DE69231946T2

DE69231946T2 - Protein-induzierende morphogenese

Info

Publication number: DE69231946T2
Application number: DE69231946T
Authority: DE
Inventors: M. Cohen; Thangavel Kuberasampath; Hermann Oppermann; H. Pang; C. Rueger
Original assignee: Curis Inc
Current assignee: Stryker Corp
Priority date: 1991-03-11
Filing date: 1992-03-11
Publication date: 2002-04-04
Anticipated expiration: 2012-03-12
Also published as: ATE203166T1; WO1992015323A1; EP0575555A4; EP0575555A1; GR3036950T3; AU1754392A; DE69231946D1; ES2161693T3; DK0575555T3; AU660019B2; JP3627985B2; EP0575555B1; JPH06506360A

Description

Ausgangspunkt der Erfindung

Die Zelldifferenzierung ist die zentrale Charakteristik der Morphogenese, die im Embryo beginnt und bis zu verschiedenen Graden während des gesamten Lebens eines Organismus bei der Reparatur bzw. Heilung von adultem Gewebe und bei Regenerationsmechanismen fortläuft. Der Grad der Morphogenese in adultem Gewebe variiert zwischen verschiedenen Geweben und betrifft u. a. den Grad des Zellumsatzes in einem gegebenen Gewebe. Auf dieser Grundlage können die Gewebe in drei Kategorien eingeteilt werden: (1) Gewebe mit statischen Zellpopulationen wie beispielsweise Nerven und Skelettmuskel, in denen keine Zellteilung auftritt und in denen die meisten während der frühen Entwicklung gebildeten Zellen während des gesamten adulten bzw. erwachsenen Lebens fortbestehen; (2) Gewebe, die konditionell sich erneuernde Populationen enthalten, wie beispielsweise Leber, wo im allgemeinen eine geringe Zellteilung existiert, wo sich jedoch in Reaktion auf einen geeigneten Stimulus bzw. Reiz Zellen teilen können, um Tochterzellen desselben differenziell definierten Typs zu produzieren und (3) Gewebe mit dauerhaft sich erneuernden Populationen, die Blut, Testes und mehrschichtiges Plattenepithel einschließen, die durch schnellen und kontinuierlichen Zellumsatz beim Erwachsenen gekennzeichnet sind. Hier weisen die endgültig differenzierten Zellen eine relativ kurze Lebensspanne auf und werden durch Proliferation einer getrennten Subpopulation von Zellen, die als Stamm- oder Vorläuferzellen bekannt sind, ersetzt.
Die zellulären und molekularen Ereignisse, die den Stimulus zur Differenzierung dieser Zellen bestimmen, sind ein Gebiet intensiver Forschung. Auf dem Gebiet der Medizin wird angenommen, daß die Entdeckung von Faktoren, die die Zelldifferenzierung und Gewebsmorphogenese kontrollieren, das Vermögen der Medizin, erkrankte oder geschädigte Säugetiergewebe und Organe zu regenerieren und zu reparieren signifikant verbessern wird. Besonders brauchbare Gebiete schließen die plastische Chirurgie und die Behandlung von degenerativen Gewebserkrankungen ein, die Arthritis, Emphysem, Osteoporose, Kardiomyopathie, Zirrhose und degenerative Nervenerkrankungen einschließen.
Eine Anzahl unterschiedlicher Faktoren wurden in den letzten Jahren ausgemacht, die eine Rolle bei der Zelldifferenzierung zu spielen scheinen. Einige dieser Faktoren sind Gentranskriptions-Aktivatoren, wie beispielsweise das NOTCH- Gen, das bei Drosophila erkannt wurde, und das verwandte XOTCH-Gen, das in Xenopus identifiziert wurde, ebenso wie eine Anzahl von Transkriptions-Aktivatoren, die in Caenorhabditis elegans identifiziert wurden.
Das hämopoetische System ist wegen dessen sich kontinuierlich erneuernder Zellpopulation ein Gebiet konzentrierter Forschung. Die in diesem System identifizierten Faktoren, die in die Zellerneuerung involviert sein können, schließen Interleukin 3 (IL-3), Erythropoetin, die CSFs (GM-CSF, G-CSF, M- CSF et al.) und verschiedene Stammzell-Wachstumsfaktoren ein.
Weitere Proteine, von denen angenommen wird, daß sie eine Rolle bei der Zelldifferenzierung spielen, schließen Proteine ein, die Mitglieder der Familie der insulinartigen Wachstumsfaktoren (IGF) sind, Mitglieder der Familie der heparinbindenden Wachstumsfaktoren (beispielsweise FGF - saure und basische Fibroblasten-Wachstumsfaktoren und ECDGF - Embryonalkarzinom-abgeleiteter Wachstumsfaktor) ebenso wie mehrere transformierende Onkogene (hst und int-2, siehe beispielsweise Heath et al., (1988), J. Cell Sci. Suppl. 10: 256-256). DIF (Differenzierung induzierender Faktor), identifiziert bei Dictyostellum discoideum, ist ein anderes bioregulatorisches Protein, das die Voransatz (Prestock)- Zelldifferenzierung in diesem Organismus leitet.
Die strukturell verwandten Proteine der TGF-β-Superfamilie der Proteine wurden ebenfalls als in eine Vielzahl von Entwicklungs-Ereignissen involviert erkannt. Beispielsweise scheinen TGF-ß und die Polypeptide der Inhibin/Aktivin-Gruppe eine Rolle bei der Regulierung des Zellwachstums und der Differenzierung zu spielen. MIS (Müllerian Inhibiting Substance) verursacht einen Rückgang des Müller-Ganges in der Entwicklung des männlichen Säugetierembryos und die DPP, das Genprodukt des Drosophila Decapentaplegic-Komplexes ist zur geeigneten dorsal-ventralen Spezifizierung erforderlich. In ähnlicher Weise ist Vg-1 in die Mesoderm-Induktion bei Xenopus involviert und Vgr-1 wurde in einer Vielzahl von sich entwickelnden murinen Geweben bzw. murinen Entwicklungsgeweben identifiziert.
Eine weitere Quelle, die sich als informationenreich herausgestellt hat, liegt auf dem Gebiet der Knochen-Morphogenese. Die Entwicklung und das Studium eines Knochen-Modellsystems hat die Entwicklungskaskade der Knochen-Differenzierung als aus einer Chemotaxis von mesenchymalen Zellen, einer Proliferation dieser Vorläuferzellen, einer Differenzierung dieser Zellen zu Chondroblasten, Knorpel-Kalzifizierung, vaskulärer Invasion, Knochenbildung, Remodellierung und zuletzt Markdifferenzierung bestehend identifiziert worden (Reddi (1981) Kollagen Rel. Res, 1: 209-206). Proteine, die zur Induktion einer endochondralen Knochenbildung bzw. Endochondralknöchenbildung bei einem Säugetier in der Lage sind, wenn sie in Verbindung mit einer Matrix implantiert wurden, wurden nunmehr in einer Vielzahl von unterschiedlichen Säugetierspezies identifiziert, genauso wie die Gene, die diese Proteine kodieren (s. beispielsweise die US-Patente Nr. 4 968 590 und US-Patent No. 5 011 691; Ozkaynak, et al., (1990) EMBO J 9: 2085-2093 und Ozkaynak et al., (1991) Biochem. Biophys. Res. Commn. 179: 116-123. WO-A-89 09788, WO-A-89 09787, WO-A- 90 03733, WO-A-91 05802 und WO-A-91 18558. Es wurde gezeigt, daß diese Proteine, die eine signifikante Aminosäuresequenz- Homologie miteinander teilen bzw. aufweisen, ebenso wie strukturelle Ähnlichkeiten mit verschiedenen Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie von Proteinen, die endochondrale Knochenbildung und/oder Knorpelbildung induzieren, wenn sie in Verbindung mit einer in geeigneter Weise modifizierten Matrix einem Säugetier implantiert wurden. Proteine, die zur Induktion einer ähnlichen Entwicklungskaskade der Gewebsmorphogenese anderer Gewebe in der Lage waren, wurden nicht identifiziert.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, morphogenetische Proteine ("Morphogene") und Verfahren zur Identifizierung dieser Proteine bereitzustellen, die zur Induktion der Entwicklungskaskade der Gewebsmorphogenese für eine Vielzahl von Geweben in Säugetieren in der Lage sind, die nicht Knochen oder Knorpel bzw. von diesen verschieden sind. Die morphogenetische Aktivität schließt die Fähigkeit ein, eine Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen zu induzieren und schließt die Fähigkeit ein, den differenzierten Phänotyp durch das Fortschreiten von Ereignissen aufrechtzuerhalten, die in der Bildung von adultem Gewebe resultieren. Es ist eine weitere Aufgabe, Gene bereitzustellen, die diese Proteine kodieren, ebenso wie Verfahren zur Expression und Isolierung dieser Proteine entweder aus natürlichen Quellen oder biosynthetischen Quellen, unter Verwendung von DNA- Rekombinationstechniken. Es ist eine noch weitere Aufgabe, azelluläre gewebsspezifische Matrizes bereitzustellen, die in Kombination mit diesen Proteinen verwendet werden können und Verfahren zu deren Herstellung.
Eine weitere Aufgabe schließt die Bereitstellung von Verfahren zur Zunahme einer Vorläufer-Zellpopulation bei einem Säugetier ein, Verfahren zur Stimulierung von. Vorläuferzellen zur Differenzierung in vivo oder in vitro und zur Aufrechterhaltung deren differenzierten Phänotyps, Verfahren zur Induktion eines gewebsspezifischen Wachstums in vivo und Verfahren zum Ersetzen von erkranktem oder beschädigtem Gewebe in vivo, ein. Diese und weitere Aufgaben und Merkmale der Erfindung werden aus der Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen die nunmehr folgen, klar ersichtlich werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist durch die hierzu beigefügten Ansprüche definiert.
Somit sind hierin morphogenetische Proteine ("Morphogene") beschrieben, die zur Induktion der Entwicklungskaskade einer gewebsspezifischen Nicht-Skelett-Morphogenese bei einem Säugetier in der Lage sind. Diese Proteine sind insbesondere zur Induktion der Proliferation von nicht festgelegten Vorläuferzellen und zur Induktion der Differenzierung dieser stimulierten Vorläuferzellen in einer gewebsspezifischen Weise unter geeigneten Umweltbedingungen in der Lage. Zusätzlich sind die Morphogene zur Unterstützung des Wachstums und der Aufrechterhaltung dieser differenzierten Zellen in der Lage. Diese morphogenetischen Aktivitäten ermöglichen den Proteinen, die Entwicklungskaskade der Gewebsmorphogenese in einer geeigneten, morphogenetisch permissiven Umgebung zu initiieren und aufrecht zu erhalten, Stammzellen zu stimulieren, so daß sie proliferieren und in einer gewebsspezifischen Weise differenzieren und das Fortschreiten von Ereignisses zu induzieren, die in der Bildung von neuem Gewebe kulminieren. Diese morphogenetischen Aktivitäten ermöglichen den Proteinen ebenfalls, die "Redifferenzierung" von Zellen zu stimulieren, die vorher induziert wurden, so daß sie von ihrem Differenzierungs-Weg abgekommen sind. Unter geeigneten Umweltbedingungen wird angenommen, daß diese Morphogene ebenfalls die "Dedifferenzierung" von festgelegten Zellen (siehe unten) stimulieren können.
Wie hierin beschrieben, sind die Proteine und Zusammensetzungen beim Ersatz von erkranktem oder geschädigtem Gewebe bei einem Säugetier brauchbar, insbesondere, wenn das geschädigte Gewebe die normale Gewebs- oder Organfunktion stört. Es wird demgemäß angenommen, daß die Proteine bei der Reparatur von geschädigtem Gewebe wie beispielsweise geschädigtem Lungengewebe, das sich aus einem Emphysem ergibt, zirrhotischem Nieren- oder Lebergewebe, geschädigtem Herz- oder Blutgefäßgewebe, wie es sich aus Kardiomyopathien und/oder arteriothrombotischen oder kardioembolischen Schlaganfällen ergeben kann, geschädigtem Magengewebe, das sich aus ulcerischen Perforationen oder deren Heilung ergibt, geschädigtem Nervengewebe, wie es sich aus einer physischen Verletzung ergeben kann, degenerativen Erkrankungen wie z. B. der Alzheimer Krankheit oder der Multiplen Sklerose oder Schlaganfällen, geschädigtem Dentin-Gewebe, wie es sich aus der Erkrankung und der mechanischen Verletzung ergeben kann, brauchbar sein wird. Wenn die Proteine einem gewebsspezifischen Ort bzw. Locus verabreicht werden oder deren Expression an diesem simuliert wird, wird die Entwicklungskaskade der Gewebsmorphogenese induziert (siehe unten). Ex vivo durch Kontakt mit den Proteinen oder Mittel stimulierte Zellen, die zur Stimulierung der Morphogenexpression in diesen Zellen geeignet sind, können ebenfalls an diesem Gewebs-Ort bereitgestellt werden. In diesen Fällen stellt das existierende Gewebe die notwendigen Matrix- Erfordernisse bereit, indem es ein geeignetes Substrat für die proliferierenden und differenzierenden Zellen in einer morphogenetisch permissiven Umgebung bereitstellt, ebenso wie es die notwendigen Signale zum Dirigieren der Gewebsspezifität des sich entwickelnden Gewebes bereitstellt.
Alternativ können die Proteine oder stimulierten Zellen mit einer formulierten bzw. zubereiteten. Matrix kombiniert und als eine Vorrichtung an einem Ort in vivo implantiert werden. Die zubereitete Matrix sollte eine biokompatible bzw. biologisch verträgliche, vorzugsweise biologisch abbaubare bzw. biodegradierbare, in geeigneter Weise modifizierte gewebsspezifische azelluläre Matrix mit den nachstehend beschriebenen Eigenschaften sein.
In vielen Fällen resultiert der Verlust einer Gewebsfunktion aus einem Narbengewebe, das in Reaktion auf eine anfängliche oder wiederholte Verletzung des Gewebes gebildet wird. Der Grad der Narbengewebs-Bildung hängt im allgemeinen von den regenerativen Eigenschaften des verletzten Gewebes und vom Grad und von der Art der Verletzung ab. Somit sind hierin Morphogene beschrieben, die zur Prävention oder zur im wesentlichen Hemmung der Bildung von Narbengewebe verwendet werden können, indem die Morphogene oder morphogenstimulierte Zellen einem gerade verletzten Gewebsort (siehe unten) verabreicht werden.
