspartat (unmittelbar C-terminal zu dem GYG-Triplet) in den BCNG-Klonen entweder ein Alanin oder Arginin.
Die Rolle des Schrittmacherstroms in Erkrankungen
Können Änderungen in BCNG-Kanalfunktion infolge posttranslationaler Modifikation, Änderungen in Genexpression oder genetische Mutationen ererbten oder erworbenen neurologischen Störungen oder Erkrankungen der Automatie zugrunde liegen? Anhand unserer Identifikation, dass die BCNG-Gene für CNS und vielleicht kardiale Schrittmacherkanäle kodieren, sollte es jetzt möglich sein zu bestimmen, ob bestimmte familiäre Sinus-Rhythmus-Erkrankungen (Spellberg, 1971) auf elementare Defekte im Schrittmacherkanal zurückzuführen sind. Defekte in der Schrittmacherkanalfunktion könnten ebenso beitragen zu erworbenen Erkrankungen des Herzens, wie beispielsweise Sick-Sinus-Syndrom, assoziiert mit Vorhofflimmern, Sinus-Tachykardien und Bradykardien (Brigger und Reiffel, 1979), und ventrikuläre Arrythmien, assoziiert mit Herzinsuffizienz (Cerbai et al., 1994; 1997).
Das Vorhandensein multipler Gene, die für regional-spezifische Kanäle kodieren, eröffnet die interessante Möglichkeit zum Entwickeln therapeutischer Agenzien, die zum Beispiel eher auf kardiale als auf Gehirnschrittmacherkanäle gerichtet sind. Umgekehrt macht die Bedeutung der Schrittmacheraktivität im Gehirn für das Erwecken und vielleicht für das Wahrnehmungsbewußtsein diese Kanäle zu interessanten Targets für pharmakologische Manipulation. Letztendlich sollten nun Debatten hinsichtlich der präzisen Rolle der Schrittmacherkanäle in der elektrischen Aktivität von sowohl des Gehirns als auch des Herzens zugänglich sein für schlagkräftige Annäherung seitens Mausgenetik.
Experimentelle Verfahren
Bibliothek Screening und RT-PCR-Klonierung
Standardmanipulationen von Escherichia coli, Lambda-Phage und Nukleinsäuren, einschließlich rekombinanter DNA-Verfahren, wurden im Wesentlichen durchgeführt wie beschrieben (Sambrook et al., 1989).
Das erste Fragment von mBCNG-2 cDNA wurde kloniert als ein Produkt von PCR-Reaktionen, die dafür konzipiert wurden, full length m-BCNG-1 cDNA zu isolieren (Santoro et al., 1997). Dieses Fragment entsprach den Aminosäuren 234-430 der mBCNG-2-Sequenz (Nummerierung hier und durchweg gemäß mBCNG-1, siehe 8A-8B) und wurde verwendet, um eine Mausgehirn-λgt10-Bibliothek (CLONTECH^® ML 3000a) bei hoher Stringenz zu screenen, was den N-terminalen Teil von mBCNG-2 ergab (Klon 11-λ1). Aus dem gleichen λgt10-Bibliothek-Screen wurde ebenso ein schwach reagierender Plaque identifiziert (Klon 15-7), für den anschließend gezeigt werden konnte, dass er ein drittes, unterschiedliches Gen darstellt (mBCNG-3).
Eine BLAST-Suche in Maus- und Gehirn-EST-Datenbanken zeigte vier EST-Klone, die Fragmente von zwei Maus-BCNG-Genen (M41- EST, gb AA023393; M28-EST, gb AA238712) und zwei humanen BCNG-Genen (H57-EST, gb H45591; H61-EST, gb N72770) zu sein schienen. Oligonukleotide wurden innerhalb dieser Sequenzen konzipiert und zusammen mit Oligonukleotiden, die in konservierten Bereichen der BCNG-Klone konzipiert wurden, verwendet, um RT-PCR-Produkte aus Maus- oder Mensch-PolyA+ RNA zu erhalten (siehe unten). RT-PCR-Produkte wurden sequenziert und die überlappenden Bereiche verglichen, um die Übereinstimmung zwischen ESTs und bekannten BCNG-Klonen zu ermitteln (siehe 5). Der M28-EST Klon schien ein viertes und unterschiedliches Gen der vorher identifizierten BCNG cDNAs darzustellen. Vollständiges Sequenzieren des M28-EST Klons zeigte, dass sich nur das 3'-Ende des Klons mit den BCNG-Sequenzen deckt; die Sequenz 5' zu Position 632 stellt wahrscheinlich ein Intron dar, und ein Stop Codon ist bei Position 869 vorhanden.
Die Humangehirn λgt10-Bibliothek (CLONTECH^®, HL 3022a) wurde mit einem Fragment, das aus dem H61-EST Klon (Sonde "H61") abgeleitet ist, gescreent; siehe unten, und 7A-C), woraus sich der N-terminale Bereich der hBCNG-2 Sequenz bis zur Aminosäure bei Position Nr. 587 ergab.
RT-PCR-Reaktionen (25 mal für 45 Sek. bei 94°C, 30 Sek. bei 55°C, und 2 Min. bei 72°C) wurden mit PolyA+ RNA Präparationen von Mausgehirn und Mausherz (CLONTECH^®, 6616-1 und 6611-1) unter Verwendung des SuperScript Preamplification System (GIBCO-BRL^®) mit den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
B123 5'CAGTGGGAAGAGATTTTCCACATGACC3' (SEQ ID NO: 23) (entsprechend zu AS 269-277) und 41REV 5'GATCATGCTGAACCTTGTGCAGCAAG3' (SEQ ID NO: 24) (entsprechend zu AS 590-598) oder 28REV 5'CACCKCRTTGAAGTGGTCCACGCT3 (SEQ ID NO: 25) (entsprechend zu AS 554-561).
Für humane Gene wurden Reaktionen (25 mal für 45 Sek. bei 94°C, 20 Sek, bei 58°C, und 3 Min. bei 72°C) mit PolyA+ RNA von humanem Gehirn und humanem Herzen (CLONTECH^®, 6516-1 und 6533-1) unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide durchgeführt:
MB1-3 5'ATGTTCGGSAGCCAGAAGGCGGTGGAG3' (SEQ ID NO: 26) (entsprechend zu AS 102-110) und H57.C 5'CAGCTCGAACACTGGCAGTACGAC3' (SEQ ID NO: 27) (entsprechend zu AS 537-544).
