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Gebiet der Erfindung
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Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist die Verbesserung eines Immuntestverfahrens zum Testen von menschlichem
Herz- und Skelett-Troponin I (TnI) in einer Probe aus dem Blutstrom
eines Patienten.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung ist ein Kit zur Verwendung in einem verbesserten diagnostischen
Immuntestverfahren zum Testen von Troponin I in einer Probe aus
dem Blutstrom eines Patienten.
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Ein anderer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung ist eine verbesserte Troponin I-Standardzubereitung zur Verwendung in
dem Verfahren und in dem Kit der vorliegenden Erfindung.
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Hintergrund
der Erfindung
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Menschliches Herz-Troponin I (h.
c. TnI) wurde unlängst
als ein spezifischer und empfindlicher Marker für den Herzmuskelzelluntergang
vorgeschlagen. Es wird nach einer Herzmuskelschädigung, z. B. nach einem akuten
Myokardinfarkt (AMI), in den Blutstrom freigesetzt (vgl. z. B. Adams
J. E. et al., Circulation 88 (1993), 101–106). Menschliches Skelett-Troponin
I (h. sk. TnI) wurde als ein empfindlicher und spezifischer Marker
für den
Skelettmuskelzelluntergang vorgeschlagen.
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TnI ist die Untereinheit eines Troponinkomplexes,
der eine wichtige Rolle bei der Ca2+-abhängigen Regulierung
der Skelett- und Herzmuskelkontraktion bei Vertebraten spielt. Der
Troponinkomplex ist auf dem dünnen
Filament des kontraktilen Apparates angeordnet, und durch seine
Assoziation mit zwei anderen dünnen Filamentproteinen,
Aktin und Tropomyosin, hemmt er die Actomyosin-Wechselwirkung bei
submikromolaren Ca2+-Konzentrationen und
stimuliert er die Wechselwirkung bei mikromolaren und höheren Ca2+-Konzentrationen. Der Troponinkomplex enthält drei
Untereinheiten – Troponin
C (TnC), das die Ca2+-bindende Untereinheit ist;
Troponin I (TnI), das die hemmende Untereinheit ist; und Troponin
T (TnT), das die Tropomyosin-bindende Untereinheit ist. Die Wechselwirkung
zwi schen den drei Untereinheiten des Troponinkomplexes ist so stark, daß ursprünglich angenommen
wurde, daß das
gereinigte Troponin ein einzelnes Protein ist.
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Die Ca2+-abhängige Regulation
wird durch Konformationsänderungen
in TnC und nachfolgende Veränderungen
in der Wechselwirkung von TnC mit TnI initiiert. TnC besteht aus
zwei globulären
Domänen,
die durch eine zentrale Helix verbunden sind. Jede Domäne enthält zwei
Metallbindungsstellen. Zwei Stellen in der N-terminalen Domäne (Stellen
I und II) binden Ca2+ mit geringer Affinität, während Stellen
in der C-terminalen Domäne
(Stellen III und IV) Ca2+ mit hoher Affinität binden.
Bei submikromolaren Ca2+-Konzentrationen sind
die Metallbindungsstellen in der C-terminalen Domäne von TnC
mit Mg2+ besetzt, während die Ca2+-spezifischen
Stellen in der N-terminalen Domäne
leer sind. In diesem Fall ist die N-terminale Region von TnI an die
C-terminale Domäne
von TnC gebunden, während
die hemmenden C-terminalen Regionen des TnI-Moleküls mit Aktin
und Tropomyosin, aber nicht mit TnC interagieren. Wenn sich die
Ca2+-Konzentration auf einen mikromolaren
Spiegel erhöht,
bindet Ca2+ an die N-terminalen, Ca2+-spezifischen, mit geringer Affinität bindenden
Stellen von TnC. Die Ca2+-Bindung erhöht die Affinität dieser
Domäne
für die
hemmenden und C-terminalen Regionen von TnI, woraus die Freisetzung
der Fragmente aus Aktin und Tropomyosin resultiert und ein enger
Kontakt mit den verlängerten
zentralen und N-terminalen Regionen von TnC hergestellt wird. Diese
Bindung mit hoher Affinität
der Komponenten des Troponinkomplexes hat wichtige Konformationsänderungen
in beiden Molekülen
zur Folge.
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Im menschlichen quergestreiften Muskel
wurden drei Formen von TnI nachgewiesen: zwei für den Skelettmuskel ((h. sk.
TnI) und eine für
den Herzmuskel (h. c. TnI). Die drei Troponinformen besitzen ähnliche Strukturen,
jedoch wurde für
das menschliche Herz-Troponin
I das Vorhandensein von 33 zusätzlichen
Aminosäuren
im N-terminalen Teil des Moleküls
gezeigt, verglichen mit der Skelett-TnI-Isoform. Dieses zusätzliche Polypeptid
und auch einige Austäusche
bezüglich
der Aminosäuren
ermöglichen
die Unterscheidung des menschlichen Herz-Troponins I von den Skelettformen,
zum Beispiel durch immunologische Verfahren. Alle gegenwärtigen diagnostischen
Systeme basieren auf der immunologischen Messung von TnI in Serumproben.
