DE69724636T2

DE69724636T2 - Verfahren und kit zur diagnose von troponin i

Info

Publication number: DE69724636T2
Application number: DE69724636T
Authority: DE
Inventors: Alex G. Katruhka; Sergei Severin; Anastasia Bersenikova; Tatiana Esakova; Kim Pettersson
Original assignee: HYTSET Ltd
Current assignee: HYTSET LTD., TURKU, FI
Priority date: 1996-06-25
Filing date: 1997-06-23
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2017-06-24
Also published as: EP0938678A1; EP0938678B1; AU3178697A; WO1997049994A1; DE69724636D1

Description

Gebiet der Erfindung
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verbesserung eines Immuntestverfahrens zum Testen von menschlichem Herz- und Skelett-Troponin I (TnI) in einer Probe aus dem Blutstrom eines Patienten.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur Verwendung in einem verbesserten diagnostischen Immuntestverfahren zum Testen von Troponin I in einer Probe aus dem Blutstrom eines Patienten.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine verbesserte Troponin I-Standardzubereitung zur Verwendung in dem Verfahren und in dem Kit der vorliegenden Erfindung.
Hintergrund der Erfindung
Menschliches Herz-Troponin I (h. c. TnI) wurde unlängst als ein spezifischer und empfindlicher Marker für den Herzmuskelzelluntergang vorgeschlagen. Es wird nach einer Herzmuskelschädigung, z. B. nach einem akuten Myokardinfarkt (AMI), in den Blutstrom freigesetzt (vgl. z. B. Adams J. E. et al., Circulation 88 (1993), 101–106). Menschliches Skelett-Troponin I (h. sk. TnI) wurde als ein empfindlicher und spezifischer Marker für den Skelettmuskelzelluntergang vorgeschlagen.
TnI ist die Untereinheit eines Troponinkomplexes, der eine wichtige Rolle bei der Ca²⁺-abhängigen Regulierung der Skelett- und Herzmuskelkontraktion bei Vertebraten spielt. Der Troponinkomplex ist auf dem dünnen Filament des kontraktilen Apparates angeordnet, und durch seine Assoziation mit zwei anderen dünnen Filamentproteinen, Aktin und Tropomyosin, hemmt er die Actomyosin-Wechselwirkung bei submikromolaren Ca²⁺-Konzentrationen und stimuliert er die Wechselwirkung bei mikromolaren und höheren Ca²⁺-Konzentrationen. Der Troponinkomplex enthält drei Untereinheiten – Troponin C (TnC), das die Ca²⁺-bindende Untereinheit ist; Troponin I (TnI), das die hemmende Untereinheit ist; und Troponin T (TnT), das die Tropomyosin-bindende Untereinheit ist. Die Wechselwirkung zwi schen den drei Untereinheiten des Troponinkomplexes ist so stark, daß ursprünglich angenommen wurde, daß das gereinigte Troponin ein einzelnes Protein ist.
Die Ca²⁺-abhängige Regulation wird durch Konformationsänderungen in TnC und nachfolgende Veränderungen in der Wechselwirkung von TnC mit TnI initiiert. TnC besteht aus zwei globulären Domänen, die durch eine zentrale Helix verbunden sind. Jede Domäne enthält zwei Metallbindungsstellen. Zwei Stellen in der N-terminalen Domäne (Stellen I und II) binden Ca²⁺ mit geringer Affinität, während Stellen in der C-terminalen Domäne (Stellen III und IV) Ca²⁺ mit hoher Affinität binden. Bei submikromolaren Ca²⁺-Konzentrationen sind die Metallbindungsstellen in der C-terminalen Domäne von TnC mit Mg²⁺ besetzt, während die Ca²⁺-spezifischen Stellen in der N-terminalen Domäne leer sind. In diesem Fall ist die N-terminale Region von TnI an die C-terminale Domäne von TnC gebunden, während die hemmenden C-terminalen Regionen des TnI-Moleküls mit Aktin und Tropomyosin, aber nicht mit TnC interagieren. Wenn sich die Ca²⁺-Konzentration auf einen mikromolaren Spiegel erhöht, bindet Ca²⁺ an die N-terminalen, Ca²⁺-spezifischen, mit geringer Affinität bindenden Stellen von TnC. Die Ca²⁺-Bindung erhöht die Affinität dieser Domäne für die hemmenden und C-terminalen Regionen von TnI, woraus die Freisetzung der Fragmente aus Aktin und Tropomyosin resultiert und ein enger Kontakt mit den verlängerten zentralen und N-terminalen Regionen von TnC hergestellt wird. Diese Bindung mit hoher Affinität der Komponenten des Troponinkomplexes hat wichtige Konformationsänderungen in beiden Molekülen zur Folge.
Im menschlichen quergestreiften Muskel wurden drei Formen von TnI nachgewiesen: zwei für den Skelettmuskel ((h. sk. TnI) und eine für den Herzmuskel (h. c. TnI). Die drei Troponinformen besitzen ähnliche Strukturen, jedoch wurde für das menschliche Herz-Troponin I das Vorhandensein von 33 zusätzlichen Aminosäuren im N-terminalen Teil des Moleküls gezeigt, verglichen mit der Skelett-TnI-Isoform. Dieses zusätzliche Polypeptid und auch einige Austäusche bezüglich der Aminosäuren ermöglichen die Unterscheidung des menschlichen Herz-Troponins I von den Skelettformen, zum Beispiel durch immunologische Verfahren. Alle gegenwärtigen diagnostischen Systeme basieren auf der immunologischen Messung von TnI in Serumproben.
