JP2561513B2 - γ−ＡＮＰを認識するモノクローナル抗体 - Google Patents
γ−ＡＮＰを認識するモノクローナル抗体Info
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- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、γ−ANPのＮ末端を認識するモノクローナ
ル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マおよび該モノクローナル抗体を用いたγ−ANPの免疫
学的測定法に関する。さらに詳しくは、該モノクローナ
ル抗体はγ−ANPのＮ末端の１〜25番目の25アミノ酸残
基からなる部分（γ−hANP［１−25］：以下同様に記
載）を主に認識する。また、該モノクローナル抗体はヒ
トγ−ANPのみならず、ラットγ−ANPをも認識する。
ル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マおよび該モノクローナル抗体を用いたγ−ANPの免疫
学的測定法に関する。さらに詳しくは、該モノクローナ
ル抗体はγ−ANPのＮ末端の１〜25番目の25アミノ酸残
基からなる部分（γ−hANP［１−25］：以下同様に記
載）を主に認識する。また、該モノクローナル抗体はヒ
トγ−ANPのみならず、ラットγ−ANPをも認識する。
従来の技術 心房性ナトリウム利尿ポリペプチド（atrial natriur
etic polypeptide、ANP）は、心房筋細胞により産生さ
れ顆粒中に含まれる、強い利尿作用およびナトリウム排
泄作用を有するポリペプチドである。このようなポリペ
プチドはヒトのみならずラットにおいても見出されてお
り、それぞれhANP、rANPと呼ばれる。hANPおよびrANPは
さらにα、β、γの３つのタイプに分類される。α−hA
NPは28アミノ酸残基からなり、Ｎ端から７番目のCys
［７］と23番目のCys［23］がジスルフィド結合してお
り、その間の配列がリング構造をなしている（Biochem.
Biophys.Res.Commun.（以下BBRCと略記する）118、131
−139、1984）。α−ANPは、α−hANPではＮ端から12番
目の残基がMetであるのに対し、α−rANPではIleである
点でのみ異なっている（BBRC 117、839−865、198
3）。β−hANPは、α−hANPの逆平行二量体である（特
開昭60−184098）。γ−hANPは126アミノ酸残基からな
り（第１図参照）、そのＣ端の99〜126アミノ酸配列が
α−hANPに相当する（Nature 313,397（1985））。
etic polypeptide、ANP）は、心房筋細胞により産生さ
れ顆粒中に含まれる、強い利尿作用およびナトリウム排
泄作用を有するポリペプチドである。このようなポリペ
プチドはヒトのみならずラットにおいても見出されてお
り、それぞれhANP、rANPと呼ばれる。hANPおよびrANPは
さらにα、β、γの３つのタイプに分類される。α−hA
NPは28アミノ酸残基からなり、Ｎ端から７番目のCys
［７］と23番目のCys［23］がジスルフィド結合してお
り、その間の配列がリング構造をなしている（Biochem.
Biophys.Res.Commun.（以下BBRCと略記する）118、131
−139、1984）。α−ANPは、α−hANPではＮ端から12番
目の残基がMetであるのに対し、α−rANPではIleである
点でのみ異なっている（BBRC 117、839−865、198
3）。β−hANPは、α−hANPの逆平行二量体である（特
開昭60−184098）。γ−hANPは126アミノ酸残基からな
り（第１図参照）、そのＣ端の99〜126アミノ酸配列が
α−hANPに相当する（Nature 313,397（1985））。
ラットの心房抽出物中に強いナトリウム利尿活性、利
尿活性、血圧降下活性が発見（de Bold,A.J.et al,Life
Sci.28,89−94,1981）されて以来、心房性ナトリウム
利尿ポリペプチドと呼ばれる一連のペプチドがヒトおよ
びラット心房組織から単離されており、このペプチドが
体液の恒常性および血圧のコントロールに関連している
ことが示唆されている（Kangawa,K et al,BBRC 118,131
−139,1984など）。
尿活性、血圧降下活性が発見（de Bold,A.J.et al,Life
Sci.28,89−94,1981）されて以来、心房性ナトリウム
利尿ポリペプチドと呼ばれる一連のペプチドがヒトおよ
びラット心房組織から単離されており、このペプチドが
体液の恒常性および血圧のコントロールに関連している
ことが示唆されている（Kangawa,K et al,BBRC 118,131
−139,1984など）。
α−ANP［17−28］に対するポリクローナルウサギ抗
血清を用いて、α−hANPおよびα−rANPを等しく認識す
るANPに特異的なラジオイムノアッセイ（RIA）が確立さ
れ（Nakao,K. et al,BBRC 124,815−821,1984）、α−A
NPが心臓から分泌されホルモンとして体内を循環するこ
とが示された（Sugawara,A.et al,Hypertension 8（Sup
pl I）,I−151−155,1986）。また、RIAとクロマト分析
を用いた研究により、ANPは中枢神経系にも存在し（Mor
ii,N.et al,BBRC 127,413−419,1985）、ラット脳およ
び脊髄に存在するANPの主要分子構造はα−rANP［４−2
8］およびα−rANP［５−28］であることが明らかにな
り（Shiono,S.et al,BBRC 135,728−734,1986,Morii,N.
