DE69531366T2

DE69531366T2 - Antagonisten des neuromedin b rezeptors

Info

Publication number: DE69531366T2
Application number: DE69531366T
Authority: DE
Inventors: H. David COY; E. John TAYLOR
Original assignee: Societe de Conseils de Recherches et dApplications Scientifiques SCRAS SAS; Tulane University
Current assignee: Ipsen Pharma SAS; Tulane University
Priority date: 1994-12-08
Filing date: 1995-12-07
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2015-12-08
Also published as: ATE245441T1; EP1011716A4; WO1996017617A1; AU715759B2; DE69531366D1; AU4474096A; EP1011716B9; ES2207656T3; PT1011716E; EP1011716B1; CA2205663A1; US5569741A; EP1011716A1; JPH10510268A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die mit Säugetier-Bombesin (Bn) verwandten Peptide, Gastrin freisetzendes Peptid (GRP), Neuromedin B (NMB) und Neuromedin C (NMC) haben vielfältige biologische Wirkungen. Hierzu gehören Chemotaxis, Kontraktion und Stimulation der glatten Muskeln und die Freisetzung zahlreicher gastrointestinaler Hormone. GRP und NMB sind auch im zentralen Nervensystem wirksam, beeinflussen die Wärmeregulierung, Verhaltensauswirkungen, das Sättigungsempfinden, das Beibehalten des zirkadianen Rhythmus und die Inhibierung der TSH-Freisetzung. Mit Bn verwandte Peptide wirken als Wachstumsfaktor in zahlreichen normalen Zellen (z. B. sternalen, epithelialen und neuroendokrinen Zellen) sowie neoplastischen Zellen, wie kleinzelligen. Lungenkrebszellen des Menschen, nicht-kleinzelligen Lungenkrebszellen, hepatozellulären Tumorzellen der Ratte, Prostatazellen und Adenocarcinomzellen der Brust.
Neuere Struktur- und Klonierungsstudien zeigen, dass mit Bn verwandte Peptide die Wirkungen zweier eigener Rezeptorklassen mediieren. GRP hat eine hohe Affinität und NMB hat eine niedrige Affinität für die GRP bevorzugende Klasse oder den GRP bevorzugenden Subtyp (GRP-Rezeptor oder GRP-R). Im Unterschied dazu hat GRP eine niedrige Affinität und NMB eine hohe Affinität zu der anderen Klasse, dem NMB bevorzugenden Subtyp (NMB-Rezeptor oder NMB-R). Beide Rezeptorklassen sind im zentralen Nervensystem und dem Gastrointestinaltrakt vorhanden.
Es ist gezeigt worden, dass natives Somatostatin, Somatostatin-14 (SS-14), die Vernetzung von ¹²⁵I-GRP mit einem 120 kD Protein in Triton^®-Extrakten von 3T3-Zellen und kleinzelligen Lungenkrebszellen des Menschen inhibiert, von denen bekannt ist, dass sie Bombesin-Rezeptoren besitzen. In neuerer Zeit ist in Orbuch et al., Mol. Pharmacol., 44: 841 (1993) gezeigt worden, dass auch Somatostatin-Octapeptidanaloga Bindungsaffinität zu NMB-R zeigen. Diese Analoga behalten jedoch auch eine wesentliche Aktivität für Somatostatin-Rezeptoren.
Die WO 94/02163 beschreibt ein Verfahren zum selektiven Inhibieren der biochemischen Aktivität von Zellen, die durch Neuromedin B induziert wird. Das Verfahren schließt die Stufe des Kontaktierens von Zellen, die Neuromedin B Rezeptor enthalten, mit einem cyclischen Octapeptid mit Lysin oder Ornitin an Position 5 ein.
Die EP-A-0 389 180 beschreibt Octapeptide, die GH freisetzende inhibierende Aktivität zeigen. Die Octapeptide haben Lysin an Position 5.
Die EP-A-0 215 171 beschreibt Octapeptide, die zur Inhibierung der Sekretion von GH, Insulin und Glukagon wirksam sind. Die Octapeptide haben Lysin an Position 5.
