DE69528128T2 - Rekombinante Chimäre Proteine und Verfahren zur deren Verwendung - Google Patents
Rekombinante Chimäre Proteine und Verfahren zur deren VerwendungInfo
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Description
- Chimäre Proteine und noch genauer chimäre Proteine mit einer Domäne, die von einem physiologisch aktiven Rest stammt, und einer Domäne, die von einem extrazellulären Matrixproteinrest stammt, werden zur Verfügung gestellt. Des weiteren werden DNA-Konstrukte, die diese chimären Proteine kodieren, und Verfahren unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie zum Herstellen dieser chimären Proteine zur Verfügung gestellt. Verfahren zum Heilen von Gewebe einschließlich der Bildung von Knochen und/oder Knorpelgewebe werden ebenfalls zur Verfügung gestellt.
- Chimäre Proteine, die auch als Fusionsproteine bekannt sind, sind Hybridproteine, die zwei oder mehr Vorläuferproteine oder Peptide durch Peptidbindungen kombinieren. Fusionsproteine können durch die rekombinante Technologie hergestellt werden, d. h. durch das Fusionieren eines Teils einer kodierenden Sequenz eines Gens an die kodierende Sequenz eines anderen Gens. Das fusionierte Gen kann dann dazu verwendet werden, einen passenden Organismus zu transformieren, der dann das Fusionsprotein exprimiert. Diese Proteine werden für gewöhnlich zum Testen der Funktion verschiedener Domänen eines Proteinmoleküls verwendet, oder um einen Lokator oder ein Bindungspeptid an ein Protein oder Peptid von Interesse anzuhängen. So wurden in einem Versuch, die Transkriptionseigenschaften zu analysieren, zum Beispiel Teile stromaufwärts und teilweise stromabwärts der menschlichen, Ratten- oder Maus-Kollagengene an andere Proteine fusioniert. Siehe z. B. Rossouw et a., DNA Sequences in the First Intron of the Human ProAlpha-1-I Collagen Gene Enhance Transcription, Journal of Biological Chemistry, 262 (31), S. 15151-15157 (1987). Die Wirkungen der genomischen Prägung sind durch das Fusionieren eines Gens, das menschliches Keratin-18 9-Protein mit dem Gen, das beta- Galactosidase (LacZ) fusioniert, analysiert worden. Siehe Thorey et al., Parent-Specific Expression of a Human Keratin 18/beta-galactosidase Fusion Gene in Transgenic Mice, Dev. Dyn. (United States), 195 (2), S. 100-12) Okt. 1992). Die europäische Patentanmeldung 88 302 039 beschreibt die Herstellung und Reinigung eines rekombinanten Proteins, z. B. Kollagen, einer Linkerregion, die eine Restriktionsstelle kodieren kann, und eines Bindungsproteins für ein Substrat. Das Fusionsprotein wird dann mit einem passenden Substrat, an das es bindet, kontaktiert und das Protein kann dann gewonnen werden, z. B. von einer Säule.
- Extrazelluläre Matrixproteine ("EMPs") werden im Raum um und nahe den Zellen multizellulärer Organismen gefunden und sind typischerweise faserförmige Proteine zweier funktionaler Typen: hauptsächlich strukturaler, z. B. Kollagen und Elastin, und hauptsächlich adhäsiver, z. B. Fibronectin und Laminin. Kollagene sind eine Familie von Faserproteinen, die typischerweise von Bindegewebszellen sezerniert werden. Zwanzig verschiedene Kollagenketten, die sich zur Bildung von insgesamt ungefähr zehn verschiedenen Kollagenmolekülen verbinden, sind identifiziert worden. Eine allgemeine Diskussion über Kollagen wird in Alberts, et al., The Cell, Garland Publishing, S. 802-823 (1989) geliefert. Weitere Faser- oder Filamentproteine schließen Typ I 1F-Proteine, z. B. Keratine; Typ II 1F-Proteine, z. B. Vimentin, Desmin und saures gliales fibrilläres Protein (glial fibrillary acidic protein); Typ III 1F-Proteine, z. B. Neurofilamentproteine und Typ IV 1F-Proteine, z. B. nukleäre Laminine ein.
- Physiologisch aktive Glycoproteine, Proteine, Peptide und Proteoglycane werden in belebten Dingen häufig gefunden. Diese Glycoproteine, Proteine, Peptide und Proteoglycane sind an einer vielfältigen Gesamtheit von zellulären und viralen Funktionen beteiligt, die die Initiierung oder Regulierung des Stoffwechsels, Katabolismus, Reproduktion, Wachstum und Reparatur verschiedener Lebensformen einschließen. Physiologisch aktive Glycoproteine, Proteine, Peptide und Proteoglycane schließen therapeutisch wirksame Glycoproteine, Proteine, Peptide und Proteoglycane wie Hormone, Wachstumsfaktoren, Enzyme, Liganden und Rezeptoren und Fragmente davon ein. Therapeutisch wirksame Substanzen schließen Glycoproteine, Proteine, Peptide und Proteoglycane ein, die in der Medizin und Forschung verwendet worden sind, z. B. um ein günstiges Ergebnis im Zusammenhang mit Krankheitsstadien, Trauma und/oder die erhöhte Wirksamkeit normaler Zellfunktionen zu erreichen. Beispiele therapeutisch aktiver Glycoproteine, Proteine, Peptide und Proteoglycane schließen Zellregulationsfaktoren wie Interleukine, GCSF, Erythropoietin, Insulin, Wachstumshormon, ACTH, Schilddrüsenhormone, verschiedene Wachstumsfaktoren, osteogene oder osteoinduktive Faktoren, Decorin und ähnliches ein.
- Die osteogenen Mittel sind eine Proteinfamilie oder Peptide, die die Bildung von Knochen und/oder Knorpelgewebe induzieren. Osteogenin, Knochenmorphogeneseprotein ("BMP") oder osteoinduktives Protein sind weitere Begriffe, die Proteine beschrieben, die knocheninduzierende Wirkung haben. BMPs sind eine Familie verwandter Proteine, die die Entwicklungskaskade der Knochendifferenzierung auslösen, indem sie mesenchymale Stammzellen induzieren, in eine Vielzahl von Geweben, einschließlich Knochen, Knorpel und Dentin zu wachsen. Die Wirkung von BMPs ist besonders nützlich zum Reparieren großer Knochendefekte, die ohne klinische Intervention nicht heilen könnten.
- Osteogene Mittel sind aus demineralisiertem Säugetierknochengewebe isoliert worden (siehe z. B. US-Patente Nr. 4,294,753 und 4,761,471). Im wesentlichen reine BMPs sind mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technologien produziert worden (siehe z. B. US-Patente Nr. 5,106,748, 5,187,076, 5,141,905, 5,108,922, 5,166,058 und 5,116,738). Das US-Patent Nr. 5,168,050 beschreibt die Verwendung eines DNA-Konstrukts mit einer DNA-Sequenz, die ein Vorläuferprotein von BMP-2A kodiert, das an die DNA-Sequenz, die für BMP-2B kodiert, ligiert wurde, um eine verbesserte BMP-2B-Expression zu erreichen.
- Es wurden verschiedene Verfahren zum Induzieren der Bildung von Knochen oder Knorpelgewebe mit BMPs angewendet. Wird BMP in lebendes Gewebe implantiert, ohne in einer Darreichungsform vorzuliegen, wird das BMP schnell resorbiert und regt die Knochenbildung nicht wirksam an. Deswegen wurden Zusammensetzungen zur Darreichung oder Implantation von BMPs entwickelt.
- Das folgende sind Beispiele von Versuchen, um Verabreichungsmittel für BMPs herzustellen. Das US-Patent Nr. 4,472,840 beschreibt Kollagen- und BMP-Konjugate oder -Komplexe in Form von mikroporösen Schwämmen, um die Bildung von Knochengewebe in Tieren oder Menschen zu induzieren. Das US-Patent Nr. 4,975,527 beschreibt enzymgelöstes Kollagen als Träger von Knochenmorphogeneseprotein. Das US-Patent Nr. 4,563,489 beschreibt Verabreichungssysteme für BMP, die Mischungen aus biodegradierbaren organischen Polymeren wie Polymilchsäure und Polyglycolsäure sind.