Für die Lokalisierung von BCNG-2/3-Transkripten im Herzbereich, wurden Reaktionen mit PolyA+ RNA, die aus Ventrikeln, Vorhof oder sinuatrialen Knoten von Kaninchenherz isoliert wurden, durchgeführt unter Verwendung der Oligonukleotide:
BCNG-2/F2 5'GAGCAGGAGCGCGTCAAGTCGGCG3' (SEQ ID NO: 35) (entsprechend zu AS 112-119) und BCNG-2/R2 5'GAAGATGTAGTCCACGGGGATGGA3' (SEQ ID NO: 36) (entsprechend zu AS 218-225).
Um die Spezifizität des Erkennens zwischen verschiedenen Familienmitgliedern zu bestimmen, wurden die selben Oligonukleotide auf Plasmid-DNAs verwendet, die mBCNG-1, -2 oder -3 cDNAs kodieren (siehe Legende zu 9A). Diese Plasmide wurden durch "Random Priming" (STRATAGENE^®) markiert und als Sonden für die Southern Blot Analyse verwendet.
Northern Blots
Für Mausgenexpressionsstudien wurde ein multipler Gewebe Northern Blot von Maus (CLONTECH^®, 7762-1) mit PCR-Produkten, die die folgenden Bereiche der mBCNG-Klone darstellen (siehe schematische Darstellung in 7A-7B und Aminosäurenummerierung in 8A-8B), untersucht:
mBCNG-1: Sonde "q1" (entsprechend zu AS 594-720; Santoro et al., 1997);
mBCNG-2: Sonde "dA" (entsprechend zu AS 234-430).
mBCNG-3: Sonde "15-7" (entsprechend zur mBCNG-3-Sequenz vom Start bis zu Position 319).
mBCNG-4: Sonde "M28" (entsprechend zu AS 529-607 der mBCNG-4-Sequenz plus 180 nt des mBCNG-4 3' UTR; diese Sonde wurde als ein Gel-gereinigtes EcoRI/BglII Restriktionsfragment, 400 bp, aus der EST-M28 DNA erhalten).
Für humane Genexpressionsstudien wurde ein humaner multipler Gewebe Northern Blot (CLONTECH^®, 7760-1) oder multipler Gewebe Northern Blot aus humanem Gehirn (CLONTECH, 7750-1) mit den folgenden PCR-Produkten sondiert:
hBCNG-1: Sonde "H57" (entsprechend zu AS 537-800).
hBCNG-2: Sonde "H61" (entsprechend zu AS 452-634).
Hybridisierungen wurden alle in EXPRESSHYB^® Lösung (CLONTECH^®) für 1 Std. bei 68°C wie im Protokollhandbuch des Herstellers angezeigt, durchgeführt. Blots wurden für 10 Min. bei Raumtemperatur in 2× SSC/0,1% SDS gewaschen, gefolgt von zwei Waschungen für 30 Min. bei 65°C in 0,2× SSC/0,1% SDS. Filter wurden zwischen nachfolgenden Hybridisierungen durch Kochen für 5 Min. in 0,5% SDS/H2O "gestripped".
Elektrophysiologische Messungen
mBCNG-1 wurde in den pSD64TR-Expressionsvektor subkloniert. RNA wurde von BamHI-linearisierter DNA unter Verwendung von SP6 RNA-Polymerase (Message Machine^®, Ambion^®) transkribiert und in Xenopus-Oozyten, die wie vorher beschrieben präpariert wurden, injiziert (Goulding et al., 1992).
Patch Clamp Messungen wurden von zellfreien Inside-out und Outside-out Patches 3-7 Tage nach cRNA-Injektion gemacht. Messdaten wurden unter Verwendung entweder eines Axopatch 200A oder 200B integrierenden Patch Clamp Verstärkers (Axon Instruments^®, USA) erfasst. Das Haltepotential in all diesen Experimenten betrug –40mV. Der Einfachheit halber sind im Text und in der Kurzbeschreibung der Figuren nur abgekürzte Beschreibungen der verwendeten Lösungen angegeben, vollständige Beschreibungen sind unten angegeben.
Die KCl-EGTA Lösung beinhaltete: 107 mM KCl, 5mM NaCl, 10mM HEPES (pH 7,4, KOH), 1 mM EGTA. Die NaCl-EGTA Lösung beinhaltete 107 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES (pH 7,4, NaOH), 1 mM EGTA. Die KCl/NaCl-EGTA und KCl/NaCl/CaCl2 Lösungen beinhalteten 82 mM KCl, 30 mM NaCl, 10 mM HEPES (pH 7,4, KOH) mit entweder 1 mM EGTA oder 1 mM CaCl2. In einigen Experimenten ersetzten wir Cl mit Aspartat in der folgenden K-Aspartat-EGTA Lösung: 107 mM K-Aspartat, 5 mM NaCl, 10 mM HEPES (pH 7,4, KOH), 1 mM EGTA. Gegebenenfalls wurde Na-cAMP in die intrazelluläre Lösung durch iso-osmolaren Austausch von NaCl eingefügt, während CsCl und BaCl2 in die angegebenen extrazellulären Lösungen durch iso-osmotischen Austausch von entweder NaCl oder CaCl2 aufgenommen wurde. Eine Ag-AgCl Erdungsleitung wurde durch eine 3 M KCl Agar-Brückenelektrode mit der Bad-Lösung verbunden. Das größte unkompensierte Kontaktpotential wurde mit 3,4 mV gemessen. Für dieses "Offset" ist zu berücksichtigen, dass Spannungen nicht korrigiert wurden. Alle Messdaten wurden bei Raumtemperatur (22-24°C) erzielt. Spannungs-Clamp-Protokolle wurden angelegt unter Verwendung eines P/N-Protokolls, um unkompensierte lineare Streuverluste zu schmälern und Kapazitanz unter Verwendung von entweder pClamp^® software (v 6,0, AXON INSTRUMENTS^®, mit N = 8) und einem Pentium 100 mHz PC Computer oder der Pulse software (v 8,11, Heka, mit N = 10) und einem MACINTOSH CENTRIS^® 650 Computer. Sofern nicht anderweitig angezeigt, wurden die Messdaten bei 1,25 kHz (8 poliger Besselfilter, Frequency Devices 902) tiefpass gefiltert und bei 2,5 kHz unter Verwendung entweder eines TL-1 DMA Interface (AXON INSTRUMENTS^®) oder eines ITC-16 Interface (INSTRUTECH CORP.^®) digitalisiert. Auswertungen wurden unter Verwendung von pClamp (v 6,0, AXON INSTRUMENTS^®), Pulse (v 8,11, Heka) oder Sigmaplot (v 4,0 SPSS Inc.) durchgeführt.