Die EP-A-0 298 732 beschreibt ein Peptid, das die Sequenz -Cys-X-D-Trp-Lys-Val-Cys umfasst, wobei X für jeden Aminosäurerest steht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Abkürzungen

Nal = 3-(2-Naphthyl)alanin oder 3-(1-Naphthyl)alanin
Bpa = 3-(4-Biphenyl)alanin
X-Phe = Phenylalanin mit einem p-, o- oder m-Substituenten, wie -OH, CH₃, NO₂ und Halogen am Phenylring, z. B. 3-(4-Chlorphenyl-1)alanin
F₅Phe = 3-(pentafluorphenyl)alanin
Nle = Norleucin
Me-Trp = Trp mit methylsubstituiertem Indolylstickstoff
Dab = 2,4-Diaminobuttersäure
Aub = 2-Aminobuttersäure

Die vorliegende Erfindung betrifft cyclische Octapeptide, die sowohl hohe Affinität als auch hohe Selektivität für den NMB-Rezeptor haben und die folgende Formel (I)
aufweisen. A¹ ist das D-Isomer von Nal oder Trp und vorzugsweise D-Nal ist. A³ ist Phe, F₅-Phe oder ortho-, para- oder metasubstituiertes X-Phe, wobei X Halogen, NO₂, CH₃ oder OH ist. A³ ist vorzugsweise Phe oder para-substituiertes X-Phe, wobei X Cl, F oder OH ist. A⁵ ist -NH-CH(Y)-CO-, wobei Y (CH₂)_m-R₄-N(R₅)(R₆) oder (CH₂)_n-R₄-NH-C(R₇)-N(R₅)(R₆) ist. Gemäß einem Aspekt – ist A⁵ -NH-CH-(Y)-CO-, wobei Y (CH₂)_m-R₄-N(R₅)(R₆) und vorzugsweise Dab, 7-Aminophenylalanin und 2,3-Diaminopropionsäure ist, mit der Maßgabe, dass A⁵ nicht Orn ist. Gemäß einem anderen Aspekt ist A⁵ -NH-CH(Y)-CO-, wobei Y (CH₂)_n-R⁴-NH-C-(R₇)-N(R₅)(R₆) ist, und ist vorzugsweise Arg oder 7-Guanidinylphenylalanin. A⁶ ist das D- oder L-Isomer von Thr, Leu, Ile, Nle, Val, Nal, Trp, Me-Trp, Abu, Bpa, F₅-Phe, Phe und X-Phe, wobei X Halogen, NO₂, CH₃ oder OH ist. A⁶ ist vorzugsweise das D- oder L-Isomer von Thr, Leu, Ile, Nle, Trp, Val und Abu. A⁸ ist Nal oder Trp und ist vorzugsweise Nal. Der Index m ist 1, 2 oder 3 und vorzugsweise 2 oder 3; n ist 1, 2, 3, 4 oder 5 und vorzugsweise 2, 3 oder 4. Jeder von R₁ und R₂ ist unabhängig H, E, COE oder CODE. E ist ein Kohlenwasserstoff mit zwischen 1 und 25 Kohlenstoffatomen, der substituiert oder unsubstituiert, gesättigt oder ungesättigt, geradkettig oder verzweigt, cyclisch, acyclisch oder polycyclisch ist. Beispiele für E schließen C₁- bis C₁₂-Alkyl, C₂- bis C₁₂-Alkenyl, C₂- bis C₁₂-Alkinyl, Phenyl, Naphthyl, C₇- bis C₁₂-Phenylalkyl oder -Alkylphenyl, C₈- bis C₁₂-Phenylalkenyl oder -Al-kenylphenyl, C₈- bis C₁₂-Phenylalkinyl oder -Alkinylphenyl, C₁₁-bis C₂₀-Naphthylalkyl oder -Alkylnaphthyl, C₁₂- bis C₂₀-Naphthylalkenyl oder -Alkenylnaphthyl oder C₁₂- bis C₂₀-Naphthylalkinyl oder -Alkinylnaphthyl ein, vorausgesetzt, dass, wenn einer von R₁ oder R₂ COE oder COOE ist, der andere H sein muss. R₃ ist -NH₂, und R₅, R₆, R₈ sind jeweils unabhängig H oder E. Jeder von R₅, R₆ und R₈ ist vorzugsweise H oder ein C₁- bis C₁₀-Kohlenwasserstoff, wie Alkyl, Alkenyl, Alkylphenyl, Phenyl und Phenylalkyl einschließlich C₁- bis C₅-Alkyl. Jeder von R₅ und R₆ ist insbesondere H. R₄ ist C₆H₄ oder fehlt, und fehlt vorzugsweise. R₇ ist =NR₈, =S oder =O und vorzugsweise =NR₈, und insbesondere ist R₇ =NH. Bevorzugte Octapeptide, die die obige erfindungsgemäße Formel (I) abdeckt, schließen H₂-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Ar Val-Cys-Nal-NH₂ (Peptid Arg)⁵ und H₂-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Dab-Val-Cys-Nal-NH₂ (Peptid Dab⁵) ein.