- Das US-Patent Nr. 5,106,626 beschreibt die Verabreichung von osteogenem Protein, das aus Säugetierknochen extrahiert wurde, und mit einer Matrix, wie beispielsweise Tricalciumphosphat, Hydroxyapatit, thermoplastischen Polymermaterialien, Kollagen, Pariser Gips, Polymilchsäure, Polycapromilchsäure oder Polyglycolsäure, gemischt oder davon absorbiert wurde. Die US-Patente Nr. 5,011,691 und 5,250,302 beschreiben Verfahren zur Reinigung osteogenen Proteins aus Säugetierknochen und das Kombinieren hiervon mit einer Matrix aus porösem Material, wie beispielsweise Kollagen, Homopolymeren oder Copolymeren der Glycolsäure und Milchsäure, Hydroxyapatit oder Tricalciumphosphat.
- Es ist vermutet worden, daß zur Verhinderung einer schnellen Resorption von BMP von einer Implantationsstelle, osteogene Sequestrierungsmittel zusammen mit einer Mischung aus osteogenem Protein und einer porösen Polymermatrix verwendet werden können. US-Patent 5,171,579 beschreibt eine Zusammensetzung einer Mischung eines osteogenen Proteins, einer porösen, partikelförmigen Matrix und einer das osteogene Protein sequestrierenden Menge aus Blutklumpen. PCT WO 93/00050 beschreibt eine Mischung eines osteogenen Proteins, einer Polymermatrix aus Poly(Milchsäure), Poly(Glycolsäure) und Copolymeren aus Milchsäure und Glycolsäure, und ein das osteogene Protein sequestrierendes Material, welches Alkylcellulose, Hyaluronsäure, Alginat, Poly(Ethylenglycol), Polyoxyethylenoxid, Carboxyvinylpolymer, Poly(Vinylalkohol) oder Carboxymethylcellulose sein kann.
- Trotz der Forschung, die im Bereich der Arzneimittelabgabesysteme unternommen wurde, sind Zusammensetzungen, die eine klinisch wirksame Dosis eines therapeutischen Mittels über einen vorherbestimmten Zeitraum genau an Zielzellen liefern und die einfache Handhabbarkeit durch den Arzt und günstige Herstellung kombinieren, noch immer wünschenswert. Die Eliminierung der oben genannten getrennten gereinigten Matrixmaterialien, Sequestrierungsmittel und die Substituierung durch effizientere therapeutisch wirksame Zusammensetzungen wären von Vorteil.
- Osteogene chimäre Proteine mit einer Domäne, die von mindestens einem extrazellulären Matrixprotein stammt, und einer Domäne, die von mindestens einem Knochenmorphogeneseprotein stammt, werden zur Verfügung gestellt. Geeignete Domänen, die von zellregulatorischen Faktoren stammen, schließen osteogene Domänen ein.
- Rekombinante DNA-Konstrukte mit DNA-Sequenzen, die für die oben erwähnten chimären Proteine kodieren, werden zur Verfügung gestellt. Klonierungsvektoren, in die die oben genannten DNA-Konstrukte inkorporiert wurden, sowie Zellen, die mit diesen Vektoren transformiert wurden, werden ebenfalls zur Verfügung gestellt. Therapeutische Zusammensetzungen, in die die oben genannten chimären Proteine und ein pharmazeutisch akzeptabler Träger inkorporiert wurden, werden zur Verfügung gestellt. Zum Beispiel wird eine Zusammensetzung zur Verabreichung von Medikamenten zur Verfügung gestellt, die ein chimäres Protein mit einer Domäne, die von einem Faserprotein, und einer Domäne, die von einem physiologisch aktiven Glycoprotein, Protein, Peptid und/oder Proteoglycan stammt, zur Verfügung gestellt.
- Verfahren zur Herstellung eines DNA-Konstrukts, das die DNA-Sequenz einschließt, die ein osteogenes Agens kodiert funktionsfähig mit einer DNA-Sequenz, die für ein extrazelluläres Matrixprotein kodiert, verbunden ist, werden zur Verfügung gestellt. Ebenfalls zur Verfügung gestellt werden Verfahren zur Herstellung osteogener/extrazellulärer Matrix chimärer Proteine durch Transformieren einer Zelle mit einem geeigneten Klonierungsvektor, der ein DNA-Konstrukt einschließt, das für das chimäre osteogene/extrazelluläre Matrixprotein kodiert, das Kultivieren der Zellen in einem geeigneten Kulturmedium und das Isolieren des chimären Proteins aus dem Kulturmedium.
- In anderen Ausführungsformen werden Verfahren zur Verfügung gestellt, die die Bildung von Knochen induzieren, was das Kontaktieren eines geeigneten Locus mit einem osteogenen chimären Protein einschließt. Geeignete chimäre osteogene Proteine haben eine Domäne, die von einem oder mehreren osteogenen Mitteln stammt, und eine Domäne, die von einem oder mehreren extrazellulären Matrixproteinen stammt. Des weiteren werden Verfahren zum Induzieren der Knochenbildung durch das Kontaktieren des chimären osteogenen Proteins mit einem Implantat an einer geeigneten Stelle in einem lebenden Gewebe eingeschlossen.
- Fig. 1 stellt eine Nukleinsäuresequenz dar, die für ein BMP2B/Kollagen IA-Proteinkonstrukt kodiert.
- Fig. 2 stellt eine Aminosäuresequenz für ein chimäres BMP2B/Kollagen IA Protein dar.
- Fig. 3 stellt einen pMal-Klonierungsvektor, der eine Polylinker-Klonierungsstelle enthält, dar.
- Fig. 4 stellt eine Polylinker-Klonierungsstelle, die in dem pMal-Klonierungsvektor der Fig. 3 enthalten ist, dar.
- Fig. 5 stellt einen pMal-Klonierungsvektor dar, der ein BMP2B/Kollagen IA DNA-Konstrukt enthält.
- Erfindungsgemäße osteogene chimäre Proteine bieten eine integrierte Kombination einer therapeutisch wirkenden Domäne, die mindestens einen oder mehrere therapeutisch aktive Reste und eine extrazelluläre Matrixproteindomäne, die ein oder mehrere EMP-Reste enthalten. Die EMP-Domäne bietet ein integriertes Vehikel zur Verabreichung des therapeutisch wirksamen Restes an einen Zielort. Die zwei Domänen werden kovalent durch eine oder mehrerer Peptidbindungen, die in einer Linkerregion enthalten sind, verbunden. Gemäß der Verwendung in dieser Beschreibung kennzeichnet integriert oder integral Eigenschaften, die aus der kovalenten Assoziierung einer oder mehrerer Domänen des erfindungsgemäßen chimären Proteins resultieren. Die hier offenbarten therapeutisch wirksamen Reste werden typischerweise aus Aminosäuren, die verbunden sind, um Peptide, Proteine, Glycoproteine oder Proteoglycane zu bilden, hergestellt.
- Die inhärenten Eigenschaften der EMPs sind ideal zur Verwendung als Vehikel des therapeutischen Rests. Beispiele geeigneter EMPs sind Kollagen, Elastin, Fibronectin und Fibrin. Fibrilliäre Kollagene (Typ I, II und III) lagern sich in geordneten Polymeren zusammen und aggregieren oft in größeren Bündeln. Typ IV Kollagen verbindet sich in schichtähnliche Netzwerke. Elastinmoleküle bilden Filamente und Schichten, in denen die Elastinmoleküle stark miteinander vernetzt sind und bieten gute Elastizität und eine hohe Reißstärke. Die vernetzten, zufällig verknäulten Strukturen des Fasernetzwerks erlauben ihm, gedehnt zu werden und sich wie ein Gummiband wieder zu verknäulen. Fibronectin ist ein großes Fibrillen formendes Glycoprotein, das in einer seiner Formen aus stark unlöslichen Fibrillen besteht, die miteinander durch Disulfidbindungen vernetzt sind. Fibrin ist ein unlösliches Protein, das durch die proteolytische Aktivität von Thrombin während der normalen Blutverklumpung aus Fibrinogen gebildet wird.
