CN103270049B - 用于结合有机靶的蜘蛛丝融合蛋白结构 - Google Patents

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Abstract

提供了能够与有机靶选择性相互作用的蛋白结构。该蛋白结构是包含能够与该有机靶选择性相互作用的重组融合蛋白作为重复结构单元的聚合物。该融合蛋白包含部分B、REP和CT、和任选的NT。B是多于30个氨基酸残基的非拖丝蛋白部分，其提供与该有机靶选择性相互作用的能力。REP是70至300个氨基酸残基的部分，并衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段。CT是70至120个氨基酸残基的部分，并衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段。NT是100至160个氨基酸残基的任选的部分，并衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段。该融合蛋白和其蛋白结构可用作亲和性介质和细胞支架材料。

Description

用于结合有机靶的蜘蛛丝融合蛋白结构
发明的技术领域
本发明涉及重组融合蛋白的领域，更具体地涉及包含衍生自蜘蛛丝蛋白(拖丝蛋白)的部分的融合蛋白。本发明提供用于提供为包含重组融合蛋白的聚合物的蛋白结构的方法，所述重组融合蛋白包含衍生自拖丝蛋白的部分。还提供了用于结合有机靶的新颖蛋白结构。
发明背景
在应用蛋白化学中，一个常见的问题是如何向相关的活性位点配制或呈现生物活性肽或蛋白，所述活性位点通常是有机靶，诸如核酸、蛋白、蛋白复合体、蛋白和/或脂质和/或碳水化合物和/或核酸的复合体。最简单的解决方案是仅仅提供生物活性肽或蛋白的水溶液。然而，许多应用的确要求一些进一步的手段来实现期望的目标。例如，可将肽/蛋白缔合于脂质混合物或化学地固定于支持结构。
用于固定于支持结构的肽/蛋白的应用包括制备和分析性分离程序诸如生物工艺、层析法、细胞捕获和培养、主动过滤器（active filters）和诊断学。基于胞外基质蛋白例如胶原的结构公开在EP704532和EP985732中。
还已经建议在支持结构中使用蜘蛛丝蛋白。蜘蛛丝是天然的高性能聚合物，由于强度和弹性的组合而获得了非同寻常的韧性和延伸性。蜘蛛具有多达七个不同的腺，这些腺产生具有不同机械性质和功能的多种丝类型。由大壶状腺产生的拖丝(dragline silk)是最坚韧的纤维。它由两种主要的多肽组成，大多被称为大壶状腺拖丝蛋白（spidroin）(MaSp)1和2，但在例如，在十字园蛛(Araneus diadematus)中被称为ADF-3和ADF-4。这些蛋白质具有200-720kDa范围内的分子量。蜘蛛拖丝蛋白质或MaSp具有分成三部分的组成：无重复的N-端结构域、由许多重复的聚Ala/Gly区段构成的中心重复区域和无重复的C-端结构域。通常认为重复区域在丝纤维中形成分子间接触，但不太清楚末端结构域的准确功能。还认为与纤维形成相联系地，重复区域经历从无规卷曲和α-螺旋构象到β-折叠结构的结构转化。拖丝蛋白的C端区域在蜘蛛种类和丝类型之间通常是保守的。
WO07/078239和Stark,M.等人,Biomacromolecules8:1695-1701,(2007)公开了由具有高的Ala和Gly含量的重复片段和蛋白质的C端片段组成的微型蜘蛛丝蛋白，以及包含蜘蛛丝蛋白的可溶性融合蛋白。在蜘蛛丝蛋白从其融合配体释放后，自然地获得蜘蛛丝蛋白的纤维。
Rising,A.等人,CMLS68(2):169-184(2010)综述了在产生蜘蛛丝蛋白方面的进展。
US2009/0263430公开了酶β-半乳糖苷酶与微型蜘蛛丝蛋白的膜的化学偶联。然而，化学偶联可能要求对蛋白稳定性和/或功能不利的条件。包含衍生自蜘蛛丝蛋白的重复区的区段的多个重复段的蛋白已经被设计以包括RGD细胞结合区段(Bini,E等人,Biomacromolecules7:3139-3145(2006))和/或R5肽(Wong Po Foo,C等人,Proc Natl AcadSci103(25):9428-9433(2006))或参与矿化作用（mineralization）的其他蛋白区段(Huang,J等人,Biomaterials28:2358-2367(2007)；WO2006/076711)。在这些现有技术文献中，通过在变性的有机溶剂六氟异丙醇(HFIP)中增溶融合蛋白和干燥来形成膜。
US2005/261479A1公开了用于纯化具有亲和性标签的重组丝蛋白的方法，包括从复杂混合物中磁亲和性分离单独的丝蛋白，而不形成丝蛋白纤维或其他聚合物结构。
已知的支持结构和相关的技术在以下方面具有某些缺陷，例如经济性、效率、稳定性、再生能力、生物活性和生物相容性。
发明概述
本发明的一个目的是提供能够与有机靶选择性相互作用的新颖蛋白结构。
本发明的另一个目的是提供能够与有机靶选择性相互作用的蛋白结构，其中所述结构的形成不使用可能对蛋白的二级结构或活性具有不可预测的作用和/或保持在蛋白结构中的强溶剂。
本发明的一个目的是提供能够与有机靶选择性相互作用的稳定蛋白结构，该蛋白结构在使用后可容易地再生，例如通过化学处理。
本发明的另一个目的是提供稳定蛋白结构，其是生物相容的，并适于细胞培养和作为植入物。
本发明的又另一个目的是提供具有高密度的能够与有机靶选择性相互作用的均匀间隔的官能团的蛋白结构。
本发明的另一个目的是提供在+4℃或在室温储存数月后保持其选择性结合能力的蛋白结构。
本发明的又一个目的是提供可高压灭菌的蛋白结构，即，在灭菌热处理后保持其选择性结合能力。
在第一个方面，本发明提供了以下实施方案：
A1.一种蛋白结构，所述蛋白结构能够与选自免疫球蛋白和包含免疫球蛋白或其衍生物的分子组成的组的有机靶选择性相互作用，其中所述蛋白结构是包含能够与所述有机靶选择性相互作用的重组融合蛋白作为重复结构单元的聚合物，所述重组融合蛋白包含部分B、REP和CT，其中：B是多于30个氨基酸残基的非拖丝蛋白部分，所述B提供与所述有机靶选择性相互作用的能力，其中所述B部分选自衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域、葡萄球菌蛋白A、和葡萄球菌蛋白A的E、D、A、B和C结构域；和与这些氨基酸序列的任一种具有至少70%同一性的蛋白片段组成的组；REP是70至300个氨基酸残基的部分并衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段；和CT是70至120个氨基酸残基的部分并衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段。
A2.根据A1所述的蛋白结构，其中所述B部分可选自衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域、和与衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域具有至少70%同一性的蛋白片段组成的组。
A3.一种蛋白结构，所述蛋白结构能够与有机靶选择性相互作用，其中所述蛋白结构是包含能够与所述有机靶选择性相互作用的重组融合蛋白作为重复结构单元的聚合物，所述重组融合蛋白包含部分B、REP和CT、和任选的NT，其中：B是多于30个氨基酸残基的非拖丝蛋白部分，其提供与所述有机靶选择性相互作用的能力；REP是70至300个氨基酸残基的部分并衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段；CT是70至120个氨基酸残基的部分并衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段；和NT是100至160个氨基酸残基的部分并衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段。
A4.根据A3所述的蛋白结构，其中所述重组融合蛋白可选自由式Bx-REP-By-CT-Bz和Bx-CT-By-REP-Bz定义的蛋白组成的组，其中x、y和z是0至5的整数；且x+y+z≥1。
A5.根据A4所述的蛋白结构，其中所述重组融合蛋白可选自由式Bx-REP-CT、BX-CT-REP、REP-CT-BZ和CT-REP-BZ定义的蛋白组成的组；其中x和z是1至5的整数。
A6.根据A5所述的蛋白结构，其中所述重组融合蛋白可选自由式B-REP-CT、B-CT-REP、REP-CT-B和CT-REP-B定义的蛋白组成的组。
A7.根据A1-A6任一个所述的蛋白结构，其中所述B部分可具有与SEQ ID NO:6-10的任一种少于30%的同一性。
A8.根据A3-A7任一个所述的蛋白结构，其中所述有机靶可选自免疫球蛋白和包含免疫球蛋白或其衍生物的分子组成的组。
A9.根据A8所述的蛋白结构，其中所述免疫球蛋白可选自来自人类的免疫球蛋白亚类IgG1、IgG2、IgG4、IgA和IGM。
A10.根据A3-A9任一个所述的蛋白结构，其中所述B部分可选自衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域、葡萄球菌蛋白A、和葡萄球菌蛋白A的E、D、A、B和C结构域、链球菌蛋白G、和链球菌蛋白G的C1、C2和C3结构域；和与这些氨基酸序列的任一种具有至少70%同一性的蛋白片段组成的组。
A11.根据A10所述的蛋白结构，其中所述B部分可选自衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域、葡萄球菌蛋白A的B结构域、和链球菌蛋白G的C2结构域；和与这些氨基酸序列的任一种具有至少70%同一性的蛋白片段组成的组。
A12.根据A11所述的蛋白结构，其中所述B部分可选自衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域和链球菌蛋白G的C2结构域组成的组。
A13.根据A3-A7任一个所述的蛋白结构，其中所述有机靶可选自白蛋白和包含白蛋白或其衍生物的分子组成的组。
A14.根据A13所述的蛋白结构，其中所述B部分可选自链球菌蛋白G、链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域、来自大芬戈尔德菌（Finegoldia magna）的GA模块；和与这些氨基酸序列的任一种具有至少70%同一性的蛋白片段。
A15.根据A13-A14任一个所述的蛋白结构，其中所述B部分可包括链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域、和与其具有至少70%同一性的蛋白片段。
A16.根据A15所述的蛋白结构，其中所述B部分可以是链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域。
A17.根据A3-A7任一个所述的蛋白结构，其中所述有机靶可选自生物素和包含生物素或其衍生物或类似物的分子组成的组。
A18.根据A17所述的蛋白结构，其中所述B部分可选自链霉亲和素、单体链霉亲和素(M4)；和与这些氨基酸序列的任一种具有至少70%同一性的蛋白片段组成的组。
A19.根据A18所述的蛋白结构，其中所述B部分可以是单体链霉亲和素(M4)。
A20.根据A1-A19任一个所述的蛋白结构，其中所述蛋白结构可在至少两个维度上具有至少0.1μm的尺寸。
A21.根据A1-A20任一个所述的蛋白结构，其中所述蛋白结构可以是以选自由纤维、膜、泡沫、网状物、网、球和胶囊组成的组的物理形态。
A22.根据A1-A21任一个所述的蛋白结构，其中所述REP部分可选自L(AG)nL、L(AG)nAL、L(GA)nL、L(GA)nGL的组，其中n是2至10的整数；每个单独的A区段是8至18个氨基酸残基的氨基酸序列，其中所述氨基酸残基中的0至3个不是Ala，且剩余的氨基酸残基是Ala；每个单独的G区段是12至30个氨基酸残基的氨基酸序列，其中至少40%的氨基酸残基是Gly；且每个单独的L区段是0至20个氨基酸残基的接头氨基酸序列。
A23.根据A1-A22任一个所述的蛋白结构，其中所述CT部分可具有与SEQ ID NO:9的至少50%同一性或与SEQ ID NO:7的至少80%同一性。
A24.根据A23所述的蛋白结构，其中所述CT部分可具有与SEQ ID NO:9的至少50%同一性和与SEQ ID NO:7的至少80%同一性。
A25.根据A1-A24任一个所述的蛋白结构，其中所述NT部分可具有与SEQ ID NO:8的至少50%同一性或与SEQ ID NO:6的至少80%同一性。
A26.根据A25所述的蛋白结构，其中所述NT部分可具有与SEQ ID NO:8的至少50%同一性和与SEQ ID NO:6的至少80%同一性。
A27.根据A1-A26任一个所述的蛋白结构，其中所述融合蛋白可包括寡肽细胞结合基序。
A28.根据A1-A27任一个所述的蛋白结构，其中所述融合蛋白可选自SEQ ID NO:14、16、18、22、24和26；和与这些序列的任一种具有至少80%同一性的蛋白组成的组。
A29.一种提供根据A1-A28任一个所述的蛋白结构的方法，所述蛋白结构展示对有机靶的结合活性，所述方法包括以下步骤：(a)提供根据A1-A28任一个所述的重组融合蛋白；(b)将所述融合蛋白经受实现包含所述重组融合蛋白的聚合物的形成的条件。
A30.一种用于固定有机靶的亲和性介质，所述亲和性介质包含根据A1-A28任一个所述的融合蛋白，其中所述B部分能够与所述有机靶选择性相互作用。
A31.根据A30所述的亲和性介质，所述亲和性介质可包含根据A1-A28任一个所述的蛋白结构，所述蛋白结构是包含所述重组融合蛋白的聚合物。
A32.根据A31所述的亲和性介质，其中所述蛋白结构可以是根据A8-A19任一个所述的。
A33.根据A30-A32任一个所述的亲和性介质，所述亲和性介质还可包含所述有机靶，其中所述B部分能够与所述有机靶选择性相互作用并结合。
A34.根据A33所述的亲和性介质，其中所述有机靶能够与第二有机靶选择性相互作用。
A35.根据A31-A34任一个所述的亲和性介质，其中所述蛋白结构可以是以膜的物理形态。
A36.一种用于培养细胞的细胞支架材料，所述细胞具有存在于所述细胞表面上的有机靶，所述细胞支架材料包含根据A1-A28任一个所述的蛋白结构。
A37.根据A36所述的细胞支架材料，其中所述B部分能够与存在于所述细胞表面上的所述有机靶选择性相互作用。
A38.根据A36所述的细胞支架材料，其中所述细胞支架材料还可包含中间有机靶，其中所述B部分能够与所述中间有机靶选择性相互作用并结合，且其中所述中间有机靶能够与存在于所述细胞表面上的所述有机靶选择性相互作用。
A39.根据A38所述的细胞支架材料，其中所述蛋白结构可以是根据A8-A19任一个所述的。
A40.根据A36-A40任一个所述的细胞支架材料，其中所述蛋白结构可以是以膜的物理形态。
A41.细胞与根据A36-A40任一个所述的细胞支架材料的组合。
A42.根据A1-A28任一个所述的蛋白结构在从样品分离有机靶中的用途。
A43.根据A1-A28任一个所述的蛋白结构在培养细胞中的用途。
A44.一种从样品分离有机靶的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含所述有机靶的样品；提供根据A30-A35任一个所述的亲和性介质，其中所述亲和性介质能够与所述有机靶选择性相互作用；在实现所述亲和性介质与所述有机靶之间的结合的适当条件下将所述亲和性介质与所述样品接触；和除去未结合的样品。
A45.根据A44所述的方法，所述方法还可包括在实现第一有机靶与第二有机靶之间的结合的适当条件下将所述亲和性介质和固定的有机靶与第二有机靶接触的步骤，所述第二有机靶能够与第一有机靶选择性相互作用。
A46.根据A44-A45任一个所述的方法，其中当将所述亲和性介质与所述样品接触以实现所述亲和性介质与所述有机靶之间的结合时，所述亲和性介质中的所述融合蛋白可以以如根据A1-A28任一个所述的蛋白结构存在。
A47.根据A44-A45任一个所述的方法，其中当将所述亲和性介质与所述样品接触以实现所述亲和性介质与所述有机靶之间的结合时，所述亲和性介质中的所述融合蛋白可在溶液中存在，且其中允许融合蛋白与所述有机靶结合的复合体形成根据A1-A28任一个所述的融合蛋白结构。
A48.根据A44-A47任一个所述的方法，所述方法还可包括检测、和任选地定量所述亲和性介质上的固定的靶的存在的步骤。
A49.根据A44-A48任一个所述的方法，所述方法还可包括从所述亲和性介质释放和收集所述有机靶的步骤。
A50.根据A44-A49任一个所述的方法，所述方法还可包括通过化学处理和/或灭菌热处理再生所述亲和性介质的最后步骤。
A51.根据A50所述的方法，其中所述化学处理可包括用NaOH和/或脲处理。
A52.一种固定细胞的方法，所述方法包括提供：包含目标细胞的样品；将所述样品应用到根据A36-A40任一个所述的细胞支架材料，其中所述细胞支架材料能够与存在于所述细胞表面上的有机靶选择性相互作用；和通过所述细胞表面上的所述有机靶与所述细胞支架材料之间的结合，允许所述细胞固定于所述细胞支架材料。
A53.一种培养细胞的方法，所述方法包括：根据A52所述的方法固定目标细胞到细胞支架材料；和在适合细胞培养的条件下保持已对其应用细胞的所述细胞支架材料。
A54.根据A44-A53任一个所述的方法，其中所述蛋白结构可以是以膜、纤维或泡沫的物理形态。
A55.根据A1-A28任一个所述的重组融合蛋白，所述重组融合蛋白能够与有机靶选择性相互作用。
A56.一种分离的多核酸，所述多核酸编码根据A55所述的融合蛋白。
A57.根据A56所述的分离的多核酸，所述多核酸可选自由编码根据A28所述的融合蛋白的核酸组成的组和由SEQ ID NO:15、17、19、23、25和27组成的组。
A58.一种产生融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：a)在适当的宿主中表达根据A1-A28任一个所述的融合蛋白；和b)获得包含所述融合蛋白的混合物，和任选地分离所述融合蛋白。
A59.根据A1-A28任一个所述的重组融合蛋白用于产生能够与有机靶选择性相互作用的蛋白结构的用途，其中所述蛋白结构是包含所述重组融合蛋白的聚合物。
在另一个方面，本发明提供了以下实施方案：
B1.一种蛋白结构，所述蛋白结构能够与选自IgG的可结晶片段（Fc）区域和包含IgG或其衍生物的分子组成的组的有机靶选择性相互作用，其中所述蛋白结构是包含能够与所述有机靶选择性相互作用的重组融合蛋白作为重复结构单元的聚合物，所述重组融合蛋白包含部分B、REP和CT，其中所述聚合物包括多于100个融合蛋白结构单元，且其中：B是多于30个氨基酸残基的非拖丝蛋白部分，所述B提供与所述有机靶选择性相互作用的能力，其中所述B部分选自葡萄球菌蛋白A的Z结构域、葡萄球菌蛋白A、和葡萄球菌蛋白A的E、D、A、B和C结构域；和与这些氨基酸序列的任一种具有至少70%同一性的蛋白片段组成的组；所述REP部分和CT部分提供形成聚合物的能力；REP是70至300个氨基酸残基的部分并选自由L(AG)nL、L(AG)nAL、L(GA)nL、L(GA)nGL组成的组，其中n是2至10的整数；每个单独的A区段是8至18个氨基酸残基的氨基酸序列，其中所述氨基酸残基中的0至3个不是Ala，且剩余的氨基酸残基是Ala；每个单独的G区段是12至30个氨基酸残基的氨基酸序列，其中至少40%的氨基酸残基是Gly；且每个单独的L区段是0至20个氨基酸残基的接头氨基酸序列；和CT是70至120个氨基酸残基的部分并具有与SEQ ID NO:9的至少50%同一性或与SEQ ID NO:7的至少80%同一性。
