DE69509626T2 - Sandwich-Immunotestverfahren für N-Peptide - Google Patents

Sandwich-Immunotestverfahren für N-Peptide

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Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG 1. Technisches Gebiet:
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum schnellen und einfachen Messen von N-Peptid, welches in der Klinik bei der Diagnose von Herzschwäche und chronischem Nierenversagen Verwendung findet, einen monoklonalen Antikörper, der in dem Verfahren verwendet wird, und ein Hybridom, das den monoklonalen Antikörper herstellt.
    • 2. Beschreibung des Standes der Technik:
  • Humanes atriales natriuretisches Polypeptid (hANP) wird biologisch als ein Peptid hergestellt, welches 126 Aminosäuren einschließt und welches als hANP(126) (γ-hANP) bezeichnet wird. Dieses γ-hANP akkumuliert in intra-atrialen Granula, und wird als Antwort auf einen auf das Atrium ausgeübten Druckstimulus ausgeschüttet. Zu diesem Zeitpunkt wird γ-hANP in hANP(1-98) (N- Peptid) und hANP(99-126) (α-hANP) gespalten und gleichzeitig in das Blut abgegeben.
  • Die Menge an α-hANP ist ein Marker für den Herzzustand bei Herzschwäche und chronischem Nierenversagen, und ein Immunoassay dafür ist bereits für diagnostische Zwecke verwendet worden. Der Immunoassay hat allerdings einige Nachteile. Beispielsweise ist eine sehr lange Reaktionszeit (3 Tage) für den Assay erforderlich, und eine immunologische Aktivität von α-hANP nimmt aufgrund der Instabilität von α-hANP merklich während des Sammelns oder Lagerns einer Probe im Blut ab (siehe T. Tsuji et al., Clin. Chim. Acta, 225, 171-177 (1994)). Im Gegensatz dazu ist N- Peptid stabiler und wird langsamer als α-hANP entfernt, dessen Konzentration im zirkulierenden Blut hoch ist. Daher wurde ein Immunossay für das N-Peptid entwickelt.
  • Es ist bereits berichtet worden, daß der Immunoassay für das N- Peptid, das ein N-terminales Peptid des oben-genannten γ-hANP ist, bei der Diagnose von Herzschwäche und chronischem Nierenversagen verwendet werden kann (siehe J. Sundsfjoed et al., J. Clin. Endocrionol. Metab., 66, 605-610 (1988); H. Itoh et al., J. Clin. Endocrinol., 67(3), 429-437 (1988); M. G. Burckley et al., din. Sci., 77, 573-579 (1989) und M. G. Burckley et al., Clin. Chim. Acta, 191, 1-14 (1990)). Jeder der Immunoassays für das N-Peptid, von denen kürzlich berichtet wurde, hängt von kompetitiven Radioimmunoassay (RIA)-Verfahren unter Verwendung einer Sorte von Antikörpern ab. Dies führt dazu, daß die Verfahren einen langen Zeitraum (3 bis 4 Tage), eingeschränkte Temperaturbedingungen (etwa 4ºC), und/oder eine komplizierte Durchführung (d. h. Seppak C-18-Extraktion) erfordern, bei der das Plasma vorbehandelt werden muß (siehe J. A. Sundsfjoed et al., a.a.O.; und M. G. Burckley et al., (1990) (a.a.O.). Ferner weist jeder dieser Immunoassays Schwierigkeiten wie geringe Präzision und schwache Reproduzierbarkeit auf. Daher war die Entwicklung eines Verfahrens zum schnellen und einfachen Messen von N-Peptid erforderlich.
  • EP-A-350 218 offenbart monoklonale Antikörper, welche die ersten 25 Aminosäuren von ANP erkennen.
  • M. Mukoyama et al. (J. Hypertens, Suppl. Band 6 (1988), S320-2) offenbart einen RIA für ANP, der auf der Erkennung der ersten 25 Aminosäuren von ANP basiert.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDÜNG
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zum Messen von N-Peptid oder einem Vorläufer desselben schließt die Schritte ein, bei denen man: eine Mischung einer Probe und eines ersten monoklonalen Antikörpers inkubiert, der einen Teil der Aminosäuresequenz des N-Peptids erkennt; zu der Mischung einen zweiten, markierten monoklonalen Antikörper hinzufügt, der einen zweiten, anderen Teil der Aminosäuresequenz des N-Peptids erkennt; eine weitere Inkubation folgen läßt; und einen daraus resultierenden Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex in der Mischung nachweist.
  • Alternativ schließt das erfindungsgemäße Verfahren zum Messen von N-Peptid oder einem Vorläufer desselben die Schritte ein, bei denen man: eine Mischung einer Probe, eines ersten monoklonalen Antikörpers, der einen Teil der Aminosäuresequenz des N- Peptids erkennt, und einen markierten zweiten monoklonalen Antikörper inkubiert, der einen zweiten, anderen Teil der Aminosäuresequenz des N-Peptids erkennt, und den daraus resultierenden Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex in der Mischung nachweist.
  • Erfindungsgemäß erkennen erste oder zweite monoklonale Antikörper einen Teil der Aminosäuresequenz von Position 43 bis Position 66 des N-Peptids.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind der erste oder zweite monoklonale Antikörper 7B6.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist einer von den ersten und zweiten monoklonalen Antikörpern 7B6, und der andere ist ein monoklonaler Antikörper, der einen Teil der Aminosäuresequenz des N-Peptids erkennt, und dessen Erkennungsstelle sich von der des 7B6 unterscheidet.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erkennt einer der ersten und zweiten monoklonalen Antikörper einen Teil der Aminosäuresequenz von Position 43 bis Position 66 des N-Peptids, und der andere erkennt einen Teil der Aminosäuresequenz von Position 1 bis Position 25 des N-Peptids.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der andere monoklonale Antikörper KY-ANP-III.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erkennt der erste monoklonale Antikörper einen Teil der Aminosäuresequenz von Position 1 bis Position 25 des N-Peptids, und der zweite monoklonale Antikörper erkennt einen Teil der Aminosäuresequenz von Position 43 bis Position 66 des N-Peptids.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der erste monoklonale Antikörper KY-ANP-III, und der zweite ist 7B6.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der zweite monoklonale Antikörper mit einem Radioisotop, einem Enzym, kolloidalem Gold, einer fluoreszierenden Substanz oder einer lumineszierenden Substanz markiert.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der zweite monoklonale Antikörper mit einem Radioisotop oder einem Enzym markiert.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein monoklonaler Antikörper zur Verfügung gestellt, der einen Teil der Aminosäuresequenz von Position 43 bis Position 66 des N- Peptids erkennt.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der monoklonale Antikörper 7B6.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Hybridom zur Verfügung gestellt, das den oben-genannten monoklonalen Antikörper herstellt.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Hybridom das Maus-Hybridom 7B6 (FERM BP-4878).