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Es ist gezeigt worden, daß in Gegenwart
von mikromolaren und höheren
Ca2+-Konzentrationen
ein Gemisch von Troponin I und Troponin C in Form eines Komplexes
vorliegt, wobei eine starke Wechselwirkung zwischen den beiden Molekülen vorhanden
ist. Falls sich jedoch die Ca2+-Konzentration
in der Lösung
auf submikromolare Spiegel ver ringert, wird das Ca2+ aus
den Metallbindungszentren von TnC herausgewaschen. Nachdem das Ca2+ entfernt ist, schwächt sich die Wechselwirkung
zwischen den zwei Proteinen ab und die Konformation von TnI zeigt Ähnlichkeiten
mit dem nativen (nicht komplexierten) Protein.
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Die Ca2+-Konzentration
in menschlichem Serum ist ausreichend, daß die zwei mit geringer Affinität bindenden
Zentren von TnC Ca2+ binden. Das bedeutet,
daß im
Serum von Patienten mit AMI oder in Patienten mit verschiedenen
Skelettmuskelerkrankungen ein Großteil des TnI's in Form eines Komplexes
mit TnC vorliegen sollte. Die Experimente der Erfinder bestätigten diese
Hypothese. Sie zeigten, daß im
Serum von AMI-Patienten der größte Teil
von TnI (50–90%)
in Form eines Komplexes mit TnC (und wahrscheinlich auch mit TnT)
vorliegt. Wie vorstehend erwähnt,
unterscheidet sich die Konformation von TnI im Komplex mit TnC bei
hohen, d. h. mikromolaren und höheren
Ca2+-Konzentrationen von der Konformation
des freien TnI oder von TnI im Komplex mit TnC bei submikromolaren
Ca2+-Konzentrationen.
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In der Praxis wird gewöhnlich ein
hochreines Protein für
die Immunisierung von Tieren zur Herstellung von monoclonalen oder
polyclonalen Antikörpern
verwendet. Die Konformation des gereinigten TnI's, das zur Immunisierung und für eine Standardzubereitung
verwendet wird, ist jedoch von. derjenigen von TnI im Komplex mit
TnC verschieden. Die Konformationsänderung des Proteins kann die
Affinität
der Antikörper
verringern oder eine Protein-Antikörper-Wechselwirkung unmöglich machen.
Außerdem
wird infolge der starken Wechselwirkung zwischen den zwei Troponinmolekülen bei
mikromolaren und höheren
Ca2+-Konzentrationen
das TnC einen Teil der Oberfläche
des TnI-Moleküls überdecken
und manche der Epitope für
einige Antikörper
blockieren, die durch die Immunisierung von Tieren mit hochreinem
Troponin I erzeugt werden. Als Ergebnis weisen Immuntests, welche
auf der Verwendung solcher Antikörper
basieren, so wie der größte Teil
der im Handel erhältlichen
Antikörper,
die für
diesen Zweck entwickelt wurden, nur das freie TnI und einen Teil
des TnI im Komplex mit TnC nach, falls die Affinitätskonstante
der Antikörper
infolge der TnI-TnC-Wechselwirkung verändert wird; oder sie weisen
nur das freie TnI nach, falls die Epitope des Antikörpers vollständig durch
TnC überdeckt
sind. In jedem Fall ist die Konzentration von TnI, welche durch
solche Systeme in AMI-Serumproben nachgewiesen wird, anders (niedriger)
als die wirkliche Konzentration dieses Proteins.
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Daher besteht ein Bedarf für ein Verfahren,
das Tests unter Verwendung solcher Antikörper verbessern würde. Ein
solches Verfahren wäre
nicht nur im Fall von diagnostischen Systemen nützlich, die zum Testen der
Herzform von TnI in Serum entwickelt wurden, sondern auch in Immuntests,
welche zur Messung der Skelettformen von TnI zur Diagnose einer
Skelettmuskelgewebsnekrose entwickelt wurden.
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In der Praxis wird gewöhnlich ein
gereinigtes Antigen zur Herstellung von Eichmaterialien oder Standardzubereitungen
für die
Immuntests verwendet. Im Fall von TnI ist die Reinigung üblicherweise
ein komplizierter Prozeß,
der mehrere Tage dauert und verschiedene Säulenchromatographieschritte
(Affinitäts-,
Ionenaustauscherchromatographie etc.) einschließt. Es ist eine hinreichend
bekannte Tatsache, daß TnI
sehr empfindlich gegen eine Proteolyse ist. Während der langen Reinigung
kann das Troponin I-Molekül
durch Proteasen teilweise gespalten werden und somit kann ein Teil
der Epitope für
einige Antikörper
verloren gehen. Außerdem
umfassen alle gegenwärtigen
Verfahren zur TnI-Reinigung Schritte, bei denen hochkonzentrierte
(6–8 M)
Harnstofflösungen
verwendet werden, um die Komponenten des Troponinkomplexes zu trennen.
