DE3751519T2

DE3751519T2 - Stromales Gewebe.

Info

Publication number: DE3751519T2
Application number: DE3751519T
Authority: DE
Inventors: Brian A Naughton; Gail K Naughton
Original assignee: Advanced Tissue Sciences Inc
Current assignee: TJ Smith and Nephew Ltd
Priority date: 1986-04-18
Filing date: 1987-04-15
Publication date: 1996-03-28
Anticipated expiration: 2007-04-16
Also published as: DE3751519D1; AU7356887A; DK665687D0; DK665687A; AU615414B2; HK1007684A1; HU202578B; AU6815990A; FI100249B; NO875286L; KR0142885B1; FI884783A; NO875286D0; EP0309456A1; AU6816090A; JPH01503195A; ATE127692T1; EP0309456A4; WO1987006120A1; NO179181B

Description

Diese Erfindung betrifft die Herstellung eines dreidimensionalen lebenden Stromagewebes in vitro sowie die Verwendung desselben zur Kultivierung von Knochenmarkzellen, Hautzellen, Leberzellen und vielen anderen Zelltypen und Geweben. Die kultivierten Zellen können zu Transplantationszwecken, für Zytotoxizitätstests und für In-vitro-Untersuchungen bestimmter Krankheitszustände verwendet werden.
Verfahren zur Transplantation von Knochenmark sind bekannt. Im allgemeinen werden Knochenmarktransplantationen an Patienten vorgenommen, die an einer Krankheit leiden, wie z. B. Krebs, die gesunde Knochenmarkzellen zerstört oder deren Funktionsfähigkeit herabgesetzt. Außerdem wird das Knochenmark durch Behandlungen wie z. B. Chemotherapie und Strahlentherapie beeinträchtigt, und dies selbst in solchen Fällen, wo das Knochenmark noch nicht direkt von der behandelten Krankheit geschädigt ist. Bekannte Verfahren zur Knochenmarktransplantation leiden unter einer Reihe von Nachteilen. Ein wesentlicher Grund für die Abstoßung von transplantiertem Knochenmark ist die "Graft-versus-Host"-Reaktion (Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion), die auftritt, wenn das einem Menschen entnommene Knochenmark in einen anderen Menschen verpflanzt wird. Ein anderer wesentlicher Grund für das Versagen eines Knochenmarktransplantats ist das Vorliegen eines Gefäßverschlusses als Folge der Entstehung von Knochenmarkemboli. Noch jung sind Verfahren, bei denen einem Patienten vor einer kombinierten chemotherapeutischen und strahlentherapeutischen Behandlung Knochenmark entnommen und aufbewahrt wird und erst nach Verabfolgung der Therapie wieder eingesetzt wird (auch autologische Transplantation genannt). Häufig jedoch leidet der Patient selbst bei erfolgter Transplantation unter einem Wiederauftreten einer Erkrankung, da das Knochenmark bereits zum Zeitpunkt der ersten Entnahme erkrankt war.
Diese Erfindung stellt zum einen ein in vitro hergestelltes dreidimensionales lebendes Stromagewebe vor bestehend aus Stromazellen und von den Stromazellen ausgeschiedenen Bindegewebs-Proteinen, gezüchtet auf einem biokompatiblen nichtlebenden dreidimensionalen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Stromazellen an den Träger anheften und diesen umhüllen, so daß eine dreidimensionale Struktur entsteht.
Weitere Aspekte betreffen ein Verfahren zur Zellkultivierung, umfassend Knochenmarkzellen, Hautzellen oder Leberzellen, die auf lebendem Stromagewebe gezüchtet werden, sowie entsprechende Einsatzmöglichkeiten für solche kultivierten Zellen.
Die Erfindung beschreibt ein dreidimensionales lebendes Stromagewebe zur Züchtung von Zellen in Kultur. Das Zellwachstum in der Gegenwart dieses lebenden Stromagewebes kann weiter gefördert werden durch Hinzufügen von Proteinen, Glycoproteinen, Glucosaminoglykanen, einer zellulären Matrix und anderen Stoffen zu dem Stromagewebe als solches oder durch Beschichten eines nichtlebenden dreidimensionalen Trägers, auf dem das Stromagewebe wächst, mit diesen Stoffen. Die Verwendung eines dreidimensionalen lebenden Stromagewebes erlaubt es den Zellen, in mehreren Schichten zu wachsen und so das dreidimensionale Zellkultursystem dieser Erfindung aufzubauen. Das dreidimensionale lebende Stromagewebe kann eingesetzt werden zur Herstellung dreidimensionaler Zellkultursysteme für Knochenmarkzellen, Hautzellen, Leberzellen und viele andere Zellarten und Gewebe. In einer Ausführungsart dieser Erfindung kann das dreidimensionale Zellkultursystem auf oder in einen lebenden Organismus übertragen werden.
