DE69528081T2 - Osmium enthaltender redoxvermittler - Google Patents
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Description
- Die Erfindung betrifft Redoxvermittler und insbesondere solche Redoxvermittler, die für elektrochemische Biosensoren brauchbar sind.
- Redoxvermittler (Elektronenübertragungsagenzien) werden in großem Umfang in elektrochemischen Biosensoren eingesetzt, die zur diagnostischen Prüfung auf Analyte wie etwa Glucose, Cholesterin, Fructose, Galactose, Nitrat, Sulfid, Bilirubin und verschiedene Aminosäuren verwendet werden. Die Funktion des Redoxvermittlers besteht darin, Elektronen wirkungsvoll von den analytspezifischen Enzymen (beispielsweise Glucoseoxidase, wenn der zu messende Analyt Glucose ist) zur Elektrodenoberfläche des Biosensors zu befördern. Er ist eine kritische Komponente für die erfolgreiche Arbeitsweise eines elektrochemischen Biosensors. Allerdings treten bei vielen der in elektrochemischen Biosensoren verwendeten Redoxvermittler merkliche Störungen durch elektroaktive Spezies auf, die in den zu messenden Proben vorhanden sind. Zu den störenden Substanzen zählen Ascorbinsäure, Harnsäure, Acetaminophen und Bilirubin. Störungen durch diese elektroaktiven Spezies zu minimieren bedeutet eine gewaltige Herausforderung für die Forschung bei elektrochemischen Biosensoren.
- Von Ohara et al., Polym. Mater. Sci. Eng., Bd. 70, S. 182- 183; Csöregi et al., Anal. Chem., Bd. 66, S. 3131-3138; Ohara et al., Anal. Chem., Bd. 66, S. 2451-2457; und Rajagopalan et al., Chemical Abstracts, Bd. 123, Abstract Nr. 322018; sind sogenannte "verdrahtete" Enzymelektroden bekannt, bei denen bestimmte, mit Polyvinylimidazol komplexierte Osmium-Verbindungen eingesetzt werden.
- Die Erfindung besteht aus einer neuen Gruppe von Verbindungen der folgenden Formel:
- worin
- R und R' gleich oder verschieden sind und 2,2'-Bipyridyl, 4,4'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl, 5,5'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl, 1,10-Phenanthrolinyl, 4,7-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl oder 5,6-disubstituiertes 1,30-Phenanthrolinyl sind, wobei die Disubstitution eine Methyl-, Ethyl- oder Phenyl-Gruppe ist,
- R und R' über ihre Stickstoff-Atome an Os koordiniert sind,
- R" Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist,
- Z Chlor oder Brom ist,
- m +1 oder +2 ist,
- X ein Anion ist und Chlorid, Bromid, Iodid, Fluorid, Tetrafluoroborat, Perchlorat, Nitrat, Sulfat, Carbonat oder Sulfit ist,
- Y ein Anion ist und Chlorid, Bromid, Iodid, Fluorid, Tetrafluoroborat, Perchlorat oder Nitrat ist, und
- n 1 oder null ist,
- jedoch, wenn X Sulfat, Carbonat oder Sulfit ist, n null ist, und
- wenn m +1 ist, n null ist und X nicht Sulfat, Carbonat oder Sulfit ist,
- wobei die Wasserlöslichkeit der Verbindung höher als etwa 1 millimolar (mM) ist.
- Diese Verbindungen sind als Redoxvermittler in elektrochemischen Biosensoren brauchbar (Redoxvermittler werden auch als Elektronenübertragungsagenzien oder Elektronenübertragungsvermittler bezeichnet). Die vorliegenden erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen die wichtige und beispiellose Kombination aus 1) niedrigem Oxidationspotential (vorzugsweise ein E1/2 von etwa 0 Millivolt (mV) bis etwa 150 mV gegen eine Silber/Silberchlorid(Ag/AgCl)-Bezugselektrode), 2) schnelle Reaktionskinetik zwischen dem elektroaktiven Zentrum eines Enzyms und der Verbindung, 3) langsame Oxidation von Osmium durch Sauerstoff, und 4) ausgezeichnete Löslichkeit in wäßrigen Medien wie etwa Vollblut oder Blutserum. Verbindungen, die weniger als alle vier dieser Merkmale aufweisen, ergeben schlechtere Leistungsfähigkeit in einem elektrochemischen Biosensor, der Blutanalyte wie z. B. Glucose nachweisen oder messen soll, und fallen nicht in den Umfang der vorliegenden Erfindung.
- Durch das niedrige Oxidationspotential der vorliegenden erfindungsgemäßen Verbindungen kann ein elektrochemischer Biosensor bei Potentialen arbeiten, bei denen Störungen durch elektroaktive Spezies wie etwa Bilirubin, Acetaminophen, Ascorbinsäure und Harnsäure gering sind.
- Durch die schnelle Reaktionskinetik zwischen dem elektroaktiven Zentrum eines Enzyms und der Verbindung kann die Verbindung wirksamer mit störenden Spezies beim Abfangen von Elektronen aus dem Redoxzentrum des Enzyms konkurrieren. Wird zum Beispiel Glucose in einer Blutprobe gemessen und Glucoseoxidase (GOD) als Enzym zur Erleichterung der Oxidation von Glucose verwendet, so kann der Sauerstoff in der Blutprobe mit einem Redoxvermittler beim Abfangen von Elektronen aus dem GOD-Redoxzentrum (der Flavin-adenin-dinucleotid(FAD)-Teil von GOD) konkurrieren. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zeigen hinreichend schnelle Reaktionskinetik zwischen der Verbindung und dem FAD-Teil von GOD, so daß die Konkurrenz durch Sauerstoff verringert wird und in einigen Fällen unbedeutend ist.
- Bei einer elektrochemischen Analyse führt die Oxidation des Redoxvermittlers durch molekularen Sauerstoff (der in physiologischen Proben vorhanden ist) zu Analysefehlern. Diese Fehler sind bei den vorliegenden erfindungsgemäßen Verbindungen unbedeutend, da die Oxidation dieser Verbindungen durch Sauerstoff sehr langsam verläuft.
- Für einen in einem elektrochemischen Biosensor verwendeten Redoxvermittler ist es wichtig, daß er in wäßrigen Medien gut löslich ist, da viele wichtige analytische Proben wie etwa Vollblut oder Blutserum wäßrigbasiert sind. Die vorliegenden erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen ausgezeichnete Löslichkeit in wäßrigen Medien.
- Fig. 1 ist ein Cyclovoltammogramm von [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2;, worin im Imidazolyl ist.
- Fig. 2 ist ein Cyclovoltammogramm von [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2;, worin im N-Methylimidazolyl ist.
- Fig. 3 zeigt die Form einer Gegenelektrode eines Biosensorsystems, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
- Fig. 4 zeigt die Form von Arbeits- und Gegenelektrode eines Biosensorsystems, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
- Fig. 5 zeigt die schnelle Reaktionskinetik zwischen dem elektroaktiven Zentrum von Glucoseoxidase und zwei Verbindungen der vorliegenden Erfindung.
- Fig. 6 zeigt den verringerten Hämatokrit-Effekt bei einem Glucose-Test, der mit einer der Verbindungen der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde.
- Die vorliegende Erfindung besteht aus einer wichtigen neuen Klasse von Redoxvermittlern, die für elektrochemische Biosensoren brauchbar sind. Die Verbindungen haben die folgende chemische Formel:
- worin
- R und R' gleich oder verschieden sind und 2,2'-Bipyridyl, 4,4'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl, 5,5'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl, 1,10-Phenanthrolinyl, 4,7-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl oder 5,6-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl sind, wobei die Disubstitution eine Methyl-, Ethyl- oder Phenyl-Gruppe ist,
- R und R' über ihre Stickstoff-Atome an Os koordiniert sind,
- R" Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist,
- Z Chlor oder Brom ist,
- m +1 oder +2 ist,
- X ein Anion ist und Chlorid, Bromid, Iodid, Fluorid, Tetrafluoroborat, Perchlorat, Nitrat, Sulfat, Carbonat oder Sulfit ist,
- Y ein Anion ist und Chlorid, Bromid, Iodid, Fluorid, Tetrafluoroborat, Perchlorat oder Nitrat ist, und
- n 1 oder null ist,
- jedoch, wenn X Sulfat, Carbonat oder Sulfit ist, n null ist, und
- wenn m +1 ist, n null ist und X nicht Sulfat, Carbonat oder Sulfit ist,
- wobei die Wasserlöslichkeit der Verbindung höher als etwa 1 millimolar (mM) ist.
- Diese Verbindungen besitzen die folgende vorteilhafte Merkmalskombination: 1) niedriges Oxidationspotential, 2) schnelle Reaktionskinetik zwischen dem elektroaktiven Zentrum eines Enzyms und der Verbindung (Redoxvermittler), 3) langsame Oxidation des Osmiums durch Sauerstoff, und 4) ausgezeichnete Löslichkeit in wäßrigen Medien.
- Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind brauchbar als Redoxvermittler bei den Erfindungen, die beschrieben sind in Pollmann et al., US-Patent Nr. 5 288 636, ausgestellt am 22. Februar 1994; Nankai et al., US-Patent Nr. 5 120 420, ausgestellt am 9. Juni 1992; Nankai et al. US- Patent Nr. 4 897 173, ausgestellt am 30. Januar 1990; Shanks et al., US-Patent Nr. 5 141 868, ausgestellt am 25. August 1992; und Kawaguri et al., US-Patent Nr. 5 171 689, ausgestellt am 15. Dezember 1992.
- Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung lassen sich mit Hilfe des folgenden allgemeinen Schemas herstellen, das in Form eines Fließbilds dargestellt ist:
- Z = Chlor oder Brom
- im = Imidazol, N-Methylimidazol oder n-Ethylimidazol
- X = Chlorid, Bromid, Iodid, Fluorid, Tetrafluoroborat, Perchlorat, Nitrat, Sulfat, Carbonat oder Sulfit
- Y = Chlorid, Bromid, Iodid, Fluorid, Tetrafluoroborat, Perchlorat oder Nitrat
- HX und HY bedeuten saure Formen von X und Y
- * NOCl oder (NO)&sub2;SO&sub4; können an Stelle von NOBF&sub4; verwendet werden, um ein Produkt mit den Gegenionen ClY oder SO&sub4; anstatt BF&sub4;Y zu ergeben.