Die Morphogene können ebenfalls zur Steigerung oder Regenerierung einer Vorläufer- oder Stammzellpopulation in einem Säugetier verwendet werden. Beispielsweise können Vorläuferzellen aus dem Knochenmark eines Individuums isoliert werden, ex vivo für eine Zeitspanne und bei einer morphogenen Konzentration, die zur Induktion der Zellen zur Proliferation ausreichend ist, stimuliert werden und an das Knochenmark zurückgegeben werden. Andere Quellen von Vorläuferzellen, die geeignet sein können, schließen biokompatible Zellen ein, die aus einer kultivierten Zell-Linie gewonnen wurden, in Kultur stimuliert wurden und anschließend dem Körper verabreicht wurden. Alternativ kann das Morphogen systemisch verabreicht werden oder implantiert, injiziert oder in anderer Weise einer Vorläuferzelle-Population in einem Individuum verabreicht werden, um dessen mitogenetische Aktivität in vivo zu induzieren. Beispielsweise kann ein Mittel, das zur Stimulierung einer Morphogen-Expression in der Vorläufer-Population von Interesse in der Lage ist, den Zellen in vivo, beispielsweise systemisch, verabreicht werden, um eine mitogenetische Aktivität zu induzieren. In ähnlicher Weise kann eine spezielle Population von hämopoetischen Stammzellen durch die Morphogene vermehrt werden, beispielsweise durch Perfusion des Bluts eines Individuums, um die interessierenden Zellen zu extrahieren, diese Zellen ex vivo zu stimulieren und die stimulierten Zellen wiederum an das Blut zurückzugeben. Es wird angenommen, daß die Fähigkeit, eine Vorläuferzell-Population eines Individuums zu vermehren, bestehende Verfahren zur Behandlung von Störungen, die sich aus einem Verlust oder der Reduktion einer erneuerbaren Zellpopulation ergeben, signifikant verbessern werden. Zwei besonders signifikante Anwendungen schließen die Behandlung von Blutstörungen und verschlechterter oder verlorener Immunfunktion ein. Andere Zellpopulationen, deren Proliferation ausgenutzt werden kann, schließen die Stammzellen der Epidermis ein, die bei einer Hautgewebs-Regeneration verwendet werden können, und die Stammzellen der gastrointestinalen Auskleidung, beispielsweise bei der Heilung von Ulcera.
Wie hierin beschrieben, können die Morphogene ebenfalls dazu verwendet werden, das Wachstum und die Aufrechterhaltung von differenzierten Zellen zu unterstützen, die bestehende differenzierte Zellen zur kontinuierlichen Expression ihres Phänotyps induzieren. Es wird angenommen, daß diese Aktivität bei der Behandlung von Gewebsstörungen besonders brauchbar sein wird, wo der Funktionsverlust durch Zellen verursacht ist, die altern bzw. alt sind oder im Ruhezustand vorliegen, wie es beispielsweise bei der Osteoporose auftritt. Eine Anwendung des Proteins direkt auf die Zellen, die behandelt werden sollen, oder eine Bereitstellung durch systemische Injektion kann dazu verwendet werden, diese Zellen zur kontinuierlichen Expression ihres Phänotyps zu stimulieren, wodurch die Wirkungen der Dysfunktion signifikant umgekehrt werden (s. unten). Zusätzlich können die Morphogene ebenfalls in Therapie- Vorschriften verwendet werden, um das Wachstum von ruhenden Zellen zu stimulieren, wodurch die Fähigkeit dieser Zellen, exogene DNA einzubauen, potentiell erhöht wird.
Wie hierin beschrieben, können die Morphogene jedenfalls zur Induktion einer "Redifferenzierung" von Zellen verwendet werden, die von ihrem Differenzierungsweg abgewichen sind, wie es beispielsweise während der Tumorgenese auftreten kann. Es wird erwartet, daß diese Aktivität der Proteine bei Behandlungen besonders brauchbar sein wird, um das Wachstum von Neoplasien zu reduzieren oder im wesentlichen zu hemmen. Es wird ebenfalls erwartet, daß das Verfahren die De- und Redifferenzierung dieser Zellen induziert. Wie oben beschrieben, können die Proteine den Zellen direkt oder systemisch verabreicht werden und ein Mittel, das zur Stimulierung der Morphogen-Expression in vivo in der Lage ist, kann bereitgestellt werden.
Zuletzt können Modulationen der endogenen Morphogen-Spiegel als Teil eines Verfahrens zum Nachweis einer Nicht-Skelett- Gewebsdysfunktion überwacht werden. Es wird insbesondere erwartet, daß Modulationen der endogenen Morphogen-Spiegel Veränderungen der Gewebs- oder Organ-Stase widerspiegeln. Die Gewebsstase kann durch Nachweis von Veränderungen in den Spiegeln des Morphogens selbst überwacht werden. Beispielsweise können Gewebsproben in Intervallen gewonnen werden und die Konzentration des in dem Gewebe vorliegenden Morphogens kann durch Standardprotein-Nachweiseinrichtungen nachgewiesen werden, die dem Fachmann bekannt sind. Beispielsweise kann einbindendes bzw. Bindungs-Protein, das zur spezifischen Interaktion mit dem interessierenden Morphogen in der Lage ist, wie beispielsweise eine Anti-Morphogen-Antikörper, dazu verwendet werden, das Morphogen in einem Standard-Immunassay bzw. -Immuntest nachzuweisen. Die nachgewiesenen Morphogenspiegel können dann verglichen werden, wobei die Veränderungen der nachgewiesenen Spiegel auf den Zustand des Gewebes hinweisen. Modulationen in den endogenen Morphogenspiegeln können ebenfalls durch Nachweis von Fluktuationen der natürlichen Antikörper-Titer des Körpers auf Morphogene nachgewiesen werden (siehe unten).
Die hierin beschriebenen morphogenetischen Proteine und Zusammensetzungen können aus einer Vielzahl von natürlich vorkommenden Quellen isoliert werden oder sie können biosynthetisch unter Verwendung von herkömmlichen DNA- Rekombinationstechniken konstruiert werden. In ähnlicher Weise können die Matrizes aus organspezifischem Gewebe gewonnen werden oder sie können synthetisch zubereitet werden, wie es nachstehend beschrieben ist.
Ein Schlüssel zu diesen Entwicklungen war die Entdeckung und Charakterisierung von natürlich vorkommenden osteogenetischen Proteinen, gefolgt von der Beobachtung ihrer bemerkenswerten Eigenschaften. Diese Pröteine, die ursprünglich aus Knochen isoliert wurden, sind zur Induktion der vollständigen Entwicklungskaskade der Knochenbildung, einschließlich der Gefäßbildung, der Mineralisierung und der Knochenmarksdifferenzierung in der Lage, wenn sie einem Säugetierkörper in Verbindung mit einer in geeigneter Weise modifizierten Matrix implantiert werden. Native Proteine, die zur Induktion dieser Entwicklungskaskade in der Lage sind, ebenso wie DNA- Sequenzen, die diese Proteine kodieren, wurden nunmehr isoliert und für eine Anzahl unterschiedlicher Spezies charakterisiert (beispielsweise menschliches und Maus OP-1, OP-2 und CBMP-2. Siehe beispielsweise die US-Patente Nr. 4 968 590 und 5 011 691; Sampath et al. (1990) J. Bio. Chem 265: 13198- 13205; Ozkaynak et al. (1990) EMBO J 9: 2085-2093 und Ozkaynak et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commn. 179: 116-123). Die reifen Formen dieser Pröteine teilen eine beträchtliche Aminosequenz-Homologie, insbesondere in den C-terminalen Bereichen der reifen Proteine. Die Proteine teilen insbesondere ein konserviertes sechs- oder sieben-Cystein-Skelett in diesem Bereich (beispielsweise ist die lineare Anordnung dieser C-terminalen Cystein-Reste im wesentlichen in den verschiedenen Proteinen konserviert, zusätzlich zu anderen, offensichtlich erforderlichen Aminosäuren (siehe Tabelle II, unten)).
Polypeptidketten, die normalerweise nicht mit der Knorpel- oder Knochenbildung assoziiert sind, jedoch eine beträchtliche Aminosäuresequenz-Homologie mit dem C-Terminus der osteogenetischen Proteine teilen, einschließlich des konservierten sechs- oder sieben-Cysteins-Skelettes, wurden ebenfalls als zum Induzieren von Knochen bei Säugetieren kompetent identifiziert. Unter diesen befinden sich Aminosäuresequenzen, die bei Drosophila und Xenopus identifiziert wurden (beispielsweise die DPP und Vgl; siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5 011 691 und Tabelle II, unten). Zusätzlich wurde gezeigt, daß nicht-native biosynthetische Konstrukte, die auf Grundlage einer Extrapolation aus diesen Sequenzhomologien entwickelt wurden und die das konservierte sechs- oder sieben-Cystein- Skelett einschlossen, eine endochondrale Knochenbildung bei Säugetieren induzieren, wenn sie in Verbindung mit einer geeigneten Matrix implantiert wurden (siehe US-Patent Nr. 5 011 691 und Tabelle III unten).
Es wurde nunmehr entdeckt, daß diese "Familie" von Proteinen, die eine beträchtliche Aminosäuresequenzhomologie und das konservierte sechs- oder sieben-Cystein-Skelett zeigt, echte Morphogene sind, die zusätzlich zu Knochen und Knorpel zur Induktion einer gewebsspezifischen Morphogenese für eine Vielzahl anderer Organe und Gewebe in der Lage sind. Die Proteine binden offensichtlich an Oberflächenrezeptoren oder berühren in anderer Weise und interagieren mit Vorläuferzellen, und prädisponieren oder stimulieren die Zellen zur Proliferation und zur Differenzierung in einer morphogenetisch permissiven Umgebung. Die Morphogene sind zur Induktion der Entwicklungskaskade von zellulären und molekularen Ereignissen in der Lage, die in der Bildung von neuem, organspezifischem Gewebe kulminieren, einschließlich jeder Gefäßbildung bzw. Vaskularisation, Bindegewebsbildung und Nerven-Innervation, wie es durch das natürlich vorkommende Gewebe erforderlich ist.
Der Begriff "Morphogen" wie hierin verwendet, betrifft die vorher erwähnten osteogenetischen Protein- und Polypeptidketten, die eine beträchtliche Aminosäuresequenzhomologie mit dem C-Terminus der osteogenetischen Proteine teilen.
Es hat sich ebenfalls herausgestellt, daß der Weg, in dem die Zellen differenzieren, ob sie beispielsweise zu knochenproduzierenden Osteoblasten, hämopoetischen Zellen, oder Leberzellen differenzieren, von der Natur ihrer lokalen Umgebung abhängt (siehe unten). Somit benötigen die proliferierenden und differenzierenden Zellen zusätzlich zum Erfordernis eines geeigneten Substrats, auf dem sie verankert sein können, geeignete Signale, um ihre Gewebs-Spezifität zu dirigieren. Diese Signale können die Form von Zelloberflächen-Markern einnehmen.
Wenn die Morphogene (oder Vorläuferzellen, die durch diese Morphogene stimuliert sind) an einem gewebsspezfischen Ort bereitgestellt werden (beispielsweise durch systemische Injektion oder Implantation oder Injektion an einem gewebsspezfischen Ort), weist das an dem Ort existierende Gewebe, gleichgültig ob erkrankt oder beschädigt, die Fähigkeit auf, als eine geeignete Matrix zu dienen. Alternativ kann eine zubereitete Matrix extern zusammen mit den stimulierten Vorläuferzellen oder dem Morphogen bereitgestellt werden, wie es notwendig sein kann, wenn das Ausmaß der Verletzung, die von dem geschädigten Gewebe erlitten wird, groß ist. Die Matrix sollte eine biokompatible, in geeigneter Weise modifizierte azelluläre Matrix mit Dimensionen sein, derartig, daß es den Influx, die Differenzierung und die Proliferation von migratorischen Vorläuferzellen erlaubt und zur Bereitstellung einer morphogenetisch permissiven Umgebung in der Lage ist (siehe unten). Die Matrix ist vorzugsweise gewebsspezifisch und biologisch abbaubar.
Zubereitete Matrizes können aus dehydriertem organspezifischem Gewebe hergestellt werden, und können beispielsweise durch Behandlung des Gewebes mit Lösungsmitteln zur im wesentlichen Entfernung der nichtstrukturellen Bestandteile aus dem Gewebe hergestellt werden. Alternativ kann die Matrix synthetisch unter Verwendung eines biokompatiblen, vorzugsweise in vivo biodegradierbaren Strukturpolymers wie beispielsweise Kollagen in Verbindung mit geeigneten gewebsspezifischen Zellanlagerungsfaktoren zubereitet werden. Gegenwärtig bevorzugte Strukturpolymere umfassen gewebsspezifische Kollagene. Gegenwärtig bevorzugte Zellanlagerungsfaktoren schließen Glykosaminoglykane und Proteoglykane ein. Die Matrix kann weiterhin mit einem Mittel oder Mitteln behandelt werden, so daß die Anzahl von Poren und Mikroporen auf ihrer Oberfläche zunimmt, so daß der Influx, die Proliferation und die Differentiation migratorischer Vorläuferzellen von dem Körper des Säugetieres gesteigert wird.
Unter den brauchbaren Morphogenen befinden sich Proteine, die ursprünglich als osteogenetische Proteinie identifiziert wurden, wie beispielsweise die OP-1, OP-2 und CBMP2-Proteine, ebenso wie Aminosäuresequenz-verwandte. Proteine wie beispielsweise DPP (von Drosophila), Vgl (von Xenopus), Vgr-1 (von der Maus, siehe Tabelle II und Seq. ID Nr. 5-14) und das kürzlich identifizierte GDF-1 Protein (Seq. ID Nr. 14). Die Mitglieder dieser Familie, die Mitglieder der TGF-β- Superfamilie von Proteinen einschließen, teilen eine beträchtliche Aminosäuresequenz-Homologie in ihrem C-terminalen Bereich. Tabelle I unten beschreibt die verschiedenen Morphogene, die bis jetzt identifiziert wurden, einschließlich ihre r wie hierin verwendeten Nomenklatur und Seq. ID- Bezugnahmen.