et al,BBRC 145,196−203,1987）、神経ペプチドとして
のANPの存在様式はホルモンとしてのANPのそれとは異な
っていることが示された（Nakao,N.et al,Can.J.Physio
l.Pharmacol.65,1756−1761,1987）．このα−ANPに対
する抗血清は、循環血中のANPと脳のANPを識別しない
が、免疫組織化学的な研究にも使用された（Kawata,M.e
t al,Neurosicence 16,521−546,1985）。さらに、ラッ
トにおいて、この抗血清の脳室内投与により脳内の内因
性ANPの作用が中和され水摂取が促進された（Katsuura,
G.et al,European J. Pharmacol.121,285−287,198
6）。このように、ポリクロナールANP抗血清は多方面で
有用であるが、これらの抗血清は供給が限定されている
こと、エピトープが多様であること、ANP以外のものに
対する不要な抗体が混入してくることなど、避けられな
い欠点を有している。
血清を用いて、α−hANPおよびα−rANPを等しく認識す
るANPに特異的なラジオイムノアッセイ（RIA）が確立さ
れ（Nakao,K. et al,BBRC 124,815−821,1984）、α−A
NPが心臓から分泌されホルモンとして体内を循環するこ
とが示された（Sugawara,A.et al,Hypertension 8（Sup
pl I）,I−151−155,1986）。また、RIAとクロマト分析
を用いた研究により、ANPは中枢神経系にも存在し（Mor
ii,N.et al,BBRC 127,413−419,1985）、ラット脳およ
び脊髄に存在するANPの主要分子構造はα−rANP［４−2
8］およびα−rANP［５−28］であることが明らかにな
り（Shiono,S.et al,BBRC 135,728−734,1986,Morii,N.
et al,BBRC 145,196−203,1987）、神経ペプチドとして
のANPの存在様式はホルモンとしてのANPのそれとは異な
っていることが示された（Nakao,N.et al,Can.J.Physio
l.Pharmacol.65,1756−1761,1987）．このα−ANPに対
する抗血清は、循環血中のANPと脳のANPを識別しない
が、免疫組織化学的な研究にも使用された（Kawata,M.e
t al,Neurosicence 16,521−546,1985）。さらに、ラッ
トにおいて、この抗血清の脳室内投与により脳内の内因
性ANPの作用が中和され水摂取が促進された（Katsuura,
G.et al,European J. Pharmacol.121,285−287,198
6）。このように、ポリクロナールANP抗血清は多方面で
有用であるが、これらの抗血清は供給が限定されている
こと、エピトープが多様であること、ANP以外のものに
対する不要な抗体が混入してくることなど、避けられな
い欠点を有している。
以上のような理由により、ANPに対するモノクローナ
ル抗体が切望されているが、最近様々な特異性を有する
モノクローナル抗体が報告されてきている（John,A.et
al,Life Sci.38,1991−1997,1986;Milne,R.et al,Mol.I
mmunol.24,127−132,1987;Glembotski,C.C.et al,Endoc
rinology121,843−852,1987;Naomi,S.et al,Hybridoma
６,433−440,1987）。また、本発明者らにより、α−AN
Pを認識するモノクローナル抗体KY−ANP−Ｉ、KY−ANP
−IIが確立されている（特願昭62−218662、特願昭63−
47280）。
ル抗体が切望されているが、最近様々な特異性を有する
モノクローナル抗体が報告されてきている（John,A.et
al,Life Sci.38,1991−1997,1986;Milne,R.et al,Mol.I
mmunol.24,127−132,1987;Glembotski,C.C.et al,Endoc
rinology121,843−852,1987;Naomi,S.et al,Hybridoma
６,433−440,1987）。また、本発明者らにより、α−AN
Pを認識するモノクローナル抗体KY−ANP−Ｉ、KY−ANP
−IIが確立されている（特願昭62−218662、特願昭63−
47280）。
ANPの測定法としては既に抗血清を用いたRIAが確立さ
れている（Science 228、323−325、1985;Nature 314、
264−266、1985;BBRC 124、815−821、1984;BBRC 124、
663−668、1984;BBRC 125、315−323、1984）。このう
ち、抗血清CR−３はANPのＣ末端断片［17−28］を認識
することが知られている。
れている（Science 228、323−325、1985;Nature 314、
264−266、1985;BBRC 124、815−821、1984;BBRC 124、
663−668、1984;BBRC 125、315−323、1984）。このう
ち、抗血清CR−３はANPのＣ末端断片［17−28］を認識
することが知られている。
抗血清を用いたγ−ANPのRIAは、Hyper−tension Vol
11,No 2,I−52−56,1988に報告されている。
11,No 2,I−52−56,1988に報告されている。
発明が解決しようとする課題 最近、ANPに対する種々のモノクローナル抗体が報告
されており、ラジオイムノアッセイや免疫組織化学的実
験や中和実験に利用されている（John,A.et al,Life Sc
i.38,1991−1997,1986;Milne,R.et al,Mol.Immunol.24,
127−132,1987;Glembotski,C.C.et al,Endocrinology12
1,843−852,1987;Naomi,S.et al,Hybridoma６,433−44
0,1987;Stasch,J.P.et al,European J. Pharmacol.129,
165−168,1986）。しかし、これらの対象のほとんど全
てα−ANPであり、γ−ANPを特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体は得られていなかった。また、本抗体をRIA
などに用いれば非常に高感度なγ−ANPの測定が可能で
ある。さらに、γ−ANP［99−126］はα−ANPに対応す
るため、本抗体と公知のα−ANPを認識する抗体、例え
ば、CR−３、11A−A11、KY−ANP−Ｉ、KY−ANP−IIを組
合わせれば、極めて高感度なγ−ANPのサンドイッチエ