B2.根据B1所述的蛋白结构，其中所述B部分可选自葡萄球菌蛋白A的Z结构域、葡萄球菌蛋白A的B结构域；和与这些氨基酸序列的任一种具有至少70%同一性的蛋白片段组成的组。
B3.根据B2所述的蛋白结构，其中所述B部分可选自葡萄球菌蛋白A的Z结构域、和与葡萄球菌蛋白A的Z结构域具有至少70%同一性的蛋白片段组成的组。
B4.根据B3所述的蛋白结构，其中所述B部分可以是葡萄球菌蛋白A的Z结构域。
B5.根据B4所述的蛋白结构，其中所述重组融合蛋白可选自由式Bx-REP-By-CT-Bz和Bx-CT-By-REP-Bz定义的蛋白组成的组，其中x、y和z是0至5的整数；且x+y+z≥1。
B6.根据B5所述的蛋白结构，其中所述重组融合蛋白可选自由式Bx-REP-CT、BX-CT-REP、REP-CT-BZ和CT-REP-BZ定义的蛋白组成的组；其中x和z是1至5的整数。
B7.根据B6所述的蛋白结构，其中所述重组融合蛋白可选自由式B-REP-CT、B-CT-REP、REP-CT-B和CT-REP-B定义的蛋白组成的组。
B8.根据B1-B7任一个所述的蛋白结构，其中所述B部分可具有与SEQ ID NO:6-10的任一种少于30%的同一性。
B9.根据B1-B8任一个所述的蛋白结构，其中所述蛋白结构可在至少两个维度上具有至少0.1μm的尺寸。
B10.根据B1-B9任一个所述的蛋白结构，其中所述蛋白结构可以是以选自由纤维、膜、泡沫、网状物、网、球和胶囊组成的组的物理形态。
B11.根据B1-B10任一个所述的蛋白结构，其中所述CT部分可具有与SEQ ID NO:9的至少50%同一性和与SEQ ID NO:7的至少80%同一性。
B12.根据B1-B10任一个所述的蛋白结构，其中所述CT部分可具有与SEQ ID NO:7的至少90%同一性。
B13.根据B12所述的蛋白结构，其中所述CT部分可以是SEQ ID NO:7。
B14.根据B1-B13任一个所述的蛋白结构，其中所述重组融合蛋白可选自SEQ IDNO:14和与SEQ ID NO:14具有至少80%同一性的蛋白组成的组。
B15.一种提供根据B1-B14任一个所述的蛋白结构的方法，所述蛋白结构展示对选自由IgG的可结晶片段（Fc）区域和包含IgG或其衍生物的分子组成的组的有机靶的结合活性，所述方法包括以下步骤：(a)提供根据B1-B14任一个所述的重组融合蛋白；(b)将所述重组融合蛋白经受实现包含所述重组融合蛋白的聚合物的形成的条件。
B16.一种用于固定选自由IgG的可结晶片段（Fc）区域和包含IgG或其衍生物的分子组成的组的有机靶的亲和性介质，所述亲和性介质包含根据B1-B14任一个所述的重组融合蛋白，其中所述B部分能够与所述有机靶选择性相互作用。
B17.根据B16所述的亲和性介质，所述亲和性介质可包含根据B1-B14任一个所述的蛋白结构，所述蛋白结构是包含所述重组融合蛋白的聚合物。
B18.根据B16-B17任一个所述的亲和性介质，所述亲和性介质还可包含所述有机靶，其中所述B部分能够与所述有机靶选择性相互作用并结合。
B19.根据B18所述的亲和性介质，其中所述有机靶能够与第二有机靶选择性相互作用。
B20.根据B17-B19任一个所述的亲和性介质，其中所述蛋白结构可以是以膜的物理形态。
B21.一种用于培养细胞的细胞支架材料，所述细胞具有存在于所述细胞表面上的有机靶，所述细胞支架材料包含根据B1-B14任一个所述的蛋白结构，其中所述细胞支架材料还包含选自由IgG的可结晶片段（Fc）区域和包含IgG或其衍生物的分子组成的组的中间有机靶，其中所述B部分能够与所述中间有机靶选择性相互作用并结合，且其中所述中间有机靶能够与存在于所述细胞表面上的所述有机靶选择性相互作用。
B22.根据B21所述的细胞支架材料，其中所述蛋白结构可以是以膜的物理形态。
B23.细胞与根据B21-B22任一个所述的细胞支架材料的组合。
B24.根据B1-B14任一个所述的蛋白结构在从样品分离选自由IgG的可结晶片段（Fc）区域和包含IgG或其衍生物的分子组成的组的有机靶中的用途。
B25.根据B1-B14任一个所述的蛋白结构在培养细胞中的用途。
B26.一种从样品分离选自由IgG的可结晶片段（Fc）区域和包含IgG或其衍生物的分子组成的组的有机靶的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含所述有机靶的样品；提供根据B16-B20任一个所述的亲和性介质，其中所述亲和性介质能够与所述有机靶选择性相互作用；在实现所述亲和性介质与所述有机靶之间的结合的适当条件下将所述亲和性介质与所述样品接触，从而提供固定的有机靶；和除去未结合的样品。
B27.根据B26所述的方法，所述方法还可包括将所述亲和性介质和所述固定的有机靶与另外的有机靶在实现这两个有机靶之间的结合的适当条件下接触的步骤，所述另外的有机靶能够与所述固定的有机靶选择性相互作用。
B28.根据B26-B27任一个所述的方法，其中当将所述亲和性介质与所述样品接触以实现所述亲和性介质与所述有机靶之间的结合时，所述亲和性介质中的所述重组融合蛋白可以以如根据B1-B14任一个所述的蛋白结构存在。
B29.根据B26-B27任一个所述的方法，其中当将所述亲和性介质与所述样品接触以实现所述亲和性介质与所述有机靶之间的结合时，所述亲和性介质中的所述重组融合蛋白可在溶液中存在，且其中允许融合蛋白与所述有机靶结合的复合体形成根据B1-B14任一个所述的融合蛋白结构。
B30.根据B26-B29任一个所述的方法，所述方法还可包括检测、和任选地定量所述亲和性介质上的所述固定的有机靶的存在的步骤。
B31.根据B26-B30任一个所述的方法，所述方法还可包括从所述亲和性介质释放和收集所述有机靶的步骤。
B32.根据B26-B31任一个所述的方法，所述方法还可包括通过化学处理和/或灭菌热处理再生所述亲和性介质的最后步骤。
B33.根据B32所述的方法，其中所述化学处理可包括用NaOH和/或脲处理。
B34.一种固定细胞的方法，所述方法包括：提供包含目标细胞的样品；将所述样品应用到根据B21-B22任一个所述的细胞支架材料，其中所述细胞支架材料能够与存在于所述细胞表面上的有机靶选择性相互作用；和通过所述细胞表面上的所述有机靶与所述细胞支架材料之间的结合，允许所述细胞固定于所述细胞支架材料。
B35.一种培养细胞的方法，所述方法包括：根据B34所述的方法固定目标细胞到细胞支架材料；和在适合细胞培养的条件下保持已对其应用细胞的所述细胞支架材料。
B36.根据B26-B35任一个所述的方法，其中所述蛋白结构可以是以膜、纤维或泡沫的物理形态。
B37.一种重组融合蛋白，所述重组融合蛋白由SEQ ID NO:14组成。
B38.一种分离的多核酸，所述多核酸选自由编码根据B37所述的重组融合蛋白的核酸和SEQ ID NO:15组成的组。
B39.一种产生重组融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：a)在适当的宿主中表达根据B37所述的重组融合蛋白；和b)获得包含所述重组融合蛋白的混合物，和任选地分离所述重组融合蛋白。
B40.根据B1-B14任一个所述的重组融合蛋白用于产生能够与选自由IgG的可结晶片段（Fc）区域和包含IgG或其衍生物的分子组成的组的有机靶选择性相互作用的蛋白结构的用途，其中所述蛋白结构是包含所述重组融合蛋白的聚合物。
附图简述
图1显示拖丝蛋白C端结构域的序列比对。
图2显示拖丝蛋白N端结构域的序列比对。
图3显示包含Z结构域的融合蛋白的宏观纤维。
图4显示来自包含Z结构域的融合蛋白的纯化和分析的SDS-PAGE凝胶。
图5显示由融合蛋白制成的纤维和对照纤维，示出融合蛋白中Z结构域的功能性（functionality）。
图6显示在组织培养板的底部由融合蛋白制成的成型膜（casted film）的部分。
图7-12显示非还原性SDS-PAGE凝胶，示出融合蛋白结构中Z结构域的功能性。
图13-15显示非还原性SDS-PAGE凝胶，示出与商业蛋白A基质相比，融合蛋白结构中的Z结构域的IgG-结合能力。
图16-17显示与商业蛋白A基质相比，融合蛋白结构的就地清洗(cleaning-in-place,CIP)程序的非还原性SDS-PAGE凝胶。
图18显示来自用生物素化的Atto-565浸泡的蛋白膜的荧光强度。
图19显示不同浓度的生物素化的Atto-565在结合融合蛋白膜后荧光强度值的图和线性拟合。
图20显示向由融合蛋白制成的膜或对照的孔加入生物素化的Atto-565之前(-)和之后(+)的荧光强度值的图。
图21是显示由溶液中游离的生物素化的HRP催化所得的反应速率的标准曲线和线性拟合的图。
图22是显示与对照相比，由固定于融合蛋白膜的生物素化的HRP催化的反应速率的图。
图23显示增溶的融合蛋白结构的还原性SDS-PAGE凝胶。
图24-26显示示出IgG-HRP与包含Z结构域的融合蛋白膜的结合的图。
图27显示示出IgG-Alexa Fluor633与包含Z结构域的融合蛋白膜的结合的图。
图28显示非还原性SDS-PAGE凝胶，示出高压灭菌后融合蛋白中Z结构域的功能性。
图29显示蛋白酶3C处理包含Z结构域的融合蛋白纤维的裂解产物的SDS-PAGE凝胶。
图30显示非还原性SDS-PAGE凝胶，示出在有机靶(IgG)存在下形成的融合蛋白结构中Z结构域的功能性。
图31-32显示非还原性SDS-PAGE凝胶，示出融合蛋白结构中Abd结构域的功能性。
图33-34显示非还原性SDS-PAGE凝胶，示出融合蛋白结构中C2结构域的功能性。
所附序列的列表
SEQ ID NO
SEQ ID NO
1 4Rep
2 4RepCT
3 NT4Rep
4 NT5Rep
5 NT4RepCTHis
6 NT
7 CT
8 共有NT序列
9 共有CT序列
10 来自Euprosthenops australis MaSp1的重复序列
11 共有G区段序列1
12 共有G区段序列2
13 共有G区段序列3
14 HisZQG4Rep4CT
15 HisZQG4Rep4CT(DNA)
16 HisAbdQG4RepCT
17 HisAbdQG4RepCT(DNA)
18 HisC2QG4RepCT
19 HisC2QG4RepCT(DNA)
20 4RepCT2
21 4RepCT2(DNA)
22 M44RepCT
23 M44RepCT(DNA)
24 modM44RepCT
25 modM44RepCT(DNA)
26 4RepCTM4
27 4RepCTM4(DNA)
发明详述
本发明总体是基于如下洞见：能够与有机靶选择性相互作用的固态蛋白结构可制备为以重组融合蛋白作为重复结构单元的聚合物形式。融合蛋白包含至少一个能够与该有机靶选择性相互作用的多于30个氨基酸残基的非拖丝蛋白部分、和对应于蜘蛛丝蛋白的至少重复片段和C端片段的部分。意外地，衍生自蜘蛛丝蛋白的部分可被诱导以在结构上重排并因而形成聚合、固态结构，而非拖丝蛋白部分不在结构上重排，但保持其期望的结构和功能，即，与该有机靶选择性相互作用的能力。可获得蛋白结构而无化学偶联步骤或变性方法步骤，这使得程序容易并改进获得具有保持其部分的功能性的融合蛋白的机会，尤其是当功能依赖于部分的二级结构时。这些融合蛋白聚合物的形成可被紧密地控制，且这一洞见已被开发为进一步的新颖蛋白结构、产生该蛋白结构的方法、和该蛋白结构在多种应用和方法中的用途。
因此，根据本发明的融合蛋白具备期望的选择性相互作用活性和蛋白结构中在生理条件下采用的内部的固态支持活性二者。当拖丝蛋白部分在结构上重排以形成聚合、固态结构时，融合蛋白的结合活性被保持，而非拖丝蛋白部分与拖丝蛋白部分共价连接，一定是被认为令人惊讶的。事实上，提供选择性相互作用活性的部分当被整合在根据本发明的融合蛋白结构中时，可增加其热和/或化学稳定性和/或结合活性。该蛋白结构还提供对有机靶的选择性相互作用活性的高和可预测的密度。具有选择性相互作用活性的有价值的蛋白部分的丢失被减到最小，因为所有表达的蛋白部分与固体支持物缔合。
从根据本发明的融合蛋白形成的聚合物是固态结构，由于其物理特征而是有用的，尤其是高强度、弹性和轻的重量的有用的组合。特别有用的特征是，融合蛋白的拖丝蛋白衍生部分是生化牢固的，适于用例如酸、碱或离液剂再生，并适于加热灭菌，例如在120℃高压灭菌20min。该聚合物还因为其支持细胞粘附和生长的能力而是有用的。衍生自拖丝的性质在开发为了医学或技术目的的新材料方面是有吸引力的。尤其是，根据本发明的蛋白结构可用在制备和分析性分离程序中，诸如层析法、细胞捕获、筛选和培养、主动过滤器（active filters）和诊断学。根据本发明的蛋白结构还可用在医疗装置中，诸如植入物和医学产品，诸如伤口闭合***、创可贴、缝线、伤口敷料、和用于细胞固定、细胞培养、组织工程和引导细胞再生的支架。
本发明提供能够与有机靶选择性相互作用的重组融合蛋白，该融合蛋白包含部分B、REP和CT、和任选的NT。本发明还提供能够与有机靶选择性相互作用的蛋白结构，其中所述蛋白结构是包含根据本发明的重组融合蛋白、和任选地由根据本发明的重组融合蛋白组成的聚合物，即，包含部分B、REP和CT、和任选的NT，和任选地由部分B、REP和CT、和任选的NT组成。
尽管在实施例中融合蛋白的REP和CT部分不得已地涉及具体蛋白，例如衍生自来自Euprosthenops australis的大拖丝蛋白1(MaSp1)的蛋白，为了产生根据本发明的融合蛋白结构的目的，考虑本公开内容可适用于任何结构上相似的部分。而且，尽管在实施例中提供融合蛋白的选择性相互作用活性的B部分不得已地涉及具体蛋白部分，例如衍生自蛋白A、蛋白G和链霉亲和素的部分，为了产生根据本发明的融合蛋白结构的目的，考虑本公开内容可适用于能够与有机靶选择性相互作用的任何结构上和/或功能上相似的B部分。
根据本发明的具体融合蛋白以式Bx-REP-By-CT-Bz和Bx-CT-By-REP-Bz定义，其中x、y和z是0至5的整数；且x+y+z≥1，任选地在融合蛋白的任一端或融合蛋白中任何两个蛋白部分之间还包含一个NT部分。如果x+y+z>1，即，如果存在两个或多个B部分，它们可以是相同或不同的。两个或多个B部分可具有与相同有机靶或与不同有机靶选择性相互作用的能力。优选地，两个或多个B部分是大致上相同的，各具有与相同有机靶选择性相互作用的能力。
在根据本发明的优选融合蛋白中，x、y和z是0至2、优选地0至1的整数。在根据本发明的某些优选融合蛋白中，y=0。在根据本发明的更优选的具体融合蛋白中，y=0且x或z是0，即，融合蛋白以式BX-REP-CT、BX-CT-REP、REP-CT-BZ和CT-REP-BZ定义，其中x和z是1至5的整数。在根据本发明的优选融合蛋白中，y=0，x和z是0至1的整数；且x+z=1。如此，根据本发明的某些优选融合蛋白以式B-REP-CT、B-CT-REP、REP-CT-B和CT-REP-B定义。在根据本发明的优选融合蛋白中，任选的NT部分不存在。
术语“融合蛋白”此处指通过由重组核酸，即通过组合正常情况下不会一起出现的两个或更多个核酸序列而人工创造的DNA或RNA表达而制备的蛋白质(遗传工程)。根据本发明的融合蛋白是重组蛋白，且因此其不同于天然存在的蛋白质。特别地，因为野生型拖丝蛋白不是由以上列出的重组核酸表达的，所以其不是根据本发明的融合蛋白。组合的核酸序列编码具有特定功能特性的不同蛋白质、部分蛋白质或多肽。所得的融合蛋白或重组融合蛋白是具有衍生自原始蛋白质、部分蛋白质或多肽中的每一种的功能特性的单一蛋白质。而且，根据本发明的融合蛋白和相应的基因是嵌合的，即，该蛋白/基因部分衍生自至少两种不同的物种。REP和CT部分、以及任选的NT部分，都衍生自蜘蛛丝蛋白。为了避免疑问，根据本发明的B部分是非拖丝蛋白的蛋白或多肽，即，其不是衍生自蜘蛛丝蛋白。具体地，根据本发明的B部分不是衍生自蜘蛛丝蛋白的C端、重复或N端片段。
融合蛋白通常由170至2000个氨基酸残基、诸如170至1000个氨基酸残基、诸如170至600个氨基酸残基、优选地170至500个氨基酸残基、诸如170至400个氨基酸残基组成。小的尺寸是有利的，因为包含蜘蛛丝蛋白片段的较长蛋白可能形成无定形的聚集物，这需要使用强力的溶剂来增溶和聚合。重组融合蛋白可包含多于2000个残基，尤其是在蜘蛛丝蛋白包含多于一个B部分和/或当其包含NT部分的情形时。
术语"拖丝蛋白（spidroin）"和"蜘蛛丝蛋白（spider silk protein）"遍及本说明书可互换地使用，并涵盖所有已知的蜘蛛丝蛋白，包括大壶状腺蜘蛛丝蛋白，其通常缩写为"MaSp"，或在十字园蛛的情形缩写为"ADF"。这些大壶状腺蜘蛛丝蛋白一般为两种类型，1和2。这些术语还包括与已知蜘蛛丝蛋白具有高程度的同一性和/或相似性的非天然蛋白。
所以，术语"非拖丝蛋白"意指不是衍生自蜘蛛丝蛋白的蛋白，即，与蜘蛛丝蛋白具有低(或无)程度的同一性和/或相似性。
根据本发明的蛋白结构能够与有机靶选择性相互作用。这一能力存在于根据本发明的融合蛋白中，更具体地存在于融合蛋白的B部分中。REP和CT部分、以及任选的NT部分，与有机分子的任何相互作用不被术语"能够与有机靶选择性相互作用"涵盖。为了避免疑问，术语"能够与有机靶选择性相互作用"不涵盖根据本发明的融合蛋白的依赖于包括REP和CT部分、以及任选的NT部分的相互作用的二聚、寡聚或聚合。
术语"有机靶"涵盖含碳原子的所有化学分子，例外是通常本领域技术人员认为是无机分子的那些，例如碳酸盐、碳的简单氧化物、氰化物、金刚石和石墨。为了避免疑问，无机分子、盐和离子，诸如硅石和氯化钙，不是有机的。有机靶可以是包含有机分子或由有机分子组成的复合体，例如，细胞表面上的受体复合体。有机靶可以是一种或多种有机分子类型的单体、二聚体、寡聚体或聚合物，可以由共价键或其他类型的缔合保持在一起。当然，它还可以简单地是单个有机分子。根据本发明的优选的有机靶包括但不限于，核酸、蛋白和多肽、脂质和碳水化合物、以及其组合。根据本发明的另外的优选的有机靶包括但不限于，免疫球蛋白、包含免疫球蛋白或其衍生物的分子、白蛋白、包含白蛋白或其衍生物的分子、生物素、和包含生物素或其衍生物或类似物的分子。
在本发明的上下文中，配体例如根据本发明的融合蛋白的B部分与其靶的"特异"或"选择性"相互作用是指，该相互作用使得特异性与非特异性、或选择性或非选择性的相互作用之间的差别变得有意义。两种蛋白之间的相互作用有时以解离常数测量。解离常数描述两种分子之间的结合强度(或亲和性)。通常抗体与其抗原之间的解离常数是10-7至10-11M。然而，高特异性不必要求高亲和性。对其对应物具有低亲和性(在摩尔范围中)的分子已经显示为与具有高的多的亲和性的分子同样特异性。在本发明的情形中，特异或选择性相互作用是指在指定条件下，在天然存在的或经加工的生物或生化流体的样品中其他蛋白的存在下，特定方法可用于确定特定蛋白、靶蛋白或其片段的存在和/或量的程度。换言之，特异性或选择性是区分相关蛋白的能力。特异和选择性在本说明书中有时可互换地使用。
根据本发明的融合蛋白还可包含一个或多个接头肽。接头肽可布置在融合蛋白的任何部分之间，例如，CT和REP部分之间、两个B部分之间、B和CT部分之间、和B和REP部分之间，或可布置在融合蛋白的任一末端。如果融合蛋白包含两个或多个B部分，接头肽还可布置在两个B部分之间。接头可在融合蛋白的功能单元之间提供间隔区，而且还可构成用于鉴定和纯化该融合蛋白的工具，例如，His和/或Trx标签。如果融合蛋白包含用于鉴定和纯化融合蛋白的两个或多个接头肽，优选它们被间隔序列隔开，例如His6-间隔区-His6-。接头还可构成将融合蛋白导向膜和/或致使融合蛋白从宿主细胞分泌到周围介质中的信号肽，例如信号识别颗粒。融合蛋白还可在其氨基酸序列中包括允许裂解并去除接头和/或其他相关部分，通常是一个或多个B部分的裂解位点。多种裂解位点是本领域技术人员已知的，例如，针对化学剂的裂解位点，例如Met残基之后的CNBr裂解位点和Asn-Gly残基之间的羟胺裂解位点，针对蛋白酶例如凝血酶或蛋白酶3C的裂解位点，和自我剪接序列，例如内蛋白(intein)自我剪接序列。