Es ist gezeigt worden, daß in Gegenwart von mikromolaren und höheren Ca²⁺-Konzentrationen ein Gemisch von Troponin I und Troponin C in Form eines Komplexes vorliegt, wobei eine starke Wechselwirkung zwischen den beiden Molekülen vorhanden ist. Falls sich jedoch die Ca²⁺-Konzentration in der Lösung auf submikromolare Spiegel ver ringert, wird das Ca²⁺ aus den Metallbindungszentren von TnC herausgewaschen. Nachdem das Ca²⁺ entfernt ist, schwächt sich die Wechselwirkung zwischen den zwei Proteinen ab und die Konformation von TnI zeigt Ähnlichkeiten mit dem nativen (nicht komplexierten) Protein.
Die Ca²⁺-Konzentration in menschlichem Serum ist ausreichend, daß die zwei mit geringer Affinität bindenden Zentren von TnC Ca²⁺ binden. Das bedeutet, daß im Serum von Patienten mit AMI oder in Patienten mit verschiedenen Skelettmuskelerkrankungen ein Großteil des TnI's in Form eines Komplexes mit TnC vorliegen sollte. Die Experimente der Erfinder bestätigten diese Hypothese. Sie zeigten, daß im Serum von AMI-Patienten der größte Teil von TnI (50–90%) in Form eines Komplexes mit TnC (und wahrscheinlich auch mit TnT) vorliegt. Wie vorstehend erwähnt, unterscheidet sich die Konformation von TnI im Komplex mit TnC bei hohen, d. h. mikromolaren und höheren Ca²⁺-Konzentrationen von der Konformation des freien TnI oder von TnI im Komplex mit TnC bei submikromolaren Ca²⁺-Konzentrationen.
In der Praxis wird gewöhnlich ein hochreines Protein für die Immunisierung von Tieren zur Herstellung von monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern verwendet. Die Konformation des gereinigten TnI's, das zur Immunisierung und für eine Standardzubereitung verwendet wird, ist jedoch von. derjenigen von TnI im Komplex mit TnC verschieden. Die Konformationsänderung des Proteins kann die Affinität der Antikörper verringern oder eine Protein-Antikörper-Wechselwirkung unmöglich machen. Außerdem wird infolge der starken Wechselwirkung zwischen den zwei Troponinmolekülen bei mikromolaren und höheren Ca²⁺-Konzentrationen das TnC einen Teil der Oberfläche des TnI-Moleküls überdecken und manche der Epitope für einige Antikörper blockieren, die durch die Immunisierung von Tieren mit hochreinem Troponin I erzeugt werden. Als Ergebnis weisen Immuntests, welche auf der Verwendung solcher Antikörper basieren, so wie der größte Teil der im Handel erhältlichen Antikörper, die für diesen Zweck entwickelt wurden, nur das freie TnI und einen Teil des TnI im Komplex mit TnC nach, falls die Affinitätskonstante der Antikörper infolge der TnI-TnC-Wechselwirkung verändert wird; oder sie weisen nur das freie TnI nach, falls die Epitope des Antikörpers vollständig durch TnC überdeckt sind. In jedem Fall ist die Konzentration von TnI, welche durch solche Systeme in AMI-Serumproben nachgewiesen wird, anders (niedriger) als die wirkliche Konzentration dieses Proteins.
Daher besteht ein Bedarf für ein Verfahren, das Tests unter Verwendung solcher Antikörper verbessern würde. Ein solches Verfahren wäre nicht nur im Fall von diagnostischen Systemen nützlich, die zum Testen der Herzform von TnI in Serum entwickelt wurden, sondern auch in Immuntests, welche zur Messung der Skelettformen von TnI zur Diagnose einer Skelettmuskelgewebsnekrose entwickelt wurden.
In der Praxis wird gewöhnlich ein gereinigtes Antigen zur Herstellung von Eichmaterialien oder Standardzubereitungen für die Immuntests verwendet. Im Fall von TnI ist die Reinigung üblicherweise ein komplizierter Prozeß, der mehrere Tage dauert und verschiedene Säulenchromatographieschritte (Affinitäts-, Ionenaustauscherchromatographie etc.) einschließt. Es ist eine hinreichend bekannte Tatsache, daß TnI sehr empfindlich gegen eine Proteolyse ist. Während der langen Reinigung kann das Troponin I-Molekül durch Proteasen teilweise gespalten werden und somit kann ein Teil der Epitope für einige Antikörper verloren gehen. Außerdem umfassen alle gegenwärtigen Verfahren zur TnI-Reinigung Schritte, bei denen hochkonzentrierte (6–8 M) Harnstofflösungen verwendet werden, um die Komponenten des Troponinkomplexes zu trennen. Eine solche rigide Behandlung kann irreversible Konformationsänderungen einiger Teile des TnI-Moleküls zur Folge haben. Folglich kann sich die Konformation der TnI-Moleküle in hochreinen Zubereitungen von derjenigen des nativen Proteins unterscheiden. Zusätzlich kann der lange Kontakt des Proteins mit Harnstoff in hohen Konzentrationen eine teilweise Carbamoylierung des TnI-Moleküls zur Folge haben. Folglich kann sich die immunologische Aktivität eines hochreinen TnI von derjenigen eines nativen TnI unterscheiden.