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Immunoassaykit für das N-Peptid oder einen Vorläufer desselben zur Verfügung gestellt, der die oben-genannten monoklonalen Antikörper einschließt.
  • Die hier beschriebene Erfindung ermöglicht es daher die Vorteile, (1) ein Sandwich-Immunoassayverfahren für N-Peptid und einen Vorläufer desselben zur Verfügung zu stellen, wobei das Verfahren für die Diagnose von Herzschwäche, Nierenversagen und anderen Kreislauferkrankungen sehr geeignet ist; (2) einen monoklonalen Antikörper zur Verfügung zu stellen, der in dem Verfahren verwendet wird; (3) ein Hybridom zur Verfügung zu stellen, das den monoklonalen Antikörper herstellt; und (4) einen Immunoassaykit für das N-Peptid oder einen Vorläufer desselben zur Verfügung zu stellen, der den monoklonalen Antikörper enthält.
  • Diese und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch Lektüre und Verstehen der folgenden detaillierten Beschreibung unter Bezugnahme auf die begleitenden Figuren für den Fachmann deutlich werden.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Fig. 1A zeigt die Reaktivität des bekannten monoklonalen Antikörpers KY-ANP-III mit N-Peptid(1-25) und N-Peptid(43- 67).
  • Fig. 1B zeigt die Reaktivität des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers 7B6 mit N-Peptid(1-25) und N-Peptid(43- 67).
  • Fig. 2 zeigt eine Standardkurve des erfindungsgemäßen Sandwich-RIA.
  • Fig. 3 zeigt eine Verdünnungskurve, die mittels des erfindungsgemäßen Sandwich-RIA mit klinischen Proben ermittelt wurde.
  • Fig. 4 zeigt eine Standardkurve des erfindungsgemäßen Sandwich-EIA.
  • Fig. 5 zeigt eine Verdünnungskurve, die mittels des erfindungsgemäßen Sandwich-EIA mit klinischen Proben ermittelt wurde.
    • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜRRUNGSFORMEN
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eine Vielzahl von Studien mit dem Zweck durchgeführt, N-Peptid und einen Vorläufer desselben schnell, einfach und genau zu messen. Als Ergebnis haben sie einen monoklonalen Antikörper hergestellt, der N-Peptid erkennt und Sandwich-Immunoassays unter Verwendung von zwei monoklonalen Antikörpern konstruiuert, von denen jeder unterschiedliche Epitope des N-Peptids erkennt, womit die vorliegende Erfindung erzielt wurde.
  • Erfindungsgemäß bezieht sich der Ausdruck "N-Peptid" auf ein Peptid, das die Aminosäuresequenz von Position 1 bis Position 98 einer N-terminalen Region von γ-hANP einschließt. γ-hANP wird in N-Peptid und α-hANP gespalten, wenn es in vivo ausgeschüttet wird, und α-hANP schließt die Aminosäuresequenz von Position 99 bis Position 126 des γ-hANP ein. Der Ausdruck "N-Peptid-Vorläufer" der vorliegenden Beschreibung schließt γ-hANP ein.
  • Erfindungsgemäß bezieht sich der Ausdruck "N-Peptid(X-Y)" auf eine Aminosäuresequenz von Position X bis Position Y des N-Peptids. Beispielsweise bezieht sich der Ausdruck "N-Peptid(1-25)" auf die Aminosäuresequenz von Position 1 bis Position 25 des N- Peptids. Der Ausdruck "N-Peptid(43-66)" bezieht sich auf die Aminosäuresequenz von Position 43 bis Position 66 des N-Peptids, und der Ausdruck "N-Peptid(43-67)" bezieht sich auf die Aminosäuresequenz von Position 43 bis Position 67 des N-Peptids. Der Ausdruck "N-Peptid(43-66)Cys" bezieht sich auf die Aminosäurese quenz, die einen zusätzlichen Cysteinrest am Carboxyterminus des N-Peptids(43-66) aufweist.
  • Erfindungsgemäß beziehen sich die Ausdrücke "N-Peptid" und "N- Peptidvorläufer" auf ein N-Peptid oder einen N-Peptidvorläufer, jeweils natürlich vorkommend oder chemisch synthetisiert.
  • Erfindungsgemäß bezieht sich der Ausdruck "Antikörper" auf einen Antikörper und Fragmente desselben, einschließlich von Fragmenten des Antikörpers wie Fab, Fab', und F(ab)&sub2;.
  • Erfindungsgemäß bezieht sich der Ausdruck "KY-ANP-III-Antikörper", der von Nakao et al. (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 2-16997) hergestellt wurde, auf einen monoklonalen Antikörper, der einen Teil des N-Peptids(1-25) erkennt, der die Aminosäuresequenz von Position 1 bis Position 25 des γ-hANP ist. Das Hybridom, das den monoklonalen Antikörper herstellt, wurde bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology of 1-3, Hagashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki hinterlegt, das eine öffentlichte Hinterlegungsstelle gemäß Budapester Vertrag ist. Die Hinterlegung erfolgte am 18. Mai 1988 und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-1887.
  • Die Hinterlegung war zum Hinterlegungszeitpunkt lebensfähig und wird durch die Anmelder ersetzt werden, sofern sie nicht lebensfähig werden sollte.
  • Als nächstes wird ein erfindungsgemäßes Verfahren schrittweise beschrieben. Die Herstellung des monoklonalen Antikörpers, der das N-Peptid erkennt, und des Sandwich-Immunoassays unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers kann durch den Fachmann gemäß eines allgemeinen Verfahrens durchgeführt werden, wenn nichts anderes angegeben ist.
    • (I) Immunisierung
  • Zur Herstellung eines N-Peptid erkennenden monoklonalen Antikörpers wird ein Tier mit einem geeigneten Antigen immunisiert. Als Tier kann eine Maus, eine Ratte oder ähnliches verwendet werden. Als Antigen kann ein Aminosäurefragment verwendet werden, das einen Teil des N-Peptids darstellt. Aus diesem Antigen wird einem Immunogen hergestellt, das für die Immunisierung geeignet ist. Um dieses Antigen als ein Immunogen zu verwenden, kann zum Beispiel N-Peptid(43-66)Cys mit einem Trägerprotein konjugiert werden. Als Trägerprotein können hochmolekulare Materialien wie Rinderserumalbumin (BSA), Hämocyanin und Rinderthioglobulin (BTG) verwendet werden. Eine Maleimidverbindung oder ähnliches kann zur Konjugation verwendet werden. Die Maleimidverbindung ist ein bifunktioneller Kreuzvernetzer, der Succinimidyl-4-(Nmaleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC), m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS), Succinimidyl-4-(p-meleimidphenyl)butyrat (SMPB), sowie Sulfo-MBS, Sulfo-SMCC und dergleichen einschließt. Eine Succinimidylgruppe dieser Kreuzvernetzer reagiert mit einem primären Amin und reagiert weiter mit dem Thiol-reaktiven Maleimid zur Bildung einer kovalenten Bindung mit dem Thiol eines Cysteinrestes. Das so erhaltene Immunogen wird in einem geeigneten Adjuvans wie Freuds Complete-Adjuvans emulsifiziert und die Immunisierung wird durch intraperitoneale Gabe der resultierenden Emulsion an ein Tier durchgeführt. Vorzugsweise wird das Tier intraperitoneal, subkutan oder intravenös mit dem Immunogen mehrmals in Intervallen von mehreren Wochen "geboostert".
