JP5301156B2 - 全血を用いる血液成分測定方法及び測定キット - Google Patents
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Description
一方、1,5−アンヒドログルシトールは食事の影響を受けず、糖尿病患者については過去1週間の血糖コントロール状態を把握するのに最も優れたマーカーであり、家庭で「1週間に1回」測定するだけで血糖コントロール状態が正確に把握できる1,5−アンヒドログルシトール自己測定キットができれば患者にとって大きなメリットである。また、集団検診においても有用である。しかしながら、1,5−アンヒドログルシトールの血中濃度は血糖に比べ極めて低く、また、その測定において血糖、即ちグルコースが測定に干渉するため、微量の全血をそのまま試料として用いるものも含めて自己測定キットは実現していない。
また、血球中の細胞内液には高濃度にグルコースが存在し、細胞膜で隔てられた細胞外液と平衡を保っており、細胞外液中のグルコースを測定に干渉しない物質へ変換すると血球中の細胞内液にあるグルコースが細胞膜を通過して放出され、測定を妨害する。
また、特許文献1には外部操作によって部材を結合させるデバイスが記載されている。
(1)グルコース及び/またはその誘導体に起因する干渉を受ける血中成分の測定方法において、全血と、グルコース及び/またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換する物質を接触させ、同時または引続いて血球の分離を行なうことを特徴とする血中成分の測定方法;
(2)全血が20μL以下である上記(1)記載の血中成分の測定方法;
(3)血球の分離を血球分離濾過材にて行なうことを特徴とする上記(1)または(2)に記載の血中成分の測定方法;
(5)グルコース及び/またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換する物質が、グルコースの酵素的酸化または酵素的リン酸化に使用する物質である上記(1)〜(4)のいずれか一項に記載の血中成分の測定方法;
(6)変換する物質が、ホスホエノールピルビン酸、α−ケトグルタル酸、オキザロ酢酸、アセチルリン酸、ピルビン酸、3−ホスホグリセリン酸、クレアチンリン酸、アデノシン−5'−二リン酸、アデノシン−5'−三リン酸、酸化型若しくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型若しくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸からなる化合物群から選ばれる1つ以上の化合物を含有することを特徴とする上記(1)〜(5)のいずれか一項に記載の血中成分の測定方法;
(8)上記(1)〜(7)のいずれか一項に記載の血中成分の測定方法に使用し、血球分離部と検出部を有することを特徴とするデバイス;
(9)血球分離部と検出部が測定前には非接触状態にあり、両部を接触させて検出定量を行う上記(8)記載のデバイス;
(10)検出部が試薬を塗布した電極を使用する検出部である上記(8)記載のデバイス;
(11)血中成分が1,5−アンヒドログルシトールである上記(8)〜(10)のいずれか一項に記載のデバイスと、血液採取のための穿刺器具を含む測定キット;
に関する。
本発明は、グルコース及び/またはその誘導体に起因する干渉を受ける血中成分の測定方法において、全血と、グルコース及び/またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換する物質を接触させ、同時または引続いて血球の分離を行なうことを特徴とする血中成分の測定方法である。
また、本発明の全血には採血管等を使用せずに、自己血糖測定に用いられる穿刺器具等により採血した血液等も含まれる。
採血部位も指先のほか、前腕外側や腹壁または上腕外側等特に制限はない。
本発明の測定方法は、少量の全血であっても血中成分の測定が可能であり、例えば、3〜50μL、好ましくは3〜20μLあればよい。
ガラス繊維濾紙は密度が0.02〜0.09程度で、保留粒子径が1〜5μm程度が好ましい。ガラス繊維の表面を、親水性高分子、糖結合タンパク質のレクチンや両親媒性脂質のレシチンやフォスファチジルコリン等で処理して用いてもよい。
微多孔性材料としては、微多孔性膜や微多孔性担体等が挙げられ、高非対称構造のそれらも使用可能である。微多孔性膜としては、例えば、ポリスルホン膜、フッ素含有ポリマー膜等がある。微多孔性担体としては、例えば、ナノ・マイクロ粒径のゲルやマイクロスフィア(ビーズやラッテクス等)等があり、それらのベース基材は、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ(ヒドロキシメタクリレート)、ポリビニルアルコール等のポリマーやシリカ等である。微多孔性材料は、酸素プラズマ処理等の活性処理を表面に施すことにより親水化して使用してもよい。