Eine solche rigide Behandlung kann irreversible Konformationsänderungen
einiger Teile des TnI-Moleküls
zur Folge haben. Folglich kann sich die Konformation der TnI-Moleküle in hochreinen
Zubereitungen von derjenigen des nativen Proteins unterscheiden.
Zusätzlich
kann der lange Kontakt des Proteins mit Harnstoff in hohen Konzentrationen
eine teilweise Carbamoylierung des TnI-Moleküls zur Folge haben. Folglich
kann sich die immunologische Aktivität eines hochreinen TnI von
derjenigen eines nativen TnI unterscheiden.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Der Gegenstand der Erfindung ist
die Bereitstellung eines verbesserten diagnostischen Immuntestverfahrens
zum Testen von Troponin I in einer Probe aus dem Blutstrom eines
Patienten, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: das
Inkontaktbringen der Probe mit einem Ca2+-Bindemittel
und das Bestimmen der Troponin I-Konzentration in der Probe unter
Verwendung eines Standards, wobei der Standard einen kompletten
Troponinkomplex umfaßt.
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Die verwendete Menge des Ca2+-Bindemittels ist ausreichend, um die Ca2+-Konzentration in der Probe auf einen submikromolaren
Spiegel zu verringern, wodurch die TnI-TnC-Wechselwirkung vermindert wird.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
ist ein Kit zur Verwendung in einem Verfahren zur Verbesserung der
Empfindlichkeit eines diagnostischen Immuntestverfahrens zum Testen
von Troponin I in einer Probe aus dem Blutstrom eines Patienten,
wobei der Kit einen monoclonalen oder polyclonalen Antikörper gegen
Troponin I, ein Ca2+-Bindemittel, einen nachweisbaren
Macker und einen Standard in Form eines kompletten Troponinkomplexes
enthält.
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Ein anderer Gegenstand der Erfindung
ist die Verwendung eines kompletten nativen Troponinkomplexes, isoliert
und gereinigt aus Muskelgewebe, zur Herstellung eines TnI-Eichmaterials oder
-Standards. Eine solche Standardzubereitung wird in dem Testverfahren
und in dem Kit gemäß der Erfindung
verwendet.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird als ein Immuntestverfahren
unter Verwendung von mono- oder polyclonalen Antikörpern gegen
TnI ausgeführt,
d. h. mit Antikörpern
gegen entweder das menschliche Herz- oder Skelett-Troponin I, abhängig von
dem spezifischen Troponin-Antigen, auf das getestet werden soll.
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Das Immuntestverfahren kann ein beliebiges
der bekannten Immuntestverfahren sein, welche für diesen Zweck geeignet sind,
wie ein Enzymimmuntest, Radioimmuntest, lumineszierender Immuntest
oder Fluoroimmuntest. Solche Immuntestsysteme sind dem Fachmann
gut bekannt und auch im Handel erhältlich.
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Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
wird das Verfahren als ein Sandwich-Immuntestverfahren unter Verwendung
von Paaren von vorzugsweise monoclonalen anti-TnI-Antikörpern durchgeführt, wobei
ein Antikörper
als ein "Fänger" (capture)-Antikörper dient,
immobilisiert an einer festen Phase, und der zweite Antikörper den
Macker trägt
und als "Nachweis"-Antikörper wirksam
ist.
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Erfindungsgemäß kann ein solches diagnostisches
Testverfahren verbessert werden, indem die zu testende Probe mit
einem Agens oder Reagens in Kontakt gebracht wird, das Ca2+ binden oder komplexieren kann. Erfindungsgemäß kann ein
solches Ca2+-Bindemittel eine beliebige
Substanz sein, welche einerseits eine ausreichende Affinitätskonstante
für Ca2+ besitzt, um den Ca2+-Spiegel
auf eine submikromolare Konzentration zu verringern, und andererseits
das Testverfahren nicht negativ beeinflußt.
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Das Ca2+-Bindemittel
wird vorzugsweise in Form einer Lösung, vorzugsweise einer wäßrigen Lösung oder
einer Pufferlösung
verwendet, die mit dem Test verträglich ist.
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Eine bevorzugte Gruppe von Ca2+-Bindemitteln sind die Metallchelate bildenden
Mittel, welche Metalle, einschließlich Ca2+,
in wäßrigen Lösungen binden.
Die Gruppe der Metallchelate bildenden Mittel ist dem Fachmann gut
bekannt und schließt
solche Stoffe wie Polyoxycarbonsäuren,
Polyamine, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Nitrilotriessigsäure (NTA)
und Ethylenglykol-O,O'-bis(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA)
sowie ähnliche
Mittel ein. Bevorzugte Stoffe sind EDTA und EGTA in wäßriger Lösung.
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Endungsgemäß wird das Ca2+-Bindemittel
in Form einer Lösung
mit der zu testenden Probe in Kontakt gebracht. Dies kann durch
direkte Zugabe der Ca2+-Bindemittellösung zu
der Probe oder, in einem Sandwich-Immuntestverfahren, zu dem Puffer,
der in dem Test während
der Inkubation mit der Blutprobe verwendet wird, erfolgen.