Das Strom-Spannungsverhältnis wurde durch Messen der stationären Stromwerte am Ende von 3 Sek. Spannungsschritten erzielt (Strom durchschnittlich zwischen 2,5 Sek. und 2,95 Sek.). Die stationäre Aktivierungskurve wurde von der Amplitude von Schweifströmen, die auf einen nachfolgenden depolarisierenden Spannungsschritt zu –40 mV (Strom durchschnittlich zwischen 4-10 ms folgend der Umkehr zu –40 mV) beobachtet wurden, bestimmt. Stromwerte wurden gegen die Hyperpolarisierungs-Stufenspannung aufgetragen und mit der Boltzmann-Gleichung angepasst: I (V) = A1 + A2/{1 + exp[–(V – V1/2)/Steigung]}wobei A₁ der "offset", A₂ die Amplitude, V die Spannung in mV und V_1/2 die Aktivierungsmittelpunktspannung ist. Die Messdaten und die angepasste Boltzmann-Funktion wurden anschließend normalisiert an die maximale Amplitude der Passung. Aktivierungszeitkonstanten wurden bestimmt durch Anpassen einzelner Exponentialen zu der Anstiegsphase des Stroms unter Berücksichtigung einer initialen Verzögerung.
Um Umkehrpotentiale unter verschiedenen ionischen Bedingungen zu bestimmen wurden Inside-out Patches die bei –40 mV gehalten wurden, schrittweise auf –130 mV für 300 ms abgestuft und anschließend zu einer Reihe von Testpotentialen, die sich von –60 bis +20 mV in 5 mV Erweiterungen erstrecken, zurückgestuft. Die Spitzenamplitude der Schweifströme wurde durch Mitteln der Daten zwischen 2 und 4 ms im Anschluß der Stufe zu dem Testpotential gemessen. Die Sensitivität des mBCNG-1 Stroms gegenüber externem Cs und Ba wurde unter Verwendung der "Outside-out Patch Clamp" Konfiguration und Messen der stationären Stromwerte am Ende der 1 Sek. Stufen zu –130 mV (Strom gemittelt zwischen 800 ms und 990 ms) bestimmt. In beiden Reihen von Experimenten wurden die Elektroden mit Sylgad beschichtet um die Pipettenkapazitanz zu minimieren und Messdaten wurden bei 2,5 kHz gefiltert und bei 5 kHz abgetastet.
Kontamination durch einen endogenen Ca-aktivierten Cl Kanal in der Oozytenmembran (Barish, 1983) wurde minimiert durch Aufnehmen von EGTA (1 mM) in die interne Lösung, ohne Kalzium hinzuzufügen. Oozyten beinhalten ebenso einen "stretch-"aktiverten Kationenkanal, der durch seine große einzelne Kanalleitfähigkeit (60 pS) (Yang und Sachs, 1990) erkannt werden kann. Patches, die solche Kanalaktivität beinhalteten, wurden nicht untersucht.
Beispiel 5: Co-Expression von BCNG-Kanal-Untereinheiten und Kandidatenproteinen.
BCNG-Proteine oder BCNG-verwandte Proteine können heteromultimere Proteine formen. Um die funktionalen Rollen von neuen BCNG-Untereinheiten zu beschreiben, wurden neue BCNG-Untereinheiten mit BCNG-Untereinheiten, die überlappende Gewebeverteilung haben coexprimiert. Spannungsabhängige K⁺-Kanäle und zyklisch-Nukleotid-gesteuerte Kanäle formen beide Heteromultimere. In einigen Fällen können die Untereinheiten-Komplexe mit vollkommen unterschiedlichen Proteinen formen (z.B. KvLQTl mit MinK – (Barkanin, et al., 1996; HERG mit MinK McDonald, et al., 1997); IrK6.1 und IrK6.2 mit dem Sulphonylharnstoffrezeptor – Isomoto, et al., 1996; Inagaki, et al., 1996). BCNG-Proteine können mit Untereinheiten wie beispielsweise MinK oder ERG ähnlichen Untereinheiten assemblieren. Kandidatenproteine werden ausgewählt auf der Basis von überlappender Gewebeverteilung und der Wahrscheinlichkeit basierend auf bekannten funktionalen Eigenschaften. Beispielsweise zeigen Kv1.2 sogar auf subzellulärer Ebene überlappende Verteilung mit mBCNG-1 (Sheng, et al., 1994; Wang, et al., 1994).
Co-Expression mit polyA+ mRNA. Wenn ein anderes Protein ein funktionales Heteromultimer mit den BCNG-Kanal-Proteinen formen kann, sollte Co-Expression mit größenfraktionierter mRNA von Gewebe (z.B. Herz, Gehirn, Muskel oder Niere) dort wo die entsprechende BCNG-Untereinheit exprimiert wird (wie gezeigt durch Northern Blot Analyse) in einem einzigartigen Strom in elektrophysiologischen Strömen resultieren, wenn die BCNG-RNA mit der mRNA aus dem Gewebe co-injiziert wird.
Alternative Strategien zum Klonieren von Untereinheiten, die die funktionalen Eigenschaften der exprimierten BCNG-Kanäle modifizieren, beinhalten Homologiescreenings von geeigneten Bibliotheken bei niedriger Stringenz unter Verwendung von Nukleotidsonden, die von BCNG-Genen abgeleitet sind oder PCR-Amplifikation von genomischer oder cDNA unter Verwendung degenerierender Oligonukleotide basierend auf BCNG-Genen.
Noch ein anderes Verfahren zum Isolieren weiterer Kanaluntereinheitenproteine, die mit identifizierten BCNG-Familienmitgliedern coassemblieren, ist das Verwenden des Hefe two-hybrid Systems (Fields und Soug, 1989). Dieses System wurde ursprünglich zum Klonieren von mBCNG-1 basierend auf seiner Interaktion mit der n-src SH3 Domäne (siehe Beispiel 1) verwendet. Konservierte zytoplasmatische N- und C-terminale Domänen von BCNG-Kanalproteinen werden als "Köder" in dem Hefe two-hybrid System verwendet. N- und C-terminale Fragmente wurden in einem geeigneten Plasmid (z.B. pEG202) (Zervos et al., 1983) subkloniert.