Zusammenfassung der Erfindung
Der Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten diagnostischen Immuntestverfahrens zum Testen von Troponin I in einer Probe aus dem Blutstrom eines Patienten, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: das Inkontaktbringen der Probe mit einem Ca²⁺-Bindemittel und das Bestimmen der Troponin I-Konzentration in der Probe unter Verwendung eines Standards, wobei der Standard einen kompletten Troponinkomplex umfaßt.
Die verwendete Menge des Ca²⁺-Bindemittels ist ausreichend, um die Ca²⁺-Konzentration in der Probe auf einen submikromolaren Spiegel zu verringern, wodurch die TnI-TnC-Wechselwirkung vermindert wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kit zur Verwendung in einem Verfahren zur Verbesserung der Empfindlichkeit eines diagnostischen Immuntestverfahrens zum Testen von Troponin I in einer Probe aus dem Blutstrom eines Patienten, wobei der Kit einen monoclonalen oder polyclonalen Antikörper gegen Troponin I, ein Ca²⁺-Bindemittel, einen nachweisbaren Macker und einen Standard in Form eines kompletten Troponinkomplexes enthält.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines kompletten nativen Troponinkomplexes, isoliert und gereinigt aus Muskelgewebe, zur Herstellung eines TnI-Eichmaterials oder -Standards. Eine solche Standardzubereitung wird in dem Testverfahren und in dem Kit gemäß der Erfindung verwendet.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Das erfindungsgemäße Verfahren wird als ein Immuntestverfahren unter Verwendung von mono- oder polyclonalen Antikörpern gegen TnI ausgeführt, d. h. mit Antikörpern gegen entweder das menschliche Herz- oder Skelett-Troponin I, abhängig von dem spezifischen Troponin-Antigen, auf das getestet werden soll.
Das Immuntestverfahren kann ein beliebiges der bekannten Immuntestverfahren sein, welche für diesen Zweck geeignet sind, wie ein Enzymimmuntest, Radioimmuntest, lumineszierender Immuntest oder Fluoroimmuntest. Solche Immuntestsysteme sind dem Fachmann gut bekannt und auch im Handel erhältlich.
Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das Verfahren als ein Sandwich-Immuntestverfahren unter Verwendung von Paaren von vorzugsweise monoclonalen anti-TnI-Antikörpern durchgeführt, wobei ein Antikörper als ein "Fänger" (capture)-Antikörper dient, immobilisiert an einer festen Phase, und der zweite Antikörper den Macker trägt und als "Nachweis"-Antikörper wirksam ist.
Erfindungsgemäß kann ein solches diagnostisches Testverfahren verbessert werden, indem die zu testende Probe mit einem Agens oder Reagens in Kontakt gebracht wird, das Ca²⁺ binden oder komplexieren kann. Erfindungsgemäß kann ein solches Ca²⁺-Bindemittel eine beliebige Substanz sein, welche einerseits eine ausreichende Affinitätskonstante für Ca²⁺ besitzt, um den Ca²⁺-Spiegel auf eine submikromolare Konzentration zu verringern, und andererseits das Testverfahren nicht negativ beeinflußt.
Das Ca²⁺-Bindemittel wird vorzugsweise in Form einer Lösung, vorzugsweise einer wäßrigen Lösung oder einer Pufferlösung verwendet, die mit dem Test verträglich ist.
Eine bevorzugte Gruppe von Ca²⁺-Bindemitteln sind die Metallchelate bildenden Mittel, welche Metalle, einschließlich Ca²⁺, in wäßrigen Lösungen binden. Die Gruppe der Metallchelate bildenden Mittel ist dem Fachmann gut bekannt und schließt solche Stoffe wie Polyoxycarbonsäuren, Polyamine, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Nitrilotriessigsäure (NTA) und Ethylenglykol-O,O'-bis(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA) sowie ähnliche Mittel ein. Bevorzugte Stoffe sind EDTA und EGTA in wäßriger Lösung.
Endungsgemäß wird das Ca²⁺-Bindemittel in Form einer Lösung mit der zu testenden Probe in Kontakt gebracht. Dies kann durch direkte Zugabe der Ca²⁺-Bindemittellösung zu der Probe oder, in einem Sandwich-Immuntestverfahren, zu dem Puffer, der in dem Test während der Inkubation mit der Blutprobe verwendet wird, erfolgen.
Das Ca²⁺-Bindemittel wird in einer ausreichenden Menge verwendet, um die Troponin I-Troponin C-Wechselwirkung zu vermindern, indem eine ausreichende Menge an Ca²⁺ gebunden wird, um den Ca²⁺-Spiegel in dem Testmedium auf einen submikromolaren Spiegel zu verringern. Die Verminderung der Wechselwirkung hat eine bessere Exposition von TnI zur Folge, welches dann getestet werden kann.