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Das Ca2+-Bindemittel
wird in einer ausreichenden Menge verwendet, um die Troponin I-Troponin C-Wechselwirkung
zu vermindern, indem eine ausreichende Menge an Ca2+ gebunden
wird, um den Ca2+-Spiegel in dem Testmedium
auf einen submikromolaren Spiegel zu verringern. Die Verminderung
der Wechselwirkung hat eine bessere Exposition von TnI zur Folge,
welches dann getestet werden kann.
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Der Standard zur Verwendung in dem
erfindungsgemäßen Verfahren
umfaßt
den kompletten nativen Troponinkomplex, der TnI, TnT und TnC in äquimolarer
Konzentration enthält
und aus Muskelgewebe, wie menschliches Herzgewebe, zum Beispiel
unter Anwendung eines Verfahrens isoliert werden kann, das hinsichtlich
des bei Katrukha et al., "Biochemistry
and Molecular Biology International", Bd. 36 (1995), Nr. 1, S. 195–202, beschriebenen
Verfahrens leicht modifiziert ist. Durch Verwendung des ganzen Komplexes
anstatt des gereinigten TnI's
können
Probleme vermieden werden, welche zum Beispiel mit Veränderungen
in einigen Epitopen auf dem Troponin I verbunden sind, die beispielsweise
während
der Reinigung auftreten können.
Die Erfinder haben auch gezeigt, daß die Stabilität von TnI
in Form des nativen Troponinkomplexes erheblich höher ist
im Vergleich zu derjenigen des gereinigten TnI, das üblicherweise
als Standard verwendet wird.
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Die vorliegende Erfindung umfaßt auch
einen Kit zur Verwendung in einem Immuntestverfahren, wie vorstehend
definiert. Ein solcher Kit würde
mindestens einen mono- oder
polyclonalen Antikörper
gegen TnI, ein Ca2+-Bindemittel, vorzugsweise
in Form einer wäßrigen Lösung, einen
nachweisbaren Marker und einen kompletten Troponinkomplex als Standard
einschließen.
Der Marker ist an eine der immunreaktiven Komponenten gebunden,
um ein Mittel zur Darstellung des Ausmaßes der immunologischen Wechselwirkung
bereitzustellen und auf diese Weise die Bestimmung des TnI-Spiegels
in der Probe zu ermöglichen.
Folglich ist der Marker von einem Typ, der durch herkömmliche
Nachweisverfahren nachgewiesen werden kann, wie unter Anwendung
von Verfahren auf der Basis von Absorption, Lumineszenz, Fluoreszenz
oder Radioaktivität.
Das nachgewiesene Signal kann dann mit Standardkurven verglichen
werden. Die Standardkurven werden aufgestellt, indem in der Standardzubereitung
bekannte Mengen des vollständigen
Troponinkomplexes verwendet werden, der die vorstehend beschriebenen
drei Untereinheiten enthält
und direkt aus Muskelgewebe gewonnen worden ist. Eine solche Zubereitung
besitzt den Vorteil, daß sie
bessere immunologische Eigenschaften als eine Zubereitung besitzt,
die das gereinigte TnI enthält.
Der Troponinkomplex in dem Standard kann mit einem Ca2+-Bindemittel
wie EDTA kombiniert werden, das zum Beispiel in einem Puffer vor
der Messung zugegeben wird.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
enthält
der Kit zwei monoclonale Antikörper
gegen TnI, um einen Sandwich-Immuntest zu ermöglichen. Der erste oder Fänger-Antikörper kann
in einem solchen Fall vorher an eine feste Phase gebunden werden,
wie die Wand einer Mikrotiterplattenvertiefung. Der zweite oder Nachweis-Antikörper, der
den Marker trägt,
kann in einer geeigneten Pufferlösung
bereitgestellt werden. Das Ca2+-Bindemittel
kann in einer wäßrigen oder
Pufferlösung
separat bereitgestellt werden oder in die Lösung des zweiten Antikörpers eingeschlossen
werden.
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Es ist auch möglich, den Kit in Form eines
hinreichend bekannten Immunchromatographiestreifens zu formulieren.
Ein solcher Streifen kann ohne weiteres mit Vollblut verwendet werden,
um zum Beispiel AMI in einem frühen
Stadium zu diagnostizieren, z. B. bereits in der Ambulanz im Falle
eines Notfalls.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
haben die Erfinder ein zweistufiges zeitaufgelöstes Fluoroimmuntestverfahren,
LANFIA, und zwar den Lanthanid-Fluoroimmuntest, verwendet. In diesem
Verfahren wird ein erster biotinylierter TnI-Antikörper (Fänger (capture)-Antikörper) auf
eine feste Phase aufgebracht, zum Beispiel die berfläche einer
Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplattenvertiefung. Nach dem
Waschen wird die beschichtete berfläche in einem zweiten Schritt
dann mit einem Gemisch aus der Probe und einem zweiten markierten,
z. B. Eu-Chelat-markierten, Antikörper (Nachweisantikörper) in
einem Puffer inkubiert. Eine Lösung
des Ca2+-Bindemittels kann entweder zu der
Probe oder zu der Lösung
des Nachweisantikörpers zugegeben
werden. Nach dem Waschen und der Zugabe einer LANFIA-Verstärkungslösung wird
das Fluoreszenzsignal (Zählimpulse
pro Sekunde) in herkömmilicher
Weise gemessen. Eine Beschreibung der Verwendung der zeitaufgelösten Fluorometrie
in einem Immuntest findet man zu Beispiel in "Alternative [Immunoassays", hrsg. durch Collins
W. P., John Wiley & Sons,
Ltd., 1985, Kapitel 12.