また、上記血球分離濾過材は、穿刺器具内に充填して用いても、下記の検出に使用する電極等に直接あるいは検出に使用される電極上の酵素等の層を挟んで塗布して形成される膜状部材として用いてもよい。
obtusus)ATCC26733の産生するピラノースオキシダーゼ、トラメテス
サングイネア(Trametes sanguinea)IFO4923の産生するL−ソルボースオキシダーゼ、特開昭62−79780号公報に記載のシュードモナス属sp.NK−85001の産生する酸化酵素、特開平2−268679号公報に記載のオイペニシリウム クルスタセウム IFO−8938等の真菌の産生する1,5−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ、特許2872983号公報記載の電子受容体を介さずに1,5−アンヒドログルシトールを脱水素化できるアグロバクテリウム ツメファシエンスNT1130株の産生する1,5−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。
また、市販の1,5−アンヒドロ−D−グルシトール測定用試薬(ラナ1,5AGオートリキッド;日本化薬(株)製)の酵素を使用することもできる。
例えば、吸光度検出に使用する発色基質は酸化型発色基質の場合、単独で用いられる色源体にはN−カルボキシメチルアミノカルボニル−4,4'−ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミンナトリウム塩(DA64)、10−カルボキシメチルアミノカルボニル−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム塩(DA67)、ビス[3−ビス(4−クロロフェニル)−メチル−4−ジメチルアミノフェニル]アミン(BCMA)、ビス[3−ビス(4−クロロフェニル)−メチル−4−カルボキシエチルアミノフェニル]アミン、10−N−メチルカルバモイル−3,7−ジメチルアミノ−10H−フェノチアジン(MCDP)、10−N−カルボキシメチルカルバモイル−3,7−ジメチルアミノ−10H−フェノチアジン(CCAP)、3,3',5,5'−テトラメチルベンチジン(TMBZ)、N,N,N',N',N'',N''−ヘキサ(3−スルホプロピル)−4,4',4''−トリアミノトリフェニルメタン ヘキサナトリウム塩(TPM−PS)等が挙げられ、カップリング色源体には、カップラーに4−アミノアンチピリン(4AA)、3−メチル−2−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン(MBTH)やアミノジフェニル系化合物(NCP)、トリンダー試薬にN−エチル−N−(3−メチルフェニル)−N'−サクシニルエチレンジアミン(EMSE)やN−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン(TOOS)等が挙げられる。また、還元型発色基質の場合、例えば、2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−フェニル−2H−テトラゾリウムクロリド(INT)、3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムブロミド(MTT)、3,3'−[3,3'−ジメトキシ−(1,1'−ビフェニル)−4,4'−ジイル]−ビス[2−(4−ニトロフェニル)−5−フェニル−2H−テトラゾリウムクロリド](NTB)、2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム 1ナトリウム塩(WST−1)、2−(4−ヨードフェニル)−3−(2,4−ジニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム 1ナトリウム塩(WST−3)等が挙げられる。
また、血球分離部と検出部が接している場合には、予め血球分離前に全血とグルコース及び/またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換する物質を接触させてもよい。
穿刺器具としては数十μL以下程度の全血を採取できれば特に限定されず、自己血糖測定装置に付けられている穿刺器具と同じであってもよい。
1)グルコース変換試薬