- Die molekulare und makromolekulare Morphologie der oben genannten EMPs verursacht Netzwerke oder Matrizes, die ein Substrat oder ein Gerüst der integralen kovalenten Assoziierung mit dem therapeutisch wirksamen Rest ermöglichen. Die Netzwerke oder Matrizes, die durch die EMP-Domäne gebildet werden, bieten ein besonders gut geeignetes Umfeld für das Einwachsen autologer Zellen, die am Wachstum, der Reparatur und dem Ersetzen vorhandenen Gewebes beteiligt sind. Die integralen therapeutisch wirksamen Reste, die innerhalb der Netzwerke oder Matrizes kovalent gebunden sind, erlauben eine maximale Freisetzung der aktiven Mittel für ihre Ziele, um so die gewünschte Antwort hervorzurufen.
- Implantate, die auf oder von den erfindungsgemäßen chimären Proteinen gebildet werden, ermöglichen die anhaltende Freisetzungswirkung in oder bei einem gewünschten Locus oder einem Zielort. Gegenüber den oben beschriebenen Zusammensetzungen, die im Stand der Technik diskutiert wurden, in denen ein Träger nicht-kovalent an EMP gebunden ist, ist die therapeutisch wirksame Domäne des erfindungsgemäßen chimären Proteins nicht frei, um einzeln zu diffundieren oder auf irgendeine Weise vom Träger forttransportiert zu werden, der es trägt, wenn die Peptidbindungen nicht gespalten werden. Daher bieten chimäre Proteine einen wirksamen Anker für die therapeutische Aktivität, die erlaubt, daß die Aktivität über einen längeren Zeitraum auf eine Zielstelle beschränkt ist. Da die Verabreichung des therapeutisch wirksamen Mittels nicht oft erneuert werden muß, können geringere Mengen des therapeutisch wirksamen Mittels über den therapeutischen Zeitraum verwendet werden. Daher sind einige Vorteile, die durch die erfindungsgemäßen chimären Proteine geboten werden, ein Sinken oder eine Eliminierung der lokalen oder systemischen Nebenwirkungen, weniger Potenzierung oder Reduktion der therapeutischen Wirkung durch chronische Verwendung, und die Minimierung der Anhäufung des Medikaments in Körpergeweben bei einer chronischen Dosierung.
- Die Verwendung der rekombinanten Technologie erlaubt die Herstellung nicht-immunogener chimärer Proteine. Die DNA, die für den therapeutisch wirksamen Rest und der EMP-Rest sollten bevorzugt aus der gleichen Art stammen, wie der Patient, der behandelt wird, um so eine immunogene Reaktion zu verhindern. Wenn der Patient beispielsweise ein Mensch ist, sollte der therapeutisch wirksame Rest wie auch der EMP-Rest vorzugsweise aus menschlicher DNA stammen.
- Osteogene/EMP chimäre Proteine stellen biodegradierbare und biokompatible Mittel zur Induktion der Knochenbildung an einem gewünschten Ort dar. In einer Ausführung wird der BMP-Rest kovalent an EMP gebunden, um ein chimäres Protein zu bilden. Der BMP-Rest induziert die Osteogenese und der extrazelluläre Matrixproteinrest bietet ein integrales Substrat oder Gerüst für den BMP-Rest und die Zellen, die am Wiederaufbau und Wachstum beteiligt sind. Zusammensetzungen, die das chimäre BMP/EMP-Protein enthalten, ermöglichen die wirksame andauernde Freisetzungsverabreichung des BMP-Rests an den gewünschten Zielorten. Das Verfahren zur Herstellung dieser osteogenen Mittel ist effizient, da die Notwendigkeit für besondere zeitverbrauchende Schritte, wie die Reinigung von EMP und dessen Mischung mit dem gereinigten BMP, eliminiert sind. Ein zusätzlicher Vorteil des chimären BMP/EMP Proteins ergibt sich aus der Stabilität, die durch die kovalente Bindung zwischen BMP und EMP hergestellt wird, d. h. daß der BMP-Anteil nicht frei vom EMP wegdiffundieren kann, so daß ein stabileres therapeutisches Mittel zur Verfügung gestellt wird.
- Die Knochenmorphogeneseproteine werden in Klassen eingeteilt, die als BMP-1 bis BMP-9 identifizierbar sind. Ein bevorzugtes osteogenes Protein zur Verwendung bei menschlichen Patienten ist menschliches BMP-2B. Ein chimäres BMP-2B/Kollagen IA Protein ist in Fig. 2 dargestellt. Die Proteinsequenz, die in Fig. 2 dargestellt ist, schließt eine helikale Kollagendomäne ein, die durch die Aminosäuren 1-1057 dargestellt wird und eine reife Form von BMP2B durch die Aminosäuren 1060-1169. Die physikalischen Eigenschaften des chimären Proteins werden teilweise durch die EMP-Komponente bestimmt. Im Fall eines Kollagenrests wird eine konzentrierte Lösung des chimären Proteins eine gelartige Konsistenz haben, die eine einfache Handhabung durch den Arzt erlaubt. Der EMP-Rest dient als Sequestrierungsmittel, um eine schnelle Desorption des BMP-Rests vom gewünschten Ort zu verhindern, und bietet eine verzögerte Freisetzung der BMP-Wirkung. Als Ergebnis daraus verbleibt der BMP-Rest über den notwendigen Zeitraum, um die Knochenbildung zu induzieren, am gewünschten Ort. Der EMP-Rest bietet auch eine Matrix, die den autologen Zellen des Patienten, d. h. Chondrozyten und ähnlichen, die normalerweise an der Osteogenese beteiligt sind, erlaubt, sich darin zusammenzufinden und ein autologes Netzwerk für das Wachstum des neuen Gewebes zu bilden. Die gelartige Konsistenz des chimären Proteins stellt ebenfalls ein nützliches und geeignetes therapeutisches Mittel zur Immobilisierung aktiven BMPs in einem passenden Vehikel oder Implantat zur Darreichung des BMP-Rests an einem Ort dar, an dem Knochenwachstum erwünscht ist.
- Der BMP-Rest und der EMP-Rest werden ggf. durch eine Linkersequenz aus Aminosäuren miteinander verbunden. Beispiele für Linkersequenzen, die verwendet wurden, sind in den Sequenzen, die in den Fig. 1-2 dargestellt und in genaueren Details, die unten beschrieben sind, dargestellt. Linkersequenzen können auf der Grundlage besonderer Eigenschaften gewählt werden, die sie dem chimären Protein geben. So werden zum Beispiel Aminosäuresequenzen wie Ile-Glu-Gly-Arg und Leu-Val-Pro-Arg durch Faktor Xa bzw. Thrombinenzymen gespalten. Das Inkorporieren von Sequenzen, die durch proteolytische Enzyme gespalten werden, in chimären Proteinen ermöglicht die Spaltung an der Linkerstelle nach der Exposition gegenüber dem geeigneten Enzym und der Trennung der zwei Domänen in getrennte Entitäten. Es wird in Erwägung gezogen, daß zahlreiche Linkersequenzen in jedes der chimären Proteine eingebaut werden können.