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Ausführliche Beschreibung der Zeichnungen
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In den Zeichnungen zeigt 1 die Troponin I-Epitopkarte.
Es sind fünf
antigene Domänen
für acht monoclonale
anti-Troponin I-Antikörper
erkennbar, die in den Experimenten der Erfinder getestet wurden.
Drei monoclonale Antikörper
(7F4, 11D7 und ES23) haben einmalige Epitope; 8E10 und 5F1 haben
das gleiche Epitop; und die Epitope von 10F4 und 10B11 sowie 8E10,
5F1 und 2A3 überlappen
sich.
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2 zeigt
die Wirkung von Troponin C auf die immunologische Aktivität von Troponin
I für mehrere Antikörperpaare
(jeweils 1–5):
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Die linke Säule (schwarz) zeigt das erhaltene
Signal beim Testen einer Troponin I-Lösung
(30 ng/ml TnI in normalem menschlichem Serum); die mittlere Säule (hellgrau)
zeigt die Wirkung der Zugabe eines 5 fachen molaren Überschusses
an Troponin C; und die rechte Säule
(dunkelgrau) zeigt die Wirkung von EDTA als ein Ca2+-Bindemittel,
zugesetzt zu dem Inkubationsgemisch von TnI und TnC. Praktisch alle
Tests (außer #3)
werden in einem unterschiedlichen Ausmaß durch die Zugabe von TnC
zu einer Troponin I-Standardzubereitung beeinflußt. EDTA, zugesetzt zu einem
Inkubationsgemisch, stellt die immunologische Aktivität von Troponin
I wieder her. Nur für
einen Antikörper,
ES23. bleibt das Epitop durch Troponin C teilweise bedeckt (verändert),
auch in Gegenwart von EDTA.
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Die 3 zeigt
die Epitopkarte für
die getesteten Antikörper
in Gegenwart von Troponin C. Die Epitope der Antikörper 10B11,
10F4, 11D7 und ES23 sind durch Troponin
C in Gegenwart von Ca2+ verändert oder
bedeckt (3A). Falls
die Ca2+-Konzentration auf einen submikromolaren
Spiegel verringert wird (-Ca2+), sind die
Epitope aller Antikörper (außer
das Epitop von Antikörper
ES23) nicht mehr bedeckt oder verändert (3B).
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4 zeigt
die Ergebnisse des Tests von drei Serumproben (1, 2 und 3) aus AMI-Patienten in drei
verschiedenen Testsystemen (A, B und C).
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Die linke Säule gibt das Signal aus einer
Serumprobe ohne ein Ca2+-Bindemittel an,
und die rechte Säule
gibt das Signal einer ähnlichen
Probe, aber mit zugesetztem EDTA, an. Die Erhöhung des Signalpegels nach
der Zugabe eines Ca2+-Bindemittels zu der
Probe ist für
die ersten zwei Systeme offensichtlich und im Fall des letzten Systems
weniger deutlich, was nahelegt, daß die Epitope der Antikörper 2A3
und 10B11 durch die Troponin I-Troponin C-Wechselwirkung nicht stark verändert werden.
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5 zeigt
den Vergleich der immunologischen Aktivitäten von hochreinem Troponin
I, gelöst
in normalem menschlichem Serum in einer Konzentration von 30 ng/ml,
und von Troponin I in Form des nativen Komplexes (gereinigt unter
milden Bedingungen) in der gleichen Konzentration.
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Die schwarze Säule zeigt das Signal, welches
beim Testen einer Troponin I-Lösung
erhalten wird; die hellgraue Säule
zeigt den Signalpegel, wenn der Troponinkomplex in Gegenwart von
Ca2+ getestet wurde; und die dritte Säule (dunkelgrau)
gibt das Signal an, das erhalten wird, wenn der Troponinkomplex
in Gegenwart von EDTA getestet wurde. Für drei getestete Paare (#3,
4 und 5) besaß Troponin
I in Form des nativen Troponinkomplexes in Gegenwart von EDTA die
gleiche immunologische Aktivität
wie das hochreine Troponin I. Für 10F4-Biot.-8E10-Eu-Antikörper wies
Troponin I in der komplexierten Form eine bessere Aktivität als das
gereinigte Troponin I auf. Diese Tatsache bestätigt, daß sich während der langen Reinigung
einige Epitope von Troponin I verändern können. Unter diesem Gesichtspunkt
ist es besser, Troponin I in Form des nativen Komplexes für eine Troponin
I-Standardzubereitung zu verwenden. Nur für einen Antikörper, den
ES23-Antikörper, bleibt
das Epitop durch Troponin C teilweise bedeckt (verändert),
selbst in Gegenwart von EDTA, so wie in dem Fall, wenn Troponin
C zu der Troponin I-Lösung
zugegeben wurde.