    • (2) Herstellung eines monoklonalen Antikörpers
  • Ein Hybridom, das einen das N-Peptid erkennenden monoklonalen Antikörper herstellt, kann durch Fusion einer Milzzelle mit einer Myelomzelle hergestellt werden. Die Milzzelle wird aus dem Tier, vorzugsweise einer Maus, gewonnen, welches oben unter Abschnitt 1 immunisiert wurde. Die Myelomzelle wird aus Säugern, vorzugsweise einer Mausmyelomzelle, gewonnen. Polyethylenglykol oder ähnliches kann für die Zellfusion verwendet werden. Ein gewünschtes Hybridom kann durch Durchsuchen und Klonen eines durch Fusion erhaltenen Hybridoms ausgewählt werden.
  • Zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers wird das Hybridom in vitro oder in vivo kultiviert. Vorzugsweise wird das Hybridom in vivo kultiviert. Beispielsweise wird das Hybridom einer Maus intraperitoneal verabreicht, um Aszites herzustellen, welcher einen monoklonalen Antikörper enthält. Der monoklonale Antikörper kann leicht von dem Ascites durch jegliches, dem Fachmann bekannte Verfahren erhalten und gereinigt werden.
  • Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper kann im erfindungsgemäßen Sandwich-Immunoassay sowie in anderen Immunoassays wie einen kompetitiven Immunoassay und anderen Sorten von Immunoassays mit zwei Antikörpern verwendet werden.
    • (3) Immunoassay
  • Der Immunoassay der vorliegenden Erfindung basiert auf einem Sandwich-Immunoassay und schließt folgende Schritte ein: Fixieren eines Antikörpers (erster monoklonaler Antikörper) auf einer festen Phase und Inkubation des fixierten ersten Antikörpers mit einer Probe, die ein Antigen enthält; Zugabe eines markierten zweiten monoklonalen Antikörpers der sich vom ersten Antikörper unterscheidet und Inkubation der resultierenden Mischung und Detektion des hergestellten markierten Antigen-Antikörper-Komplexes in der Mischung. Im erfindungsgemäßen Immunoassay können eine Probe, der erste monoklonale Antikörper und der markierte zweite monoklonale Antikörper gleichzeitig inkubiert werden.
  • Bezüglich eines Detektionsverfahrens schließt der erfindungsgemäße Sandwich-Immunoassay einen Sandwich-Radioimmunoassay (RIA), einen Sandwich-Enzymimmunoassay (EIA), einen Sandwich- Fluoroimmunoassay (FIA), einen Sandwich-Chemilumineszenzimmu noassay (CLIA), einen Sandwich-Chemilumineszenz-Enzymimmunoassay (CLEIA) und eine auf dem Sandwich-Assay basierende immunochromatographische Methode ein. Vorzugsweise können der RIA und der EIA verwendet werden.
  • Der erfindungsgemäße erste monoklonale Antikörper kann auf einer festen Phase wie einer Mikrotiterplatte, einem Kügelchen, einer Röhre, einer Membran, einem Filterpapier oder einem Plastikgefäß immobilisiert werden. Insbesondere wird vorzugsweise ein Polystyrenkügelchen verwendet.
  • Zu messende Proben können solche sein, welche N-Peptid und einen Vorläufer desselben enthalten, und Plasma, Serum, Blut, Urin und ähnliches einschließen.
  • Der erfindungsgemäße zweite monoklonale Antikörper kann mit einem Radioisotop, einem Enzym, einer fluoreszierenden Substanz und einer lumineszierenden Substanz markiert werden. Die Markierung kann durch jegliches, dem Fachmann bekannte Verfahren durchgeführt werden.
  • Beispiele für Radioisotope, die zum Markieren verwendet werden können, schließen ¹&sup4;C, ³H, ³²p, ¹²&sup5;I und ¹³¹I ein. Insbesondere kann ¹²&sup5;I in einer bevorzugten Ausführungsform verwendet werden. Diese Radioisotope können an den monoklonalen Antikörper durch das Chloramin-T-Verfahren, das Peroxidaseverfahren, das Iodogenverfahren oder das Bolton-Hunter-Verfahren gebunden werden.
  • Beispiele für das Enzyms, das zum Markieren verwendet werden kann, schließen β-Galaktosidase (βGAL), alkaline Phosphatase (ALP) und Meerrettichperoxidase (HRP) ein. Diese Enzyme können durch das Nakane-Verfahren an den monoklonalen Antikörper gebunden werden, oder durch das Ishikawa et al. -Verfahren (Seiten 75- 127, in "Enzyme immunoassay," von E. Ishikawa et al., 3. Auflage, 1987, Igakushoin).
  • Beispiele für die fluoreszierende Substanz, die zum Markieren verwendet werden kann, schließen Fluorescein, Fluoroscamin, Fluoresceinisothiocyanat und Tetramethylrhodaminisothiocyanat ein.
  • Beispiele für die lumineszierende Substanz, die zum Markieren verwendet werden kann, schließen Luciferin, ein Luminolderivat, und einen Acridiniumester ein.
  • Kolloidales Gold kann zum Markieren verwendet werden.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann ein N-Peptid Sandwich-RIA durchgeführt werden. Insbesondere wird der N-Peptid- Sandwich-RIA wie folgt durchgeführt: Ein Kügelchen, auf dem der erste monoklonale Antikörper immobilisiert wurde, wird zu einer Standard-N-Peptid-Lösung oder Probe gegeben, und die resultierende Mischung wird bei einer Temperatur von 4ºC bis 45ºC, vorzugsweise bei 25ºC bis 37ºC 1-4 Stunden lang, vorzugsweise 2 Stunden lang inkubiert. So wird eine erste Reaktion durchgeführt. Das Kügelchen wird gewaschen, und dann wird eine Lösung, die den zweiten monoklonalen Antikörper enthält, der mit einem Radioisotop wie 1251 markiert ist, zu dem Kügelchen gegeben. Die resultierende Mischung wird bei einer Temperatur von 4ºC bis 45ºC, vorzugsweise bei 25ºC bis 37ºC 1-4 Stunden lang, vorzugsweise 2 Stunden lang inkubiert. So wird eine zweite Reaktion durchgeführt. Das Kügelchen wird gewaschen, und dann wird die Radioaktivität des Antigen-Antikörper-Komplexes, der an das Kügelchen gebunden ist, durch einen γ-Strahlen-Zähler detektiert, um die Menge an N-Peptid zu bestimmen.