In Formel (I) ist in Übereinstimmung mit der konventionellen Darstellung einer Polypeptidkette das N-terminale Ende auf der linken Seite und das C-terminale Ende auf der rechten Seite. Die Symbole A¹, A² oder dergleichen in einer Peptidsequenz stehen für einen Aminosäurerest, d. h. =N-CH(R)-CO-, wenn sie sich am N-terminalen Ende befinden, oder -NH-CH-(R)-CO-, wenn sie sich nicht am N-terminalen Ende befinden, wobei R die Seitenkette dieses Aminosäurerests bezeichnet. R ist für Val somit -CH(CH₃)₂. Wenn der Aminosäurerest optisch aktiv ist, ist auch die Konfiguration in der L-Form gemeint, wenn die D-Form nicht ausdrücklich angegeben ist. Es sei darauf hingewiesen, dass die beiden Cys-Rests (d. h. A² und A⁷) in Formel (I) über eine Disulfidbindung miteinander verbunden sind. Der Bequemlichkeit halber wird eine Linie, die konventionellerweise zur Angabe einer Disulfidbindung zwischen zwei Cys-Resten verwendet wird, hier jedoch weggelassen. COE bezieht sich auf -(C=O)-E, und COOE bezieht sich auf -(C=O)-O-E.
Die Verabreichung eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes eines Octapeptids, das von Formel (I) abgedeckt ist, an einen Patienten, dessen Befindlichkeitsstörung aus einer durch NMB mediierten biochemischen Aktivität resultiert, liegt auch im Bereich der vorliegenden Erfindung. In anderen Worten können die Octapeptide in Form pharmazeutisch annehmbarer Salze bereitgestellt werden, wie Säureadditionssalzen oder Metallkom plexen, wie mit Zink oder Eisen. Beispiele für Säureadditionssalze sind (i) jene, die mit organischen Säuren hergestellt sind, wie Essig-, Milch-, Pamoa-, Malein-, Zitronen-, Äpfel-, Ascorbin-, Bernstein-, Palmitin-, Kork-, Salicyl-, Wein-, Methansulfon- oder Toluolsulfonsäure, (ii), jene, die mit polymeren Säuren hergestellt sind, wie Tanninsäure oder Carboxymethylcellulose, und (iii) jene, die mit anorganischen Säuren hergestellt sind, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure.
Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und auch aus den angefügten Ansprüchen hervor.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Wir beschreiben zuerst kurz die Zeichnungen.
1 ist eine graphische Darstellung, die die Unterdrückung der NMB-stimulierten Nahrungsaufnahme durch ein Analogon der Erfindung zeigt.
2 ist eine graphische Darstellung, die die Unterdrückung der NMB-stimulierten Nahrungsaufnahme durch ein Analogon der Erfindung zeigt.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Erfindungsgemäße Octapeptide werden an Methylbenzhydrylaminharz unter Verwendung von Standard-Festphasenverfahren hergestellt und mit Fluorwasserstoff/Anisol-Mischungen gespalten. Die Peptide werden in verdünnter 90% Essigsäurelösung durch Titration mit I₂ cyclisiert und durch Gelfiltration an SEPHADEX^TM G-25 (Aldrich, Milwaukee, WI, USA) in 50% Essigsäure und Gradienteluierung an C 18 Silika unter Verwendung von Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure-Puffern gereinigt. Siehe z. B. Y. Sasaki et al., J. Med. Chem., 30: 1162 (1987); J. M. Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Auflage, Pierce Chemical Co ., Rockford, IL, USA (1984) und D. H. Coy et al., Tetrahedron, 44: 835 (1988). Homogenität wurde durch Dünnschichtchromatographie ("DC"), analytische HPLC, Aminosäureanalyse und Massenspektroskopie beurteilt.
Die Homogenität sollte laut Bestimmung bei jedem Peptid vorzugsweise > 96% sein. Das folgende Beispiel 1 ist eine detaillierte Beschreibung der Synthese des Peptids Dab⁵. Andere erfindungsgemäße Peptide können hergestellt werden, indem mit den Fähigkeiten des Durchschnittsfachmanns geeignete Modifikationen der hier offenbarten Syntheseverfahren vorgenommen werden.
Die NMB-Analoga der Erfindung werden in Bindungs-Assays einem Screening unterzogen, um ihre jeweiligen Affinitäten zu den NMB-, GRP- und Somatostatinrezeptoren zu ermitteln. Siehe Beispiele 2, 3 beziehungsweise 4. Es ist gezeigt worden, dass Agonisten des NMB-Rezeptors die Erzeugung von Inositolphosphaten stimulieren, Wang et al., J. Biochem., 286: 641 bis 648 (1992). In dem folgenden Beispiel 5 wurde die Fähigkeit der NMB-Analoga, die NMB-Rezeptoraktivierung zu antagonisieren, mit einem Inositolphosphat-Umschlag-Assay gemessen. In dem folgenden Beispiel 6 zeigte ein in vivo Assay die Fähigkeit der erfindungsgemäßen NMB-Analoga, die durch NMB produzierte Unterdrückung der Nahrungsaufnahme zu blockieren.