Der Standard zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren umfaßt den kompletten nativen Troponinkomplex, der TnI, TnT und TnC in äquimolarer Konzentration enthält und aus Muskelgewebe, wie menschliches Herzgewebe, zum Beispiel unter Anwendung eines Verfahrens isoliert werden kann, das hinsichtlich des bei Katrukha et al., "Biochemistry and Molecular Biology International", Bd. 36 (1995), Nr. 1, S. 195–202, beschriebenen Verfahrens leicht modifiziert ist. Durch Verwendung des ganzen Komplexes anstatt des gereinigten TnI's können Probleme vermieden werden, welche zum Beispiel mit Veränderungen in einigen Epitopen auf dem Troponin I verbunden sind, die beispielsweise während der Reinigung auftreten können. Die Erfinder haben auch gezeigt, daß die Stabilität von TnI in Form des nativen Troponinkomplexes erheblich höher ist im Vergleich zu derjenigen des gereinigten TnI, das üblicherweise als Standard verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch einen Kit zur Verwendung in einem Immuntestverfahren, wie vorstehend definiert. Ein solcher Kit würde mindestens einen mono- oder polyclonalen Antikörper gegen TnI, ein Ca²⁺-Bindemittel, vorzugsweise in Form einer wäßrigen Lösung, einen nachweisbaren Marker und einen kompletten Troponinkomplex als Standard einschließen. Der Marker ist an eine der immunreaktiven Komponenten gebunden, um ein Mittel zur Darstellung des Ausmaßes der immunologischen Wechselwirkung bereitzustellen und auf diese Weise die Bestimmung des TnI-Spiegels in der Probe zu ermöglichen. Folglich ist der Marker von einem Typ, der durch herkömmliche Nachweisverfahren nachgewiesen werden kann, wie unter Anwendung von Verfahren auf der Basis von Absorption, Lumineszenz, Fluoreszenz oder Radioaktivität. Das nachgewiesene Signal kann dann mit Standardkurven verglichen werden. Die Standardkurven werden aufgestellt, indem in der Standardzubereitung bekannte Mengen des vollständigen Troponinkomplexes verwendet werden, der die vorstehend beschriebenen drei Untereinheiten enthält und direkt aus Muskelgewebe gewonnen worden ist. Eine solche Zubereitung besitzt den Vorteil, daß sie bessere immunologische Eigenschaften als eine Zubereitung besitzt, die das gereinigte TnI enthält. Der Troponinkomplex in dem Standard kann mit einem Ca²⁺-Bindemittel wie EDTA kombiniert werden, das zum Beispiel in einem Puffer vor der Messung zugegeben wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Kit zwei monoclonale Antikörper gegen TnI, um einen Sandwich-Immuntest zu ermöglichen. Der erste oder Fänger-Antikörper kann in einem solchen Fall vorher an eine feste Phase gebunden werden, wie die Wand einer Mikrotiterplattenvertiefung. Der zweite oder Nachweis-Antikörper, der den Marker trägt, kann in einer geeigneten Pufferlösung bereitgestellt werden. Das Ca²⁺-Bindemittel kann in einer wäßrigen oder Pufferlösung separat bereitgestellt werden oder in die Lösung des zweiten Antikörpers eingeschlossen werden.
Es ist auch möglich, den Kit in Form eines hinreichend bekannten Immunchromatographiestreifens zu formulieren. Ein solcher Streifen kann ohne weiteres mit Vollblut verwendet werden, um zum Beispiel AMI in einem frühen Stadium zu diagnostizieren, z. B. bereits in der Ambulanz im Falle eines Notfalls.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform haben die Erfinder ein zweistufiges zeitaufgelöstes Fluoroimmuntestverfahren, LANFIA, und zwar den Lanthanid-Fluoroimmuntest, verwendet. In diesem Verfahren wird ein erster biotinylierter TnI-Antikörper (Fänger (capture)-Antikörper) auf eine feste Phase aufgebracht, zum Beispiel die berfläche einer Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplattenvertiefung. Nach dem Waschen wird die beschichtete berfläche in einem zweiten Schritt dann mit einem Gemisch aus der Probe und einem zweiten markierten, z. B. Eu-Chelat-markierten, Antikörper (Nachweisantikörper) in einem Puffer inkubiert. Eine Lösung des Ca²⁺-Bindemittels kann entweder zu der Probe oder zu der Lösung des Nachweisantikörpers zugegeben werden. Nach dem Waschen und der Zugabe einer LANFIA-Verstärkungslösung wird das Fluoreszenzsignal (Zählimpulse pro Sekunde) in herkömmilicher Weise gemessen. Eine Beschreibung der Verwendung der zeitaufgelösten Fluorometrie in einem Immuntest findet man zu Beispiel in "Alternative [Immunoassays", hrsg. durch Collins W. P., John Wiley & Sons, Ltd., 1985, Kapitel 12.
Ausführliche Beschreibung der Zeichnungen
In den Zeichnungen zeigt 1 die Troponin I-Epitopkarte. Es sind fünf antigene Domänen für acht monoclonale anti-Troponin I-Antikörper erkennbar, die in den Experimenten der Erfinder getestet wurden. Drei monoclonale Antikörper (7F4, 11D7 und ES23) haben einmalige Epitope; 8E10 und 5F1 haben das gleiche Epitop; und die Epitope von 10F4 und 10B11 sowie 8E10, 5F1 und 2A3 überlappen sich.