Der dreidimensionale Träger hat vorzugsweise die Gestalt eines Maschenwerks. Präparierte Träger können zur späteren Verwendung in einem dreidimensionalen physiologischen Zellkultursystem aufbewahrt werden. In einer Ausführungsart zur Züchtung von hämatopoetischen Knochenmarkzellen wird das Maschenwerk gebildet durch Züchten einer Schicht von Stroma-Markzellen auf dem Maschenwerk, bis die Stroma-Markzellen kurz vor dem Zusammenwachsen ("subkonfluent") sind.
Die Erfindung wird im folgenden am Beispiel ihrer Anwendungen auf Knochenmark beschrieben, wobei jedoch klar sein muß, daß diese Erfindung auf viele andere Zellarten und Gewebe anwendbar ist.
Ein Verfahren zur Kultivierung von Knochenmark zur Verwendung im Rahmen der Behandlung eines Menschen, dessen Knochenmark entweder zerstört worden ist oder seine Funktionsfähigkeit verloren hat, umfaßt die nachstehenden Verfahrensschritte:
I. Gewinnen einer Knochenmarkprobe von einem Spender; anschließend
II. Kultivieren der Knochenmarkprobe in vitro, um kultiviertes Knochenmark herzustellen, das hämatopoetische Stammzellen mit Mark-Wiederbesiedelungsaktivität enthält, von denen ein Teil zur späteren Verwendung gefrierkonserviert werden kann; und schließlich
III. Transplantieren des kultivierten, hämatopoetische Stammzellen enthaltenden Knochenmarks in den Empfänger zur Wiederherstellung der Hämatopoese in dem Empfänger.
Außerdem ist eine Verwendung vorgesehen zur Behandlung von Krankheiten oder Zuständen, die gesunde Knochenmarkzellen zerstört haben oder deren Funktionsfähigkeit herabgesetzt haben. Dies ist besonders von Nutzen im Rahmen der Behandlung von hämatologischen Neoplasmen oder anderen in das Knochenmark metastasierenden Neoplasmen.
Eine Ausführungsart dieser Erfindung beinhaltet die nachstehenden Schritte: Aspiration einer kleinen Menge Knochenmark von einem gesunden Patienten; Kryokonservierung besagter Zellen; Kultivierung der Knochenmarkzellen in vitro zur Erhöhung der Anzahl von Knochenmarkzellen auf eine für eine autologe Transplantation, z. B. Reinfusion, ausreichende Anzahl, die über der ursprünglich dem Patienten entnommenen Anzahl liegt; schließlich Wiedereinbringung (Reinfusion) der Knochenmarkzellen in den Patienten.
Entsprechend einer anderen Ausführungsart dieser Erfindung werden die Knochenmarkzellen des Patienten sofort nach ihrer Aspiration kryokonserviert oder gefroren und später aufgetaut und reproduziert. Entsprechend einer anderen Ausführungsart dieser Erfindung wird eine allogene Knochenmarktransplantation durchgeführt durch Aspiration von Knochenmark von einem Patienten, Reproduktion der Knochenmarkzellen in vitro und später Wiedereinbringung (Reinfusion) der reproduzierten Knochenmarkzellen in eine andere Person.
Das In-vitro-Knochenmark-Reproduktionssystem bietet auch eine Möglichkeit zur Überwachung eines Patienten hinsichtlich solcher Bedingungen, die das Knochenmark schädigen. So wird beispielsweise einem behandelten Krebspatienten eine kleine Probe von Knochenmark durch Aspiration entnommen und in dem In-vitro-System dieser Erfindung reproduziert, um eine Überprüfung auf ein etwaiges Wiederauftreten oder eine etwaige Metastasenbildung des ursprünglichen Neoplasmas vorzunehmen.
Das In-vitro-Knochenmark-Reproduktionssystem eignet sich auch zur Überprüfung der Zytotoxizität von pharmazeutischen Erzeugnissen, Lebensmittelzusätzen, Produkten zur Gesundheitspflege, antineoplastischen Mitteln und Karzinogenen. Eine proportionale, maßstäblich verkleinerte Dosis der Testsubstanz wird zu dem In-vitro-Knochenmark-System dieser Erfindung hinzugegeben, und es werden die Auswirkungen dieser Substanz auf verschiedene Zellarten festgehalten. Andere Zellarten als Knochenmarkzellen werden nach Bedarf substituiert, um eine bestimmte Substanz zu testen.
Diese Erfindung ist leichter verständlich unter Bezugnahme auf die einzige Abbildung in dem nachfolgenden Abbildungsteil, die eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme in 1,65-tausendfacher Vergrößerung zeigt, in der ein Maschenwerk mit darauf wachsenden Knochenmark-Stromazellen zu sehen ist.
Die im folgenden beschriebenen speziellen Verkörperungen sind lediglich als Beispiele zu verstehen;
Die einzige Abbildung zeigt ein für diese Erfindung brauchbares Maschenwerk (10). Dieses Maschenwerk (10) enthält Kettfäden (12) und Schußfäden (13). Wie der Aufnahme zu entnehmen ist, wachsen Stromazellen (14) auf den Fäden (12,13).