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Die 6A und 6B zeigen die Stabilität von gereinigtem
TnI und von TnI in dem Troponinkomplex, inkubiert für eine Woche
bei 4°C
bzw. 20°C.
Die Tests wurden unter Verwendung des menschlichen Herz-Troponinkomplexes
(HyTest, Turku) in einem 10F4-Biot.-7F4-Eu-Test
ausgeführt.
Der Komplex wurde unter milden Bedingungen gereinigt und enthält alle
Komponenten in äquimolaren
Anteilen. Das in dem Test mit TnI in Form des Komplexes erhaltene
Signal war höher
als das Signal, welches in dem Test mit gereinigtem TnI erhalten
wurde. Dies bestätigt,
daß während der
Reinigung von TnI das Protein seine native Konformation verändern kann.
Die 6A und 6B zeigen, daß die Stabilität von TnI
in dem nativen Troponinkomplex wesentlich höher ist als die Stabilität des gereinigten
TnI-Proteins.
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Beispiele
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Troponin I-Reinigung
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Das Troponin I, welches die Erfinder
zur Immunisierung von Mäusen,
zum Testen von Hybridomen und für
die Standardzubereitung verwendeten, wurde hergestellt, wie in "Biochemistry and
Molecular Biology International",
Bd. 36 (1995), Nr. 1, S. 195–202,
beschrieben ist.
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Troponinkomplex-Präparation
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Zur Troponinkomplex-Präparation
wendeten die Erfinder ein Verfahren an, welches bezüglich des
in "Biochemistry
and Molecular Biology International", Bd. 36 (1995), Nr. 1, S. 195–202, beschriebenen
Verfahrens leicht modifiziert war.
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10 Gramm Muskelgewebe wurden bei
Höchstgeschwindigkeit
in 100 ml Puffer 1, enthaltend 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid
(PMSF), 5 mM CaCl2, homogenisiert. Das Homogenat wurde
für 10
min bei 10.000 g zentrifugiert, und das Pellet wurde ein zweites
Mal in dem gleichen Volumen desselben Puffers, enthaltend 1% Triton
X-100, homogenisiert. Nach der Zentrifugation wurde das Pellet in 100
ml 150 mM Kaliumphosphatpuffer (Puffer 2), pH 6,5, enthaltend 0,3
M KCl, 0,2 mM ATP, 1 mM PMSF, homogenisiert. Nach dem Zentrifugieren
für 30
min bei 10.000 g wurde das Pellet in 100 ml eines kalten 25 mM Tris/HCl-Puffers,
pH 7,5, enthaltend 0,7 M LiCl, 5 mM CaCl2,
PMSF (Puffer 3), suspendiert. Die Suspension wurde für 30 min
bei 0°C
gerührt
und dann für
1 Stunde bei 10.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Papierfilter
filtriert und dann auf eine Affinitätssäule, enthaltend einen immobilisierten
monoclonalen anti-Troponin I-Anti körper (Clon C5, Antikörper dieses
Clon sind mit den Skelett- und Herzformen von Troponin I kreuzreaktiv,
weshalb diese Säule
zur Präparation
der Skelett- und Herzformen von Troponin verwendet werden kann),
aufgegeben. Die Affinitätssäule wurde
mit Puffer 3 voräquilibriert.
Die Säule
wurde mit mehreren Volumina von Puffer 3 gewaschen, und das Troponin
wurde mit 0,1 M Glycinpuffer, pH 2,0, enthaltend 5 mM CaCl2, eluiert. Anschließend wurde das Protein gegen
Puffer 3 über
Nacht dialysiert. Die Ausbeute beträgt üblicherweise 12–15 mg Troponin
aus 10 g Muskelgewebe. Gemäß einer
SDS-Gelelektrophorese war das Troponin durch unbekannte Proteine
leicht verunreinigt. Die Konzentration von Troponin I und Troponin
T wurde mittels Durchmustern der Gele mit dem Troponinkomplex und
mit Troponin I- und Troponin T-Standardzubereitungen bestimmt.
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Herstellung
von monoclonalen Antikörpern
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BALB/c-Mäuse wurden mit gereinigtem
Troponin I unter Verwendung eines Standardprotokolls immunisiert.
Kurz zusammengefaßt
wurden den Mäusen
am Tag 1 intraperitoneal 100 μg
menschliches Herz-Troponin I in komplettem Freundschen Adjuvans
injiziert. An den Tagen 31 und 61 erhielten die Mäuse intraperitoneal
eine Nachimpfung mit 100 μg
Troponin I in inkomplettem Freundschen Adjuvans. Die letzten Nachimpfungen
wurden an den Tagen 91 und 93 mit 50 μg des Antigens in phosphatgepufferter
Salzlösung,
pH 7,4, sowohl intraperitoneal als auch intravenös injiziert, verabreicht. Am
Tag 96 wurden die Mäuse
getötet,
ihre Milz wurde entnommen, und die Splenocyten wurden für eine Fusion
isoliert. Die Splenocyten wurden mit der Nichtsekretor-Zelllinie
sp2/0 fusioniert und in Dulbecco's
modifiziertem Eagle-Medium, enthaltend Hypoxanthin, Aminopterin
und Thymidin (HAT) mit 15% fötalem
Rinderserum, ausplattiert.