2 zeigt die Wirkung von Troponin C auf die immunologische Aktivität von Troponin I für mehrere Antikörperpaare (jeweils 1–5):
Die linke Säule (schwarz) zeigt das erhaltene Signal beim Testen einer Troponin I-Lösung (30 ng/ml TnI in normalem menschlichem Serum); die mittlere Säule (hellgrau) zeigt die Wirkung der Zugabe eines 5 fachen molaren Überschusses an Troponin C; und die rechte Säule (dunkelgrau) zeigt die Wirkung von EDTA als ein Ca²⁺-Bindemittel, zugesetzt zu dem Inkubationsgemisch von TnI und TnC. Praktisch alle Tests (außer #3) werden in einem unterschiedlichen Ausmaß durch die Zugabe von TnC zu einer Troponin I-Standardzubereitung beeinflußt. EDTA, zugesetzt zu einem Inkubationsgemisch, stellt die immunologische Aktivität von Troponin I wieder her. Nur für einen Antikörper, ES23. bleibt das Epitop durch Troponin C teilweise bedeckt (verändert), auch in Gegenwart von EDTA.
Die 3 zeigt die Epitopkarte für die getesteten Antikörper in Gegenwart von Troponin C. Die Epitope der Antikörper 10B11, 10F4, 11D7 und ES23 sind durch Tropo_nin C in Gegenwart von Ca²⁺ verändert oder bedeckt (3A). Falls die Ca²⁺-Konzentration auf einen submikromolaren Spiegel verringert wird (-Ca²⁺), sind die Epitope aller Antikörpe_r (außer das Epitop von Antikörper ES23) nicht mehr bedeckt oder verändert (3B).
4 zeigt die Ergebnisse des Tests von drei Serumproben (1, 2 und 3) aus AMI-Patienten in drei verschiedenen Testsystemen (A, B und C).
Die linke Säule gibt das Signal aus einer Serumprobe ohne ein Ca²⁺-Bindemittel an, und die rechte Säule gibt das Signal einer ähnlichen Probe, aber mit zugesetztem EDTA, an. Die Erhöhung des Signalpegels nach der Zugabe eines Ca²⁺-Bindemittels zu der Probe ist für die ersten zwei Systeme offensichtlich und im Fall des letzten Systems weniger deutlich, was nahelegt, daß die Epitope der Antikörper 2A3 und 10B11 durch die Troponin I-Troponin C-Wechselwirkung nicht stark verändert werden.
5 zeigt den Vergleich der immunologischen Aktivitäten von hochreinem Troponin I, gelöst in normalem menschlichem Serum in einer Konzentration von 30 ng/ml, und von Troponin I in Form des nativen Komplexes (gereinigt unter milden Bedingungen) in der gleichen Konzentration.
Die schwarze Säule zeigt das Signal, welches beim Testen einer Troponin I-Lösung erhalten wird; die hellgraue Säule zeigt den Signalpegel, wenn der Troponinkomplex in Gegenwart von Ca²⁺ getestet wurde; und die dritte Säule (dunkelgrau) gibt das Signal an, das erhalten wird, wenn der Troponinkomplex in Gegenwart von EDTA getestet wurde. Für drei getestete Paare (#3, 4 und 5) besaß Troponin I in Form des nativen Troponinkomplexes in Gegenwart von EDTA die gleiche immunologische Aktivität wie das hochreine Troponin I. Für 10F4-Biot.-8E10-Eu-Antikörper wies Troponin I in der komplexierten Form eine bessere Aktivität als das gereinigte Troponin I auf. Diese Tatsache bestätigt, daß sich während der langen Reinigung einige Epitope von Troponin I verändern können. Unter diesem Gesichtspunkt ist es besser, Troponin I in Form des nativen Komplexes für eine Troponin I-Standardzubereitung zu verwenden. Nur für einen Antikörper, den ES23-Antikörper, bleibt das Epitop durch Troponin C teilweise bedeckt (verändert), selbst in Gegenwart von EDTA, so wie in dem Fall, wenn Troponin C zu der Troponin I-Lösung zugegeben wurde.
Die 6A und 6B zeigen die Stabilität von gereinigtem TnI und von TnI in dem Troponinkomplex, inkubiert für eine Woche bei 4°C bzw. 20°C. Die Tests wurden unter Verwendung des menschlichen Herz-Troponinkomplexes (HyTest, Turku) in einem 10F4-Biot.-7F4-Eu-Test ausgeführt. Der Komplex wurde unter milden Bedingungen gereinigt und enthält alle Komponenten in äquimolaren Anteilen. Das in dem Test mit TnI in Form des Komplexes erhaltene Signal war höher als das Signal, welches in dem Test mit gereinigtem TnI erhalten wurde. Dies bestätigt, daß während der Reinigung von TnI das Protein seine native Konformation verändern kann. Die 6A und 6B zeigen, daß die Stabilität von TnI in dem nativen Troponinkomplex wesentlich höher ist als die Stabilität des gereinigten TnI-Proteins.
Beispiele
Troponin I-Reinigung
Das Troponin I, welches die Erfinder zur Immunisierung von Mäusen, zum Testen von Hybridomen und für die Standardzubereitung verwendeten, wurde hergestellt, wie in "Biochemistry and Molecular Biology International", Bd. 36 (1995), Nr. 1, S. 195–202, beschrieben ist.
Troponinkomplex-Präparation
Zur Troponinkomplex-Präparation wendeten die Erfinder ein Verfahren an, welches bezüglich des in "Biochemistry and Molecular Biology International", Bd. 36 (1995), Nr. 1, S. 195–202, beschriebenen Verfahrens leicht modifiziert war.