TABELLE I

"OP-1" Betrifft gattungsgemäß bzw. generisch die Gruppe von morphogenetisch aktiven Proteinen, die aus einem Teil oder der gesamten DNA-Sequenz exprimiert wird, die das OP-1 Protein kodiert, einschließlich Allel- und Speziesvarianten hiervon, beispielsweise menschliches OP-1 ("hOP-1", Seq. ID Nr. 5, reife Protein Aminosäuresequenz), oder Maus OP-1 ("mOP-1", Seq. ID Nr. 6, reife Protein Aminosäuresequenz). Das konservierte sieben- Cystein-Skelett wird durch die Reste 38 bis 139 von Seq. ID Nr. 5 und 6 definiert. Die cDNA- Sequenzen und die Aminosäuren, die die Proteine in voller Länge kodieren, sind in den Seq. ID Nr. 16 und 17 (hOP1) und in den Seq. ID Nr. 18 und 19 (mOP1) bereitgestellt. Die reifen Proteine sind durch die Reste 293-431 (hOP1) und 292 430 (mOP1) definiert. Die "Pro"-Regionen der Proteine, die zur Darstellung der reifen, morphogenetisch aktiven Proteine abgespalten werden, werden im wesentlichen durch die Reste 30- 292 (hOP1) und durch die Reste 30-291 (mOP1) definiert.
"OP2" betrifft gattungsgemäß bzw. generisch die Gruppe der aktiven Proteine, die aus einem Teil oder gesamten DNA-Sequenz exprimiert werden, die das OP-2 Protein kodiert, einschließlich Allel- und Speziesvarianten hiervon, beispielsweise menschliches OP-2 ("hOP2", Seq. ID Nr. 7, reife Protein-Aminosäuresequenz) oder Maus OP-2 ("mOP-2", Seq ID Nr. 8, reife Proteinaminosäuresequenz). Das konservierte sieben-Cystein-Skelett wird durch die Reste 38 bis 139 der Seq ID Nr. 7 und 8 definiert. Die cDNA-Sequenzen und die Aminosäuren, die die Proteine in voller Länge kodieren, sind in den Seq. ID Nr. 20 und 21 (hOP2) und in den Seq. ID Nr. 22 und 23 (mOP2) bereitgestellt. Die reifen Proteine werden im wesentlichen durch die Reste 264-402 (hOP2) und 261 399 (mOP2) definiert. Die "Pro"-Regionen der Proteine, die zur Erzielung der reifen, morphogenetisch aktiven Proteine abgespalten werden, werden im wesentlichen durch die Reste 18 263 (hOP2) und durch die Reste 18-260 (mOP1) definiert.
"CBMP2" betrifft gattungsgemäß die morphogenetisch aktiven Proteine, die aus einer DNA-Sequenz exprimiert werden, die die CBMP2-Proteine kodiert, einschließlich Allel- und Speziesvarianten hiervon, beispielsweise menschliches CBMP2A ("CBMP2A(fx), Seq ID Nr. 9) oder menschliche CBMP2B DNA ("CBMP2B(fx)", Seq ID Nr. 10).
"DPP(fx)" betrifft Proteinsequenzen, die von dem Drosophila DPP-Gen kodiert sind und die das konservierte sieben-Cystein-Skelett definieren (Seq. ID Nr. 12).
"Vgl(fx)" betrifft Proteinsequenzen, die durch das Xenopus Vgl-Gen kodiert sind und die das konservierte sieben-Cystein-Skelett definieren (Seq. ID Nr. 12).
"Vgr-1(fx)" betrifft Proteinsequenzen, die durch das murine Vgr-1-Gen kodiert sind und die das konservierte sieben-Cystein-Skelett definieren (Seq. ID Nr. 13).
"GDF-1(fx)" betrifft Proteinsequenzen, die von dem menschlichen GDF-1-Gen kodiert sind und die das konservierte sieben-Cystein-Skelett definieren (Seq. ID Nr. 14).
Die OP-2-Proteine weisen einen zusätzlichen Cystein-Rest in dieser Region auf (beispielsweise siehe Rest 41 von Seq. ID Nr. 7 und 8), zusätzlich zu dem konservierten Cystein- Skelett, das sie mit anderen Proteinen dieser Familie gemein haben. Das GDF-1 Protein weist einen vier-Aminosäure-Insert bzw. -Einfügung innerhalb des konservierten Skelettes (Reste 44-47 von Seq. ID Nr. 14) auf, jedoch stört diese Einfügung wahrscheinlich nicht die Beziehung der Cysteine in der gefalteten Struktur. Zusätzlich fehlt den CBMP2-Proteinen ein Aminosäurerest innerhalb des Cystein-Skeletts.
Die Morphogene sind inaktiv, wenn sie reduziert sind, sind jedoch als oxidierte Homodimere aktiv und wenn sie in Kombination mit anderen Morphogenen dieser Erfindung oxidiert sind. Somit ist, wie hierin definiert, ein erfindungsgemäßes Morphogen ein dimeres Protein, das zwei Polypeptidketten umfaßt, wobei jede Polypeptidkette zumindest das C-terminale sechs-Cystein-Sekelett, definiert durch die Reste 43-139 von Seq. ID Nr. 5 umfaßt, einschließlich funktionell äquivalenter Anordnungen dieser Cysteine (beispielsweise Aminosäure-Einfügungen oder Deletionen, die die lineare Anordnung der Cysteine in der Sequenz derartig verändern, jedoch nicht deren Beziehungen der gefalteten Struktur), daß, wenn die Polypeptidketten gefaltet werden, die dimere Proteinspezies, die die zwei Polypeptidketten umfaßt, die geeignete dreidimensionale Struktur aufweist, einschließlich der geeigneten Intra- oder Inter-Ketten-Disulfidbindungen, so daß das Protein dazu in der Lage ist, als ein wie hierin definiertes Morphogen zu dienen. Das Protein ist insbesondere zu all den folgenden biologischen Funktionen einer morphogenetisch permissiven Umgebung in der Lage: Stimulierung der Proliferation von Vorläuferzellen; Stimulierung der Differenzierung von Vorläuferzellen; Stimulierung der Proliferation von differenzierten Zellen; und Unterstützendes Wachstums und der Aufrechterhaltung von differenzierten Zellen, einschließlich der "Redifferenzierung" dieser Zellen. Es sind ebenfalls erwartet, daß die Morphogene dazu in der Lage sind, die Redifferenzierung von festgelegten Zellen unter geeigneten Umwelt-Bedingungen zu induzieren.
Vorzugsweise umfassen die Morphogene eine von zwei Spezies von generischen Aminosäuresequenzen: Generische Sequenz 1 (Seq. ID No. 1) oder generische Sequenz 2 (Seq. ID Nr. 2); wobei jedes Xaa eine der 20 natürlich vorkommenden L-Isomer, α-Aminosäuren oder Derivate hiervon anzeigt. Die generische Sequenz 1 umfaßt das konservierte sechs-Cystein-Skelett und die generische Sequenz 2 umfaßt das konservierte 6-Cystein- Skelett plus dem zusätzlichen Cystein, das bei OP-2 identifiziert wurde (siehe Rest 36, Seq. ID Nr. 2). Bei einem weiteren bevorzugten Grundgedanken umfassen diese Sequenzen weiterhin die nachfolgenden zusätzliche Sequenz an ihrem N- Terminus:
Bevorzugte Aminosäuresequenzen innerhalb der vorhergehenden generischen Sequenzen schließen ein: Die generische Sequenz 3 (Seq. ID Nr. 3) und die generische Sequenz 4 (Seq. ID Nr. 4), nachstehend aufgelistet, die die zwischen den verschiedenen bevorzugten Mitglieder dieser Morphogenfamilie, die bis jetzt identifiziert wurden (siehe Tabelle II), geteilten Homologien enthalten, ebenso wie die Aminosäuresequenz-Variation zwischen diesen. Die generischen Sequenzen 3 und 4 sind zusammengesetzte Aminosäuresequenzen der in Tabelle II präsentierten Proteine, die die Sequenz ID Nr. 5-14 identifiziert sind. Die generischen Sequenzen schließen sowohl die durch die Sequenzen in Tabelle II geteilte Aminosäure-Identität ebenso wie alternative Reste für die variablen Positionen innerhalb der Sequenz ein. Es sei angemerkt, daß diese generischen Sequenzen jeweils ein zusätzliches Cystein in der Position 41 oder 46 in den generischen Sequenzen 3 oder 4 erlaubt, wodurch ein geeignetes Cystein-Skelett bereitgestellt wird, bei dem sich inter - oder intra-molekulare Disulfidbindungen bilden können und enthalten bestimmte entscheidende Aminosäuren, die die Tertiärstruktur der Proteine beeinflussen. Generische Sequenz 3
bei der jedes Xaa unabhängig aus einer Gruppe einer oder mehrerer spezieller Aminosäuren ausgewählt ist, die wie folgt definiert sind: "Res." bedeutet "Rest" und Xaa bei Res.4 = (Ser, Asp oder Glu); Xaa bei Res.6 = (Arg, Gln, Ser oder Lys); Xaa bei Res.7 = (Asp oder Glu); Xaa bei Res.8 = (Leu oder Val); Xaa bei Res.11 = (Gln, Leu, Asp, His oder Asn); Xaa bei Res.12 = (Asp, Arg oder Asn); Xaa bei Res.14 = (Ile oder Val); Xaa bei Res.15 = (Ile oder Val); Xaa bei Res.18 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro oder Arg); Xaa bei Res.20 = (Tyr oder Phe); Xaa bei Res.21 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Leu oder Glri); Xaa bei Res.23 = (Tyr, Asn oder Phe); Xaa bei Res.26 = (Glu, His, Tyr, Asp oder Gln); Xaa bei Res.28 = (Glu, Lys, Asp oder Gln); Xaa bei Res.30 = (Ala, Ser, Pro oder Gln); Xaa bei Res.31 = (Phe, Leu oder Tyr); Xaa bei Res.33 = (Leu oder Val); Xaa bei Res.34 = (Asn, Asp, Ala oder Thr); Xaä bei Res.35 = (Ser; Asp, Glu, Leu oder Ala); Xaa bei Res.36 = (Tyr, Cys, His, Ser oder Ile); Xaa bei Res.37 = (Met, Phe, Gly oder Leu); Xaa bei Res.38 = (Asn oder Ser); Xaa bei Res.39 = (Ala, Ser oder Gly); Xaa bei Res.40 = (Thr, Leu oder Ser); Xaa bei Res.44 = (Ile oder Val); Xaa bei Res.45 = (Val oder Leu); Xaa bei Res.46 = (Gln oder Arg); Xaa bei Res. 47 = (Thr, Ala oder Ser); Xaa bei Res.49 = (Val oder Met); Xaa bei Res.50 = (His oder Asn); Xaa bei Res.51 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala oder Val); Xaa bei Res.52 = (Ile, Met, Asn, Ala oder Val); Xaa bei Res.53 = (Asn, Lys, Ala oder Glu); Xaa bei Res.54 = (Pro oder Ser); Xaa bei Res.55 = (Glu, Asp, Asn, oder Gly); Xaa bei Res.56 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser oder Ala); Xaa bei Res.57 = (Val, Ala oder Ile); Xaa bei Res.58 = (Pro oder Asp); Xaa bei Res.59 = (Lys oder Leu); Xaa bei Res.60 = (Pro oder Ala); Xaa bei Res.63 = (Ala oder Val); Xaa bei Res.65 = (Thr oder Ala); Xaa bei Res.66 = (Gln, Lys, Arg oder Glu); Xaa bei Res.67 = (Leu, Met oder Val); Xaa bei Res.68 = (Asn, Ser oder Asp); Xaa bei Res.69 = (Ala, Pro oder Ser); Xaa bei Res.70 = (Ile, Thr oder Val); Xaa bei Res.71 = (Ser oder Ala); Xaa bei Res.72 = (Val oder Met); Xaa bei Res.74 = (Tyr oder Phe); Xaa bei Res.75 = (Phe, Tyr oder Leu); Xaa bei Res.76 = (Asp oder Asn); Xaa bei Res.77 = (Asp, Glu, Asn oder Ser); Xaa bei Res.78 = (Ser, Gln, Asn oder Tyr); Xaa bei Res.79 = (Ser, Asn, Asp oder Glu); Xaa bei Res.80 = (Asn, Thr oder Lys); Xaa bei Res.82 = (Ile oder Val); Xaa bei Res.84 = (Lys oder Arg); Xaa bei Res.85 = (Lys, Asn, Gln oder His); Xaa bei Res.86 = (Tyr oder His); Xaa bei Res.87 = (Arg, Gln oder Glu); Xaa bei Res.88 = (Asn, Glu oder Asp); Xaa bei Res.90 = (Val, Thr oder Ala); Xaa bei Res.92 = (Arg, Lys, Val, Asp oder Glu); Xaa bei Res.93 = (Ala, Gly oder Glu); und Xaa bei Res.97 = (His oder Arg); und die generische Sequenz 4: Generische Sequenz 4
bei der jedes Xaa unabhängig aus einer Gruppe einer oder mehrerer spezieller Aminosäuren ausgewählt ist, die wie folgt definiert sind: "Res." bedeutet "Rest" und Xaa bei Res.2 = (Lys oder Arg); Xaa bei Res.3 = (Lys oder Arg); Xaa bei Res.4 = (His oder Arg); Xaa bei Res.5 = (Glu, Ser, His, Gly, Arg oder Pro); Xaa bei Res.9 = (Ser, Asp oder Glu); Xaa bei Res.11 = (Arg, Gln, Ser oder Lys); Xaa bei Res.12 = (Asp oder Glu); Xaa bei Res.13 = (Leu oder Val); Xaa bei Res.16 = (Gln, Leu, Asp, His oder Asn); Xaa bei Res.17 = (Asp, Arg, oder Asn); Xaa bei Res.19 = (Ile oder Val); Xaa bei Res.20 = (Ile oder Val); Xaa bei Res.23 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro oder Arg); Xaa bei Res.25 = (Tyr oder Phe); Xaa bei Res.26 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Leu, oder Gln); Xaa bei Res.28 = (Tyr, Asn oder Phe); Xaa bei Res.31 = (Glu, His, Tyr, Asp oder Gln); Xaa bei Res.33 = Glu, Lys, Asp oder Gln); Xaa bei Res.35 = (Ala, Ser oder Pro); Xaa bei Res.36 = (Phe, Leu oder Tyr); Xaa bei Res.38 = (Leu oder Val); Xaa bei Res.39 = (Asn, Asp, Ala oder Thr); Xaa bei Res.40 = (Ser, Asp, Glu, Leu oder Ala);Xaa bei Res.41. = (Tyr, Cys, His, Ser oder Ile); Xaa bei Res.42 = (Met, Phe, Gly oder Leu); Xaa bei Res.44 = (Ala, Ser oder Gly); Xaa bei Res.45 = (Thr, Leu oder Ser); Xaa bei Res.49 = (Ile oder Val); Xaa bei Res.50 = (Val oder Leu); Xaa bei Res.51 = (Gln oder Arg); Xaa bei Res.52 = (Thr, Ala oder Ser); Xaa bei Res.54 = (Val oder Met); Xaa bei Res.55 = (His oder Asn); Xaa bei Res.56 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala oder Val); Xaa bei Res.57 = (Ile, Met, Asn, Ala oder Val); Xaa bei Res.58 = (Asn, Lys, Ala oder Glu); Xaa bei Res.59 = (Pro oder Ser); Xaa bei Res.60 = (Glu, Asp, oder Gly); Xaa bei Res.61 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser oder Ala); Xaa bei Res. 62 = (Val, Ala oder Ile); Xaa bei Res.63 = (Pro oder Asp); Xaa bei Res.64 = (Lys oder Leu); Xaa bei Res.65 = (Pro oder Ala); Xaa bei Res. 68 (Alä oder Val); Xaa bei Res. 70 = (Thr oder Ala); Xaa bei Res.71 = (Gln, Lys, Arg oder Glu); Xaa bei Res.72 = (Leu, Met oder Val); Xaa bei Res.73 = (Asn, Ser oder Asp); Xaa bei Res.74 = (Ala, Pro oder Ser); Xaa bei Res.75 = (Ile, Thr oder Val); Xaa bei Res.76 = (Ser oder Ala); Xaa bei Res.77 = (Val oder Met); Xaa bei Res.79 = (Tyr oder Phe); Xaa bei Res.80 = (Phe, Tyr oder Leu); Xaa bei Res.81 = (Asp oder Asn); Xaa bei Res.82 = (Asp, Glu, Asn oder Ser); Xaa bei Res.83 (Ser, Gln, Asn oder Tyr); Xaa bei Res.84 = (Ser, Asn, Asp oder Glu); Xaa bei Res.85 = (Asn, Thr oder Lys); Xaa bei Res.87 = (Ile oder Val); Xaa bei Res.89 = (Lys oder Arg); Xaa bei Res.90 = (Lys, Asn, Gln oder His); Xaa bei Res.91 = (Tyr oder His); Xaa bei Res.92 = (Arg, Gln oder Glu); Xaa bei Res.93 = (Asn, Glu oder Asp); Xaa bei Res.95 = (Val, Thr oder Ala); Xaa bei Res.97 = (Arg, Lys, Val, Asp oder Glu); Xaa bei Res.98 = (Ala, Gly oder Glu); und Xaa bei Res.102 = (His oder Arg).
Besonders brauchbare Sequenzen zur Verwendung als Morphogene schließen die C-terminalen Domänen ein, beispielsweise die C- terminalen 96 - 102 Aminosäurereste von Vgl, Vgr-1, DPP, OP- 1, OP-2, CBMP-2A, CBMP-2B und GDF-1 (siehe Tabelle 11, unten und die Seq. ID Nr. 5-14), die zumindest das konservierte sechs- oder sieben-Cystein-Skelett einschließen. Andere Sequenzen schließen das C-terminale CBMP3 und die Inhibin/Aktivin-Proteine ein (siehe Beispiel US-Patent Nr. 4 968 590 und 5 011 691). Demgemäß sind weitere brauchbare Sequenzen diejenigen, die zumindest 70% Aminosäuresequenz-Homologie und vorzugsweise 80% Homologie mit irgendeiner der obigen Sequenzen zeigen. Es wird erwartet, daß diese Allel- und Speziesvarianten und Mutanten und biosynthetische Muteine ebenso wie neuartige Mitglieder dieser morphogenetischen Familie von Proteinen einschließen.
Besonders in der Familie verwandter Proteine ins Auge gefaßt werden diejenigen Proteine, die eine morphogenetische Aktivität zeigen und bei denen die Aminosäure-Veränderungen aus den bevorzugten Sequenzen konservative Veränderungen einschließen, beispielsweise diejenigen, die von Dayoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure; Band 5, Erg. 3, S. 345-362 (M. O. Dayoff, Hrsg., National BioMed. Research Fdn., Washington, D. C. 1979) definiert sind.
Die gegenwärtig am meisten bevorzugten Proteinsequenzen, die als Morphogene brauchbar sind, schließen diejenigen ein, die mehr als 60% Identität, vorzugsweise mehr als 65% Identität mit der Aminosäuresequenz aufweisen, die das konservierte sechs-Cystein-Skelett von hOP1 definiert (beispielsweise die Reste 43-139 von Seq. ID No. 5). Diese am meisten bevorzugten Sequenzen schließen sowohl Allel- als auch Spezies- Varianten der OP1 und OP2-Proteine ein. Somit sind hierin Proteine beschrieben, die irgendeine der oben beschriebenen Polypeptid-Ketten umfaßt, gleichgültig ob sie aus natürlich vorkommenden Quellen isoliert oder durch DNA-Rekombinationstechniken hergestellt wurden, und schließen alle Allel- und Speziesvarianten dieser Proteine, natürlich vorkommende oder biosynthetische Mutanten hiervon ebenso wie verschiedene trunkierte bzw. verkürzte und Fusions-Konstrukte ein. Deletions- oder Additionsmutanten werden ebenfalls als aktiv betrachtet (siehe unten), einschließlich derjenigen, die das konservierte C-terminale Cystein-Skelett verändern können, vorausgesetzt, daß die Veränderung die Beziehung dieser Cysteine in der gefaltenen Struktur nicht funktionell stört. Demgemäß werden derartige aktive Formen als Äquivalenz der hierin offenbarten speziell beschriebenen Konstrukte betrachtet. Die Proteine können Formen einnehmen, die variierende Glykolisierungs-Muster, variierende N-Termini, eine Familie verwandter Proteine mit Bereichen einer Aminosäuresequenz-Homologie und aktive trunkierte oder mutierte Formen nativer oder biosynthetischer Proteine einschließen, die durch Expression rekombinanter DNA in Wirtszellen hergestellt werden.
Die morphogenetischen Proteine können aus intakter oder trunkierter cDNA oder aus synthetischen DNAs in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen exprimiert und gereinigt, gespalten, erneut gefaltet und dimerisiert werden, so daß morphogenetisch aktive Zusammensetzungen gebildet werden. Gegenwärtig bevorzuge Wirtszellen schließen E. coli oder Säugetierzellen wie beispielsweise CHO, COS oder BSC-Zellen ein.
Somit können, in Bezug auf diese Offenbarung, geschulte Gentechniker Gene aus cDNA-Banken oder Genom-Banken verschiedener unterschiedlicher Spezies isolieren, die geeignete Aminosäure-Sequenzen kodieren oder DNAs aus Oligonukleotiden konstruieren und können diese dann in verschiedenen Arten von Wirtszellen exprimieren, einschließlich sowohl Prokaryoten als auch Eukaryoten, uni große Mengen aktiver Proteine zu produzieren, die zur Induktion einer gewebsspezifischen Zelldifferenzierung und Gewebsmorphogenese in einer Vielzahl von Säugetieren, einschließlich Menschen, in der Lage sind.
Ein weiterer hierin beschriebener Gebrauch umfaßt die Induktion einer gewebsspezifischen Morphogenese unter Verwendung der morphogenetischen Proteine und pharmazeutische und therapeutische Mittel, die Morphogene umfassen. Ebenfalls ist hierin die Verwendung dieser Morphogene bei der Herstellung von pharmazeutischen Produkten für verschiedene medizinische Verfahren definiert, einschließlich von Verfahren zur Induktion eines Gewebswachstums, Verfahren zur Induktion einer Vorläuferzell-Proliferation, Verfahren zur Hemmung von Neoplasma-Wachstum und Verfahren zur Förderung einer phänotypischen Zellexpression differenzierter Zellen einschließen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die vorhergehend erwähnten und weitere Aufgaben und Merkmale dieser Erfindung ebenso wie die Erfindung selbst können besser aus der nachfolgenden Beschreibung verständlich werden, wenn sie zusammen mit den begleitenden Zeichnungen gelesen werden, bei denen:
Fig. 1 eine Mikrofotografie eines Northern Blot ist, der Vgr- 1 spezifische Transkripte in verschiedenen adulten murinen Geweben identifiziert;
Fig. 2 eine Mikrofotografie eines Northern Blot ist, der die mOP-1-spezifische mRNA-Expression in verschiedenen murinen Geweben identifiziert, die aus 2 Wochen alten Mäusen (Feld A) und 5 Wochen alten Mäusen (Feld B) erzeugt wurden;
Fig. 3 eine Mikrofotografie eines Northern Blot ist, die die mRNA-Expression von EF-Tu (A, Kontrolle), mOP-1 (B, D), und Vgr-1 (C) in (1) 17-Tage-Embryonen und (2) 3-Tage alten postnatalen Mäusen identifizieren.
Fig. 4A und 4B Mikrofotografien sind, die das Vorhandensein von OP-1 (durch Immunfluoreszenzfärbung) in der Hirnrinde (A) und im Rückenmark (B) darstellen;
Fig. 5A und 5B Mikrofotografien sind, die die Fähigkeit von Morphogen (OP-1) veranschaulichen, undifferenzierte NG108- Zellen (5A) zur Durchführung einer Differenzierung einer neuralen Morphologie (5B) zu induzieren.
Die Fig. 6A-6D Mikrofotografien sind, die die Wirkung von Morphogen (OP-1) auf die menschliche Embryokarzinomzell- Redifferenzierung darstellen;
Fig. 7 eine Mikrofotografie ist, die die Wirkungen von Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS, Tier 1) oder Morphogen (OP- 1, Tier 2) auf teilweise hepatoektomisierte Ratten zeigt;
Fig. 8A-8C Mikrofotografien sind, die die Wirkung keiner Behandlung (8A), Trägermatrixbehandlung (8B) und Morphogenbehandlung (OP-1, 8C) auf die Dentin-Regeneration zeigen.