- In einer weiteren Ausführungsform schließt das chimäre DNA-Konstrukt ein Gen ein, das für ein osteogenes Protein oder ein Fragment davon kodiert, das an ein Gen, das für EMP oder ein Fragment davon kodiert, gebunden ist. Die Gensequenzen verschiedener BMPs sind bekannt, siehe z. B. US-Patente Nr. 4,294,753, 4,761,471, 5,106,748, 5,187,076, 5,141,905, 5,108,922, 5,166,058, 5,116,738 und 5,168,050. Das erfindungsgemäß verwendete BMP-2B-Gen wird durch das Ligieren von Oligonukleotiden, die das BMP-Protein kodieren, synthetisiert. Die Oligonukleotide, die BMP-2B kodieren, werden unter Verwendung eines automatischen DNA- Synthesegeräts (Beckmen Oligo-1000) synthetisiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nukleotidsequenz, die BMP kodiert, für die Expression in E. coli maximiert. Das wird dadurch ausgeführt, indem E. coli Verwendungstabellen verwendet werden, um die Aminosäuresequenzen des BMPs in die am häufigsten von E. coli verwendeten Kodons zu übersetzen. Alternativ dazu kann auch die natürliche DNA, die das BMP kodiert, aus Säugetieren, einschließlich dem Menschen, isoliert, gereinigt und verwendet werden.
- Das BMP-Gen und die das extrazelluläre Matrixprotein kodierende DNA-Sequenz werden durch Standard-Gentechnik- Verfahren, wie in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 1982, beschrieben, kloniert.
- Die der helikalen Region des Kollagen I(a) entsprechende DNA-Sequenz wird aus einer menschlichen Fibroblasten- Zelllinie kloniert. Zwei Funden der Polymerasekettenreaktion werden unter Verwendung von cDNA, die nach Standardverfahren aus AG02261A-Zellen gewonnen wurde, durchgeführt. Das erste Paar der PCR-Primer schließt einen 5'-Primer, der eine XmnI- Linkersequenz und einen 3'-Primer, der an der Nukleotidnummer 1722 die BsmI-Stelle trägt, ein. Das daraus resultierende PCR-Produkt besteht aus der Sequenz von Position 1 bis 1722. Das zweite Primerpaar schließt die BsmI-Stelle an 1722 ein und eine Linkersequenz am 3'-Ende, die eine BglII-Stelle trägt. Die daraus resultierenden PCR-Produkte bestehen aus einer Sequenz von Position 1722 bis 3196. Die gesamte helikale Sequenz wird durch Standardklonierungstechniken zusammengesetzt. Die zwei PCR-Produkte werden miteinander an der BsmI-Stelle ligiert und der zusammengesetzte Klon wird in einen Vektor mit XmnI-BgIII-Stellen oder XmnI-BamHI-Stellen, wie der pMALc2-Vektor, insertiert.
- Um das BMP-2B-Gen zu klonieren, wird die gesamte zelluläre RNA aus menschlichen Osteosarkomzellen (U-20S) durch ein Verfahren, das von Robert E. Farrel Jr. (Academic Press, CA, 1993, S. 68-69) beschrieben wurde, isoliert. Die Integrität der RNA wird durch spektrophotometrische Analyse und Elektrophorese in Agarosegelen verifiziert. Typische Ausbeuten der gesamten RNA sind 50 ug aus einer 1090 mm konfluenten Gewebekulturschale. Die RNA wird verwendet, um cDNA durch reverse Transkription, unter Verwendung des Superscript Pre-amplification Systems von Gibco BRL herzustellen. Die cDNA wird als Matrix für die PCR- Amplifizierung unter Verwendung von stromaufwärts und stromabwärts liegenden Primern, die spezifisch für BMP-2B (GenBank HUMBMP2B accession # M22490) sind, verwendet. Das erhaltene PCR-Produkt besteht aus der BMP-2B-Sequenz von Position 1289-1619. Das PCR-Produkt wird durch Elektrophorese mit Agarosegelen aufgetrennt, mit Gene Clean (BIO 101) gereinigt und in den pMal-c2-Vektor (New England Biolabs) ligiert. Die helikale Domäne der menschlichen Kollagen I(a) Kette wird auf ähnliche Weise kloniert. Die gesamte zelluläre RNA wird jedoch aus einer menschlichen Fibroblasten-Zelllinie (AG02261A menschliche Hautfibroblasten) isoliert.
- Das chimäre BMP/EMP-DNA-Konstrukt wird durch Ligieren eines synthetischen BMP-Gens an eine DNA-Sequenz erhalten, die ein EMP wie Kollagen, Fibrin, Fibronectin, Elastin oder Laminin kodiert. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese besonderen Proteine beschränkt. Fig. 1 stellt ein DNA-Konstrukt dar, das ein BMP-2B/Kollagen IA chimäres Protein kodiert. Die kodierende Sequenz eines EMPs kann stromaufwärts und/oder stromabwärts und in Leseraster mit einer kodierenden Sequenz des BMPs ligiert werden. Die DNA, die ein EMP kodiert, kann ein Teil des Gens oder das gesamte EMP-Gen sein. Außerdem können zwei verschiedene EMPs stromaufwärts und stromabwärts vom BMP ligiert werden.
- Das chimäre BMP-2B/Kollagen IA Protein, das in Fig. 1 dargestellt ist, schließt eine XmnI-Linkersequenz an den Basenpaaren (bp) 1-19 ein, eine helikale Kollagendomäne (bp 20-3190), eine BglII/BamHI-Linkersequenz (bp 3191-3196), eine reife Form des BMP-2Bs (bp 3197-3529) und eine HindIII- Linkersequenz (bp 3530-3535).
- Jede Kombination aus Knochenmorphogeneseprotein- und Matrixproteinsequenzen werden in Erwägung gezogen, einschließlich sich wiederholender Einheiten oder mehrfacher Anordnung jedes Segments in irgendeiner Abfolge. Die Inkorporierung von Fragmenten von sowohl den Matrix- wie auch den Knochenmorphogeneseproteinen ist ebenfalls in Erwägung zu ziehen. Im Fall des Kollagens kann beispielsweise nur die helikale Domäne eingeschlossen sein. Andere Matrixproteine haben definierte Domänen, wie Laminin, das EGF-ähnliche Domänen besitzt. In diesen Fällen können bestimmte Funktionseigenschaften gewählt werden, um die erwünschten Wirkungen zu erreichen. Außerdem kann es nützlich sein, Domänen unterschiedlicher Matrixproteine zu mischen, wie die helikale Region des Kollagens und die Zellanheftungsregionen von Fibronectin. Im Fall der Wachstumshormone wurde gezeigt, daß spezifische Segmente von reifem Protein durch posttranslationale Prozessierung entfernt werden. Chimäre Proteine können so angelegt sein, daß sie nur die reife, biologisch aktive Region einschließen. Im Fall von BMP-2B werden beispielsweise nur die letzten 110 Aminosäuren im aktiven Protein gefunden.
- Die kodierende Sequenz eines EMPs kann stromaufwärts und/oder stromabwärts und im Leseraster mit der kodierenden Sequenz für Decorin ligiert sein. Die DNA, die für das EMP kodiert, kann einen Teil oder ein Fragment des EMPS oder das gesamte EMP kodieren. Die DNA, die für Decorin kodiert, kann gleichermaßen ein Fragment davon sein oder das gesamte Gen. Außerdem können zwei oder mehr verschiedene EMPs stromaufwärts der DNA, die den Decorinrest kodiert, ligiert sein.