ンザイムイムノアッセイ（EIA）が可能になる。
されており、ラジオイムノアッセイや免疫組織化学的実
験や中和実験に利用されている（John,A.et al,Life Sc
i.38,1991−1997,1986;Milne,R.et al,Mol.Immunol.24,
127−132,1987;Glembotski,C.C.et al,Endocrinology12
1,843−852,1987;Naomi,S.et al,Hybridoma６,433−44
0,1987;Stasch,J.P.et al,European J. Pharmacol.129,
165−168,1986）。しかし、これらの対象のほとんど全
てα−ANPであり、γ−ANPを特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体は得られていなかった。また、本抗体をRIA
などに用いれば非常に高感度なγ−ANPの測定が可能で
ある。さらに、γ−ANP［99−126］はα−ANPに対応す
るため、本抗体と公知のα−ANPを認識する抗体、例え
ば、CR−３、11A−A11、KY−ANP−Ｉ、KY−ANP−IIを組
合わせれば、極めて高感度なγ−ANPのサンドイッチエ
ンザイムイムノアッセイ（EIA）が可能になる。
問題点を解決するための手段 本発明者らはγ−hANPを特異的に認識するモノクロー
ナル抗体を創製すべく鋭意研究を行なった結果、γ−AN
PのＮ末端を特異的に認識し親和性の高いモノクローナ
ル抗体を得、それを利用するγ−hANPの高感度測定法を
完成するに至った。さらに詳細には、本発明のモノクロ
ーナル抗体はγ−hANP［１−25］に含まれる部分を認識
しているものと考えられ、さらに、γ−rANPも認識す
る。
ナル抗体を創製すべく鋭意研究を行なった結果、γ−AN
PのＮ末端を特異的に認識し親和性の高いモノクローナ
ル抗体を得、それを利用するγ−hANPの高感度測定法を
完成するに至った。さらに詳細には、本発明のモノクロ
ーナル抗体はγ−hANP［１−25］に含まれる部分を認識
しているものと考えられ、さらに、γ−rANPも認識す
る。
（１） モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製 γ−hANPにおいては、γ−hANP［99−126］は、α−h
ANP［１−28］と同一であるため、γ−hANPに特異的な
抗体を調製するためには、抗原としてγ−hANP［１−9
8］に含まれる部分を用いればよい。それらを抗原とし
て用いるためには牛血清アルブミン、牛チログロブリン
などと結合させる。得られた複合体は、フロイントの完
全アジュバント等の適当なアジュバントに乳濁し、マウ
スの免疫に用いる。
ANP［１−28］と同一であるため、γ−hANPに特異的な
抗体を調製するためには、抗原としてγ−hANP［１−9
8］に含まれる部分を用いればよい。それらを抗原とし
て用いるためには牛血清アルブミン、牛チログロブリン
などと結合させる。得られた複合体は、フロイントの完
全アジュバント等の適当なアジュバントに乳濁し、マウ
スの免疫に用いる。
免疫は、上記乳濁液を数週間おきにマウスの腹腔また
は静脈に数回繰り返し接種することにより行なう。最終
免疫後３日ないし７日後に脾臓を取り出し、抗体産生細
胞として使用する。この時同時に抗体産生細胞と融合さ
せてハイブリドーマを得るための親細胞として、ヒボキ
サンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラー
ゼ欠損（HGPRT-）あるいはチミジンキナーゼ欠損（T
K-）の様な適切なマーカーを持つミエローマ細胞株を用
意し、これと抗体産生細胞とを融合させてハイブリドー
マを作製する。
は静脈に数回繰り返し接種することにより行なう。最終
免疫後３日ないし７日後に脾臓を取り出し、抗体産生細
胞として使用する。この時同時に抗体産生細胞と融合さ
せてハイブリドーマを得るための親細胞として、ヒボキ
サンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラー
ゼ欠損（HGPRT-）あるいはチミジンキナーゼ欠損（T
K-）の様な適切なマーカーを持つミエローマ細胞株を用
意し、これと抗体産生細胞とを融合させてハイブリドー
マを作製する。
ハイブリドーマ作製における培地として、イーグルME
M、ダルベツコ変法培地、RPMI−1640などの通常良く使
用されているものに、適宜約15％の牛胎児血清（FCS、f
etal calf serum）を加えて用いる。
M、ダルベツコ変法培地、RPMI−1640などの通常良く使
用されているものに、適宜約15％の牛胎児血清（FCS、f
etal calf serum）を加えて用いる。
まず、親細胞であるミエローマと脾細胞を約1:10の割
合で用意する。融合剤としてはよく用いられているポリ
エチレングリコール（PEG）の50％を用いるのが融合率
が高いとされている。融合株はHAT選択法により選択す
る。生じるハイブリドーマのスクリーニングは培養上清
を用い、膜螢光抗体法、ELISA法（Enzyme Linked Immun
osorbent Assay）、免疫組織染色法、RIA法など既知の
方法により行ない、目的の免疫グロブリンを分泌してい
るハイブリドーマのクローンを選択する。ハイブリドー
マの単一性を吟味するため、96穴のマイクロウェルにフ
イーダーレイヤー（feeder layer）として正常な脾細胞
を蒔いた上にハイブリドーマを１穴に１個より多くなら
ないように蒔き、生育してくるクローンについて再びス
クリーニングを行なう。このサブクローニングを繰り返
すことにより、単一性のハイブリドーマを得る。
合で用意する。融合剤としてはよく用いられているポリ
エチレングリコール（PEG）の50％を用いるのが融合率
が高いとされている。融合株はHAT選択法により選択す
る。生じるハイブリドーマのスクリーニングは培養上清
を用い、膜螢光抗体法、ELISA法（Enzyme Linked Immun
osorbent Assay）、免疫組織染色法、RIA法など既知の
方法により行ない、目的の免疫グロブリンを分泌してい
るハイブリドーマのクローンを選択する。ハイブリドー
マの単一性を吟味するため、96穴のマイクロウェルにフ
イーダーレイヤー（feeder layer）として正常な脾細胞
を蒔いた上にハイブリドーマを１穴に１個より多くなら
ないように蒔き、生育してくるクローンについて再びス
クリーニングを行なう。このサブクローニングを繰り返
すことにより、単一性のハイブリドーマを得る。
（２） モノクローナル抗体の産生 次に、本発明のモノクローナル抗体を製造するため
に、上記で得られたハイブリドーマを培養容器中（in v
itro）または動物体内（in vivo）で培養する。in vitr