Ausführliche Beschreibung

Reinigungsprotokolle bzw. -vorschriften wurden zunächst entwickelt, die die Isolierung des osteogenetischen (knocheninduktiven) Proteins ermöglichten, das in Rohproteinextrakten aus Säugetierknochen vorlag. (Siehe WO-A-89 09787 und US 4 968 590) Die Entwicklung des Verfahrens, gekoppelt mit der Verfügbarkeit von frischem Kalbsknochen ermöglichte die Isolierung von im wesentlichen reinem bovinem osteogenetischen Protein (bovine osteogenic protein = BOP). BOP wurde signifikant charakterisiert; seine Fähigkeit, Knorpel und letztendlich endochondrales Knochenwachstum bei Katze, Kaninchen und Ratte zu induzieren, wurden gezeigt und untersucht; es wurde als dazu in der Lage dargestellt, die volle Entwicklungskaskade der Knochenbildung zu induzieren, die kürzlich unbekanntem Protein oder Proteinen in heterogenen Knochenextrakten zugeschrieben wurde. Diese dosisabhängige und hochspezifische Aktivität lag vor, gleichgültig ob das Protein glykosyliert war oder nicht (siehe US Patent Nr. 4 968 958, eingereicht 4/8/88 und Sämpath et al., (1990), J. Biol. Chem 265: 13198- 13205). Die aus den bovinen Materialien gewonnenen Sequenzdaten legten Sonden-Designs nahe, die zur Isolierung von Genen verwendet wurden, die osteogenetische Proteine aus unterschiedlichen Spezies kodierten. Menschliche und murine osteogenetische Protein-Gegenstücke wurden nunmehr identifiziert und charakterisiert (siehe beispielsweise US Patent Nr. 5 011 691, Ozkaynak et al., (1990) EMBO J 9: 2085-2093 und Ozkaynak et al., (1991) Biochem. Biochys. Res. Commn. 179: 116-123, deren Offenbarungen hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen sind.)
Die Sequenzdaten aus den bovinen Materialien legten ebenfalls eine beträchtliche Homologie mit einer Anzahl von Proteinen nahe, die in der Technik bekannt sind, von denen nicht bekannt war, daß sie bei der Knochenbildung eine Rolle spielten. Knochenbildungs-Assays, die mit diesen Proteinen durchgeführt wurden zeigten, daß, wenn diese Proteine einem Säugetier in Verbindung mit einer geeigneten Matrix implantiert wurden, eine Knorpel- und endochondrale Knochen-Bildung induziert wurde (siehe beispielsweise US Patent Nr. 5 011 691). Eines dieser Proteine ist DPP, ein Drosophila-Protein, von dem bekannt ist, daß es eine Rolle bei der dorsal-ventralen Spezifizierung spielt und für die korrekte Morphogenese der Bildscheiben (imaginal discs) erforderlich ist. Zwei weitere Proteine sind verwandte Sequenzen, die in Xenopus und Maus identifiziert wurden (Vgl bzw. Vgr-1), von denen angenommen wird, daß sie bei der Steuerung des Wachstums und der Differenzierung während der Embryogenese eine Rolle spielen. Während DPP und Vgr-1 (oder Vgr-1-artige) Transkripte in einer Vielzahl von Geweben identifiziert wurden (embryonale, neonatale und adulte, Lyons et al., (1989) PNAS 86: 4554-4558 und siehe auch unten), nahmen Vgl-Transkripte, die von der Mutter vererbt und räumlich auf das vegetable Endoderm beschränkt sind, dramatisch nach der Gastrulation ab.
Von diesen Homologien wurde eine generische Konsensus-Sequenz abgeleitet, die die aktive Sequenz umfaßt, die zur Induktion einer Knochen-Morphogenese in einem Säugetier erforderlich ist, wenn es in Verbindung mit einer Matrix implantiert wird. Die generische Sequenz weist zumindest ein konserviertes sechs-Cystein-Skelett auf (generische Sequenz 1, Seq. ID Nr. 1) oder wahlweise ein sieben-Cystein-Skelett (generische Sequenz 2, Seq. ID Nr. 2), die das konservierte sechs-Cystein- Skelett einschließt, das durch die generische Sequenz 1 definiert ist und ein zusätzliches Cystein bei Rest 36, das den zusätzlichen Cystein-Rest, der in den OP2-Proteinen identifiziert wurde, enthält. Jedes "Xaa" in den generischen Sequenzen zeigt an, daß irgendeine der 20 natürlich vorkommenden L- Isomer, a-Aminosäuren oder ein Derivat hiervon an dieser Position verwendet werden kann. Längere generische Sequenzen, die ebenfalls brauchbar sind, umfassen weiterhin die nachfolgende Sequenz an ihren N-Termini:
Es zeigte sich ebenfalls, daß biosynthetische Konstrukte, die aus dieser generischen Konsensus-Sequenz entwickelt wurden, die Knorpel- und/oder endochondrale Knochen-Bildung induzierten (beispielsweise COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7 und COP-16, beschrieben im US-Patent Nr. 5 011 691 und unten dargestellt in Tabelle III). Tabelle II, unten dargestellt, vergleicht die Aminosäuresequenzen der aktiven Bereiche von nativen Proteinen, die als Morphogene identifiziert wurden, einschließlich menschliches OP-1 (hOP-1, Seq. ID Nr. 5 und 16 -17), Maus OP-1 (mOP-1, Seq. ID Nr. 6 und 18-19), menschliches und. Maus OP-2 (Seq. ID Nr. 7, 8 und 20-22), CBMP2A (Seq. ID No. 9), CBMP2B (Seq. ID No. 10), DPP (von Drosophila, Seq ID Nr. 11), Vgl (von Xenopus, Seq. ID Nr. 12), Vgr-1 (von der Maus, Seq. ID Nr. 13), und GDF-1 (Seq. ID Nr. 14) ein. In dieser Tabelle zeigen drei Punkte an, daß die Aminosäure in dieser Position dieselbe wie die Aminosäure hOP- 1 ist. Drei Striche zeigen an, daß keine Aminosäure an dieser Position vorliegt und diese sind zum Zweck der Veranschaulichung von Homologien enthalten. Beispielsweise ist der Aminosäurerest 60 von CBMP-2A und CBMP-2B "missing" bzw. "fehlend". Natürlich umfassen diese beide Aminosäuresequenzen in diesem Bereich Asn-Ser (Reste 58, 59), wobei CBMP-2A dann Lys und Ile umfaßt, wohingegen CBMP-2B Ser und Ile umfaßt. Tabelle II
** Zwischen den Resten 43 und 44 von GDF-1 liegt die Aminosäuresequenz Gly-Gly-Pro-Pro.
Tabelle III, unten dargelegt, vergleicht die Aminosäuresequenzdaten für sechs verwandte biosynthetische Konstrukte, die als COP 1, 3, 4, 5, 7 und 16 bezeichnet werden. Diese Sequenzen werden ebenfalls im US-Patent Nr. 5 011 691 dargelegt. Wie bei Tabelle 11 bedeuten die Punkte, daß in dieser Position eine identische Aminosäure zur derjenigen von COP-1 vorliegt und Striche bedeuten, daß die COP-1 Aminosäure an dieser Position fehlt. Tabelle III
Wie es aus den vorhergehenden Aminosäuresequenz-Vergleichen hervorgeht, können signifikante Aminosäure-Veränderungen bzw. Austausche innerhalb der generischen Sequenzen vorgenommen werden, während die morphogenetische Aktivität erhalten bleibt. Während beispielsweise die GDF-1 Proteinsequenz, dargestellt in Tabelle 11, nur ungefähr 50% Aminosäuresequenzidentität mit der hOP1-Sequenz, die hierin beschrieben ist, teilt, teilt die GDF-1 Sequenz mehr als 70% Aminosäuresequenz-Homologie mit der hOP1-Sequenz, wobei Homologie durch erlaubte konservative Aminosäure-Austausche innerhalb der Sequenz definiert ist, wie die definiert von Dayoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure Bd. 5, Erg. 3, S. 345- 362 (M. O. Dayoff, Hrsg., Nat'1 BioMed. Res. Fdn, Washington D. C. 1979).
Es wurde nunmehr entdeckt, daß die von diesen Sequenzen beschriebene Proteinfamilie ebenfalls dazu in der Lage ist, die gewebsspezifische Entwicklurigskaskade in anderen Geweben als Knochen und Knorpeln zu iniziieren. Wenn sie mit nativen Vorläuferzellen, wie hierin offenbart, kombiniert werden, sind diese Pröteine, die als Morphogene bezeichnet werden, zur Induktion der Proliferation und Differenzierung der Vorläuferzellen in der Lage. In der Gegenwart geeigneter gewebsspezifischer Signale zur Führung der Differenzierung dieser Zellen und einer morphogenetisch permissiven Umgebung sind diese Morphogene dazu in der Lage, die Kaskade von zellulären und molekularen Ereignissen zu reproduzieren, die während der embryonalen Entwicklung auftritt, um funktionelles Gewebe zu liefern.
Ein Schlüssel zu diesen Entwicklungen waren der Aufbau eines Säugetiergewebsmodellsystems, nämlich eines Modellsystems für die endochondrale Knochen-Bildung und die Erforschung der Kaskade von Ereignissen, die für die Knochengewebs- Morphogenese von Bedeutung ist. Die Arbeit an diesem System hat die Entdeckung nicht nur von knocheninduktiven Morphogenen, jedoch ebenfalls von gewebsinduktiven Morphogenen und deren Aktivitäten ermöglicht. Die zur Entwicklung des Knochenmodellsystems verwendeten Verfahren, die nunmehr im Stand der Technik wohl bekannt sind, zusammen mit den Proteinen dieser Erfindung, können zur Erzeugung von Modellsystemen für andere Gewebe, wie beispielsweise Leber, verwendet werden (siehe unten).
Unter Verwendung des Modellsystems für die endochondrale Knochen-Bildung hat es sich ebenfalls herausgestellt, daß die örtliche Umgebung, in der das morphogenetische Material angeordnet ist, für die Gewebs-Morphogenese wichtig ist. Wie hierin verwendet, bedeutet "örtliche Umgebung" die strukturelle Gewebsmatrix und die Umgebung, die das Gewebe umgibt. Beispielsweise bedürfen die Morphogen-stimulierten Zellen zusätzlich zum Bedarf nach einem geeigneten Anker-Substrat für ihre Proliferation Signale zur Leitung bzw. Führung der Gewebsspezifität zu ihrer Differenzierung. Diese Signale variieren für die unterschiedlichen Gewebe und können Zelloberflächenmarker einschließen. Zusätzlich macht die Vaskularisierung von neuem Gewebe eine lokale Umgebung erforderlich, die die Vaskularisierung unterstützt.
Unter Verwendung des Knochenmodellsystems als Beispiel ist bekannt, daß unter Standard-Assay-Bedingungen das Implantieren von osteoinduktiven Morphogenen in loses Mesenchym in Abwesenheit einer Gewebsspezifizierenden Matrix im allgemeinen nicht die endochondrale Knochen-Bildung zur Folge hat, es sei denn, daß sehr hohe Konzentrationen des Proteins implantiert werden. Im Gegensatz hierzu hat die Implantation von relativ niedrigen Konzentrationen des Morphogens in Verbindung mit einer in geeigneter Weise modifizierten Knochen-abgeleiteten Matrix die Bildung von vollständig funktionellem endochondralen bzw. Ersatz-Knochen zur Folge (siehe beispielsweise Sampath et al. (1981) PNAS 78: 7599-7603 und US-Patent Nr. 4 975 526). Zusätzlich erlaubt eine synthetische Matrix, die ein strukturelles Polymer wie beispielsweise gewebsspezifisches Kollagen und gewebsspezifische Zellanlagerungsfaktoren wie beispielsweise gewebsspezifische Glykosylaminoglykane umfaßt, die endochondrale Knochenbildung (siehe beispielsweise PCT Veröffentlichung US 91/03603, veröffentlicht am 12. Dezember 1991 (WO 91/18558). Zuletzt ist, wenn das Morphogen und eine geeignete knochen- oder knorpelspezifische Matrix (beispielsweise umfassend Typ 1 Knorpel) zusammen in loses Mesenchym implantiert wird, eine Knorpel- und endochondrale Knochen- Bildung die Folge, einschließlich der Bildung von Knochenmark und eines Gefäßsystems. Wenn jedoch dieselbe Zusammensetzung einer nicht-vaskulären Umgebung ausgesetzt wird, beispielsweise kultivierten Zellen in vitro oder einem Knorpelspezifischen Ort, läuft die Gewebs-Entwicklung, abgesehen von der Knorpel-Bildung nicht weiter (siehe unten). Es wird ähnlicherweise angenommen, daß eine morphogenetische Zusammensetzung, die eine knorpelspezifische Matrix, zusammengesetzt aus Typ 2-Kollagen enthält, die Bildung von Nicht-Knorpel- Gewebe in vivo induziert (beispielsweise Hyalin). Wenn die Zusammensetzung jedoch einer Gefäß-tragenden Umgebung ausgesetzt wird, wie beispielsweise losem Mesenchym, ist die Zusammensetzung dazu in der Lage, die Differenzierung von proliferierenden Vorläuferzellen zu Chondrozyten und Osteoblasten zu induzieren, was die Knochenbildung zur Folge hat.
Es wurde ebenfalls entdeckt, daß die Gewebsmorphogenese eine morphogenetisch permissive Umgebung benötigt. Klarerweise müssen in voll funktionierendem gesundem Gewebe, das nicht aus einer sich permanent erneuernden Zellpopulation besteht, Signale existieren, um ein fortgesetztes Gewebswachstum zu verhindern. Es wird somit postuliert, daß ein Kontrollmechanismus existiert, wie beispielsweise ein Feedback- Kontrollmechanismus, der die Kontrolle des Zellwachstums und der Differenzierung reguliert. Es ist tatsächlich bekannt, daß sowohl TGF-β als auch MIS zur Hemmung des Zellwachstums in der Lage sind, wenn sie in geeigneten Konzentrationen vorliegen. Es kann zusätzlich unter Verwendung des Knochenmodellsystems gezeigt werden, daß osteogenetische Vorrichtungen, die einen Knochen-abgeleiteten Träger (Matrix) umfassen, der demineralisiert und Guanidin-extrahiert wurde, so daß nichtKollagenöse Proteine im wesentlichen entfernt werden, eine endochondrale Knochen-Bildung erlauben, wenn sie in Verbindung mit einem osteoinduktiven Morphogen implantiert werden. Wenn jedoch der Knochen-abgeleitete Träger nicht demineralisiert, sondern beispielsweise nur in Wasser mit niedrigem Salzgehalt gewaschen wird, wird die Induktion der endochondralen Knochenbildung gehemmt, was das Vorhandensein einer oder mehrerer hemmender Faktoren innerhalb des Trägers nahelegt.
Ein weiterer Schlüssel zu diesen Entwicklungen war die Bestimmung der breiten Verteilung dieser Morphogene in sich entwickelndem und adultem Gewebe. Beispielsweise wird die DPP sowohl in embryonalen als auch sich entwickelndem Drosophila- Gewebe exprimiert. Vgl wurde in embryonalem Xenopus-Gewebe identifiziert. Vgr-1-Transkripte wurden in einer Vielzahl von murinen Geweben identifiziert, einschließlich embryonalem und sich entwickelndem Gehirn-, Lungen-, Leber-, Nieren und Calvaria- (Dermalknochen) -Gewebe. Kürzlich wurden Vgr-1- Transkripte ebenfalls in adultem murinem Lungen-, Nieren-, Herz- und Gehirngewebe identifiziert, wobei eine besonders große Fülle in der Lunge vorlag (siehe unten).
OP-1 und die CBMP2-Proteine, die beide zunächst als Knochen- Morphogene identifiziert wurden, wurden in Maus- und menschlichem Plazenta-, Hippocampus-, Calvaria- und Osteosarkom- Gewebe identifiziert, wie es durch Identifizierung von OP-1 und CMBP2-spezifischen Sequenzen und cDNA-Banken bestimmt wurde, die aus diesen Geweben konstruiert wurden (siehe Ozkaynak et al., (1990) EMBO J 9: 2085-2093, und Ozkaynak et al., (1991) Biochem. Biophys. Res. Commn. 179: 116-123). Zusätzlich liegt das OP-1 Protein in einer Vielzahl von embryonalen und sich entwickelnden Geweben einschließlich Nieren, Leber, Herz, Nebennierengewebe und Gehirn vor, wie es durch Western Blot Analyse und Immunlokalisierung bestimmt wurde (siehe unten). OP-1-spezifische Transkripte wurden ebenfalls sowohl in embryonalen als auch in Entwicklungsgeweben identifiziert, in größter Fülle in sich entwickelnden Nieren-, Blasen- und Gehirngewebe (siehe unten). OP-1 wurde ebenfalls als ein Mesoderm-induzierender Faktor identifiziert, der während der Embryogenese vorliegt (siehe unten). Darüber hinaus hat sich herausgestellt, daß OP-1 im Anschluß an eine Schädigung adulten murinen endochondralen Knochens mit Muskel- Satelliten-Zellen und mit pluripotenten Stammzellen im Knochenmark assoziiert ist, was auf seine morphogenetische Rolle in der Gewebsreparatur und Regeneration hinweist. Zusätzlich wurde das kürzlich identifizierte Protein GDF-1 (siehe Tabelle 11) in neuralem Gewebe identifiziert (Lee, (1991) PNAS 88 4250-4254).

Beispiele

IDENTIFIZIERUNG UND ISOLIERUNG DER MORPHOGENE

Unter den in der vorliegenden Erfindung brauchbaren Proteine befinden sich Pröteine, die ursprünglich als Knocheninduktive Proteine identifiziert wurden, wie beispielsweise die OP-1, OP-2 und die CBMP-Proteine, ebenso wie Aminosäuresequenz-verwandte Proteine, wie beispielsweise DPP (von Drosophila), Vgl (von Xenopus) und Vgr-1 (von der Maus, siehe Tabelle 11 und die Sequenzliste). Die Mitglieder dieser Familie, die spezielle Mitglieder der TGF-β-Superfamilie strukturell verwandter Proteine einschließt, teilen eine beträchtliche Aminosäuresequenzhomologie in ihren C-terminalen Bereichen. Die OP-2-Proteine weisen einen extra Cystein-Rest in diesem Bereich auf (auf Position 41 von Seq. ID Nr. 7 und 8), zusätzlich zum konservierten Cystein-Skelett, das sie mit den anderen Proteinen dieser Familie gemein haben. Die Proteine sind inaktiv, wenn sie reduziert sind, sie sind jedoch als oxidierte, homodimere Spezies ebenso aktiv, ebenso als wenn sie in Kombination mit anderen Morphogenen oxidiert werden.
Demgemäß können die Morphogene dieser Erfindung durch jede der nachfolgenden beiden Spezies generischer Aminosäuresequenzen beschrieben werden: Generische Sequenz 1 oder generische Sequenz 2 (Seq. ID Nr. 1 und 2), wobei jedes Xaa eine der 20 natürlich vorkommenden L-Isomer, α-Aminosäuren oder ein Derivat hiervon anzeigt. Besonders brauchbare Sequenzen, die in diese Familie von Proteinen fallen, schließen die 96- 102 C-terminalen Reste von Vgl, Vgr-1, DPP, OP-1, OP-2, CBMP- 2A, CBMP-2B und GDF-1 ebenso wie deren intakte reife Aminosäuresequenzen ein. Ebenfalls sind biosynthetische Konstrukte, die aus den generischen Sequenzen entwickelt wurden, wie beispielsweise COP-1, COP-3-5, COP-7 und COP-16 brauchbar (siehe beispielsweise US Patent Nr. 5 011 691).
Generische Sequenzen, die bevorzugte Aminosäuresequenzen zeigen, die aus bis jetzt identifizierten Sequenzen zusammengestellt sind, die als Morphogene brauchbar sind (beispielsweise Tabelle II und III) werden durch die generische Sequenz 3 (Seq. ID Nr. 3) und durch die generische Sequenz 4 (Seq. ID Nr. 4) beschrieben. Es sei angemer kt, daß diese generischen Sequenzen ein 7- oder 8-Cystein-Skelett aufweisen, in dem sich inter- oder intramolekulare Disulfidverbindungen bilden können und bestimmte entscheidende Aminosäuren enthalten, die die Tertiärstruktur der Proteine beeinflussen. Es wurde ebenfalls betrachtet, daß die sich unterscheidenden N-Termini der natürlich vorkommenden Proteine eine gewebsspezifische oder andere, modulierende Aktivität dieser Proteine bereitstellen.
Unter Vorgabe der vorhergehenden Aminosäure und DNA-Sequenz- Information, nämlich der Ebene des Stands der Technik und der Offenbarungen der US Patente Nr. 4 968 590 und 5 011 691, der PCT-Anmeldung US 89/01469, veröffentlicht am 19. Oktober 1989 (WO 89/09788) und Ozkaynak et al., (1990) EMBO J 9: 2085-2093 und Ozkaynak et al., (1991) Biochem. Biophys. Res. Commn. 179: 116-123, können verschiedene DNA's konstruiert werden, die zumindest den aktiven Bereich eines erfindungsgemäßen Morphogens und verschiedener Analoga hiervon (einschließlich Allel-Varianten und derjenigen, die gentechnische Mutationen enthalten) ebenso wie Proteine, trunkierte Formen der reifen Proteine, Deletions- und Insertionsmutanten und ähnliche Konstrukte kodieren. Darüber hinaus können DNA- Hybridisierungssonden aus Bruchstücken der Gene konstruiert werden, die irgendeines dieser Proteine kodieren, einschließlich von Sequenzen, die die aktiven Bereiche der Proregionen der Proteine kodieren (siehe unten), oder die de novo aus der generischen Sequenz entwickelt wurden. Diese Sonden können zum Screenen unterschiedlicher Genom- und cDNA-Banken verwendet werden, um zusätzliche morphogenetische Proteine aus unterschiedlichen Geweben zu identifizieren.
Die DNA's können vom Fachmann unter Verwendung wohlbekannter DNA-Manipulationstechniken hergestellt werden, die die genomische und cDNA-Isolierung, die Konstruktion synthetischer DNA aus synthetisierten Oligonukleotiden und Kassetten- Mutagenese-Techniken einschließen. 15-100mer Oligonukleotide können auf einem Biosearch DNA Model 8600 Synthesizer synthetisiert und durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) in Tris-Borat-EDTA-Puffer gereinigt werden. Die DNA kann dann aus dem Gel elektroeluiert werden. Überlappende Oligomere können durch T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert und in größeren Blocks ligiert werden, die ebenfalls durch PAGE gereinigt werden können.
Die DNA aus in geeigneter Weise identifizierten Klonen können dann isoliert, subkloniert (vorzugsweise in einem Expressionsvektor) und sequenziert werden. Plasmide, die interessierende Sequenzen enthalten, können dann in eine geeignete Wirtszelle zur Expression des Morphogens und zur weiteren Chatakterisierung transfiziert werden. Der Wirt kann eine prokaryotische oder eine eukaryotische Zelle sein, weil die Unfähigkeit der ersteren, Proteine zu glykosylieren, nicht die morphogenetische Aktivität des Proteins zerstören wird, Brauchbare Wirtszellen schließen E. coli, Saccharomyces, das Insekten/Baculovirus-Zell-System, Myelom-Zellen und verschiedene andere Säugetierzellen ein. Die Vektoren können zusätzlich verschiedene Sequenzen kodieren, und die korrekte Expression des rekombinanten Proteins zu unterstützen, einschließlich eines Transkriptionspromotors, und kann Terminationssequenzen, Enhancer-Sequenzen, bevorzugte Ribosom- Bindungsstellen-Sequenzen, bevorzugte mRNA-Leader-Sequenzen, bevorzugte Signal-Sequenzen zur Proteinsekretion und dergleichen einschließen.
Die DNA-Sequenz, die das interessierende Gen kodiert, kann ebenfalls so manipuliert werden, daß potentiell hemmende Sequenzen entfernt werden oder so daß eine unerwünschte Sekundär- und Tertiärstrukturbildung minimiert wird. Das rekombinante Morphogen kann ebenfalls als ein Fusionsprotein exprimiert werden. Nachdem es translatiert ist, kann das Protein aus den Zellen selbst aufgereinigt werden oder aus dem Kulturmedium gewonnen werden. Alle biologisch aktiven Proteine umfassen dimere Spezies, die durch Disulfid-Bindungen verbunden oder in anderer Weise assoziiert sind, die durch erneutes Falten und Oxidieren einer oder mehrerer der verschiedenen rekombinanten Polypeptidketten innerhalb einer geeigneten eukaryotischen Zelle oder in vitro nach Expression von individuellen Untereinheiten erzeugt wird. Eine ausführliche Beschreibung der aus rekombinanter DNA in E. coli und in zahlreichen unterschiedlichen Säugetierzellen exprimierten Morphogene ist in der PCT Veröffentlichung US 90/05903, veröffentlicht am 2. Mai 1991 (WO 91/05802), offenbart.
Alternativ können morphogenetische Polypeptidketten chemisch unter Verwendung herkömmlicher Peptid-Synthesetechniken synthetisiert werden, die dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt sind. Beispielsweise können die Proteine intakt oder in Teilen auf einem Biosearch Solid Phase Peptid Synthesizer unter Verwendung von Standardbetriebsverfahren synthetisiert werden. Vervollständigte Ketten werden deprotektiert und durch. HPLC (high pressure liquid chromatography = Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie) gereinigt. Wenn das Protein in Teilen synthetisiert wird, können die Teile unter Verwendung von Standardmethodologien zur Bildung des intakten Proteins Peptid-gebunden werden. Im allgemeinen kann die Art und Weise, in der die Morphogene hergestellt werden, konventionell sein und stellt keinen Teil dieser Erfindung dar.