REP、CT和B部分彼此直接或间接连接。直接连接指部分之间的直接共价结合而无间插序列例如接头。间接连接也是指部分通过共价键连接，但是存在间插序列，例如接头和/或一个或多个另外的部分，例如NT部分。
一个或多个B部分可布置在融合蛋白的内部或任何一端，即，布置在C端或布置在N端。优选一个或多个B部分布置在融合蛋白的N末端。如果融合蛋白包含用于鉴定和纯化融合蛋白的一个或多个接头肽，例如，His或Trx标签，优选地其被布置在融合蛋白的N末端。
优选的融合蛋白具有布置在N端的B部分通过1-30个氨基酸残基，经由例如1-10个氨基酸残基的接头肽偶联到布置在C端的REP和CT部分的形式。接头肽可包含裂解位点。任选地，融合蛋白具有可包含纯化标签例如His标签和裂解位点的N端或C端接头肽。
另一种优选的融合蛋白具有布置在N端的B部分直接偶联到布置在C端的REP和CT部分的形式。任选地，融合蛋白具有可包含纯化标签例如His标签和裂解位点的N端或C端接头肽。
根据本发明的蛋白结构是包含根据本发明的重组融合蛋白作为重复结构单元的聚合物，这是意指，其包含有序的多个根据本发明的融合蛋白，通常远多于100个融合蛋白单元、例如，1000个融合蛋白单元或更多。任选地，聚合物可包含无B部分的互补蛋白、优选地衍生自蜘蛛丝的蛋白作为另外的重复结构单元。如果融合蛋白的B部分是大和/或庞大的，这可以是有益的。这些互补蛋白通常包括REP部分和CT部分、和任选地NT部分。根据本发明的优选的互补蛋白可具有本文列出的结构的任一种，并缺失B部分。优选地，互补融合蛋白与缺失B部分的融合蛋白基本上相同。然而优选地，根据本发明的蛋白结构是由根据本发明的重组融合蛋白作为重复结构单元组成的聚合物，即，根据本发明的蛋白结构是根据本发明的重组融合蛋白的聚合物。
聚合物中融合单元的量值意指该蛋白结构获得显著的大小。在优选的实施方案中，蛋白结构在至少两个维度上具有至少0.1μm的尺寸。如此，本文使用的术语"蛋白结构"涉及具有至少0.1μm的厚度的融合蛋白聚合物，优选地人眼可见的宏观聚合物，即，具有至少1μm的厚度。术语"蛋白结构"不涵盖无结构的聚集物或沉淀物。尽管融合蛋白的单体是水溶性的，应理解的是，根据本发明的蛋白结构是固态结构，即，不溶于水。该蛋白结构是包含根据本发明的重组融合蛋白作为重复结构单元单体的聚合物。
优选地，根据本发明的蛋白结构是以选自由纤维（fiber）、膜（film）、泡沫（foam）、网状物（net）、网（mesh）、球（sphere）和胶囊（capsule）组成的组的物理形态。
优选地，根据本发明的蛋白结构是厚度为至少0.1μm、优选地至少1μm的纤维或膜。优选地，纤维或膜具有范围在1-400μm、优选地60-120μm中的厚度。优选地，纤维具有范围在0.5-300cm、优选地1-100cm中的长度。其他优选的范围是0.5-30cm和1-20cm。纤维具有在物理操作期间保持完整的能力，即，可用于旋转、编织、扭转、钩编和类似程序。膜是有利的，因为其是一致的并粘附于固体结构，例如，微量滴定板中的塑料制品。膜的这一特征有助于洗涤和再生程序，对于分离目的是非常有用的。特别有用的蛋白结构是膜或纤维，其中B部分是衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域或与其具有至少70%同一性的蛋白片段，参见例如，实施例1-6。
还优选地，根据本发明的蛋白结构具有高于1MPa、优选地高于2MPa、更优选地10MPa或更高的抗张强度。优选地，根据本发明的蛋白结构具有高于100MPa、更优选地200MPa或更高的抗张强度。
REP部分是包含70至300个氨基酸残基的蛋白片段，并衍生自蜘蛛丝蛋白的重复片段。这意指，REP部分具有在富含丙氨酸的区段和富含甘氨酸的区段之间交替的重复性特征。如以下将更详细地解释的，REP部分通常包含多于70，例如多于140且少于300，优选地少于240，例如少于200个氨基酸残基，且自身可分成几个L(接头)区段、A(富含丙氨酸)区段和G(富含甘氨酸)区段。通常，所述接头区段是任选的，位于REP部分末端，而剩余的区段依次是富含丙氨酸和富含甘氨酸的。因此，REP部分通常可具有以下结构中的任何一种，其中n是整数：
L(AG)nL，例如LA1G1A2G2A3G3A4G4A5G5L；
L(AG)nAL，例如LA1G1A2G2A3G3A4G4A5G5A6L；
L(GA)nL，例如LG1A1G2A2G3A3G4A4G5A5L；或
L(GA)nGL，例如LG1A1G2A2G3A3G4A4G5A5G6L。
其遵循：富含丙氨酸或富含甘氨酸的区段是否与N端或C端接头区段相邻不是关键的。优选n是2至10，优选地2至8，优选地4至8，更优选地4至6，即n=4、n=5或n=6的整数。
在优选的实施方案中，根据本发明的REP部分的丙氨酸含量高于20%，优选地高于25%，更优选地高于30%且低于50%，优选地低于40%，更优选地低于35%。这是有利的，因为设想更高的丙氨酸含量提供更硬和/或更强和/或不太可延伸的结构。
在某些实施方案中，REP部分不含脯氨酸残基，即REP部分中不存在脯氨酸残基。
现在转向构成根据本发明的REP部分的区段，应强调的是每个区段是单独的，即，特定REP部分的任何两个A区段、任何两个G区段或任何两个L区段可以是相同的或可以是不相同的。因此，每种类型的区段在特定REP部分内是相同的不是本发明的一般特征。而是，以下公开内容为技术人员提供了如何设计单独的区段并将其聚集成REP部分的指南，该REP部分从而被认为是来源于蜘蛛丝蛋白的重复片段，且构成根据本发明的功能性融合蛋白的一部分。
每个单独的A区段是具有8至18个氨基酸残基的氨基酸序列。优选每个单独的A区段包含13至15个氨基酸残基。大多数或多于两个的A区段包含13至15个氨基酸残基，且少数例如一或两个A区段包含8至18个氨基酸残基例如8-12或16-18个氨基酸残基也是可能的。这些氨基酸残基中的绝大多数是丙氨酸残基。更特别地，这些氨基酸残基中的0至3个不是丙氨酸残基，且剩余的氨基酸残基是丙氨酸残基。因此，每个单独的A区段中的所有氨基酸残基毫无例外地或除了一、二或三个氨基酸残基可以是任何氨基酸以外，都是丙氨酸残基。优选取代丙氨酸的氨基酸是天然氨基酸，优选地单独选自丝氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸的组，更优选地是丝氨酸。当然，A区段中的一个或多个是全丙氨酸区段，而剩余的A区段包含1-3个非丙氨酸的残基，例如丝氨酸、谷氨酸、半胱氨酸或甘氨酸是可能的。
在优选的实施方案中，每个A区段包含13-15个氨基酸残基，包括10-15个丙氨酸残基和0-3个上述非丙氨酸的残基。在更优选的实施方案中，每个A区段包含13-15个氨基酸残基，包括12-15个丙氨酸残基和0-1个上述非丙氨酸的残基。
优选每个单独的A区段与选自SEQ ID NO:10的氨基酸残基7-19、43-56、71-83、107-120、135-147、171-183、198-211、235-248、266-279、294-306、330-342、357-370、394-406、421-434、458-470、489-502、517-529、553-566、581-594、618-630、648-661、676-688、712-725、740-752、776-789、804-816、840-853、868-880、904-917、932-945、969-981、999-1013、1028-1042和1060-1073的组的氨基酸序列具有至少80%，优选地至少90%，更优选地95%，最优选地100%的同一性。该组的每个序列对应于Euprosthenops australis MaSp1蛋白质的天然存在的序列的区段，该天然存在的序列经过克隆相应的cDNA而推断得来，参见WO2007/078239。可选择地，每个单独的A区段与选自SEQ ID NO:3的氨基酸残基143-152、174-186、204-218、233-247和265-278的组的氨基酸序列具有至少80%，优选地至少90%，更优选地95%，最优选地100%的同一性。该组的每个序列对应于表达的、非天然蜘蛛丝蛋白的区段，这些蛋白具有在合适的条件下形成丝结构的能力。因此，在根据本发明的某些实施方案中，每个单独的A区段与选自上述氨基酸区段的氨基酸序列相同。不期望被任何具体的理论束缚，设想根据本发明的A区段形成螺旋结构或β折叠。
如下计算遍及本说明书和所附权利要求书使用的术语“%同一性”。使用CLUSTAL W算法(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.和Gibson,T.J.,Nucleic Acids Research,22:4673-4680(1994))比对查询序列与靶序列。在对应所比对的序列中的最短序列的窗口上进行对比。对比每个位置的氨基酸残基，并将在靶序列中具有相同对应物的查询序列中的位置的百分比报告为%同一性。
如对“%同一性”所描述的计算遍及本说明书和所附权利要求书使用的术语“%相似性”，但以下除外：疏水残基Ala、Val、Phe、Pro、Leu、Ile、Trp、Met和Cys是相似的；碱性残基Lys、Arg和His是相似的；酸性残基Glu和Asp是相似的；且亲水性的、不带电荷的残基Gln、Asn、Ser、Thr和Tyr是相似的。在该上下文中剩余的天然氨基酸Gly不与任何其他氨基酸相似。
遍及本说明书，根据本发明的替代实施方案满足相应百分比的相似性，而不是指定百分比的同一性。其他替代实施方案满足指定百分比的同一性以及另一个较高百分比的相似性，选自对于每个序列的优选百分比的同一性的组。例如，某序列可以与另一序列70%相似；或其可以与另一序列70%相同；或其可以与另一序列70%相同且90%相似。
此外，已从实验数据推断出每个单独的G区段是12至30个氨基酸残基的氨基酸序列。优选每个单独的G区段由14至23个氨基酸残基组成。每个G区段的至少40%的氨基酸残基是甘氨酸残基。通常，每个单独的G区段的甘氨酸含量在40-60%的范围内。
优选每个单独的G区段与选自SEQ ID NO:10的氨基酸残基20-42、57-70、84-106、121-134、148-170、184-197、212-234、249-265、280-293、307-329、343-356、371-393、407-420、435-457、471-488、503-516、530-552、567-580、595-617、631-647、662-675、689-711、726-739、753-775、790-803、817-839、854-867、881-903、918-931、946-968、982-998、1014-1027、1043-1059和1074-1092的组的氨基酸序列具有至少80%，优选地至少90%，更优选地95%，最优选地100%的同一性。该组的每个序列对应于Euprosthenops australis MaSp1蛋白质的天然存在的序列的区段，该天然存在的序列从克隆相应的cDNA推断得来，参见WO2007/078239。可选择地，每个单独的G区段与选自SEQ ID NO:3的氨基酸残基153-173、187-203、219-232、248-264和279-296的组的氨基酸序列具有至少80%，优选地至少90%，更优选地95%，最优选地100%的同一性。该组的每个序列对应于表达的、非天然蜘蛛丝蛋白的区段，所述蛋白具有在合适的条件下形成丝结构的能力。因此，在根据本发明的某些实施方案中，每个单独的G区段与选自上述氨基酸区段的氨基酸序列相同。
在某些实施方案中，根据本发明的每个G区段的前两个氨基酸残基不是-Gln-Gln-。
根据本发明的G区段存在三种亚型。该分类基于对Euprosthenops australisMaSp1蛋白质序列的仔细分析(WO2007/078239)，并已在构建新颖、非天然蜘蛛丝蛋白中使用并验证了该信息。
根据本发明的G区段的第一种亚型由单字母氨基酸共有序列GQG(G/S)QGG(Q/Y)GG(L/Q)GQGGYGQGAGSS(SEQ ID NO:11)代表。该第一种且通常不是最长的G区段亚型通常包含23个氨基酸残基，但是可包含少至17个氨基酸残基，且缺少带电荷的残基或包含一个带电荷的残基。因此，优选该第一种G区段亚型包含17-23个氨基酸残基，但设想其可包含少至12个或多至30个氨基酸残基。不期望被任何具体的理论束缚，设想该亚型形成卷曲结构或31-螺旋结构。该第一种亚型的代表性G区段是SEQ ID NO:10的氨基酸残基20-42、84-106、148-170、212-234、307-329、371-393、435-457、530-552、595-617、689-711、753-775、817-839、881-903、946-968、1043-1059和1074-1092。在某些实施方案中，根据本发明的该第一种亚型的每个G区段的前两个氨基酸残基不是-Gln-Gln-。
根据本发明的G区段的第二种亚型由单字母氨基酸共有序列：GQGGQGQG(G/R)YGQG(A/S)G(S/G)S(SEQ ID NO:12)代表。该第二种通常中间尺寸的G区段亚型通常包含17个氨基酸残基且缺少带电荷的残基或包含一个带电荷的残基。优选该第二种G区段亚型包含14-20个氨基酸残基，但设想其可包含少至12个或多至30个氨基酸残基。不期望被任何具体的理论束缚，设想该亚型形成卷曲结构。该第二种亚型的代表性G区段是SEQ ID NO:10的氨基酸残基249-265、471-488、631-647和982-998；及SEQ ID NO:3的氨基酸残基187-203。
根据本发明的G区段的第三种亚型由单字母氨基酸共有序列：G(R/Q)GQG(G/R)YGQG(A/S/V)GGN(SEQ ID NO:13)代表。该第三种G区段亚型通常包含14个氨基酸残基，且通常是根据本发明的G区段亚型中最短的。优选该第三种G区段亚型包含12-17个氨基酸残基，但设想其可包含多至23个氨基酸残基。不期望被任何具体的理论束缚，设想该亚型形成转角结构。该第三种亚型的代表性G区段是SEQ ID NO:10的氨基酸残基57-70、121-134、184-197、280-293、343-356、407-420、503-516、567-580、662-675、726-739、790-803、854-867、918-931、1014-1027；及SEQ ID NO:3的氨基酸残基219-232。
因此，在优选的实施方案中，每个单独的G区段与选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少80%，优选地90%，更优选95%的同一性。
在REP部分的A和G区段的交替序列的优选实施方案中，每隔一个G区段具有第一种亚型，而剩余的G区段具有第三种亚型，例如...A1G短A2G长A3G短A4G长A5G短...。在REP部分的另一个优选实施方案中，第二种亚型的一个G区段通过***而中断G区段的规律性，例如...A1G短A2G长A3G中A4G短A5G长...。
每个单独的L区段代表可包含0至20个氨基酸残基，例如0至10个氨基酸残基的任选的接头氨基酸序列。虽然该区段是任选的且对于蜘蛛丝蛋白不是功能上关键的，但是其存在仍允许根据本发明的完全功能性的蜘蛛丝融合蛋白形成蛋白结构。在从Euprosthenops australis的MaSp1蛋白质推断的氨基酸序列的重复部分(SEQ ID NO:10)中也存在接头氨基酸序列。特别地，接头区段的氨基酸序列可能与所描述的A或G区段的任何一种相似，但是通常不足以满足本文对其定义的标准。
如WO2007/078239中所示的，设置在REP部分的C端部分的接头区段可由富含丙氨酸的单字母氨基酸共有序列ASASAAASAA STVANSVS和ASAASAAA代表。实际上，第二序列可被认为是根据本发明的A区段，而第一序列与根据本发明的A区段具有高度的相似性。根据本发明的接头区段的另一实例具有富含甘氨酸的单字母氨基酸序列GSAMGQGS并与根据本发明的G区段具有高度的相似性。接头区段的另一实例是SASAG。
代表性L区段是SEQ ID NO:10的氨基酸残基1-6和1093-1110；及SEQ ID NO:3的氨基酸残基138-142，但是本领域技术人员将易于认识到存在这些区段的许多合适的替代氨基酸序列。在根据本发明的REP部分的一个实施方案中，L区段中的一个包含0个氨基酸，即缺少L区段中的一个。在根据本发明的REP部分的另一个实施方案中，两个L区段都包含0个氨基酸，即不含这两个L区段。因此，根据本发明的REP部分的这些实施方案可示意性地表示如下：(AG)nL、(AG)nAL、(GA)nL、(GA)nGL；L(AG)n、L(AG)nA、L(GA)n、L(GA)nG；和(AG)n、(AG)nA、(GA)n、(GA)nG。这些REP部分中的任何一种适合与以下定义的任何CT部分一起使用。
CT部分是包含70至120个氨基酸残基的蛋白片段，并衍生自蜘蛛丝蛋白的C端片段。表述"衍生自"意指在根据本发明的CT部分的上下文中，它与蜘蛛丝蛋白的C端氨基酸序列具有高度的相似性。如图1中所示，该氨基酸序列在各个物种和蜘蛛丝蛋白，包括MaSp1和MaSp2之间相当保守。以SEQ ID NO:9提供了MaSp1和MaSp2的C端区域的共有序列。在图1中，比对了以GenBank登记条目(如果可用)表示的下列MaSp蛋白质：
表1–拖丝蛋白CT部分
哪种特定的CT部分存在于根据本发明的蜘蛛丝蛋白中不是关键的，只要该CT部分没有完全缺失。因此，根据本发明的CT部分可选自图1和表1中示出的氨基酸序列或具有高度相似性的序列中的任何一种。多种多样的C端序列可用在根据本发明的蜘蛛丝蛋白中。
根据本发明的CT部分的序列与基于图1的氨基酸序列的共有氨基酸序列SEQ IDNO:9具有至少50%的同一性，优选地至少60%，更优选地至少65%的同一性，或甚至至少70%的同一性。
根据本发明的代表性的CT部分是Euprosthenops australis序列SEQ ID NO:7。因此，根据本发明的一个优选方面，CT部分与SEQ ID NO:7或图1和表1中的任何单独的氨基酸序列具有至少80%、优选地至少90%、例如至少95%的同一性。在本发明的优选方面中，CT部分与SEQ ID NO:7或图1和表1中的任何单独的氨基酸序列相同。
CT部分通常由70至120个氨基酸残基组成。优选CT部分包含至少70、或多于80、优选地多于90个氨基酸残基。还优选CT部分包含至多120、或少于110个氨基酸残基。典型的CT部分包含约100个氨基酸残基。
任选的NT部分是包含100至160个氨基酸残基的蛋白片段，并衍生自蜘蛛丝蛋白的N端片段。表述"衍生自"意指在根据本发明的NT部分的上下文中，它与蜘蛛丝蛋白的N端氨基酸序列具有高度的相似性。如图2中所示，该氨基酸序列在各个物种和蜘蛛丝蛋白，包括MaSp1和MaSp2之间相当保守。在图2中，比对了以GenBank登记条目(如果可用)表示的以下拖丝蛋白NT部分：
表2-拖丝蛋白NT部分
对每个序列显示仅对应N端部分的部分，省略了信号肽。Nc flag和NIm flag根据Rising A.等人.Biomacromolecules7,3120-3124(2006)翻译和编辑。
哪种特定的NT部分存在于根据本发明的蜘蛛丝蛋白中不是关键的。因此，根据本发明的NT部分可选自图2中示出的氨基酸序列或具有高度相似性的序列中的任何一种。多种多样的N端序列可用在根据本发明的蜘蛛丝蛋白中。基于图2的同源序列，以下序列构成共有NT氨基酸序列：QANTPWSSPNLADAFINSF(M/L)SA(A/I)SSSGAFSADQLDDMSTIG(D/N/Q)TLMSAMD(N/S/K)MGRSG(K/R)STKSKLQALNMAFASSMAEIAAAESGG(G/Q)SVGVKTNAISDALSSAFYQTTGSVNPQFV(N/S)EIRSLI(G/N)M(F/L)(A/S)QAS ANEV(SEQ ID NO:8).