Sequenzen von BCNG-Familienmitgliedern: DNA und vorhergesagte Aminosäuresequenzen von Maus und Mensch BCNG-Klonen Maus-Sequenzen DNA und vorhergesagte Aminosäuresequenz von mBCNG-1
Diese Maus-Sequenzen sind die erhaltene Original-DNA und vorhergesagte Aminosäuresequenzen und sind diejenige in GenBank Accession Number AG028737.
Offener Leserahmen der mBCNG-1 DNA
Vorhergesagte Aminosäuresequenz von mBCNG-1
Literatur

Adelman, J. P., Shen, K.-Z., Kavanaugh, M. P., Warren, R. A., Wu, Y.-N., Lagrutta, A., Bond, C. T., & North, R. A. (1992) Neuron 9, 209-216.
Adelman, J. P. (1995) Current Opinion in Neurobiology 5, 286-295.
Aiba, H., Fujimoto, S. and Ozaki, N. (1982) Nucleic Acids Res. 10:1345-1361.
Anderson, J. A., Huprikar, S. S., Kochian, L. V., Lucas, W. J. und Gaber, R. F. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:3736-3740.
Arancio, O., Kandel, E. R., & Hawkins, R. D. (1995) Nature 376, 74-80.
Atkinson, N. S., Robertson, G. A., & Ganetzky, B. (1991) Science 253, 551-555.
Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A.,& Struhl, K. (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, New York, NY).
Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., and Fishman, M. C. (1997). Defective "pacemaker" current (I_h) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4554-4559.
Barhanin, J., Lesage, F., Guillemare, E., Fink, M., Lazdunski, M. & Romey, G. (1996) Nature 384:78-80.
Barton, S. K. et al., 1992 J. Am. Chem. Soc. 114:8736-40.
Bigger, J. T. Jr. and Reiffel, J. A. (1979). Sick sinus syndrome. Annu. Rev. Med. 30, 91-118.
Bois, P., Renaudon, B., Baruscotti, M., Lenfant, J., und DiFrancesco, D. (1997). J. Physiol. (Lond) 501, 565-571.
Bolshakov, V. Y., Golan, H., Kandel, E. R., & Siegelbaum, S. A.(1997) Neuron 19,635-651.
Bradley, J., Li, J., Davidson, N., Lester, H. A., & Zinn, K. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91, 8890-8894.
Bradley, J., Zhang, Y, Bakin, R., Lester, H. A., Ronnett, G. V., & Zinn, K. (1997) J. of Neurosci. 17, 1993-2005.
Breede, L., & Nasmyth, K. (1985) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50, 643-650.
Broillet, M. C. & Firestein, S. (1997) Neuron 18: 951-958.
Brown, H. F., DiFrancesco, D., und Noble, S. J. (1979). Nature 280, 235-236.
Brown, H. und DiFrancesco, D. (1980). J. Physiol. (Lond) 308, 331-351.
Brugge, J. S., Cotton, P. C., Querel, A. E., Barrett, J. N., Nonner, D., & Keane, R. W. (1985) Nature 316, 554-557.
Brüggemann, A., Pardo, L., Stühmer, W., & Pongs, 0. (1993) Nature 365, 445-448.
Buller, A. L. and White, M. M. (1990). Mol. Pharmacol. 37, 423-428.
Cerbai, E., Pino, R., Porciatti, F., Sani, G., Toscano, M., Maccherini, M., Giunti, G., und Mugelli, A. (1997). Circulation 95, 568-571.
Cerbai, E., Barbieri, M., und Mugelli, A. (1994). J. Physiol. (Lond) 481, 585-591.
Cerbai, E. et al. (1997) J. Physiol. (Lond) 492, 97-106.
Chang, F., Cohen, I. S., DiFrancesco, D., Rosen, M. R, und Tromba, C. (1991). J. Physiol. (Lond) 440, 367-384.
Chen, T. Y., Peng, Y. W., Dhallan, R. S., Ahamed, B., Reed, R. R, & Yau K. W. (1993) Nature 362, 764-767.
Cossart, P. und Gicquel-Sanzey, B. (1982) Nucleic Acids Res. 10: 1363-1378.
Dale, R. N. K. et al., 1973 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:2238-42.
Dekin, M. S. (1993). J. Neurophysiol. 70, 590-601.
Demo, S. D. und Yellen, G. (1991). Neuron 7, 743-753.
Dhallan, R. S., Yau, K. W., Schrader, K. A., und Reed, R. R. (1990) Nature 347, 184-187.
DiFrancesco, D. and Tortora, P. (1991). Nature 351, 145-147.
DiFrancesco, D., Porciatti, F., und Cohen, I. S. (1991).
Experientia 47, 449-452.
DiFrancesco, D. (1986). Nature 324, 470-473.
DiFrancesco, D. (1993). Annu. Rev. Physiol. 55, 455-472.
DiFrancesco, D. (1984). J. Physiol. (Lond) 348, 341-367.
DiFrancesco, D., Ojeda, C. (1980). J. Physiol. (Lond) 308, 353-367.
DiFrancesco, D. und Mangoni, M. (1994). J. Physiol. (Lond) 474, 473-482.
DiFrancesco, D., Ferroni, A., Mazzanti, M., und Tromba, C. (1986). J. Physiol. (Lond) 377, 61-88.
DiFrancesco, D., Ducouret, P., und Robinson, R. B. (1989). Science 243, 669-671.
DiFrancesco, D. (1981). J. Physiol. (Lond) 314, 359-376.
DiFrancesco, D. (1995). Cardiovasc. Res. 30, 307-308.
Doyle, D. A., Cabral, J. M., Pfuetzner, R. A., Kuo, A., Gulbis, J. M., Cohen, S. L., Chait, B. T., und MacKinnon, R. (1998). Science 280, 69-77.
Erickson, P. F. et al., 1982 J. Inmunol. Methods 51:241-49.
Fields S., & Song O. K. (1989) Nature 340, 245-246.
Frangioni, J. V., & Neel, B. G. (1993) Anal. Biochem. 210, 179-187.
Frey, U, Huang, Y.-Y., & Kandel, E. R. (1993) Science 260, 1661-1664.