  • Es wird angenommen, daß N-Peptid im Vergleich zu α-hANP stabiler ist, und daß eine Abnahme der immunologischen Aktivität während der Durchführung des Sammelns einer Probe gering ist, so daß das N-Peptid auch im Rahmen des folgenden Nicht-RIA verwendet werden kann.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann ein N-Peptid- Sandwich-EIA durchgeführt werden. Insbesondere wird der N-Peptid-Sandwich-EIA wie folgt durchgeführt: Ein Kügelchen, auf dem der erste monoklonale Antikörper immobilisiert wurde, wird zu einer Standard-N-Peptid-Lösung oder Probe hinzugegeben, und die resultierende Mischung wird bei einer Temperatur von 4ºC bis 45ºC, vorzugsweise bei 25ºC bis 37ºC, 2 Stunden lang inkubiert. So wird die erste Reaktion durchgeführt. Das Kügelchen wird gewaschen, und dann wird eine Lösung, die den zweiten monoklonalen Antikörper enthält, der mit einem Enzym wie HRP markiert ist, zu dem Kügelchen gegeben. Die resultierende Mischung wird bei einer Temperatur von 4ºC bis 45ºC, vorzugsweise bei 25ºC bis 37ºC, 2 Stunden lang inkubiert. So wird die zweite Reaktion zur Bildung eines Antikörper/N-Peptids/Antikörper-Komplexes auf dem Kügelchen durchgeführt. Die Enzymaktivität, die auf dem Kügelchen erhalten bleibt, wird durch ein spezifisches Substrat kolorimetrisch bestimmt, woraus die Menge an N-Peptid, welche auf dem Kügelchen festgehalten ist, bestimmt werden kann. Die kolorimetrische Bestimmung kann mit einem konventionellen Spektrophotometer oder ähnlichem durchgeführt werden.
  • Wie oben beschrieben, ist der erfindungsgemäße Immunoassay ein Sandwich-Immunoassay, welcher zwei Sorten von Antikörpern verwendet, welche verschiedene Epitope erkennen. Verglichen mit einem gewöhnlichen kompetitiven Verfahren unter Verwendung einer Sorte von Antikörper, weist der erfindungsgemäße Sandwich-Immunoassay daher eine hohe Sensitivität sowie eine hervorragende Präzision, leichte Handhabbarkeiten und Schnelligkeit auf.
    • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird im Detail durch erläuternde Beispiele beschrieben.
    • Beispiel 1: Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, welcher einen Teil des N-Peptids(43-66)Cys erkennt und eines Hybridoms, das den Antikörper herstellt A. Herstellung eines Immunogens und Immunisierung
  • Zum Zweck des Messens von N-Peptid durch Sandwich-Immunoassay, wurde ein monoklonaler Antikörper, der einen Teil des N-Peptids erkennt, und dessen Erkennungsstelle sich von der des bekannten monoklonalen Antikörpers KY-ANP-III unterscheidet, wie unten beschrieben hergestellt. N-Peptid(43-66)Cys wurde als Antigen verwendet.
  • Zunächst wurden 33,5 mg Rinderthioglobulin (BTG, erhältlich von Sigma) als Trägerprotein in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) (Puffer A) gelöst. Dann wurden 1,2 ml Puffer A, welcher 10,5 mg Sulfosuccinimidyl-4-(Nmaleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC, erhältlich von Pierce) enthielt, hinzugegeben. Man ließ die resultierende Mischung bei 30ºC 1 Stunde lang reagieren, wodurch ein Maleimidderivat von BTG erhalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine Sephadex G-25 Säule (Pharmacia) aufgetragen, welche mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0) (Puffer B) equilibriert worden war, und Leerfraktionen, welche das Maleimid gebundene BTG enthielten, wurden gesammelt. Dann wurden 0,4 ml Puffer B, welcher 3,3 mg N-Peptid(43-66)Cys (Peptide Institute, Inc.) und 2,5 mM EDTA enthielt, zu 2,6 ml Puffer B gegeben, welcher 6 mg des BTG-Maleimidderivats enthielt, und man ließ die Mischung bei 4ºC 20 Stunden lang reagieren. Danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 40 ul 50 mM N-Ethylmaleimid gestoppt. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde auf eine Sephadex G-50 Säule (Pharmacia) aufgetragen, welche mit Puffer B equilibriert worden war, und Leerfraktionen wurden gesammelt, um das unverändert gebliebene Peptid zu entfernen. Die gesammelten Fraktionen wurden gegen Wasser bei 4ºC über Nacht dialysiert und lyophilisiert. Als Resultat wurden 10,9 mg (Trockengewicht) N-Pep- N-Peptid(43-66)Cys-BTG-Konjugat erhalten und als Immunogen wie folgt verwendet.
  • Die Immunisierung wurde durch intraperitoneale Verabreichung von 100 ug des Konjugats pro BALB/c Maus durchgeführt. Es wurde 3 mal in 3 bis 4 Wochenintervallen "geboostert". Bei den ersten und zweiten Immunisierungen wurde das Konjugat zusammen mit Freunds Complete-Adjuvans verabreicht.
    • B. Herstellen eines Hybridoms, das 7B6 Antikörper herstellt und Herstellen des 7B6 Antikörpers unter Verwendung des Hybridoms.