25.0mMの2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸(HEPES)緩衝液(pH7.5)に、7.38mMのMgCl2、49.6mMのKCl、24.0mMのホスホエノールピルビン酸(PEP)、1.0mMのATP、10U/mLのピルビン酸キナーゼ(PK)、8U/mLのグルコースリン酸化酵素、100mMのNaCl、0.1mMのEDTA・2Na(エチレンジオキシ四酢酸2ナトリウム塩)、0.1%のNaN3、0.6g/LのBSA(牛血清アルブミン)、0.05%のノニオンHS210(界面活性剤;日本油脂(株)製)、0.1mMのフェロシアン化カリウム、5U/mLのホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)の組成となるように各成分を溶解した後、pH7.5に調整してグルコース変換試薬を調製した。
8mMのNCP−04(N−メチル−N−フェニル−p−フェニレンジアミン)、8mMのTOOSの組成となるように各成分を70%(v/w)エタノールに溶解して、発色試薬を調製した。
500U/mLの1,5−アンヒドログルシトール酸化酵素、500U/mLのHRPの組成となるように各成分を1.0Mのリン酸緩衝液に溶解した後、pH7.5に調整して酵素試薬を調製した。
上記の2)発色試薬に、バイオダインAメンブレン(PALL製)10mmx45mmを室温で10分間浸して、50℃で20分乾燥した。次に、上記の3)酵素試薬に、そのメンブレンを冷蔵で1晩浸して、同様に50℃で20分乾燥した。
5mmx5mm片に裁断して酵素発色試験紙を得た。
図1に示すように、支持体4(白色PET5mmx50mm)の接着面に、その左端に合わせて血球分離部3(血球分離用のPALL製ヘマセップL5mmx16mm)を貼り合わせた。一方、上記の酵素発色試験紙を検出部1として検出部支持体2(Adhesives Research Inc.製ARcare8192透明PET5mmx40mm)の接着面に、その左端に合わせて貼り合わせた。最後に検出部1の全面と血球分離部3の右端が重なるように、支持体4(白色PET5mmx50mm)の接着面に検出部支持体2を貼り付けることで、デバイスを作製した。
1,5−アンヒドログルシトール検量線作成用に濃度既知の全血3検体(後記の参考例1の操作により求めた各検体の1,5−アンヒドログルシトール濃度は8.9、18.5、28.5μg/mLであった)各15μLとグルコース変換試薬15μLとをエッペンドルフチューブ内で混合して5分間放置した。その後、図1の血球分離部3の検体添加位置部分に反応液15μLを滴下し、血球分離した血漿が、検出部1(酵素発色試験紙)が接触できる血球分離部3の部位に届いたら検出部1を押し付け、60秒後に反射光度計(測色色差計SUPER COLOR SP−80;(有)東京電色製)で吸光度を測定した。吸光度と1,5−アンヒドログルシトール濃度から検量線を作成した。
1,5−アンヒドログルシトールを測定する健常人6名の全血15μLをそれぞれグルコース変換試薬15μLとエッペンドルフチューブ内で混合して5分間放置した。その後、図1の血球分離部3の検体添加位置部分に反応液15μLを滴下し、血球分離した血漿が、検出部1(酵素発色試験紙)が接触できる血球分離部3の部位に届いたら検出部1を押し付け、60秒後に反射光度計で吸光度を測定した。検量線を用い、6検体について全血中の1,5−アンヒドログルシトール量を求めた結果を表1に示す。
実施例1の7)で測定したのと同じ健常人6名の全血検体を3000rpmで5分間遠心分離後、その上清を常法である1,5−アンヒドロ−D−グルシトール測定用試薬(ラナ1,5AGオートリキッド;日本化薬(株)製)と自動分析装置7150形((株)日立製作所製)にて、以下のパラメータで1,5−アンヒドログルシトールを定量測定し、結果を表1に示す。
分析法 2ポイントエンド
測定ポイント 24−50
検体量 8μL
ラナ1,5AGオートリキッドの
前処理液(R1) 240μL
ラナ1,5AGオートリキッドの
発色液(R2) 120μL
温度 37℃
測定波長(副/正) 700/546nm
1,5−アンヒドログルシトール濃度(μg/mL)
参考例1 実施例1
全血検体1 15.1 15.7
全血検体2 19.9 20.2
全血検体3 25.1 26.0
全血検体4 15.4 14.7
全血検体5 21.3 20.4
全血検体6 17.5 17.3
1)グルコース変換試薬
10.0mMの2−モルフォリノエタンスルホン酸(MES)緩衝液に、17.6mMのMgCl2、17.6mMのKCl、175.7mMのホスホエノールピルビン酸(PEP)、17.6mMのATP、123U/mLのピルビン酸キナーゼ(PK)、97U/mLのヘキソキナーゼ、20U/mLのアスコルビン酸酸化酵素の組成となるように各成分を溶解した後、pH7.0に調整してグルコース変換試薬を調製した。