根据本发明的NT部分的序列与共有氨基酸序列SEQ ID NO:8(其基于图2的氨基酸序列)具有至少50%的同一性、优选至少60%的同一性。在优选的实施方案中，根据本发明的NT部分的序列与共有氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少65%的同一性、优选至少70%的同一性。在优选的实施方案中，根据本发明的NT部分进一步地与共有氨基酸序列SEQ ID NO:8具有70%、优选80%的相似性。
根据本发明的代表性NT部分是Euprosthenops australis序列SEQ ID NO:6。根据本发明的优选实施方案，NT部分与SEQ ID NO:6或图1中的任何单独的氨基酸序列具有至少80%同一性。在本发明的优选实施方案中，NT部分与SEQ ID NO:6或图2中的任何单独的氨基酸序列具有至少90%、诸如至少95%的同一性。在本发明的优选实施方案中，NT部分与与SEQID NO:6或图1中的任何单独的氨基酸序列、尤其是与Ea MaSp1相同。
NT部分包含100至160个氨基酸残基。优选NT部分包含至少100、或多于110、优选地多于120个氨基酸残基。还优选NT部分包含至多160、或少于140个氨基酸残基。典型的NT部分包含大约130-140个氨基酸残基。
B部分是包含多于30个氨基酸残基的蛋白或多肽片段。B部分优选地包含多于40个氨基酸残基，诸如多于50个氨基酸残基。B部分优选地包含少于500个氨基酸残基，诸如少于200个氨基酸残基、更优选地少于100个氨基酸残基，诸如少于100个氨基酸残基。其能够与有机靶选择性相互作用，且融合蛋白中是B部分提供与有机靶选择性相互作用的能力。
B部分是非拖丝蛋白部分。这是意指，其不是衍生自蜘蛛丝蛋白，即，其与蜘蛛丝蛋白具有低(或无)程度的同一性和/或相似性。根据本发明的B部分的序列优选地与本文公开的拖丝蛋白氨基酸序列的任一种、具体地与SEQ ID NO:6-10的任一种具有少于30%同一性、诸如少于20%同一性、优选地少于10%同一性。
选择B部分被认为是在本领域普通技术人员能力范围内的。然而，以下为了示例起见，提供了可证明用作B部分的亲和配体的实例、以及用于检测和/或定量的形式和条件的实例。
选择亲和配体所需的生物分子多样性可通过组合改造多个可能的支架分子之一来产生，然后利用适当的选择平台选择特异性和/或选择性亲和配体。可用于针对有机靶产生亲和配体的此类结构的非限制性实例是葡萄球菌蛋白A和其结构域、和这些结构域的衍生物，诸如Z结构域(Nord K等人.(1997)Nat.Biotechnol.15:772-777)；脂笼蛋白(Beste G等人.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:1898-1903)；锚蛋白重复结构域(Binz HK等人.(2003)J.Mol.Biol.332:489-503)；纤维素结合结构域(CBD)(Smith GP等人.(1998)J.Mol.Biol.277:317-332；Lehtio J等人.(2000)Proteins41:316-322)；γ晶体蛋白(crystallines)(Fiedler U和Rudolph R,WO01/04144)；绿色荧光蛋白(GFP)(Peelle B等人.(2001)Chem.Biol.8:521-534)；人类细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)(HuftonSE等人.(2000)FEBS Lett.475:225-231；Irving RA等人.(2001)J.Immunol.Meth.248:31-45)；蛋白酶抑制剂，诸如Knottin蛋白(Wentzel A等人.(2001)J.Bacteriol.183:7273-7284；Baggio R等人.(2002)J.Mol.Recognit.15:126-134)和Kunitz结构域(Roberts BL等人.(1992)Gene121:9-15；Dennis MS和Lazarus RA(1994)J.Biol.Chem.269:22137-22144)；PDZ结构域(Schneider S等人.(1999)Nat.Biotechnol.17:170-175)；肽适体，诸如硫氧还蛋白(Lu Z等人.(1995)Biotechnology13:366-372；Klevenz B等人.(2002)Cell.Mol.Life Sci.59:1993-1998)；葡萄球菌核酸酶(Norman TC等人.(1999)Science285:591-595)；淀粉酶抑肽(McConell SJ和Hoess RH(1995)J.Mol.Biol.250:460-479；Li R等人.(2003)Protein Eng.16:65-72)；基于纤连蛋白III型结构域的trinectins(Koide A等人.(1998)J.Mol.Biol.284:1141-1151；Xu L等人.(2002)Chem.Biol.9:933-942)；和锌指(Bianchi E等人.(1995)J.Mol.Biol.247:154-160；Klug A(1999)J.Mol.Biol.293:215-218；Segal DJ等人.(2003)Biochemistry42:2137-2148)。
上述实例包括展现用于产生新的结合特异性的单个随机化环的支架蛋白，具有其中从蛋白表面突出的侧链被随机化以产生新的结合特异性的刚性二级结构的蛋白支架，和展现用于产生新的结合特异性的非连续高变性环区的支架。
寡核苷酸也可用作亲和配体。称为适体或诱饵（decoy）的单链核酸，折叠为充分确定的三维结构并以高的亲和性和特异性结合其靶。(Ellington AD和Szostak JW(1990)Nature346:818-822；Brody EN和Gold L(2000)J.Biotechnol.74:5-13；Mayer G和Jenne A(2004)BioDrugs18:351-359)。寡核苷酸配体可以是RNA或DNA，并可结合宽范围的靶分子种类。
对于从上述支架结构的任一种的变体池选择期望的亲和配体，大量选择平台可用于分离针对所选靶蛋白的特定新配体。筛选平台包括但不限于，噬菌体展示(Smith GP(1985)Science228:1315-1317)、核糖体展示(Hanes J和Pltickthun A(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:4937-4942)、酵母双杂交***(Fields S和Song0(1989)Nature340:245-246)、酵母展示(Gai SA和Wittrup KD(2007)Curr Opin Struct Biol17:467-473)、mRNA展示(Roberts RW和Szostak JW(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:12297-12302)、细菌展示(Daugherty PS(2007)Curr Opin Struct Biol17:474-480，Kronqvist N等人.(2008)Protein Eng Des Sel1-9，Harvey BR等人.(2004)PNAS101(25):913-9198)、微珠展示(Nord O等人.(2003)J Biotechnol106:1-13，WO01/05808)、SELEX(配体指数富集的***进化（System Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）)(Tuerk C和Gold L(1990)Science249:505-510)和蛋白片段互补检验(PCA)(Remy I和Michnick SW(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:5394-5399)。对免疫球蛋白、白蛋白或其他有机靶具有亲和性的B部分的优选的组是细菌receptin结构域或其衍生物。
优选的B部分的组能够与免疫球蛋白和包含免疫球蛋白或其衍生物的分子选择性相互作用。免疫球蛋白亚类的优选的组是被衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域识别的亚类，即，来自人类的IgG1、IgG2、IgG4、IgA和IgM、来自兔和牛的所有Ig亚类、来自豚鼠的IgG1和IgG2、和来自小鼠的IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM(参见Hober,S.等人,J.ChromatogrB.848:40-47(2007))、更优选地来自人类的免疫球蛋白亚类IgG1、IgG2、IgG4、IgA和IgM。免疫球蛋白亚类的另一优选的组是被C2结构域链球菌蛋白G识别的亚类；即，IgG的所有人类亚类，包括IgG3、和来自多种动物，包括小鼠、兔和绵羊的IgG。
优选的B部分的一个组选自以下组成的组：衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域、葡萄球菌蛋白A和其结构域，优选地E、D、A、B或C结构域、链球菌蛋白G和其结构域，优选地C1、C2和C3结构域；和与这些氨基酸序列的任一种具有至少70%同一性、诸如至少80%同一性、或至少90%同一性的蛋白片段。优选地，B部分选自以下组成的组：衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域、葡萄球菌蛋白A的B结构域、和链球菌蛋白G的C2结构域；和与这些氨基酸序列的任一种具有至少70%同一性、诸如至少80%同一性、或至少90%同一性的蛋白片段。优选地，B部分选自以下组成的组：衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域、和与这一氨基酸序列具有至少70%同一性、诸如至少80%同一性、或至少90%同一性的蛋白片段。优选地，B部分选自以下组成的组：衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域和链球菌蛋白G的C2结构域，参见例如，实施例1-6和8。对免疫球蛋白具有亲和性的B部分的优选的组是细菌receptin结构域或其衍生物。
优选的B部分的另一组能够与白蛋白和包含白蛋白或其衍生物的分子选择性相互作用。对白蛋白具有亲和性的B部分的优选的组是细菌receptin结构域或其衍生物。优选的B部分选自链球菌蛋白G、链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域、来自大芬戈尔德菌（Finegoldia magna）的GA模块；和与这些氨基酸序列的任一种具有至少70%同一性、诸如至少80%同一性、或至少90%同一性的蛋白片段。优选地，B部分选自链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域、和与其具有至少70%同一性、诸如至少80%同一性、或至少90%同一性的蛋白片段。优选地，B部分是链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域，参见例如，实施例7。
优选的B部分的另一组能够与生物素和包含生物素或其衍生物或类似物的分子选择性相互作用。优选的B部分选自以下组成的组：链霉亲和素、单体链霉亲和素(M4)；和与这些氨基酸序列的任一种具有至少70%同一性、诸如至少80%同一性、或至少90%同一性的蛋白片段。优选地，B部分是单体链霉亲和素(M4)，参见例如，实施例10-12。
根据本发明的具体融合蛋白和蛋白结构在实施例中提供。这些优选的融合蛋白形成由SEQ ID NO14、16、18、22、24和26组成的组。另外优选的融合蛋白与这些序列的任一种具有至少80%、优选地至少90%、更优选地至少95%的同一性。
本发明还提供编码根据本发明的融合蛋白的分离的多核酸。具体地，具体的多核酸在实施例和所附的序列表中提供，例如，SEQ ID NO15、17、19、23、25和27。另外优选的多核酸编码与SEQ ID NO14、16、18、22、24和26的任一种具有至少80%、优选地至少90%、更优选地至少95%的同一性的融合蛋白。
根据本发明的多核酸可用于产生根据本发明的融合蛋白。本发明提供了制备融合蛋白的方法。第一步骤包括在合适的宿主中表达根据本发明的融合蛋白。合适的宿主是本领域技术人员熟知的且包括，例如细菌和真核细胞，例如酵母、昆虫细胞系和哺乳动物细胞系。通常，该步骤包括在大肠杆菌中表达编码该融合蛋白的多核酸分子。
方法的第二步骤包括获得包含该融合蛋白的混合物。混合物可例如通过裂解或机械破坏宿主细胞获得。如果宿主细胞分泌融合蛋白，还可通过收集细胞培养基获得混合物。可使用标准方法分离由此获得的蛋白质。如需要的话，该混合物可进行离心，并收集合适的部分(沉淀或上清液)。包含融合蛋白的混合物还可进行凝胶过滤、层析例如阴离子交换层析、透析、相分离或过滤以导致分离。任选地，脂多糖和其他热原在该阶段被有效地去除。如需要的话，可在该步骤中通过裂解去除接头肽。
根据本发明的蛋白结构在适当的条件下从根据本发明的融合蛋白自发地组装，并且组装为聚合物由剪切力和/或两个不同相之间的界面的存在而促进，所述界面例如，固相与液相之间、气相与液相之间、或在疏水/亲水界面，例如，矿物油-水界面。所得的界面的存在刺激在界面或在界面周围区域中聚合，该区域延伸进入液体介质，从而所述聚合在所述界面或在所述界面区域中开始。通过修改组装期间的条件，可产生多种蛋白结构。例如，如果允许组装在从一侧向一侧轻微摆动的容器中发生，则在空气-水界面形成纤维。如果允许混合物静置，则在空气-水界面形成膜。如果蒸发混合物，则在容器底部形成膜。如果向含水混合物的顶部加入油，则在油-水界面形成膜，无论允许静置或摆动。如果混合物起泡沫，例如，通过鼓入空气或甩动，如果允许干燥，则泡沫是稳定的并固化
如此，本发明提供用于提供展示对有机靶的结合活性的蛋白结构的方法。在第一方法步骤中，提供了根据本发明的重组融合蛋白。融合蛋白可例如，通过在适当的宿主中从根据本发明的多核酸表达来提供。在第二方法步骤中，对融合蛋白进行实现形成包含重组融合蛋白的聚合物的条件。注意，尽管自发地组装的蛋白结构可在六氟异丙醇中溶解，溶解的融合蛋白随后不能够自发地再次组装为例如，纤维。
蛋白结构可用作固定有机靶的亲和性介质的部分，其中B部分能够与该有机靶选择性相互作用。样品，例如，生物样品可施加到能够结合该生物样品中存在的有机靶的根据本发明的融合蛋白或蛋白结构，然后融合蛋白或蛋白结构可用于从样品分离有机靶。可对已经从受治疗者取出的生物样品，诸如血液、血清或血浆进行有机靶的检测、分离和/或定量。
如此，本发明提供从样品分离有机靶的方法。提供了包含有机靶的样品，例如，生物样品，诸如血液、血清或血浆。生物样品可以是较早获得的样品。如果在方法中使用较早获得的样品，方法的步骤都不是对人类或动物体进行的。
提供了根据本发明的亲和性介质，其包含根据本发明的融合蛋白或蛋白结构。在某些实施方案中，亲和性介质由根据本发明的融合蛋白或蛋白结构组成。亲和性介质能够借助根据本发明的融合蛋白中的B部分与有机靶选择性相互作用。在实现亲和性介质与有机靶之间结合的适当条件下将亲和性介质与样品接触。在保持亲和性介质与有机靶之间选择性结合的适当条件下除去未结合的样品。这一方法导致有机靶被固定于根据本发明的亲和性介质，具体地被固定于融合蛋白。
在根据本发明的优选的方法中，当亲和性介质与样品接触以实现亲和性介质与有机靶之间的结合时，亲和性介质中的融合蛋白作为根据本发明的蛋白结构存在。
在这一方面，特别有用的蛋白结构是膜或纤维，其中B部分是衍生自葡萄球菌蛋白A的Z结构域或与其具有至少70%同一性，诸如至少80%同一性、或至少90%同一性的蛋白片段，参见例如，实施例1-6。膜是有利的，因为其粘附于固体结构，例如，微量滴定板中的塑料制品。膜的这一特征有助于洗涤和再生程序，对于分离目的是非常有用的。
已经令人惊讶地观察到，当作为根据本发明的蛋白结构中的根据本发明的融合蛋白的部分时，Z结构域的碱稳定性可甚至被增强。这一特征对于洗涤和再生目的可以是非常有用的，例如，允许高浓度的NaOH，诸如0.1M、0.5M、1M或甚至高于1M，例如，2M，和/或允许高浓度的脲，例如，6-8M。化学稳定性还可用于允许为了亲和纯化反复周期地使用Z结构域。这一碱稳定性可通过利用Z结构域的稳定的突变体来进一步增加。另外，已经有利地显示，包括Z结构域的根据本发明的融合蛋白是热稳定的。这允许加热灭菌并保持结合能力。
具有Z结构域的传统亲和性基质的一个已知问题是Z结构域从亲和性基质的泄漏。由于Z结构域被肽键稳定地掺入本发明的融合蛋白中，预计Z结构域从根据本发明的蛋白结构的不期望的泄露是低的或不存在。根据本发明的融合蛋白的另一优点是，所得的蛋白结构具有高密度的Z结构域(或其他B部分)。预计这一高密度提供高结合能力。总之，融合蛋白的这些特征对于多种B部分是非常有吸引力的，尤其是对于以良好的生产经济使用蛋白Z的亲和纯化。这些特征在以传统凝胶珠亲和柱以外的形式也是有用的，例如，以滤器样的形式。
固定的有机靶能够与第二有机靶选择性相互作用。然后该方法还包括在实现第一和第二有机靶之间的结合的适当条件下，将所述亲和性介质和固定的有机靶与第二有机靶接触的步骤，第二有机靶能够与第一有机靶选择性相互作用。
固定的有机靶是可检测和/或可定量的。有机靶的检测和/或定量可以以本领域技术人员已知用于检测和/或定量结合试剂的任何方式、以基于多种生物或非生物相互作用的检验实现。有机靶本身可以用多种标志物标记，或可转而由第二、标记的亲和配体检测以允许检测、可视化和/或定量。这可使用许多标记的任何一种或多种实现，所述标记可与有机靶或任何第二亲和配体轭合，使用本领域技术人员已知的许多技术的任何一种或多种实现，如此不牵涉任何过度的实验。可与有机靶和/或第二亲和配体轭合的标记的非限制性实例包括，荧光染料或金属(例如，荧光素、罗丹明、藻红蛋白、荧光胺)、发色染料(例如，视紫质)、化学发光化合物(例如，鲁米那、咪唑)和生物发光蛋白(例如，萤光素、萤光素酶)、半抗原(例如，生物素)。多种其他可用的荧光剂和发色团描述在Stryer L(1968)Science162:526-533，Brand L和Gohlke JR(1972)Annu.Rev.Biochem.41:843-868。有机靶和/或第二亲和配体还可用酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-内酰胺酶)、放射性同位素(例如，3H、14C、32P、35S或125I)和颗粒(例如，金)标记。在本公开内容的上下文中，"颗粒"是指适于标记分子的颗粒，诸如金属颗粒。另外，亲和配体还可用荧光半导体纳米晶体(量子点)标记。量子点具有极佳的量子产量，比有机荧光团更耐光，因此更容易检测(Chan等人.(2002)Curr Opi Biotech.13:40-46)。不同类型的标记可使用多种化学反应轭合于有机靶或第二亲和配体，例如，胺反应或硫醇反应。然而，可使用胺和硫醇以外的其他反应基团，例如，醛、羧酸和谷氨酰胺。
如果检测和/或定量包括暴露于第二有机靶或第二亲和配体，再次用缓冲液洗涤亲和性介质以除去未结合的第二亲和配体。举例来说，第二亲和配体可以是抗体或其片段或衍生物。之后，可以用常规方法检测和/或定量有机靶。对第二亲和配体的结合特征可以变化，但本领域技术人员将能够通过常规实验确定对每种确定有效和最佳的检验条件。
标记的分子的检测、定位和/或定量可包括可视化技术，诸如光显微术或免疫荧光显微术。其他方法可包括经由流式细胞术或发光测定法检测。标记可视化的方法可包括但不限于，荧光测定、发光测定和/或酶促技术。荧光通过如下检测和/或定量：将荧光标记暴露于特定波长的光，之后检测和/或定量特定波长区域中的发射光。发光标记的分子的存在可由在化学反应期间发生的发光检测和/或定量。酶反应的检测是由于化学反应导致的样品的色移。本领域技术人员知晓，为了适当的检测和/或定量，可修改多种不同的实验方案。
用于检测和/或定量有机靶的一种可得的方法是通过将其或第二亲和配体与酶连接，随后可在酶免疫测定(诸如EIA或ELISA)中检测和/或定量该酶。此类技术是充分建立的，其实现对本领域技术人员不产生任何过度的困难。在此类方法中，将生物样品与结合有机靶的根据本发明的蛋白结构接触，然后用酶促标记的第二亲和配体检测和/或定量。之后，在适当的缓冲液中，将适当的底物与酶促标记反应产生化学部分，例如使用分光光度计、荧光计、光度计或通过可见手段检测和/或定量。
有机靶或第二亲和配体可用放射性同位素标记以使得能够检测和/或定量。本公开内容中适当的放射性标记的非限制性实例是3H、14C、32P、35S或125I。标记的亲和配体的比活性依赖于放射性标记的半衰期、同位素纯度，和标记如何被掺入亲和配体。亲和配体优选地使用公知技术标记(Wensel TG和Meares CF(1983)于:Radioimmunoimaging andRadioimmunotherapy(Burchiel SW和Rhodes BA编著)Elsevier,New York,pp185-196中)。如此放射性标记的亲和配体可用于通过检测放射性显现有机靶。放射性核素扫描可用以下进行，例如，γ射线照相机、磁共振光谱学、发射断层照相术、γ射线/β射线计数器、闪烁计数器和放射照相术。
如此，可向蛋白结构施加样品以检测、分离和/或定量有机靶。这一程序使得能够不仅检测有机靶，而且另外可显示其分布和相对水平。任选地，可从亲和性介质释放有机靶并收集。如此，用途可包括在其上已经固定有机靶的亲和性介质上亲和纯化。蛋白结构可例如布置在柱中或多孔板(诸如96孔板)中、或在磁珠、琼脂糖珠或sepharose珠上。另外，用途可包括蛋白结构在可溶基质上的用途，例如使用葡聚糖基质，或在表面等离子共振仪器诸如BiacoreTM仪器中的用途，其中分析可例如包括监测对固定的有机靶或多种可能的亲和配体的亲和性。