Die erfindungsgemäßen NMB-Analoga verhalten sich wie potente Antagonisten des NMB-Rezeptors. Es ist gezeigt worden, dass NMB das Wachstum von Krebszelllinien stimuliert (Moody et al., J. Pharmacol., 263: 1 (1992); Wang et al., Biochem. J., 286: 641 (1992)). Als NMB-Antagonisten können die erfindungsgemäßen Analoga zur Behandlung von Krebsen verwendet werden, wie kleinzelligen Lungentumoren und Glioblastomen. Zudem ist gezeigt worden, dass NMB die Nahrungsaufnahme unterdrückt (Kirkman et al., Society for the Study of Ingestive Behavior, Toronto, Kanada). Die erfindungsgemäßen Analoga können zum Stimulieren der Nahrungsaufnahme zur Behandlung von Essstörungen verwendet werden, wie Anorexie, oder solchen, die durch Krebs oder Aids hervorgerufen werden. Zudem ist auch gezeigt worden, dass NMB die Gastrinfreisetzung herabsetzt, Kawai et al., Endocrinol. Japan, 37(6): 857 (1990). Die erfindungsgemäßen Analoga können somit zum Stimulieren der Gastrinfreisetzung bei Patienten verwendet werden, die unzureichende Mengen Gastrin produzieren.
Die erfindungsgemäßen Analoga sind auch hochselektiv für den NMB-Rezeptor. Die erfindungsgemäßen Analoga haben daher verringerte Kreuzreaktivität mit beiden dieser Rezeptoren. Andere Agonisten der Somatostatinrezeptoren können beispielsweise die Ausschüttung von Wachstumshormon inhibieren oder den Kohlehydratmetabolismus stören, da die Agonisten die Insulinausschüttung inhibieren.
Die Dosis der erfindungsgemäßen Verbindung zur Behandlung der oben genannten Krankheiten variiert in Abhängigkeit von der Verabreichungsweise, dem Alter und dem Körpergewicht des Individuums und dem Zustand des zu behandelnden Individuums und wird letztendlich durch den behandelnden Arzt oder Tierarzt festgelegt. Solche Menge der aktiven Verbindung, wie sie durch den behandelnden Arzt oder Tierarzt festgelegt worden ist, wird hier als "therapeutisch wirksame Menge" bezeichnet.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen werden in Einzeldosisform bereitgestellt und werden nach beliebigen Verfahren hergestellt, die in der Pharmazie wohl bekannt sind. Alle Verfahren schließen die Stufe ein, in der der aktive Bestandteil/die aktiven Bestandteile mit dem Träger zusammengebracht wird bzw. werden, der ein oder mehrere Hilfsbestandteile stellt. Die Formulierungen für Tabletten oder Pulver werden im Allgemeinen durch gleichförmiges und inniges Mischen des aktiven Bestandteils mit feinteiligen festen Trägern und nachfolgend, falls im Fall von Tabletten erforderlich, Formen des Produkts zu der gewünschten Form und Größe hergestellt.
Es wird angenommen, dass ohne weitere Ausführungen ein Fachmann die vorliegende Erfindung in vollem Umfang basierend auf der hier gegebenen Beschreibung nutzen kann. Die folgenden spezifischen Ausführungsformen werden daher nur als veranschaulichend und nicht als den Rest der Offenbarung in irgendeiner Weise einschränkend angesehen. Auf alle hier zitierten Veröffentlichungen wird Bezug genommen.
BEISPIEL 1
Die Synthese von Boc-D-Nal-S-methylbenzyl-Cys-O-brombenzyl-oxycarbonyl-Tyr-D-Trp-N-benzyloxycarbonyl-Dab-Va-S-methylbenzyl-Cys-Nal-benzhydrylaminharz war wie folgt. Benzhydrylamin-Polystyrolharz (Advanced Chem Tech, Inc., Louisville, KY, USA) (0,7 g, 0,3 mmol) in Chloridionenform wurde in das Reaktionsgefäß eines Advanced Chem Tech^TM Peptidsynthesegeräts gegeben, das so programmiert war, dass der folgende Reaktionszyklus durchgeführt wurde: (a) Methylenchlorid; (b) 33% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (2 Mal jeweils 1 und 25 Minuten); (c) Methylenchlorid, (d) Ethanol; (e) Methylenchlorid; (f) 10% Triethylamin in Chloroform.
Das neutralisierte Harz wurde mit t-Butyloxycarbonyl ("Boc")-Nal und Diisopropylcarbodiimid (jeweils 1,5 mmol) in Methylenchlorid eine Stunde lang gerührt, und das resultierende Aminosäureharz wurde dann durch den Zyklus der Stufen (a) bis (f) in dem obigen Waschprogramm geführt. Die folgenden Aminosäuren (0,9 mmol) wurden dann nachfolgend nach demselben Verfahren gekoppelt: Boc-S-methylbenzyl-Cys, Val, Boc-N-ben zyloxycarbonyl-Dab, Boc-D-Trp, Boc-O-brombenzyloxycarbonyl-Tyr und Boc-S-methylbenzyl-Cys und Boc-D-Nal. Nach Waschen und Trocknen wog das fertige Harz 1,13 g.