MORPHOGENVERTEILUNG

Die generische Funktion der Morphogene dieser Erfindung während des gesamten Lebens des Organismus kann durch deren Expression in einer Vielzahl ungleicher Säugetiergewebe bewiesen werden. Die Bestimmung der Gewebsverteilung der Morphogene kann ebenfalls zur Identifizierung unterschiedlicher Morphogene verwendet werden, die in einem vorgegebenen Gewebe exprimiert werden, ebenso wie um neue, verwandte Morphogene zu identifzieren. Die Proteine (oder deren mRNA-Transkripte) werden in einfacher Weise in unterschiedlichen Geweben unter Verwendung von Standardmethodologien und geringeren Veränderungen hiervon in Geweben identifiziert, in denen die Expression niedrig sein kann. Beispielsweise kann die Protein- Verteilung unter Verwendung einer Standard Western Blot- Analyse oder Immunfluoreszenz-Techniken bestimmt werden und Antikörper, die für das oder die interessierenden Morphogene spezifisch sind. In ähnlicher Weise kann die Verteilung der Morphogen-Transkripte unter Verwendung von Standard Northern- Hybridisierungsvorschriften und Transkript-spezifischen Sonden bestimmt werden.
Jede Sonde, die zur spezifischen Hybridisierung an einem Transkript in der Lage ist und die zur Unterscheidung des interessierenden Transkripts von anderen, verwandten Transkripten in der Lage ist, kann verwendet werden. Weil die erfindungsgemäßen Morphogene eine derartig hohe Sequenzhomologie in ihren aktiven, C-terminalen Domänen teilen, kann die Gewebsverteilung eines spezifischen Morphogentranskripts am besten unter Verwendung einer Sonde bestimmt werden, die für die Pro-Region des unreifen Proteins und/oder die N-terminale Region des reifen Proteins spezifisch ist. Eine weitere brauchbare Sequenz ist die 3' nicht-kodierende Region, die das Stopkodon flankiert, das diesem unmittelbar folgt. Diese Sequenzanteile variieren zwischen den Morphogenen dieser Erfindung beträchtlich und sind demgemäß für jedes Protein spezifisch. Beispielsweise ist eine besonders brauchbare Vgr-1- spezifische Sonden-Sequenz das PvuII-SacI-Fragment, ein 265 bp-Fragment, das sowohl einen Teil der nichttranslatierten Proregion als auch den N-Terminus der reifen Sequenz kodiert (siehe Lyons et al. (1989) PNAS 86: 4554-4558 für eine Beschreibung der cDNA-Sequenz). In ähnlicher Weise sind besonders auch brauchbare mOP-1-spezifische Sonden-Sequenzen das BstX1-BgII-Bruchstück, eine 0,68 Kb Sequenz, die ungefähr zwei Drittel der mOP-1 Proregion abdeckt; ein StuI-StuI- Fragment, eine 0,2 Kb Sequenz unmittelbar stromaufwärts der 7-Cystein-Domäne und das Ear1-Pst1-Fragment, ein 0,3 Kb-pro Stück, das einen Anteil der 3' nichttranslatierten Sequenz enthält (siehe Seq. ID Nr. 18, wobei die Proregion im wesentlichen durch die Reste 30-291 definiert ist). Ähnliche Ansätze können verwendet werden, beispielsweise bei hOP1 (Seq. ID Nr. 16) oder menschlichem oder Maus OP2 (Seq. ID Nr. 20 und 22).
Unter Verwendung dieser morphogen-spezifischen Sonden, die synthetisch hergestellt oder aus klonierten Sequenzen gewonnen werden können, können Morphogen-Transkripte in Säugetiergewebe unter Verwendung von Standardmethodologien, die dem Durchschnittsfachmann aus dem Gebiet wohlbekannt sind, identifiziert werden. Kurz, es wird Gesamt-RNA aus verschiedenen adulten murinen Geweben (beispielsweise Leber, Niere, Testis, Herz, Gehirn, Thymus und Magen) durch eine Standard- Methodologie wie beispielsweise das Verfahren von Chomczyaski et al. ((1987) Anal. Biochem 162: 156-159) hergestellt und nachstehend beschrieben. Poly(A) + RNA wird durch Verwendung einer oligo(dT)-Zellulose-Chromatographie hergestellt (beispielsweise Typ 7 von Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.). Poly(A) + RNA (im allgemeinen 15 ug) aus jedem Gewebe wird auf einem 1% Agarose/Formaldehydegel fraktioniert und auf eine Nytran-Membran übertragen (Schleicher & Schuell). Im Anschluß an die Übertragung wird die Membran bei 80ºC gebacken bzw. getrocknet und die RNA unter UV-Licht vernetzt (im allgemeinen 30 Sekunden bei 1 mW/cm²). Vor der Hybridisierung wird die geeignete Sonde (beispielsweise das PvuII-SacI Vgr-1- Fragment) durch Erhitzen denaturiert. Die Hybridisierung wird in einem Lucit-Zylinder durchgeführt, der in einem Ro11- Flaschen-Gerät rotiert und zwar bei ungefähr 1 U/min für ungefähr 15 Stunden bei 37ºC unter Verwendung eines Hybridisierungsgemisches von 40% Formamid, 5 · Denhardts, 5 · SSPE, und 0,01% SDS. Im Anschluß an die Hybridisierung werden die nicht-spezifischen Counts vom Filter in 0,1 · SSPE, 0,1% SDS bei 50ºC weggewaschen. Northern Blots, die unter Verwendung von Vgr-1-Sonden durchgeführt werden, die für den variablen N-Terminus der reifen Sequenz spezifisch sind, zeigen an, daß die Vgr-1-Botschaft ungefähr 3,5Kb ist.
Fig. 1 ist eine Mikrofotografie, die eine Northern Blot- Analyse darstellt, die eine Anzahl von adulten murinen Geweben mit den Vgr-1-spezifischen Sonden sondiert: Leber, Niere, Testis, Herz, Gehirn, Thymus und Magen, dargestellt jeweils in den Bahnen 3-10. Die Bahnen 1 und 12 sind Größenstandards und die Bahnen 2 und 11 sind leer. Unter den getesteten Geweben erscheint Vgr-1 in größter Fülle in adulter Lunge exprimiert zu werden und in einem geringeren Ausmaß in adulter Niere, Herz und Gehirn. Diese Ergebnisse bestätigen und führen frühere Studien weiter, die Vgr-1 und Vgr-1-artige Transkripte in mehreren embryonalen und adulten murinen Gewebe identifizieren (Lyons et al., (1989) PNAS 86: 4554-4558), ebenso wie Studien, die OP-1 und CBMP2 in verschiedenen menschlichen cDNA-Banken identifizieren (beispielsweise Plazenta, Hippocampus, Calvaria und Osteosarkom, siehe Ozkaynak et al., (1990) EMBO 9: 2085-2093). Unter Verwendung derselben allgemeinen Sondierungs- Methodologie wurden mOP-1 Transkripte ebenfalls in einer Vielzahl von murinen Geweben, einschließlich Embryo und verschiedenen sich entwickelnden Geweben identifiziert, wie es in den Fig. 2 und 3 ersichtlich ist. Details der Sondierungs-Methodologie sind in Ozkaynak et al., (1991) Biochem. Biophys. Res. Commn. 179: 116-123 offenbart, deren Offenbarung durch diese Bezugnahme hierin mit aufgenommen ist. Die Northern Blots, die in Fig. 2 dargestellt sind, sondierten RNA, die aus sich entwickelnden Gehirn, Milz, Lunge, Nieren (und Nebennierendrüse), Herz und Leber bei 13 Tage postnatalen Mäusen (Feld A) oder 5 Wochen alten Mäusen (Feld B) präpariert wurde. Die OP-1-spezifische Sonde war eine Sonde, die die 3' untranslatierten Sequenzen enthielt, die oben beschrieben wurden (0,34 Kb EarI-Pst I-Fragment). Als eine Kontrolle für die RNA-Gewinnung wurde die EF-Tu (translationaler Verlängerungsfaktor) mRNA-Expression ebenfalls gemessen (es wird angenommen, daß die EF-Tu-Expression in den meisten Geweben relativ gleichförmig ist).
Die Pfeilspitzen zeigen die OP-1-spezifischen Botschaften an, die in den verschiedenen Geweben beobachtet wurden. Wie es in Fig. 2 ersichtlich ist, variieren die OP-1-Expressionsniveaus in den Milz-, Lungen-, Nieren- und Nebennierengeweben signifikant, wohingegen die EF-Tu mRNA-Spiegel konstant sind. Gleichförmig niedrigere Spiegel der EF-Tu mRNA Spiegel wurden im Herz, Gehirn und der Leber gefunden. Wie aus der Mikrofotografie ersichtlich ist, erscheinen die höchsten Levels der OP-1 mRNA in den Nieren und Nebennierengewebe vorzuliegen, gefolgt vom Gehirn. Im Gegensatz hierzu lieferten Herz und Leber kein nachweisbares Signal. Nicht dargestellt sind zusätzliche Analysen, die bezüglich Blasen-Gewebe durchgeführt wurden, die eine signifikante OP-1 mRNA-Expression zeigt und zwar in Spiegeln, die denjenigen in Nieren/Nebennieren-Gewebe nahekommt. Die Northern Blots zeigen ebenfalls an, daß die OP-1 mRNA Expression, die GDF-1, in unterschiedlichen Geweben bicistonisch sein kann. 4 Transkripte sind ersichtlich: 4 Kb, 2,4 Kb, 2,2 Kb und 1,8 Kb-Transkripte können in den unterschiedlichen Geweben identifiziert werden und eine Kreuzsondierung mit OP-1-spezifischen Sonden aus der Pro-Region und den N-terminalen Sequenzen des Gens zeigt an, daß diese Transkripte OP-1 spezifisch sind.
Ein Seite an Seite-Vergleich von OP-1 und Vgr-1 in Fig. 3 zeigt, daß die Sonden zwischen den Morphogenen Vgr-1 und OP-1 Transkripten in den unterschiedlichen Geweben unterscheiden und beleuchtet ebenfalls die vielfache Transkription von OP-1 in unterschiedlichen Geweben. Fig. 3 vergleicht insbesondere die Expression von OP-1 (Feld B und D), Vgr-1 (Feld C) und EF-Tu (Feld A) (Kontrolle) mRNA in 17 Tagen alten Embryos (Bahn 1) und 3 Tage alten postnatalen Mäusen (Bahn 2). Derselbe Filter würde für sequentielle Hybridisierungen mit markierten DNA-Sonden verwendet, die für OP-1 (Felder B und D), Vgr-1 (Feld C) und EF-Tu (Feld A) spezifisch war. Feld A: die EF-Tu spezifische Sonde (Kontrolle) war das 0,4 Kb HindIII- SacI Bruchstück (Teil der proteinkodierenden Region), wobei die verwendete SacI-Stelle zum Vektor gehörte; Feld B: die OP-1 spezifische Sonde war das 0,68 Kb BstXI-BgII-Bruchstück, das die Proregionsequenzen enthielt; Feld D; die OP-1 spezifische Sonde war das 0,34 Kb EarI-PstI-Bruchstück, das die 3' untranslatierte Sequenz enthielt; Feld C: die Vgr-1 spezifische Sonde war das 0,26 Kb PvuII-SacI-Bruchstück, das in den oben beschriebenen Vgr-I Blots beschrieben wurde.
Die 1,8-2,5 Kb OP-1 mRNA scheint ungefähr zweimal höher in drei Tage alten postnatalen Mäusen als in 17 Tagen alten Embryos zu sein, was vielleicht Phasen in der Knochen und/oder Nieren-Entwicklung reflektiert. Zusätzlich erscheinen von den vier im Gehirn gefundenen Botschaften das 2,2 Kb Transkript am häufigsten vorhanden zu sein, wohingegen in Lunge und Milz die 1,8 Kb-Botschaft vorherrscht. Zuletzt enthüllt die vorsichtige Trennung des Nieren- und Nebennieren-Gewebes in 5 Wochen alten Mäusen, daß die 2,2 Kb Transkripte aus renalem Gewebe abstammten und die 4 Kb mRNA in Nebennierengewebe vorherrschender ist (wie Fig. 2).
In ähnlicher Weise wurden unter Verwendung derselben allgemeinen Sondierungs-Methodologie BMP3- und CBMP2B-Transkripte kürzlich in großer Fülle in Lungengewebe identifiziert.
Die Morphogenverteilung in embryonalem Gewebe kann unter Verwendung von fünf oder sechs Tage alten Mausembryos und Standardimmunfluoreszenz-Techniken zusammen mit morphogenspezifischen Antiseren bestimmt werden. Beispielsweise wird Kaninchen-Anti-Op-1-Antiserum in einfacher Weise unter Verwendung irgendeiner von einer Vielzahl von Standardantikörper- Vorschriften gewonnen, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Technik wohlbekannt sind. Die Antikörper werden dann unter Verwendung von Standard-Verfahren fluoreszenzmarkiert. Ein 5- oder 6-Tage alter Maus-Embryo wird dann in dünne Abschnitte geschnitten und die verschiedenen Entwicklungsgewebe mit dem markierten Antikörper sondiert, indem wiederum Standard-Vorschriften gefolgt wird. Unter Verwendung dieser Technik wurde OP-1 Protein in dem sich entwickelnden Gehirn und Herz nachgewiesen.
Dieses Verfahren kann ebenfalls als zur Identifizierung von morphogenen in adulten Geweben verwendet werden, die eine Reparatur bzw. einen Heilungsprozeß durchmachen. Beispielsweise kann eine Bruchstelle im langen Knochen einer Ratte, wie beispielsweise dem Femur induziert werden. Die Fraktur läßt man dann 2 oder 3 Tage heilen. Das Tier wird dann getötet und die Bruchstelle in Abschnitte aufgeteilt und auf das Vorliegen des Morphogens, beispielsweise OP-1, mit fluoreszenzmarkierten Kaninchen-OP-1-Antiseren unter Verwendung von Standardimmunlokalisierungs-Methodologien sondiert. Diese Technik identifiziert OP-1 in Muskelsatellitenzellen, den Vorläuferzellen für die Entwicklung des Muskels, des Knorpels und eines endochondralen Knochens. Zusätzlich wird OP-1 mit potentiellen pluripotenten Stammzellen im Knochenmark nachgewiesen, was auf dessen morphogenetische Rolle bei der Gewebsreparatur und Gewebsregeneration hinweist.
OP-1 Protein wurde ebenfalls im Rattengehirn unter Verwendung von Standardimmunfluoreszenzfärbetechniken identifiziert. Insbesondere wird adultes Rattengehirn (2-3 Monat alt) und Rückenmark gefroren und chirurgisch geschnitten bzw. sektioniert. Anti-OP-1, gezüchtet in Kaninchen und auf einer OP-1 Affinitätssäule, die unter Verwendung von Standard- Methodologien hergestellt wurde, gereinigt, wurde den Schnitten unter Standardbedingungen für eine spezifische Bindung zugesetzt. Ziegen-Anti-Kaninchen IgG, markiert mit Fluoreszenz wurde dann verwendet, um die OP-1-Antikörperbindung an die Gewebsschnitte sichtbar zumachen.
Wie es in Fig. 4A und 4B ersichtlich ist, zeigt die Immunfluoreszenzfärbung das Vorhandensein von OP-1 im zentralen Nervensystem (ZNS) von adulten Ratten. Ähnliche und extensive Färbung ist sowohl im Gehirn (4A) als auch im Rückenmark (9B) zu sehen. OP-1 erscheint vorherrschend auf die extrazelluläre Matrix der grauen Substanz lokalisiert zu sein, und liegt in allen Bereich vor, außer den neuronalen Zellkörpern. In der weißen Substanz scheint das Färben auf Astrozyten beschränkt zu sein. Ein ähnliches Färbemuster war ebenfalls in neugeborenen Ratten (10 Tage alt) Gehirnschnitten zu sehen.

ZELLDIFFERENZIERUNG

Die Fähigkeit von Morphogenen dieser Erfindung, eine Zelldifferenzierung zu induzieren, kann durch Kultivieren früher mesenchymaler Zellen in Gegenwart des Morphogens bestimmt werden und darauf kann die Histologie der kultivierten Zellen durch Färben mit Toluidinblau untersucht werden. Es ist beispielsweise bekannt, daß mesenchymale Rattenzellen dazu bestimmt sind, Unterkieferknochen zu werden, wenn sie von den darüberliegenden Epithelzellen im Stadium 11 getrennt und in vitro unter Standardgewebs-Kulturbedingungen kultiviert werden, und werden nicht fortfahren zu differenzieren. Wenn dieselben Zellen jedoch mit dem darüberliegenden Endoderm für einen zusätzlichen Tag in Berührung bleiben, zu welchem Zeitpunkt sie Stadium 12-Zellen werden, werden sie fortfahren, von selbst in vitro zu differenzieren, um Chondrozyten zu bilden. Eine weitere Differenzierung in Osteoblasten und letztendlich Unterkieferknochen erfordert eine geeignete lokale Umgebung, beispielweise eine vaskularisierte Umgebung.
Es wurde nunmehr entdeckt, daß Stadium 11 - mesenchymale Zellen, die in vitro in der Gegenwart eines Morphogens kultiviert wurden, beispielsweise OP-1, in vitro zur Bildung von Chondrozyten fortfahren zu differenzieren. Diese Stadium 11- Zellen fahren ebenfalls in vitro fort zu differenzieren, wenn sie mit den Zellprodukten kultiviert bzw. gezüchtet werden, die aus den darüberliegenden endodermalen Zellen geerntet wurden. Überdies kann OP-1 in dem durch endodermale Zellen konditionierten Medium entweder durch Western Blot oder Immunfluoreszenz identifiziert werden. Dieses Experiment kann mit anderen Morphogenen durchgeführt werden und auch mit unterschiedlichen mesenchymalen Zellen, um die Zelldifferentiationsfähigkeit unterschiedlicher Morphogene zu bestimmen, ebenso wie ihre Verteilung in unterschiedlichen Entwicklungsgeweben.
Als ein weiteres Beispiel einer morphogenen-induzierten Zelldifferenzierung wurde die Wirkung von OP-1 auf die Differenzierung neuronaler Zellen in Kultur getestet. Insbesondere wurde die Wirkung von OP-1 auf die NG108-15 Neuroblastom x Gliomhybrid-Klonzelllinie bestimmt. Die Zelllinie zeigt eine fibroblastenartige Morphologie in Kultur. Die Zelllinie kann zur Differenzierung chemisch unter Verwendung von 0,5 mM Butyrat, 1% DMSO oder 500 mM Forskolin induziert werden, wodurch die Expression praktisch aller wichtiger neuronalen Eigenschaften kultivierter primärer Neurone induziert wird. Jedoch induziert die chemische Induktion dieser Zellen ebenfalls das Ende der Zellteilung.
Im vorliegenden Experiment wurden NG108-15-Zellen auf Poly-L- Lysinbeschichtet en 6 Well- bzw. Vertiefungs-Platten subkultiviert. Jedes Well enthielt 40-50.000 Zellen in 2,5 ml chemisch definiertem Medium. Am dritten Tag würden 2,5 ul an OP- 1 in 60% Ethanol, der 0,025% Trifluoressigsäure enthielt, jedem Well zugesetzt. Die OP-1 Konzentrationen von 0, 1, 10, 40 und 100 ng/ml wurden getestet. Die Medien wurden täglich mit neuen Teilmengen an OP-1 ausgetauscht. Nach 4 Tagen mit 40 und 100 ng OP-1/ml Konzentrationen induzierte OP-1 die Differenzierung der NG108-15 Zellen. Fig. 5 zeigt die morphologischen Veränderungen, die eintraten. Das OP-1 induziert ein Verklumpen und Abrunden der Zellen und die Erzeugung eines Neurit-Auswuchses (Verfahren). Ein Vergleich von Fig. 5A (naive NG108-15 Zellen) mit Fig. 5B zeigt die Wirkungen von OP-1 behandelten Zellen. Somit kann OP-1 dazu induzieren, zu einer neuronalen Zellenmorphologie zu differenzieren. Einige der Auswüchse erscheinen sich in einer Synapsen-artigen Verbindung zu verbinden. Diese Wirkung war bei Zellen, die mit TGF-B1 in Konzentrationen von 1 bis 100 ng/ml inkubiert wurden, nicht ersichtlich.
Die neuroprotektiven Wirkungen von OP-1 wurden durch Vergleich mit chemischen Differenzierungsmitteln bezüglich der NG108-15 Zellen demonstriert. 50.00 leiten wurden auf 6 Well-Platten plattiert und mit Butyrat, DMSO, Forskolin oder OP-T vier Tage lang behandelt. Zellzählungen demonstrierten, daß in den Kulturen, die die chemischen Mittel enthielten, die Differenzierung durch ein Ende der Zellteilung begleitet wurde. Im Gegensatz hierzu fuhren die Zellen, die durch OP-1 zur Differenzierung induziert wurden, fort, sich zu teilen, Wie es durch H³-Thymidin-Aufnahme bestimmt wurde. Die Daten legen nahe, daß OP-1 zur Aufrechterhaltung der Stabilität der Zellen in Kultur nach der Differenzierung in der Lage ist.
Als noch weiteres, verwandtes Beispiel wurde das Vermögen der Morphogene dieser Erfindung zur Induktion der "Redifferenzierung" transformierter Zellen ebenfalls bestimmt. Die Wirkung von OP-1 auf menschliche EC-Zellen (Embryokarzinom-Zellen, NTERA-Z CL.D1) ist hierin offenbart. Bei Fehlen eines externen Stimulans können diese Zellen als undifferenzierte Stammzellen gehalten werden und können induziert werden, so daß sie in serumfreien Medien (serum free media = SFM) wachsen. Bei Fehlen einer Morphogenbehandlung proliferieren die Zellen üppig und sind verankerungs-unabhängig. Die Wirkung einer Morphogenbehandlung ist in Fig. 6A bis 6B ersichtlich. Die Fig. 6A und 6B zeigen 4 Tage Wachstum in SFM in der Gegenwart von OP-1 (25 ng/ml, 6A) oder in Abwesenheit eines Morphogens (6B). Die Fig. 6C und 6D sind 5 Tage Wachstum in Gegenwart von 10 ng/ml OP-1 (6C) oder keinem Morphogen (6D). Die Fig. 6C und 6D sind eine 10 · und 20 · Vergrößerung im Vergleich zu den Fig. 6A und 5B. Wie leicht ersichtlich ist, wachsen EC-Zellen in der Gegenwart von OP-1 als flache Zellen und werden verankerungs-abhängig. Zusätzlich wird die Wachstumsrate bzw. -geschwindigkeit ungefähr um das 10fache reduziert. Zuletzt werden die Zellen zur Differenzierung induziert.