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Vertiefungen mit einem Hybridomwachstum
in HAT-Medium wurden auf die Produktion von anti-Troponin I-Antikörpern durchmustert.
Für diesen
Zweck wurden die Hybridomkulturmedien für 30 Minuten bei 37°C in Mikro-ELISA-Platten
inkubiert, welche mit Troponin I (300 ng/Vertiefung) beschichtet
waren, und nach dem Waschen mit HRP-markierten Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörpern inkubiert.
Nach dem Waschen wurde die HRP-Aktivität unter
Verwendung von o-Phenylendiamin/Wasserstoffperoxid als Substrat
und 1 M Schwefelsäure
als Stoppreagens und einer 30-minütigen Farbentwicklung bestimmt.
Positive Hybridome wurden unter Verwendung von Mikro-ELISA-Vertiefungen,
beschichtet mit der Skelettform von Troponin I, erneut auf die Antikörperspezifität getestet.
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Die basierend auf der Spezifität selektierten
Hybridome wurden durch zwei Grenzverdünnungsrunden in Aminopterin-freiem
(HT) Medium cloniert. Stabile Hybridomclone wurden als Aszitestumoren
in BALB/c-Mäusen
gezüchtet.
Die Spezifität
des monoclonalen Antikörpers
wurde unter Verwendung von h. c. TnI- und h. sk. TnI-beschichteten
Mikro-ELISA-Platten
und unterschiedlichen Verdünnungen
der Aszitesflüssigkeit
noch einmal überprüft.
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Die monoclonalen Antikörper wurden
durch eine Protein-A-Sepharose-Affinitätschromatographie (Pharmacia)
aus den Aszitesflüssigkeiten
gereinigt. Die Antikörperkonzentrationen
wurden mittels der Lowry-Methode unter Verwendung von Maus-IgG (Calbiochem)
als Standard bestimmt.
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Die Spezifität der monoclonalen Antikörper wurde
durch ein Western-Blot-Verfahren bestätigt. Die gereinigten monoclonalen
Antikörper
wurden mit Western-Blot-Membranen, enthaltend gereinigte Proteine – h. c.
TnI und h. sk. TnI, übertragen
aus einem SDS-PAGE-Gel
(Gel mit einen Gradienten von 7,5–15%), inkubiert (3 μg/ml, 1 Stunde,
37°C). Nach
dem Waschen und einer 1-stündigen
Inkubation mit HRP-markierten Ziege-anti-Maus-Antikörpern bei
37°C wurden
die Proteinbanden nach Inkubation mit 4-Chlor-l-naphthol/Wasserstoffperoxid-Substrat
sichtbar gemacht. Alle hierin beschriebenen Antikörper waren
h. c. TnI-spezifisch
ohne eine Kreuzreaktion mit h. sk. TnI.
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Antikörperbiotinylierung
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Zur Antikörperbiotinylierung verwendeten
die Erfinder einen Biotinamidocaproat-N-hydroxysuccinimidester. Kurz zusammengefaßt wurde
das Biotinylierungsreagens in Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von
10 mg/ml gelöst.
Die Antikörperlösung (3
mg/ml) wurde in 0,1 M Boratpuffer, pH 8,8, hergestellt. Das Biotinylierungsreagens
wurde zu der Antikörperlösung in
einem Verhältnis
von 200 μg
Ester pro Milligramm Antikörper
zugegeben, gut gemischt und bei Raumtemperatur für 4 Stunden inkubiert. Anschließend wurden
17 μl 1
M NH4C1 pro 200 μg Biotinester zugegeben, und
nach einer 10-minütigen
Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Puffer unter Verwendung
von NAPTM-5- und NAPTM-10-Säulen (Pharmacia, Uppsala, Schweden), voräquilibriert
mit 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,75, enthaltend 0,9% NaCl und 0,05%
NaN3, ausgetauscht.
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Antikörper-Eu-Markierung
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Die zur Markierung der Nachweisantikörper verwendeten
stabilen fluoreszierenden Eu-Chelate wurden von Wallac Oy (Turku,
Finnland) bezogen. Die Erfinder verwendeten ein Eu-Chelat von 4-[2-(4-Isothiocyanatophenyl)ethinyl]-2,6-bis{[N,N-bis(carboxymethyl)amino]methyl}pyridin.