10 Gramm Muskelgewebe wurden bei Höchstgeschwindigkeit in 100 ml Puffer 1, enthaltend 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 5 mM CaCl₂, homogenisiert. Das Homogenat wurde für 10 min bei 10.000 g zentrifugiert, und das Pellet wurde ein zweites Mal in dem gleichen Volumen desselben Puffers, enthaltend 1% Triton X-100, homogenisiert. Nach der Zentrifugation wurde das Pellet in 100 ml 150 mM Kaliumphosphatpuffer (Puffer 2), pH 6,5, enthaltend 0,3 M KCl, 0,2 mM ATP, 1 mM PMSF, homogenisiert. Nach dem Zentrifugieren für 30 min bei 10.000 g wurde das Pellet in 100 ml eines kalten 25 mM Tris/HCl-Puffers, pH 7,5, enthaltend 0,7 M LiCl, 5 mM CaCl₂, PMSF (Puffer 3), suspendiert. Die Suspension wurde für 30 min bei 0°C gerührt und dann für 1 Stunde bei 10.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Papierfilter filtriert und dann auf eine Affinitätssäule, enthaltend einen immobilisierten monoclonalen anti-Troponin I-Anti körper (Clon C5, Antikörper dieses Clon sind mit den Skelett- und Herzformen von Troponin I kreuzreaktiv, weshalb diese Säule zur Präparation der Skelett- und Herzformen von Troponin verwendet werden kann), aufgegeben. Die Affinitätssäule wurde mit Puffer 3 voräquilibriert. Die Säule wurde mit mehreren Volumina von Puffer 3 gewaschen, und das Troponin wurde mit 0,1 M Glycinpuffer, pH 2,0, enthaltend 5 mM CaCl₂, eluiert. Anschließend wurde das Protein gegen Puffer 3 über Nacht dialysiert. Die Ausbeute beträgt üblicherweise 12–15 mg Troponin aus 10 g Muskelgewebe. Gemäß einer SDS-Gelelektrophorese war das Troponin durch unbekannte Proteine leicht verunreinigt. Die Konzentration von Troponin I und Troponin T wurde mittels Durchmustern der Gele mit dem Troponinkomplex und mit Troponin I- und Troponin T-Standardzubereitungen bestimmt.
Herstellung von monoclonalen Antikörpern
BALB/c-Mäuse wurden mit gereinigtem Troponin I unter Verwendung eines Standardprotokolls immunisiert. Kurz zusammengefaßt wurden den Mäusen am Tag 1 intraperitoneal 100 μg menschliches Herz-Troponin I in komplettem Freundschen Adjuvans injiziert. An den Tagen 31 und 61 erhielten die Mäuse intraperitoneal eine Nachimpfung mit 100 μg Troponin I in inkomplettem Freundschen Adjuvans. Die letzten Nachimpfungen wurden an den Tagen 91 und 93 mit 50 μg des Antigens in phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,4, sowohl intraperitoneal als auch intravenös injiziert, verabreicht. Am Tag 96 wurden die Mäuse getötet, ihre Milz wurde entnommen, und die Splenocyten wurden für eine Fusion isoliert. Die Splenocyten wurden mit der Nichtsekretor-Zelllinie sp2/0 fusioniert und in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium, enthaltend Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT) mit 15% fötalem Rinderserum, ausplattiert.
Vertiefungen mit einem Hybridomwachstum in HAT-Medium wurden auf die Produktion von anti-Troponin I-Antikörpern durchmustert. Für diesen Zweck wurden die Hybridomkulturmedien für 30 Minuten bei 37°C in Mikro-ELISA-Platten inkubiert, welche mit Troponin I (300 ng/Vertiefung) beschichtet waren, und nach dem Waschen mit HRP-markierten Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörpern inkubiert. Nach dem Waschen wurde die HRP-Aktivität unter Verwendung von o-Phenylendiamin/Wasserstoffperoxid als Substrat und 1 M Schwefelsäure als Stoppreagens und einer 30-minütigen Farbentwicklung bestimmt. Positive Hybridome wurden unter Verwendung von Mikro-ELISA-Vertiefungen, beschichtet mit der Skelettform von Troponin I, erneut auf die Antikörperspezifität getestet.
Die basierend auf der Spezifität selektierten Hybridome wurden durch zwei Grenzverdünnungsrunden in Aminopterin-freiem (HT) Medium cloniert. Stabile Hybridomclone wurden als Aszitestumoren in BALB/c-Mäusen gezüchtet. Die Spezifität des monoclonalen Antikörpers wurde unter Verwendung von h. c. TnI- und h. sk. TnI-beschichteten Mikro-ELISA-Platten und unterschiedlichen Verdünnungen der Aszitesflüssigkeit noch einmal überprüft.
Die monoclonalen Antikörper wurden durch eine Protein-A-Sepharose-Affinitätschromatographie (Pharmacia) aus den Aszitesflüssigkeiten gereinigt. Die Antikörperkonzentrationen wurden mittels der Lowry-Methode unter Verwendung von Maus-IgG (Calbiochem) als Standard bestimmt.