AUFRECHTERHALTUNG DES PHÄNOTYPS

Die Morphogene dieser Erfindung können ebenfalls zur Aufrechterhaltung des differenzierten Phänotyps einer Zelle verwendet werden. Diese morphogenetische Fähigkeit ist insbesondere zum Induzieren der fortgesetzten Expression des Phänotyps in alten oder ruhenden Zellen brauchbar.
Die Fähigkeit von Morphogenen, den Phänotyp aufrechtzuerhalten, ist einfach festzustellen. Eine Anzahl differenzierter Zellen werden nach vielfachen Durchläufen bzw. Passagen unter Standardgewebskultur-Bedingungen in vitro alt oder ruhend. Wenn diese Zellen jedoch in vitro in Verbindung mit einem erfindungsgemäßen Morphogen kultiviert werden, werden die Zellen zur Aufrechterhaltung der Expression ihres Phänotyps durch vielfache Passagen induziert. Beispielsweise wird die alkalische Phosphatase-Aktivität kultivierter Osteoblasten, wie kultivierter Osteosarkom-Zellen und Calvaria-Zellen nach vielfachen Passagen in vitro signifikant reduziert. Wenn die Zellen jedoch in Gegenwart eines Morphogens (beispielsweise OP-1) kultiviert werden, wird die alkalische Phosphatase- Aktivität über ausgedehnte Zeiträume aufrechterhalten. In ähnlicher. Weise wird die phänotypische Expression von Myozyten in Gegenwart des Morphogens aufrechterhalten. Dieses Experiment kann mit anderen Morphogenen und unterschiedlichen Zellen durchgeführt werden, um die Fähigkeit unterschiedlicher Morphogene zur Aufrechterhaltung des Phänotyps bezüglich Zellen unterschiedlichen Ursprungs festzustellen.
Die Fähigkeit, den Phänotyp aufrecht zu erhalten, kann ebenfalls in vivo unter Verwendung eines Rattenmodells für Osteoporose festgestellt werden, wie es in der gleichzeitig anhängigen USSN 752 857, eingereicht am 30. August 1991 offenbart ist (entsprechend dem erteilten US-Patent Nr. 5 674 844). Wie hierin offenbart, werden Long Evans-Ratten ovariektomisiert bzw. die Eierstöcke entfernt, um einen osteoporotischen Zustand herzustellen, der sich aus einer verminderten Östrogen-Produktion ergibt. Acht Tage nach der Ovariektomie bzw. Entfernung der Eierstöcke werden die Ratten systemisch mit Phosphat gepufferter Salzlösung (phosphate buffered sahne = PBS) oder OP-1 (21 ug oder 20 ug) 22 Tage lang versorgt. Die Ratten werden dann getötet und die alkalischen Phosphatase-Spiegel im Serum, die Kalziumspiegel im Serum und die Osteocalcin-Spiegel im Serum unter Verwendung von Standard- Methodologien bestimmt. Dreifach höhere Spiegel an Osteocalcinspiegel werden in Ratten gefunden, die mit 1 oder 20 ug OP-1 versorgt wurden. Erhöhte alkalische Phosphatasespiegel wurden ebenfalls beobachtet. Histomorphometrische Analysen des diaphysialen Schienbeinknochens zeigen, daß OP-1 den Knochenmassen-Verlust, der auf das Abfallen des Östrogen- Spiegels zurückzuführen ist, reduzieren kann.

ZELLSTIMULATION

Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Morphogene, die Proliferation von Vorläuerzellen zu stimulieren, kann ebenfalls in einfacher Weise in vitro untersucht werden. Brauchbare naive Stammzellen schließen pluripotente Stammzellen ein, die aus Knochenmark oder Nabelschnurblut unter Verwendung herkömmlicher Methodologien isoliert wurden (siehe beispielsweise Faradji et al., (1988), Vox Sang. 55 (3): 133-138 oder Broxmeyer et al. (1989) PNAS 86 (10): 3828-3832), ebenso wie naive Stammzellen, die aus Blut gewonnen wurden. Alternativ können embryonale Zellen (beispielsweise aus einer kultivierten mesodermalen Zell-Linie) brauchbar sein.
Ein weiteres Verfahren zur Gewinnung von Vorläuferzellen und zur Bestimmung der Fähigkeit von Morphogenen, die Zellproliferation zu stimulieren, ist es, Vorläuferzellen aus einer in vivo Quelle einzufangen. Beispielsweise kann ein biokompatibles Matrixmaterial, das den Einstrom bzw. Influx von migratorischen Vorläuferzellen ermöglichen kann, an einer in vivo Stelle lange genug implantiert werden, um den Einstrom migratorischer Vorläuferzellen zu ermöglichen. Beispielsweise kann eine knochen-abgeleitete, guanidin-extrahierte Matrix, die wie beispielsweise bei Sampath et al. ((1983), PNAS 80: 6591- 6595)) oder US-Patent Nr. 4 975 526 offenbart zubereitet ist, einer Ratte an einer subkutanen Stelle implantiert werden, im wesentlichen unter Befolgung des Verfahrens von Sampath et al. (ibd.). Nach drei Tagen wird das Implantat entfernt und die Vorläuferzellen, die mit der Matrix verbunden sind, dispergiert und kultiviert.
Wie auch immer gewonnene Vorläuferzellen werden dann in vitro mit einem unter Verdacht stehenden Morphogen unter Standardzellkultur- Bedingungen inkubiert, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet wohl bekannt sind. In Abwesenheit eines externen Stimulus proliferieren die Vorläuferzellen nicht oder nur minimal von sich aus in Kultur. Wenn die Zellen jedoch in Gegenwart eines Morphogens kultiviert werden, wie beispielsweise OP-1, werden sie zu Proliferation stimuliert. Das Zellwachstum kann visuell oder spektrophotometrisch unter Verwendung von Standard-Verfahren bestimmt werden, die in der Technik wohlbekannt sind.

PROLIFERATION VON VORLÄUFERZELL-POPULATIONEN

Vorläuferzellen können zur Proliferation in vivo oder ex vivo stimuliert werden. Die Zellen können in vivo durch Injizieren oder in anderer Weise stimuliert werden, indem eine sterile Zubereitung an das Individuum verabreicht wird, die das Morphogen enthält. Beispielsweise kann die Hämopoetische pluripotente Stammzellpopulation eines Individuums durch Injektion oder in anderer Weise stimuliert werden, indem eine geeignete Konzentration des Morphogens an das Knochenmark des Individuums zur Proliferation bereitgestellt wird.
Vorläuferzellen können ex vivo durch in Berührung Bringen von Vorläuferzellen der Population, die mit einem Morphogenen vergrößert werden soll, unter sterilen Bedingungen in einer Konzentration und für eine Zeitspanne, die zur Stimulierung der Proliferation der Zellen ausreicht, stimuliert werden. Im allgemeinen sollte eine Zeitspanne von ungefähr 10 Minuten bis ungefähr 24 Stunden ausreichend sein. Die stimulierten Zellen werden dann dem Individuum wie beispielsweise durch Injizieren der Zellen an einen geeigneten Ort in vivo verabreicht. Geeignete biokompatible Vorläuferzellen können durch irgendeines der bekannten Verfahren oder der hierin beschriebenen Verfahren gewonnen werden.

REGENERATION VON BESCHÄDIGTEM ODER ERKRANKTEM GEWEBE

Die erfindungsgemäßen Morphogene können zur Reparatur von erkranktem oder beschädigtem Säugetiergewebe verwendet werden. Das Gewebe, das repariert werden soll, bzw. instandgesetzt werden soll, wird vorzugsweise bestimmt und überschüssiges nekrotisches oder störendes Narbengewebe wird nach Bedarf durch chirurgische, chemische, abtragende oder andere Verfahren, die in der Medizintechnik bekannt sind, entfernt.
Das Morphogen kann dann direkt dem Gewebsort als Teil einer sterilen, biokompatiblen Zusammensetzung, entweder durch chirurgische Implantation oder Injektion verabreicht werden. Alternativ kann eine sterile, biokompatible Zusammensetzung, die Morphogen-stimulierte Vorläuferzellen enthält, dem Gewebsort verabreicht werden. Das an dem Ort existierende Gewebe, gleichgültig ob erkrankt oder beschädigt, stellt die geeignete Matrix bereit, um die Proliferation und gewebsspezifische Differenzierung der Vorläuferzellen zu ermöglichen. Zusätzlich stellt ein geschädigter oder erkrankter Gewebsort, insbesondere einer, der weiterhin durch chirurgische Mittel attaktiert wurde, eine morphogenetisch permessive Umgebung dar. Für einige Gewebe wird es ins Auge gefaßt, daß die systemische Verabreichung des Morphogens ausreichend sein wird.
Unter einigen Umständen, insbesondere wenn die Gewebsschädigung extensiv ist, kann das Gewebe nicht dazu in der Lage sein, eine ausreichende Matrix für einen Zelleinstrom und die Proliferation bereitzustellen. In diesen Fällen kann es notwendig sein, daß Morphogen oder Morphogen-stimulierte Vorläuferzellen den Gewebsort in Verbindung mit einer geeigneten, biokompatiblen zubereiteten Matrix zuzuführen, die durch irgendeines der hierin nachstehen beschriebenen Mittel hergestellt wurde. Die Matrix ist vorzugsweise gewebsspezifisch, in vivo biologisch abbaubar und umfaßt Teilchen mit Abmessungen innerhalb des Bereichs von 70-850 um, am meisten bevorzugt 150-420 um.
Die erfindungsgemäßen Morphogene können zur Vermeidung oder im wesentlichen Hemmung der Narbengewebs-Bildung im Anschluß an eine, Verletzung verwendet werden. Wenn ein Morphogen einem neu verletzten Gewebsort verabreicht wird, kann es eine Gewebs-Morphogenese an diesem Ort induzieren, indem es die Aggregation bzw. Anhäufung von migrierenden Fibroblasten in nicht-differenziertem Bindegewebe vermeidet. Das Morphogen wird vorzugsweise als eine sterile pharmazeutische Zubereitung verabreicht, die in den Gewebsort innerhalb 5 Stunden nach der Verletzung injiziert wird. Mehrere, nicht einschränkende Beispiele folgen, die darstellen, daß die Morphogene die Fähigkeiten in unterschiedlichen Geweben regenerieren. Es hat sich kürzlich herausgestellt, daß die erfindungsgemäßen Proteine zur Induktion der Knorpel- und endochondralen Konchen-Bildung in der Lage sind (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5 011 691).
Als Beispiel ist die Protein-induzierte Morphogenese von beträchtlich verletztem Lebergewebe im Anschluß an eine teilweise Hepatoektomie offenbart. Variationen dieser allgemeinen Vorschrift können angewendet werden, um die Morphogen- Aktivität in anderen unterschiedlichen Geweben zu testen. Das allgemeine Verfahren schließt das Ausschneiden eines sich im wesentlichen regenerierenden Anteils eines Gewebes und das Bereitstellen des Morphogens, vorzugsweise als eine lösliche pharmazeutische Zubereitung an den ausgeschnittenen Gewebsort, der die Wunde einschließt und eine Überprüfung der Stelle an einem zukünftigen Zeitpunkt ein. Wie Knochen weist auch die Leber ein Potential auf, sich nach einer Verletzung während der post-fötalen Lebensspanne zu regenerieren.
Morphogen (beispielsweise gereinigtes humanes kombinantes OP- 1, reife Form) wurde solubilisiert (1 mg/ml) in 50% Ethanol (oder einem kompatiblen Lösungsmittel) das 0,1% Trifluoressigsäure (oder eine kompatible Säure) enthielt. Die injizierbare OP-1 Lösung wurde durch Verdünnen eines Volumens von OP- 1/Lösungsmittel-saure Stammlösung mit 9 Volumina 0,2%igem Rattenserumalbumin in steriler PBS (phosphat-gepufferte Salzlösung) hergestellt.
Wachsende Ratten oder ausgewachsene Ratten wurden unter Verwendung von Ketamin anästhetisiert. Zwei der Leberlappen (links und rechts) wurden herausgeschnitten (ungefähr 1/3 des Lappens) und das OP-1 wurde lokal an verschiedenen Stellen entlang der Schnittenden injiziert. Die injizierte Menge an OP-1 betrug 100 ug in 100 PBS/RSA (Phosphat gepufferte Salzlösung/Rattenserumalbumin)-Injektionspuffer. Plazeboproben sind Injektionspuffer ohne OP-1. Fünf Ratten in jeder Gruppe wurden verwendet. Die Wunde wurde geschlossen und man gestattete den Ratten den Zugang zu normaler Nahrung und Leitungswasser.
Nach 12 Tagen wurden die Ratten getötet und die Leberregeneration wurde visuell beobachtet. Die Mikrofotografie in Fig. 7 veranschaulicht dramatisch die regenerativen Wirkungen von OP-1 auf die Leberregeneration. Die mit OP-1 injizierte Gruppe zeigte eine komplette Lebergewebs-Regeneration und kein Zeichen blieb von irgendeinem Schnitt in der Leber zurück (Tier 2). Im Gegensatz hierzu war in der Kontrollgruppe, der nur PBS injiziert wurde, nur eine minimale Regeneration zu beobachten (Tier 1). Zusätzlich blieb der Einschnitt in dieser Probe zurück.
Als weiteres Beispiel wurde die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Morphogene, eine Dentinogenese zu induzieren, untersucht. Bis jetzt ist die nicht vorhersehbare Reaktion des Zahnpulpagewebes gegenüber einer Verletzung ein grundlegendes klinisches Problem in der Zahnheilkunde. Zynomolgus-Affen wurden als Primaten-Modelle ausgewählt, weil davon ausgegangen wird, daß Affen besser auf die menschliche Dentalbiologie als solche Modelle hinweisen, die auf niederen Nicht- Primatensäugetieren basieren.
Unter Verwendung von standardzahnchirurgischen Verfahren wurden kleine Flächen (beispielsweise 2 mm) von Dentalpulpa chirurgisch durch Entfernen des Zahnschmelzes und des Dentins unmittelbar oberhalb der Pulpa (durch Bohren) von Probenzähnen freigelegt, indem eine Teilamputation des Knonenpulpa- Gewebes durchgeführt wurde, indem eine Hämostase durchgeführt wurde, indem die Pulpabehandlung angewendet und indem die Kavität bzw. Höhle durch Standardverfahren verschlossen und gefüllt wurde.
Die verwendeten Pulpa-Behandlungen waren: OP-1 dispergiert in einer Trägermatrix; Trägermatrix alleine und keine Behandlung. Zwölf Zähne pro Tier (vier für jede Behandlung) wurden präpariert und zwei Tiere wurden verwendet. Bei vier Wochen wurden die Zähne extrahiert und histologisch für eine Analyse der Dentinbildung verarbeitet und/oder gemahlen, um die Dentinmineralisierung zu untersuchen. Fig. 8 veranschaulicht dramatisch die Wirkung Von Morphogen auf die Osteodentinreparatur. Fig. 8A ist eine Mikrofotografie der Kontrollbehandlung (PBS) und zeigt eine nur geringe oder keine Reparatur.
Fig. 8B ist eine Mikrofotografie der Behandlung mit Träger alleine, und zeigt eine minimale Reparatur. Im Gegensatz hierzu zeigt die Behandlung mit Morphogen (Fig. 8C) eine signifikante Reparatur. Die Ergebnisse von Fig. 8 zeigen, daß OP-1-cm (OP-1 plus Trägermatrix) die Bildung von Reparatur- oder Osteodentinbrücken auf chirurgisch exponierten gesunden Dentalpulpa zuverlässig induziert. Im Gegensatz hierzu fand bei Pulpen, die mit Trägermatrix alleine behandelt wurden oder nicht behandelt wurden, die Bildung von Reparatur Dentin statt.
Als weiteres Beispiel können die Morphogen-induzierten regenerativen Wirkungen auf die Reparatur des zentralen Nervensystems (ZNS) unter Verwendung eines Rattengehirn- Stichmodells untersucht werden. Kurz gesagt, wurden männliche Long Evans-Ratten anästhetisiert und die Kopfgegend für einen chirurgischen Eingriff vorbereitet. Die Calvaria wird unter Verwendung von chirurgischen Standardverfahren exponiert und ein Loch hin zum Zentrum jedes Lappens unter Verwendung eines 0,035K-Drahtes gebohrt, der die Calvaria gerade durchdringt. 25 ul Lösungen, die jeweils entweder Morphogen (OP-1, 25 ug) oder PBS erteilten, werden dann jeder der Löcher durch eine Hamilton-Spritze verabreicht. Die Lösungen werden in eine Tiefe von ungefähr 3 mm unterhalb der Oberfläche der darunterliegenden Rinde, Corpus Callosum und Hippocampus zugeführt. Die. Haut wird dann vernäht und man läßt das Tier sich erholen.
Drei Tage nach dem chirurgischen Eingriff werden die Ratten durch Enthauptung getötet und ihre Gehirne für eine Sektion vorbereitet. Die Narbgewebsbildung wird durch Immunfluoreszenzfärbung nach saurem Gliafibrill-Protein, einem Markerprotein für die Glia-Narbenbildung gefärbt, um den Grad der Narbenbildung qualitativ zu bestimmen. Schnitte wurden ebenfalls mit Anti-OP-1-Antikörpern sondiert, um das Vorliegen von OP-1 zu bestimmen. Reduzierte Spiegel des sauren Gliafibrill- Proteins werden in den Gewebs-Schnitten von Tieren angenommen, die mit Morphogen behandelt wurden, was die Fähigkeit von Morphogen unter Beweis stellt, die Glia-Narben-Bildung zu hemmen, wodurch die Nerven-Regenerierung stimuliert wird.