- Die Synthese der im obigen Fließbild gezeigten Verbindungen wird in der folgenden Reihenfolge unter den folgenden Überschriften beschrieben:
- I. Synthese (oder Verfügbarkeit im Handel) der Liganden R und R'
- A. Im Handel erhältliche Liganden R und R'
- B. 4,4'-Diethyl-2,2'-bipyridin
- C. 5,5'-Dimethyl-2,2'-bipyridin
- D. 5,5'-Diethyl-2,2'-bipyridin und 5,5'-Diphenyl-2,2'- bipyridin
- E. 4,7-Diethyl-1,10-phenanthrolin
- F. 5,6-Diethyl-1,10-phenanthrolin
- G. 5,6-Diphenyl-1,10-phenanthrolin
- II. Synthese von Os(R)(R')Z&sub2;
- A. Os(R)(R')Cl&sub2;
- B. Os(R)(R')Br&sub2;
- III. Synthese von [Os(II)(R)(R')imZ]Y
- A. [Os(II)(R)(R')imZ]Cl
- B. [Os(II)(R)(R')imZ]Br
- C. N-Methylimidazol- und N-Ethylimidazol-Analoga
- D. Austausch der Gegenionen
- E. Andere Methode zur Synthese von [Os(II)(R)(R')imZ]Y
- IV. Synthese von [Os(III)(R)(R')imZ]²&spplus;XYn
- A. [Os(III)(R)(R')imZ]²&spplus;BF&sub4;Y;
- [Os(III)(R)(R')imZ]²&spplus;SO&sub4;; und
- [Os(III)(R)(R')imZ]²&spplus;ClY
- B. Austausch der Gegenionen
- C. Alternative Oxidationsmethoden
- Die folgenden Verbindungen für R und R' sind von Aldrich Chemical Co. im Handel erhältlich: 2,2'-Bipyridin, 4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridin, 4,4'-Diphenyl-2,2'-bipyridin, 1,10- Phenanthrolin; 4,7-Dimethyl-1,10-phenanthrolin, 4,7-Diphenyl-1,10-phenanthrolin und 5,6-Dimethyl-1,10-phenanthrolin.
- Weitere Verbindungen für R und R' lassen sich wie nachstehend gezeigt synthetisieren.
- 4,4'-Diethyl-2,2'-bipyridin läßt sich nach dem bei Rosevear et al., Journal of Heterocyclic chemistry, Bd. 8, Seite 483-485 (1971), beschriebenen Verfahren synthetisieren.
- 1 Gramm (g) 5% oder 10% Palladium/Kohle-Katalysator und 25 Milliliter (ml) 4-Ethylpyridin werden 3 Tage lang unter Rühren am Rückfluß erhitzt. (Alternativ kann 5% Platin auf Kohle oder 5% Rhodium auf Kohle als Katalysator verwendet werden.) Die Reaktionsmischung wird mit siedendem Benzol behandelt, filtriert und destilliert, um Benzol, 4-Ethylpyridin und 4,4'-Diethyl-2,2'-bipyridin zu ergeben.
- 5,5'-Dimethyl-2,2'-bipyridin läßt sich mit Hilfe des bei Case, J. Am. Chem. Soc. Bd. 68, Seite 2574-2577 (1946), beschriebenen Verfahrens herstellen.
- Zunächst wird 2-Brom-5-methylpyridin wie folgt hergestellt:
- Eine Mischung aus 55 g 5-Methyl-2-pyridon und 180 g Phosphortribromid wird 3 Stunden lang auf 180-190ºC erhitzt. Nach dem Abkühlen wird der Inhalt des Kolbens mit Eiswasser zersetzt, mit Natriumhydroxid alkalisch gemacht und mit Ether extrahiert. Nach Abziehen des Ethers wird der Rückstand im Vakuum destilliert. Die Destillation muß möglicherweise wiederholt werden.
- 2-Brom-5-methylpyridin kann auch mit Hilfe der Methode von Craig (Craig, J. Am. Chem. Soc. Bd. 56, Seite 232 (1934)) wie folgt hergestellt werden:
- Eine Lösung von 12 g 2-Amino-5-methylpyridin in 70 Milliliter (ml) 47% Bromwasserstoffsäure wird mit 17 ml Brom versetzt. Eine Lösung von 21 g Natriumnitrit in 30 ml Wasser wird dann nach und nach zugegeben, wobei die Temperatur bis gegen Ende der Reaktion unter 5ºC gehalten wird, wo sie spontan auf etwa 10ºC ansteigt. Dann wird eine Lösung von 45 g Natriumhydroxid in 115 ml Wasser zugesetzt, wobei die Temperatur unter 25ºC gehalten wird. Das resultierende Öl wird mit Ether extrahiert und im Vakuum destilliert. Das Produkt kanh unter Atmosphärendruck redestilliert werden.
- 5,5'-Dimethyl-2,2'-bipyridin kann aus 2-Brom-5-methylpyridin wie folgt hergestellt werden:
- Eine Mischung aus 18,5 g 2-Brom-5-methylpyridin und 29 g Kupferpulver wird auf 220ºC erhitzt, und die Temperatur wird im Lauf einer Dreiviertelstunde nach und nach auf 240ºC angehoben. Nach dem Abkühlen wird die Reaktionsmischung mit verdünnter Salzsäure extrahiert, mit einer Natriumhydroxid/Ammoniumhydroxid-Mischung alkalisch gemacht und mit Ether extrahiert. Der Ether kann am Rotationsverdampfer abgezogen werden.
- In ähnlicher Weise können 5,5'-Diethyl-2,2'-bipyridin und 5,5'-Diphenyl-2,2'-bipyridin mit Hilfe des gleichen Verfahrens wie oben für 5,5'-Dimethyl-2,2'-bipyridin beschrieben hetgestellt werden, indem die passende Pyridon- oder Pyridin-Verbindung in das obige Verfahren eingesetzt wird (zum Beispiel wird 5-Ethyl-2-pyridon oder 2-Amino-5-ethylpyridin in das vorstehend beschriebenen Verfahren eingesetzt, um 2-Brom-5-ethylpyridin zu ergeben, das dann unter Erhitzen mit Kupfer umgesetzt wird, um 5,5'-Diethyl-2,2'bipyridin zu ergeben).
- 4,7-Diethyl-1,10-phenanthrolin läßt sich wie folgt herstellen:
- Eine gerührte Mischung aus einem 1molaren Anteil o-Nitroanilin, 1 mol Arsensäure-hemihydrat, 4 mol Schwefelsäure in 96,8%iger Lösung und einem Volumen Wasser gleich 1/3 des Volumens der verwendeten Schwefelsäure wird auf 100ºC erhitzt und mit 2 mol 1-Chlor-3-pentanon (erhältlich von Aldrich Chemical Co., Inc.) mit einer Geschwindigkeit versetzt, daß die Temperatur 140ºC nicht übersteigt. Es wird 2 Stunden lang bei dieser Temperatur weiter erhitzt. Die Mischung wird dann in Wasser gegossen, alkalisch gemacht, und der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt. Sowohl das Filtrat als auch der Niederschlag werden mit heißem Benzol extrahiert. Nach Abziehen des Lösungsmittels wird das resultierende 4-Ethyl-8-nitrochinolin aus Benzol/Petrolether kristallisiert.
- Ein alternatives Verfahren zur Herstellung von 4-Ethyl-8- nitrochinolin ist wie folgt:
- Eine gerührte Mischung aus einem 1molaren Anteil o-Nitroanilin, 2 mol Arsensäure-hemihydrat und 85%iger Phosphorsäure (100 ml pro 0,1 mol o-Nitroanilin) wird auf 100ºC erhitzt und tropfenweise mit 1-Chlor-3-pentanon (1,3 mol) mit einer Geschwindigkeit versetzt, daß die Temperatur 105ºC nicht übersteigt. Diese Temperatur wird für weitere 0,5 Stunden beibehalten. Die Reaktionsmischung wird dann auf Eis gegossen und mit konzentriertem Ammoniumhydroxid neutralisiert. Der resultierende Niederschlag und auch das Filtrat werden mit heißem Benzol extrahiert, und die vereinigten Extrakte werden zur Trockene eingedampft. Das resultierende 4-Ethyl-8-nitrochinolin wird aus Benzol/Petrolether umkristallisiert.
- 4-Ethyl-8-nitrochinolin wird durch katalytische Reduktion mit Adams-Katalysator wie folgt zu 4-Ethyl-8-aminochinolin reduziert: eine Lösung von 0,05 mol 4-Ethyl-8-nitrochinolin in 100 ml rektifiziertem Spiritus (Ethylalkohol) wird zusammen mit 0,1 g Adams-Katalysator (Platin(IV)-oxid, erhältlich von Aldrich Chemical Co., Inc.) in einen Hydrierkolben gegeben und in Wasserstoff geschüttelt. Nach Aufnahme des theoretischen Wasserstoff-Volumens wird das Platin abgesaugt und das Reaktionsgefäß mit rektifiziertem Spiritus gespült. Der Alkohol des mit den Waschlösungen vereinigten Filtrats wird auf einem Wasserbad abgezogen. Der rohe Rückstand wird in rektifiziertem Spiritus gelöst, mit wenig entfärbender Aktivkohle versetzt, aufgekocht und filtriert. Man erhitzt das Filtrat zum Sieden, gibt heißes Wasser zur Einleitung der Kristallisation zu und läßt abkühlen.
- Die gleichen, vorstehend ausgeführten Verfahrensweisen zur Herstellung von 4-Ethyl-8-nitrochinolin können nun zur Herstellung von 4,7-Diethyl-1,10-phenanthrolin angewandt werden, indem 4-Ethyl-8-aminochinolin für o-Nitroanilin eingesetzt wird.