Reproduktion und Kryokonservierung von Knochenmark zur Verwendung für Knochenmarktransplantationen

In einer Ausführungsart betrifft diese Erfindung das Kultivieren von Knochenmarkzellen zum Zwecke der Herstellung eines Transplantats zur Behandlung von Krankheiten oder Zuständen, die gesunde Knochenmarkzellen zerstören oder deren Funktionsfähigkeit herabsetzen. Dies ist besonders von Nutzen im Rahmen der Behandlung von hämatologischen Neoplasmen und anderen Neoplasmen, die in das Knochenmark metastasieren. Diese Erfindung ist ebenso von Nutzen bei der Behandlung von Patienten, deren Knochenmark durch eine auf Grund einer Krankheit, die nicht direkt das Knochenmark schädigt, notwendig gewordene Chemotherapie und/oder Strahlentherapie beeinträchtigt worden ist. Diese Erfindung liefert desweiteren ein Instrument für die Entnahme und Konservierung von Knochenmarkzellen von einem gesunden Patienten und eine spätere Reproduktion und Reinfusion der Knochenmarkzellen in dem Falle, daß der Patient eine Krankheit entwickelt, die entweder direkt das Knochenmark zerstört oder deren Behandlung das Knochenmark schädigt.
Entsprechend dieser Erfindung wird eine kleine Menge (10-15 cm³ Suspension aus Knochenmark und peripherem Blut) aus dem Darmbeinkamm (Crista iliaca) eines Spenders aspiriert. Die Ergebnisse dieses Verfahrens sind optimal, wenn 1.) die Person zum Zeitpunkt der Kryokonservierung ihres Knochenmarks unter 40 Jahre als ist, 2.) der Patient gesund ist. Dieses Verfahren kann sich für manche Patienten mit metastasierender Krankheit oder hämatologischen Neoplasmen als günstig erweisen, wenn vor dem Kultivieren ein "Reinigen" von bösartigen Zellen mit physikalischen oder chemotherapeutischen Mitteln vorgenommen werden kann. Derzeit sind diese Verfahren am brauchbarsten, wenn Zellen in geringer Anzahl gebraucht werden, eine Tatsache, die für die nachfolgenden Verfahren von Nutzen sein könnte. Verfahren zur Entnahme von Knochenmark von einem Spender durch Aspiration sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Beispiele für Gerät und Verfahren zur Aspiration von Knochenmark bei einem Spender finden sich in den US-Patenten Nr. 4.481.946 und Nr. 4.486.188.
Das einem Spender entnommene Knochenmark wird kultiviert, d. h. reproduziert, oder zum Zwecke einer Reproduktion zu einem späteren Zeitpunkt konserviert. Soll das Knochenmark konserviert werden, dann kann es in Stufen eingefroren werden mit Hilfe einer rechnergestützten kryotechnischen Ausrüstung. Eine Suspension aus frischem Knochenmark/Blut wird in gleichmäßig auf sterile Nunc-Röhrchen verteilt, die in ein Becherglas mit zerstoßenem Eis gegeben werden, bis die Kryokonservierungskammer gleiche Temperatur (4ºC) erreicht hat. Unmittelbar vor dem Einsetzen der Proben in die Kammer wird zu jedem Nunc-Röhrchen mittels Steriltechnik eine Lösung hinzugegeben, so daß die Kryoprotektoren, Dimethylsulfoxid und Glycerol, letztlich in einer Konzentration von 7% bzw. 5% vorliegen. Das Gefrierprogramm wird unmittelbar nach Einsetzen der Probe begonnen. Es wird das Gefrierprogramm Nummer 1 an dem Steuergerät des CryoMed Modellnummer 1010 benutzt.
Bei Anwendung dieser Technik liegt die zelluläre Lebensfähigkeit nach Einfrieren und schnellem Auftauen in einem 80ºC warmen Wasserbad über 90% ermittelt nach dem Ausschlußverfahren durch Trypan-Blau-Färbung. Außerdem lassen sich über 80% der ursprünglichen "colony forming unit culture" [CFU-C (entsprechen unipotenten Stammzellen der Granulo- und Monozytopoese; Anm. d. Übers.)] nach dem Gefrieren wiedergewinnen. Beispiele für Systeme zum Einfrieren von Knochenmark und biologischen Substanzen entsprechend einer vorberechneten Temperatur- und Zeitverlaufskurve werden in den US-Patenten Nr. 4.107.937 und 4.117.881 offengelegt. Vorzugsweise werden Knochenmarkzellen in der Flüssigphase von Flüssig- Stickstoff bei einer Temperatur von -196ºC aufbewahrt, einer Temperatur, bei der die gesamte Zellstoffwechselaktivität erloschen ist.
Nach dem Auftauen werden die Knochenmarkzellen einer Person wieder zugeführt oder erst reproduziert und dann wieder zugeführt.
Diese Erfindung hat mehrere Vorteile für einen Patienten, der eine Knochenmarktransplantation benötigt. Wenn der Patient/die Patientin seine bzw. ihre eigenen Zellen empfängt, so spricht man von einer autologen Transplantation. Die Wahrscheinlichkeit, daß ein solches Transplantat abgestoßen wird, ist sehr gering. Bei einer autologen Transplantation entfällt ein wichtiger Grund für eine Knochenmarktransplantatabstoßung, nämlich die "Graft-versus- Host"-Reaktion. Desweiteren können hämatopoetische Zellen, wenn in Kultur gezüchtet, leicht durch physikalische Maßnahmen und/oder Enzymbehandlung getrennt werden. Dies verringert das Risiko eines Gefäßverschlusses als Folge von Markemboli. Außerdem erlaubt diese Erfindung eine aggressivere Behandlung von neoplastischen Störungen mittels Chemotherapeutika und Bestrahlung. Derzeit sind diese Behandlungsformen wegen ihrer toxischen Wirkungen auf das Knochenmark in ihrem Umfang häufig beschränkt.