16mg/mLのオスミウム(III)錯体([Os(III)(ビピリジル)2(イミダゾイル)2Cl]Cl2)、465.2U/mLの1,5−アンヒドログルシトール酸化酵素の組成となるように各成分を精製水に溶解して、電極試薬を調製した。
上記の2)電極試薬4μLをカーボン電極の検出部1に塗布して、50℃で13分乾燥して、センサーチップを作製した。
図2に示すように、センサーチップの検出部1に血球分離部3(血球分離用のPALL製ヘマセップL5mmx15mm)の最端部が覆うように貼り付けることで、デバイスを作製した。
1,5−アンヒドログルシトール検量線作成用に濃度既知の全血3検体(前記の参考例1の操作により求めた各検体の1,5−アンヒドログルシトール濃度は9.4、18.6、42.6μg/mLであった)各20μLとグルコース変換試薬10μLとをエッペンドルフチューブ内で混合して5分間放置した。その後、図2の血球分離部3の検体添加位置部分に反応液20μLを滴下し、血球分離した血漿が検出部1(電極試薬)に到達してから80秒後に0.15Vで10秒間印加して、5秒後の電流値を電気化学検出器(GPIB RS232C付き8CH マルチポテンショスタット MODEL PS−08;(株)東方技研)で測定した。電流値と1,5−アンヒドログルシトール濃度から検量線を作成した。
1,5−アンヒドログルシトールを測定する健常人4名の全血20μLをそれぞれグルコース変換試薬10μLとエッペンドルフチューブ内で混合して5分間放置した。その後、図2の血球分離部3の検体添加位置部分に反応液20μLを滴下し、血球分離した血漿が検出部1(電極試薬)に到達してから80秒後に0.15Vで10秒間印加して、5秒後の電流値を電気化学検出器で測定した。検量線を用い、4検体について全血中の1,5−アンヒドログルシトール量を求めた結果を表2に示す。
実施例2の6)で測定した時と同じ全血検体を参考例1と同様の操作方法で1,5−アンヒドログルシトールを定量測定し、結果を表2に示す。
1,5−アンヒドログルシトール濃度(μg/mL)
参考例2 実施例2
全血検体7 17.5 18.2
全血検体8 24.4 24.5
全血検体9 28.2 26.8
全血検体10 31.5 32.5
2 検出部支持体
3 血球分離部
4 支持体
Claims (5)
- 全血を試料とし、グルコース及び/またはその誘導体に起因する干渉を受ける血中成分である1,5−アンヒドログルシトールの測定方法において、
(1)全血と、グルコース及び/またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換する物質を接触させ、グルコース及び/またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換し、
(2)引続いて、血球分離濾過材を用いて血球の分離を行ない、
(3)次いで、グルコース及び/またはその誘導体に起因する干渉を受ける血中成分である1,5−アンヒドログルシトールの測定を行う
ことを特徴とする、グルコース及び/またはその誘導体に起因する干渉を受ける血中成分である1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。 - 全血が20μL以下である請求項1記載の血中成分の測定方法。
- 血球分離濾過材が、ガラス繊維濾紙、セルロース濾紙、微多孔性材料、高分子材料またはそれらを組合せた部材である請求項1記載の血中成分の測定方法。
- グルコース及び/またはその誘導体を該測定に干渉しない物質へ変換する物質が、グルコースの酵素的酸化または酵素的リン酸化に使用する物質である請求項1〜3のいずれか一項に記載の血中成分の測定方法。
- 変換する物質が、ホスホエノールピルビン酸、α−ケトグルタル酸、オキザロ酢酸、アセチルリン酸、ピルビン酸、3−ホスホグリセリン酸、クレアチンリン酸、アデノシン−5'−二リン酸、アデノシン−5'−三リン酸、酸化型若しくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型若しくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸からなる化合物群から選ばれる1つ以上の化合物を含有することを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の血中成分の測定方法。
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