- Jedes der oben beschriebenen chimären DNA-Konstrukte kann in einen geeigneten Klonierungsvektor inkorporiert sein. Fig. 3 stellt einen pMal-Klonierungsvektor dar, der eine Polylinker- Klonierungsstelle enthält. Bevorzugte Klonierungsvektoren sind die Plasmide pMal-p2 und pMal-c2 (kommerziell erhältlich von New England Biolabs). Das gewünschte chimäre DNA- Konstrukt wird in eine Polylinkersequenz des Plasmids inkorporiert, die einige nützliche Restriktionsendonukleasestellen enthält, die in Fig. 4 dargestellt sind. Die pMal-p2 Polylinkersequenz hat XmnI, EcoRI, BamHI, Hindlil, XbaI, SalI und PstI Restriktionsendonukleasestellen, die in Fig. 4 dargestellt sind. Die Polylinkersequenz wird mit einer passenden Restriktionsendonuklease verdaut und das chimäre Konstrukt wird durch Ligieren an die DNA-Sequenzen des Plasmids in den Klonierungsvektor inkorporiert. Das chimäre DNA-Konstrukt kann mit dem Plasmid verbunden werden, indem die Enden des DNA-Konstrukts und des Plasmids mit der gleichen Restriktionsendonuklease verdaut werden, um "klebrige Enden" zu erzeugen, die 5-Phosphat- und 3'-Hydroxygruppen haben, und die dem DNA-Konstrukt erlauben, sich an den Klonierungsvektor anzulagern. Lücken zwischen dem insertierten DNA-Konstrukt und dem Plasmid werden dann mit der DNA-Ligase versiegelt. Weitere Techniken zum Inkorporieren des DNA-Konstrukts in Plasmid-DNA schließen Blunt-end-Ligation, Poly(dA.dT)Endtechniken ein und die Verwendung von chemisch synthetisierten Linkem. Ein alternatives Verfahren zur Einführung des chimären DNA- Konstrukts in einen Klonierungsvektor besteht darin, die DNA, die das extrazelluläre Matrixprotein kodiert, in einen Klonierungsvektor zu inkorporieren, der bereits ein Gen enthält, das eine therapeutisch wirksame Gruppe kodiert.
- Die Klonierungsstellen in der oben beschriebenen Polylinkerstelle erlauben es der cDNA für das chimäre Kollagen IA/BMP-2B Protein, das in Fig. 1 dargestellt ist, zwischen der XmnI und der Hindlil Stelle insertiert zu werden.
- Plasmide, die das chimäre DNA-Konstrukt enthalten, werden durch Standardtechniken wie Gelelektrophorese identifiziert. Verfahren und Materialien zur Herstellung rekombinanter Vektoren, der Transformation von Wirtszellen mit den Vektoren und der Expression von Polypeptiden durch Wirtszellen sind in Maniatis et a., Molecular Cloning A: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, beschrieben. Im allgemeinen können prokaryotische und eukaryotische Wirtszellen mit den rekombinanten DNA-Plasmiden transformiert werden. Transformierte Wirtszellen können durch phenotypische Selektionsgene des Klonierungsvektors lokalisiert werden, die Resistenz gegenüber einem bestimmten Antibiotikum bieten, wenn die Wirtszellen in einem Kulturmedium, das dieses Antibiotikum enthält, herangezogen werden.
- Transformierte Wirtszellen werden isoliert und kultiviert, um die Expression des chimären Proteins zu ermöglichen. Das chimäre Protein kann dann aus dem Kulturmedium isoliert werden und durch zahlreiche Verfahren wie Dialyse, Dichtegradientenzentrifugation, Flüssigkeitssäulen- Chromatographie, isoelektrische Präzipitation, Lösungsmittelfraktionierung und Elektrophorese gereinigt werden. Die Reinigung des chimären Proteins durch Affinitätschromatographie wird jedoch bevorzugt, wobei das chimäre Protein durch Ligieren an ein bindendes Protein und das Kontaktieren mit einem Liganden oder Substrat, zu dem das bindende Protein eine besondere Affinität hat, gereinigt wird.
- Um eine effizientere Expression eukaryotischer Gene von Säugetieren oder Menschen in Bakterien (Prokaryoten) zu erreichen, sollte das Säuger- oder Menschengen unter Kontrolle eines bakteriellen Promoters lokalisiert sein. Um das chimäre Protein zu erhalten, wird ein Proteinfusions- und -reinigungssystem angewandt. Bevorzugt kann jedes der oben beschriebenen chimären DNA-Konstrukte in einen pMal-Vektor an einer Stelle der Polylinkersequenz des Vektors kloniert werden. Im Ergebnis ist das chimäre DNA-Konstrukt arbeitsfähig mit dem malE-Gen des pMal-Vektors fusioniert. Das malE-Gen kodiert das Maltosebindungsprotein (MBP). Fig. 5 stellt einen pMal-Klonierungsvektor dar, der ein BMP/Kollagen-DNA-Konstrukt enthält. Eine Spacersequenz, die für 10 Asparaginreste kodiert, ist zwischen der malE-Sequenz und der Polylinkersequenz lokalisiert. Diese Spacersequenz isoliert MBP vom Protein von Interesse. Der pMal-Vektor, der eines der chimären DNA-Konstrukte enthält, das an das malE-Gen fusioniert ist, wird in E. coli transformiert. Diese Technik verwendet den PtaC-Promoter des malE-Gens.
- Die E. coli werden in einem Medium kultiviert, das die Bakterien dazu anregt, das Maltosebindungsprotein, das an das chimäre Protein fusioniert ist, zu produzieren. Das MBP enthält 26 Aminosäuren einer N-terminalen Signalsequenz, die das MBP chimäre Protein durch die Zytoplasmamembran von E. coli leitet. Das Protein kann dann aus dem Periplasma gereinigt werden. Alternativ dazu kann der pMal-c2- Klonierungsvektor mit diesem Proteinfusions- und -reinigungssystem verwendet werden. Der pMal-c2-Vektor enthält eine präzise Deletion der malE-Signalsequenz, die zur zytoplasmatischen Expression des Fusionsproteins führt. Ein Rohzellextrakt, der das Fusionsprotein enthält, wird hergestellt und über eine Amyloseharzsäule gegossen. Da MBP eine Affinität für die Amylose hat, bindet es an das Harz. Alternativ dazu kann die Säule jedes Substrat einschließen, für das MBP eine spezifische Affinität hat. Nicht erwünschte Proteine, die in dem Rohextrakt vorhanden sind, werden durch die Säule hindurchgewaschen. Das MBP, das an das chimäre Protein fusioniert ist, wird mit einem neuralen Puffer, der Maltose enthält, oder einer anderen verdünnten Lösung eines desorbierenden Mittels zum Entfernen des Hybridpolypeptids eluiert. Das gereinigte MBP chimäre Protein wird mit einer Protease, wie Faktor Xa-Protease, gespalten, um das MBP vom chimären Protein abzuspalten. Das pMal-p2-Plasmid hat eine Sequenz, die die Erkennungsstelle der Protease Faktor Xa kodiert, die nach der Aminosäuresequenz Isoleucin- Glutaminsäure-Glycin-Arginin der Polylinkersequenz schneidet.
- Das chimäre Protein wird dann vom abgespaltenen MBP getrennt, indem die Mischung über eine Amylosesäule geschickt wird. Eine alternative Methode zum Trennen des MBPs vom chimären Protein ist durch Ionenaustauschchromatographie. Dieses System ergibt bis zu 100 mg des MBP chimären Protein je Liter der Kultur. Siehe Riggs, P., in Ausebel, F. M., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. (Hrsg), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 19 (16.6.116.6.10) (1990), Green Associates/Wiley Interscience, New York, New England Biolabs (cat # 800-65S 9pMALc2) pMal protein fusion and purification system. (Siehe auch europäisches Patent Nr. 286 239, das ein ähnliches Verfahren zur Herstellung und Reinigung eines Proteins wie Kollagen offenbart.)
- Es können andere Proteinfusions- und -reinigungssysteme zur Herstellung chimärer Proteine benutzt werden. Prokaryoten wie E. coli sind die bevorzugten Wirtszellen zur Expression des chimären Proteins. Systeme, die eukaryotische Wirtszelllinien benutzen, sind jedoch ebenfalls akzeptabel, wie Hefe-, Menschen-, Maus-, Ratten-, Hamster-, Affen-, Amphibien-, Insekten-, Algen- und Pflanzenzelllinien. Akzeptable Zelllinien sind z. B. HeLa (Menschenepithel), 3T3 (Mäusefibroblasten), CHO (Chinesischer Hamster Ovare) und SP2 (Mausplasmazellen). Die besonderen Wirtszellen, die ausgewählt werden, sollten mit dem entsprechenden ausgewählten Klonierungsvektor kompatibel sein.