- 5,6-Diethyl-1,10-phenanthrolin läßt sich mit Hilfe des folgenden Verfahrens herstellen:
- Eine Mischung aus 175 ml rauchender Salpetersäure (spezifisches Gewicht 1,59-1,60) und 87,5 ml Eisessig wird auf 10ºC abgekühlt. Unter kräftigem Rühren dieser Lösung werden 50 g o-Diethylbenzol mit einer Geschwindigkeit zugesetzt, daß die Temperatur zwischen 10-20ºC gehalten wird. Nachdem das letzte o-Diethylbenzol zugesetzt ist, wird 45 Minuten lang bei der gleichen Temperatur weitergerührt. Die Reaktionsmischung wird dann in 1 Liter Eiswasser gegossen. Die rohe Nitro-Verbindung wird mit 4 · 125 ml-Portionen Ether extrahiert, und der Ether-Extrakt wird mit 3 · 50 ml-Portionen Wasser, 6 · 50 ml-Portionen 10% Natriumhydroxid-Lösung (bis zur alkalischen Reaktion) und wiederum mit 3 · 50 ml- Portionen Wasser gewaschen. Der Ether-Extrakt wird dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel abgezogen. Das Produkt wird aus einem Claisen-Kolben bei einem Druck von 10 mmHg destilliert. Die bei 130-150ºC siedende Fraktion wird aufgefangen. Die verwendete Säule ist 60 Zentimeter lang, hat einen Innendurchmesser von 1,5 Zentimeter und ist mit kleinen Einfachglaswendeln gefüllt. Der Fraktionierkopf ist so ausgestaltet, daß jeder gewünschte Anteil Kondensat in die Säule zurückgeleitet werden kann. Das Material wird dreimal hintereinander in drei Bereiche zwischen 120-141ºC fraktioniert. Das 1,2-Diethyl-4- nitrobenzol wird im Siedebereich von 139-141ºC bei einem Druck von 10 mmHg aufgefangen.
- 1,2-Diethyl-4-nitrobenzol wird dann mit Hilfe des folgenden Verfahrens in 3,4-Diethylanilin überführt: 1,2-Diethyl-4- nitrobenzol wird in einer Parr-Hydrierapparatur bei einem Anfangsdruck von 413·10&sup5; N/m² (60 psi) unter Verwendung von Platinoxid, Platin auf Zirconium oder Palladium auf Zirconiumoxid katalytisch reduziert. 17,9 g (0,1 mol) 1,2-Diethyl-4-nitrobenzol werden in 150 ml absolutem Alkohol gelöst, und es werden 0,2 g Platinoxid zugegeben. Bei 24ºC ist die Reduktion in 20 Minuten zu 97% vollständig und zu 100% in 1 Stunde. Katalysator und Lösungsmittel werden abgetrennt, und das 3,4-Diethylanilin wird bei einem Druck von 10 mmHg destilliert, um das Produkt zu ergeben.
- Als nächstes wird 3,4-Diethylanilin mit Hilfe des folgenden Verfahrens in 4,5-Diethyl-2-nitrocarbethoxyanilid überführt:
- 28,7 g (0,193 mol) 3,4-Diethylanilin, 73 ml Aceton, 43 ml Wasser und 34 ml Natriumhydroxid-Lösung (24%) sowie 29 g Ethylchlorcarbonat werden zur Herstellung des Urethans eingesetzt. Das Urethan wird direkt bei der Nitrierung verwendet, die in einer Mischung aus 118 ml konzentrierter Salpetersäure und 43 ml konzentrierter Schwefelsäure durchgeführt wird. Nachdem das Produkt auf Eis gegossen worden ist und sich verfestigt hat, wird es in Ether gelöst. Die Ether-Lösung wird mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wird auf einem Dampfbad abgezogen. Das Produkt wird aus Alkohol umkristallisiert.
- Als nächstes wird 4,5-Diethyl-2-nitrocarbethoxyanilid mit Hilfe des folgenden Verfahrens in 4,5-Diethyl-2-nitroanilin überführt.
- Eine Lösung von 20 g Natriumhydroxid; 50 ml Wasser und 150 ml Alkohol wird mit 12,1 g (0,062 mol) 4,5-Diethyl-2- nitrocarbethoxyanilid versetzt. Unter Rühren der Lösung wird die Temperatur auf 70ºC angehoben und eine Stunde lang beibehalten. Der Alkohol wird unter vermindertem Druck abgezogen, und es werden 100 ml Wasser zugesetzt. Die Suspension wird wiederholt mit Benzol extrahiert. Die Benzol- Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Benzol wird unter vermindertem Druck abgezogen. Der Rückstand wird aus verdünntem Alkohol umkristallisiert. Das Nitroanilin-Produkt ist wasserdampfdestillierbar. Das Nitroanilin-Produkt wird durch Wasserdampfdestillation isoliert, und das Destillat wird mit Ether extrahiert. Nach Trocknen des Ether-Extrakts und Abziehen des Ethers wird der Rückstand unter vermindertem Druck destilliert, um 4,5- Diethyl-2-nitroanilin zu ergeben.
- 5,6-Diethyl-8-nitrochinolin kann mit Hilfe der obigen alternativen Verfahren zur Herstellung von 4-Ethyl-8- nitrochinolin aus o-Nitroanilin hergestellt werden, indem 3,5 mol Glycerin für die 2 mol 1-Chlor-3-pentanon in das Verfahren eingesetzt werden, bei dem Schwefelsäure verwendet wird.
- 5,6-Diethyl-8-nitrochinolin wird durch Behandlung mit Adams-Katalysator wie vorstehend beschrieben in 5,6-Diethyl-8-aminochinolin überführt. Das 5,6-Diethyl-8-aminochinolin wird dann mit Hilfe des gleichen Verfahrens in 5,6-Diethyl-1,10-phenanthrolin überführt, das zur Überführung von 4,5-Diethyl-2-nitroanilin in 5,6-Diethyl-8-nitrochinolin beschrieben wurde, mit der Ausnahme, daß das Erhitzen nach der Glycerin-Zugabe 25 Minuten und nicht 2 Stunden lang fortgesetzt wird. Das 5,6-Diethyl-1,10- phenanthrolin wird aus Petrolether umkristallisiert.
- 5,6-Diphenyl-1,10-phenanthrolin kann mit Hilfe des gleichen Verfahrens hergestellt werden, mit dem 5,6-Diethyl-1,10- phenanthrolin dargestellt wird, mit der Ausnahme, daß bei der ersten Reaktion der Sequenz, die schließlich das Phenanthrolin-Produkt ergibt, o-Diphenylbenzol und nicht o-Diethylbenzol als Ausgangsmaterial verwendet wird.
- Os(R)(R')Cl&sub2; kann mit Hilfe des folgenden Verfahrens hergestellt werden:
- 19,335 g K&sub2;OsCl&sub6; (0,04019 mol) und 0,08512 mol R + R' (wenn R und R' beispielsweise beide 2,2'-Bipyridin sind, entspricht die Gesamtmenge von 13,295 g 2,2'-Bipyridin 0,08512 mol) werden in etwa 400 ml N,N'-Dimethylformamid (DMF) gelöst. Die resultierende Lösung wird gerührt und auf Rückfluß erhitzt, der 1 Stunde lang beibehalten wird (wobei zu starkes Sieden zu vermeiden ist).
- Nach dem Rückflußerhitzen wird der Inhalt des Reaktionsgefäßes über einen Zeitraum von 1-2 Stünden auf 30-40ºC abgekühlt. Die resultierende Mischung wird mit Hilfe eines Glasfrittenfilters mittlerer Größe abgenutscht. Das Reaktionsgefäß wird mit 20 ml DMF gespült, und die Spülflüssigkeit wird über das Frittenfilter filtriert. Das resultierende Filtrat wird in ein 3 Liter(l)-Becherglas überführt und gerührt.
- Zu der gerührten Lösung wird eine Lösung von 22,799 g Na&sub2;S&sub2;O&sub4; in 2 l deionisiertem Wasser tropfenweise über 45 Minuten zugesetzt. Die resultierende Mischung wird in einem Eisbad mehr als 3 Stunden lang gekühlt. Die gekühlte Mischung wird dann unter Verwendung eines qualitativen Whatman-Filterpapiers in einer Keramiknutsche abgesaugt. Die filtrierten Feststoffe werden dann zweimal mit 50 ml Wasser, zweimal mit 50 ml Methanol und zweimal mit 50 ml Ether gewaschen. Das filtrierte feste Produkt wird unter Hochvakuum (etwa 762 mm (30 inch) Hg bei 50ºC über mehr als 15 Stunden (oder über Nacht)) getrocknet. Das Produkt wird in eine braune Flasche mit Schraubverschluß überführt, und die Flasche wird in einem Exsikkator bei Raumtemperatur aufbewahrt.
- Das obige Verfahren kann zur Herstellung von Os(R)(R')Br&sub2; abgewandelt werden, indem die 0,04019 mol K&sub2;OsCl&sub6; durch eine äquivalente molare Menge (NH&sub4;)&sub2;OsBr&sub6; ersetzt werden, das von Strem oder Johnsohn Matthey erhältlich ist. (K&sub2;OsCl&sub6; kann von Strem, Aldrich oder Matthey Johnson bezogen werden.)
- Die vorstehend beschriebenen Syntheseverfahren können zur Herstellung der obengenannten Verbindungen Os(R)(R')Z&sub2; herangezogen werden. Allerdings kann es bisweilen erforderlich sein, die Reaktionsbedingungen und die Verfahren zur Produktisolierung in einer Weise anzugleichen, die durchaus zum normalen Wissensstand auf dem Gebiet der synthetischen Chemie gehört.