o系で培養する場合、培地は先に述べた通常培地にFCSを
添加したものでよく、この培地で３から５日培養の後、
培養上清からモノクローナル抗体を得る。in vivo系の
培養では、ハイブリドーマを哺乳動物の腹腔に接種し、
７ないし14日後に腹水を採取し、これよりモノクローナ
ル抗体を得る。in vivo系での培養の場合、in vitro系
での培養に比べて遥かに大量の抗体を効率的に取得しう
るので好ましい。
に、上記で得られたハイブリドーマを培養容器中（in v
itro）または動物体内（in vivo）で培養する。in vitr
o系で培養する場合、培地は先に述べた通常培地にFCSを
添加したものでよく、この培地で３から５日培養の後、
培養上清からモノクローナル抗体を得る。in vivo系の
培養では、ハイブリドーマを哺乳動物の腹腔に接種し、
７ないし14日後に腹水を採取し、これよりモノクローナ
ル抗体を得る。in vivo系での培養の場合、in vitro系
での培養に比べて遥かに大量の抗体を効率的に取得しう
るので好ましい。
こうして得られた培養上清または腹水からのモノクロ
ーナル抗体の精製は、硫安分画、DEAEセフアロースカラ
ム等の既知の方法を適宜組み合わせて行なうことができ
る。
ーナル抗体の精製は、硫安分画、DEAEセフアロースカラ
ム等の既知の方法を適宜組み合わせて行なうことができ
る。
本発明者らは、γ−hANPに対するモノクローナル抗体
KY−ANP−IIIを確立しその特性を調べた。得られたモノ
クローナル抗体はγ−hANPに対して高い親和性を示し、
Kaは5.3×109M-1であった。また、このモノクローナル
抗体の特異性の分析においては、γ−hANP［１−25］お
よびγ−hANP［１−72］に強い交差反応性が見られた
が、γ−hANP［１−10］およびγ−hANP［17−25］とは
殆ど反応せず、γ−hANPの最初の25アミノ酸が抗体の結
合に最も重要であることを示している。また、本抗体
は、γ−rANPにも交差反応性を示した。
KY−ANP−IIIを確立しその特性を調べた。得られたモノ
クローナル抗体はγ−hANPに対して高い親和性を示し、
Kaは5.3×109M-1であった。また、このモノクローナル
抗体の特異性の分析においては、γ−hANP［１−25］お
よびγ−hANP［１−72］に強い交差反応性が見られた
が、γ−hANP［１−10］およびγ−hANP［17−25］とは
殆ど反応せず、γ−hANPの最初の25アミノ酸が抗体の結
合に最も重要であることを示している。また、本抗体
は、γ−rANPにも交差反応性を示した。
本発明のモノクローナル抗体KY−ANP−IIIを産生する
ハイブリドーマKY−ANP−IIIは1988年５月18日から茨城
県つくば市東１丁目１番３号の工業技術院微生物工業技
術研究所に、Mouse hybridoma KY−ANP−III、微工研条
寄第1887号（FERM BP−1887）として、ブダペスト条約
に基づいて寄託されている。
ハイブリドーマKY−ANP−IIIは1988年５月18日から茨城
県つくば市東１丁目１番３号の工業技術院微生物工業技
術研究所に、Mouse hybridoma KY−ANP−III、微工研条
寄第1887号（FERM BP−1887）として、ブダペスト条約
に基づいて寄託されている。
本発明のモノクローナル抗体KY−ANP−IIIを用いるγ
−ANPの免疫学的測定法としては、一抗体法によるRIAや
サンドイッチEIAを挙げることができる。RIAに関して
は、実施例に示すとおり、試料または標準γ−ANPと一
定量のアイソトープ標識したγ−ANPとを本抗体と結合
させ、抗体に結合した放射能を測定する競合法が上げら
れる。サンドイッチEIAとしては、前述のα−ANPを認識
する抗血清CR−３、KY−ANP−Ｉ、KY−ANP−IIなどはγ
−ANP［99−126］と反応するので、これらと組み合わせ
た方法が可能であり、以下の様にして測定できる。
−ANPの免疫学的測定法としては、一抗体法によるRIAや
サンドイッチEIAを挙げることができる。RIAに関して
は、実施例に示すとおり、試料または標準γ−ANPと一
定量のアイソトープ標識したγ−ANPとを本抗体と結合
させ、抗体に結合した放射能を測定する競合法が上げら
れる。サンドイッチEIAとしては、前述のα−ANPを認識
する抗血清CR−３、KY−ANP−Ｉ、KY−ANP−IIなどはγ
−ANP［99−126］と反応するので、これらと組み合わせ
た方法が可能であり、以下の様にして測定できる。
抗体を固定化する固相としては、通常の免疫測定法に
使用される市販の抗原抗体反応用担体、例えば、ガラス
または合成樹脂製の粒状物（ビーズ）あるいは球状物
（ボール）、チューブ、ブレートなどを用いることがで
きる。これらの担体に、α−ANPまたはγ−ANPを認識す
る抗体を吸着せしめる。吸着は通常リン酸バッファ−
中、pH6〜10、好ましくは中性付近で室温下に一夜放置
することにより行なう。抗体を吸着した担体は、アジ化
ナトリウムなどの防腐剤の存在下、冷所に保存する。
使用される市販の抗原抗体反応用担体、例えば、ガラス
または合成樹脂製の粒状物（ビーズ）あるいは球状物
（ボール）、チューブ、ブレートなどを用いることがで
きる。これらの担体に、α−ANPまたはγ−ANPを認識す
る抗体を吸着せしめる。吸着は通常リン酸バッファ−
中、pH6〜10、好ましくは中性付近で室温下に一夜放置
することにより行なう。抗体を吸着した担体は、アジ化
ナトリウムなどの防腐剤の存在下、冷所に保存する。
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体につい
て、同様の処理で担体に結合せしめることができる。
て、同様の処理で担体に結合せしめることができる。
抗体を含む腹水または抗血清は硫酸ナトリウムで分画
し、次いで、DEAE−セルロースのカラムを通すことによ
りIgGを調製する。得られたIgGをペプシンで消化してＦ
（ab′）２断片とし、更にこれを２−メチルカプトエチ
ルアミンで還元すれば、抗α−ANP Fab′または抗γ−A
NP Fab′が得られる。IgGからFab′の調製については、
ジャーナル・オブ・イムノアッセイ［J.Immunoassa
y］、４、209〜327（1983）に詳細な説明があり、本発
明においても、同様の手法を利用することができる。
し、次いで、DEAE−セルロースのカラムを通すことによ
りIgGを調製する。得られたIgGをペプシンで消化してＦ
（ab′）２断片とし、更にこれを２−メチルカプトエチ
ルアミンで還元すれば、抗α−ANP Fab′または抗γ−A
NP Fab′が得られる。IgGからFab′の調製については、
ジャーナル・オブ・イムノアッセイ［J.Immunoassa
y］、４、209〜327（1983）に詳細な説明があり、本発