Unter Verwendung des fertigen Harzes wurde H-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Dab-Cys-Nal-NH₂ hergestellt. Das oben erhaltene Peptidharz (1,13 g, 0,5 mmol) wurde mit Anisol (5 ml), Dithiothreitol (100 mg) und wasserfreiem Fluorwasserstoff (35 ml) bei 0°C gemischt und 45 Minuten lang gerührt. Überschüssiger Fluorwasserstoff wurde rasch unter einem trockenen Stickstoffstrom verdampft. Freies Peptid wurde ausgefällt und mit Ether gewaschen. Das Rohpeptid wurde dann in 250 ml 90% Essigsäure gelöst, der eine konzentrierte Lösung I₂/MeOH zugefügt wurde, bis eine bleibende braune Farbe erkennbar war. Überschüssiges I₂ wurde durch Zugabe von Ascorbinsäure entfernt, und die Lösung wurde durch Verdampfen auf ein kleines Volumen reduziert. Die rohe Peptidlösung wurde auf eine Säule (2,5 × 90 cm) SEPHADEX^TM G-25 gegeben und mit 50% Essigsäure eluiert. Fraktionen, die gemäß UV-Absorption und DC eine Hauptkomponente enthielten, wurden dann zusammengegeben, durch Verdampfen auf ein geringes Volumen reduziert und auf eine Säule (1,5 × 70 cm) VYDAC^® Octadecylsilan-Silika (10–15 μ) (Vydac, Hesperia, CA, USA) gegeben, gefolgt von Eluierung mit einem linearen Gradienten von Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser. Fraktionen wurden mittels DC und analytischer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie untersucht und zusammengegeben, um maximale Reinheit zu ergeben.
Wiederholte Lyophilisierung der Lösung aus Wasser ergab 97 mg des Produkts als weißes, flaumiges Pulver. Das Produkt war laut HPLC und DC homogen. Aminosäurenanalyse des Säurehydrolysats und FAB MS bestätigten die Zusammensetzung des Octapeptids.
BEISPIEL 2
NMB-Rezeptorbindungs-Assay
Das Verfahren zum Transfektizieren des NMB-Rezeptors der Ratte in BALB-3T3-Fibroblasten wird in Wada et al., Neuron, 6: 4221 bis 430 (1991) und Benya et al., Mol. Pharmacol., 42: 1058 (1992) erörtert. Membranen für den NMB-Rezeptorbindungs-Assay wurden durch Homogenisieren von BALB-3T3 Fibroblasten, die mit dem NMB-Rezeptor der Ratte transfektiziert waren, mit einem POLYTRON^TM Gewebehomogenisator (Einstellung 6, 15 Sekunden) (Brinkman, Westbury, NY, USA) in eiskaltem 50 mM Tris-HCl (Puffer A) (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA) und zweimaliges Zentrifugieren mit 39 000 × g (10 Min) mit zwischendurch erfolgender, erneuter Suspendierung in frischem Puffer A erhalten. Die am Ende erhaltenen Pellets wurden in dem 50 mM Tris-HCl, das 0,1 mg/l Bacitracin (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA) und 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) (Puffer B) Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA) enthielt, erneut suspendiert und für den Rezeptorbindungs-Assay auf Eis gehalten. Aliquote (0,4 ml) wurden mit 0,05 ml [¹²⁵I-Tyr⁴]Bombesin (etwa 220 Ci/mmol) (New England Nuclear, Boston, MA, USA) in Puffer B mit und ohne 0,05 ml der nicht markierten NMB-Analoga inkubiert. Nach 30-minütiger Inkubierung (4°C) wurde das gebundene [¹²⁵I-Tyr⁴]Bombesin von dem freien [¹²⁵I-Tyr⁴]Bombesin durch rasche Filtration durch WHATMAN^TM GF/B-Filter, der zuvor in 0,3% Polyethylenimin eingeweicht worden war, unter Verwendung eines Brandel-Filtrationsverteilers (Brandel, Gaithersberg, ND, USA) getrennt. Die Filter wurden dann drei Mal mit 5 ml Aliquoten eiskaltem Puffer A gewaschen. Die spezifische Bindung war definiert als das gesamte gebundene [¹²⁵I]-Bombesin minus demjenigen, das in Anwesenheit von 1 μM nicht markiertem NMB gebunden war. Die erfindungsgemäßen Analoga hatten eine hohe Bindungsaffinität zu dem NMB-Rezeptor. Beispiele für Ergebnisse von drei erfindungsgemäßen Analoga in dem NMB-Rezeptorbindungs-Assay waren (K_i-Werte in nM) 47,4 ± 10,3 (Peptid Arg⁵) und 85,1 ± 2, 7 (Peptid Dab⁵).