In-vitro-Knochenmark-Reproduktionssystem

Das Verfahren dieser Erfindung umfaßt den Schritt der Reproduktion von Knochenmarkzellen in vitro in einem System, das mit physiologischen Bedingungen vergleichbar ist. Die in diesem System reproduzierten Knochenmarkzellen schließen darüber hinaus alle Zellen mit ein, die in normalem Knochenmark vorkommen, vorausgesetzt, daß alle Zellarten in der ursprünglichen Knochenmark-Impfkultur (Inokulum) vorkamen.
Die Knochenmarkzellen, entweder direkt von dem Spender gewonnen oder der kryokonservierenden Lagerstätte entnommen, werden zunächst anhand von physikalischen Hilfsmitteln von ihrem Retikulum getrennt. Dann werden die Knochenmarkzellen in gemeinsamer Kultur mit Stromakomponenten von normalem Mark, umfassend Fibroblasten, Makrophagen, Retikulumzellen und Fettzellen, auf einem dreidimensionalen Träger gezüchtet. Ebenso zu der Kultur hinzugefügt werden können aus Medien von Milz- und/oder Leber- Makrophagen-Kulturen oder Teilmengen von Stromazellen abgeleitete Faktoren.
Wenngleich Knochenmarkzellen zu begrenztem Wachstum in der Lage sind, wenn sie alleine kultiviert werden, ist ein Langzeitwachstum dieser Kulturen nur dann möglich, wenn Stromazellen oder deren sekretorischen Produkte vorliegen. Siehe: Long-Term Bone Marrow Culture, Wright, D.G., und Greenberger, J.S., Hrsg., A. R. Liss, New York (1984).
Diese Erfindung sucht die Proliferation von multipotenten hämatopoetischen Stammzellen, die die Fähigkeit zur Wiederbesiedelung (Repopulation) von Knochenmark besitzen, in dem Falle zu maximieren, wo das Knochenmark durch eine konstitutionell vermittelte oder umwelt-vermittelte Krankheit oder durch die Behandlung einer solchen Krankheit mittels Chemotherapie und/oder Strahlentherapie zerstört worden ist. Stammzellen, die Mark-Wiederbesiedelungsaktivität aufweisen, bestehen, wie gezeigt wurde, in den Langzeit- Knochenmarkkulturen fort und vermehren sich in diesen. Progenitor-Zellen, hämatopoetische Stammzellen sowie hämatopoetische Vorstufen-Zellen vermehren sich und wuchern allesamt in dem System dieser Erfindung. Desweiteren kann eine Differenzierung in diesem System auf physiologische Weise weitergehen. Beispielsweise können erythroide, myeloide, lymphoide, macrophagozytäre und megakaryozytäre Kolonien fortlaufend in demselben Kultursystem heranwachsen bei Verwendung der Systeme, wie sie in dieser Erfindung gelehrt werden.
Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsart dieser Erfindung erfolgt die Züchtung hämatopoetischer Stammzellen wie folgt:

1. Aufbau der Stromaträgerschicht

Marksuspensionen werden 20 Minuten lang mit 3.000 x g zentrifugiert und das weiße Substrat aus Zellen umfassend Macrophagen, Fibroblasten, Fettzellen, mononuklearen Blutzellen, Retikulumzellen, Endothelzellen und andere residente Zellen wird entfernt. Die Zellen werden in einem Medium mit der Bezeichnung "Roswell Park Memorial Institute'-Medium Nr. 1640" oder einfach "RPMI 1640" suspendiert. Das Medium RPMI 1640 wird bezogen von GIBCO Incorporated of Grand Island, New York, USA. Das RPMI 1640 wird mit 10% Rinderfötusserum, 10% Pferdeserum, Hydrocortison-hemisuccinat und geeigneten Antibiotika ergänzt.
10&sup6; dieser Zellen werden auf ein steriles Nylonnetz von Tetko Corp. aus New York, New York, USA, in einer Petrischale ausplattiert. Dieses Netz wurde zuvor entsprechend den Innenmaßen eines 25-mm²-Kunststoff-Kulturkolbens zugeschnitten. Die Siebfläche des Netzes beträgt 400 um², der Faserdurchmesser 100 um.
Das geimpfte Netz wird aufgerollt und in den Kulturkolben, der 5 ml des zuvor beschriebenen Mediums enthält, plaziert. Das Netz entrollt sich in dem Kulturkolben und deckt den Boden des Kolbens vollkommen ab. Die Kulturen werden bei 37ºC in 5% CO&sub2; unter Umgebungsluft bei einer relativen Luftfeuchte von über 90% gezüchtet. Stromazellen, bei denen es sich überwiegend um Fibroblasten handelt, wachsen zunächst an den Nylonfasern entlang und um diese herum, bevor sie damit beginnen, in die Netzmaschen hineinzuwachsen. Dieser Prozeß dauert ungefähr 14 bis 18 Tage. Der Grad des Zusammenwuchses der Stromazellen sollte vor dem Beimpfen von hämatopoetischen Zellen dem in der Abbildung gezeigten entsprechen.
Suspendierte Stromazellen können gefrierkonserviert werden unter Anwendung derselben Technik wie zuvor für Knochenmarkzellen beschrieben. Zur Kryokonservierung von fast zusammengewachsenen Zellen auf dem Netz muß das Nylonnetz gerollt und in das Nunc-Röhrchen, das das Medium RPMI 1640 zusammen mit den Kryoprotektoren Dimethylsulfoxid und Glycerol in Endkonzentrationen von 5% bzw. 15% enthält, gegeben werden. Das Gefrieren der Stromazellen auf dem Netz kann mit einer Anfangskühlgeschwindigkeit von -1ºC/Minute in dem Bereich von +1ºC bis -40ºC erfolgen. Dann ist eine Kühlgeschwindigkeit von -2ºC bis -3ºC pro Minute optimal und wird bis Erreichen der letzten Temperaturstufe von -84ºC gewählt. Ungefähr 20% bis 25% der Stromazellen werden sich von dem Nylonnetz ablösen.

2. Beimpfen mit hämatopoetischen Zellen

Knochenmarkzellen werden in einem modifizierten Fischer-Medium oder McCoy-5A-Medium, ergänzt mit 5%-10% Rinderfötusserum und 5% bis 10% Pferdeserum, Vitaminen, Hydrocortison, Glutamin und Antibiotika, suspendiert. Bei diesen Zellen kann es sich entweder um Frischzellen oder um von einer zu einem früheren Zeitpunkt gefrierkonservierten und nun in einem 80ºC-heißen Wasserbad schnell aufgetauten Probe stammenden Zellen handeln. Es werden 2 bis 5·10&sup6; Zellen auf Maschenwerke mit fast zusammengewachsenen Stromazellen in 25-mm²-Kunststoffkulturkolben verimpft und bei 33ºC bis 34ºC unter Umgebungsluftbedingungen bei einem CO&sub2;-Gehalt von 5% gezüchtet. Die relative Luftfeuchte dieser Kulturen muß über 90% betragen. Nach 3 Tagen wird die Kultivierungstemperatur auf 35ºC bis 37ºC angehoben.
Hämatopoetische Zellen wachsen in den natürlichen Taschen, die durch die fast zusammengewachsenen Stromazellen gebildet werden, und die Progenitor-Zellen verbleiben in der adhärenten Zellschicht. Die adhärente Schicht wird aus den Zellen gebildet, die direkt an dem Maschenwerk haften oder die indirekt durch Ankopplung an Zellen gebunden sind, die selbst direkt an dem Maschenwerk haften. Nach 4 bis 5 Tagen zeigen sich reife Granulozyten, mononukleare Zellen und Erythrozyten in der nichtadhärenten Schicht, wie durch Zytospin-Darstellung festgestellt. Nach 7 bis 10 Tagen zeigen sich zahlreiche hämatopoetische Kolonien, die morphologisch CFU-C ("colonyforming unit culture"), Mischkolonien und Lymphoidkolonien entsprechen, in den Zwischengitterplätzen. Megakaryozytäres Wachstum ist beschränkt, kann jedoch auch in dieser Matrix beobachtet werden. Eine durchschnittliche Kultur wird 450 bis 950 CFU-C pro Woche ergeben.
Kulturen, die aus Stromazellen und hämatopoetischen Zellen bestehen, die von ein und derselben Person gewonnen wurden (autolog), müssen zweimal pro Woche gespeist werden. Kulturen, die aus dem Knochenmark eines Patienten bestehen, das auf ein von einer (oder mehreren) anderen Person(en) stammendes Stromazellen-Maschenwerk verimpft worden ist (allogen), müssen dreimal pro Woche gespeist werden, um einen angemessenen Rückgang der Besiedlungsdichte von reifen immunkompetenten Zellen in der nichtadhärenten Schicht sicherzustellen.