MORPHOGENAKTIVITÄTS-MODULATION

Antikörper gegen erfindungsgemäße Morphogene wurden in gesundem menschlichem Serum identifiziert. Zusätzlich wurde entdeckt, daß das Implantieren von Vorrichtungen, die Morphögene umfassen (beispielsweise OP-1) eine Zunahme an Anti- Morphogen-Antikörpern (beispielsweise Anti-OP-1-Antikörpern) induzieren. Es wird angenommen, daß diese Antikörper einen Teil det Regulation der Morphogen-Aktivität des Körpers in vivo darstellen. Das Vorliegen der Antikörper und die Fluktuation in ihren Spiegeln, die leicht überwacht werden können, können eine brauchbares Verfahren zur Überwachung der Gewebs- Stase und der Gewebe-Lebensfähigkeit bereitstellen (beispielsweise die Identifizierung eines pathologischen Zustands). Beispielsweise können Standard-Radioimmungssays oder ELISA verwendet werden, um endogene Anti-Morphogen-Antikörper in Seren nachzuweisen und zu quantifizieren. Antikörper und andere Bindungsproteine, die zum Nachweis von Anti-Morphogen- Antikörpern in der Lage sind, können unter Verwendung von Standardmethodologien gewonnen werden.

MATRIX-HERSTELLUNG

Die erfindungsgemäßen Morphogene können chirurgisch implantiert, in einer biokompatiblen, vorzugsweise in vivo biologisch abbaubaren Matrix, die in geeigneter Weise modifiziert wurde, um eine Struktur bereitzustellen, in der das Morphogen dispergiert werden kann und die den Influx, die Differenzierung und die Proliferation von migrierenden Vorläuferzellen ermöglicht, dispergiert. Die Matrix sollte ebenfalls Signale bereitstellen, die zum Dirigieren der Gewebsspezifität der differenzierenden Zellen in der Lage ist, ebenso wie eine morphogenetisch permissive Umgebung, die im wesentlichen frei von den wachstumshemmenden Signalen ist.
Bei vielen dieser Merkmale scheint die Matrix nicht als Teil einer morphogenetischen Zusammensetzung geeignet zu sein. Kürzlich erfolgte in Studien über osteogenetische Vorrichtungen (Morphogene, die in einer zubereiteten Matrix dispergiert sind) unter Verwendung von Matrizes, die aus Polymilchsäure und/oder Polyglycolsäure-Biopolymeren, Keramiken (a-tri- Calcium-phosphat) oder Hydroxyapatit zubereitet wurden, zeigen, daß diese Materialien selbst nicht dazu in der Lage sind, die geeignete Umgebung zur Induktion der de novo endochondralen Knochen-Bildung in Ratten bereitzustellen. Zusätzlich sind Matrizes, die aus dem Handel erhältlichen hochgereinigten, rekonstituierten Kollagenen oder natürlich abgeleiteten Nicht-Knochen, Spezies-spezifischen Kollagen (beispielsweise aus der Rattenschwanz-Sehne) ebenfalls bei der Induzierung eines Knochens nicht erfolgreich, wenn sie in Verbindung mit einem osteogenetischen Protein implantiert werden. Diesen Matrizes fehlen offensichtlich spezielle struktur-verwandte Merkmale, die bei der Lenkung der Gewebsspezifität der Morphogen-stimulierten, differenzierenden Vorläuferzellen helfen.
Die formulierte Matrix kann wie erwünscht vor dem chirurgischen Eingriff geformt werden oder kann durch den Arzt oder einen Techniker während des chirurgischen Eingriffs geformt werden. Somit kann das Material in topischen, subkutanen, intraperitonalen oder intramuskulären Implantaten zur Reparatur von Gewebe oder zur Induktion dessen de novo Wachstums verwendet werden. Die Matrix ist vorzugsweise in vivo biodegradierbar, wird vom Körper langsam absorbiert und durch neues Gewebs-Wachstum ersetzt, in der Form oder sehr Nahe der Form des Implantates.
Details, wie die in dieser Erfindung brauchbaren Matrize s hergestellt und zu verwenden sind, sind nachstehend offenbart.

GEWEBE-ABGELEITETE MATRIZES

Geeignete biokompatible, in Vivo biodegradierbare azelluläre Matrizes können aus natürlich vorkommenden Gewebe hergestellt werden. Das Gewebe wird mit geeigneten Mitteln behandelt, um die zellulären, nichtstrukturellen Bestandteile des Gewebes im wesentlichen zu extrahieren. Die Mittel sollten dazu in der Lage sein, alle wachstumshemmenden Komponenten, die mit dem Gewebe verbunden sind, zu extrahieren. Das sich ergebende Material ist eine poröse, azelluläre Matrix, aus der im wesentlichen die nichtstrukturell-assoziierten Komponenten depletiert sind.
Die Matrix kann weiter mit Mitteln behandelt werden, die die Matrix modifizieren, die die Anzahl der Poren und Mikroporen auf ihrer Oberfläche erhöhen. Dem Fachmann wird bekannt sein, wie festzustellen ist, welche Mittel am besten für die Extraktion der nichtstrukturellen Bestandteile für unterschiedliche Gewebe geeignet sind. Beispielsweise können weiche Gewebe wie beispielsweise Leber und Lunge, dünn geschnitten und einem unpolaren Lösungsmittel wie beispielsweise 100% Ethanol ausgesetzt werden, um die Zellstruktur des Gewebes zu zerstören und nicht strukturelle Bestandteile zu extrahieren. Das Material wird dann getrocknet und pulverisiert, um nicht anhaftende poröse Teilchen zu gewinnen. Strukturelle Gewebe, wie beispielsweise Knorpel und Dentin, in denen Kollagen der primäre Bestandteil ist, können demineralisiert und mit Guadinin extrahiert werden, im wesentlichen folgend dem Verfahren von Sampath et al. (1983) PNAS 80: 6591-6595. Beispielsweise wird pulverisiertes und demineralisiertes Dentin mit fünf Volumina 4M Guadinin-HCl, 50 mM, Tris-HCl, pH 7,0, 16 Stunden lang bei 4ºC extrahiert. Die Suspension wird dann filtriert. Das unlösliche Material, das zurückbleibt, wird gesammelt und zur Herstellung der Matrix verwendet. Das Material ist in seiner Art überwiegend kollagenös. Es fehlt ihm eine morphogenetische Aktivität. Die Matrixteilchen können weiterhin mit einem Kollagen Fibrill-modifizierendem Mittel behandelt werden, das potentiell unerwünschte Bestandteile aus der Matrix extrahiert und die Oberflächenstruktur des Matrixmaterials verändert. Brauchbare Mittel schließen Säuren, organische Lösungsmittel oder erhitzte wässrige Medien ein. Eine ausführliche Beschreibung dieser Matrixbehandlungen ist im US-Patent Nr. 4 975 526 und in der PCT Veröffentlichung US 90/00912, veröffentlicht am 7. September 1990 (WO 90/10018) offenbart.
Das gegenwärtig am meisten bevorzugte Mittel ist ein erhitztes wässriges Fibrill-modifizierendes Medium wie beispielsweise Wasser, um die Matrixpartikeloberfläche und Porosität zu erhöhen. Das gegenwärtig am meisten bevorzugte wässrige Medium ist ein saures wässriges Medium mit einem pH von weniger als ungefähr 4,5, beispielsweise innerhalb des Bereichs von pH 2 - pH 4, das darin Unterstützung leisten kann, das Kollagen vor dem Erhitzen "zu quellen". 0,1% Essigsäure, die einen pH von ungefähr 3 hat, ist gegenwärtig am meisten bevorzugt. 0,1M Essigsäure kann ebenfalls verwendet werden.
Verschiedene Mengen an entfettetem, demineralisiertem Guanidin-extrahierten KnochenKollagen werden in dem wässrigen Medium erhitzt (1 g Matrix/30 ml wässriges Medium) unter beständigem Rühren in einem Wassermantel-Glaskolben und bei einer gegebenen Temperatur für eine vorherbestimmte Zeitspanne gehalten. Bevorzugte Behandlungs-Zeiten sind ungefähr eine Stunde, obwohl die Expositionszeiten zwischen ungefähr 0,5 - 2 Stunden als akzeptabel erscheinen. Die verwendete Temperatur wird bei einer Temperatur innerhalb des Bereichs von ungefähr 37ºC bis 65ºC konstant gehalten. Die gegenwärtig bevorzugte Hitzebehandlungs-Temperatur liegt innerhalb des Bereichs von ungefähr 45ºC bis 60ºC.
Nach der Hitzebehandlung wird die Matrix filtriert, gewaschen, lyophilisiert bzw. gefriergetrocknet und für ein Implantat verwendet. Wenn ein saures wässrigs Medium verwendet wird, wird die Matrix ebenfalls vorzugsweise vor dem Waschen und der Lyophilisation neutralisiert. Ein gegenwärtig bevorzugter Neutralisierungspuffer ist ein 200 mM Natriumphosphat- Puffer, pH 7,0. Um die Matrix zu neutralisieren, läßt man die Matrix vorzugsweise im Anschluß an die Wärmebehandlung abkühlen, danach wird das saure wässrige Medium (beispielsweise 0,1% Essigsäure) entfernt und mit dem Neutralisierungspuffer ersetzt und die Matrix für ungefähr 30 Minuten geschüttelt. Der Neutralisierungspuffer wird danach entfernt und die Matrix gewaschen und lyophilisiert.
Weitere brauchbare fibrill-modifizierende Behandlungen schließen Säurebehandlungen (beispielsweise Trifluoressigsäure und Fluorwasserstoff} und Lösungsmittel-Behandlungen wie beispielsweise Dichlormethan, Acetonitril, Isopropanol und Chloroform ebenso wie spezielle Säure/Lösungsmittel/Kombinationen ein.
Nach Berührung mit dem fibrill-modifizierenden Mittel kann die behandelte Matrix zur Entfernung aller extrahierten Bestandteile im Anschluß an eine Verfahrensform extrahiert werden, die nachstehend dargelegt ist:
1. Suspendieren einer Matrix-Präparation in TBS (Tris- gepufferte Salzlösung) 1 g/200 ml und Rühren für 2 Stünden bei 4ºC; oder in 6M Urea, 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7,0 (UTBS) oder Wasser und Rühren bei Raumtemperatur (RT) für 30 Minuten (ausreichende Zeit, um den pH zu neutralisieren);
2. Zentrifugieren und erneuter Waschschritt; und
3. Zentrifugieren; Abscheiden des Überstandes; Wasserwaschung des Restes und dann Lyophilisieren.

SYNTHETISCHE GEWEBS-SPEZIFISCHE MATRIZES

Zusätzlich zu den gewebesspezifischen Matrizes natürlicher Abstammung, die oben beschrieben wurden, können brauchbare gewebsspezifische Matrizes synthetisch zubereitet werden, wenn sie in geeigneter Weise modifiziert sind. Diese porösen biokompatiblen, in Vivo biodegradierbaren synthetischen Matrizes sind in der PCT Veröffentlichung US 91/03603, veröffentlicht am 12. Dezember 1991 (WO 91/18558) offenbart. Kurz, die Matrix umfaßt ein poröses vernetztes Strukturpolymer eines biokompatiblen, biodegradierbaren Kollagens und geeigneter, gewebsspezifische Glycosaminoglycane als gewebsspezifische Zellanlagerungsfaktoren. Aus einer Anzahl von Quellen stammendes Kollagen kann zur Verwendung bei diesen synthetischen Matrizes geeignet sein, einschließlich unlösliches Kollagen, säurelösliches Kollagen, Kollagen, das in neutralen oder basischen wässrigen Lösungen löslich ist, ebenso wie diejenigen Kollagene, die im Handel erhältlich sind.
Glycosaminoglycane (GAGS) oder Mukopolysaccharide sind hexosamin-enthaltende Polysaccharide tierischen Ursprungs, die eine gewebsspezifische Verteilung aufweisen und deswegen zur Unterstützung der Bestimmung der Gewebsspezifität der Morphogen-stimulierten differenzierenden Zellen verwendet werden können. Eine Reaktion mit den GAGs stellt ebenfalls Kollagen mit einer weiteren wertvollen Eigenschaft bereit, d. h. das Unvermögen; eine Immunantwort (Fremdkörperreaktion) bei einem tierischen Wirt hervorzurufen.
Chemisch gesehen sind GAGs aus Resten von Hexosaminen hergestellt, die glycosidisch gebunden sind und in einer mehr oder weniger regelmäßigen Art und Weise mit entweder Hexeronsäure oder Hexose-Komponenten alternieren (siehe beispielsweise Dodgson et al. in Carbohydrate Metabolism and its Disorders (Dickens et al., Hrsg.) Bd. 1, Academic Press (1968)). Brauchbare GAGs schließen Hyaluronsäure, Heparin, Heparinsulfat, Chondroitin 6-Sulfat, Chondroitin 4-Sulfat, Dermatan- Sulfat und Keratin-Sulfat ein. Andere GAGs sind zur Bildung der hier beschriebenen Matrix geeignet und die Fachleute auf dem einschlägigen Gebiet werden andere geeignete GAGs entweder kennen oder dazu in der Lage sein, diese herauszufinden unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimenten. Für eine ausführlichere Beschreibung der Mucopolysaccharide siehe Aspinall, Polysaccharide, Pergamon Press, Oxford (1970). Beispielsweise kann, wie in der US-Patentanmeldung Serien-Nr. 529 852 (entsprechend der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO-A-91 18558, Chondroitin-6-Sulfat verwendet werden, wo eine endochondrale Knochenbildung erwünscht ist. Heparinsulfat kann andererseits verwendet werden, um synthetische Matrizes zur Verwendung bei der Lungengewebs-Reparatur zuzubereiten.
Kollagen kann mit GAG in sauren wässrigen Lösungen zur Reaktion gebracht werden, vorzugsweise in verdünnten Essigsäurelösungen. Durch Zusatz des GAGs tropfenweise in eine wässrige Kollagen-Dispersion ergeben sich Kopräzipitate von verwirrten bzw. verwickelten Kollagen-Fibrillen, die mit GAG beschichtet sind. Diese verwickelte Masse an Fasern kann dann zur Bildung einer homogenen Dispersion aus feinen Fasern homogenisiert und dann filtriert und getrocknet werden.
Die Unlöslichkeit der Kollagan-GAG-Produkte kann auf den erwünschten Grad durch kovalente Verbindung dieser Materialien angehoben werden, was ebenfalls dazu dient, die Beständigkeit dieser Materialien gegenüber einer Resorption zu erhöhen. Im allgemeinen ist jedes kovalente Vernetzungsverfahren zum Vernetzen von Kollagen ebenfalls zum. Vernetzen dieser zusammengesetzten Materialien geeignet, obwohl eine Vetnetzung durch ein dehydrothermales Verfahren bevorzugt wird.
Wenn sie trocken bzw. getrocknet sind, sind die vernetzte Teilchen im wesentlichen kugelförmig mit Durchmessern von ungefähr 500 um. Eine Rasterelektronenmikroskopie zeigt Poren von ungefähr 20 um auf der Oberfläche und 40 um auf der Innenseite. Die Innenseite ist sowohl aus fibrösen als auch blattartigen Strukturen aufgebaut, und stellt Oberflächen zur Zellanlagerung bereit. Die Hohlräume sind verbunden und stellen einen Zugang der Zellen durch den gesamten Innenraum des Partikels bereit. Das Material scheint ungefähr 99,5% Hohlraumvolumen aufzuweisen, was das Material bezüglich der potentiellen Zellmasse, die pro Gramm Mikroträger gezüchtet werden kann, sehr effizient macht.
Die hierin beschriebenen Morphogene können kombiniert und in einer geeigneten modifizierten spezifizierten Matrix unter Verwendung irgendeines der nachstehend beschriebenen Verfahren dispergiert werden:

1. Ethanol Präzipitation

Matrix wird dem in Guadinin-HCl gelösten Morphogen zugesetzt. Die Proben werden gewirbelt und bei einer niedrigen Temperatur inkubiert. Die Proben werden dann weiter gewirbelt. Kalter, absoluter Ethanol wird dem Gemisch zugesetzt, das dann gerührt und inkubiert wird. Nach Zentrifugation (Mikrofuge, hohe Geschwindigkeit) wird der Überstand abgesondert. Die Matrix wird mit kaltem konzentriertem Ethanol in Wasser gewaschen und dann lyophilisiert.

2. Acetonitril-Trifluoressigsäure-Lyophilisation

Bei diesem Verfahren wird Morphogen in eine Acetonitril-Trifluoressigsäure (ACN/TFA)-Lösung dem Trägermaterial zugesetzt. Die Proben werden viele Male kräftig gewirbelt und dann lyophilisiert.

3. Gepufferte Salzlösung-Lyophilisation

Morphogenzubereitungen in physiologischer Salzlösung können ebenfalls mit der Matrix gewirbelt und zur Erzeugung eines morphogenetisch aktiven Materials lyophilisiert werden.

BIOASSAY

Das nachfolgende legt verschiedene Verfahren zur Evaluierung der in vivo morphogenetischen Nützlichkeit der Morphogene und Morphogenzusammensetzungen dieser Erfindung dar. Die Proteine und Zusammensetzungen können injiziert oder chirurgisch einem Säugetier implantiert werden, einer Anzahl von Verfahren folgend, die in der Technik wohlbekannt sind. Beispielsweise können chirurgische Implantations-Bioassays im wesentlichen folgend dem Verfahren von Sampath et al. (1983) PNAS 80: 6591-6595 durchgeführt werden.

Histologische Evaluation

Histologische Schnitte und Einfärben wird durchgeführt, um das Ausmaß der Morphogenese in vivo zu bestimmen, insbesondere bei Gewebsreparatur-Verfahren. Ausgeschnittene Implantate werden in Bouins Lösung fixiert, in Paraffin eingebettet und in 6-8 um Schnitte geschnitten. Ein Färben mit Toluidinblau oder Hämotoxylin/Eosin zeigt die letzte Entwicklung des neuen Gewebes in klarer Weise an. Zwölf Tage-Implantate sind üblicherweise ausreichend, um zu bestimmen, ob die Implantate neu induziertes Gewebe enthalten.
Erfolgreiche Implantate zeigen ein kontrolliertes Fortschreiten durch die Stadien der induzierten Gewebsentwicklung, und erlauben jemandem, die gewebsspezifischen Ereignisse, die auftreten, zu identifizieren und zu verfolgen. Beispielsweise schließt die endochondrale Knochen-Bildung die folgenden Stadien ein:
(1) Leukozyten am Tag eins; (2) Mesenchymalzell Migration und Proliferation an den Tagen zwei und drei;
(3) Chondrozyten-Auftreten an den Tagen fünf und sechs;
(4) Knorpel-Matrix-Bildung am Tag sieben;
(5) Knorpelkalzifizierung am Tag 8; (6) vaskuläre Invasion, Auftreten von. Osteoblasten und Bildung von neuem Knochen an den Tagen neun und zehn; (7) Auftreten einer osteoblastischen und Knochen-Umformung bzw. Umbildung und Lösen der implantierten Matrix an den Tagen zwölf bis achtzehn; und
(8) Hämopoetische Knochenmarks-Differenzierung im Ossiculum am Tag einundzwanzig:

Biologische Marker

Zusätzlich zur histologischen Evaluation können biologische Marker als Marker für die Gewebs-Morphogenese verwendet werden. Brauchbare Marker schließen gewebsspezfische Enzyme ein, deren Aktivitäten untersucht werden können (beispielsweise spektrofotometrisch) nach Homogenisierung des Implantats. Diese Assays können zur Quantifizierung und zur Gewinnung einer Einschätzung der Gewebsbildung, kurz nachdem die Implantate aus dem Tier entfernt werden, brauchbar sein. Beispielsweise kann die alkalische Phosphatase-Aktivität als ein Marker für die Osteogenese verwendet werden.
Der Einbau von systemisch verabreichten Morphogenen kann folgen unter Verwendung von markierten Morphogenen (beispielsweise radioaktiv markierte) und deren Bestimmung in neuem Gewebe und/oder durch Überwachung ihres Verschwindens aus dem Kreislaufsystem unter Verwendung eines Standardpuls-Chase- Markierungsprotokolls. Das Morphogen kann ebenfalls mit einer gewebsspezifischen molekularen Markierung ausgestattet sein, deren Aufnahme überwacht und mit der Konzentration des verabreichten Morphogens korreliert werden kann. Als Beispiel hat die Ovar-Entfernung bei weiblichen Ratten eine reduzierte Knochen-alkalische Phosphatase-Aktivität zur Folge, was die Ratten gegenüber Osteoporose prädisponiert macht. Wenn die weiblichen Ratten nunmehr mit einem Morphogen ausgestattet werden, beispielsweise mit OP-1; ist eine Reduktion der systemischen Konzentration an Kalzium (CA²&spplus;) ersichtlich, die mit dem Vorhandensein des verabreichten Morphogens korreliert und kann als der erhöhten alkalischen Phosphatase-Aktivität entsprechend dargestellt werden.
Die vorliegenden Ausführungsformen werden deswegen in jeglicher Hinsicht als veranschaulichend und nicht als einschränkend betrachtet und der Umfang der Erfindung wird durch die beigefügten Ansprüche eher als durch die vorhergehende Beschreibung angezeigt und alle Veränderungen, die sich aus der Bedeutung und dem Äquivalenzbereich der Ansprüche ergeben, sollen deswegen von diesem eingeschlossen sein.