Die Spezifität der monoclonalen Antikörper wurde durch ein Western-Blot-Verfahren bestätigt. Die gereinigten monoclonalen Antikörper wurden mit Western-Blot-Membranen, enthaltend gereinigte Proteine – h. c. TnI und h. sk. TnI, übertragen aus einem SDS-PAGE-Gel (Gel mit einen Gradienten von 7,5–15%), inkubiert (3 μg/ml, 1 Stunde, 37°C). Nach dem Waschen und einer 1-stündigen Inkubation mit HRP-markierten Ziege-anti-Maus-Antikörpern bei 37°C wurden die Proteinbanden nach Inkubation mit 4-Chlor-l-naphthol/Wasserstoffperoxid-Substrat sichtbar gemacht. Alle hierin beschriebenen Antikörper waren h. c. TnI-spezifisch ohne eine Kreuzreaktion mit h. sk. TnI.
Antikörperbiotinylierung
Zur Antikörperbiotinylierung verwendeten die Erfinder einen Biotinamidocaproat-N-hydroxysuccinimidester. Kurz zusammengefaßt wurde das Biotinylierungsreagens in Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst. Die Antikörperlösung (3 mg/ml) wurde in 0,1 M Boratpuffer, pH 8,8, hergestellt. Das Biotinylierungsreagens wurde zu der Antikörperlösung in einem Verhältnis von 200 μg Ester pro Milligramm Antikörper zugegeben, gut gemischt und bei Raumtemperatur für 4 Stunden inkubiert. Anschließend wurden 17 μl 1 M NH₄C1 pro 200 μg Biotinester zugegeben, und nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Puffer unter Verwendung von NAP^TM-5- und NAP^TM-10-Säulen (Pharmacia, Uppsala, Schweden), voräquilibriert mit 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,75, enthaltend 0,9% NaCl und 0,05% NaN₃, ausgetauscht.
Antikörper-Eu-Markierung
Die zur Markierung der Nachweisantikörper verwendeten stabilen fluoreszierenden Eu-Chelate wurden von Wallac Oy (Turku, Finnland) bezogen. Die Erfinder verwendeten ein Eu-Chelat von 4-[2-(4-Isothiocyanatophenyl)ethinyl]-2,6-bis{[N,N-bis(carboxymethyl)amino]methyl}pyridin. Die Markierung der monoclonalen Antikörper mit dem Eu-Chelat wurde über Nacht bei +4°C mit einem 200 fachen molaren Überschuß des Chelats in 50 mM Natriumcarbonatpuffer, pH 9,8, durchgeführt. Die markierten Antikörper wurden von dem Überschuß an freiem Chelat durch Gelfiltration an einer Superdex^TM 200 HR 10/30-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) getrennt. Die Säule wurde mit 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,75, enthaltend 0,9% NaCl und 0,05% NaN₃, voräquilibriert. Der Markierungsgrad der gepoolten Antikörperfraktion wurde gegenüber einem Eu-Eichmaterial bestimmt.
Vorinkubation von Streptavidin-beschichteten Platten mit biotinylierten anti-TnI-Antikörpern
Biotinylierte Antikörper wurden in den Vertiefungen einer Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatte für 30 min bei Raumtemperatur unter Verwendung einer Konzentration von 400 ng Antikörper pro Vertiefung in 0,2 ml DELFIA^®-Puffer unter vorsichtigem Schütteln inkubiert. DELFIA^®-Assaypuffer enthält pro Liter 50 mM Tris/HCl, pH 7,75, 9 g NaCl, 5 g BSA, 0,5 g Rinderserum-γ-Globulin, 0,1 g Tween^® 40, 20 μM DTPA, 0,5 g NaN₃ und 20 mg Kirschrot.
Nach der Inkubation wurden die Platten zweimal mit DELFIA^®-Waschlösung gewaschen.
Inkubation der markierten Antikörper mit Serumproben in den vorabsorbierten Platten
Im zweiten Schritt wurden AMI-Serumproben mit Eu-markierten Antikörpern (200 ng/Vertiefung) und mit EDTA in einer Konzentration von 5 mM für 30 min bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Schütteln inkubiert. 0,025 ml Serum und 0,1 ml Antikörperlösung in DELFIA^®-Puffer wurden pro Vertiefung verwendet. Die EDTA-Lösung kann entweder direkt zu der Serumprobe oder zu der Lösung des markierten Antikörpers zugegeben werden.
Nach der Inkubation wurde die Platte 6 mal mit DELFIA^®-Waschlösung gewaschen, und danach wurden 0,2 ml LANFIA-Verstärkungslösung pro Vertiefung zugegeben. Nach einer 3-minütigen Inkubation unter vorsichtigem Schütteln wurde das Signal gemessen.
Anstelle von EDTA als Lösung in Wasser kann eine Lösung in DELFIA^®-Puffer verwendet werden (pH eingestellt auf 7,7–7,8). Statt EDTA kann EGTA (Ethylenglykol-,'-bis(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraessigsäure) in Lösung mit Wasser oder Puffer in der gleichen Konzentration wie EDTA verwendet werden.
Das vorstehende System wurde auch verwendet, um die in den 2, 4 und 5 gezeigten Ergebnisse zu erhalten, indem anstelle der Serumprobe eine Troponin I-Lösung in normalem menschlichem Serum mit oder ohne Troponin C verwendet wird, welche zum Beispiel gemäß dem Verfahren von Katrukha et al., "Biochemistry and Molecular Biology International", Bd. 36, Nr. 1 (1995), S. 195–202, hergestellt wurde.