- Ein weiteres akzeptables Protein-Expressionssystem ist das Baculovirus-Expressionssystem, das von Invitrogen in San Diego, Kalifornien hergestellt wird. Baculoviren bilden auffällige Kristalleinschlußkörperchen in den Kernen der Zellen, die sie infizieren. Jeder kristalline Einschlußkörper besteht aus zahlreichen Viruspartikeln, die in ein Protein, das Polyhedrin heißt, eingehüllt sind. Im Baculovirus- Expressionssystem wird das natürliche Gen, das Polyhedrin kodiert, durch ein DNA-Konstrukt substituiert, das ein Protein oder Peptid mit einer gewünschten Aktivität kodiert. Das Virus stellt dann große Menge Proteine, die durch das fremde DNA-Konstrukt kodiert sind, her. Der bevorzugte Klonierungsvektor zur Verwendung in diesem System ist pBlueBac III (zu erhalten von Invitrogen in San Diego, Kalifornien). Das Baculovirus-System verwendet das Autograph californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) regulierten Polyhedrinpromoter, um die Expression fremder Gene zu steuern. AcMNPV wird aus einer Motte isoliert, die als kalifornischer Spanner (California looper) bezeichnet wird. Das chimäre Gen, d. h. das DNA-Konstrukt, das das chimäre Protein kodiert, wird unmittelbar stromabwärts des Baculovirus Polyhedrinpromoters im pBlueBac III Vektor insertiert.
- Der pBlueBac III Transfervektor enthält ein B-Galactosidase- Reportergen, das die Identifizierung des rekombinanten Virus erlaubt. Das B-Galactosidase-Gen wird durch den Baculovirus- ETL-Promoter (PETL) gesteuert, der in entgegengesetzter Orientierung des Polyhedrinpromoters (PpH) und der multiplen Klonierungsstelle des Vektors positioniert ist. Deswegen exprimiert das rekombinante Virus sowohl B-Galactosidase und das chimäre Gen.
- Spodoptera frugeperda (Sf9) Insektenzellen werden dann mit viraler DNA vom Wildtyp und dem pBlueBac III Vektor, der das chimäre Gen enthält, co-transfiziert. Die Rekombinationssequenzen im pBlueBac III Vektor steuern die Integration des Vektors in das Genom des Wildtyp Baculovirus. Eine homologe Rekombination tritt auf und führt zum Ersetzen des nativen Polyhedringens des Baculovirus durch das DNA- Konstrukt, das das chimäre Protein kodiert. Das Wildtyp Baculovirus, das die fremde DNA nicht enthält, exprimiert das Polyhedrinprotein in den Kernen der infizierten Insektenzellen. Die Rekombinanten stellen jedoch kein Polyhedrinprotein her und bilden keine viralen Einschlußkörperchen. Statt dessen stellen die Rekombinanten das chimäre Protein her.
- In diesem Expressionssystem alternativ verwendbare Insekten- Wirtszellen sind die Sf21 Zelllinie, die von Spodoptera frugeperda stammt und High Five Zelllinien, die von Trichoplusia ni stammen.
- Weitere akzeptable Klonierungsvektoren schließen Phagen, Cosmide oder artifizielle Chromosomen ein. So ist beispielsweise bakteriophage Lambda ein nützlicher Klonierungsvektor. Dieser Phage kann fremde DNA-Stücke bis zu ungefähr 20.000 Basenpaaren Länge akzeptieren. Das Lambda- Phagengenom ist ein lineares doppelsträngiges DNA-Molekül mit einzelsträngigen komplementären (kohäsiven) Enden, die miteinander hybridisieren können, wenn sie in einer infizierten Wirtszelle sind. Die Lambda-DNA wird mit einer Restriktionsendonuklease geschnitten und die fremde DNA, z. B. die zu klonierende DNA, wird in die Phagen-DNA-Fragmente ligiert. Das erhaltene rekombinante Molekül wird dann in infektiöse Phagenpartikel verpackt. Wirtszellen werden mit den Phagenpartikeln, die die rekombinante DNA enthalten, infiziert. Die Phagen-DNA repliziert sich in der Wirtszelle, um viele Kopien der gewünschten DNA-Sequenz herzustellen.
- Cosmide sind Hybrid-Plasmid/Bakteriophagenvektoren, die zur Klonierung von DNA-Fragmenten von ungefähr 40.000 Basenpaaren verwendet werden. Cosmide sind Plasmide, die eine oder mehrere DNA-Sequenzen, die vom Bakteriophagen Lambda stammen, die "cos"-Stellen heißen, zur Verpackung von Lambda-DNA in infektiöse Phagenpartikel enthalten. Zwei Cosmide werden an die zu klonierende DNA ligiert. Das erhaltene Molekül wird in infektiöse Lambda Phagenpartikel verpackt und in bakterielle Wirtszellen transfiziert. Sobald die Cosmide innerhalb der Wirtszelle sind, verhalten sie sich wie Plasmide und multiplizieren sich unter der Kontrolle eines Plasmid- Replikationsursprungs. Der Replikationsursprung ist eine DNA- Sequenz, die einem Plasmid erlaubt, innerhalb einer Wirtszelle vermehrt zu werden.
- Artifizielle Hefe-Chromosomenvektoren sind dem Plasmid ähnlich, erlauben aber die Inkorporierung von viel größeren DNA-Sequenzen von ungefähr 400.000 Basenpaaren. Die künstlichen Hefechromosomen enthalten Sequenzen zur Replikation in Hefe. Das artifizielle Hefechromosom, das die zu klonierende DNA enthält, wird in Hefezellen transformiert, wo es sich repliziert und dabei viele Kopien der gewünschten DNA-Sequenz herstellt. Wenn Phagen, Cosmide oder künstliche Hefechromosomen als Klonierungsvektoren verwendet werden, kann die Expression des chimären Proteins durch Kultivieren der Wirtszellen, die mit dem Klonierungsvektor transfiziert oder transformiert worden sind, in einem geeigneten Kulturmedium erhalten werden.
- Hier offenbarte chimäre Proteine sind für die Behandlung von Säugetieren oder anderen Tieren gedacht. Die oben beschriebenen therapeutisch aktiven Reste, genauer gesagt die osteogenen Mittel wie BMPs und/oder Fragmente davon, werden alle so betrachtet, daß sie von regulären Regulationsfaktoren stammen oder diese sind. Die chimären Proteine und DNA- Konstrukte, die eine Domäne, die von einem oder mehreren zellulären Regulationsfaktoren stammen, inkorporieren, können zur therapeutischen Behandlung in vivo, zur Forschung in vitro oder für allgemeine diagnostische Zwecke verwendet werden.
- Wenn sie in vivo verwendet werden, sollten Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen chimären Proteine enthalten, in direktem Kontakt mit lebensfähigem Gewebte, einschließlich Knochen, gebracht werden, um Wachstum, Reparatur und/oder Ersetzen dieser Gewebe zu induzieren oder zu steigern. Das kann durch die direkte Anwendung des chimären Proteins an einem Zielort während eines chirurgischen Eingriffs geschehen. Minimal invasive Techniken wie Endoskopie, die verwendet werden, um ein chimäres Protein an einem gewünschten Ort anzuwenden, finden Berücksichtigung.
- Zusammensetzungen, die die hier offenbarten chimären Proteine enthalten, können nur aus einem oder auch mehreren chimären Proteinen bestehen und können außerdem eines oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Adjuvanzien inkorporieren.