  • Eine Milzzelle (1,1 · 10&sup8;), die von der oben in Abschnitt A immunisierten Maus am 3. Tag nach der letzten Immunisierung erhalten wurde, wurde mit einer Mausmyelomazelle (P3-U1-X63-Ag8, Tokyo Shuryu Research Institute, 2,1 · 10&sup7;) unter Verwendung von 50% Polyethylenglykol 4000 (Merck) fusioniert. Das so durch Fusion erhaltene Hybridom wurde durch die Verwendung eines selektiven Mediums welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthielt, erhalten. Am 10. Tag nach der Zellfusion wurde ein Hybridom, das einen spezifischen Antikörper herstellte, gescreent. Ein EIA, welcher für das Screening verwendet wurde, wurde wie folgt durchgeführt: 50 ul PBS (Phosphatpuffer (pH 7,4), enthält 0,15 M NaCl), das 1 ug N-Peptid(43-67) (Peptide Institute, Inc.) oder N-Peptid(1-25) (Peptide Institute, Inc.) enthielt, wurden zu jeder Vertiefung einer 96 Vertiefungen enthaltenden Mikrotiterplatte (Nung) gegeben und die Peptide wurden durch Belassen bei 4ºC über Nacht daren gebunden. Die Vertiefungen wurden danach einmal mit einer Lösung gewaschen, welche 25% Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) enthielt, und 300 ul dieser Lösung wurden zu den Vertiefungen gegeben, um das Blockieren durchzuführen. Dann wurden die Vertiefungen dreimal mit PBS gewaschen, das 0,05% Tween 20 enthielt, und 50 ul des Kulturüberstandes des Hybridoms wurden zu den Vertiefungen gegeben, und man ließ die Mischung bei Raumtemperatur 2 Stunden lang reagieren. Die Vertiefungen wurden dann dreimal gewaschen, 50 ul einer 25%igem Block Ace-Lösung, die 5 ug HRP- markiertem Antimaus-IgG enthielten, wurden zu den Vertiefungen gegeben, und man ließ die so erhaltene Mischung bei Raumtemperatur 1 Stunde lang reagieren. Die Vertiefungen wurden dreimal gewaschen, und 50 ul einer Lösung, welche 4 mM 2,2'-Azino-bis(3- ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS, Boehringer-Mannheim) und 2 mM H&sub2;O&sub2; enthielt, wurde zu den Vertiefungen gegeben, wodurch die Reaktion des HRP in den Vertiefungen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur durchgeführt wurde. Dann wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 ul einer 0,002%igen NaN&sub3;-Lösung gestoppt. Die Absorption jeder Vertiefung wurde bei 415 nm mit einem Plattenlesegerät (MTP-32, Corona) gemessen.
  • Hybridoma in Vertiefungen, die eine positive Herstellung von monoklonalen Antikörper zeigten, wurden dreimal durch eine limitierende Verdünnung geklont, wodurch Hybridoma, welche N-Peptid(43-66) erkennende monoklonale Antikörper herstellten, erhalten wurden.
  • Eine Untergruppe der durch die Hybridoma hergestellten Antikörper wurde unter Verwendung des Kulturüberstandes der Hybridoma bestimmt. Ein Maus-monoklonaler Antikörper Isotypbestimmungskit (Amersham Corp.) wurde für diese Bestimmung verwendet. Ein neu erhaltener Antikörper wurde als 7B6 bezeichnet, der zum Isotyp IgG&sub1;(κ) gehört.
  • Die Reaktivitäten des bekannten monoklonalen Antikörpers KY-ANP- III (IgG&sub1;κ) und des neuen monoklonalen Antikörpers 7B6 mit verschiedenen Arten von N-Peptid-Fragmenten wurden durch das oben beschriebene EIA-Verfahren bestätigt. Als KY-ANP-III, wurde ein durch das Hybridom FERM BP-1887 hergestellter monoklonaler Antikörper verwendet. Die Resultate sind in Fig. 1 gezeigt. In dieser Figur stellt O die Reaktivität mit N-Peptid(1-25) dar und stellt die Reaktivität mit N-Peptid(43-67) dar. Der KY-ANP- III-Antikörper reagierte mit dem N-Peptid(1-25), aber nicht mit dem N-Peptid(43-67) (Fig. 1A). Im Gegensatz dazu reagierte der 7B6-Antikörper mit dem N-Peptid(43-67) aber nicht mit dem N- Peptid(1-25) (Fig. 1B). Somit wurde bestätigt, daß die beiden Antikörper verschiedene Teile des N-Peptids erkennen, d. h. der KY-ANP-III-Antikörper erkennt die 1-25 Aminosäuresequenz des N- Peptids, und der 7B6-Antikörper erkennt den 43-66 Teil des N- Peptids.
  • Das Hybridom, das den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper 7B6 herstellt, wurde bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology of 1,3, Higsahi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki hinterlegt, das eine öffentliche Hinterlegungsstätte gemäß Budapester Vertrag ist. Die Hinterlegung geschah am 9. November 1994 und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-4878.
  • Die Hinterlegung war zum Zeitpunkt der Hinterlegung lebensfähig und wird durch die Anmelder ersetzt werden, sofern sie nicht lebensfähig werden sollte.
    • Beispiel 2: Reinigung des monoklonalen Antikörper 7B6 von einem Maus-Aszites
  • Zwei Wochen nach intraperitonealer Verabreichung von 0,5 ml Pristan an Mäuse (BALB/c), wurden etwa 1 · 10&sup7; nach Beispiel 1 erhaltene Hybridoma jeder Maus intraperitoneal verabreicht. Am 7. bis 10. Tag nach der Verabreichung wurde Ascites gesammelt und bei 10 000 g 20 Minuten lang zentrifugiert. Dann wurde der Überstand mit PBS 1 : 2 verdünnt und auf eine Protein G Sephadex- Säule (Pharmacia) aufgebracht. Die Säule wurde mit PBS gewaschen. Dann wurde die Säule mit 0,2 M Glycin-HCl-Puffer (pH 2,7) eluiert, und das Eluat wurde sofort mit 1 M Trispuffer neutralisiert. Das Eluat wurde mit 50%igen gesättigten Ammoniumsulfat bei 0ºC ausgesalzen. Das Präzipitat wurde durch 20 Minuten lange Zentrifugation bei 10 000 g gesammelt. Das so erhaltene Präzipitat wurde in PBS gelöst und gegen PBS bei 4ºC über Nacht dialysiert, um gereinigte 7B6 monoklonale Antikörper zu erhalten.
    • Beispiel 3: Herstellung von Kügelchen mit immobilisiertem KY- ANP-III-Antikörper
  • Polystyrenkügelchen (Immunochemical), die zuvor mit wäßriger 1%iger Glutaraldehydlösung behandelt worden waren, wurden in 25 ug/ml einer KY-ANP-III-Antikörperlösung (ein Kügelchen /200 ul) in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,1) aufgeschlämmt. KY- ANP-III-Antikörper, der ein monoklonaler Antikörper ist, der das N-Peptid(I-25) erkennt, wurde durch Kultivieren eines den Antikörper herstellenden Hybridoms (FERM BP-1887) erhalten. Die Mischung aus Polystyrenkügelchen und dem KY-ANP-III-Antikörper wurde bei 25ºC 3 Stunden lang geschüttelt und ferner bei 4ºC mindestens 19 Stunden lang geschüttelt. Der wäßrige Teil wurde durch Absaugen entfernt, und die Polystyrenkügelchen wurden mit 0,05 M. Phosphatpuffer (pH 7,1) gewaschen. Danach wurden 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,1), welcher 25% Block Ace enthielt, zu den Kügelchen zum mindestens 40-stündigen Blockieren bei 4ºC gegeben, wodurch die Kügelchen, auf denen der KY-ANP-III-Antikörper immobilisiert war, erhalten wurden. Die so erhaltenen Kügelchen wurden in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,5) gelagert, der 0,15 M Natriumchlorid, 0,1% BSA, 1 mM EDTA und 0,1% Natriumazid enthielt.