根据本发明的蛋白结构可被洗涤并用多种清洁剂，包括酸、碱和离液剂再生。尤其有用的清洁剂包括NaOH，诸如0.1、0.5或1M NaOH，和脲，诸如6-8M脲。由于根据本发明的蛋白结构令人惊讶地耐受化学处理和/或灭菌性热处理，包括使用蛋白结构的根据本发明的方法可包括再生蛋白结构的最终步骤。方法优选地包括通过化学处理和/或灭菌性热处理再生亲和性介质的最终步骤。优选地，化学处理包括用NaOH，诸如0.1、0.5或1M NaOH、和/或脲，诸如6-8M脲处理。
根据本发明的融合蛋白还可被允许在溶液中结合有机靶，即，在允许融合蛋白聚合并形成蛋白结构诸如膜、泡沫或纤维之前。拖丝蛋白衍生部分(例如，REP-CT)本身和掺入B部分的相应的融合蛋白二者聚合为固体结构，即使在污染蛋白存在时，而没有明显地将污染物掺入材料中，且功能(B)部分保留其预期的结合特征。因此，预计B部分的结合特征可用于从周围溶液捕获化合物或细胞，并将捕获的化合物或细胞掺入根据本发明的蛋白结构之中或之上。
如此，在根据本发明的另一优选的方法中，当将亲和性介质与样品接触以实现亲和性介质与有机靶之间的结合时，亲和性介质中的融合蛋白在溶液中存在。然后允许融合蛋白结合有机靶的复合体形成根据本发明的融合蛋白结构。
当目的是从溶液"捞出"特定分子或细胞时，这一方法可以是尤其有用的，例如，在分泌了靶蛋白时从大规模真核细胞生产***的培养基获得靶分子。由于由拖丝蛋白衍生部分结合靶分子和形成固体结构可以在生理条件发生且由于拖丝蛋白衍生部分是细胞相容的，该方法可重复地应用于进行中的生产过程。
根据本发明的蛋白结构还可用于细胞的分离、固定和/或培养。在这方面尤其有用的蛋白结构是膜、纤维或泡沫，参见例如，实施例14和23。膜是有利的，因为其粘附于固体结构，例如，微量滴定板中的塑料制品。膜的这一特征有助于洗涤和再生程序，对于分离目的是非常有用的。
如此，本发明提供用于培养具有存在于细胞表面的有机靶的细胞的细胞支架材料。细胞支架材料包括根据本发明的蛋白结构。在某些实施方案中，细胞支架材料由根据本发明的蛋白结构构成。
本发明人已经发现，包括包含根据本发明的融合蛋白、和任选地由根据本发明的融合蛋白构成的聚合物的细胞支架材料提供在多种不同情况中培养细胞、优选地真核细胞的有益环境。此外，该环境使得能够建立以其他方式建立非常困难、非常昂贵或甚至不可能在实验室中培养的细胞培养物，并且用于建立对组织工程和/或移植有用的包含细胞的材料。
本发明还提供细胞、优选地真核细胞与根据本发明的细胞支架材料的组合。根据本发明的该组合可以各种不同的形式呈现，并被调整为适合特定情况的需要。应设想，例如，本发明的组合作为用于替代受损或患病组织中的细胞的含细胞植入物可以是有用的。
细胞支架材料可用于直接或间接地捕获细胞。在直接捕获中，B部分能够与存在于细胞表面上的有机靶选择性相互作用。可选地，B部分能够与中间有机靶（intermediateorganic target）选择性相互作用并结合，且中间有机靶能够与存在于细胞表面上的有机靶选择性相互作用。如此，在间接捕获中，细胞支架材料还包含中间有机靶，且B部分能够与所述中间有机靶选择性相互作用并结合。反过来，中间有机靶能够与存在于细胞表面上的有机靶选择性相互作用。
在本文公开的细胞支架材料的一个实施方案中，所述融合蛋白还包含寡肽细胞结合基序。结合某些情况中某些细胞的培养，已发现寡肽细胞结合基序的存在提高或维持细胞存活，且认为将该基序作为蜘蛛丝蛋白的一部分纳入到细胞支架材料中提供另外的益处。细胞结合基序是通过至少一个肽键偶联到融合蛋白的剩余部分的寡肽。例如，其可被偶联到融合蛋白的剩余部分的N端或C端，或蜘蛛丝蛋白的剩余部分的氨基酸序列内的任何位置。关于寡肽细胞结合基序的选择，技术人员知晓几种替代方案。例如，所述寡肽可包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：RGD、IKVAV、YIGSR、EPDIM和NKDIL。RGD、IKVAV和YIGSR是常用的细胞结合基序，而EPDIM和NKDIL已知为角质形成细胞特异性基序，其在培养角质形成细胞的背景中可能是特别有用的。其他有用的细胞结合基序包括来自弹性蛋白原的GRKRK、KYGAASIKVAVSADR(层粘连蛋白衍生的)、NGEPRGDTYRAY(来自骨唾液蛋白)、PQVTRGDVFTMP(来自玻连蛋白)、和AVTGRGDSPASS(来自纤连蛋白)。可由技术人员使用标准的基因工程或化学偶联技术容易地实现寡肽细胞结合基序与蜘蛛丝蛋白的剩余部分的偶联。因此，在某些实施方案中，细胞结合基序通过基因工程引入，即，在编码融合蛋白和细胞结合基序的核酸之间形成部分基因融合。作为这些实施方案的一个额外的有益特征，细胞结合基序将与组成细胞支架材料的聚合物中的融合蛋白单体以1:1的比例存在。
用于本文描述的方法或组合中的细胞支架材料中的聚合物可采取多种物理形态，且特定物理形态的使用可在不同的具体情况中提供另外的优点。例如，在这些方法或组合的实施方案中，所述细胞支架材料处于选自由膜、泡沫、纤维和纤维网（fiber-mesh）组成的组的物理形态。
因此，本发明提供用于固定细胞的方法。提供包含目标细胞的样品例如，生物样品，诸如血液。生物样品可以是较早获得的样品。如果在方法中使用较早获得的样品，方法的步骤都不是对人类或动物体进行的。
在允许细胞支架材料与存在于目标细胞表面上的有机靶之间选择性相互作用的适当条件下，将样品施加于根据本发明的细胞支架材料。允许细胞通过细胞表面上的有机靶与所述细胞支架材料之间的结合固定于所述细胞支架材料。在适当条件下去除未结合的样品以维持细胞支架材料与有机靶之间的选择性结合。这一方法产生展示被固定于细胞支架材料、具体地固定于根据本发明的蛋白结构的有机靶的细胞。
如上所述，细胞支架材料可用于直接或间接地捕获细胞。在直接捕获中，B部分能够与存在于细胞表面上的有机靶选择性相互作用。可选地，B部分能够与中间有机靶选择性相互作用并结合，且中间有机靶能够与存在于细胞表面上的有机靶选择性相互作用。如此，在间接捕获中，细胞支架材料还包含中间有机靶，且B部分能够与所述中间有机靶选择性相互作用并结合。反过来，中间有机靶能够与存在于细胞表面上的有机靶选择性相互作用。
无论捕获方法，可通过裂解融合蛋白以从细胞支架材料释放参与细胞捕获的部分，从融合蛋白释放捕获的细胞。如上所述，融合蛋白可在其氨基酸序列中包括允许裂解并去除相关部分，通常是B部分或细胞结合基序的裂解位点。多种裂解位点是本领域技术人员已知的，例如，针对化学剂的裂解位点，例如Met残基之后的CNBr裂解位点和Asn-Gly残基之间的羟胺裂解位点，针对蛋白酶例如凝血酶或蛋白酶3C的裂解位点，和自我剪接序列，例如内蛋白自我剪接序列。
本发明还提供用于培养细胞的方法。使用上文公开的方法将目标细胞固定于细胞支架材料。在适于细胞培养的条件下保持细胞支架材料与固定的细胞的组合。
在本发明的上下文中，术语细胞的“培养”、“细胞培养”等应被广义地理解，使得它们包括例如细胞***和/或增殖的情况，细胞被保持在保留了该细胞类型当存在于其天然环境时所显示出的至少一种功能特征的分化状态的情况以及干细胞被保持在未分化状态的情况。
以下将通过下列非限制性实例进一步说明本发明。
实施例
实施例1-IgG-结合融合蛋白的克隆、表达和纤维形成
为了证明融合蛋白概念，产生了与Z蛋白结构域(B部分)融合的Rep4CT蛋白(具有4个内部重复段的REP部分和CT部分)。Z结构域是葡萄球菌蛋白A的免疫球蛋白G(IgG)结合结构域B的工程化形式，并是结合IgG的可结晶片段(fragment crystallisable，Fc)区域的58个氨基酸长的三螺旋基序。我们的目的是研究是否可能从Z结构域与Rep4CT融合组成的融合蛋白(标为His6ZQGRep4CT，SEQ ID NO:14)产生结构，诸如纤维、膜和薄膜，并仍保持结构域Z的IgG-结合能力、以及Rep4CT的结构形成特征。为了如此，克隆了由N端融合于Rep4CT的Z结构域组成的融合蛋白。
克隆
编码His6ZQGRep4CT融合蛋白的基因(SEQ ID NO:14-15)如下构建。设计引物以从包含此类Z序列的载体产生结构域Z的PCR片段。而且，引物包含在Z与Rep4CT之间的蛋白酶3C裂解的识别位点(LEALFQGP，标为QG)。然后用限制性内切核酸酶NdeI和EcoRI处理所得的PCR产物、以及靶载体(标为pT7His6TrxHis6QGRep4CT，包含卡那霉素抗性基因)。在限制性裂解靶载体后，将TrxHis6QG部分切下。在T4DNA连接酶的帮助下将裂解的PCR片段与靶载体连接在一起，接着将所得的、正确连接的载体(pT7His6ZQGRep4CT)转化到化学感受态的大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)细胞，允许该细胞在补充有卡那霉素(70μg/ml)的琼脂板上生长。之后挑取菌落，PCR筛选正确的***物，随后还测序证实***靶载体的ZQG的DNA序列。
产生
将具备pT7His6ZQGRep4CT载体的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在30℃在补充有卡那霉素(70μg/ml)的Luria-Bertani培养基(共6升)中生长至OD600值为1-1.5，随后用300μΜIPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)诱导His6ZQGRep4CT表达，在20℃另外培养大约2h。然后，通过在4700rpm离心20min来收获细胞，将所得的细胞团溶解在20mM Tris(pH8.0)中。
纯化
对20mM Tris(pH8.0)中溶解的细胞团补充溶菌酶和DNA酶I以裂解细菌细胞，从而在15000rpm离心30min后回收细胞溶解产物。然后，将回收的细胞溶解产物分开并上样到共四种Chelating Sepharose Fast Flow Zn2+柱上，经由His6标签保持His6ZQGRep4CT蛋白结合于柱基质。洗涤后，用20mM Tris/300mM咪唑(pH8.0)洗脱结合的蛋白。按照A280测量，汇集的洗脱级分包含27mg的His6ZQGRep4CT蛋白。然后，将汇集的洗脱液体分为相等的两半(每个中13.5mg His6ZQGRep4CT)，其中将第一半对5升20mM Tris(pH8.0)透析过夜，浓缩到1.07mg/ml并最终允许形成纤维。图3显示宏观的His6ZQGRep4CT纤维。从这一融合蛋白(SEQID NO:14)形成纤维说明，Z结构域(B部分)不干扰Rep4CT(REP和CT部分)的纤维形成特征。在透析和浓缩后，用蛋白酶3C裂解之前His6ZQGRep4CT蛋白的量是10mg(图4)。
用补充有1mM二硫苏糖醇(DTT)的1.34mg蛋白酶3C裂解汇集的洗脱液的第二半，从Rep4CT分离His6Z。在对20mM Tris(pH8.0)透析下进行裂解过夜，随后允许蛋白溶液通过Ni-NTA琼脂糖柱，收集包含Rep4CT的流通级分，浓缩到0.79mg/ml并允许形成纤维。裂解后Rep4CT的最终量是6mg(图4)。
图4显示来自融合蛋白His6ZQGRep4CT(SEQ ID NO:14)的纯化和其随后的蛋白酶3C裂解产物Rep4CT(SEQ ID NO:14的残基81-339)的SDS-PAGE凝胶。凝胶按照以下顺序上样：
(1)Spectra多色宽范围蛋白梯（Multicolor Broad Range Protein Ladder）,Fermentas
(2)细胞溶解产物
(3)来自上样到Chelating Sepharose Fast Flow Zn2+柱的细胞溶解产物的流通液
(4)来自Chelating Sepharose Fast Flow Zn2+柱的His6ZQGRep4CT的汇集的洗脱液
(5)用蛋白酶3C裂解的His6ZQGRep4CT
(6)来自上样到Ni-NTA琼脂糖柱的裂解的His6ZQGRep4CT的流通液
(7)用5ml20mM Tris/500mM咪唑(pH8.0)再生Ni-NTA琼脂糖柱。
His6ZQGRep3CT、His6Z、Rep4CT和蛋白酶3C的分子量分别是32kDa、9kDa、23kDa和30kDa。
尽管Rep4CT已被融合于另一蛋白，即，具有对IgG的结合亲和性的58个氨基酸长的Z结构域，但是能够获得His6ZQGRep4CT(SEQ ID NO:14)的宏观纤维的事实，证明Rep4CT尽管融合于Z结构域(SEQ ID NO:14的残基13-70)，仍保持其纤维形成特征。而且，融合蛋白的Z结构域表现为对His6ZQGRep4CT赋予良好的溶解性。
实施例2-生物素化的IgG对融合蛋白纤维的结合
为了进一步证明融合蛋白概念，研究了融合蛋白结构中的B部分是否保持其与有机靶选择性相互作用的能力。在这一研究中，评价了融合蛋白His6ZQGRep4CT(SEQ ID NO:14)的纤维中Z结构域(B部分)结合IgG的能力。将生物素化的兔IgG的溶液与His6ZQGRep4CT纤维一起培养，随后将相同的纤维在溶液中与链霉亲和素官能化的珠一起培养，其后在光显微镜中观察纤维。使用在兔中制备的IgG的选择回到以下事实：来自兔的IgG以强的亲和性结合Z结构域。
将如实施例1中所述地制备的大约50mm长的His6ZQGRep4CT纤维浸入包含50μl1×PBS/0.5%牛血清白蛋白和10μl0.5mg/ml在兔中产生的生物素化的IgG(抗大鼠IgG(H+L),小鼠吸附的,Vector Laboratories,Inc.)的结合溶液，在室温培养75min，伴随轻微摇动。丢弃上清液，在60μl1×PBS/0.07%Tween20中洗涤纤维三次。接着，将纤维浸入包含40μl1×PBS/0.5%牛血清白蛋白和20μl10mg/ml Dynabeads M-280链霉亲和素(Dynal AS)的溶液，再次在室温培养75min，伴随轻微摇动。丢弃上清液，在60μl1×PBS/0.07%Tween20中洗涤纤维三次。
为了得到Dynabeads与纤维非特异性结合的指示，将另一个His6ZQGRep4CT纤维浸入仅如上所述的Dynabeads溶液，而没有之前用生物素化的IgG的培养。用Rep4CT型纤维进行以上对His6ZQGRep4CT所述的相同程序，所有纤维在USB显微镜中以固定的500×放大倍数观察。
图5是结合生物素化的兔IgG、随后链霉亲和素官能化的Dynabeads后，His6ZQGRep4CT和Rep4CT纤维的可视化。图(A、B)显示首先用生物素化的IgG(在兔中产生的)培养，随后用Dynabeads M-280链霉亲和素培养的His6ZQGRep4CT纤维的在沿着纤维的不同位置拍摄的两张代表性照片(2.8μm)。图(C、D)显示仅浸入Dynabeads M-280链霉亲和素，而没有之前用IgG培养的另一个His6ZQGRep4CT纤维的两张代表性照片。Rep4CT纤维的相应照片分别显示在图(E、F)和(G、H)。所有照片都用USB显微镜以固定的500×放大倍数拍摄，Dynabeads在照片中表现为深灰色点。
在图5中，看起来Dynabeads几乎仅在图A和B中观察到，这两张照片显示经受生物素化的IgG、随后链霉亲和素官能化的Dynabeads的His6ZQGRep4CT纤维。这一结果是指，在His6ZQGRep4CT中，融合蛋白中Z结构域的相当大部分在纤维形成后保持了其IgG结合能力。
实施例3-纯的IgG和血清IgG对融合蛋白纤维和膜的结合
为了进一步证明融合蛋白结构中B部分与有机靶选择性相互作用的能力，研究了融合蛋白His6ZQGRep4CT(SEQ ID NO:14)中的结构域Z结合IgG的能力。将这一融合蛋白的纤维和膜用来结合纯化的IgG和来自血清的IgG，随后洗脱并随后在SDS-PAGE上分析，其中在非还原性条件下IgG表现为～146kDa条带。血清是血液凝结后剩余的液相，血清的两种主要组成成分是白蛋白和IgG。例如，在兔血清中，IgG的浓度是5-10mg/ml且白蛋白的甚至更高。纯化的IgG和血清都是兔来源的。
His6ZQGRep4CT的膜通过在24孔组织培养板的单独孔底部在室温空气干燥100μl蛋白溶液(0.96mg/ml)过夜来制备。然后成型的膜在+4℃储存18天，浸入20mM Tris(pH8.0)的标为"T膜"，不浸入任何液体的标为"A膜"。图6显示从亲水的24孔组织培养板的孔底部制备的成型的His6ZQGRep4CT膜的部分。为了捕获照片，使用倒置光显微镜的2×放大倍数。如实施例1中所述地制备融合蛋白的纤维，并在+4℃储存在20mM Tris(pH8.0)中直到使用。
进行两种平行的实验设置。在第一设置中，在室温将His6ZQGRep4CT制成的T膜、A膜和纤维的三个重复浸入500μl50μg/ml纯化的兔IgG(从汇集的兔血清纯化,VectorLaboratories,Inc.)1h，伴随轻微摇动。在另一种设置中，代替地在室温将相同类型的His6ZQGRep4CT膜和纤维的三个重复浸入500μl热灭活、离心的兔血清(NationalVeterinary Institute,Uppsala,Sweden)的5倍稀释液也1h，伴随轻微摇动。从所有纤维和膜丢弃上清液，随后在500μl20mM Tris(pH8.0)中洗涤三次。来自纯化的IgG或来自血清的结合的IgG，通过在500μl0.5M乙酸/1M脲/100mM NaCl(pH2.7)中培养30min来洗脱。如上所述对His6ZQGRep4CT纤维和A膜的相同程序也对His6TrxHis6QGRep4CT和作为对照的Rep4CT的膜和纤维进行。用SDS-PAGE在非还原性条件下分析洗脱的级分(图7-9)。
图7显示非还原性SDS-PAGE凝胶。洗脱的级分如下上样到泳道中：
(1-3)His6TrxHiS6QGRep4CT，A膜，用兔IgG培养
(4-6)His6TrxHis6QGRep4CT，A膜，用兔血清培养
(7-8)His6TrxHis6QGRep4CT，纤维，用兔IgG培养
(9)Spectra多色宽范围蛋白梯，Fermentas
(10-11)His6TrxHis6QGRep4CT，纤维，用兔血清培养
(12-14)His6ZQGRep4CT，T膜，用兔IgG培养
(15-17)His6ZQGRep4CT，T膜，用兔血清培养。
图8显示另一种非还原性SDS-PAGE凝胶。洗脱的级分按照以下上样：
(1-3)His6ZQGRep4CT，A膜，用兔IgG培养
(4-6)His6ZQGRep4CT，A膜，用兔血清培养
(7-9)His6ZQGRep4CT，纤维，用兔IgG培养
(10)Spectra多色宽范围蛋白梯，Fermentas
(11-13)His6ZQGRep4CT，纤维，用兔血清培养
(14-16)Rep4CT，A膜，用兔IgG培养。
图9显示另一种非还原性SDS-PAGE凝胶。洗脱的级分按照以下上样：
(1-3)Rep4CT，A膜，用兔血清培养
(4-6)Rep4CT，纤维，用兔IgG培养
(7)Spectra多色宽范围蛋白梯，Fermentas
(8-10)Rep4CT，纤维，用兔血清培养
(11)培养中使用的纯化的兔IgG(50μg/ml)
(12)培养中使用的兔血清(1:50稀释)。
图7-9中的结果显示，所有类型的His6ZQGRep4CT基质，即，膜(A型和T型)和纤维具有经由Z结构域结合IgG(纯化的或来自血清的)的能力。而且，暴露于兔血清的His6ZQGRep4CT基质表现为不结合除了IgG以外的任何血清级分。除了暴露于血清的Rep4CT的纤维显示IgG(～146kDa)和白蛋白(～70kDa)区中的弱的条带，使用的另两种蛋白变体的基质(即，His6TrxHis6QGRep4CT和Rep4CT)表现为完全不结合任何物质。评价融合蛋白His6ZQGRep4CT(SEQ ID NO:14)中Z结构域的IgG结合能力的这一方法是Z结构域在纤维和膜形式二者的融合蛋白中是活性的的强的指示。没有观察到兔血清中IgG以外的其他级分结合His6ZQGRep4CT。
实施例4-纯的IgG和血清IgG对融合蛋白纤维和膜的结合再现性
为了研究IgG结合融合蛋白His6ZQGRep4CT(SEQ ID NO:14)的膜和纤维的再现性，再次进行了实施例3中的实验。再次使用实施例3中使用的His6ZQGRep4CT、His6TrxHis6QGRep4CT和Rep4CT的相同纤维和膜。在进行了之前的实验后，在+4℃将所有纤维和膜材料浸入20mM Tris(pH8.0)中70天。实验如实施例3中所述地进行。用SDS-PAGE在非还原性条件下分析洗脱的级分(图10-12)。
图10显示非还原性SDS-PAGE凝胶。洗脱的级分按照以下上样：
(1-3)His6TrxHis6QGRep4CT，A膜，用兔IgG培养
(4-6)His6TrxHis6QGRep4CT，A膜，用兔血清培养
(7-8)His6TrxHis6QGRep4CT，纤维，用兔IgG培养
(9)Spectra多色宽范围蛋白梯，Fermentas
(10-11)His6TrxHis6QGRep4CT，纤维，用兔血清培养
(12-14)His6ZQGRep4CT，T膜，用兔IgG培养
(15-17)His6ZQGRep4CT，T膜，用兔血清培养。
图11显示另一个非还原性SDS-PAGE凝胶。洗脱的级分按照以下上样：
(1-3)His6ZQGRep4CT，A膜，用兔IgG培养
(4-6)His6ZQGRep4CT，A膜，用兔血清培养
(7-9)His6ZQGRep4CT，纤维，用兔IgG培养
(10)Spectra多色宽范围蛋白梯，Fermentas
(11-13)His6ZQGRep4CT，纤维，用兔血清培养
(14-16)Rep4CT，A膜，用兔IgG培养。
图12显示非还原性SDS-PAGE凝胶。洗脱的级分按照以下上样：
(1-3)Rep4CT，A型膜，用兔血清培养
(4-6)Rep4CT，纤维，用兔IgG培养
(7)Spectra多色宽范围蛋白梯，Fermentas
(8-10)Rep4CT，纤维，用兔血清培养
(11)空孔
(12)培养中使用的纯化的兔IgG(50μg/ml)
(13)培养中使用的兔血清(1:50稀释)。