- Die Synthese von [Os(II)(R)(R')imZ]Cl ist nachstehend angegeben:
- 0,0244 mol Os(R)(R')Cl&sub2; und 2,30 g Imidazol (0,0338 mol) werden in 1200 ml Ethanol/deionisiertem Wasser, 50 : 50 (Vol./Vol.) gelöst. Es wird gerührt und auf Rückfluß erhitzt, der 6 Stunden lang beibehalten wird (wobei zu starkes Sieden zu vermeiden ist). Nach dem Rückflußerhitzen wird weitergerührt, und die Reaktionsmischung wird über einen Zeitraum von einer Stunde auf 30-40ºC abgekühlt. Nun wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer abgezogen. Der resultierende Rückstand (Produkt) wird mit 50 ml Ether gespült. Das Produkt wird dann unter Hochvakuum (etwa 762 mm (30 inch) Hg bei 50ºC über mehr als 15 Stunden (über Nacht)) getrocknet. Nach dem Trocknen wird das Produkt in eine braune Flasche mit Schraubverschluß überführt und in einem Exsikkator bei Raumtemperatur aufbewahrt.
- Die Verbindung [Os(II)(R)(R')imZ]Br kann anstatt [Os(II)(R)(R')imZ]Cl hergestellt werden, indem 0,0244 mol Os(R)(R')Br&sub2; für die 0,0244 mol Os(R)(R')Cl&sub2; in das obige. Verfahren eingesetzt werden.
- Die N-Methylimidazol- und N-Ethylimidazol-Analoga der obigen Verbindungen lassen sich herstellen durch Ersetzen der 0,0338 mol Imidazol im obigen Verfahren durch 0,0338 mol N-Methylimidazol beziehungsweise N-Ethylimidazol.
- Bis jetzt ist das Anion (bzw. Gegenion) der dargestellten Verbindungen entweder Chlorid oder Bromid. Diese Anionen können durch andere Anionen ersetzt werden, die in der vorliegenden Anmeldung aufgeführt sind. Die vorstehend gebildete Osmium-Vermittlerverbindung, die ein Chlorid- oder Bromid-Gegenion aufweist, ist hydrophil und wasserlöslich. Zum Austausch der in diesen Verbindungen vorliegenden Gegenionen sollte zunächst eine gesättigte wäßrige Lösung der Verbindung gebildet werden. Als nächstes sollte wenigstens ein molares Äquivalent Ammoniumtetrafluoroborat oder Ammoniumperchlorat der gesättigten wäßrigen Lösung zugesetzt werden. Durch diese Verfahrensweise wird die wasserlösliche Verbindung mit Bromid- bzw. Chlorid-Gegenion durch eine weniger wasserlösliche (mehr organisch lösliche) Verbindung mit einem Tetrafluoroborat- bzw. Perchlorat-Gegenion ersetzt. Somit ist die Osmium-Vermittlerverbindung in eine organisch lösliche Verbindung überführt. Die organisch lösliche Verbindung kann in Acetonitril gelöst werden (es sollte eine gesättigte Lösung gebildet werden). Nun kann die Osmium-Vermittlerverbindung wieder in eine hydrophile Verbindung mit Chlorid-, Bromid-, Iodid-, Fluorid- oder Nitrat-Gegenion überführt werden, indem wenigstens ein molares Äquivalent des passenden Tetraethylammonium-Salzes der gesättigten Acetonitril-Lösung zugesetzt wird, so daß die nunmehr hydrophile Osmium-Vermittlerverbindung mit Chlorid- Bromid-, Iodid-, Fluorid- oder Nitrat-Gegenion ausfällt.
- Ein alternatives Verfahren zur Synthese von [Os(II)(R)(R')imZ]Y, worin im Imidazolyl, N-Methylimidazolyl, oder N-Ethylimidazolyl sein kann, sei anhand der folgenden Synthese von [Os(II)(R)(R')imCl]BF&sub4; erläutert:
- 5,00 g (8,72 mmol) Os(bpy)&sub2;Cl&sub2; und 0,819 g Imidazol werden in 315 ml einer Mischung aus Ethanol und deionisiertem Wasser (2 : 1, Vol./Vol.) gelöst. Die Lösung wird auf Rückfluß erhitzt und sechs Stunden lang am Rückfluß gehalten. Nun wird die resultierende Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt, und das Ethanol wird am Rotationsverdampfer abgezogen. Bei Zugabe von 1,377 g (13, 13 Millimol (mmol)) NH&sub4;BF&sub4; bildet sich ein Niederschlag. Nach Kühlen der Mischung in einem Eisbad über dreißig Minuten wird der Niederschlag durch Filtration gewonnen und mit 20 ml deionisiertem Wasser und 20 ml Ether gewaschen. Schließlich wird das Produkt, [Os(II)(bpy)&sub2;imCl]BF&sub4;, unter Vakuum bei 50ºC getrocknet.
- [Os(II)(bpy)&sub2;imBr]BF&sub4; läßt sich synthetisieren, indem eine äquimolare Menge Os(bpy)&sub2;Br&sub2; für Os(bpy)&sub2;Cl&sub2; in das vorstehende Verfahren eingesetzt wird.
- Die Gegenionen können mit Hilfe des Verfahrens unter Abschnitt III. D. oben mit dem Titel "Austausch der Gegenionen" ausgetauscht werden.
- 9,50 Millimol (mmol) [Os(II)(R)(R')imZ]Y werden in 2 l CH&sub3;CN gelöst und unter N&sub2;-Atmosphäre gerührt. Nun werden 1,136 g NOBF&sub4; (9,73 mmol) der Lösung zugesetzt, und das Rühren unter N&sub2;-Atmosphäre wird 45 lang Minuten bei Raumtemperatur fortgesetzt. Es werden weitere 0,6666 g NOBF&sub4; (5,71 mmol) der resultierenden Lösung zugesetzt, und das Rühren unter N&sub2;- Atmosphäre wird 2 Stunden lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Nun wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer abgezogen, und der resultierende Rückstand (Produkt) wird mit 100 ml Ether gespült. Das Produkt, [Os(III)(R)(R')imZ]²&spplus;BF&sub4;Y, wird dann unter Hochvakuum (etwa 762 mm (30 inch) Hg) bei 50ºC über mehr als 72 Stunden (über das Wochenende) getrocknet. Schließlich wird das Produkt in eine braune Flasche mit Schraubverschluß überführt und in einem Exsikkator bei Raumtemperatur aufbewahrt.
- Zu den Oxidationsmitteln, die anstatt Nitrosoniumtetrafluoroborat verwendet werden können, gehören Nitrosoniumsulfat und Nitrosoniumchlorid.
- Ein teilweiser oder vollständiger Austausch der Gegenionen bei [Os(III)(R)(R')imZ]²&spplus;XYn kann mit Hilfe des in III. D. oben beschriebenen Schemas erreicht werden (d. h., durch Überführen der Verbindungen von hydrophil nach hydrophob oder von hydrophob nach hydrophil und Ausfällen mit der in III.D beschriebenen geeigneten Kombination von Lösungsmitteln und Salzen). Zur Liste der Tetraethylammonium-Salze, die hydrophile Verbindungen bilden, zählen auch Tetraethylammoniumsulfat, Tetraethylammoniumcarbonat und Tetraethylammoniumsulfit.
- Zur Bildung von [Os(III)(R)(R')imZ]²&spplus;SO&sub4;, [Os(III)(R)(R')imZ]²&spplus;CO&sub3; oder [Os(III)(R)(R')imZ]²&spplus;SO&sub3; kann eine organisch lösliche Verbindung, etwa [Os(III)(R)(R')imZ]²&spplus;(BF&sub4;)&sub2;, in einer ausreichenden Menge Acetonitril gelöst werden, um eine gesättigte Lösung zu bilden. Nun wird Tetraethylammoniumsulfat, Tetraethylammoniumcarbonat oder Tetraethylammoniumsulfit der gesättigten Lösung zugesetzt, um das Sulfat-, Carbonat- oder Sulfit- Salz auszufällen.
- Eine alternative Methode zur Oxidation von [Os(II)(R)(R')imZ]Y zu [Os(III)(R)(R')imZ]²&spplus;XYn besteht darin, [Os(II)(R)(R')imZ]Y in einem geeigneten Lösungsmittel zu lösen (zum Beispiel Wasser, wenn die Verbindung ein Gegenion das - wie vorstehend ausgeführt - die Verbindung hydrophil macht, oder Acetonitril, wenn die Verbindung ein Perchlorat- oder Tetrafluoroborat-Gegenion aufweist) und anschließend eine geeignete Säure zuzugeben, um den pH unter 3 zu senken. Nun wird Sauerstoff in die Lösung eingeperlt, und die Os(II)-Vermittlerverbindung wird zur Os(III)-Vermittlerverbindung oxidiert. Bei diesem Verfahren kann eine breite Auswahl von Säuren verwendet werden (zum Beispiel Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure, Flußsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Schwefelsäure).
- Ein weiteres alternatives Verfahren zur Oxidation von [Os(II)(R)(R')imZ]Y zu [Os(III)(R)(R')imZ]²&spplus;XYn ist nachstehend anhand der Überführung von [Os(II)(bpy)&sub2;imCl]BF&sub4; in [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2; beispielhaft beschrieben.
- [Os(II)(bpy)&sub2;imCl]BF&sub4;, worin im Imidazolyl ist, wird wie folgt in [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2; überführt: 4,50 g (6,49 mmol) [Os(II)(bpy)&sub2;imCl]BF&sub4; wird in 180 ml Acetonitril gelöst. Nun werden 0,912 g (7,81 mmol) NOBF&sub4; zugesetzt, und man läßt die Reaktion bei Raumtemperatur 45 Minuten lang fortschreiten. Nun werden 2,688 g (16,22 mmol) Tetraethylammoniumchlorid der gerührten Lösung langsam zugesetzt. Das Produkt wird durch Eingießen der Reaktionsmischung in 240 ml Aceton unter schnellem Rühren ausgefällt. Nach Kühlen der resultierenden Mischung in Trockeneis über 15 Minuten wird der Niederschlag durch Filtration gewonnen und zweimal mit 50 ml Aceton gewaschen. Schließlich wird das Produkt unter Vakuum bei 50ºC getrocknet.