    • Beispiel 4: Markieren des 7B6-Antikörpers mit radioaktivem Iod (¹²&sup5;I)
  • Ein gereinigter 7B6-Antikörper wurde mit ¹²&sup5;I durch das Chloramin T-Verfahren wie folgt markiert:
  • Zuerst wurden 100 ul 0,5 M Phosphatpuffer (pH 7,5) und 2 mCi/20 ul Na¹²&sup5;I (Amersham Corp.) in ein Glasröhrchen gegeben. Dann wurden 60 ul 3,3 mg/ml 7B6-Antikörperlösung in PBS und 20 ul 1 mg/ml Chloramin T-Lösung in 0,5 M Phosphatpuffer (pH 7,5) zu dem Glasröhrchen gegeben und es wurde gerührt. Man ließ die Mischung bei Raumtemperatur 30 Sekunden lang reagieren, und die Reaktion wurde durch Zugabe von 20 ul von 2,5 mg/ml Natriumpyrosulfit-Lösung in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5) gestoppt. Dann wurden 20 ul einer wäßrigen 50 mg/ml Kaliumiodidlösung zu der Reaktionsmischung gegeben, und die Mischung wurde auf Superose 12 (1 · 30 cm) (Pharmacia) aufgetragen und mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert, um ¹²&sup5;I-markierten 7B6 Antikörperfraktionen zu erhalten.
    • Beispiel 5: Sandwich-RIA
  • Standardlösungen, welche eine Serie von Konzentrationen von N- Peptid(1-67) (Peptide Institute, Inc.) enthielten, wurden hergestellt. 50 ul der Standardlösung oder einer Probe wurden in jedes von einer vorherbestimmten Anzahl an Teströhrchen gegeben. Dann wurden 250 ul Puffer C, der ein 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,5) ist, der 0,15 M Natriumchlorid, 0,1% BSA, 1 mM EDTA, und 0,1% Kathon CG (Rohin und Haas) enthält, zu jedem der Teströhrchen gegeben. Jedes der Kügelchen, welche mit dem KY- ANP-III-Antikörper beschichtet waren und welche in Beispiel 3 hergestellt wurden, wurde zu jedem Teströhrchen gegeben. Jedes Teströhrchen wurde bei 200 Bewegungen/Minute bei 25ºC 2 Stunden lang geschüttelt (erste Reaktion), die Lösung in jedem Teströhrchen wurde durch Absaugen entfernt, und die Teströhrchen wurden dreimal mit 2 ml Puffer D (d. h. 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,5), der 1 mM EDTA, 0,0075% Tween 20 und 0,1% Kathon CG enthält) gewaschen. Dann wurde eine zweite Reaktion wie folgt durchgeführt. 300 ul (etwa 200 000 cpm) einer Lösung von ¹²&sup5;I-markiertem 7B6-Antikörper, der in Puffer D verdünnt worden war, der 0,1% BSA enthielt, wurden zu jedem Teströhrchen gegeben, und die Teströhrchen wurden bei 200 Schlägen/Minute bei 25ºC 2 Stunden lang geschüttelt. Die Lösung in den Teströhrchen wurde durch Absaugen entfernt, und die Teströhrchen wurden dreimal mit 2 ml Puffer D gewaschen. Die zurückgebliebene Radioaktivität auf den Kügelchen in jedem Teströhrchen wurde durch einen γ-Strahlenzähler (ARC-600, Aroca) gemessen.
  • Eine Standardkurve, welche mit dem oben-genannten Sandwich-RIA erhalten wurde, wird in Fig. 2 gezeigt. Die Radioaktivität war der Konzentration an N-Peptid(1-67) im Bereich von 0 bis 5000 fmol/ml proportional. Die geringste meßbare Sensitivität war 40 fmol/ml. Ein Reproduzierbarkeitstest wurde mit 4 Proben von humanem Plasma durchgeführt. Der Reproduzierbarkeitstest wurde durchgeführt, um die Genauigkeit des Verfahrens zu bestätigen. Es gibt zwei Arten von Meßmethoden: Ein Intra-Assay-Reproduzierbarkeitstest wird durchgeführt, um die Variation der gemessenen Werte bei einer einzelnen Probe innerhalb eines Tests zu bestätigen. Ein Inter-Assay-Reproduzierbarkeitstest wird durchgeführt, um die Variation der gemessenen Werte zwischen einer Anzahl von Tests, welche mit einer Einzelprobe durchgeführt wurden, zu bestätigen. Die Tabellen 1 und 2- zeigen die Resultate dieser zwei Reproduzierbarkeitstests. In dem Intra- Assay-Reproduzierbarkeitstest war der Variationskoeffizient (CV) 1,5% bis 2,2% (Tabelle 1) und in dem Inter-Assay-Reproduzierbarkeitstest war CV 4,1% bis 5,6% (Tabelle 2). Tabelle 1 Intra-Assay-Reproduzierbarkeit des Sandwich-RIA Tabelle 2 Inter-Assay-Reproduzierbarkeit des Sandwich-RIAa
  • a Sieben verschiedene Versuche wurden im Triplikat über 7 Tage durchgeführt.
  • Danach wurde ein Verdünnungstest mit humanem Plasma durchgeführt. Serielle Zweifach-Verdünnungen mit Puffer C wurden mit vier Proben von humanem Plasma durchgeführt, was zu einer Vielzahl von Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen führte, die gemessen wurden. Die so erhaltenen Proben wurden durch das Sandwich-RIA-Verfahren auf dieselbe Weise wie oben gemessen. Die Resultate sind in Fig. 3 gezeigt. Die Daten zeigen, daß in jeder Konzentration jeder Punkt auf einer geraden Linie liegt, welche in etwa den Nullpunkt schneidet.
  • Danach wurde getestet, ob Bestandteile, von denen angenommen wurde, daß sie in Plasma vorhanden sind, Einfluß auf den Sandwich-RIA haben. Die Resultate zeigen, daß Effekte von gebundenem Bilirubin (0,15 mg/ml), freiem Bilirubin (0,17 mg/ml), Hämoglobin (4,25 mg/ml) und Chylus (Formazintrübung, 24º) nicht gefunden wurden, und daß damit die Bestandteile keinen Einfluß ausübten.
  • So wurde bestätigt, daß N-Peptid durch den erfindungsgemäßen Sandwich-RIA mit guter Präzision ohne Beeinflussung durch andere Plasmabestandteile bestimmt werden kann.