BEISPIEL 3
GRP-Rezeptorbindungs-Assay
Membranen für den GRP-Rezeptorbindungs-Assay wurden durch Homogenisieren kultivierter AR42J-Zellen mit einem Polytron^TM-Gewebehomogenisator (Einstellung 6, 15 Sekunden) in eiskaltem 50 mM Tris-HCl (Puffer A) und zweimaliges Zentrifugieren mit 39 000 × g (10 Min) mit zwischenzeitlich erfolgender erneuter Suspendierung in frischem Puffer A erhalten. Die fertigen Pellets wurden in dem 50 mM Tris-HCl erneut suspendiert, das 0,1 mg/ml Bacitracin und 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) (Puffer B) enthielt, und für den GRP-Rezeptorbindungs-Assay auf Eis gehalten. Aliquote (0,4 ml) wurden mit 0,05 ml [¹²⁵I-Tyr⁴)-Bombesin (etwa 2200 Ci/mmol) in Puffer B mit und ohne 0,05 ml unmarkierte NMB-Analoga inkubiert. Nach 30-minütiger Inkubierung (4°C) wurde das gebundene [¹²⁵I-Tyr⁴]Bombesin von dem freien [¹²⁵I-Tyr⁴] Bombesin durch rasche Filtration durch WHATMAN^TM GF/B-Filter, die zuvor in 0,3% Polyethylenimin eingeweicht worden waren, unter Verwendung eines Brandel-Filtrationsverteilers getrennt. Die Filter wurden dann drei Mal mit 5 ml Aliquoten eiskaltem Puffer A gewaschen. Die spezifische Bindung war definiert als das gesamte gebundene [¹²⁵I]-Bombesin minus demjenigen, das in Anwesenheit von 1 μM nicht markiertem GRP gebunden war. Die erfindungsgemäßen Analoga hatten eine schwache Bindungsaffinität zu dem GRP-Rezeptor. Beispiele für Ergebnisse von erfindungsgemäßen Analoga in dem GRP-Rezeptorbindungs-Assay waren (K_i-Werte in nM) 2921 ± 250 (Peptid Arg⁵) und 2632 ± 216 (Peptid Dab⁵).
BEISPIEL 4
Somatostatin-Rezeptorbindungs-Assay
Membranen für den Somatostatin-Rezeptorbindungs-Assay wurden durch Homogenisieren kultivierter azinöser AR42J-Pankreaszellen mit einem Polytron^TM-Gewebehomogenisator (Einstellung 6, 15 Sekunden) in eiskaltem 50 mM Tris-HCl (Puffer A) und zweimaliges Zentrifugieren mit 39 000 × g (10 Min) mit zwischenzeitlich erfolgender erneuter Suspendierung in frischem Puffer A erhalten. Die fertigen Pellets wurden für den Rezeporbindungs-Assay erneut in 10 mM Tris-HCl suspendiert. Zur Bestimmung der K_i-Werte wurden die verschiedenen Konzentrationen der NMB-Analoga 90 Minuten bei 25°C mit ungefähr 0,05 nM [¹²⁵I]MK-678 (University of Arizona, School of Medicine, Tucson, AZ, USA) in 50 mM HEPES (pH 7,4) (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA) inkubiert, der BSA (Fraktion V) (10 mg/ml) (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA), MgCl₂ (5 mM) (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA), Aprotinin (200 KIU/ml) (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA), Bacitracin (0,02 mg/ml) und Phenylmethylsulfonylfluorid (0,02 mg/ml) (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA) enthielt. Das am Ende vorhandene Assay-Volumen betrug 0,3 ml. Die Inkubationen wurden durch rasche Filtration durch GF/C-Filter (vorgeweicht in 0,3% Polyethylenimin) unter Verwendung eines BRANDEL^TM Filtrationsverteilers beendet. Jedes Röhrchen und jeder Filter wurden dann drei Mal mit 5 ml Aliquoten eiskaltem Puffer gewaschen. Die spezifische Bindung war definiert als das gesamte gebundene [¹²⁵I]MK-678 minus demjenigen, das in Anwesenheit von 200 nM MK-678 gebunden war. Ein bekanntes cyclisches Octapeptid D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Nal-NH₂ (Lys⁵) wurde in Orbuch et al., Mol. Pharmacol., 44: 841 (1993) offenbart, und hatte eine extrem hohe Affinität zu dem Somatostatinrezeptor (K_i = 0,84 ± 0,53). Im Unterschied dazu hatten erfindungsgemäße Analoga eine viel niedrigere Affinität, im Bereich von etwa einem Hundertstel oder einem Tausendstel des K_i-Werts von Lys⁵. K_i-Werte (nM) für erfindungsgemäße Analoga waren beispielsweise 407 ± 82 (Peptid Dab⁵) und beachtenswerterweise 1032 ± 113 (Peptid Arg⁵).