- Diese zweite alternative Oxidationsmethode sollte auch auf andere [Os(II)(R)(R')imZ]Y-Verbindungen anwendbar sein. Die Gegenionen können mit Hilfe der vorstehend beschriebenen Verfahrensweisen ausgetauscht werden.
- Wie oben ausgeführt, können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung als Redoxvermittler in elektrochemischen Biosensoren verwendet werden, etwa bei dem Biosensor, der bei Pollmann et al. beschrieben ist (vorstehend erwähnt). Da diese Biosensoren Analyte aus biologischen Flüssigkeiten messen, die wäßrig basiert sind, sind wasserlösliche Redoxvermittler überaus bevorzugt. Die Redoxvermittler der vorliegenden Erfindung besitzen eine Wasserlöslichkeit von wenigstens etwa 1 mM, doch kann es sein, daß die Löslichkeit dieser Vermittler bei einer speziellen Anwendung viel höher sein muß als 1 mM. Wird zum Beispiel die Konzentration von Glucose (in einer Blut- oder Serumprobe) mit der bei Pollmann et al. beschriebenen Vorrichtung gemessen, so sollte die Redoxvermittler-Konzentration im Reagens (vor dem Trocknen des Reagens) wenigstens etwa 150 mM betragen und ist vorzugsweise wenigstens etwa 160 mM.
- Die Auswahl des Gegenions (Anion) für die Verbindungen der vorliegenden Erfindung hat starken Einfluß auf die Wasserlöslichkeit der Verbindungen (je hydrophiler das Gegenion, desto höher ist die Wasserlöslichkeit des Redoxvermittlers). Der nachstehend gezeichnete Pfeil zeigt Gegenionen zunehmender Hydrophilie (von links nach rechts). Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit Gegenionen auf der rechten Seite des Pfeils haben höhere Wasserlöslichkeit als Verbindungen mit Gegenionen auf der linken Seite des Pfeils. Verbindungen mit einem PF&sub6;-Gegenion sind schlecht löslich und sind nicht Bestandteil der vorliegenden Erfindung.
- Zur Veranschaulichung des niedrigen Oxidationspotentials der Verbindungen der vorliegenden Erfindung wurde eine Cyclovoltammetrie mit [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2;, worin im Imidazolyl ist, wie folgt durchgeführt (siehe Fig. 1): [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2; wurde in 0,1 N Na&sub2;SO&sub4;-Lösung gelöst. Ausreichend [Os(ILI)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2; wurde in 0,1 N Na&sub2;SO&sub4;- Lösung gelöst, um eine Lösung zu ergeben, die 1,89 millimolar (mM) an [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2; war. Als nächstes wurden eine Arbeitselektrode aus einer kreisförmigen Goldscheibe (Durchmesser = 2 Millimeter (mm)), eine Gegenelektrode aus einem Platin-Netz (Platin-Drahtnetz) und eine Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode in diese Lösung eingetaucht, und es wurde ein Cyclovoltammogramm durch Abtasten des Potentials zwischen -0,2 Volt und 0,6 Volt aufgenommen. Ein typisches Voltämmogramm ist in Fig. 1 gezeigt. Das Voltammogramm zeigt, daß dieser Os(III)-Redoxvermittler Teil eines hochgradig reversiblen Redoxpaars ist. Typische Ergebnisse für das in Fig. 1 gezeigte Voltammogramm sind wie folgt (Ergebnisse normiert durch die molare Konzentration):
- Ein sehr ähnliches Voltammogramm ergab sich aus der Cyclovoltammetrie von [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2;, worin im N-Methylimidazolyl ist. Unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben zeigte dieses N-Methylimidazolyl-Analogon ein reversibles Redoxpaar, einen Oxidationspeak bei +0,14 Volt gegen Silber/Silberchlorid (anodisches Peakpotential) und einen Reduktionspeak bei +0,08 Volt gegen Silber/Silberchlorid (kathodisches Peakpotential). (Fig. 2; uA in Fig. 1 und 2 bedeutet Mikroampere).
- Wie vorstehend ausgeführt, ist die Oxidation von Osmium durch Sauerstoff in Gegenwart der erfindungsgemäßen Verbindungen langsam. Zum Beispiel läßt sich [Os(II)(bpy)&sub2;imCl]Cl, worin im Imidazolyl ist, in [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2; überführen durch Lösen von [Os(II)(bpy)&sub2;imCl]Cl in 30 mM HCl und Einperlen von Sauerstoffgas in die resultierende Lösung über etwa 19 Stunden. Liegt der pH jedoch oberhalb 3, so ist eine wäßrige Lösung von [Os(II)(bpy)&sub2;imZ]Y stabil.
- Die schnelle Reaktionskinetik zwischen dem elektroaktiven Zentrum eines Enzyms und den Verbindungen der vorliegenden Erfindung läßt sich anhand Fig. 5 erläutern. Bei einem Glucose-Test, bei dem ein Reagens der vorliegenden Erfindung verwendet wird, das Glucoseoxidase in einem Biosensor enthält, etwa ein Biosensor wie bei Pollmann et al. beschrieben, konkurriert die Reaktion unter Beteiligung von Glucose, Glucoseoxidase und Osmium(III) enthaltendem Redoxvermittler mit der Reaktion unter Beteiligung von Glucose, Glucoseoxidase und Sauerstoff. Die letztere Reaktion führt zu einem Fehler beim Glucose-Test, da sie nicht zur Erzeugung eines Stroms führt, der mit der Konzentration der Glucose in der zu messenden Probe korreliert werden kann. Je schneller die Reaktionskinetik der ersteren Reaktion gegenüber der letzteren Reaktion, desto weniger signifikant ist der Fehler aufgrund der letzteren Reaktion.
- Bei einem Test, bei dem es sehr geringe oder unbedeutende Störungen durch die vorstehend beschriebene Reaktion mit Sauerstoff gibt, sollte daher das Testergebnis bei einer Probe venösen Bluts (mit niedrigem Sauerstoffgehalt) und einer Probe sauerstoffbeladenen Bluts (mit hohem Sauerstoffgehalt) praktisch gleich sein, wobei jede Probe eine äquivalente Konzentration Glucose enthält. Fig. 5 zeigt einen Vergleich der Dosis/Ansprech-Kurven von Proben venösen und sauerstoffbeladenen Vollbluts.
- Fig. 5a) zeigt einen Vergleich eines Glucose-Tests für eine Probe venösen Bluts 31 mit einem Glucose-Test für eine Probe sauerstoffbeladenen Vollbluts 33. Das bei diesen Tests verwendete Reagens wurde in ähnlicher Weise wie bei nachstehendem Reagensbeispiel 1 hergestellt, enthielt jedoch die folgenden Komponenten mit den folgenden Konzentrationen (vor dem Trocknen des Reagens): 300 millimolar (mM) 3-Sulfobenzoesäure, 0,07% (Gewicht) des Tensids Triton X-100, 160 mM [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]²&spplus;Cl&sub2;, worin im N-Methylimidazolyl ist, und 3000 Tetramethylbenzidin(TMB)-Einheiten Glucoseoxidase pro Milliliter Reagens, wobei der pH des Reagens auf 4,25 eingestellt wurde. Sechs Mikroliter dieses Reagens wurden in die Reagenzienmulde des bei Pollmann et al. beschriebenen Biosensors gegeben, und anschließend wurde 6 Minuten lang bei etwa 50ºC getrocknet. Eine Probe venösen oder sauerstoffbeladenen Vollbluts wurde dann in die Reagenzienmulde 9 gegeben, und die resultierende Testprobe wurde 20 Sekunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nun wurden Arbeits- und Gegenelektrode aus Palladium um +150 Millivolt (mV) separiert. Zehn Sekunden nach Anlegen dieser Potentialdifferenz wurde der Strom gemessen und mit der Glucose-Konzentration in der Probe korreliert.
- Fig. 5b) zeigt einen weiteren Vergleich eines Glucose- Tests für eine Probe venösen Vollbluts 35 und sauerstoffbeladenen Vollbluts 37. Vorrichtung und Testmethode waren wie bei Fig. 5a) beschrieben. Das Reagens wies die folgenden Komponenten mit den folgenden Mengen auf (vor dem Trocknen des Reagens): 150 mM 3-Sulfobenzoesäure, 150 mM [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2;, worin im Imidazolyl ist, 3000 TMB- Einheiten Glucoseoxidase pro ml Reagens, 100 mM MgCl&sub2;, 0,09% (Gewicht) des Tensids Igepal CO-530 (erhältlich bei Rhône- Poulenc), mit einem Reagens-pH von 5,5.
- Fig. 5c) zeigt einen weiteren Vergleich eines Glucose- Tests für eine Probe venösen Vollbluts 39 und sauerstoffbeladenen Vollbluts 41. Bei diesen Tests war die Vorrichtung die gleiche wie bei den Fig. 5a) und 5b), jedoch wurde das Reagens mit Hilfe des bei Pollmann et al. beschriebenen Verfahrens zur Formulierung eines Glucose-Reagens formuliert, aber mit den folgenden Komponenten in den folgenden Mengen (vor dem Trocknen des Reagens): 250 mM Kaliumphosphat-Puffer, etwa 14 Gramm mikrokristalline Cellulose pro Liter Reagens, 300 mM Kaliumhexacyanoferrat(III), 0,5 Gramm des Tensids Triton X-100 pro Liter Reagens, 1,6 Millionen TMB-Einheiten Glucoseoxidase pro Liter Reagens, 0,6 Gramm Hydroxyethylcellulose pro Liter Reagens und 37 mM Dinatriumsuccinat (es wurde Dinatriumsuccinat an Stelle von Kaliumglutamat bei der von Pollmann et al. offenbarten Formulierung verwendet), mit einem Reagens-pH von 6,6. Die Testmethode war wie bei den Fig. 5a) und 5b) beschrieben, mit der Ausnahme, daß Arbeitselektrode und Gegenelektrode um +300 mV und nicht um +150 mV separiert wurden.