  • Ferner wurde ein Rückgewinnungstest unter Verwendung von humanem Plasma durchgeführt, bei dem eine Standardsubstanz zu einer Testprobe gegeben wird. Vier Proben von humanem Plasma wurden mit einem Faktor 2 mit einer Standard-N-Peptid(1-67)-Lösung verdünnt, die N-Peptid in einer Konzentration von 250, 500 oder 1000 fmol/ml enthielt. Die so erhaltenen Proben wurden mittels des Sandwich-RIA auf dieselbe Weise wie oben beschrieben gemessen. Die Resultate sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Rückgewinnung von zugeführten N-Peptid war 88 bis 134%. Somit wurde bestätigt, daß verschiedene N-Peptide in humanem Plasma und das Standard-N-Peptid eine weitgehend übereinstimmende Reaktivität in dem erfindungsgemäßen Sandwich-RIA zeigen. Tabelle 3 Rückgewinnungstest für zugegebene Substanz durch Sandwich-RIA
  • a Anstieg über endogenes N-Peptid hinaus
  • Danach wurde die Konzentration von N-Peptid in Plasmen von 36 gesunden Subjekten (23 Männer und 13 Frauen) durch den erfindungsgemäßen Sandwich-RIA gemessen. Als Resultat ergab sich ein Durchschnittswert von 213 fmol/ml und eine Standardabweichung von 90 fmol/ml.
    • Beispiel 6: Markieren des 7B6-Antikörpers mit Meerrettichperoxidase (HRP)
  • Ein gereinigter 7B6-Antikörper wurde mit HRP mit dem Verfahren nach Ishikawa et al., a.a.O. wie folgt markiert:
  • Zuerst wurden 4,5 ml 0,2 M Citratpuffer (pH 4,0) und 0,9 ml 2,2 mg/ml Pepsinlösung (Boehringer-Mannheim) in 0,2 M Citratpuffer (pH 4,0) zu 4,5 ml einer 4,4 mg/ml Lösung von gereinigtem 7B6-Antikörper in PBS gegeben, und die Mischung wurde bei 37ºC 18 Stunden lang inkubiert. Der resultierende Verdau in der Mischung wurde durch Ultrogel ACA 44 (2,6 · 84 cm) (IBF Biotechnics) aufgetrennt, das mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) equilibriert wurde. Fraktionen, welche F(ab)&sub2; enthielten, wurden gesammelt und mit Centricon 30 (Amicon) konzentriert.
  • Danach wurden Aliquots des so erhalten F(ab)&sub2; wie folgt reduziert: 1/10 des Volumens an 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0), der 0,1 M 2-Mercaptoethylamin und 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthielt, wurden zu 1,2 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gegeben, welcher 3,3 mg F(ab)&sub2; enthielt, und man ließ die Mischung bei 37ºC 30 Minuten lang reagieren. Die Mischung, welche die reduzierenden Substanzen enthielt, wurde durch Superose 12 (1,5 · 50 cm) (Pharmacia) aufgetrennt, das mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0) equilibriert wurde, der 5 mM EDTA enthielt, um Fraktionen zu erhalten, welche Fab enthielten. Die Fraktionen wurden mit Centricon 10 (Amicon) konzentriert.
  • Auf der anderen Seite wurden 23,6 mg -Maleimidocaproyloxysuccinimid (EMCS, Dojinkagaku), das in 250 ul N,N-Dimethylformamid gelöst worden war, zu 17,2 mg HRP (Sigma) gegeben, das in 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst worden war, und man ließ die Mischung bei 30ºC 15 Minuten lang reagieren. Das so hergestellte Präzipitat wurde durch Zentrifugation entfernt, und der Überstand wurde durch PD-10 (Pharmacia) equilibriert mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0) geleitet, um niedermolekulare Substanzen zu entfernen, wodurch das Maleimidderivat von HRP erhalten wurde.
  • Die erhaltene Fraktion, welche das Maleimidderivat von HRP enthielt und die konzentrierten Fab wurden zusammengemischt, so daß das molare Verhältnis von HRP und Fab 1 : 1 war, und bei 30ºC 1 Stunde lang reagieren gelassen. Mit HRP markierte Fab wurden von nicht-markierten Materialien unter Verwendung von Superose 12 (1,5 · 50 cm), welche mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,5) equilibriert worden war, abgetrennt. Auf diese Weise wurde mit HRP markiertes Fab-Fragment (0,62 mg) erhalten.
    • Beispiel 7: Sandwich-RIA
  • 50 ul einer Standardlösung von N-Peptid(1-67) oder einer Probe wurden in jedes von mehreren Teströhrchen gegeben. Danach wurden 250 ul Puffer C zu jedem Teströhrchen gegeben. In jedes Teströhrchen wurde eines der mit KY-ANP-III-Antikörper beschichteten Kügelchen gegeben, welche in Beispiel 3 hergestellt wurden. Jedes Teströhrchen wurde horizontal bei 200 Bewegungen/Minute bei 25ºC 2 Stunden lang geschüttelt (erste Reaktion), die Lösung in jedem Teströhrchen wurde durch Absaugen entfernt, und die Teströhrchen wurden dreimal mit 2 ml Puffer D gewaschen. Dann wurde die zweite Reaktion wie folgt durchgeführt. 300 ul einer HRP-markierten 7B6-Antikörperlösung, verdünnt in Puffer D, der 0,1% BSA enthielt, wurden zu jedem Teströhrchen gegeben (200 ng/Teströhrchen), und die Teströhrchen wurden mit 200 Bewegungen/Minute bei 25ºC 2 Stunden lang horizontal geschüttelt. Die Lösung in den Teströhrchen wurde durch Absaugen entfernt, und die Teströhrchen wurde fünfmal mit 2 ml Puffer D gewaschen. Dann wurden als Substratlösung 300 ul 0,01 M Citratpuffer (pH 5,0) welcher 8,5 mg/ml 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure (ABTS, Boehringer-Mannheim) und 2 mM H&sub2;O&sub2; enthielt, zu jedem Teströhrohen gegeben, die Teströhrchen wurden bei 25ºC genau 30 Minuten lang stehen gelassen und dann wurden 2 ml Stoplösung zu jedem Teströhrchen gegeben. Die Absorption bei 415 nm von jeder der Mischungen wurde mit einem Spektrophotometer (UV-264, Shimadzu Corporation) gemessen. Destilliertes Wasser wurde als Leerwert verwendet.
  • In Fig. 4 ist eine Standardkurve gezeigt, welche mittels des oben-genannten Sandwich-EIA erhalten wurde. Die auf dem Kügelchen zurückbehaltene Enzymaktivität war proportional zur Konzentration an N-Peptid(1-67) im Bereich von 0 bis 5000 fmol/ml. Die geringste meßbare Sensitivität war 25 fmol/ml. Ein Reproduzierbarkeitstest wurde unter Verwendung von drei Proben von humanem Plasma durchgeführt, die Resultate dessen sind in Tabellen 4 und 5 gezeigt. Im Intra-Assay-Reproduzierbarkeitstest war CV 1,2% bis 4,6%, und in dem Inter-Assay-Reproduzierbarkeitstest war CV 5,9% bis 15,0%. Tabelle 4 Intra-Assay-Reproduzierbarkeit des Sandwich-EIA Tabelle 5 Inter-Assay-Reproduzierbarkeit des Sandwich-EIAa
  • a Vier verschiedene Versuche wurden im Duplikat über 4 Tage durchgeführt.