Epitopkartierung
Die Erfinder verwendeten in ihren Experimenten acht monoclonale Antikörper, welche für die Herzform von menschlichem Troponin I ohne Kreuzreaktion mit den Skelettformen von Troponin I spezifisch sind. Alle möglichen Kombinationen dieser Antikörper für einen Sandwich-Fluoroimmuntest wurden getestet. Der erste monoclonale Antikörper wurde biotinyliert und an Vertiefungen von Mikrotiterstreifen immobilisiert; der zweite wurde mit dem Europium-Chelat markiert, wie vorstehend beschrieben. Alle Kombinationen wurden auf ihre Reaktivität mit dem hochreinen menschlichen Troponin I getestet. Die 1 zeigt die Troponin I-Epitopkarte, welche auf den überprüften Ausschlußexperimenten und der Bestimmung von Kreuzreaktivitäten basiert.
Troponin C überdeckt während der Bindung an Troponin I in Gegenwart von Ca²⁺ einen Teil der Troponin I-berfläche, wodurch die Epitope einiger anti-Troponin I-Antikörper verändert werden, die sich nach der Immunisierung eines Tieres mit gereinigtem Troponin I entwickelten. Die Erfinder überprüften in einem Sandwich-Imuntest die Wechselwirkung verschiedener Antikörperpaare mit gereinigtem Troponin I und mit Troponin I in Gegenwart eines 5 fachen molaren Überschusses von Troponin C (mit und ohne Ca²⁺). 2 zeigt, daß die Zugabe von Troponin C zu dem Troponin I-Standard den Signalspiegel für einige Antikörperpaare verringert. Die Zugabe von 5 mM EDTA stellte die immunologische Aktivität von Troponin I durch Verminderung der Troponin I-Troponin C-Wechselwirkung wieder her.

Claims

Verfahren zur Verbesserung eines diagnostischen Immuntestverfahrens zum Testen von Troponin I (TnI) in einer Probe aus dem Blutstrom eines Patienten, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – Inkontaktbringen der Probe mit einem Ca²⁺-Bindemittel, und – Bestimmen des Gehalts an Troponin I in der Probe unter Verwendung eines Standards, wobei der Standard eine Zubereitung eines kompletten, nativen Troponinkomplexes ist, der TnI, TnT und TnC in äquimolarer Konzentration enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ca²⁺-Bindemittel in Form einer wässrigen Lösung bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Ca²⁺-Bindemittel ein ein Metallchelat bildendes Mittel ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Ca²⁺-Bindemittel ein ein Metallchelat bildendes Mittel ist, das ausgewählt ist aus EDTA und EGTA.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Menge des Ca²⁺-Bindemittels, das der Probe zugesetzt wird, ausreicht, um die Ca²⁺-Konzentration auf eine submikromolaren Spiegel zu verringern.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das diagnostische Verfahren ein Fluorimmuntestverfahren ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das diagnostische Verfahren ein Sandwich-Immuntest unter Verwendung eines ersten Fänger (capture)-anti-TnI-Antikörpers und eines zweiten Nachweis-anti-TnI-Antikörpers ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Ca²⁺-Bindemittel der Lösung des zweiten Antikörpers zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Ca²⁺-Bindemittel der Blutprobe zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Gehalt an menschlichem Herztroponin I bestimmt wird.
Troponin I-Standard- und -Eichmaterialzubereitung, umfassend einen kompletten nativen Troponin-Komplex, der TnI, TnT und TnC in äquimolarer Konzentration enthält, isoliert aus Herzmuskel- oder Skelettmuskelgewebe unter milden Bedingungen in normalem menschlichem Serum.
Verfahren zur Herstellung eines Troponin I-Standards oder -Eichmaterials, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – Isolieren und Reinigen eines kompletten nativen Troponin-Komplexes, der TnI, TnT und TnC in äquimolarer Konzentration enthält, von Herzmuskel- oder Sklelettmuskelgewebe unter milden Bedingungen, und – Hinzufügen des erhaltenen Komplexes zu normalem menschlichem Serum, und – gegebenenfalls Hinzugeben eines Ca²⁺-Bindemittels.
Kit zur Verbesserung eines diagnostischen Immuntestverfahrens zum Testen von Troponin I in einer Probe aus dem Blutstrom eines Patienten, wobei der Kit die folgenden Bestandteile enthält: – einen mono- oder polyclonalen Antikörper gegen Troponin I, – ein Ca²⁺-Bindemittel, – einen nachweisbaren Marken, und – einen Standard, der einen kompletten nativen Troponin-Komplex umfasst.
Kit nach Anspruch 13, wobei das Ca²⁺-Bindemittel ein Metallchelat bildendes Mittel in Form einer wässrigen Lösung ist.
Kit nach Anspruch 14, wobei das Metallchelat bildende Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EDTA und EGTA.
Kit nach Anspruch 13, wobei der nachweisbare Marken ein Fluoreszenzmarker ist.
Kit nach Anspruch 13, enthaltend – einen ersten monoclonalen Fängerantikörper gegen menschliches Herz-Troponin I, gegebenenfalls auf einer Festphase immobilisiert, – einen zweiten monoclonalen Nachweisantikörper gegen menschliches Herztroponin I, und – einen Fluoreszenzmarker auf dem zweiten Antikörper.
Kit nach Anspruch 13, enthaltend – einen ersten Antikörper, der unter Verwendung einer Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung auf einer Festphase immobilisiert wurde, – einen mit Eu-Chelat markierten zweiten Antikörper, und – eine wässrige oder gepufferte EDTA-Lösung.