Goulding, E. H., Ngai, J., Kramer, R. H., Colicos, S., Axel, R., Siegelbaum, S. A. und Chess, A. (1992) Neuron 8:45-58.
Goulding, E. H., Tibbs, G. R. und Siegelbaum, S. A. (1994) Nature 372:369-374.
Grant, S. G. N., Karl, K. A., Kiebler, M., & Kandel, E. R. (1995) Genes Dev. 9, 1909-1921.
Greene, W. N., & Millar, N. S. (1995) Trends Neurosci. 18, 280-287.
Halliwell, J. V. und Adams, P. R. (1982). Brain. Res. 250, 71-92.
Harlow, E., & Lane, D. (1988) Antibodies: a laboratory manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, NY).
Hedin, K. E., Lim, N. F., und Clapham, D. E. (1996). Neuron 16, 423-429.
Heginbotham, L., Lu, Z., Abramson, T., und MacKinnon, R. (1994). Biophys. J. 66, 1061-1067.
Hille, B. (1992). Ionic Channels of Excitable Membranes. Sinauer.
Hoshi, T. (1995) J. Gen. Physiol. 105, 309-328.
Huang Y.-Y., & Kandel E. R. (1994) Learning & Memory 1:74-82.
Inagaki, N., Gonoi, T., Clement, J. P., Wang, C. Z., Aguilar-Bryan, L., Bryan, J. & Seino, S. (1996) Neuron 16:1011-1017.
Ingram, S. L. und Williams, J. T. (1996). J. Physiol. (Lond) 492, 97-106.
Irisawa, H., Brown, H. F., und Giles, W. (1993). Physiol. Rev. 73, 197-227.
Isomoto, S., Kondo, C., Yamada, M., Matsumoto, S., Higashiguchi, O., Horio, Y., Matsuzawa, Y. & Kurachi, Y. (1996) J Biol Chem 271:24321-24324.
Jan, L. Y. und Jan, Y. N. (1997). Annu. Rev. Neurosci. 20, 91-123.
Jegla, T. & Salkoff, L. J. Neurosci (1997) 17, 32-44.
Johnson, S. M. und Getting, P. A. (1991). J. Neurophysiol. 66, 744-761.
Johnson, T. K. et al., 1983 Anal. Biochem. 133:125-131.
Kamb, A., Iverson, L. E., & Tanouye, M. A. (1987) Cell 50, 405-413.
Kaupp, U. B., Niidome, T, Tanabe, T., Terada, S., Bönigk, W., Stühmer, W., Cook, N.J., Kangawa, K., Matsuo, H., Hirose, T., Miyata, T., & Numa, S. (1989) Nature 342, 762-766.
Kingston, P. A., Zufall, F., & Barnstable, C. J. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93,10440-10445.
Kohler, M., Hirschberg, B., Bond, C. T., Kinzie, J. M., Marrion, N. V., Maylie, J., & Adelman, J. P. (1996) Science 273, 1709-1714.
Kramer, R. H. und Tibbs, G. R. (1996) J. Neurosci. 16:1285-1293.
Krapivinsky, G., Krapivinsky, L., Wickman, K., & Clapham, D. E. (1995) J. Biol. Chem. 270,29059-29062.
Kumar, V. D, und Weber, I. T. (1992) Biochemistry 31:4643-4649.
Lidofsky, S. D. (1996) J. Membr. Biol. 157, 231-236.
Liman, E. R., & Buck, L. B. (1994) Neuron 13, 1-20.
Liman, E. R., Hess, P., Weaver, F. & Koren, G. Nature (1991) 353: 752-756.
Maccaferri, G., Mangoni, M., Lazzari, A., und DiFrancesco, D. (1993). J. Neurophysiol. 69, 2129-2136.
Maccaferri, G. und McBain, C.J. (1996). J. Physiol. (Lond) 497, 119-130.
MacKinnon, R. (1991). Nature 350, 232-235.
Martinez, R., Mathey-Prevot, B., Bernards, A., & Baltimore, D. (1987) Science 237, 411-415.
Matthaei, F. S. et al., (1986) Anal. Biochem. 157:123-128.
Marunaka, Y. et al. (1991) Biochim. Biophys. Acta 1070, 152-156.
Mayer, M. L. und Westbrook, G. L. (1983). J. Physiol. (Lond) 340, 19-45.
Mayford, M., Wang, J., Kandel, E. R., & O'Dell, T. J. (1995) Cell 81:891-904.
McCormick, D. A. und Bal, T. (1997). Annu. Rev. Neurosci. 20, 185-215.
McCormick, D. A. und Pape, H. C. (1990). J. Physiol. (Lond) 431, 291-318.
McDonald, T. V., Yu, Z., Ming, Z., Palma, E., Meyers, M. B., Wang, K. W., Goldstein, S. A. & Fishman, G. I. (1997) Nature 388:289-292.
Miller, A. G. und Aldrich, R. W. (1996). Neuron 16, 853-858.
Noma, A., Morad, M, und Irisawa, H. (1983). Pflugers Arch. 397, 190-194.
Palay, S. L., & Chan-Palay, V. (1974) Cerebellar cortex: cytology and organization (Springer, New York, NY).
Pallanck, L., & Ganetzky, B. (1994) Hum. Mol. Genet. 3, 1239-1243.
Papazian, D. M., Tempe, L. C., Jan, Y. N., & Jan, L. Y. (1991) Nature 349:305-310.
Papazian, D. M., Schwartz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., & Jan, L. Y. (1987) Science 237, 749-753.
Pape, H. C. und McCormick, D. A. (1989). Nature 340, 715-718.
Pape, H. C. (1996). Annu. Rev. Physiol. 58, 299-327.
Pawson, T. (1995) Nature 373, 573-580.
Pedarzani, P., & Storm, J. F. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11716-11720.
Pedarzani, P., & Storm, J. F. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11716-11720.
Pongs, O., (1992) Physiol. Rev. 72: S69-S88.
Raisman, G., Cowan, W-. M., & Powell, T. P. S. (1965) Brain 88:963-996.
Robinson, R. B., Yu, H., Chang, F., und Cohen, I. S. (1997). Pflugers Arch. 433, 533-535.
Roden, D. (1996). Antiarryhthmic drugs. In, The Pharmacological Basis of Therapeutics, neunte Ed. Herausgeb., Hardman, J. G., Limbird, L. E. McGraw Hill, New York.
Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.te Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Sanguinetti, M. C., Jiang, C., Curran, M. E., und Keating, M. T. (1995). Cell 81, 299-307.
Santoro, B., Grant, S. G. N., Bartsch, D., und Kandel, E. R. (1997). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14815-14820.
Schlack W. et al. (1998) Arzneimittelforschung 1998 Jan; 48(1):26-33.
Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., und Gaber, R. F. (1994). Science 258, 1654-1658.
Scott, S.-P., Harrison, R. W., Weber, I. T. und Tanaka, J. C. (1996) Protein Engineering 9:333-344.
Sentenac, H., Bonneaud, N., Minet, M., Lacroute, F., Salmon, J.-M., Gaymard, F. und Grignon, C. (1992) Science 256:663-665.
Shabb, J. B. und Corbin, J. D. (1992) J. Biol. Chem. 267, 5723-5726.
Sheng, M., Tsaur, M.-L., Jan, Y. N., & Jan, L. Y. (1994) J. Neurosci. 14, 2408-2417.
Singer, W. und Gray, C. M. (1995). Annu. Rev. Neurosci. 18, 555-586.
Smith, P. L., Baukrowitz, T., und Yellen, G. (1996). Nature 379, 833-836.
Spellberg, R. D. (1971). Chest 60, 246-251.
Staub, O., Dho, S., Henry, P. C., Correa, J., Ishikawa, T., McGlade, J., & Rotin, D. (1996) EMBO J. 15, 2371-2380.
Strata, F., Atzori, M., Molnar, M., Ugolini, G., Tempia, F., und Cherubini, E. (1997). J. Neurosci. 17, 1435-1446.
Strong, M., Chandy, G., & Gutman, G. (1993) Mol. Biol. Evol. 10, 221-242.
Su, Y., Dostmann, W. R. G., Herberg, F. W., Durick, K., Xuong, N-H., Ten Eyck, L., Taylor, S. S. und Varughese, K. I. (1995) Science 269:807-813.
Sudol, M. (1996) TIBS 21, 161-163.
Sugrue, M. M., Brugge, J. S., Marshak, D. R., Greengard, P., & Gustafson, E. L. (1990) J. Neurosci. 10, 2513-2527.
Thomas M. J., Moody T. D., Makhinson M., und O'Dell, T. J. (1996) Neuron 17, 475-482.
Tibbs, G. R., Liu, D. T., Leypold, B. G., und Siegelbaum, S. A. (1998). J. Biol. Chem. 273, 4497-4505.
Titani, K., Sasagawa, T., Ericsson, L. H., Kumar, S., Smith, S. B., Krebs, E. G. und Walsh, K. A. (1984) Biochemistry 23:4193-4199.
Trudeau, M. C., Warmke, J. W., Ganetzky, B., und Robertson, G. A. (1995). Science 269, 92-95.
Tsien, R. W. (1974). J. Gen. Physiol. 64, 293-319.
Tzounopoulos, T., Maylie, J., und Adelman, J. P. (1995). Biophys. J. 69, 904-908.
Varnum, M. D., Black, K. D. und Zagotta, W. N. (1995) Neuron 15:619-625.
Vassalle, M. (1995). Cardiovasc. Res. 30, 309-310.
Wang, H., Kunkel, D. D., Schwartzkroin, P. A., & Tempel, B. L. (1994) J. Neurosci. 14, 4588-4599.
Warmke, J, Drysdale, R., & Ganetzky, B. (1991) Science 252, 1560-1562.
Warmke, J. W., & Ganetzky, B. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3438-3442.
Weber, I. T., Shabb, J. B., & Corbin, J. D. (1989) Biochemistry 28, 6122-6127.
Weber, I. T. und Steitz, T. A. (1987) J. Mol. Biol. 198:311-326.
Wohlfart, P., Haase, W., Molday, R. S., & Cook, N. J. (1992) J. Biol. Chem. 267, 644-648.
Yanagihara, K., und Irisawa, H. (1980). Pflugers Arch. 385, 11-19.
Yu, H., Chang, F., und Cohen, I. S. (1993). Circ. Res. 72, 232-236.
Zagotta, W. N., & Siegelbaum, S. A. (1996) Annu. Rev. Neurosci. 19, 235-263.
Zaza, A., Robinson, R. B., und DiFrancesco, D. (1996). J. Physiol. (Lond) 491, 347-355.
Zervos, A. S., Gyuris, J., & Brent, R. (1993) Cell 72, 223-232.

SEQUENZ PROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polypeptid, das in der Lage ist, eine Einheit eines Mehrfacheinheitenionenkanals zu formen und das einen Teil umfasst, der die Sequenz von Aminosäurerest 111 bis 419 von SEQ ID NO: 2 (mBCNG-1) hat.
Isoliertes Polynukleotid, kodierend das Polypeptid nach Anspruch 1.
Isoliertes Plasmid, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 2.
Zelle, die ein Polypeptid umfasst, das in der Lage ist, eine Einheit eines Mehrfacheinheitenionenkanals zu formen und das einen Teil umfasst, der die Sequenz von Aminosäurerest 111 bis 419 von SEQ ID NO: 2 (mBCNG-1) hat, wobei die Zelle das Polypeptid naturgemäß nicht enthält.
Zelle, die ein Polypeptid umfasst, das in der Lage ist, eine Einheit eines Mehrfacheinheitenionenkanals zu formen und das einen Teil umfasst, der die Sequenz von Aminosäurerest 111 bis 419 von SEQ ID NO: 2 (mBCNG-1) hat, wobei die Zelle verändert wurde, um das Polypeptid zu enthalten.
Membranabschnitt, der ein Polypeptid umfasst, das in der Lage ist, eine Einheit eines Mehrfacheinheitenionenkanals zu formen und das einen Teil umfasst, der die Sequenz von Aminosäurerest 111 bis 419 von SEQ ID NO: 2 (mBCNG-1) hat.
Zusammensetzung, umfassend den Membranabschnitt nach Anspruch 6 und einen Puffer.