- In einer anderen Ausführungsform kann jedes der oben beschriebenen chimären Proteine mit einem Implantat kontaktiert, darauf adhäriert oder auf eine andere Weise darin inkorporiert werden, wie als Arzneimittelabgabemittel oder als prothetisches Mittel. Chimäre Proteine können durch Liposomen oder andere membranbildende Materialien mikroverkapselt oder makroverkapselt sein, wie durch Alginatsäurederivate vor der Implantation, und dann in Form eines taschenförmigen Implantats implantiert werden. Das chimäre Protein kann in Strukturen in Form von Kugeln, Aggregaten aus einem kernbildenden Material, die in ein Kontinuum aus einem Wandmaterial oder kapillären Designs mikroverkapselt sein. Mikroverkapselungstechniken sind im Stand der Technik gut bekannt und beschrieben in der Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Bd. 9, S. 724 et seq. (1980). Chimäre Proteine können auch auf medizinisch nützliche Materialien, wie Netzen, Tupfer, Filze (felts), Dressings geschichtet oder darin inkorporiert werden, oder auf Prothesenmittel, wie Verbindungsbolzen (rod pins), Knochenplatten, künstliche Gelenke, künstliche Gliedmaßen oder Knochenverbesserungsimplantate. Die Implantate können teilweise auf biokompatiblen Materialien wie Glas, Metall Keramik, Calciumphosphat oder Calciumcarbonat basierenden Materialien bestehen. Implantate mit biokompatiblen Biomaterialien sind im Stand der Technik wohl bekannt und sind alle zur Verwendung geeignet. Implantatbiomaterialien, die aus natürlichen Quellen wie Proteinfasern, Polysacchariden und behandelten aus der Natur stammenden Geweben stammen, werden in der Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Bd. 2, S. 267 et seq. (1989) beschrieben. Synthetische biokompatible Polymere sind im Stand der Technik wohl bekannt und sind ebenfalls geeignete Implantatmaterialien. Beispiele für geeignete synthetische Polymere schließen Urethane, Olefine, Terephthalate, Acrylate, Polyester und ähnliches ein. Weitere akzeptable Implantatmaterialien sind biodegradierbare Hydrogele oder Aggregate aus dicht gepackten Partikeln, wie Polymethylmethacrylat-Kügelchen mit einem polymerisierten Hydroxyethylmethacrylat-Überzug. Siehe Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Bd. 2, S. 267 et seq. (1989).
- Das chimäre Protein stellt einen nützlichen Weg zum Immobolisieren oder Beschichten eines regulatorischen Zellfaktors an einem pharmazeutisch akzeptablen Vehikel zur Verabreichung des regulatorischen Zellfaktor an gewünschte Orte in lebenden Geweben dar. Geeignete Vehikel schließen solche ein, die aus bioabsorbierbaren Polymeren, biokompatiblen nicht-absorbierenden Polymeren, Lactoner Kitt und Pariser Gips gemacht sind. Beispiele für geeignete bioabsorbierbare und biokompatible Polymere schließen Homopolymere, Copolymere und Gemische aus Hydroxysäuren wie Lactide und Glycolide ein, weitere absorbierbare Polymere, die allein oder in Kombination mit Hydroxysäuren verwendet werden können, schließen Dioxanone, Carbonate wie Trimethylencarbonat, Lactone wie Caprolacton, Polyoxyalkylene und Oxylate ein. Siehe Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Bd. 2, S. 230 et seq. (1989).
- Diese Vehikel können in Form von Kügelchen, Partikeln, Kitt, Überzügen oder Schichtvehikeln vorliegen. Diffusionssysteme, in denen der Kern des chimären Proteins von einer porösen Membranschicht umgeben ist, sind andere akzeptable Vehikel. Die folgenden Beispiele sollten als Darstellung einiger hier offenbarter Ausführungen verstanden werden, sollten aber nicht als die Erfindungsoffenbarung einschränkend betrachtet werden.
- Klonierung von BMP-2B/Kollagen IA DNA-Segmentkonstrukten
- Erhalten von PCR-Produkten für BMP-2B und Kollagen I(a): Das chimäre Gen, das das BMP-2B/Kollagen I(a) Fusionsprotein kodiert, wird aus PCR-Produkten zusammengebaut. Die PCR- Primer sind so gefertigt, daß sie an den 5'- und 3'-Enden Restriktionsstellen zur Verfügung stellen, die spätere Ligationsschritte erleichtern. Die 5'- und 3'-Enden des BMP-2B PCR-Produkts enthalten BamHI bzw. Hindill Restriktionsstellen. Die 5'- und 3'-Enden des Kollagen I(a) PCR-Produkts enthalten XmnI bzw. BglII Restriktionsstellen. Die Amplifizierung wird auf Matrix cDNA durchgeführt, die aus gesamter zellulärer RNA unter Verwendung von Standardverfahren synthetisiert wurde. Die PCR-Reaktionen für BMP-2B und Kollagen I(a) verwenden cDNA, die aus U-20S bzw. AG02261A Zelllinien hergestellt wurden. Nach der Amplifizierung und Reinigung werden die PCR-Produkte in PCR II Vektoren ligiert. Positive Klone werden durch das Durchmustern von Plasmiden mit dem korrekten Molekulargewicht identifiziert. Die Klone werden durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung von Standardverfahren geprüft. Das BMP-2B PCR- Produkt wird aus PCRII durch Restriktionsverdauung mit BamHI und Hindlil ausgeschnitten und das Kollagen I(a) Segment wurde aus dem PCRII unter Verwendung von XmnI und BglII herausgeschnitten. Die Restriktionsverdauungsumsetzungen werden durch Agarosegelelektrophorese aufgelöst und die DNA- Fragmente mit den BMP-2B und Kollagen I(a) Sequenzen werden mit Gene clean (BIO 101) gereinigt.
- Ligation von BMP-2B und Kollagen I(a) Segmenten in den pMal-c2-Expressionsvektor: Der pMal-c2-Vektor wird mit BamHI und Hind3 behandelt, durch Agarosegelelektrophorese aufgelöst und durch Standardverfahren gereinigt. Das BMP-2B Segment mit den passenden BamHI und Hind3 Restriktionsstellen an den 5'- und 3'-Enden wird in den pMal-c2 ligiert und Transformanten werden durch Standardtechniken auf eine Insertion hin durchmustert. Positive Klone werden durch DNA-Sequenzierung geprüft und als pMal-c2 BMP bezeichnet. Zur Beendigung der Konstruktion wird der pMal-c2-BMP mit XmnI und BamHI verdaut und das Kollagen I(a) Segment, das mit XmnI und BgIII verdaut wird, wird in diese Stellen durch Standardverfahren ligiert (BamHI und Bglil erzeugen kompatible Enden). Positive Klone werden durch DNA-Sequenzierung geprüft und als pMal-CB bezeichnet. Siehe Fig. 5.
- Das Expressionsplasmid pMal-CB (Kollagen-BMP2B Chimäre) wird unter Verwendung von Standardtechniken zur Transformierung von E. coli HB 101 verwendet. Um das Protein zu exprimieren, wird eine 50 ml Kultur E. coli, die einen der Expressionsvektoren beinhaltet, in 1 l LB-Medium inokuliert und unter Schütteln bei 37ºC inkubiert. Wenn die A600 0,5 ± 0,1 beträgt, werden 0,1 M IPT6 bis zu einer finalen Konzentration von 1,5-15 mM hinzugegeben. Die Kultur wird bei 37ºC belassen, bis die A600 1,3 bis 1,8 beträgt und die E. coli durch Zentrifugieren bei 4.000 xg geerntet werden. Die Zellpellets werden in 7,5 ml 20 mM Tris·HCl pH 7,5, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (nachstehend als "Säulenpuffer" bezeichnet) resuspendiert und in einem Trockeneis/Ethanolbad gefroren. Die gefrorenen Zellpellets werden bei 4ºC aufgetaut, dann auf Eis sonifiziert, bis die Zellen zerstört sind. Zelltrümmer werden durch Zentrifugieren bei 9.000 xg für 30 Minuten bei 4ºC entfernt. Die Überstandsfraktion enthält das rohe E. coli Zelllysat, das auf die Proteinherstellung mittels SDS-PAGE untersucht wird. Die rekombinanten Proteinprodukte, die aus dem pMal-Vektor hergestellt werden, sind ein Fusionsprotein mit MBP (Maltosebindungsprotein). Das MBP-Segment wird eingeschlossen, um eine Einzelschrittreinigung des Proteins zu erreichen.