3. Veränderungen in dem In-vitro-Knochenmark-Reproduktionssystem

Förderung des Wachstums von Stromazellen des Knochenmarks

Der primäre geschwindigkeitsbeschränkende Faktor beim Wachstum von Stromazellen des Knochenmarks ist der relativ niedrige Mitoseindex der Fibroblasten, die sich unter den Knochenmark-Stromazellen befinden. Das Wachstum dieser Zellen und deren Ablagerung von extrazellulären Matrixkomponenten kann gefördert werden durch Zugabe von: 1.) Hydrocortison-hemisuccinat und/oder 2.) selbstregulierenden Wachstumsfaktoren, abgeleitet aus dem Medium aus kultivierten, von menschlichen Föten stammenden Fibroblasten, die eine hohe Zellteilungsrate aufweisen.
Auch die Anheftung und das Wachstum von Fibroblasten an bzw. auf dem Maschenwerk kann gefördert werden, und zwar durch: 1.) Vorbeschichten des Maschenwerkes mit solubilisiertem Kollagen Typ I-IV oder 2.) Verwendung eines mit Kollagen beschichteten oder in Kollagen eingebetteten Maschenwerkes, wobei das Kollagen ausgeschieden wurde von von humanen Föten oder von Erwachsenen stammenden Fibroblasten (im folgenden "wachstumsfördernde Fibroblasten" bezeichnet), die nach ihrer Fähigkeit, bestimmte Kollagenarten zu synthetisieren, unterteilt werden. Hierbei werden die wachstumsfördernden Fibroblasten durch geringfügige Trypsinisierung mit Beginn des Zusammenwachsens (5 bis 7 Tage im Falle der von menschlichen Föten stammenden Fibroblasten und 14 bis 18 Tage im Falle der von Erwachsenen stammenden Fibroblasten) von dem Maschenwerk abgehoben und können nun entweder 1.) mit Stromazellen des Knochenmarks wie zuvor beschrieben beimpft oder 2.) zur späteren Verwendung gefrierkonserviert werden.
In einer Ausführungsart dieser Erfindung werden wachstumsfördernde Fibroblasten, die Kollagen synthetisieren, sowie andere extrazelluläre Matrixkomponenten auf einem Maschenwerk solange kultiviert, bis sie fast zusammengewachsen sind. Dann wird ein Gemisch aus hämatopoetischen Zellen und Stromazellen des Knochenmarks auf dem Maschenwerk aus fast zusammengewachsenen wachstumsfördernden Fibroblasten verimpft.
Die Verfahren der Kultivierung, Teilmengenbildung ("subsetting") und Kryokonservierung von wachstumsfördernden Fibroblasten sind im folgenden beschrieben:

a. Kultivierung von wachstumsfördernden Fibroblasten

Fibroblasten werden in RPMI 1640 gezüchtet, das mit 2-10% Rinderfötusserum oder 2-10% Pferdeserum, versetzt mit 1 ug/ml Hydrocortisonhemisuccinat und 2 ug/ml Gentamycin, Penicillin, Streptomycin und Fungizon, ergänzt wird. Die Kultivierung erfolgt in Umgebungsluft mit 5% CO&sub2;-Gehalt bei 37ºC und einer relativen Luftfeuchte von über 90%.

b. Bildung von Tellmengen von wachstumsfördernden Fibroblasten

5,0·10&sup6; aus dem Leukozytenfilm in zentrifugiertem Blut aus einer Knochenmark-Suspension gewonnene Fibroblasten, dermale Fibroblasten oder aus der Leber von Leichen stammende Fibroblasten werden in die Vertiefungen (1 mm²) von Mikrotiter-Platten ausgestrichen und bis kurz vor dem Zusammenwachsen kultiviert. Diese Zellen werden aus den Kulturvertiefungen durch wiederholtes Waschen, üblicherweise 4 bis 5 Vorgänge mit ausgewogener Hank-Salzlösung ohne Ca&spplus;&spplus; oder Mg&spplus;&spplus;, herausgelöst. Die auf den Mikrotiter-Platten zu rückbleibende Matrix wird mittels indirekter Immunfluoreszenz unter Einsatz von monoklonalen Antikörpern gegen verschiedene Matrixkomponenten und fluoreszeinisothiocyanat-markiertem, vom Kaninchen stammendem Anti-Maus-Immunglobulin G untersucht, um sich der vorhandenen Kollagentypen zu vergewissern. Die suspendierten Zellen werden mit monoklonalen Antikörpern gegen Kollagen Typ 1-Typ 4, Elastin, Tropoelastin und Fibronectin behandelt, um Subpopulationen von Zellen zu isolieren, die in der Lage sind, jedes Produkt zu synthetisieren. Diese Zellen werden mit Meerschweinchen-Komplement behandelt, die solche Zellen schädigen oder zerstören, an die sich monoklonale Antikörper angedockt haben. Die lebensfähigen Zellen werden erneut in die Vertiefungen von Microtiter-Platten ausgestrichen, wie zuvor beschrieben, bis unmittelbar vor dem Zusammenwachsen kultiviert und abgelöst. Sodann wird der Wirkungsgrad des Isolationsverfahrens durch Untersuchung der von diesen Zellen ausgeschiedenen Matrix mit monoklonalen Antikörpern und indirekter Immunofluoreszenz überprüft.
Für ein optimales Wachstum von hämatopoetischen Zellen sollte die Matrix Kollagen vom Typ III, Typ IV und Typ I in einem Verhältnis von ungefähr 6 : 3 : 1 enthalten.

c. Kryokonservierung von wachstumsfördernden Fibroblasten

Wachstumsfördernde Fibroblasten können anhand derselben Verfahren wie zuvor für Stromazellen beschrieben gefrierkonserviert werden. Wie die Stromazellen werden sich einige der wachstumsfördernden Fibroblasten während des Einfrierens auch von dem Maschenwerk ablösen. Diese Matrix wirkt jedoch noch mit an der Anheftung von Stromazellen des Knochenmarks und reduziert somit die Zeitspanne, die zur Errichtung einer für das Wachstum von hämatopoetischen Zellen förderlichen Matrix erforderlich ist.