Die Markierung der monoclonalen Antikörper mit dem Eu-Chelat wurde über Nacht
bei +4°C
mit einem 200 fachen molaren Überschuß des Chelats
in 50 mM Natriumcarbonatpuffer, pH 9,8, durchgeführt. Die markierten Antikörper wurden
von dem Überschuß an freiem
Chelat durch Gelfiltration an einer SuperdexTM 200
HR 10/30-Säule
(Pharmacia, Uppsala, Schweden) getrennt. Die Säule wurde mit 50 mM Tris/HCl-Puffer,
pH 7,75, enthaltend 0,9% NaCl und 0,05% NaN3,
voräquilibriert.
Der Markierungsgrad der gepoolten Antikörperfraktion wurde gegenüber einem
Eu-Eichmaterial bestimmt.
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Vorinkubation
von Streptavidin-beschichteten Platten mit biotinylierten anti-TnI-Antikörpern
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Biotinylierte Antikörper wurden
in den Vertiefungen einer Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatte für 30 min
bei Raumtemperatur unter Verwendung einer Konzentration von 400
ng Antikörper
pro Vertiefung in 0,2 ml DELFIA®-Puffer
unter vorsichtigem Schütteln
inkubiert. DELFIA®-Assaypuffer enthält pro Liter
50 mM Tris/HCl, pH 7,75, 9 g NaCl, 5 g BSA, 0,5 g Rinderserum-γ-Globulin,
0,1 g Tween® 40,
20 μM DTPA,
0,5 g NaN3 und 20 mg Kirschrot.
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Nach der Inkubation wurden die Platten
zweimal mit DELFIA®-Waschlösung gewaschen.
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Inkubation
der markierten Antikörper
mit Serumproben in den vorabsorbierten Platten
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Im zweiten Schritt wurden AMI-Serumproben
mit Eu-markierten Antikörpern
(200 ng/Vertiefung) und mit EDTA in einer Konzentration von 5 mM
für 30
min bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Schütteln inkubiert. 0,025 ml Serum
und 0,1 ml Antikörperlösung in
DELFIA®-Puffer
wurden pro Vertiefung verwendet. Die EDTA-Lösung kann entweder direkt zu
der Serumprobe oder zu der Lösung
des markierten Antikörpers
zugegeben werden.
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Nach der Inkubation wurde die Platte
6 mal mit DELFIA®-Waschlösung gewaschen,
und danach wurden 0,2 ml LANFIA-Verstärkungslösung pro Vertiefung zugegeben.
Nach einer 3-minütigen
Inkubation unter vorsichtigem Schütteln wurde das Signal gemessen.
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Anstelle von EDTA als Lösung in
Wasser kann eine Lösung
in DELFIA®-Puffer
verwendet werden (pH eingestellt auf 7,7–7,8). Statt EDTA kann EGTA
(Ethylenglykol-,'-bis(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraessigsäure) in
Lösung
mit Wasser oder Puffer in der gleichen Konzentration wie EDTA verwendet
werden.
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Das vorstehende System wurde auch
verwendet, um die in den 2, 4 und 5 gezeigten Ergebnisse zu erhalten, indem
anstelle der Serumprobe eine Troponin I-Lösung in normalem menschlichem
Serum mit oder ohne Troponin C verwendet wird, welche zum Beispiel
gemäß dem Verfahren
von Katrukha et al., "Biochemistry
and Molecular Biology International", Bd. 36, Nr. 1 (1995), S. 195–202, hergestellt
wurde.
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Epitopkartierung
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Die Erfinder verwendeten in ihren
Experimenten acht monoclonale Antikörper, welche für die Herzform von
menschlichem Troponin I ohne Kreuzreaktion mit den Skelettformen
von Troponin I spezifisch sind. Alle möglichen Kombinationen dieser
Antikörper
für einen
Sandwich-Fluoroimmuntest wurden getestet. Der erste monoclonale
Antikörper
wurde biotinyliert und an Vertiefungen von Mikrotiterstreifen immobilisiert;
der zweite wurde mit dem Europium-Chelat markiert, wie vorstehend
beschrieben. Alle Kombinationen wurden auf ihre Reaktivität mit dem
hochreinen menschlichen Troponin I getestet. Die 1 zeigt die Troponin I-Epitopkarte, welche
auf den überprüften Ausschlußexperimenten
und der Bestimmung von Kreuzreaktivitäten basiert.
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Troponin C überdeckt während der Bindung an Troponin
I in Gegenwart von Ca2+ einen Teil der Troponin
I-berfläche,
wodurch die Epitope einiger anti-Troponin I-Antikörper verändert werden,
die sich nach der Immunisierung eines Tieres mit gereinigtem Troponin
I entwickelten. Die Erfinder überprüften in
einem Sandwich-Imuntest die Wechselwirkung verschiedener Antikörperpaare
mit gereinigtem Troponin I und mit Troponin I in Gegenwart eines
5 fachen molaren Überschusses
von Troponin C (mit und ohne Ca2+). 2 zeigt, daß die Zugabe
von Troponin C zu dem Troponin I-Standard den Signalspiegel für einige
Antikörperpaare
verringert. Die Zugabe von 5 mM EDTA stellte die immunologische
Aktivität
von Troponin I durch Verminderung der Troponin I-Troponin C-Wechselwirkung
wieder her.