- Das Rohlysat wird über eine Amylosesäule, die je ml Harz 3 mg rekombinantes Protein (erwartete Ausbeute) enthält, geschickt. Die Säule wird mit 8 Volumina des Säulenpuffers gewaschen und der Säulendurchlauf wird wieder auf die Säule aufgetragen. Weitere 8 Volumina des Säulenpuffers werden verwendet, um die Säule zu waschen. Das Fusionsprotein wird von der Säule unter Verwendung des Säulenpuffer, der 10 mM Maltose enthält, eluiert. Fraktionen, die das rekombinante chimäre Protein enthalten, werden durch den BCA-Proteintest (Pierce) identifiziert und durch SDS-PAGE überprüft. Die das Protein enthaltenden Fraktionen werden zusammengefügt.
- Das MBP-Segment des gereinigten Proteins wird von der Kollagen-Wachstumsfaktor-Chimäre durch Behandlung mit Faktor Xa (New England Biolabs) für 24 Stunden bei Raumtemperatur abgespalten. Die Kollagen-Wachstumsfaktor-Chimäre wird vom MBP-Segment durch Chromatographie über eine Amylosesäule getrennt. Der Säulendurchfluß enthält die Kollagen- Wachstumsfaktor-Chimäre, die durch SDS-PAGE analysiert wird. Die typische Ausbeute des gereinigten Proteins reicht von 10-50 mg/l der E. coli Kultur.
- Eine nützliche Alternative zum E. coli Expressionssystem ist Baculovirus. Das Gen für die Kollagen-Knochenmorphogenese- Proteinchimären wird modifiziert, um einen ATG-Start-Kodon am 5'-Ende und ein TAA-Stop-Kodon am 3-Ende einzuschließen. Die Transkriptionseinheit wird in den Baculovirus Transfervektor pBlueBac III (Invitrogen) ligiert. Der erhaltene Transfervektor wird durch DNA-Sequenzierung überprüft. Das chimäre Kollagen-Knochenmorphogenese-Proteingen wird in das Baculovirusgenom (AcMNPV) durch Standard in vivo Rekombinationsverfahren transferiert. Der pBlueBac III Transfervektor, der das Kollagen-Knochenmorphogenese- Proteinchimären enthält, wird in Sf9-Zellen durch Standardverfahren co-transfiziert. Rekombinante virale Plaques, die blau sind, werden durch mehrere Runden der Reinfektion selektioniert und isoliert. Das gereinigte rekombinante Baculovirus wird durch DNA-Sequenzierung überprüft. Ein rekombinantes Virus, das das Kollagen- Knochenmorphogenese-Proteinchimären enthält, wird zur Infektion von Suspensionskulturen von Sf9-Zellen verwendet, und die optimale Proteinexpression wird nach 48-72 Stunden Postinfektion bestimmt. Das Proteinprodukt wird aus dem Kulturmedium gewonnen und mittels SDS-PAGE analysiert.
- Die folgenden Ansprüche geben zusätzliche Ausführungsformen der Erfindung zu den oben im Detail beschriebenen an.
Claims (19)
1. Chimäres DNA-Konstrukt, das eine Domäne umfaßt, die von
einer DNA-Sequenz stammt, die ein
Knochenmorphogeneseprotein oder ein Fragment davon
kodiert, und eine Domäne, die von einer DNA-Sequenz
stammt, die ein extrazelluläres Matrixprotein kodiert,
wobei das durch das chimäre DNA-Konstrukt kodierte
Protein osteogene Wirkung hat.
2. Chimäres DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 1, wobei das
extrazelluläre Matrixprotein aus der Gruppe, die aus
Kollagen, Laminin, Fibronectin, Elastin und Fibrin
besteht, ausgewählt ist.
3. DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das
BMP-Protein BMP-2B umfaßt.
4. Klonierungsvektor, der ein DNA-Konstrukt gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 3 umfaßt.
5. Klonierungsvektor gemäß Anspruch 4, wobei der
Klonierungsvektor aus der Gruppe, die aus Plasmiden,
Phagen, Cosmiden und artifiziellen Chromosomen besteht,
ausgewählt ist.
6. Klonierungsvektor gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei der
Klonierungsvektor pMal-p2 oder pMal-c2 ist.
7. Mit einem Klonierungsvektor gemäß einem der Ansprüche 4
bis 6 transformierte Zelle.
8. Zelle gemäß Anspruch 7, wobei die Zelle aus der aus
E. coli, HeLa, 3T3, CHO, SP2, Sf9, Sf21 und High Five
bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
9. Osteogenes chimäres Protein, das eine Domäne, die von
einem Knochenmorphogeneseprotein oder einem Fragment
davon stammt, und eine Domäne, die von einem
extrazellulären Matrixprotein stammt, umfaßt.
10. Chimäres Protein gemäß Anspruch 9, wobei das
extrazelluläre Matrixprotein aus der Gruppe, die aus
Kollagen, Fibronectin, Elastin, Laminin und Fibrin
besteht, ausgewählt ist.
11. Verfahren zur Herstellung eines chimären
Knochenmorphogeneseproteins/extrazellulären
Matrixproteins, das umfaßt: Transformieren einer Zelle
mit dem Vektor gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6;
Kultivieren der Zelle in einem geeigneten Kulturmedium;
und Gewinnen des chimären
Knochenmorphogeneseproteins/extrazellulären
Matrixproteins aus dem Kulturmedium.
12. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein osteogenes
chimäres Protein umfaßt, das eine Domäne, die von einem
Knochenmorphogeneseprotein oder einem Fragment davon
stammt, und eine Domäne, die von einem extrazellulären
Matrixprotein stammt sowie ein pharmazeutisch
akzeptables Vehikel umfaßt.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei
das extrazelluläre Matrixprotein aus der Gruppe, die aus
Kollagen, Fibronectin, Elastin und Fibrin besteht,
ausgewählt ist.
14. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 12 oder
13, wobei das Vehikel ein Material, das aus der Gruppe,
die aus bioabsorbierbaren Polymeren, biokompatiblen
nicht-absorbierbaren Polymeren, Lactoner Kitt (lactoner
putty) und Pariser Gips besteht, umfaßt.
15. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, wobei
das Material aus der Gruppe, die aus Lactid, Glycolid,
Trimethylencarbonat, Dioxanon, Caprolacton,
Polymethylmethacrylat und Hydroxyethylmethacrylat
besteht, ausgewählt ist.
16. Verfahren zur Herstellung eines DNA-Konstrukts gemäß
Anspruch 1, umfassend:
Zurverfügungstellen einer DNA, die ein
Knochenmorphogeneseprotein oder ein Fragment davon
kodiert;
Zurverfügungstellen einer DNA, die ein extrazelluläres
Matrixprotein oder ein Fragment davon kodiert; und
funktionsfähiges Verbinden der DNA, die das
Knochenmorphogeneseprotein oder Fragment davon kodiert,
mit der DNA, die das extrazelluläre Matrixprotein oder
Fragment davon kodiert, um ein chimäres DNA-Konstrukt zu
bilden.
17. Verwendung eines chimären Proteins gemäß einem der
Ansprüche 9 oder 10 oder einer pharmazeutischen
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15 zur
Herstellung eines Medikaments zur Krankheitsprävention
oder -behandlung.
18. Verwendung eines chimären Proteins gemäß Anspruch 9 oder
10 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß
einem der Ansprüche 12 bis 15 zur Herstellung eines
osteogenen Mittels.
19. Verwendung eines chimären Proteins gemäß Anspruch 9 oder
10 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß
einem der Ansprüche 12 bis 15 zur Herstellung eines
Medikaments zum Induzieren der Knochen- und/oder
Knorpelgewebebildung.
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