明においても、同様の手法を利用することができる。
抗体の標識酵素としては、アルカリ性ホスファター
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシドーゼ、ベルオキシダーゼ、グ
ルコースオキシダーゼなどが利用可能であるが、本発明
においては、特に西洋わさびペルオキシダーゼが好まし
く用いられる。また、架橋剤としては、N,N′−ｏ−フ
ェニレンジマレイミド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）
シクロヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、６−
マレイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸・Ｎ−スクシ
ンイミドエステル、4,4'−ジチオジピリジン、その他公
知の架橋剤が利用可能である。これらの架橋剤と酵素お
よび抗体との反応は、それぞれの架橋剤の性質に応じ
て、既知の方法に従って行なえばよい。また、抗体とし
ては、場合によっては、そのフラグメント、例えばFa
b′、Fab、Ｆ（ab′）２を用いる。また、ポリクローナ
ル、モノクローナル抗体にかかわらず同様の処理により
酵素標識体はを得ることができる。上記架橋剤を用いて
得られる酵素標識抗体はアフィニティ・クロマトグラフ
ィーなどにより精製すれば、更に感度の高い免疫測定系
が可能となる。精製した酵素標識抗体は、安定剤として
チメロサールまたはグリセリンを加えて、あるいは凍結
乾燥して冷暗所に保存する。
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシドーゼ、ベルオキシダーゼ、グ
ルコースオキシダーゼなどが利用可能であるが、本発明
においては、特に西洋わさびペルオキシダーゼが好まし
く用いられる。また、架橋剤としては、N,N′−ｏ−フ
ェニレンジマレイミド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）
シクロヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、６−
マレイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸・Ｎ−スクシ
ンイミドエステル、4,4'−ジチオジピリジン、その他公
知の架橋剤が利用可能である。これらの架橋剤と酵素お
よび抗体との反応は、それぞれの架橋剤の性質に応じ
て、既知の方法に従って行なえばよい。また、抗体とし
ては、場合によっては、そのフラグメント、例えばFa
b′、Fab、Ｆ（ab′）２を用いる。また、ポリクローナ
ル、モノクローナル抗体にかかわらず同様の処理により
酵素標識体はを得ることができる。上記架橋剤を用いて
得られる酵素標識抗体はアフィニティ・クロマトグラフ
ィーなどにより精製すれば、更に感度の高い免疫測定系
が可能となる。精製した酵素標識抗体は、安定剤として
チメロサールまたはグリセリンを加えて、あるいは凍結
乾燥して冷暗所に保存する。
上記で調製された免疫学的測定試薬を用いてγ−ANP
を測定する際の抗体の組合わせとしては、γ−ANPのＮ
端側を認識する抗体を固定化した場合にはα−ANPを認
識する抗体を酵素標識抗体とし、α−ANPを認識する抗
体を固定化した場合にはγ−ANPのＮ端側を認識する抗
体を酵素標識抗体とすればよい。一般には、固定化には
比較的大量の抗体が必要であるため安定的に大量の抗体
が得られるモノクローナル抗体が固定化に適している
が、抗血清から得られるポリクローナル抗体も不都合な
く使用できる。酵素標識する抗体は、モノクローナル抗
体、ポリクローナル抗体のいずれでもよく、固定化した
抗体が認識するのとは異なる部位を認識するものであれ
ばよい。例えば、固定化抗体として本発明のKY−ANP−I
IIを用いた場合には酵素標識抗体として上述の抗血清CR
−３、KY−ANP−Ｉ、KY−ANP−IIなどが適用でき、また
この逆の組合わせでもよい。
を測定する際の抗体の組合わせとしては、γ−ANPのＮ
端側を認識する抗体を固定化した場合にはα−ANPを認
識する抗体を酵素標識抗体とし、α−ANPを認識する抗
体を固定化した場合にはγ−ANPのＮ端側を認識する抗
体を酵素標識抗体とすればよい。一般には、固定化には
比較的大量の抗体が必要であるため安定的に大量の抗体
が得られるモノクローナル抗体が固定化に適している
が、抗血清から得られるポリクローナル抗体も不都合な
く使用できる。酵素標識する抗体は、モノクローナル抗
体、ポリクローナル抗体のいずれでもよく、固定化した
抗体が認識するのとは異なる部位を認識するものであれ
ばよい。例えば、固定化抗体として本発明のKY−ANP−I
IIを用いた場合には酵素標識抗体として上述の抗血清CR
−３、KY−ANP−Ｉ、KY−ANP−IIなどが適用でき、また
この逆の組合わせでもよい。
実施例 ハイブリドーマの調製 合成γ−hANP［１−25］（5.0mg）と牛チログロブリ
ン（10mg）を1.6mlの蒸留水に溶解する。この溶液に、
蒸留水0.2mlに溶解した１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド20mgを４℃で10分か
けて滴下し、０℃で窒素気流下４時間撹拌する。この溶
液を、蒸留水１に対して４回、３日間透析する。この
透析物を５つに分注して−20℃で保存した（BBRC 124,
815−821,1984参照）。
ン（10mg）を1.6mlの蒸留水に溶解する。この溶液に、
蒸留水0.2mlに溶解した１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド20mgを４℃で10分か
けて滴下し、０℃で窒素気流下４時間撹拌する。この溶
液を、蒸留水１に対して４回、３日間透析する。この
透析物を５つに分注して−20℃で保存した（BBRC 124,
815−821,1984参照）。
上記の分注保存した溶液（300μｇのγ−hANP［１−2
5］を含む）に蒸留水を加え1.2mlとし、これを1.2mlの
フロイントの完全アジュバントに懸濁した。そのうち約
2mlを10匹のBALB/c雌マウスの腹腔および皮下に注射し
た（１匹当り200μｌ）。その後、約４週間隔で、完全
アジュバントに乳濁した１匹当り7.5〜30μｇのγ−hAN
P［１−25］の皮下投与を７回繰り返した。30μｇのγ
−hANP［１−25］の静脈注射による最終免疫の６日後、
マウスの脾臓を摘出し、細胞融合に用いた。
5］を含む）に蒸留水を加え1.2mlとし、これを1.2mlの
フロイントの完全アジュバントに懸濁した。そのうち約
2mlを10匹のBALB/c雌マウスの腹腔および皮下に注射し