所有三种蛋白基质(即，His6ZQGRep4CT、His6TrxHis6QGRep4CT和Rep4CT)的IgG结合模式对应于在实施例3中观察到的，而对用兔血清培养的His6ZQGRep4CT纤维观察到对应白蛋白的相当弱的条带(～70kDa)。这一初始的IgG结合再现性研究显示，His6ZQGRep4CT的纤维和膜二者对于结合和洗脱纯化的IgG和血清IgG可以使用至少两次。再现性的进一步研究在实施例19中报告。
实施例5-IgG对融合蛋白基质和商业蛋白A基质的结合
His6ZQGRep4CT融合蛋白结构的IgG结合能力通过与市售蛋白A基质(蛋白ASepharose CL-4B,GE Healthcare)比较来评价。在旋转柱内制备His6ZQGRep4CT(SEQ IDNO:14)的纤维和膜。还将蛋白A基质加到旋转柱（spin column），其方式是附加于基质的蛋白A分子的总数等于His6ZQGRep4CT膜中Z分子的总数。允许发生纯化的IgG和来自血清的IgG与His6ZQGRep4CT的膜和纤维、以及与蛋白A基质的结合，随后洗脱和其后在SDS-PAGE上分析。
His6ZQGRep4CT的膜通过在旋转柱(SigmaPrepTM Spin Columns,Sigma)内聚乙烯熔块（polyethylene frit）的底部在室温空气干燥100μl蛋白溶液(1.05mg/ml)三天来制备，得到共3×10-9摩尔His6ZQGRep4CT/膜。此外，将His6ZQGRep4CT的纤维放置在相同类型旋转柱内的熔块上。对Rep4CT的膜和纤维进行相同程序，其中膜包含共4×10-9摩尔Rep4CT/膜。对于商业蛋白A基质，将对应3×10-9摩尔蛋白A的排干的基质体积（drained matrixvolume）转移到熔块/旋转柱，从而用1×500μl加上2×150μl去离子水洗涤基质，随后以400rcf离心旋转柱1.5min。
对His6ZQGRep4CT和Rep4CT的纤维和膜、以及蛋白A基质进行两种平行的实验设置。在第一设置中，在室温将所有三种不同基质的两个重复浸入500μl50μg/ml纯化的兔IgG(从兔血清纯化的IgG,Sigma)1h。在另一种设置中，代替地在室温将相同三种类型的基质的两个重复浸入500μl离心的兔血清(正常兔血清,Invitrogen)的5倍稀释液也1h。
通过简单移液从所有纤维和膜丢弃上清液，对于蛋白A基质通过离心(400rcf,1.5min)，随后在500μl20mM Tris(pH8.0)中洗涤三次。来自纯化的IgG或来自血清的结合的IgG，通过在500μl0.5M乙酸/1M脲/100mM NaCl(pH2.7)中培养30min来洗脱。用SDS-PAGE在非还原性条件下分析洗脱的级分(图13-15)，并标为来自运行1。洗脱后紧接着，用3×500μl20mM Tris(pH8.0)洗涤所有基质，随后重复刚才描述的实验一次来评价IgG结合的再现性。来自重复实验的洗脱的级分标为来自运行2。注意：在非还原性SDS-PAGE条件下，IgG的分子量是大约146kDa。
图13显示来自运行1的洗脱的级分的非还原性SDS-PAGE凝胶，按照以下上样：
(1)培养中使用的纯化的兔IgG(50μg/ml)
(2)培养中使用的兔血清(1:50稀释)
(3-4)His6ZQGRep4CT，膜，用兔IgG培养
(5-6)His6ZQGRep4CT，膜，用兔血清培养
(7-8)Rep4CT，膜，用兔IgG培养
(9)Spectra多色宽范围蛋白梯，Fermentas
(10-11)Rep4CT，膜，用兔血清培养
(12-13)蛋白A Sepharose CL-4B基质，用兔IgG培养
(14-15)蛋白A Sepharose CL-4B基质，用兔血清培养
(16-17)His6ZQGRep4CT，纤维，用兔IgG培养。
图14显示来自运行1和运行2二者的洗脱的级分的非还原性SDS-PAGE凝胶，按照以下上样：
(1-2)His6ZQGRep4CT，纤维，用兔血清培养，运行1
(3-4)Rep4CT的两个重复，纤维，用兔IgG培养，运行1
(5-6)Rep4CT的两个重复，纤维，用兔血清培养，运行1
(7)Spectra多色宽范围蛋白梯，Fermentas
(8)培养中使用的纯化的兔IgG(50μg/ml)
(9)培养中使用的兔血清(1:50稀释)
(10-11)His6ZQGRep4CT，膜，用兔IgG培养，运行2
(12-13)His6ZQGRep4CT，膜，用兔血清培养，运行2
(14-15)Rep4CT，膜，用兔IgG培养，运行2
(16-17)Rep4CT，膜，用兔血清培养，运行2。
图15显示都来自运行2的洗脱的级分的非还原性SDS-PAGE凝胶，按照以下上样：
(1-2)蛋白A Sepharose CL-4B基质，用兔IgG培养
(3-4)蛋白A Sepharose CL-4B基质，用兔血清培养
(5-6)His6ZQGRep4CT，纤维，用兔IgG培养
(7)Spectra多色宽范围蛋白梯，Fermentas
(8-9)His6ZQGRep4CT，纤维，用兔血清培养
(10-11)Rep4CT，纤维，用兔IgG培养
(12-13)Rep4CT，纤维，用兔血清培养。
图13-15中的结果显示，基质选择性结合来自血清的IgG。所有类型的His6ZQGRep4CT基质即膜和纤维的IgG结合能力在与商业蛋白A基质相同的范围中。类似于商业蛋白A基质，融合蛋白结构可被再生并保持结合能力。
实施例6-融合蛋白基质和商业蛋白A基质的就地清洗(CIP)
为了评价在洗脱后沉淀或变性的物质是否保持附加于His6ZQGRep4CT(SEQ ID NO:14)和Rep4CT制成的蛋白结构和商业蛋白A基质(蛋白A Sepharose CL-4B,GEHealthcare)，对在实施例4-5的实验中使用的暴露于兔血清的所有基质用8M脲进行就地清洗(CIP)。
在室温将此前都暴露于兔血清的来自实施例4和实施例5的His6ZQGRep4CT和Rep4CT制成的纤维和膜、和来自实施例5的商业蛋白A基质浸入200μl8M脲20min，随后去除上清液，然后在SDS-PAGE上以非还原性条件分析脲级分(图16-17)。
图16显示来自经受两次兔血清的用8M脲就地清洗基质的非还原性SDS-PAGE凝胶。凝胶按照以下上样：
(1)兔血清(1:50稀释)
(2)空孔
(3-5)His6ZQGRep4CT，T膜，来自实施例4
(6-8)His6ZQGRep4CT，A膜，来自实施例4
(9)Spectra多色宽范围蛋白梯，Fermentas
(10-12)His6ZQGRep4CT，纤维，来自实施例4
(13-15)Rep4CT，A膜，来自实施例4
(16)Rep4CT，纤维，来自实施例4
(17)空孔。
图17显示来自经受两次兔血清的用8M脲就地清洗基质的第二非还原性SDS-PAGE凝胶。凝胶按照以下上样：
(1)兔血清(1:50稀释)
(2)空孔
(3-4)Rep4CT，纤维，来自实施例4
(5-6)His6ZQGRep4CT，膜，来自实施例5
(7)Rep4CT，膜，来自实施例5
(8)Spectra多色宽范围蛋白梯，Fermentas
(9)Rep4CT，膜，来自实施例5
(10-11)His6ZQGRep4CT，纤维，来自实施例5
(12-13)Rep4CT，纤维，来自实施例5
(14-15)蛋白A Sepharose CL-4B基质，来自实施例5
(16-17)空孔。
图16-17中的结果表示，在洗脱和清洗后，仅少量的沉淀或变性的物质保持附加于融合蛋白结构。具体地，在与商业蛋白A基质相同范围中的仅少量的沉淀或变性的物质保持附加于His6ZQGRep4CT融合蛋白的膜。
实施例7-白蛋白结合融合蛋白的克隆、表达和纤维形成
为了进一步证明融合蛋白概念，产生了与来自链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域(Abd)融合的Rep4CT。Abd是结合白蛋白的5-kDa的三螺旋基序。为了如此，克隆了由N端融合于Rep4CT的Abd结构域组成的融合蛋白(标为His6AbdQGRep4CT)(SEQ ID NO:16-17)。
克隆
设计引物以从包含此类序列的载体产生Abd的PCR片段。而且，引物包含在Abd与Rep4CT之间的蛋白酶3C裂解位点，标为QG。然后用限制性内切核酸酶NdeI和EcoRI处理所得的PCR产物、以及靶载体，标为pT7His6TrxHis6QGRep4CT(包含卡那霉素抗性基因)。在限制性裂解靶载体后，将TrxHis6QG部分切下。在T4DNA连接酶的帮助下将裂解的PCR片段与靶载体连接在一起，接着将所得的、正确连接的载体(pT7His6AbdQGRep4CT)转化到化学感受态的大肠杆菌BL21(DE3)细胞，允许该细胞在补充有卡那霉素的琼脂板上生长。之后挑取菌落，PCR筛选正确的***物，随后还测序。
产生
将具备pT7His6AbdQGRep4CT载体的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在30℃在补充有卡那霉素的Luria-Bertani培养基(共6升)中生长至OD600值为1-1.5，随后用IPTG诱导His6AbdQGRep4CT表达，在20℃另外培养大约2h。然后，通过离心来收获细胞，将所得的细胞团溶解在20mM Tris(pH8.0)中。
纯化
对20mM Tris(pH8.0)中溶解的细胞团补充溶菌酶和DNA酶I以完全裂解细菌细胞，从而在15000rpm离心后回收上清液。然后，将回收的上清液上样到Ni IMAC柱或ChelatingSepharose Fast Flow ZN柱上，经由His6标签保持His6AbdQGRep4CT蛋白结合于基质。洗涤后，用20mM Tris/300mM咪唑(pH8.0)洗脱结合的蛋白。将包含His6AbdQGRep4CT(SEQ ID NO:16)的汇集的洗脱级分对5升20mM Tris(pH8.0)透析，浓缩，获得4mg蛋白的最终量。
纤维和膜形成
从纯化的、可溶的Abd-Rep4CT蛋白，在蛋白浓度0.87mg/ml成功制备纤维和膜二者。
尽管Rep4CT已被融合于另一蛋白，即白蛋白结合结构域(Abd)，但是获得Abd-Rep4CT的宏观纤维和膜的事实，证明Rep4CT尽管融合于Abd结构域，仍保持其纤维形成特征。然后，目的是揭示Abd结构域当融合于Rep4CT时是否保持其白蛋白结合能力，参见实施例24和25。
实施例8-IgG结合融合蛋白的克隆、表达和纤维形成
为了进一步证明融合蛋白概念，产生与来自链球菌蛋白G的IgG结合结构域C2融合的Rep4CT。C2包含55个氨基酸，结构由以下构成：两个β-发夹缔合形成四链的混合反平行/平行β-片层，具有位于跨片层的一个面的单个α-螺旋。为了如此，克隆了由N端融合于Rep4CT的C2结构域组成的融合蛋白(标为His6C2QGRep4CT)(SEQ ID NO:18-19)。
克隆
设计引物以从包含此类序列的载体产生C2的PCR片段。而且，引物包含在C2与Rep4CT之间的蛋白酶3C裂解位点，标为QG。然后用限制性内切核酸酶NdeI和EcoRI处理所得的PCR产物、以及靶载体，标为pT7His6TrxHis6QGRep4CT(包含卡那霉素抗性基因)。在限制性裂解靶载体后，将TrxHis6QG部分切下。在T4DNA连接酶的帮助下将裂解的PCR片段与靶载体连接在一起，接着将所得的、正确连接的载体(pT7His6C2QGRep4CT)转化到化学感受态的大肠杆菌BL21(DE3)细胞，允许该细胞在补充有卡那霉素的琼脂板上生长。之后挑取菌落，PCR筛选正确的***物，随后还测序。
产生
将具备pT7His6C2QGRep4CT载体的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在30℃在补充有卡那霉素的Luria-Bertani培养基(共6升)中生长至OD600值为1-1.5，随后用IPTG诱导His6C2QGRep4CT表达，在20℃另外培养大约2h。然后，通过离心来收获细胞，将所得的细胞团溶解在20mM Tris(pH8.0)中。
纯化
对20mM Tris(pH8.0)中溶解的细胞团补充溶菌酶和DNA酶I以完全裂解细菌细胞，从而在15000rpm离心后回收上清液。然后，将回收的上清液上样到Ni IMAC柱上，经由His6标签保持His6C2QGRep4CT蛋白结合于基质。洗涤后，用20mM Tris/300mM咪唑(pH8.0)洗脱结合的蛋白。将包含His6C2QGRep4CT的汇集的洗脱级分对5升20mM Tris(pH8.0)透析，浓缩，获得6mg蛋白的最终量。
纤维和膜形成
从纯化的、可溶的C2-Rep4CT蛋白，在蛋白浓度0.87mg/ml成功制备纤维和膜二者。尽管Rep4CT已被融合于另一蛋白，即IgG结合结构域C2，但是获得C2-Rep4CT的宏观纤维和膜的事实，证明Rep4CT尽管融合于C2结构域，仍保持其纤维形成特征。然后，目的是揭示C2结构域当融合于Rep4CT时是否保持其IgG结合能力，参见实施例26和27。
实施例9-生物素结合融合蛋白的克隆、表达和膜和纤维形成
链霉亲和素是四个相同单体的四聚体，每个单体具有一个结合位点。其显示对生物素(维生素H)高的亲和性，达到Kd～10-15M的解离常数，使其成为基本上不可逆的结合事件。链霉亲和素还在蛋白酶存在时、在高温和在变性剂中、以及在极端pH值显示高稳定性(Wilchek,M.等人,Anal.Biochem.171:1-32(1988))。如此，这一相互作用在包括蛋白标记、分离和靶向的许多应用中是有吸引力的。在实践中，现在，利用生物素化的接头分子容易地促进生物素化，生物素化的接头分子还容纳攻击和桥连生物素于不同生物分子例如蛋白和DNA的多种反应性有机分子之中的一种。然而已经证明包被有链霉亲和素的高密度官能表面的产生难以实现，参见例如，表4。为了在结合可逆性是必要的应用(例如，纯化期间)中减少结合强度和为了能够在大肠杆菌中成功表达可溶的蛋白，已经开发了链霉亲和素的一种单体变体M4(Wu.S.-C.等人,Protein Expres.Purif.46,268-273(2006))。与野生型四聚体链霉亲和素的单体相比，M4具有四个氨基酸取代(V55T、T76R、L109T和V125R)，这保持M4为活性的单体形式。
由重组技术将M4N或C端融合于Rep4CT(SEQ ID NO:20-21)。所得的蛋白和编码其的基因分别称为M4Rep4CT(SEQ ID NO:22-23)、modM4Rep4CT(SEQ ID NO:24-25)和Rep4CTM4(SEQ ID NO:26-27)。M4Rep4CT与modM4Rep4CT之间的差异是M4与Rep4CT之间接头区域中Gly取代为Arg-Ala-Arg。所有蛋白都表达为融合于His6-Trx-His6标签，其在纯化期间被切下和去除。
所有蛋白的产生和纯化基本如Stark,M.等人,Biomacromolecules8,1695-1701(2007)和Hedhammar M.等人,Biochemistry47,3407-3417(2008)中所述地进行。Rep4CTM4、M4Rep4CT和modM4Rep4CT的蛋白浓度在280nm利用53860M-1cm-1的摩尔消光系数测量。对纯化的蛋白样品进行还原性SDS-PAGE，且蛋白纯度在用考马斯亮蓝R-250染色凝胶后确定。所有纯化的蛋白的理论分子量和其他相关的物理特征列在表3。
表3-表达的蛋白的物理参数
*理论值
从Rep4CTM4、M4Rep4CT和modM4Rep4CT融合蛋白的每一种形成了膜和纤维二者。这些结果证实，Rep4CT尽管融合于M4，但是保持其自组装为固体结构的能力。这还证实，有可能获得蛋白的纤维和膜，在该蛋白中M4利用不同长度的接头融合于Rep4CT。
实施例10-含生物素的靶对融合蛋白纤维和膜的结合
(A)生物素化的Atto-565对Rep4CTM4膜的结合.
通过在室温在透明或黑色96孔微量滴定板的孔的底部干燥25μl蛋白溶液，允许Rep4CTM4(SEQ ID NO:26)和Rep4CT(SEQ ID NO.20，对照)形成膜。使用前，在室温储存板一至两周。在室温用100μl PBS(pH7.4)中1%BSA培养各孔>1小时以避免非特异性结合。背景值如下获得：通过在添加生物素化的Atto-565之前，测量在50μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中具有各自蛋白Rep4CT或Rep4CTM4的膜的孔中的荧光强度。孔用50μl生物素化的Atto-565(SigmaAldrich,Germany)溶于PBS(pH7.4)中的1%BSA中的80μΜ溶液另外培养。允许混合物在室温静置2至3小时，随后用包含0.05%Tween-20的PBS(PBS-T)洗涤两次并用PBS一次。向孔加入50μl PBS后在Tecan Infinite M200读板仪(λex=565nm,λem=590nm)中读取所得的荧光强度。
在PBS中准备连续稀释，以三个重复将不同浓度生物素化的Atto-565的50μl样品加到具有各自膜的孔，然后记录来自孔的所得的荧光强度。
在图18中，在用生物素化的Atto-565浸泡并洗涤后，用Nicon Eclipse Ti-S荧光显微镜(λex=509-550nm和λem=570-614nm)以2x放大倍数观察来自蛋白膜的荧光强度。添加生物素化的Atto-565后Rep4CTM4膜(图A)和Rep4CT膜(图B)之间荧光强度的差异是明显的。
为了确定结合Rep4CTM4膜的生物素化的Atto-565的总量，利用已知量的生物素化的Atto-565的连续稀释记录荧光强度。以这种方式，来自具有已知量的(以摩尔计)生物素化的Atto-565的样品(以三个重复，在具有Rep4CTM4的孔中)的荧光强度用于获得标准曲线。对应背景值(无生物素化的Atto-565的Rep4CTM4膜)的所得的荧光强度值和与加入孔的三种浓度的生物素化的Atto-565关联的数据点显示在图19中的图中。图19中图下方的表格显示对荧光强度值线性回归获得的值，以及在具有相同浓度生物素化的Atto-565的n=3个孔中测量的标准偏差。
从生物素化的Atto-565对Rep4CTM4膜的结合实验所得的荧光强度值开始(图20)，这些值用于计算对应获得的荧光强度的生物素化的Atto-565的摩尔量。将所得的荧光值在图20中绘图，图A和B展示向具有Rep4CT(A)和Rep4CTM4(B)的膜的孔添加生物素化的Atto-565之前(-)和之后(+)的值。图C显示向Rep4CT或Rep4CTM4的膜添加生物素化的Atto-565后所得的荧光强度的比较。对于Rep4CT膜，之前和之后的值没有显著(ns)差异(图A)。对于Rep4CTM4，添加生物素化的Atto-565值之前和之后之间(图B；P<0.01)、和各蛋白之间(图C；P<0.0001)的显著差异，由统计检验证实。图20中的条表示n=10个膜的荧光强度值之间的标准偏差。
计算从结合实验获得的生物素化的荧光团/表面积比。对于大约28mm2的表面积，2.1pmol生物素化的Atto-565结合于Rep4CTM4膜。这导致结合的生物素/表面积为0.073pmol/mm2(表5)。
(B)生物素化的辣根过氧化物酶(HRP)对Rep4CTM4膜的结合
由于其相对高稳定性和在非发色底物和过氧化物的转化中产生发色产物，在诸如ELISA、Western点杂交和免疫组织化学的应用中，HRP通常用于偶联于第二抗体或结合分子(例如，生物素)。为了确定生物素化的HRP结合由Rep4CTM4(SEQ ID NO:26)和Rep4CT(SEQ IDNO:20；对照)制成的膜的总量，允许生物素化的HRP结合每种各自的膜。利用已知量的底物在570nm记录产物形成的速率。产物试卤灵的摩尔消光系数从制造商(Invitrogen)获得，声称为54000cm-1M-1。
允许在透明96孔微量滴定板的孔底部的Rep4CTM4和Rep4CT的蛋白溶液(25μl)完全干燥，从而形成膜。孔用100μl PBS(pH7.4)中1%BSA培养>1小时，随后用50μl PBS(pH7.4)中1%BSA中的0.3mg/ml生物素化的HRP(Invitrogen,Camarillo,CA)培养>1小时。孔其后用PBS-T洗涤两次，用PBS洗涤一次。反应通过在室温添加50μl50μΜ Amplex red溶液(Invitrogen)和溶于0.2%BSA、28mM NaCl、0.54mM KCl、0.3mM KH2PO4、42mM Na2HPO4(pH7.4)的2mM过氧化氢来开始。动力学测量在Tecan Infinite M200读板仪上进行。
已知量的生物素化的HRP(溶液中游离的)用于确定哪种量的HRP导致与对膜上的生物素化的HRP测量的产物形成相同速率。由溶液(pH7.4)中游离的生物素化的HRP催化的50μΜ Amplex red和2mM过氧化氢向产物试卤灵的所得的反应速率，显示在图21中的图中。数据点与用相同浓度的生物素化的HRP的三个重复测量相关。图21中图下方的表格显示从对数据线性回归获得的值。图21中的条表示从相同浓度生物素化的HRP的n=3个孔中测量的标准偏差。图21中所得的标准曲线和斜率用于计算结合于融合蛋白膜的生物素化的HRP的量。
用生物素化的HRP培养融合蛋白和对照的膜的孔中，50μΜ Amplex red和2mM H2O2的催化反应速率显示在图22。图21和22中的反应速率表示为每分钟形成以μΜ计的试卤灵，利用由Invitrogen提供的消光系数(54000cm-1M-1)计算。条表示在n=8个孔测量的反应的标准偏差。图22显示用Rep4CTM4包被的孔和对照Rep4CT包被的孔之间产物形成速率(因此以及结合的生物素化的HRP)的显著差异。确定0.2pmol HRP/mm2结合于Rep4CTM4膜(表5)。
(C)与商业产品的比较
已经证明包被有链霉亲和素的高密度官能表面的产生难以实现。市售板的生物素结合能力列在表4中。
表4-市售板的生物素结合能力
a由制造商声称的生物素结合能力
b基于由制造商声称的包被体积计算
cHBC=高结合能力.
d限值基于声称的8kDa生物素化的分子的检测范围计算.
e利用MW=120kDa基于生物素化的抗体的声称的结合计算.