BEISPIEL 5
Inositolphosphat-Umschlag-Assay
Zur Messung des Inositolphosphat-Umschlags wurden BALB-3T3-Fibroblasten, die mit dem NMB-Rezeptor der Ratte transfektiziert waren, geerntet und erneut in phosphatgepufferter Salzlösung suspendiert, die 25 mM Glukose (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA) und 75 mM Sucrose (PBS + GS) enthielt, und mit 25 μCi/ml myo-[3H]-Inositol (New England Nuclear, Boston, MA, USA) 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen, erneut in PBS + GS suspendiert und mit LiCl (100 mM) (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA) und den NMB-Analoga in einem Endvolumen von 0,30 ml inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Chloroform/Methanol (1 : 2) beendet (Burdick & Johnson, Muskegeon, Michigan; Mallinckrodt, Paris, Kentucky), und die gesamten [³H]-Inositolphosphate wurden wie in Snider et al., J. Neurochem., 47: 1214 (1986) beschrieben isoliert. Peptid Dab5 ist ein potenter Agonist des NMB-Rezeptors mit einer K_i von 78,1 ± 25,9 in dem Inositolphosphat-Umschlag-Assay.
Das folgende Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der in-vivo-Unterdrückung der Nahrungsaufnahme unter Verwendung eines cyclischen Octapeptids.
BEISPIEL 6
Individuell untergebrachte männliche Sprague-Dawley-Ratten (Charles River, n = 8), die 450 bis 500 g wogen, wurden in einem temperaturgeregelten Raum mit 12 : 12 h Licht : Dunkelheits-Zyklen gehalten. Ratten wurden an ein fünfstündiges Nahrungsentzugsschema, gefolgt von 60 Minuten Zugang zu einer 0,5 kcal/ml Glukoselösung gewöhnt. Den Ratten wurde intraperitoneal entweder 0,9% Salzlösung (1,0 ml/kg) oder 100 nmol/kg des Peptids Prn⁵ injiziert. Eine Minute später wurde den Ratten intraperitoneal entweder 0,9% Salzlösung, 32,0 nmol/kg NMB oder 3,2 nmol/kg NMC (GRP 18–27), der biologisch aktive Anteil von GRP, injiziert. Es war zuvor bestimmt worden, dass diese Agonistdosen zuverlässig die Nahrungsaufnahme in diesem experimentellen Beispiel unterdrücken, Ladenheim et al., Amer. Physiol. Soc. R263-R266 (1991). Fünf Minuten nach der zweiten Injektion wurde die Glukoselösung angeboten und die Einnahme nach 15, 30, 45 und 60 Minuten aufgezeichnet. Jede Ratte erhielt alle vier Bedingungen für sowohl NMB als auch NMC. Die Verabreichung der Agonisten oder der Antagonisten lag mindestens 48 Stunden auseinander. Die Daten wurden statistisch unter Verwendung einer 4 (Injektion) × 4 (Zeit) Analyse der Varianz analysiert, gefolgt von geplanten T-Test-Vergleichen für jeden Agonisten. Weil die Einnahme gemäß dem Basislinienzustand (Salzlösung + Salzlösung) sich für beide Gruppen von Experimenten nicht erheblich unterschied (p > 0,5), wurden diese Bemittelt und zum Vergleich mit Auswirkungen der Agonisten und Peptid Orn⁵ verwendet.
Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl NMB (1) als auch NMC (2) die Nahrungsaufnahme zu allen Zeitpunkten signifikant unterdrückten, verglichen mit der Basislinieneinnahme (p < 0,01). Vorhergehende Verabreichung von 100 nmol/kg Peptid Orn⁵ blockierte die Unterdrückung der Glukoseeinnahme, die durch NMB erzeugt war, vollständig. Die Einnahme unter den Bedingungen Peptid Orn⁵+ NMB und Peptid Orn⁵ + Salzlösung war größer als unter der Bedingung Salzlösung + Salzlösung (p < 0,01). Im Unterschied zu NMB hatte die vorhergehende Verabreichung von Peptid Orn⁵ keine Auswirkung auf die Unterdrückung der Einnahme, die durch NMC erzeugt worden war, da die Unterdrückung der Aufnahme unter der Bedingung Salzlösung + NMC sich von der Einnahme unter der Bedingung Peptid Orn⁵+ NMC nicht erheblich unterschied (p > 0,5).
ANDERE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Der Fachmann kann der obigen Beschreibung leicht die wesentlichen Charakteristika der vorliegenden Erfindung entnehmen und, ohne von deren Umfang abzuweichen, verschiedene Veränderungen und Modifikationen der Erfindung vornehmen, um sie an verschiedene Verwendungen und Bedingungen anzupassen. Somit liegen auch andere Ausführungsformen innerhalb der Ansprüche.