た（１匹当り200μｌ）。その後、約４週間隔で、完全
アジュバントに乳濁した１匹当り7.5〜30μｇのγ−hAN
P［１−25］の皮下投与を７回繰り返した。30μｇのγ
−hANP［１−25］の静脈注射による最終免疫の６日後、
マウスの脾臓を摘出し、細胞融合に用いた。
脾臓細胞とミエローマ細胞X63−Ag8.653（1:10）をダ
ルベッコ培地中（DMEM）で混合し、1500rpm、４℃で５
分間遠沈した。得られたペレットを37℃に加温し解した
後、50％PEG4000（PEG1g/DMEM1ml）1mlを37℃で１分間
かけて滴下した。37℃で２分間放置した後、37℃のDMEM
10mlを５分かけて加え希釈し、４℃で15％FCS添加DMEM
で遠心洗浄する。
ルベッコ培地中（DMEM）で混合し、1500rpm、４℃で５
分間遠沈した。得られたペレットを37℃に加温し解した
後、50％PEG4000（PEG1g/DMEM1ml）1mlを37℃で１分間
かけて滴下した。37℃で２分間放置した後、37℃のDMEM
10mlを５分かけて加え希釈し、４℃で15％FCS添加DMEM
で遠心洗浄する。
融合後、15％牛胎児血清を含むHAT培地中でハイブリ
ドーマを選択した。細胞の増殖に伴い、［125I］γ−hA
NP［１−25］を用いるRIAによって培養液中の抗体産生
を定期的に調べた。ほぼ全てのウェルにおいてハイブリ
ドーマの増殖が観察され、そのうち約0.8％（３ウエ
ル）が抗体を産生していた。抗体産生細胞は、マウス胸
腺細胞をフィーダーとして、限界希釈法により２回クロ
ーニングした。最も強い反応性を有する抗体を産生する
クローン株KY−ANP−IIIを確立し、その特性を調べるた
めに増殖させた。
ドーマを選択した。細胞の増殖に伴い、［125I］γ−hA
NP［１−25］を用いるRIAによって培養液中の抗体産生
を定期的に調べた。ほぼ全てのウェルにおいてハイブリ
ドーマの増殖が観察され、そのうち約0.8％（３ウエ
ル）が抗体を産生していた。抗体産生細胞は、マウス胸
腺細胞をフィーダーとして、限界希釈法により２回クロ
ーニングした。最も強い反応性を有する抗体を産生する
クローン株KY−ANP−IIIを確立し、その特性を調べるた
めに増殖させた。
モノクローナル抗体の調製 BALB/cマウスを、0.5mlのプリスタンを腹腔に２回１
〜２週間間隔で投与することにより前処理した。そのマ
ウスの腹腔に、200μｌのDMEMに懸濁した５×106個のハ
イブリドーマKY−ANP−IIIを注射した。得られた腹水を
プロテインＡ−セファロースCL−4Bカラムで精製し、モ
ノクローナル抗体KY−ANP−IIIを得た。
〜２週間間隔で投与することにより前処理した。そのマ
ウスの腹腔に、200μｌのDMEMに懸濁した５×106個のハ
イブリドーマKY−ANP−IIIを注射した。得られた腹水を
プロテインＡ−セファロースCL−4Bカラムで精製し、モ
ノクローナル抗体KY−ANP−IIIを得た。
モノクローナル抗体の特性 上記で得られたモノクローナル抗体のアイソタイプを
オクタロニー法（Mouse Monoclonal Typing Kit、Mile
s）によって決定した。親和定数は後記のRIAによるスキ
ャッチャード分析法に従って決定した。特異性は、γ−
hANPのRIAにおける各種ANP関連ペプチドとの交差反応性
を調べることにより分析した。
オクタロニー法（Mouse Monoclonal Typing Kit、Mile
s）によって決定した。親和定数は後記のRIAによるスキ
ャッチャード分析法に従って決定した。特異性は、γ−
hANPのRIAにおける各種ANP関連ペプチドとの交差反応性
を調べることにより分析した。
得られたモノクローナル抗体は、オクタロニー法によ
りIgG1サブクラスに属するものと決定された。スキャッ
チャード法により親和定数を調べたところ、γ−hANP
［１−25］に対するKa値は5.3×109M-1であり、高い親
和性を示した（第２図参照）。
りIgG1サブクラスに属するものと決定された。スキャッ
チャード法により親和定数を調べたところ、γ−hANP
［１−25］に対するKa値は5.3×109M-1であり、高い親
和性を示した（第２図参照）。
RIA モノクローナル抗体を用いたRIAは、Hypertension,Vo
l 11,No 2,I−52−56（1988）に詳述されているポリク
ローナル抗血清による方法に従って行なった。
l 11,No 2,I−52−56（1988）に詳述されているポリク
ローナル抗血清による方法に従って行なった。
試薬はすべて、0.1％ゼラチン（メルク）、1mM Na2ED
TA、0.2mMシスチン、0.1％Triton X−100と0.1％メルチ
オレイトを含む0.05Mリン酸バッファー（pH7.4）に溶解
した。
TA、0.2mMシスチン、0.1％Triton X−100と0.1％メルチ
オレイトを含む0.05Mリン酸バッファー（pH7.4）に溶解
した。
KY−ANP−IIIを含む腹水希釈液（100,000倍）100μ
ｌ、試料または標準γ−ANP希釈液100μｌ、上記バッフ
ァー200μｌ、［125I］γ−hANP［１−25］（約10,000c
pm）100μｌの混合液を４℃で48時間反応させる。これ
をデキストラン−コーテッド−チャーコール1m1と混合
し４℃で15分間反応させる。その後、４℃で30分間3000
rpmにて遠心し、その上清の放射活性をγ−カウンター
で測定することにより、サンプル希釈液中の抗体価を求
めた。［125I］γ−hANP［１−25］の比活性は570μCi/
μｇであった。マウス腹水は最終希釈500,000倍に希釈
して使用でき、その時のトレイサーとの結合率は約25％
であった。
ｌ、試料または標準γ−ANP希釈液100μｌ、上記バッフ
ァー200μｌ、［125I］γ−hANP［１−25］（約10,000c
pm）100μｌの混合液を４℃で48時間反応させる。これ
をデキストラン−コーテッド−チャーコール1m1と混合
し４℃で15分間反応させる。その後、４℃で30分間3000
rpmにて遠心し、その上清の放射活性をγ−カウンター
で測定することにより、サンプル希釈液中の抗体価を求
めた。［125I］γ−hANP［１−25］の比活性は570μCi/
μｇであった。マウス腹水は最終希釈500,000倍に希釈
して使用でき、その時のトレイサーとの結合率は約25％
であった。
上記125I−γ−hANP［１−25］はクロラミンＴ法によ
って調製した。即ち、γ−hANP［１−25］（１μｇ）と
Na125I（1mCi）を混合し、10μｌのクロラミンＴ（5.25
mg/ml）を加え、10秒後に20μｌのピロ亜硫酸ナトリウ
ム（4.5mg/ml）を加える。さらに、２％ゼラチン1m1を
加え、Sep−Pak C18（Waters社製）で精製する。