从实施例10A中生物素化的Atto-565和实施例10B中生物素化的HRP的结合实验获得的生物素化的荧光团/表面积比概述在表5中。Rep4CTM4(SEQ ID NO:26)的膜上两种不同生物素化的分子的密度是0.073-0.2pmol/mm2。
表5-M4融合蛋白的膜的生物素结合能力
表4-5中的结果表示，由具有M4部分的融合蛋白制成的膜提供与商业替代品相同范围中的生物素结合密度，无论生物素是否偶合于小(荧光团)或大(蛋白)分子。
统计
GraphPad Prism4.0(GraphPad Software,San Diego,CA)用于数据的统计分析。在实施例10A中，非参数的成对Wilcoxon检验用于比较向从Rep4CT或Rep4CTM4形成的膜添加生物素化的Atto-565之前和之后的荧光值。另外，非参数的不成对Mann Whitney U检验用于比较使用Rep4CT或Rep4CTM4膜培养生物素化的Atto-565后孔中的荧光强度，还比较从实施例10B中用生物素化的HRP培养的膜上测量获得的[试卤灵]/min值。P-值<0.05认为是显著的。
实施例11-生物素化的抗体和第二抗体对融合蛋白纤维和膜的结合
试验Rep4CT(SEQ ID NO:20，对照)和modM4Rep4CT(SEQ ID NO:24)的膜和纤维对兔来源的生物素化的抗体的结合能力。膜在8×1或12×1孔带(孔是与96孔微量滴定板形式相等的大小)中形成。
用PBS(pH7.4)中的1%BSA预培养膜和纤维后，用蛋白结构(膜/纤维)培养生物素化的抗体(兔)>1h，随后添加用125I放射标记的第二抗兔抗体。洗涤膜和纤维。在γ射线计数器中对单独的膜或单独的纤维进行γ辐射的检测。准备已知量的125I标记的抗体的连续稀释，测量辐射以获得标准曲线，从其可计算结合融合蛋白膜和纤维的生物素化的抗体的量。
实施例12-融合蛋白的纯膜的制备
利用25μl RepCT4M4(SEQ ID NO:26)在10-20μΜ的浓度将膜成型。允许100μl PBS(pH7.4)在孔中与膜培养一小时。除去这一溶液，加入50μl六氟异丙醇(HFIP)以破裂膜和溶解蛋白。向另外的膜加入相同量的HFIP，而没有之前用PBS的洗涤。允许HFIP对四个膜作用3.5h，将所得的清澈HFIP溶液转移到包含50μl20%SDS的Eppendorf管。蒸发管中的水，将其余的内容物溶于60μl10mM Tris-HCl(pH8.0)中，并对其进行还原性SDS-PAGE。
结果显示在图23。泳道1对应于SpectraTM多色宽范围蛋白梯(Fermentas)中的蛋白。数字对应于蛋白大小。泳道2对应于加入HFIP之前未用PBS浸泡的纯化的Rep4CTM4膜。泳道3对应于已经用PBS浸泡一小时、随后除去这一溶液、其后加入HFIP的Rep4CTM4膜。
尽管一些蛋白与Rep4CTM4蛋白共纯化(泳道2,图23)，用100μl PBS培养一小时溶解了污染蛋白，留下仅由Rep4CTM4蛋白构成的膜，如由还原性SDS-PAGE判断的(泳道3,图23)。如此，大多数污染蛋白被聚合过程本身除去，由融合蛋白制成的蛋白结构中任何剩余的杂质可通过用含水缓冲液中轻柔洗涤来容易地去除。
实施例13-溶液中有机靶的捕获
将ZRep4CT蛋白溶液(～1mg/ml)加入由血清组成的样品，藉以允许样品中的IgG分子结合溶液中融合蛋白的Z部分。使混合物经受疏水/亲水界面，这导致融合蛋白/IgG复合体的Rep4CT部分形成膜或泡沫，留下其他血清蛋白在溶液中并将IgG捕获到固体结构上。
可选地，允许混合物在固体支持物上干燥，形成具有固定的IgG的膜。用缓冲液例如PBS洗涤该膜以溶解和除去污染蛋白。
可选地，通过提供疏水-亲水界面并使混合物经受剪切力来形成纤维。融合蛋白/IgG复合体的Rep4CT部分聚合为宏观纤维，留下其他蛋白在溶液中。
可收集形成的固体结构(膜、泡沫或纤维)，并可在适当的洗脱缓冲液中回收IgG(例如，通过降低pH到2.7)。洗脱的蛋白在SDS-PAGE上鉴定。还参见实施例22。
实施例14-用于细胞捕获的融合蛋白支架
(A)眼睛前房中非粘附细胞的体内研究
允许用针对CD45或CD34的IgG培养ZRep4CT纤维/膜/泡沫。将白细胞捕获到具有针对CD45的IgG的ZRep4CT支架，将肥大细胞捕获到具有针对CD34的IgG的ZRep4CT支架。允许细胞固定于支架。将细胞和融合蛋白支架移植到裸小鼠眼睛的前房中。经目窗（eye window）体内检查细胞。
(B)非粘附细胞的体外研究
将肥大细胞和白细胞生长在分别具有针对CD34和CD45的IgG的ZRep4CT支架上，然后体外监测。一些细胞在发育期间的一个阶段是非粘附的，例如，能够以群生长的神经干细胞。在神经群中，细胞停留在未分化形式。神经干细胞在具有针对神经干细胞上的细胞受体的IgG的ZRep4CT支架上以群生长。
(C)特定细胞的选择
ZRep4CT支架(膜/泡沫/纤维)用于经由特定抗体筛选细胞。肥大细胞以两步骤程序筛选。步骤1：将细胞结合到具有针对CD34的IgG的ZRep4CT支架。步骤2：在具有针对C-kit受体的IgG的ZRep4CT支架上筛选肥大细胞。
(D)在ZRep4CT上生长的真核细胞中的蛋白产生
用于蛋白产生的许多细胞衍生自非粘附细胞系。然而，当使用粘附细胞时大规模生产在许多方面被促进，例如物理分离被促进。通过使用具有针对细胞受体的IgG的ZRep4CT支架，可以以粘附的方式进行非粘附细胞的生长。
实施例15-脲处理对IgG结合Z-Rep4CT的影响的研究
在这里评价脲处理Z-Rep4CT膜和纤维对IgG结合的影响。Z-Rep4CT的膜和纤维用脲处理，随后结合来自兔血清的IgG。洗脱结合的IgG并由SDS-PAGE分析。
Z-Rep4CT的纤维和膜，在实施例6中观察到其结合来自兔血清的IgG，用8M脲处理(200μl8M脲,20min,室温)，在室温与500μl兔血清(1:5稀释)培养1h。Rep4CT(SEQ ID NO:20)的膜和纤维用作对照材料，以相同方式处理。用600μl PBS洗涤三次后，通过用洗脱缓冲液(0.5M乙酸、1M脲、100mM NaCl)降低pH到大约2.7，洗脱结合的IgG到500μl，随后洗脱的级分由非还原性SDS-PAGE分析(未显示)。
从凝胶推断，用8M脲处理后，Z-Rep4CT的膜和纤维保持其对IgG的结合能力。Rep4CT的对照膜和纤维不显示任何IgG结合。
实施例16-NaOH处理对IgG结合Z-Rep4CT的影响的研究
为了进一步评价对清洗条件的耐久性，评价NaOH处理Z-Rep4CT(SEQ ID NO:14)的膜和纤维对IgG结合的影响。来自实施例4和5的Z-Rep4CT的纤维和膜，在实施例6中观察到其结合来自兔血清的IgG，用8M脲处理(200μl8M脲,20min,室温)，现在用1M NaOH(500μl1MNaOH,20min,室温)进一步处理。Rep4CT(SEQ ID NO:20)的膜和纤维用作对照材料，以相同方式处理。在NaOH处理后，在室温与500μl兔血清(1:5稀释)培养膜和纤维1h。用600μlPBS洗涤三次后，通过用洗脱缓冲液(即，0.5M乙酸、1M脲、100mM NaCl)降低pH到大约2.7，洗脱结合的IgG到500μl，随后洗脱的级分由非还原性SDS-PAGE分析(未显示)。
从凝胶推断，用1M NaOH处理后，Z-Rep4CT的膜和纤维保持其对IgG的结合能力。Rep4CT的对照膜和纤维不显示任何IgG结合。
实施例17-结合于Z-Rep4CT膜的IgG-HRP的定量
(A)Z-Rep4CT膜与IgG-HRP的结合
为了定量IgG对Z-Rep4CT的结合，将辣根过氧化物酶(HRP)偶联的IgG(IgG-HRP)结合到Z-Rep4CT膜。
Z-Rep4CT(SEQ ID NO:14)和Rep4CT(对照，SEQ ID NO:20)的膜以不同浓度(0.011-890pmol)在96孔板中成型。在室温用100μl1%BSA封闭膜1h。然后在室温在50μl IgG-HRP(即，34pmol IgG-HRP，兔来源IgG)中培养膜1h，用100μl0.05%Tween洗涤膜两次，随后用100μl PBS最后洗涤。为了测量结合膜的IgG-HRP，每次向一个膜加入50μl50μΜ Amplex Red/2mM H2O2，随后在Tecan读板仪监测570nm的吸光度三分钟。还在与对膜相同类型的板中测量可溶的IgG-HRP的连续稀释(0.05-0.5pmol)，通过用100μl1%牛血清白蛋白(BSA)封闭孔1h，随后添加20μl可溶的IgG-HRP、20μl125μΜ Amplex Red和10μl9.79mM H2O2。对膜和连续稀释进行三个重复测量。
线性回归拟合使用Tecan软件对每个单独测量进行，对应于在570nm的吸光度(Abs570/min)的线性区域相对于时间的粗的数据图。斜率对应于无色底物向有色产物的HRP转化速率，并与结合的IgG-HRP分子的数目成比例。
对于每个单独的三个重复，计算结合的IgG-HRP的量(pmol)的平均值和标准偏差。图24A显示结合于不同蛋白浓度的Z-Rep4CT和Rep4CT膜的IgG-HRP的量，图24B显示不同蛋白浓度的膜中具有结合的IgG-HRP的Z-Rep4CT和Rep4CT分子的比例。
对于包含1.1pmol蛋白和更多蛋白的膜，Z-Rep4CT膜比相应的Rep4CT对照膜结合显著更多的IgG-HRP。这些膜中具有结合的IgG-HRP的Z-Rep4CT分子的比例是大约～7%或更少。
(B)NaOH处理Z-Rep4CT膜后与IgG-HRP的结合
为了研究NaOH处理对IgG结合Z-Rep4CT膜的影响，将IgG-HRP结合到NaOH处理的膜并检测结合的IgG-HRP的量。
具有来自实施例17(A)的结合的IgG-HRP的Z-Rep4CT(SEQ ID NO:14；1.1-890pmol)和Rep4CT(SEQ ID NO:20,108pmol)的膜在室温在100μl洗脱缓冲液(pH2.7)中培养1h以除去结合的IgG-HRP。接着，在室温在100μl1M NaOH中培养膜20-30min，随后在150μlPBS中洗涤两次。然后用1%BSA封闭包含膜的孔，用IgG-HRP(34pmol)培养并洗涤三次，随后添加50μΜ Amplex Red/2mM H2O2，然后监测在570nm的吸光度，如以上在(A)中列出的。对于每个单独的三个重复，计算结合的IgG-HRP的量(pmol)的平均值和标准偏差。
图25A显示结合于不同蛋白浓度的Z-Rep4CT和Rep4CT膜的IgG-HRP的量，图25B显示不同蛋白浓度的膜中具有结合的IgG-HRP的Z-Rep4CT和Rep4CT分子的比例。图26显现在NaOH处理之前和之后结合Z-Rep4CT和Rep4CT膜的IgG-HRP的量。
108pmol Z-Rep4CT膜显示比相应的Rep4CT膜显著更多的结合，且IgG-HRP与NaOH处理的膜的Z-Rep4CT结合的量显示随着膜中蛋白的量增加而增加的趋势。看起来，与未处理的膜相比，结合Z-Rep4CT膜的IgG-HRP的量被严酷的1M NaOH处理减少大约2-4倍。
实施例18-结合于Z-Rep4CT膜的IgG-荧光团的定量
轭合于荧光团的IgG的结合对包含不同量蛋白的Z-Rep4CT和Rep4CT膜进行。
Z-Rep4CT(SEQ ID NO:14)和Rep4CT(对照，SEQ ID NO:20)在不同浓度(0.011-890pmol)的膜如实施例17列出地准备和封闭。然后在室温在50μlIgG-荧光团(100pmolIgG-荧光团,兔来源IgG,荧光团:Alexa Fluor633)中培养膜1h，随后用100μl0.05%Tween洗涤膜两次，随后用100μl PBS最后洗涤。荧光测量前，向每个膜加入100μl PBS。
还在与对膜相同类型的板中测量可溶的IgG-荧光团的连续稀释(0-1pmol)，通过用100μl1%牛血清白蛋白(BSA)封闭孔1h，随后添加100μl可溶的IgG-荧光团。在Tecan读板仪设备(激发：632nm,发射：660nm,放大：200)上以三个重复测量膜和连续稀释的荧光。
对于每个单独的三个重复，对具有0.011-55pmol蛋白的膜计算结合的IgG-荧光团的量(pmol)的平均值和标准偏差(图27A)。还计算结合IgG-荧光团的Z-Rep4CT和Rep4CT分子的比例(图27B)。
可推断，IgG-Alexa Fluor633对Z-Rep4CT膜比对相应的Rep4CT对照膜有显著更多的结合。观察到0.011-11pmol Z-Rep4CT膜的IgG-荧光团结合无显著差异，这看起来不是因为单独Z-Rep4CT膜在这一波长的自动荧光(数据未显示)。结合包含多于55pmol蛋白的Z-Rep4CT膜的IgG-荧光团不能以任何可靠方式计算，因为来自它们的荧光信号在校准曲线以外。
通过比较Z-Rep4CT膜结合的IgG-荧光团的量与实施例17中IgG-HRP的相应的结合，Z-Rep4CT表现为比结合IgG-HRP结合更多的IgG-荧光团(例如，对55和1.1pmol膜分别是～4和～6倍)，这可能是因为荧光团和HRP之间大小的差异。而且，结合IgG-荧光团的Z-Rep4CT分子的比例还表现为比IgG-HRP结合的增加。
实施例19-来自人类血浆的IgG对Z-Rep4CT膜的结合
在这一实验中，如实施例3所列地准备Z-Rep4CT(SEQ ID NO:14)的三个膜。所有膜在成型后在+4℃储存8个月，储存期间不浸入任何液体。在室温用500μl人类血浆(1:5稀释)培养每个Z-Rep4CT膜1h。用600μl PBS洗涤三次后，通过用洗脱缓冲液(0.5M乙酸、1M脲、100mM NaCl)降低pH到大约2.7，洗脱结合的IgG到500μl，随后洗脱的级分由非还原性SDS-PAGE分析(未显示)。Rep4CT(SEQ ID NO:20)的膜用作对照材料，以相同方式处理。
从凝胶明显的是，IgG(～146kDa)存在于从Z-Rep4CT膜洗脱的级分中，说明在+4℃储存8个月、不浸入任何液体后，Z-Rep4CT的膜保留结合来自人类血浆的IgG的能力。Rep4CT的对照膜在洗脱的级分中不显示任何IgG。这些发现扩展了在实施例4中报告的使用根据本发明的结构时的实验再现性的观察结果，还显示，该蛋白结构可结合人类IgG。
实施例20-来自人类血浆的IgG对高压处理的Z-Rep4CT纤维的结合
研究了高压处理灭菌后Z-Rep4CT结合IgG的能力。高压处理Z-Rep4CT纤维后，允许纤维结合来自人类血浆的IgG。将高压处理的纤维的IgG结合与非高压处理的纤维的IgG结合比较。
将两个大约相等大小的Z-Rep4CT(SEQ ID NO:14)纤维转移到包含20mM Tris(pH8)的两个试管中。然后一个纤维在121℃高压处理20min。两个Rep4CT(SEQ ID NO:20)纤维用作对照材料，以相同方式处理。
将纤维在室温与500μl人类血浆(1:5稀释)培养1h。用600μl PBS洗涤三次后，通过用洗脱缓冲液(0.5M乙酸、1M脲、100mM NaCl)降低pH到大约2.7，洗脱结合的IgG到500μl，随后洗脱的级分由非还原性SDS-PAGE分析(图28)。
图28中所示的凝胶按照以下上样：
(1)人类血浆(1:5)，上样1.4μl
(2)Z-Rep4CT，非高压处理的纤维，上样14μl
(3)Z-Rep4CT,高压处理的纤维，上样14μl
(4)Rep4CT，非高压处理的纤维，上样14μl
(5)Rep4CT，高压处理的纤维，上样14μl
(6)分子量标志。
未高压处理的和高压处理的Z-Rep4CT纤维二者显示清楚的大约146kDa的IgG条带。这些IgG条带的强度没有明显差异，说明高压处理对IgG结合能力几乎没有影响。未高压处理的和高压处理的Rep4CT纤维在洗脱的级分中都不显示任何IgG。所有纤维显示另外的、弱的多的白蛋白条带(～50-60kDa)。
实施例21-Z-Rep4CT纤维的蛋白酶3C裂解
Z-Rep4CT蛋白(完全蛋白结构是His6-Z-LEALFQGP-Rep4CT；SEQ ID NO:14)在Z结构域和Rep4CT区段之间包含蛋白酶3C识别位点(LEALFQGP，蛋白酶3C在氨基酸Q和G之间裂解)。
将任意大小的Z-Rep4CT纤维转移到Eppendorf管，蛋白酶裂解通过添加9.6g蛋白酶3C和0.35μl1M DTT(二硫苏糖醇)至总体积为350μl来开始。允许裂解在+4℃继续24h，随后从裂解上清液取出样品用于SDS-PAGE。然后允许裂解继续另外24h(+4℃)，此时从裂解上清液取出第二样品用于SDS-PAGE。然后由SDS-PAGE分析取出的两种样品(图29)。
图29中所示的凝胶按照以下上样：
(1),分子量标志
(2),用蛋白酶3C裂解Z-Rep4CT纤维24h的上清液
(3),用蛋白酶3C裂解Z-Rep4CT纤维48h的上清液。
从图29可以看出，用蛋白酶3C裂解Z-Rep4CT纤维后的两种上清液包含两个明显的条带。第一条带略微低于35kDa，对应于蛋白酶3C(～31kDa)，而第二条带位于刚好高于10kDa。由于蛋白酶3C裂解Z-Rep4CT将产生对应(i)His6-Z-LEALFQ(～9kDa)和(ii)GP-Rep4CT(～23kDa)的两个寡肽区段，推断第二条带对应于切下的HZ片段(9kDa)。因此推断蛋白酶3C裂解位点可用于裂解Z-Rep4CT纤维，且因此，可除去HZ部分。
实施例22-在IgG存在下可溶的Z-Rep4CT的纤维形成
当混合可溶的Z-Rep4CT与IgG时，IgG结合Z结构域的动力学应当比Z-Rep4CT纤维的形成快。研究了即使大多数Z结构域被IgG占据时，形成纤维的可能性。
在IgG存在时的纤维形成
以上述的相同方式进行Z-Rep4CT(SEQ ID NO:14)的纯化，将纯化的蛋白溶液浓缩到2.2mg/ml。纤维形成在四种不同条件进行，都以总纤维形成体积3ml，包含71nmole可溶的Z-Rep4CT蛋白。第一条件仅包括Z-Rep4CT；第二条件是Z-Rep4CT与纯化的兔IgG(Z-Rep4CT与IgG相比8倍过量)混合；第三条件是Z-Rep4CT与兔血清(血清IgG与Z-Rep4CT相比～1.5倍过量)混合；第四条件是Z-Rep4CT与兔血清(Z-Rep4CT与血清IgG相比～7倍过量)混合。允许纤维形成在室温持续3天。
3天纤维形成后，条件1、2和4的纤维已经形成。对于条件4，除了形成的纤维以外，还形成了显著量的Z-Rep4CT蛋白聚集物。对于条件3，完全没有可见的纤维或聚集物。
从这里的一个结论可以是，如果存在许多其他生物分子，纤维形成是受损的，如在条件3的情形，遮掩单独的Rep4CT分子使彼此不能相互作用。其另一方面可以是，如果存在过多IgG，如在条件3的情形，Z-Rep4CT中的许多Z结构域可能结合IgG，具有结合的IgG的Z-Rep4CT的大比例可以阻止纤维形成。
从Z-Rep4CT纤维去除结合的IgG
回收在条件1、2和4制造的纤维、连同来自条件4的聚集物，并在20mM Tris(pH8)中洗涤。接着，将所有纤维和聚集物分为相等的两半，一半用于通过降低pH来洗脱结合的IgG，另一半用于用蛋白酶3C裂解。
将第一组纤维和聚集物转移到Eppendorf管，并向每个管加入144μl洗脱缓冲液(0.5M乙酸、1M脲、100mM NaCl),pH2.7。允许IgG的洗脱在室温继续30min，随后回收洗脱上清液并由SDS-PAGE分析(图30)。
向第二组纤维和聚集物加入包含DTT的144μl蛋白酶3C(即，110g蛋白酶3C)。允许蛋白酶3C裂解在+4℃继续过夜，随后回收裂解上清液并由SDS-PAGE分析(图30)。
图30展示从通过混合可溶的Z-Rep4CT与IgG形成的Z-Rep4CT纤维和聚集物取出的IgG的非还原性SDS-PAGE凝胶。凝胶按照以下上样：
(1)纯化的、可溶的Z-Rep4CT(2.2mg/ml)
(2)Z-Rep4CT纤维的低pH洗脱(条件1)
(3)Z-Rep4CT纤维的低pH洗脱(条件2)
(4)Z-Rep4CT纤维的低pH洗脱(条件4)
(5)Z-Rep4CT聚集物的低pH洗脱(条件4)
(6)分子量标志
(7)Z-Rep4CT纤维的蛋白酶3C裂解(条件1)
(8)Z-Rep4CT纤维的蛋白酶3C裂解(条件2)
(9)Z-Rep4CT纤维的蛋白酶3C裂解(条件4)
(10)Z-Rep4CT聚集物的蛋白酶3C裂解(条件4)。
[注意：His6Z、蛋白酶3C和兔IgG的分子量分别是9、30和～146kDa。]
从图30明显的是，从试验的所有纤维和聚集物回收了IgG，而不论其在哪种条件下形成。还参见实施例13。
实施例23-利用抗体结合将淋巴细胞捕获到Z-Rep4CT