- Die Fig. 5a) und 5b) mit zwei verschiedenen Redoxvermittlern der vorliegenden Erfindung zeigen einen sehr kleinen Analysenfehler aufgrund der Sauerstoff-Reaktion, während die Fig. 5c), bei der Hexacyanoferrat(III) als Vermittler verwendet wird, einen wesentlich größeren Analysenfehler aufgrund der konkurrierenden Sauerstoff-Reaktion zeigt, und dies bedeutet, daß die Reaktionskinetik zwischen dem elektroaktiven Zentrum von Glucoseoxidase und [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2;, worin im Imidazolyl oder N-Methylimidazolyl ist, schneller ist als die zwischen dem elektroaktiven Zentrum von Glucoseoxidase und Hexacyanoferrat(III).
- Analysen, die mit elektrochemischen Biosensoren durchgeführt werden, bei denen ein Redoxvermittler verwendet wird, der an der Elektrodenoberfläche oxidiert oder reduziert wird, um einen Strom zu erzeugen, der mit der Konzentration des zu messenden Analyts korreliert, sind fehlerhaft, wenn andere Substanzen, die nicht mit der Konzentration des zu messenden Analyts korrelieren, in der Probe oxidiert oder reduziert werden und zum gemessenen Strom beitragen. Da die Redoxvermittler der vorliegenden Erfindung niedrige Oxidationspotentiale aufweisen (Fig. 1 und 2 zeigen Vermittler mit Oxidationspotentialen von 0,175 Volt (gegen Ag/AgCl) bzw. 0,14 Volt (gegen Ag/AgCl)), können Analysen mit diesen Redoxvermittlern bei niedrigen angelegten Potentialen durchgeführt werden. Durch die Anwendung niedriger angelegter Potentiale sollten weniger störende Probensubstanzen wie etwa Bilirubin, Acetaminophen, Ascorbinsäure und Harnsäure in Blutproben oxidiert werden.
- Bei Verwendung als Redoxvermittler in einem elektrochemischen Biosensor können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in ein Reagens eingebracht werden, das bei dem Biosensor verwendet wird, um Analyte aus einer Flüssigkeitsprobe wie z. B. einer Blutprobe zu messen. Diese Reagensformulierungen werden nachstehend anhand Reagensbeispiel Nr. 1 und Reagensbeispiel Nr. 2 erläutert, die als Reagens zur Messung von Glucose bei dem von Pollmann et al. beschriebenen Biosensor verwendet werden können.
- Ein Reagens zur Messung von Glucose in einer Blutprobe wurde wie folgt formuliert: Eine 160 mM-Lösung von [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]²&spplus;Cl&sub2;, worin im Imidazolyl ist, in 150 mM 3-Sulfobenzoesäure (pH 5,50), die auch 0,06% (Gewicht) des Tensids Triton X-100 und Glucoseoxidase mit einer Konzentration von 3000 TMB-Einheiten/Milliliter Reagens enthielt (die Triton-Tenside bestehen aus verschiedenen Polyoxyethylenethern und anderen oberflächenaktiven Verbindungen. Triton-Tenside sind erhältlich von Sigma Chemical Company. Triton ist ein eingetragenes Warenzeichen von Rohm und Haas Co.). Sechs Mikroliter (ul) dieses Reagens können der Reagensmulde 9 des bei Pollmann et al. beschriebenen Biosensors zugesetzt, 6 Minuten lang bei etwa 50ºC getrocknet und dann zur Messung der Glucosemenge in der Blutprobe verwendet werden. Zum Beispiel kann - wie bei Pollmann et al. beschrieben - eine Blutprobe in die Reagensmulde gegeben werden, man läßt die enzymatische Reaktion bis zum Ende ablaufen, und anschließend können Arbeitselektrode und Gegenelektrode um eine Potentialdifferenz von etwa 150 Millivolt (mV) separiert werden. Nach dem Anlegen dieser Potentialdifferenz kann der Strom gemessen (zum Beispiel nach 7 und 1/2 Sekunde nach Anlegen der Potentialdifferenz an Arbeits- und Gegenelektrode) und mit der Glucose-Konzentration der Blutprobe korreliert werden.
- Das Reagens bei diesem Beispiel wird ähnlich formuliert wie das Reagens von Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß 100 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 6,80) an Stelle von 150 mM 3-Sulfobenzoesäure (pH 5,50) verwendet werden. Eine Analyse auf Glucose kann in der gleichen Weise wie vorstehend bei Reagensbeispiel Nr. 1 beschrieben durchgeführt werden.
- Bei den vorstehend erwähnten Reagenzien (Reagensbeispiele Nr. 1 und Nr. 2) sind vorzugsweise Mengen von etwa 25 mM bis etwa 200 mM (vor dem Trocknen des Reagens) eines Reagensstabilisators vorhanden, bei dem es sich um Magnesiumchlorid, Magnesiumsulfat, Zinksulfat, Mangansulfat oder Nickelchlorid handelt (besonders bevorzugt sind 25 mM Magnesiumchlorid).
- Der Redoxvermittler in den obigen Reagenzien sollte in einer Konzentration (vor dem Trocknen des Reagens) von wenigstens etwa 150 mM und vorzugsweise in einer Konzentration von wenigstens etwa 150 mM vorliegen. Die Konzentration der 3-Sulfobenzoesäure liegt vorzugsweise in einem Konzentrationsbereich von etwa 100 mM bis etwa 300 mM (300 mM sind besonders bevorzugt), und der pH eines 3-Sulfobenzoesäure enthaltenden Reagens beträgt vorzugsweise etwa 4,25 bis etwa 5,5 (besonders bevorzugt ist ein pH von 4,5).
- Der Phosphat-Puffer oder ein anderer in den obigen Reagenzien bereitgestellter Puffer ist vorzugsweise in einem Konzentrationsbereich von etwa 100 mM bis etwa 200 mM (vor dem Trocknen des Reagens) vorhanden.
- Bevorzugte Tenside in den obigen Reagenzien sind das Tensid Triton X-100 (erhältlich von Sigma Chemical Company) und das Tensid IGEPAL CO-610 (Nonylphenoxypoly(ethylenoxy)- ethanol, verzweigt, erhältlich von Rhône-Poulenc), vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,01% (Gewicht) bis etwa 0,1% (Gewicht) und ganz besonders bevorzugt in einer Konzentration von etwa 0,06% (Gewicht).
- Filmbildner wie etwa der Filmbildner UCAR® Vehicle 451 (ein mit Wasser verdünnbarer Styrol/Acryl-Latex, der etwa 42% (Gewicht) Polymer plus Eigenschaftsadditive, etwa 58% (Gewicht) Wasser und etwa 0,03% (Gewicht) Formaldehyd enthält, erhältlich von Union Carbide) oder der Filmbildner ELVACE (ein Vinylacetat-Copolymer, erhältlich von Reichhold Chemicals, Inc., Produkt Nr. 40709-00) können im Reagens in einer bevorzugten Konzentration von etwa 3% bis etwa 6% (Gewicht) enthalten sein (3 Gew.-% sind besonders bevorzugt). (Alle vorstehenden Konzentrationen sind Reagenskonzentrationen vor dem Trocknen des Reagens in der bei Pollmann et al. beschriebenen Reagensmulde 9.)
- Ein besonderer Vorteil, der bei [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2;, worin im Imidazolyl ist, für einen mit Hilfe des bei Pollmann et al. beschriebenen elektrochemischen Biosensors durchgeführten Glucose-Test entdeckt wurde, ist ein verringerter Hämatokrit-Effekt bei der Messung von Glucose in einer Vollblutprobe. Fig. 6a) zeigt die Dosis/Ansprech-Kurven für die Messung von Glucose in einer Vollblutprobe, die 19% Hämatokrit (51), 45% Hämatokrit (53) und 75% Hämatokrit (55) aufweist. (Die Analyse wurde mit dem Biosensorstreifen, Reagens und Verfahren wie für Fig. 5c) beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Inkubationszeit der Testprobe 35 Sekunden und nicht 20 Sekunden betrug. Bei diesem Reagens wurde ein Hexacyanoferrat(III)-Vermittler verwendet.)
- Fig. 6b) zeigt die Ergebnisse einer identisch durchgeführten Analyse, mit der Ausnahme, daß das verwendete Reagens ähnlich dem vorstehend beschriebenen Reagensbeispiel Nr. 1 formuliert wurde und die folgenden Komponenten in den folgenden Mengen enthielt (vor dem Trocknen des Reagens): 150 mM 3-Sulfobenzoesäure, 0,06% (Gewicht) des Tensids Triton X-100, 125 mM [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2;, worin im Imidazolyl ist, 3000 TMB-Einheiten Glucoseoxidase pro ml Reagens, mit einem Reagens-pH von 5,5.
- In Fig. 6b) bedeutet 61 die Probe mit 19% Hämatokrit, 63 bedeutet die Probe mit 45% Hämatokrit, und 65 bedeutet die Probe mit 75% Hämatokrit.
- Die Dosis/Ansprech-Kurven in Fig. 6b) liegen näher zusammen als die Dosis/Ansprech-Kurven in Fig. 6a), womit gezeigt ist, daß ein Glucose-Test, der mit einem bestimmten Vermittler der vorliegenden Erfindung, [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2;, worin im Imidazolyl ist, durchgeführt wird, weniger vom Hämatokritspiegel der Probe beeinflußt wird als ein Glucose-Test, der mit Hexacyanoferrat(III) durchgeführt wird - einem gängigen Redoxvermittler, der bei derartigen Analysen verwendet wird.
- Zunächst wurde eine Polymermatrix gebildet durch Mischen einer Zusammensetzung aus 100 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES-Puffer), 0,02% (Gewicht) des Tensids Triton X-100, 1% (Gewicht) Polyvinylalkohol (Molekulargewicht 10 000, 88% hydrolysiert). Der pH dieser Mischung wurde auf 6,55 eingestellt, um so die Polymermatrix zu bilden.