Verfahren zum Identifizieren eines Agens, das ein Agonist eines Ionenkanals ist, umfassend ein Polypeptid, das einen Teil umfasst, der die Sequenz von Aminosäurerest 111 bis 419 von SEQ ID NO: 2 (mBCNG-1) hat, wobei das Verfahren die Schritte umfasst von: a. in Kontakt bringen des Ionenkanals mit dem Agens; b. Bestimmen der Ionenkanalaktivität in der Anwesenheit des Agens; und c. Vergleichen der in (b) bestimmten Aktivität, mit der Aktivität in der Abwesenheit des Agens, wobei ein größerer Betrag an Aktivität in der Anwesenheit des Agens anzeigt, dass das Agens ein Agonist des Ionenkanals ist.
Verfahren zum Identifizieren eines Agens, das ein Antagonist eines Ionenkanals ist, umfassend ein Polypeptid, das einen Teil umfasst, der die Sequenz von Aminosäurerest 111 bis 419 von SEQ ID NO: 2 (mBCNG-1) hat, wobei das Verfahren die Schritte umfasst von: a. in Kontakt bringen des Ionenkanals mit dem Agens; b. Bestimmen der Ionenkanalaktivität in der Anwesenheit des Agens; und c. Vergleichen der in (b) bestimmten Aktivität, mit der Aktivität in der Abwesenheit des Agens, wobei ein geringerer Betrag an Aktivität in der Anwesenheit des Agens anzeigt, dass das Agens ein Antagonist des Ionenkanals ist.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei der Ionenkanal in einem Membranabschnitt oder in einer Zelle ist.
Isoliertes Polypeptid, das in der Lage ist, eine Einheit eines Mehrfacheinheitenionenkanals zu formen und das einen Teil umfasst, der mindestens 84% Sequenzidentität zu der Sequenz von Aminosäurerest 111 bis 419 von SEQ ID NO: 2 (mBCNG-1) hat.
Polypeptid nach Anspruch 11, wobei das Polypeptid die Sequenz YSYALFKAMSHMLCIGYGAQAPVSM umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 11, wobei das Polypeptid die Sequenz YSYALFKAMSHMLCIGYGRQAPVSM umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 11, wobei das Polypeptid die Sequenz YSYALFKAMSHMLCIGYGRQAPVGM umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 11, wobei das Polypeptid die Sequenz YSFALFKAMSHMLCIGYGRQAPESM umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 11, wobei das Polypeptid die Sequenz KTARALRIVRFTKILSLLRLLRLSRLIRYIHQW umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 11, wobei das Polypeptid die Sequenz KTARAVRIVRFTKILSLLRLLRLSRLIRYIHQW umfasst.
Isoliertes Polynukleotid, kodierend das Polypeptid nach Anspruch 11.
Plasmid, kodierend das Polynukleotid nach Anspruch 18.
Zelle, die ein Polypeptid umfasst, das in der Lage ist, eine Einheit eines Mehrfacheinheitenionenkanals zu formen und das einen Teil umfasst, der mindestens 84% Sequenzidentität zu der Sequenz von Aminosäurerest 111 bis 419 von SEQ ID NO: 2 (mBCNG-1) hat, wobei die Zelle das Polypeptid naturgemäß nicht enthält.
Zelle, die ein Polypeptid umfasst, das in der Lage ist, eine Einheit eines Mehrfacheinheitenionenkanals zu formen und das einen Teil umfasst, der mindestens 84% Sequenzidentität zu der Sequenz von Aminosäurerest 111 bis 419 von SEQ ID NO: 2 (mBCNG-1) hat, wobei die Zelle verändert wurde, um das Polypeptid zu enthalten.
Membranabschnitt, umfassend ein Polypeptid, das in der Lage ist, eine Einheit eines Mehrfacheinheitenionenkanals zu formen und das einen Teil umfasst, der mindestens 84% Sequenzidentität zu der Sequenz von Aminosäurerest 111 bis 419 von SEQ ID NO: 2 (mBCNG-1) hat.
Zusammensetzung, umfassend den Membranabschnitt nach Anspruch 22 und einen Puffer.
Verfahren zum Identifizieren eines Agens, das ein Agonist eines Ionenkanals ist, umfassend ein Polypeptid, das einen Teil umfasst, der mindestens 84% Sequenzidentität zu der Sequenz von Aminosäurerest 111 bis 419 von SEQ ID NO: 2 (mBCNG-1) hat, wobei das Verfahren die Schritte umfasst von: a. in Kontakt bringen des Ionenkanals mit dem Agens; b. Bestimmen der Ionenkanalaktivität in der Anwesenheit des Agens; und c. Vergleichen der in (b) bestimmten Aktivität, mit der Aktivität in der Abwesenheit des Agens, wobei ein größerer Betrag an Aktivität in der Anwesenheit des Agens anzeigt, dass das Agens ein Agonist des Ionenkanals ist.
Verfahren zum Identifizieren eines Agens, das ein Antagonist eines Ionenkanals ist, umfassend ein Polypeptid, das einen Teil umfasst, der mindestens 84% Sequenzidentität zu der Sequenz von Aminosäurerest 111 bis 419 von SEQ ID NO: 2 (mBCNG-1) hat, wobei das Verfahren die Schritte umfasst von: a. in Kontakt bringen des Ionenkanals mit dem Agens; b. Bestimmen der Ionenkanalaktivität in der Anwesenheit des Agens; und c. Vergleichen der in (b) bestimmten Aktivität, mit der Aktivität in der Abwesenheit des Agens, wobei ein geringerer Betrag an Aktivität in der Anwesenheit des Agens anzeigt, dass das Agens ein Antagonist des Ionenkanals ist.
Isoliertes Polypeptid, bestehend aus SEQ ID NO: 2 (mBCNG-1).
Isoliertes Polynukleotid, kodierend das Polypeptid nach Anspruch 26.
Plasmid, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 27.
Polynukleotid, das eine Sequenz komplementär zu der Sequenz des Polynukleotids nach Anspruch 2 oder 27 hat.
Nukleinsäuresonde, die in der Lage ist, mit dem Polynukleotid nach Anspruch 2 oder 27 spezifisch zu hybridisieren.