って調製した。即ち、γ−hANP［１−25］（１μｇ）と
Na125I（1mCi）を混合し、10μｌのクロラミンＴ（5.25
mg/ml）を加え、10秒後に20μｌのピロ亜硫酸ナトリウ
ム（4.5mg/ml）を加える。さらに、２％ゼラチン1m1を
加え、Sep−Pak C18（Waters社製）で精製する。
このモノクローナル抗体を用いたRIAにおけるγ−hAN
Pの標準曲線と関連ペプチドの交差反応性を第３図に示
す。
Pの標準曲線と関連ペプチドの交差反応性を第３図に示
す。
発明の効果 本発明のKY−ANP−IIIは、γ−hANPを特異的に認識
し、その他の公知のANPに対する抗体と組み合わせるな
どして、高感度に特異的にγ−hANPを測定できる。ま
た、γ−hANPをも認識するので、その測定も可能であ
る。このγ−hANPの測定法の確立により、心疾患、腎疾
患、高血圧症（本態性、二次性）、浮腫性疾患（肝硬
変、ネフローゼ、突発性浮腫等）、脱水症等体液バラン
スの異常を伴う疾患の診断および治療経過の簡便かつ観
察が可能になる。
し、その他の公知のANPに対する抗体と組み合わせるな
どして、高感度に特異的にγ−hANPを測定できる。ま
た、γ−hANPをも認識するので、その測定も可能であ
る。このγ−hANPの測定法の確立により、心疾患、腎疾
患、高血圧症（本態性、二次性）、浮腫性疾患（肝硬
変、ネフローゼ、突発性浮腫等）、脱水症等体液バラン
スの異常を伴う疾患の診断および治療経過の簡便かつ観
察が可能になる。
第１図はγ−hANPのアミノ酸配列を示す。 第２図は、［125I］γ−hANP［１−25］のモノクローナ
ル抗体KY−ANP−IIIへの結合のスキャッチャードプロッ
トである。KY−ANP−IIIを含む腹水を［125I］γ−hANP
［１−25］（12〜800pM、500μ1/tube）と共に４℃で48
時間インキュベートし、デキストランコーテッドチャコ
ール法により分離した後、特異的な結合を測定した。 第３図は、KY−ANP−IIIを用いたRIAにおけるγ−hAN
Pの典型的標準曲線と関連ペプチドの交差反応曲線を示
す。［125I］γ−hANP［１−25］と種々の濃度の標準γ
−hANPまたは関連ペプチドをKY−ANP−IIIと共に４℃で
24時間インキュベートした。●はγ−hANP［１−25］、
○はγ−hANP［１−72］、▲はγ−hANP［１−67］、△
はγ−hANP［１−16］、◆はγ−hANP［１−10］、◇は
γ−hANP［17−25］、■はγ−hANP、□はγ−rANPを示
す。
ル抗体KY−ANP−IIIへの結合のスキャッチャードプロッ
トである。KY−ANP−IIIを含む腹水を［125I］γ−hANP
［１−25］（12〜800pM、500μ1/tube）と共に４℃で48
時間インキュベートし、デキストランコーテッドチャコ
ール法により分離した後、特異的な結合を測定した。 第３図は、KY−ANP−IIIを用いたRIAにおけるγ−hAN
Pの典型的標準曲線と関連ペプチドの交差反応曲線を示
す。［125I］γ−hANP［１−25］と種々の濃度の標準γ
−hANPまたは関連ペプチドをKY−ANP−IIIと共に４℃で
24時間インキュベートした。●はγ−hANP［１−25］、
○はγ−hANP［１−72］、▲はγ−hANP［１−67］、△
はγ−hANP［１−16］、◆はγ−hANP［１−10］、◇は
γ−hANP［17−25］、■はγ−hANP、□はγ−rANPを示
す。
Claims (3)
- 【請求項１】γ−ANPのＮ末端の１〜25番目の25アミノ
酸残基からなる部分（γ−ANP［１−25］）に含まれる
部分を認識し、ハイブリドーマKY−ANP−III（FERM BP
−1887）により産生されるモノクローナル抗体。 - 【請求項２】γ−ANP［１−25］に含まれる部分を認識
するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマKY−
ANP−III（FERM BP−1887）。 - 【請求項３】請求項１記載のモノクローナル抗体を用い
ることを特徴とするγ−ANPの免疫学的測定法。
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63166641A JP2561513B2 (ja) | 1988-07-04 | 1988-07-04 | γ−ＡＮＰを認識するモノクローナル抗体 |
| US07/380,597 US5124248A (en) | 1988-07-04 | 1989-06-26 | Monoclonal antibody recognizing gamma atrial natriuretic polypeptide |
| AU37178/89A AU625398B2 (en) | 1988-07-04 | 1989-06-28 | Monoclonal antibody recognizing gamma atrial natriuretic polypeptide |
| DE68914345T DE68914345T2 (de) | 1988-07-04 | 1989-06-30 | Gamma-atriales, natriuretisches Polypeptid erkennende monoklonale Antikörper, solche Antikörper produzierende Hybridome und deren Herstellung und Verwendung. |
| EP89306669A EP0350218B1 (en) | 1988-07-04 | 1989-06-30 | Monoclonal antibodies recognizing gamma atrial natriuretic polypeptide, hybridomas producing such antibodies, and their preparation and use |
| ES89306669T ES2055066T3 (es) | 1988-07-04 | 1989-06-30 | Anticuerpos monoclonales que reconocen el extremo n del gamma polipeptido natriuretico atrial, hibridomas que los producen y su preparacion y aplicacion. |
| AT89306669T ATE103973T1 (de) | 1988-07-04 | 1989-06-30 | Gamma-atriales, natriuretisches polypeptid erkennende monoklonale antikoerper, solche antikoerper produzierende hybridome und deren herstellung und verwendung. |