- Als nächstes wurden 6000 Einheiten Glucoseoxidase und 4,5 Milligramm (7,0 Mikromol) [Os(II)(bpy)&sub2;imCl]Cl, worin im Imidazolyl ist, zu 1 Milliliter der vorstehend beschriebenen Polymermatrix gegeben. Ein Mikroliter (ul) wurde der Arbeitselektrode eines jeden der nachstehend beschriebenen fünf Biosensorsysteme zugesetzt, und das Reagens wurde 15 Minuten lang bei 45ºC getrocknet. Nach dem Trocknen wurde die Glucose in einer Blutprobe oder in einer 20 mM Phosphat-gepufferten Salzlösung gemessen.
- Die mit Reagensbeispiel Nr. 3 (s. oben) und Reagensbeispiel Nr. 4 (s. unten) verwendeten elektrochemischen Biosensoren unterscheiden sich von dem bei Pollmann et al. beschriebenen Biosensor. Die zur Durchführung der Analysen mit den Reagenzien 3 und 4 verwendeten Biosensorsysteme sind nachstehend beschrieben.
- Die Arbeitselektrode bestand aus einem aufgestäubten Goldfilm auf einem Siliciumdioxid-Wafer-Träger. Diese Elektrode war 2 Millimeter (mm) · 2 mm im Quadrat.
- Die Gegenelektrode bestand ebenfalls aus einem aufgestäubten Goldfilm auf einem Siliciumdioxid-Wafer-Träger, und ihre Abmessungen sind in Fig. 3 gezeigt. In Fig. 3 ist die Seite 1 2 mm, die Seite 3 3,5 mm, die Seite 5 5 mm, die Seite 7 2 mm, die Seite 9 3 mm und die Seite 11 1,5 mm.
- Die Bezugselektrode bestand aus einem aufgestäubten Silberfilm auf einem Siliciumdioxid-Wafer-Träger. Die Oberfläche des Films wurde mit Eisen(III)-chlorid in verdünnter Säure behandelt, um eine Silberchlorid-Oberflächenschicht zu bilden. Die Abmessungen der Bezugselektrode waren ähnlich den Abmessungen der Gegenelektrode.
- Die Arbeitselektrode 25 (Fig. 4) war ähnlich aufgebaut wie die Arbeitselektrode des Biosensorsystems Nr. 1. Die Abmessungen der Arbeitselektrode waren 1 mm · 1 mm im Quadrat.
- Die Gegenelektrode 27 war ein aufgestäubter Goldfilm auf einem Siliciumdioxid-Wafer und ihre Form war wie in Fig. 4 gezeigt. In Fig. 4 ist die Seite 21 1.6 mm lang und die Seiten 23 sind 1,3 mm lang. Die Abmessungen der Gegenelektrode 27 waren so, daß die Arbeitselektrode wie in Fig. 4 gezeigt angeordnet werden konnte.
- Die Bezugselektrode war eine externe Silber/Silberchlorid- Elektrode.
- Die Arbeitselektrode war ähnlich aufgebaut wie die Arbeitselektrode von Biosensorsystem Nr. 2.
- Die Bezugselektrode war ein aufgestäubter Silberfilm, der in der gleichen Weise wie die Bezugselektrode in Biosensorsystem Nr. 1 behandelt wurde, um eine Silberchlorid- Oberflächenschicht zu bilden. Die Abmessungen der Bezugselektrode sind die gleichen wie die der Gegenelektrode in Biosensorsystem Nr. 2, und Arbeits- und Bezugselektrode wurden in der gleichen Weise zueinander angeordnet wie die Arbeitselektrode und Gegenelektrode von Biosensorsystem Nr. 2.
- Die Arbeitselektrode bestand aus einem aufgestäubten Goldfilm auf einer 10 mil-FR4-Glasfaser-Leiterplatte. Die Elektrodenabmessungen wurden durch ein photobelichtbares Lötresist (Enplate DSR-3242 von Enthone-Omi, ein Negativresist) definiert. Die Abmessungen der Elektrode waren 1 mm · 1 mm im Quadrat.
- Die Bezugselektrode bestand aus einem aufgestäubten Silberfilm auf FR4-Glasfaser. Die Elektrodenoberfläche war mit einer siebdruckfähigen Silber/Silberchlorid-Farbe (Acheson Colloids DB 2268) beschichtet, um eine Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode zu ergeben. Die Oberfläche der Bezugselektrode wurde definiert durch Einschieben eines 10 mil-Kunststoff-Abstandshalters, der einen U-förmigen Ausschnitteil an einem Ende und ein Klebemittel an den gegenüberliegenden Seiten aufwies. Der Abstandshalter wurde zwischen Arbeitselektrode und Bezugselektrode angeordnet, um so einen Kapillarraum zwischen der Arbeitselektrode und der Bezugselektrode zu definieren. Dieses Elektrodensystem umfaßt eine Probeneinführungsmündung und ein Lüftungsloch in der Arbeits- und/oder Bezugselektrode, so daß eine Flüssigkeitsprobe in den Kapillarraum eingeführt werden kann.
- Die Arbeitselektrode bestand aus einem aufgestäubten Goldfilm auf 7 mil-Polyester, vertrieben unter der Marke Mylar. Die Arbeitselektrode war kreisförmig (Kreis mit 1,5 mm Durchmesser) und wurde definiert durch eine Siebdruckstruktur unter Verwendung einer siebdruckfähigen UV-härtbaren dielektrischen Farbe (zum Beispiel Acheson Colloids ML 25198) oder einer heißhärtbaren dielektrischen Farbe (zum Beispiel Metech 7192 M).
- Die Bezugselektrode war in der gleichen Weise aufgebaut wie vorstehend für Biosensorsystem Nr. 4 beschrieben, und die Anordnung von Arbeitselektrode und Bezugselektrode, getrennt durch einen Abstandshalter, war wie vorstehend für Biosensorsystem Nr. 4 beschrieben.
- Wie vorstehend beschrieben, wird 1 ul des in Reagensbeispiel Nr. 3 beschriebenen Reagens auf die Arbeitselektrode eines jeden der vorstehend beschriebenen 5 Biosensorsysteme aufgebracht und 15 Minuten lang bei 45ºC getrocknet.
- Zur Messung von Glucose in einer Blutprobe oder in einer Probe von 20 mM Phosphat-gepufferter Salzlösung kann das Potential der Arbeitselektrode auf 150 mv gegen die Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode eingestellt werden, um [Os(II)(bpy)&sub2;imCl]Cl in situ (nach Einbringen der Blutprobe oder der gepufferten Salzlösungsprobe) an der Oberfläche der Arbeitselektrode zu [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2; zu oxidieren. Nach Aufbringen der Blutprobe oder der gepufferten Salzlösungsprobe auf das Elektrodensystem wird [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2;, das wie vorstehend beschrieben in situ erzeugt wird, durch die Reaktion unter Beteiligung von Glucose, Glucoseoxidase und [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2; zu [Os(II)(bpy)&sub2;imCl]Cl reduziert. Das [Os(II)(bpy)&sub2;imCl]Cl wird dann an der Oberfläche der Arbeitselektrode wieder zu [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2; oxidiert, wodurch ein Strom erzeugt wird, der mit der Konzentration der Glucose in der Blutprobe oder in der gepufferten Salzlösungsprobe korreliert werden kann.
- Zunächst wird eine Pufferpolymermatrix durch Zusammenmischen einer Zusammensetzung gebildet, bei der es sich um 150 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HE- PES-Puffer), 20 mM Magnesiumsulfat, 1% (Gewicht/Gewicht) Polyvinylalkohol (Molekulargewicht 10 000, 88% hydrolysiert) und 15 mM Adenosintriphosphat (ATP) handelt. Diese Zusammensetzung wird auf pH 8,00 eingestellt, um so die Pufferpolymermatrix zu bilden.
- 1 Milliliter der Pufferpolymermatrix wird mit 3 Milligramm (mg)(4,7 Mikromol) [Os(II)(bpy)&sub2;imCl]Cl, worin im Imidazolyl ist, 1,333 Einheiten Glycerin-3-phosphatoxidase und 3,333 Einheiten Glycerinkinase versetzt. Ungefähr 1,5 Mikroliter des resultierenden Reagens können auf die Arbeitselektrode des vorstehend beschriebenen Biosensorsystems Nr. 1 aufgebracht und 15 Minuten lang bei 45ºC getrocknet werden.
- Glycerin kann in einer Glycerin enthaltenden Flüssigkeitsprobe in analoger Weise wie bei der Messung von Glucose mit Reagensbeispiel Nr. 3 gemessen werden.
- Durch Einstellen des Potentials der Arbeitselektrode auf 150 mv gegen Silber/Silberchlorid wird [Os(II)(bpy)&sub2;imCl]Cl an der Oberfläche der Arbeitselektrode in situ (nach Aufbringen der Glycerin enthaltenden Flüssigkeitsprobe) zu [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2; oxidiert. Nach Zugabe der Glycerin enthaltenden Flüssigkeitsprobe zum Elektrodensystem reagieren Glycerin und ATP in Gegenwart von Glycerinkinase und Magnesiumsulfat unter Bildung von L-α-Glycerin-3-phosphat und Adenosindiphosphat. Das L-α-Glycerin-3-phosphat beteiligt sich dann an einer Reaktion mit Glycerinphosphatoxidase und [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2;, wodurch L-α-Glycerin-3- phosphat in Dihydroxyacetonphosphat und [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2; in [Os(II)(bpy)&sub2;imCl]Cl überführt wird. An der Oberfläche der Arbeitselektrode wird [Os(II)(bpy)&sub2;imCl]Cl wieder zu [Os(III)(bpy)&sub2;imCl]Cl&sub2; oxidiert, wodurch ein Strom erzeugt wird, der mit der Konzentration des Glycerins in der Probe korreliert werden kann.
- Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können als Redoxvermittler zur Messung anderer Analyte verwendet werden, die bei Pollmann et al. beschrieben sind. Weiterhin ist ein Puffer nicht erforderlich, wenn auch die Beigabe eines solchen zu den vorstehend beschriebenen Reagenzien bevorzugt ist. Zudem sind Verbesserungen bei der Stromquelle und beim Meßgerät wie bei Pollmann et al. beschrieben in US-Patent Nr. 4 963 814 (ausgestellt am 16. Oktober 1990), US-Patent Nr. 4 999 632 (ausgestellt am 12. März 1991), US-Patent Nr. 4 999 582 (ausgestellt am 12. März 1991) und US-Patent Nr. 5 243 516 (ausgestellt am 7. September 1993) beschrieben.
- Die vorliegende Erfindung wurde anhand der obigen Lehren und Abbildungen mit hinreichender Klarheit und Knappheit offenbart, um dem Fachmann zu ermöglichen, die Erfindung durchzuführen und anzuwenden, um die beste Art der Durchführung dieser Erfindung zu wissen und sie von anderen Erfindungen und von Altem zu unterscheiden.
Claims (25)
1. Verbindung
der Formel
worin
R und R' gleich oder verschieden sind und
2,2'-Bipyridyl, 4,4'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl,
5,5'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl, 1,10-Phenanthrolinyl, 4,7-
disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl oder
5,6-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl sind, wobei die
Disubstitution eine Methyl-, Ethyl- oder Phenyl-Gruppe ist,
R und R' über ihre Stickstoff-Atome an Os koordiniert
sind,
R" Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist,
Z Chlor oder Brom ist,
m +1 oder +2 ist,
X ein Anion ist und Chlorid, Bromid, Iodid, Fluorid,
Tetrafluoroborat, Perchlorat, Nitrat, Sulfat, Carbonat
oder Sulfit ist,
Y ein Anion ist und Chlorid, Bromid, Iodid, Fluorid,
Tetrafluoroborat, Perchlorat oder Nitrat ist, und
n 1 oder null ist,
jedoch, wenn X Sulfat, Carbonat oder Sulfit ist, n null
ist, und
wenn m +1 ist, n null ist und X nicht Sulfat, Carbonat
oder Sulfit ist,
wobei die Wasserlöslichkeit der Verbindung höher als
etwa 1 millimolar ist.
2. Verbindung nach Anspruch 1, worin R und R' gleich oder
verschieden sind und 2,2'-Bipyridyl,
4,4'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl oder 5,5'-disubstituiertes 2,2'-
Bipyridyl sind, wobei die Disubstitution eine Methyl-,
Ethyl- oder Phenyl-Gruppe sein kann.
3. Verbindung nach Anspruch 2, worin R" Wasserstoff oder
Methyl ist.
4. Verbindung nach Anspruch 3, worin Z Chlor ist.
5. Verbindung nach Anspruch 4, worin
X ein Anion ist und Chlorid, Bromid oder
Tetrafluoroborat ist,
Y ein Anion ist und Chlorid, Bromid oder
Tetrafluoroborat ist, und
wenn m +2 ist, n 1 ist, und wenn m +1 ist, n null ist.
6. Verbindung nach Anspruch 1, worin R und R' 2,2'-
Bipyridyl sind.
7. Verbindung nach Anspruch 6, worin R" Wasserstoff oder
Methyl ist.
8. Verbindung nach Anspruch 7, worin Z Chlor ist.
9. Verbindung nach Anspruch 8, worin
X ein Anion ist und Chlorid, Bromid oder
Tetrafluoroborat ist,
Y ein Anion ist und Chlorid, Bromid oder
Tetrafluoroborat ist, und
wenn m +2 ist, n 1 ist, und wenn m +1 ist, n null ist.
10. Verbindung nach Anspruch 9, worin
R" Wasserstoff ist,
X ein Anion ist und Chlorid oder Tetrafluoroborat ist,
Y ein Anion ist und Chlorid oder Tetrafluoroborat ist,
und
wenn m +2 ist, n 1 ist, und wenn m +1 ist, n null ist.
11. Verbindung nach Anspruch 1, worin
R und R' gleich oder verschieden sind und
2,2'-Bipyridyl, 4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridyl, 4,4'-Diphenyl-2,2'-
bipyridyl, 1,10-Phenanthrolinyl, 4,7-Dimethyl-1,10-
phenanthrolinyl, 4,7-Diphenyl-1,10-phenanthrolinyl oder
5,6-Dimethyl-1,10-phenanthrolinyl sind.
12. Reagens für eine elektrochemische Vorrichtung, die
einen Analyten aus einer Flüssigkeitsprobe mißt,
umfassend:
einen Redoxvermittler mit der Formel von Anspruch 1,
worin m +2 ist, und ein Enzym,
wobei der Redoxvermittler durch eine Reaktion reduziert
wird, an der das Enzym, der Analyt und der
Redoxvermittler beteiligt sind, und durch die Oxidation der
reduzierten Form des Redoxvermittlers ein Strom erzeugt
wird, der mit der Konzentration des Analyten in der
Flüssigkeitsprobe korreliert, und das Enzym die
Reaktion unter Beteiligung von Enzym, Analyt und
Redoxvermittler katalysiert.
13. Reagens nach Anspruch 12, des weiteren umfassend:
einen Puffer, wobei der Puffer ein höheres
Oxidationspotential als die reduzierte Form des
Redoxvermittlers aufweist und einen pH ergibt und aufrechterhält,
bei dem das Enzym die Reaktion unter Beteiligung von
Enzym, Analyt und Redoxvermittler katalysiert.
14. Reagens nach Anspruch 12 oder 13, wobei der
Redoxvermittler die Formel von Anspruch 2, 7 oder 11 aufweist,
worin m +2 ist.
15. Reagens nach Anspruch 12 oder 13, wobei das Reagens des
weiteren wenigstens ein weiteres Enzym und einen
weiteren Redoxvermittler umfaßt.
16. Reagens für eine elektrochemische Vorrichtung, die
einen Analyten aus einer Flüssigkeitsprobe mißt,
umfassend:
einen Redoxvermittler mit der Formel von Anspruch 1,
worin m +1 ist, ein Enzym und einen Puffer, wobei der
Redoxvermittler durch eine Reaktion oxidiert wird, an
der das Enzym, der Analyt und der Redoxvermittler
beteiligt sind, und durch die Reduktion der oxidierten
Form des Redoxvermittlers ein Strom erzeugt wird, der
mit der Konzentration des Analyten in der
Flüssigkeitsprobe korreliert, das Enzym die Reaktion unter
Beteiligung von Enzym, Analyt und Redoxvermittler katalysiert,
und der Puffer ein niedrigeres Reduktionspotential als
die oxidierte Form des Redoxvermittlers aufweist und
einen pH ergibt und aufrechterhält, bei dem das Enzym
die Reaktion unter Beteiligung von Enzym, Analyt und
Redoxvermittler katalysiert.
17. Reagens nach Anspruch 16, wobei der Redoxvermittler die
Formel von Anspruch 7 oder 11 aufweist, worin m +1 ist.
18. Reagens zur Verwendung in einer elektrochemischen
Vorrichtung, die Glucose aus einer Flüssigkeitsprobe mißt,
umfassend:
etwa 160 mM eines Redoxvermittlers mit der Formel von
Anspruch 1, worin m +2 ist;
etwa 150 mM 3-Sulfobenzoesäure mit einem pH von etwa
5,5;
etwa 0,06% (Gewicht) des Tensids Triton-X 100; und
etwa 3000 Einheiten Glucoseoxidase pro Milliliter
Reagens.
19. Reagens nach Anspruch 18, wobei der Redoxvermittler die
Formel von Anspruch 2, 7 oder 11 aufweist, worin m +2
ist.
20. Reagens nach Anspruch 18 ohne die 3-Sulfobenzoesäure
mit einem pH von etwa 5,5 und mit einem Phosphat-Puffer
mit einer Konzentration von etwa 100 mM und einem pH
von etwa 6,8.
21. Reagens nach Anspruch 20, wobei der Redoxvermittler die
Formel von Anspruch 11 aufweist, worin m +2 ist.
22. Reagens zur Verwendung in einer elektrochemischen
Vorrichtung, die Glucose aus einer Flüssigkeitsprobe mißt,
die vor dem Trocknen folgendes umfaßt:
eine Mischung aus einer Polymermatrix, Glucoseoxidase
und einem Redoxvermittler mit der Formel von Anspruch
1, worin m +1 ist, im Verhältnis von etwa 1 Milliliter
Polymermatrix zu etwa 7 umol Redoxvermittler zu etwa
6000 Einheiten Glucoseoxidase,
wobei die Polymermatrix etwa 100 mM 2-(N-Morpholino)-
ethansulfonsäure, etwa 0,02% (Gewicht) des Tensids
Triton-X 100 und etwa 1% (Gewicht) Polyvinylalkohol
umfaßt, wobei die Polymermatrix mit einem pH von etwa
6,55 vorliegt.
23. Reagens nach Anspruch 22, wobei der Redoxvermittler die
Formel von Anspruch 2, 7 oder 11 aufweist, worin m +1
ist.
24. Reagens zur Verwendung in einer elektrochemischen
Vorrichtung, die Glycerin aus einer Flüssigkeitsprobe
mißt, die vor dem Trocknen folgendes umfaßt:
eine Mischung aus einer Pufferpolymermatrix, Glycerin-
3-phosphatoxidase, Glycerinkinase und einem
Redoxvermittler mit der Formel von Anspruch 1, worin m +1 ist,
im Verhältnis von etwa 1 Milliliter Pufferpolymermatrix
zu etwa 1,333 Einheiten Glycerin-3-phosphatoxidase zu
etwa 3,333 Einheiten Glycerinkinase zu etwa 4,7 umol
Redoxvermittler,
wobei die Pufferpolymermatrix etwa 150 mM
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure, etwa 20 mM
Magnesiumsulfat, etwa 1% (Gewicht) Polyvinylalkohol und etwa
15 mM Adenosintriphosphat umfaßt, wobei die
Pufferpolymermatrix mit einem pH von etwa 8 vorliegt.
25. Reagens nach Anspruch 24, wobei der Redoxvermittler die
Formel von Anspruch 7 aufweist, worin m +1 ist.
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