Claims

Cyclisches Octapeptid mit der Formel:
in der A¹ D-Nal oder D-Trp ist; A³ Phe, F₅-Phe oder X-Phe ist, wobei X Halogen, NO₂, CH₃ oder OH ist; A⁵ -NH-CH(Y)-CO- ist, wobei Y (CH₂)_m-R₄-N(R₅)(R₆) oder (CH₂)_n-R₄-NH-C(R₇)-N(R₅)(R₆) ist, mit der Maßgabe, dass A⁵ nicht Orn ist; A⁶ das D- oder L-Isomer einer Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Thr, Leu, Ile, Nle, Val, Abu, Nal, Trp, Me-Trp, Bpa, F₅-Phe, Phe und X-Phe ist, wobei X Halogen, NO₂, CH₃ oder OH ist; A⁸ Nal oder Trp ist; m 1, 2 oder 3 ist; n 1, 2, 3, 4 oder 5 ist; jedes von R₁ und R₂ unabhängig H, E, COE oder COOE ist, wobei E C_1-12-Alkyl, C_2- ₁₂-Alkenyl, C_2- ₁₂-Alkinyl, Phenyl, Naphthyl, C_7-12-Phenylalkyl oder -Alkylphenyl, C_8- ₁₂-Phenylalkenyl oder -Alkenylphenyl, C_8-12-Phenylalkinyl oder -Al-kinylphenyl, C_11-20-Naphthylalkyl oder -Alkylnaphthyl, C_12-20-Naphthylalkenyl oder -Alkenylnaphthyl oder C_12-20-Naphthylalkinyl oder -Alkinylnaphthyl ist, mit der Maßgabe, dass, wenn eines von R₁ oder R₂ COE oder COOE ist, dea andere H sein muss; R₃ -NH₂ ist; R₄ C₆H₄ ist oder fehlt; R₇ =NR₈, =S oder =O ist; jedes von R₅, R₆ und R₈ unabhängig H oder E ist; und die beiden Cys-Reste über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 1, bei dem Y a) (CH₂)_m-R₄-N(R₅)(R₆) oder b) (CH₂)_n-R₄-NH-C(R₇)-N-(R₅)(R₆) ist, wobei R₄ fehlt und im Fall von b) R₇ =NR₈ ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 2, bei dem m 2 oder 3 ist, n 2, 3 oder 4 ist, und jedes von R₅, R₆ und R₈, wo vorhanden, unabhängig H oder C₁- bis C₅-Alkyl ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 3, bei dem A⁶ das Doder L-Isomer einer Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Thr, Leu, Ile, Nle, Trp, Val und Abu ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 4, bei dem A³ Phe oder para-substituiertes X-Phe ist, wobei x Cl, F oder OH ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 5, bei dem A¹ D-Nal ist und A⁸ Nal ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 6, bei dem A³ Tyr ist und A⁶ Val ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 3, bei dem A⁵ im Fall von a) Dab ist und im Fall von b) Arg ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 8, bei dem A⁶ ein Doder L-Isomer einer Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Thr, Leu, Ile, Nle, Trp, Val und Abu ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 8, bei dem A³ Phe oder para-substituiertes X-Phe ist, wobei X Cl, F oder OH ist; oder bei dem A¹ D-Nal ist und A⁸ Nal ist; oder bei dem A³ Tyr ist und A⁶ Val ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 10 mit der Formel:
oder mit der Formel
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 9, bei dem A¹ D-Nal ist und A⁸ Nal ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 9, bei dem A³ Tyr ist und A⁶ Val ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 13 mit der Formel:
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 1, bei dem Y (CH₂)_n-R₄-NH-C(R₇)-N(R5)(R₆) ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 15, bei dem R₄ fehlt und R₇ =NR₈ ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 16, bei dem n 2, 3 oder 4 ist, und jedes von R₅, R₆ und R₈ unabhängig H oder C₁- bis C₅-Alkyl ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 17, bei dem A⁶ ein Doder L-Isomer einer Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Thr, Leu, Ile, Nle, Trp, Val und Abu ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 18, bei dem A³ Phe oder para-substituiertes X-Phe ist, wobei X Cl, F oder OH ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 19, bei dem A¹ D-Nal ist und A⁸ Nal ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 20, bei dem A³ Tyr ist und A⁶ Val ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 19, bei dem A⁵ Arg ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 22, bei dem A⁶ ein Doder L-Isomer einer Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Leu, Ile, Nle, Trp, Val und Abu ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 23, bei dem A³ Phe oder para-substituiertes X-Phe ist, wobei X Cl, F oder OH ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 24, bei dem A¹ D-Nal ist und A⁸ Nal ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 25, bei dem A³ Tyr ist und A⁶ Val ist.
Cyclisches Octapeptid nach Anspruch 26, bei dem das Octapeptid die Formel
hat.