| DK198903297A DK175750B1 (da) | 1988-07-04 | 1989-07-03 | Monoklonale antistoffer, der genkender gamma-atrialt natriuretisk polypeptid, hybridomceller, der producerer sådanne antistoffer, og fremstilling og anvendelse deraf |
| KR1019890009495A KR0145406B1 (ko) | 1988-07-04 | 1989-07-04 | 감마 아트리알 나트륨 이뇨성 폴리펩티드를 인식하는 단일 클론 항체 |
| CA000604715A CA1334176C (en) | 1988-07-04 | 1989-07-04 | Monoclonal antibody recognizing gamma atrial natriuretic polypeptide |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63166641A JP2561513B2 (ja) | 1988-07-04 | 1988-07-04 | γ−ＡＮＰを認識するモノクローナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0216997A JPH0216997A (ja) | 1990-01-19 |
| JP2561513B2 true JP2561513B2 (ja) | 1996-12-11 |
Family
ID=15835041
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63166641A Expired - Lifetime JP2561513B2 (ja) | 1988-07-04 | 1988-07-04 | γ−ＡＮＰを認識するモノクローナル抗体 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5124248A (ja) |
| EP (1) | EP0350218B1 (ja) |
| JP (1) | JP2561513B2 (ja) |
| KR (1) | KR0145406B1 (ja) |
| AT (1) | ATE103973T1 (ja) |
| AU (1) | AU625398B2 (ja) |
| CA (1) | CA1334176C (ja) |
| DE (1) | DE68914345T2 (ja) |
| DK (1) | DK175750B1 (ja) |
| ES (1) | ES2055066T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2796470A2 (en) | 2013-04-05 | 2014-10-29 | Shibayagi Co., Ltd. | Anti-canine N-terminal pro-atrial natriuretic peptide antibody, and immunological measurement method and immunologically measuring kit using the same |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2561513B2 (ja) * | 1988-07-04 | 1996-12-11 | 塩野義製薬株式会社 | γ−ＡＮＰを認識するモノクローナル抗体 |
| EP0721105B1 (en) * | 1994-12-09 | 1999-05-12 | Shionogi & Co., Ltd. | Sandwich immunoassay for N-peptide |
| AT407674B (de) * | 1998-09-29 | 2001-05-25 | Biomedica Gmbh | Verfahren zur bestimmung von atrialem natriuretischem peptid (anp) |
| EP1569683B1 (en) | 2002-11-26 | 2010-03-03 | Biocon Limited | Modified natriuretic compounds, conjugates, and uses thereof |
| DE102007022367A1 (de) | 2007-05-07 | 2008-11-20 | B.R.A.H.M.S Ag | Verfahren zur Bestimmung von aminoterminalen pro-ANP bei übergewichtigen Patienten |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3509958A1 (de) * | 1985-03-20 | 1986-09-25 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Monoklonale antikoerper gegen atriale, natriuretische peptide vom menschen |
| CA1335082C (en) * | 1987-09-01 | 1995-04-04 | Hiroo Imura | Monoclonal antibody recognizing -hanp and a reagent for immunoassay of -hanp |
| JP2561513B2 (ja) * | 1988-07-04 | 1996-12-11 | 塩野義製薬株式会社 | γ−ＡＮＰを認識するモノクローナル抗体 |
-
1988
- 1988-07-04 JP JP63166641A patent/JP2561513B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
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Non-Patent Citations (1)
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| Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．２，Ｐ．５２−５６（Ｆｅｂ．１９８８） |
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