Beimpfung mit mononuklearen Zellen

Um das Langzeit-Wachstum von Knochenmark-Kulturen zu fördern, werden mononukleare Zellen des peripheren Bluts aus einer heparinisierten Suspension präpariert unter Verwendung von Ficoll-hypague oder Percoll. Zellen des peripheren Bluts sowie hämatopoetische Zellen des Knochenmarks werden von ein und derselben Person gewonnen (autolog). Diese Zellen sollte durch Venenpunktion gewonnen und während der Zeit der Entnahme der Knochenmarkprobe gefrierkonserviert werden. Zusätzliche Zellen des peripheren Bluts könnten bei Bedarf dem erkrankten Patienten während des Kultivierungsverfahrens entnommen werden. Besteht jedoch der Verdacht auf eine metastasierende Krankheit, dann muß die Probe zunächst gereinigt werden, wie zuvor erwähnt.
5·10&sup5; bis 10&sup6; mononukleare Zellen (die Monozyten-Subpopulation ist für diesen Schritt der bevorzugte Zelltyp innerhalb der mononuklearen Zellschicht) werden 4 bis 5 Tage vor der ersten Impfung mit hämatopoetischen Zellen des Knochenmarks und danach alle drei Wochen auf Maschennetze verimpft. Dieses Verfahren bewirkt eine Verbesserung der Hämatopoese um 10% bis 13%, wie durch wöchentliche Nachprüfung festgestellt.

Fortbestehen der Kultur und Anlegen von Progenitorzellbanken

In unserem Experiment wird die Hämatopoese durch Kulturen zusammenfließender Stromazellen nicht oder bestenfalls geringfügig gefördert. Unbegrenztes Wachstum von humanen hämatopoetischen Progenitor-Zellen ist möglich, wenn sie mit den notwendigen stroma-abgeleiteten Wachstums-/ Regulatorfaktore n versorgt werden.
So wird zum Beispiel die Ausgangs-Markprobe in eine Anzahl von Aliquoten mit jeweils ungefähr 10&sup6; hämatopoetischen Zellen aufgeteilt. Jede davon wird auf ein Maschenwerk mit fast zusammengewachsenen Stromazellen verimpft. Die Kulturen werden durch direkte Betrachtung mit einem Umkehrphasen-Mikroskop und differentielle Zählung der nichtadhärenten Zellen wie in dem Zytospin-Präparat zu sehen nach jeder Speisung überwacht. Vor Einsetzen des Ineinanderfließens werden die Kulturen mit Kollagenase behandelt und für ca. 6 bis 10 Minuten einer leichten Ultrabeschallung ausgesetzt. Hämatopoetische Zellen und Stromazellen werden anhand von Dichtegradienten- Verfahren getrennt. Die hämatopoetischen Zellen werden mit einem Hämazytometer ausgezählt, und ungefähr 50% werden gefrierkonserviert, wie zuvor bereits beschrieben. Die verbleibenden 50% der hämatopoetischen Zellen werden in aliquote Teile von jeweils rund 10&sup6; Zellen aufgeteilt und auf Kulturen fast zusammengewachsener Stromazellen verimpft, die gleichzeitig, versetzt zueinander, gezüchtet werden. Sobald diese beginnen, zusammenzuwachsen, wird dasselben Verfahren durchgeführt.
Dieses Verfahren: 1.) setzt das Wachstum von hämatopoetischen Zellen auf unbegrenzte Zeit fort durch Bieten eines Kleinmilieus, das die erforderlichen Wachstumsfaktoren hervorbringt, und 2.) bildet eine kontinuierliche Bank, auf der hämatopoetische Progenitor-Zellen deponiert werden können, bis die für eine Transplantation geeigneten Mengen erreicht sind.