SEQUENZLISTE

(1) Allgemeine Information:
(i) Anmelder: Cohen, Charles M.
KUBERSAMPATH, THANGAVEL
PANG, ROY H. L.
OPPERMANN, HERMANN
RUEGER, DAVID C.
(ii) Titel der Erfindung: Protein-induzierte Morphogenese
(iii) Anzahl der Sequenzen: 23
(iv) Korrespondenz-Adresse:
(A) Adressat, Tester, Hurwitz & Thibeault
(B) Straße: 53 State Street
(C) Stadt: Boston
(D) Staat: Massachusetts
(E) Land: USA
(F) ZIP: 02109
(v) Computerlesbare Form
(A) Medium Typ: Floppy Disk.
(B) Computer: IBM PC compatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS DOS
(D) Software: PatentIn Release # 1,0, Version # 1,25
(vii) Frühere Anmelde-Daten:
(A) Anmeldenummer: US 667 274
(B) Anmeldetag: 11. März 1991
(vii) Frühere Anmelde-Daten:
(A) Anmeldenummer: US 752 764
(B) Anmeldetag: 30. August 1991
(2) Information für Seq ID Nr. 1:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 97 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäuren
(C) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(ix) Merkmal:
(A) Name: Generische Sequenz 1
(D) Weitere Information: jedes Xaa zeigt eine der 20 natürlich vorkommenden L-Isomer, α- Aminosäuren oder ein Derivat hiervon an. (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 1
(2) Information für Seq ID Nr. 2:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 97 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäuren
(C) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(ix) Merkmal:
(A) Name: Generische Sequenz 2
(D) Weitere Information: jedes Xaa zeigt eine der 20 natürlich vorkommenden L-Isomer, α- Aminosäuren oder ein Derivat hiervon an. (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 2
(2) Information für Seq ID Nr. 3:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 97 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäuren
(C) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(ix) Merkmal:
(A) Name: Generische Sequenz 3
(D) Weitere Information: wobei jedes Xaa unabhängig aus einer Gruppe einer oder mehrerer spezieller Aminosäuren ausgewählt ist, wie in der Beschreibung beschrieben ist. (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 3
(2) Information für Seq ID Nr. 4:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 102 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäuren
(C) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(ix) Merkmal:
(A) Name: Generische Sequenz 4
(D) Weitere Information: wobei jedes Xaa unabhängig aus einer Gruppe einer oder mehrerer spezieller Aminosäuren ausgewählt ist, wie in der Beschreibung beschrieben ist. (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 4
(2) Information für Seq ID Nr. 5:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 139 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäuren
(C) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(ix) Merkmal:
(A) Name: hOP-1 (reife Form) (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 5:
(2) Information für Seq ID Nr. 6:
(1) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 139 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäuren
(C) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(ix) Merkmal:
(A) Name: mOP-1 (reife Form) (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 6:
(2) Information für Seq ID Nr. 7:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 139 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäuren
(C) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(ix) Merkmal:
(A) Name: hOP-2 (reife Form) (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 7:
(2) Information für Seq ID Nr. 8:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 139 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäuren
(C) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(ix) Merkmal:
(A) Name: mOP-2 (reife Form) (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 8:
(2) Information für Seq ID Nr. 9:
(i) Sequenzeigenschaften:
(Ä) Länge: 96 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäuren
(C) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(ix) Merkmal:
(A) Name: CBMP-2A (fx) (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 9:
(2) Information für Seq ID Nr. 10:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 101 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäuren
(C) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(ix) Merkmal:
(A) Name: CBMP-2B (fx) (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 10:
(2) Information für Seq ID Nr. 11:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 102 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäuren
(C) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(ix) Merkmal:
(A) Name: DPP (fx) (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 11:
(2) Information für Seq ID Nr. 12:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 102 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäuren
(C) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(ix) Merkmal:
(A) Name: Vgl (fx) (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 12:
(2) Information für Seq ID Nr. 13:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 102 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäuren
(C) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(ix) Merkmal:
(A) Name: Vgr-1 (fx) (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 13:
(2) Information für Seq ID Nr. 14:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 106 Aminosäuren
(B) Typ: Protein
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(vi) Originalquelle:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(F) GEWEBSART: Gehirn
(ix) Merkmal:
(D) Weitete Information: /Produkt = "GDF-1 (fx)" (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 14:
(2) Information für Seq ID Nr. 15:
(1) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 5 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäuren
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Peptid (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 15:
(2) Information für Seq ID Nr. 16:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 1822 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: cDNA
(vi) Originalquelle:
(B) ORGANISMUS: HOMO SAPIENS
(F) GEWEBSART: HIPPOCAMPUS
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lokalisierung: 49..1341
(D) Weitere Information: /standard name "hOP- 1" (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 16:
(2) Information für Seq ID Nr. 17:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 431 Aminosäuren
(B) Typ: Protein
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(ix) Merkmal:
(D) Weitere Information: /Produkt = "OP1-PP" (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 17:
(2) Information für Seq ID Nr. 18:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 1873 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: cDNA
(vi) Originalquelle:
(C) ORGANISMUS: Muridae
(F) GEWEBSART: Embryo
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lokalisierung: 104..1393
(D) Weitere Information: /Bemerkung = "mOP1-1 (CDNA)" (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 18:
(2) Information für Seq ID Nr. 19:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 430 Aminosäuren
(B) Typ: Protein
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(ix) Merkmal:
(D) Weitere Information: /Produkt = "mOP1-PP" (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 19:
(2) Information für Seq ID Nr. 20:
(1) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 1723 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: cDNA
(vi) Originalquelle:
(D) ORGANISMUS: Homo sapiens
(F) GEWEBSART: Hippocampus
(ix) Merkmal:
(A} Name/Schlüssel: CDS
(8) Lokalisierung: 490..1696
(D) Weitere Information: /Bemerkung = "hOP2 (cDNA)" (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 20:
(2) Information für Seq ID Nr. 21:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 402 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(ix) Merkmal:
(D) Weitere Information: /Produkt = "hOP2-PP" (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 21:
(2) Information für Seq ID Nr. 22:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 1926 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: cDNA
(vi) Originalquelle:
(E) ORGANISMUS: Muridae
(F) GEWEBSART: Embryo
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lokalisierung: 93..1289
(D) Weitere Information: /Bemerkung = "mOP-2 cDNA" (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 22:
(2) Information für Seq ID Nr. 23:
(1) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 399 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein
(ix) Merkmal:
(D) Weitere Information: /Produkt = "mOP2-PP" (xi) Sequenzbeschreibung: Seq ID Nr. 23:

Claims

1. Zusammensetzung umfassend: (1) Eine biokompatible azelluläre Matrix, die ein Haftsubstrat für Säugetier-Vorläuferzellen bereitstellt und im wesentlichen frei von Substanzen ist, die die Morphogenese hemmen; und (b) ein an dieser Matrix in einer zur Induzierung der Entwicklungskaskade einer gewebsspezifischen Morphogenese sorbiertes Morphogen, wobei die Zusammensetzung in vivo an einem nicht-Skelett-Gewebsort angeordnet wird, wobei die Matrix Bestandteile aufweist, die für diesen Gewebs-Ort spezifisch sind.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der die Matrix biologisch abbaubar und/oder porös ist (die beispielsweise aus organspezifischem Gewebe stammt oder Kollagen oder Zellanlagerungsfaktoren umfaßt, die aus Glykosaminoglykanen und Proteoglykanen ausgewählt sind).

3. Zusammensetzung, die ein Morphogen in Verbindung mit einer Matrix umfaßt, die aus dehydriertem nicht-Skelett-Gewebe gewonnen wird.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei der die Matrix aus Lebergewebe oder aus demineralisiertem und Guanidinextrahiertem Dentin gewonnen wird, beispielsweise zur Verwendung in der Dentinogenese, der Leberregeneration, der Dentinregeneration oder der Reparatur von beschädigtem Leber- oder Dentingewebe (wobei die Schädigung beispielsweise durch Krankheit oder mechanische Verletzung entstanden ist).

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-4 für:

(a) die Vermehrung einer sich erneuernden Vorläuferzell- Population in einem Säugetier;

(b) das Induzieren einer nicht-Skelett-Gewebsmorphogenese in einem Säugetier;

(c) die Verwendung in einem Verfahren, umfassend die Schritte, auf der azellulären Matrix angeordnete Vorläuferzellen in vivo einem nicht-Skelett-Gewebs-Ort zu verabreichen, um dadurch eine nicht-Skelett-gewebsspezifische Differenzierung und Proliferation innerhalb des Ortes zu induzieren;

(d) die Aufrechterhaltung oder Wiederherstellung der phänotypischen Expression differenzierter Säugetierzellen (beispielsweise Zellen, die alt sind oder ruhen (oder einem Risiko ausgesetzt sind, dieses zu werden));

(f) das Induzieren der Proliferation von Säugetier-Vorläuferzellen (beispielsweise ex vivo).

6. Verwendung eines Morphogens (oder der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-5) zur Herstellung eines Medikamentes zur Unterstützung einer nicht-Skelett-Gewebs-Regeneration.

7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Gewebe ein anderes Gewebe als Knochen- und Knorpel-Gewebe ist, beispielsweise:

(a) Lungengewebe, das durch ein Emphysem geschädigt ist;

(b) zirrhotisches Leber- oder Nierengewebe;

(c) geschädigtes Herz- und/oder Blutgefäß-Gewebe (das beispielsweise aus Kardiomyopathien, artherothrombotischem oder kardioembolischem Schlaganfall entstanden sind);

(d) geschädigtes Magengewebe, das aus einer Ulzerierung entstanden ist;

(e) geschädigtes Nervengewebe (das beispielsweise aus einer körperlichen Verletzung oder degenerativen Erkrankungen entstanden ist);

(f) beschädigtes Dentingewebe (das beispielsweise aus einer Erkrankung oder mechanischen Verletzung entstanden ist).

6. Verwendung nach Anspruch 7 (e), bei der die degenerative Erkrankung die Alzheimer'sche Krankheit, multiple Sklerose oder ein Schlaganfall ist.

9. Verwendung eines Morphogens zur Herstellung eines Medikamentes für:

(a) die Stimulierung der Redifferenzierung von Zellen in vivo (beispielsweise zur Reduzierung oder zur im wesentlichen Hemmung der Tumorgenese und/oder des Wachstums von Neubildungen);

(b) die Krebstherapie (beispielsweise über Hemmung des Neubildungs-Wachstums);

(c) die Stimulierung der Redifferenzierung von determinierten Zellen in vivo;

(d) das Induzieren der De- oder Redifferenzierung von Neubildungen.

10. Verwendung eines Morphogens zur Herstellung eines Medikamentes für:

(a) die Vermeidung oder im wesentlichen Hemmung der Bildung von Narbengewebe;

(b) die Behandlung von Störungen, die sich aus einem Verlust oder einer Verminderung einer erneuerbaren Zellpopulation ergeben (beispielsweise Blutstörungen und Störungen, die sich aus verlorenen oder verschlechterten Immunfunktionen ergeben);

(c) die Behandlung von Störungen, die aus Zellalterung (beispielsweise von Leberzellen) oder Ruhezustand (beispielsweise Osteoporose) entstehen, über die Stimulierung der Zellen in vivo;

(d) die Verwendung in der Gentherapie zur Stimulierung des Wachstums von ruhenden Zellen und dadurch zur Steigerung des Einbaus von exogener DNA;

(e) den Nachweis der Gewebs-Dysfuriktion durch Beobachten der Spiegel von endogenen Morphogenen (beispielsweise zum Nachweis von Veränderungen der Gewebs- oder Organstasis);

(f) das Stimulieren der Proliferation von differenzierten Zellen;

(g) die Förderung der Gewebs-Stasis;

(h) die Dentinogenese oder Dentin-Regeneration;

(i) die Lebergewebsbildung;

(j) die Hautgewebs-Regeneration;

(k) die Heilung von gastrointestinalen Ulzera;

(l) den nicht-Skelett-Gewebsersatz in der plastischen Chirurgie;

(m) die Behandlung einer degenerativen Nervenerkrankung;

(n) das Induzieren der Innervation eines Gewebes;

(o) die Verwendung als Nervenschutzmittel;

(p) die Verwendung in der ZNS-Regeneration;

(q) das Induzieren der Gewebsmorphogenese in Säugetiergewebe, wobei das Gewebe nicht Knochen oder Knorpel-Gewebe ist;

(r) das ex vivo-Stimulieren von Zellen gefolgt von dem Anordnen der stimulierten Zellen in einem gewebsspezifischen Ort, zum Induzieren einer Gewebsmorphogenese;

(s) die Verwendung in einem Verfahren, umfassend die Schritte, Vorläuferzellen aus Knochenmark zu isolieren, diese Zellen ex vivo zum Induzieren einer Proliferation zu stimulieren und diese Zellen zu dem Knochenmark zu übertragen;

(t) die Verwendung in einem Verfahren, umfassend die Schritte, biokompatible Zellen aus einer Kulturzell-Linie zu isolieren, Zellen ex vivo zum Induzieren einer Proliferation zu stimulieren und diese Zellen zu implantieren;

(u) das Induzieren einer mitogenen Aktivität einer Vorläuferzell-Population in vivo (beispielsweise unter Verwendung eines Morphogens, das zur systemischen Verabreichung, Implantation oder Injektion geeignet ist);

(v) die Vermehrung einer ausgewählten Population von hämatopoetischen Stammzellen (beispielsweise durch Extrahieren von Zellen aus dem Blut durch Perfusion und Stimulieren der Zellen ex vivo zur Gewinnung stimulierter Zellen, die dazu geeignet sind, wieder an das Blut zurückgegeben zu werden);

(w) die Vermehrung einer sich erneuernden Vorläuferzell-Population in einem Säugetier;

(x) das Induzieren einer nicht-Skelett-Gewebsmorphogenese in einem Säugetier;

(y) die Verwendung in einem Verfahren, umfassend die Schritte, auf der azellulären Matrix angeordnete Vorläuferzellen einem nicht-Skelett-Gewebs-Ort in vivo zu verabreichen, um dadurch eine nicht-Skelett-gewebsspezifische Differenzierung und Proliferation innerhalb des Ortes zu induzieren;

(z) das Induzieren eines nicht-Skelett-Ersatzgewebes in einem nicht-Skelett-Gewebs-Ort in einem Säugetier;

(aa) die Aufrechterhaltung oder Wiederherstellung der phänotypischen Expression von differenzierten Säugetierzellen (beispielsweise Leberzellen), die beispielsweise alt oder im Ruhezustand sind (oder einem Risiko ausgesetzt sind, dieses zu werden);

(ab) das Induzieren der Proliferation von Säugetier-Vorläuferzellen (beispielsweise ex vivo), unter dem Vorbehalt, daß die Zellen in (b), (c), (f), (r), (s), (t), (u), (w) und (ab) gellen aus nicht-Skelett-Gewebe sind.

11. Zusammensetzung oder Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Morphogen ein dimeres Morphogen umfaßt, das eine gewebsspezifische Morphogenese bei dem Säugetier induziert und das zwei gefaltete Polypeptide umfaßt, wobei deren Aminosäuresequenz jeweils eine Sequenz umfaßt, die zumindest 70%, beispielsweise zumindest 80% Homologie mit den Resten 38 bis 139 von hOP1 (Sequenz ID Nr. 5) teilt.

12. Zusammensetzung oder Verwendung nach Anspruch 11, bei der die Aminosäuresequenz mehr als 60%, beispielsweise mehr als 65%, Aminosäureidentität mit den Resten 43 bis 139 von hOP1 (Sequenz ID Nr. 5) aufweist.

13. Zusammensetzung oder Verwendung nach Anspruch 12, bei der die Aminosäuresequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Resten 38 bis 139 von hOP1 (Sequenz ID Nr. 5); mOP1 (Sequenz ID Nr. 6); hOP2 (Sequenz ID Nr. 7) oder mOP2 (Sequenz ID Nr. 8) ausgewählt ist oder eine natürlich vorkommende oder biosynthetische Variante einer Sequenz ist, die aus dieser Gruppe ausgewählt ist.

14. Zusammensetzung oder Verwendung nach einem der Ansprüche 11-13, wobei die Aminosäuresequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Sequenz ID Nr. 9, 10, 11, 12, 13 und 14 ausgewählt ist oder eine natürlich vorkommende oder biosynthetische Variante dieser Sequenz ist.

15. Zusammensetzung oder Verwendung nach einem der Ansprüche 11-14, wobei die Sequenz der Morphogen-Polypeptide jeweils weiterhin eine Aminosäuresequenz umfassen, die aus den Resten 1 bis 37 der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Sequenz ID Nr. 5, 6, 7 und 8, oder eine natürlich vorkommenden oder biosynthetischen Variante hiervon bestehen, derartig, daß die Sequenzen eine Sequenz umfassen, die aus den Sequenzen von reifem hOP1, mOP1, hOP2 oder natürlich vorkommenden oder biosynthetischen Varianten hiervon ausgewählt sind.

16. Verfahren zum Nachweis einer nicht-Skelett-Gewebs-Dysfunktion durch Beobachtung der Spiegel endogener Morphogene (beispielsweise zum Nachweis von Veränderungen in der Gewebs- oder Organstasis).

17. Ex vivo-Verfahren der:

(a) Vermehrung einer Population von Säugetier-Vorläuferzellen; oder

(b) Aufrechterhaltung der phänotypischen Expression von differenzierten Säugetierzellen (beispielsweise Zellen, die einem Risiko ausgesetzt sind, alt oder ruhend zu werden);

Umfassend den Schritt, die Zellen ex vivo mit einem Morphogen in einer Konzentration und für eine ausreichende Zeit lang in Berührung zu bringen, derartig, daß die Vorläuferzellen zur Poliferation oder zum Exprimieren (oder wieder exprimieren) ihres Phänotyps stimuliert werden, wobei die Zellen Zellen aus nicht-Skelett-Gewebe sind.