  • Als nächstes wurde ein Verdünnungstest unter Verwendung humanen Plasmas durchgeführt. Serielle Zweifach-Verdünnungen mit Puffer C wurden bei drei Proben von humanem Plasma durchgeführt. Die so erhaltenen Proben wurden in dem Sandwich-EIA auf dieselbe Weise wie in Beispiel 7 gemessen. Die Resultate sind in Fig. 5 gezeigt. Die Daten zeigen, daß bei jeder Konzentration jeder Punkt sich auf einer geraden Linie befindet, welche in etwa den Nullpunkt schneidet.
  • Daher wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 5 bestätigt, daß das N-Peptid mit dem erfindungsgemäßen Sandwich-EIA ohne Beeinflussung durch andere Bestandteile des Plasmas mit einer guten Präzision gemessen werden kann.
  • Ferner wurde ein Rückgewinnungstest für zugegebenen Substanzen unter Verwendung humanen Plasmas durchgeführt. Drei Proben von humanem Plasma wurden mit einem Faktor 2 mit einer Standard-N- Peptid(1-67)-Lösung verdünnt, welche N-Peptid in einer Serie von Konzentrationen enthielt. Die so erhaltenen Proben wurden den Sandwich-EIA auf dieselbe Weise wie oben beschrieben gemessen. Die Resultate sind in Tabelle 6 gezeigt. Die Rückgewinnung des zugegebenen N-Peptids war 82% bis 103%. Auf diese Weise wurde bestätigt, daß verschiedene N-Peptide in humanem Plasma und das Standard-N-Peptid eine ähnliche Reaktivität im erfindungsgemäßen Sandwich-EIA zeigen. Tabelle 6 Rückgewinnungstest für zugegebene Substanz durch Sandwich-EIA
  • a Anstieg über endogenes N-Peptid hinaus
  • Die Korrelation zwischen den Werten (X) erhalten für 14 Proben von humanem Plasma, welche durch den Sandwich-RIA gemessen wurden und den entsprechenden Werten (Y), gemessen durch den Sandwich-EIA, wurde untersucht. Als Ergebnis ergab sich, daß eine Korrelationsgleichung durch Y = 0,79X -132 (fmol/ml) repräsentiert wurde und daß der Korrelationskoeffizient R 0,99 betrug.

Claims (15)

1. Verfahren zum Messen von hANP(1-98) oder eines Vorläufers desselben, bei dem man
eine Mischung inkubiert, die eine Probe und einen ersten monoklonalen Antikörper enthält, der einen Teil der Aminosäuresequenz von hANP(1-98) erkennt;
zu der Mischung einen zweiten, markierten monoklonalen Antikörper hinzufügt, der einen zweiten, anderen Teil der Aminosäuresequenz von hANP(1-98) erkennt und eine weitere Inkubation folgen läßt; und
einen daraus resultierenden Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex in der Mischung nachweist, wobei der erste oder der zweite monoklonale Antikörper einen Teil der Aminosäuresequenz von Position 43 zu Position 66 des hANP(1-98) erkennen.
2. Verfahren zum Messen von hANP(1-98) oder eines Vorläufers desselben, bei dem man
eine Mischung inkubiert, die eine Probe, einen ersten monoklonalen Antikörper, der einen Teil der Aminosäuresequenz von hANP(1-98) erkennt, und einen zweiten, markierten monoklonalen Antikörper enthält, der einen zweiten, anderen Teil der Aminosäuresequenz von hANP(1-98) erkennt;
und
einen daraus resultierenden Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex in der Mischung nachweist, wobei der erste oder der zweite monoklonale Antikörper einen Teil der Aminosäuresequenz von der Position 43 bis zur Position 66 des hANP(1- 98) erkennen.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, bei dem der erste oder der zweite monoklonale Antikörper 7B6 sind, herstellbar mittels des Hybridoma 7B6 (FERN BP 4878).
4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der erste oder der zweite monoklonale Antikörper 7B6 sind, und der andere ein monoklonaler Antikörper ist, der einen Teil der Aminosäuresequenz des hANP(1-98) erkennt, und dessen Erkennungsstelle sich von der des 7B6 unterscheidet, wobei monoklonale Antikörper 7B6 mittels des Hybridoma 7B6 (FERM BP 4878) herstellbar ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, bei dem der erste oder der zweite monoklonale Antikörper einen Teil der Aminosäuresequenz von Position 43 bis Position 66 des hANP(1-98) erkennen, und der andere monoklonale Antikörper einen Teil der Aminosäuresequenz von Position 1 bis Position 25 des hANP(1-98) erkennt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der andere monoklonale Antikörper KY-ANP-III ist, herstellbar mittels des Hybridoma KY-ANP-III (Ferm BP 1887).
7. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der erste monoklonale Antikörper einen Teil der Aminosäuresequenz von Position 1 bis Position 25 des hANP(1-98) erkennt, und der zweite monoklonale Antikörper einen Teil der Aminosäuresequenz von Position 43 bis Position 66 des hANP(1-98) erkennt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem der erste monoklonale Antikörper KY-ANP-III ist, herstellbar mittels des Hybridoma KY-ANP-III (FERN BP-1887) und der zweite monoklonale Anti körper 7B6 ist, herstellbar mittels des Hybridoma 7B6 (FERM BP-4878).
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, bei dem der zweite monoklonale Antikörper mit einem Radioisotop, einem Enzym, kolloidalem Gold, einer fluoreszierenden Substanz oder einer lumineszierenden Substanz markiert ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem der zweite monoklonale Antikörper mit einem Radioisotop oder einem Enzym markiert ist.
11. Monoklonaler Antikörper, der einen Teil der Aminosäuresequenz von Position 43 bis Position 66 des humanen hANP(1-98) erkennt.
12. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 11, wobei der monoklonale Antikörper 7B6 ist, herstellbar mittels des Hybridoma 7B6 (FERM BP-4878).
13. Hybridoma, das den monoklonalen Antikörper nach den Ansprüchen 11 oder 12 liefert.
14. Hybridoma nach Anspruch 13, wobei das Hybridoma das Maus- Hybridoma 7B6 (FERM BP-4878) ist.
15. Immunoassaykit für hANP (1-98) oder einen Vorläufer desselben, der den monoklonalen Antikörper nach den Ansprüchen 11 oder 12 umfaßt.
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