利用Z-Rep4CT基质例如纤维和膜来结合IgG的Fc部分，打开了进一步结合特异性导向捕获的IgG的某物的可能性。一个吸引人的想法是，利用Z-Rep4CT基质上捕获的IgG作为细胞亲和配体，从包含许多不同细胞类型的生物样品分离某一细胞类型。为了试验这一细胞捕获方法，允许Z-Rep4CT纤维和膜结合特异性导向人类T淋巴细胞的细胞表面上的CD3分子的IgG。捕获的细胞由荧光显微镜术分析。
Z-Rep4CT(SEQ ID NO:14)的蛋白表达和纯化如上所述地进行。浓缩纯化的蛋白到～1mg/ml，随后纤维和膜按照以上陈述的程序制造(膜在24孔组织培养板中制造)。此外，Rep4CT(SEQ ID NO:20)对照纤维和膜以相同方式从～1mg/ml蛋白溶液制备。
为了将导向人类淋巴细胞的CD3分子的IgG捕获到基质上，在室温将纤维和膜浸入150μl1:20稀释的荧光团轭合的抗人类CD3IgG(针对人类CD3抗原的小鼠单克隆IgG2a,标记：Alexa Fluor488)1h。用300μl PBS(pH7.4)洗涤纤维和膜三次，随后用倒置Nikon EclipseTi荧光显微镜分析其IgG结合(在455-490nm激发,在500-540nm检测)。Z-Rep4CT的纤维和膜二者结合Alexa Fluor488轭合的IgG抗体，从而证实Z-Rep4CT中的Z结构域结合IgG的能力。未暴露于IgG的Z-Rep4CT基质在这一所选区域不显示任何荧光信号，Rep4CT的对照纤维和膜不显示任何荧光，即使暴露于IgG。
在室温在Ficoll-Paque密度梯度分离培养液中通过梯度离心(30min,400×g)从新鲜收集的人类外周血分离单核细胞(即，淋巴细胞和单核细胞)。离心后回收单核细胞级分，随后在PBS中洗涤两次，之后将细胞重悬在20ml RPMI/10%FCS培养基中。单核细胞耗竭通过转移细胞悬液到T-75组织培养烧瓶，随后在37℃培养90min来实现。单核细胞耗竭后，回收悬液中的细胞，计数淋巴细胞的总数为11×106。
为了将淋巴细胞结合于Z-Rep4CT(SEQ ID NO:14)基质，将淋巴细胞(1ml,～0.37×106细胞/ml)施加到纤维和膜，随后在+4℃培养30min(伴随轻微摇动)。接着，用3ml PBS/2%FCS(pH7.4)洗涤纤维和膜三次。在+4℃在2%PFA(多聚甲醛)中固定结合的细胞15min。通过在室温将具有结合的细胞的纤维和膜浸入200μl DAPI(1μg/ml)染色溶液5min，随后用300μlPBS洗涤三次，将细胞核染色。向每个纤维和膜加入300μl体积的PBS，然后利用倒置Nikon Eclipse Ti仪器荧光显微镜术分析(在380-395nm激发,在415-475nm检测)。
Z-Rep4CT纤维的照片(未显示)对于未暴露于抗人类CD3IgG抗体的纤维显示数个结合的淋巴细胞，而已经暴露于IgG的纤维表现为具有结合的更多的淋巴细胞。在Z-Rep4CT膜的情形中，对于暴露于IgG的膜染色的细胞是清楚可见的，但对于未暴露于IgG的膜也如此。然而，还对于膜，看起来在细胞结合之前暴露于抗人类CD3IgG的膜比在细胞结合之前未暴露于IgG的相应的膜具有更多结合的细胞。而且，Rep4CT(SEQ ID NO:20)的对照纤维和膜完全不显示任何淋巴细胞结合。
在这一实验中，已经由荧光显微镜术显示，Z-Rep4CT的纤维和膜，不同于Rep4CT的，具有结合荧光标记的IgG抗体即小鼠抗人类CD3IgG的能力。而且，Z-Rep4CT纤维和膜二者具有结合淋巴细胞的能力，而不论是否具有特异性识别人类T淋巴细胞的IgG抗体。这可暗示，Z结构域本身具有对人类淋巴细胞的某种亲和性。然而，当在细胞结合之前用IgG包被时，结合Z-Rep4CT基质的细胞的数目表现为略微增加。为了能够知晓结合的细胞是否是T型淋巴细胞，必须施加还针对人类CD3分子的第二抗体，以区分T淋巴细胞与其他类型的淋巴细胞(例如，B淋巴细胞和NK细胞)。
实施例24-来自人类血浆的白蛋白对Abd-Rep4CT膜的结合
为了评价膜中Abd结构域(SEQ ID NO:16中的残基13-58)的可及性、和Abd-Rep4CT膜结合白蛋白的能力，人类血浆用作白蛋白来源。洗脱结合的白蛋白并由SDS-PAGE分析。
在室温用500μl人类血浆(1:5稀释)培养实施例7中制备的六个Abd-Rep4CT(SEQID NO:16)的膜1h。用600μl PBS洗涤三次后，通过用洗脱缓冲液(0.5M乙酸、1M脲、100mMNaCl)降低pH到大约2.7，洗脱结合的白蛋白到500μl，随后洗脱的级分由非还原性SDS-PAGE分析(图31)。也在实施例7中制备的Rep4CT(SEQ ID NO:20)的膜用作对照材料，以相同方式处理。
图31中所示的凝胶按照以下上样：
(1)人类血浆(1:50)，上样0.7μl
(2-7)Abd-Rep4CT的六个重复，膜，上样14μl
(8)用人类血浆培养的空孔，上样14μl
(9)分子量标志
(10-12)Rep4CT的三个重复，膜，上样14μl。
所有六个Abd-Rep4CT膜具有来自人类血浆的结合的白蛋白(泳道2-7)。由于只有单个白蛋白条带(～60kDa)出现在这些Abd-Rep4CT膜的洗脱的级分中，它们表现为不非特异性地结合来自人类血浆的任何物质。Rep4CT的膜在洗脱的级分中不显示任何白蛋白(泳道10-12)。
为了研究膜的稳定性，再次试验已经用过一次(参见以上)、并在PBS(+4℃)中储存29天的Abd-Rep4CT膜的白蛋白结合能力。在室温用500μl人类血浆(1:5稀释)培养六个Abd-Rep4CT膜1h。用600μl PBS洗涤三次后，通过用洗脱缓冲液(0.5M乙酸、1M脲、100mM NaCl)降低pH到大约2.7，洗脱结合的白蛋白到500μl，随后洗脱的级分由非还原性SDS-PAGE分析(未显示)。Rep4CT的膜用作对照材料，以相同方式处理。
在PBS中储存29天后，所有六个Abd-Rep4CT膜保持结合来自人类血浆的白蛋白的能力。Rep4CT的膜在洗脱的级分中不显示任何白蛋白。
实施例25-Abd-Rep4CT膜的清洗
(A)Abd-Rep4CT膜的脲处理
在室温用500μl8M脲培养Abd-Rep4CT(SEQ ID NO:16)的膜(共六个膜，之前在实施例24中使用的)20min，随后在600μl PBS中洗涤三次。接着，在室温用500μl人类血浆(1:5稀释)培养膜1h。用600μl PBS洗涤三次后，通过用洗脱缓冲液(即，0.5M乙酸、1M脲、100mMNaCl)降低pH到大约2.7，洗脱结合的白蛋白到500μl，随后洗脱的级分由非还原性SDS-PAGE分析(未显示)。在用8M脲处理后，所有六个Abd-Rep4CT膜可仍然结合来自人类血浆的白蛋白。
(B)Abd-Rep4CT纤维和膜的NaOH处理
首先在室温用500μl人类血浆(1:5稀释)培养Abd-Rep4CT(SEQ ID NO:16)纤维1h。用600μl PBS洗涤三次后，通过用洗脱缓冲液(0.5M乙酸、1M脲、100mM NaCl)降低pH到大约2.7，洗脱结合的白蛋白到500μl，随后洗脱的级分由非还原性SDS-PAGE分析。对Rep4CT(SEQID NO:20)对照纤维进行相同程序。
对于NaOH处理，使用三组Abd-Rep4CT(SEQ ID NO:16)膜的三个重复：(i)此前用8M脲处理的膜(参见以上(A))，用1M NaOH处理，随后白蛋白结合；(ii)此前未使用的膜，用1MNaOH处理，随后白蛋白结合；和(iii)此前未使用的膜，仅分析白蛋白结合。以上用于白蛋白结合的Abd-Rep4CT纤维用1M NaOH处理，随后再次白蛋白结合。
对于NaOH处理，Abd-Rep4CT纤维和膜[膜组(i)和(ii)]在室温用500μl1M NaOH培养～20min，随后用600μl PBS洗涤三次。接着，在室温用500μl人类血浆(1:5稀释)培养纤维和所有三组的膜1h。用600μl PBS洗涤三次后，通过用洗脱缓冲液(0.5M乙酸、1M脲、100mMNaCl)降低pH到大约2.7，洗脱结合的白蛋白到500μl，随后洗脱的级分由非还原性SDS-PAGE分析(图32)。
图32中的凝胶按照以下上样：
(1)人类血浆(1:5)，上样1.4μl
(2-3、5)Abd-Rep4CT膜的三个重复，白蛋白结合前用8M脲和1M NaOH处理，上样14μl
(4)分子量标志
(6-8)Abd-Rep4CT膜的三个重复，白蛋白结合前未处理，上样14μl
(9-11)Abd-Rep4CT膜的三个重复，白蛋白结合前用1M NaOH处理，上样14μl
(12)Abd-Rep4CT纤维，白蛋白结合前未处理，上样14μl
(13)Abd-Rep4CT纤维，白蛋白结合前用1M NaOH处理，上样14μl
(14)Rep4CT纤维，白蛋白结合前未处理，上样14μl。
Abd-Rep4CT纤维在1M NaOH处理之前和之后清楚地结合白蛋白(～60kDa)(分别是泳道12和13)，而相应的未处理的Rep4CT纤维不显示任何白蛋白结合(泳道14)。所有Abd-Rep4CT膜显示白蛋白结合，在白蛋白结合之前未处理的膜与用1M NaOH处理的膜之间条带强度没有明显差异(分别是泳道6-8和9-11)。然而，在白蛋白结合之前用8M脲和1M NaOH二者处理的膜与其他两组膜相比，显示洗脱的白蛋白条带的强度的下降(泳道2、3和5)。
实施例26-兔和小鼠IgG对C2-Rep4CT膜和纤维的结合
如下分析C2-Rep4CT纤维和膜中C2结构域(SEQ ID NO:18中残基13-67)的可及性。在室温用500μl兔血清(1:5稀释)培养C2-Rep4CT(SEQ ID NO:18)的两个膜和一个纤维，而用500μl～50μg/ml小鼠IgG1(单克隆抗兔免疫球蛋白,小鼠IgG1同种型,小鼠腹水液)培养C2-Rep4CT(SEQ ID NO:18)的另两个膜和一个纤维1h。用600μl PBS洗涤三次后，通过用洗脱缓冲液(0.5M乙酸、1M脲、100mM NaCl)降低pH到大约2.7，洗脱结合的IgG到500μl，随后洗脱的级分由非还原性SDS-PAGE分析(图33)。Rep4CT(SEQ ID NO:20)的膜和纤维用作对照材料，以相同方式处理。
图33的凝胶按照以下上样：
(1)小鼠腹水液(同种型IgG1)
(2)兔血清(1:50)
(3-4)C2-Rep4CT的两个重复，膜，小鼠IgG1
(5、7)C2-Rep4CT的两个重复，膜，兔血清
(6)分子量标志
(8)C2-Rep4CT，纤维，小鼠IgG1
(9)C2-Rep4CT，纤维，兔血清
(10-11)Rep4CT的两个重复，膜，小鼠IgG1
(12)Rep4CT，膜，兔血清
(13)Rep4CT，纤维，兔血清
(14)Rep4CT，纤维，小鼠IgG1
[注意：在非还原性SDS-PAGE条件下，兔IgG是～146kDa且小鼠IgG是～160kDa。]
在SDS-PAGE上，来自腹水液的小鼠IgG1与C2-Rep4CT膜的结合在洗脱的级分中没有给出任何可检测的IgG条带(泳道3-4)，但C2-Rep4CT纤维表现为具有结合的小鼠IgG1(泳道8,小鼠IgG是～160kDa)。然而，C2-Rep4CT的膜(泳道5和7)和纤维(泳道9)二者显示结合来自兔血清的IgG。由于此次小鼠IgG1的来源是以腹水液的形式，可能是因为腹水中的某种物质以某种方式干扰C2与膜中IgG1的结合。Rep4CT的对照膜和纤维在洗脱的级分中不显示任何IgG(泳道10-14)。
实施例27-来自人类血浆的IgG对C2-Rep4CT膜的结合
为了进一步研究C2-Rep4CT结合IgG的能力，在室温用500μl人类血浆(1:5稀释)培养C2-Rep4CT(SEQ ID NO:18)、Z-Rep4CT(SEQ ID NO:14)和Rep4CT(SEQ ID NO:20)的每一种的两个膜1h。用600μl PBS洗涤三次后，通过用洗脱缓冲液(0.5M乙酸、1M脲、100mM NaCl)降低pH到大约2.7，洗脱结合的IgG到500μl，随后洗脱的级分由非还原性SDS-PAGE分析(图34)。
图34中的凝胶按照以下上样：
(1)人类血浆(1:5)，上样1.4μl
(2)分子量标志
(3-4)C2-Rep4CT的两个重复，膜，上样14μl
(5-6)Z-Rep4CT的两个重复，膜，上样14μl
(7-8)Rep4CT的两个重复，膜，上样14μl。
在图34中，可以看出，Z-Rep4CT膜具有来自人类血浆的清楚地结合的IgG(泳道5-6)。C2-Rep4CT膜也在洗脱的级分中显示较弱的IgG条带(泳道3-4)。Rep4CT的对照膜不显示来自人类血浆的IgG的结合(泳道7-8)。
实施例28-利用ATR-FTIR比较Z-Rep4CT和Rep4CT纤维和膜中的二级结构
Z结构域的二级结构以其活性构象是α-螺旋，而Rep4CT纤维的二级结构主要是β-片层类型。如果Z-Rep4CT纤维和膜中的Z结构域是正确地折叠的，人们将预计这些基质中与Rep4CT纤维和膜相比较高的α-螺旋含量。为了研究二级结构的差异，由光谱方法衰减全反射傅里叶变换红外光谱法(Attenuated Total Reflectance Fourier TransformInfraRed spectroscopy,ATR-FTIR)分析Z-Rep4CT和Rep4CT的纤维和膜，藉以可能区分α-螺旋(条带位置：1648-1657cm-1)与β-片层结构(条带位置：1623-1641、1674-1695cm-1)。
通过允许15μl蛋白溶液在室温空气干燥过夜，制造Z-Rep4CT(SEQ ID NO:14)的一个膜和Rep4CT(SEQ ID NO:20)的一个膜。对Z-Rep4CT和Rep4CT制造纤维，然后在室温在张力下空气干燥～30min。然后使用来自Bruker的铂ATR部件记录ATR-FTIR。纤维和膜二者的IR谱(未显示)显示，Z-Rep4CT具有比Rep4CT更高的α-螺旋含量，这表示存在正确折叠的Z结构域。这与根据本发明的Z-Rep4CT结构中的Z结构域保持功能性一致，参见例如实施例2-5、17-19和22-23。

Claims (33)

1.一种蛋白结构，所述蛋白结构能够与选自IgG的可结晶片段区域和包含IgG或其衍生物的分子组成的组的有机靶选择性相互作用，其中所述蛋白结构是由能够与所述有机靶选择性相互作用的重组融合蛋白作为重复结构单元组成的聚合物，所述重组融合蛋白由B部分、REP部分和CT部分组成，其中所述聚合物由多于100个融合蛋白结构单元组成，且其中：
所述B部分是多于30个氨基酸残基的非拖丝蛋白部分，所述B部分提供与所述有机靶选择性相互作用的能力，其中所述B部分是葡萄球菌蛋白A的Z结构域；
所述REP部分和所述CT部分提供形成聚合物的能力并且是SEQ ID NO:14的残基81-339；
其中所述重组融合蛋白选自由式B-REP-CT和REP-CT-B定义的蛋白组成的组；并且
其中所述蛋白结构是以选自由纤维、膜、泡沫、网状物、网、球和胶囊组成的组的物理形态。
2.根据权利要求1所述的蛋白结构，其中所述重组融合蛋白由式B-REP-CT定义。
3.根据权利要求1所述的蛋白结构，其中所述蛋白结构在至少两个维度上具有至少0.1μm的尺寸。
4.根据权利要求1所述的蛋白结构，其中所述CT部分是SEQ ID NO:7。
5.根据权利要要求1-4中任一项所述的蛋白结构，其中所述重组融合蛋白是氨基酸序列为SEQ ID NO:14的蛋白。
6.一种提供根据权利要求1-5任一项所述的蛋白结构的方法，所述蛋白结构展示对选自由IgG的可结晶片段区域和包含IgG或其衍生物的分子组成的组的有机靶的结合活性，所述方法包括以下步骤：
(a)提供权利要求1-5的任一项中定义的重组融合蛋白；
(b)将所述重组融合蛋白经受实现由所述重组融合蛋白组成的聚合物的形成的条件。
7.一种用于固定选自由IgG的可结晶片段区域和包含IgG或其衍生物的分子组成的组的有机靶的亲和性介质，所述亲和性介质包含权利要求1-5的任一项中定义的重组融合蛋白，其中所述B部分能够与所述有机靶选择性相互作用。
8.根据权利要求7所述的亲和性介质，所述亲和性介质包含根据权利要求1-5任一项所述的蛋白结构，所述蛋白结构是由所述重组融合蛋白组成的聚合物。
9.根据权利要求7-8任一项所述的亲和性介质，所述亲和性介质还包含所述有机靶，其中所述B部分能够与所述有机靶选择性相互作用并结合。
10.根据权利要求9所述的亲和性介质，其中所述有机靶能够与第二有机靶选择性相互作用。
11.根据权利要求8或10所述的亲和性介质，其中所述蛋白结构是以膜的物理形态。
12.一种用于培养细胞的细胞支架材料，所述细胞具有存在于所述细胞表面上的有机靶，所述细胞支架材料包含根据权利要求1-5任一项所述的蛋白结构，其中所述细胞支架材料还包含选自由IgG的可结晶片段区域和包含IgG或其衍生物的分子组成的组的中间有机靶，其中所述B部分能够与所述中间有机靶选择性相互作用并结合，且其中所述中间有机靶能够与存在于所述细胞表面上的所述有机靶选择性相互作用。
13.根据权利要求12所述的细胞支架材料，其中所述蛋白结构是以膜的物理形态。
14.细胞与根据权利要求12-13任一项所述的细胞支架材料的组合。
15.根据权利要求1-5任一项所述的蛋白结构在从样品分离选自由IgG的可结晶片段区域和包含IgG或其衍生物的分子组成的组的有机靶中的用途。
16.根据权利要求1-5任一项所述的蛋白结构在培养细胞中的用途。
17.一种从样品分离选自由IgG的可结晶片段区域和包含IgG或其衍生物的分子组成的组的有机靶的方法，所述方法包括以下步骤：
提供包含所述有机靶的样品；
提供根据权利要求7-11任一项所述的亲和性介质，其中所述亲和性介质能够与所述有机靶选择性相互作用；
在实现所述亲和性介质与所述有机靶之间的结合的适当条件下将所述亲和性介质与所述样品接触，从而提供固定的有机靶；和
除去未结合的样品。
18.根据权利要求17所述的方法，所述方法还包括将所述亲和性介质和所述固定的有机靶与另外的有机靶在实现这两个有机靶之间的结合的适当条件下接触的步骤，所述另外的有机靶能够与所述固定的有机靶选择性相互作用。
19.根据权利要求17-18任一项所述的方法，其中当将所述亲和性介质与所述样品接触以实现所述亲和性介质与所述有机靶之间的结合时，所述亲和性介质中的所述重组融合蛋白以如根据权利要求1-5任一项所述的蛋白结构存在。
20.根据权利要求17-18任一项所述的方法，其中当将所述亲和性介质与所述样品接触以实现所述亲和性介质与所述有机靶之间的结合时，所述亲和性介质中的所述重组融合蛋白在溶液中存在，且其中允许融合蛋白与所述有机靶结合的复合体形成根据权利要求1-5任一项所述的蛋白结构。
21.根据权利要求17-18任一项所述的方法，所述方法还包括检测所述亲和性介质上的所述固定的有机靶的存在的步骤。
22.根据权利要求21所述的方法，所述方法还包括定量所述亲和性介质上的所述固定的有机靶的存在的步骤。
23.根据权利要求17-18任一项所述的方法，所述方法还包括从所述亲和性介质释放和收集所述有机靶的步骤。
24.根据权利要求17-18任一项所述的方法，所述方法还包括通过化学处理和/或灭菌热处理再生所述亲和性介质的最后步骤。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述化学处理包括用NaOH和/或脲处理。
26.一种固定细胞的方法，所述方法包括
提供包含目标细胞的样品；
将所述样品应用到根据权利要求12-13任一项所述的细胞支架材料，其中所述细胞支架材料能够与存在于所述细胞表面上的有机靶选择性相互作用；和
通过所述细胞表面上的所述有机靶与所述细胞支架材料之间的结合，允许所述细胞固定于所述细胞支架材料。
27.一种培养细胞的方法，所述方法包括
根据权利要求26所述的方法固定目标细胞到细胞支架材料；和
在适合细胞培养的条件下保持已对其应用细胞的所述细胞支架材料。
28.根据权利要求17-18和25-27任一项所述的方法，其中所述蛋白结构是以膜、纤维或泡沫的物理形态。
29.一种重组融合蛋白，所述重组融合蛋白由SEQ ID NO:14组成。
30.一种分离的多核酸，所述多核酸选自由编码根据权利要求29所述的重组融合蛋白的核酸和SEQ ID NO:15组成的组。
31.一种产生重组融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在适当的宿主中表达根据权利要求29所述的重组融合蛋白；和
b)获得包含所述重组融合蛋白的混合物。
32.根据权利要求31所述的方法，所述方法还包括分离所述重组融合蛋白的步骤。
33.权利要求1-5的任一项中定义的重组融合蛋白用于产生能够与选自由IgG的可结晶片段区域和包含IgG或其衍生物的分子组成的组的有机靶选择性相互作用的蛋白结构的用途，其中所述蛋白结构是由所述重组融合蛋白组成的聚合物。
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