Verfahren zum Identifizieren einer Nukleinsäure in einer Probe, die ein BCNG-Protein kodiert, umfassend a. in Kontakt bringen der Probe mit einer detektierbaren Nukleinsäuresonde, die in der Lage ist, spezifisch mit einem Polynukleotid zu hybridisieren, das SEQ ID NO: 2 (mBCNG-1) kodiert, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen; und b. Bestimmen, ob ein Komplex zwischen der Nukleinsäuresonde und irgendeiner Nukleinsäure in der Probe geformt wurde, wobei eine derartige Komplexbildung die Anwesenheit einer Nukleinsäure, die ein BCNG-Protein kodiert, in der Probe anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei Schritt (a) weiterhin das Amplifizieren des Nukleinsäuremoleküls umfasst, das das BCNG-Protein kodiert, unter Bedingungen, die für eine Polymerase Kettenreaktion geeignet sind.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Amplifikation das in Kontakt bringen des Nukleinsäuremoleküls aus der Probe mit mindestens einem Amplifikationsprimer umfasst, der in der Lage ist, spezifisch mit dem Polynukleotid zu hybridisieren, das SEQ ID NO: 2 (mBCNG-1) kodiert.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei der Primer SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, oder SEQ ID NO: 32 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei das amplifizierte Nukleinsäuremolekül, das das BCNG-Protein kodiert, durch Größenfraktionierung detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Nukleinsäuresonde mit einem detektierbaren Marker gekennzeichnet ist.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei der detektierbare Marker ein radioaktiv-markiertes Molekül, ein flureszierendes Molekül, ein Enzym, ein Ligand, oder ein magnetisches Bead ist.
Verfahren zum Isolieren einer Nukleinsäure, die ein BCNG-Protein kodiert, aus einer Probe, umfassend: a. in Kontakt bringen der Probe mit einer detektierbaren Nukleinsäuresonde, die in der Lage ist, spezifisch mit einem Polynukleotid zu hybridisieren, das SEQ ID NO: 2 (mBCNG-1) kodiert, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen; b. Bestimmen, ob ein Komplex zwischen der Nukleinsäuresonde und irgendeiner Nukleinsäure in der Probe geformt wurde, wobei eine derartige Komplexbildung die Anwesenheit einer Nukleinsäure, die ein BCNG-Protein kodiert, in der Probe anzeigt; und c. Isolieren des Komplexes durch Größenfraktionierung.
Verfahren zum Detektieren, ob eine Verbindung die Expression eines mBCNG-1 (SEQ ID NO: 2) Proteins beeinflusst, umfassend: a. in Kontakt bringen einer Probe, die ein mBCNG-1 (SEQ ID NO: 2) Protein exprimiert, mit der Verbindung; b. Bestimmen der Menge an Expression von mBCNG-1 (SEQ ID NO: 2) Protein in der Probe; und c. Vergleichen der in Schritt (b) bestimmten Menge an mBCNG-1 (SEQ ID NO: 2) Proteinexpression mit der Menge, bestimmt in der Abwesenheit der Verbindung, dadurch bestimmend, ob die Verbindung die Expression von mBCNG-1 (SEQ ID NO: 2) Protein beeinflusst.
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die in der Lage ist mit einem mBCNG-1 (SEQ ID NO: 2) Protein zu interagieren, umfassend: a. in Kontakt bringen einer Probe von mBCNG-1 (SEQ ID NO: 2) Protein mit der Verbindung unter Bedingungen, die das Formen eines Komplexes zwischen der Verbindung und dem mBCNG-1 (SEQ ID NO: 2) Protein erlauben; b. Bestimmen des zwischen der Verbindung und dem mBCNG-1 (SEQ ID NO: 2) Protein geformten Komplexes; und c. Vergleichen der Menge des in Schritt (b) geformten Komplexes, mit der Menge, geformt in der Abwesenheit der Verbindung, wobei eine größere Menge an Komplex, geformt in der Anwesenheit von der Verbindung, anzeigt, dass die Verbindung mit dem mBCNG-1 (SEQ ID NO: 2) Protein interagiert.
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die in der Lage ist, die mBCNG-1 (SEQ ID NO: 2) Proteinaktivität zu modulieren, umfassend: a. in Kontakt bringen einer Probe von mBCNG-1 (SEQ ID NO: 2) Protein mit der Verbindung; b. Bestimmen der Menge an Aktivität des mBCNG-1 (SEQ ID NO: 2) Proteins in der Probe; und c. Vergleichen der in Schritt (b) bestimmten Menge an Aktivität, mit der Menge, bestimmt in der Abwesenheit der Verbindung, wobei eine größere oder geringere Menge an Aktivität in der Anwesenheit der Verbindung anzeigt, dass die Verbindung die mBCNG-1 (SEQ ID NO: 2) Proteinaktivität moduliert.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei Schritt (a), zuerst das Einbringen eines Polynukleotids, das SEQ ID NO: 2 (mBCNG-1) kodiert, in ein Expressionssystem umfasst und Bewirken, dass das Expressionssystem die Nukleinsäure unter Bedingungen exprimiert, wodurch ein BCNG-Protein produziert wird.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei Schritt (b) das Messen des elektrischen Kanalstroms oder des intrazellulären Kalziumspiegels in der Anwesenheit der Verbindung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 42, wobei das Expressionssystem eine kultivierte Wirtszelle umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 44, wobei die Probe eine Zelle, Zelllysat oder ein zellfreies Translationssystem umfasst.
Verfahren nach Anspruch 45, wobei die Zelle eine Herzzelle, eine Nierenzelle, eine Leberzelle, eine Zelle des Atemwegsepithels, eine Muskelzelle, eine neuronale Zelle, eine Gliazelle, eine Mikrogliazelle, eine Endothelzelle, eine mononukleäre Zelle, eine Tumorzelle, eine Säugerzelle, eine Insektenzelle, oder eine Xenopus-Oozyte ist.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Modulation eine gesteigerte Ionendurchflussrate oder verminderte Ionendurchflussrate ist.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Modulation eine gesteigerte Ionendurchlässigkeit oder verminderte Ionendurchlässigkeit ist.
Isolierter Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 11 bis 17, oder 26 bindet.
Zelle, die in der Lage ist, den Antikörper nach Anspruch 49 zu produzieren, die normalerweise einen derartigen Antikörper nicht produziert.
Verfahren zum Identifizieren des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1, 11 bis 17, oder 26 in einer Probe, umfassend: a. in Kontakt bringen der Probe mit einem Antikörper, der spezifisch an ein derartiges Polypeptid bindet, unter Bedingungen, die das Formen eines Komplexes zwischen dem Antikörper und dem Polypeptid erlauben; und b. Bestimmen, ob es einen Komplex, geformt in Schritt (a), gibt, wobei die Komplexbildung die Anwesenheit des Polypeptids in der Probe anzeigt.