Modulation des Wachstums hämatopoetischer Zellen mit Zellprodukten

Verfahren, die verschiedenen zellulären Komponenten von menschlichem Knochenmark separat in Subkulturen zu kultivieren, gehören zum derzeitigen Stand der Technik. Makrophagen, Retikulumzellen, Fettzellen und Fibroblasten können getrennt gezüchtet werden, und deren jeweilige sekretorische Aktivität kann durch Behandlung mit verschiedenen Mitteln modifiziert werden. Auf die Modulation der Aktivität von Fibroblasten wurde bereits eingegangen.
Auch die Hämatopoese in Langzeit-Kulturen von menschlichem Knochenmark auf dem dreidimensionalen Maschenwerk kann durch Ausscheidungen von extramedullären Makrophagen (Kupffer-Zellen) moduliert werden, wenn in Kultur herangezogen, wie im folgenden beschrieben. Kupffer-Zellen werden von ihrem Organstroma nach Pronase-Aufschluß getrennt. Kurz, Gewebeproben werden 1 Stunde lang in Pronase-Lösung [0,2% Pronase (Calbiochem) und Gey-Salzlösung (Gey's Balanced Salt Solution)] unter leichtem Rühren inkubiert. Der pH-Wert der Lösung wird auf 7,3 bis 7,5 mit 1 N NaOH gehalten. Deoxyribonuclease (0,5 mg) (Calbiochem) wird während des obigen Verfahrens in 30-minütigen Intervallen hinzugegeben, und die resultierende Zellsuspension wird gefiltert und 10 Minuten lang mit 350 x g zentrifugiert. Das Pellet wird in Gey-Salzlösung resuspendiert, und die litoralen Zellen (Macrophagen und Endothelzellen) werden mit Hilfe eines Percoll-Gradienten (Pharmacia) von den Zelltrümmern und den reifen Blutzellen getrennt. Die resultierende Zellfraktion wird 3·3 Minuten gewaschen mit einem modifizierten Dulbecco-Medium, angereichert mit 10% fetalem Rinderserum, und auf Kunststoffkulturschalen in einer Menge von 3 bis 4·10&sup6; Zellen ausplattiert.
Nach eintägiger Inkubation werden die nichtadhärenten Zellen durch Waschen mit dem Kulturmedium entfernt und werden die adhärenten Zellen bei 33ºC in einem Gasgemisch bestehend aus Raumluft mit einem CO&sub2;-Gehalt von 6% bei über 80% relativer Luftfeuchte gehalten. Die Wachstums- und/oder sekretorische Aktivität dieser Zellen kann stimuliert werden durch: 1.) Veränderung des CO&sub2;/O&sub2;-Verhältnisses, 2.) Behandlung der Kulturen mit Latex-Perlen, 3.) Behandlung der Kulturen mit Siliziumdioxid, 4.) Versetzen des Mediums mit Prostaglandin E&sub2;, E&sub1; oder F2α, 5.) Ergänzen des Mediums mit Interleukin 1 oder Interleukin 2. Makrophagen-Sekretionsprodukte können durch diese Verfahren/Agenzien moduliert werden.
Das mit den Sekretionsprodukten dieser Macrophagen konditionierte Medium kann verwendet werden, um das erythropoietische/granulopoietische Verhältnis in Langzeit-Knochenmarkkulturen mehr oder weniger so zu ergänzen, wie es in vivo vorkommt.
Das Verfahren dieser Erfindung bietet dem Patienten, der eine Knochenmarktransplantation benötigt, mehrere Vorteile.

Einsatz des In-vitro-Knochenmark-Reproduktionssystems zur Überwachung des Zustandes eines Patienten

Bei einem an einer metastasierenden Krankheit (z. B. Krebs) oder anderen Krankheit leidenden Patienten ist es häufig sinnvoll, den Zustand des Patienten durch Aspiration einer Knochenmarkportion des Patienten und Untersuchung dieser Probe zu überwachen. Auf diese Weise kann eine Metastase oder ein Wiederauftreten festgestellt werden, bevor dies klinisch erkennbar ist. Patienten mit anderen Zuständen, die durch Untersuchung von Knochenmarkzellen erkennbar sind, können ebenso auf diese Weise überwacht werden.
Die Langzeit-Kultivierung von Zellen in einer aspirierten Knochenmarkprobe mit Hilfe des Knochenmark-Reproduktionssystems dieser Erfindung erhöht die Wahrscheinlichkeit, daß klonale metastatische Zellen und hämatopoetische Zellen mit Chromosomenaberrationen erkannt werden. Diese Zellen können einer Erkennung in einem herkömmlichen Abstrich von frisch aspiriertem (nicht kultiviertem) Knochenmark entgehen.

Einsatz des In-vitro-Knochenmark-Reproduktionssystems im zytotoxischen System

Die Zytotoxizität von pharmazeutischen Erzeugnissen, antineoplastischen Wirkstoffen, Carzinogenen, Lebensmittelzusätzen und anderen Substanzen in bezug auf das Knochenmark läßt sich mit Hilfe des In-vitro-Knochenmark- Reproduktionssystems dieser Erfindung testen.
Zunächst werden stabile, wachsende Kulturen von Knochenmarkzellen (Stromazellen und hämatopoetische Zellen eingeschlossen) angelegt. Dann werden die Kulturen verschiedenen Konzentrationen der Testsubstanz ausgesetzt. Nach Inkubation mit den Testsubstanzen werden die Kulturen phasenmikroskopisch untersucht, um die höchstzulässige Dosis zu ermitteln - die Konzentration der Testsubstanz, bei der die ersten morphologischen Anormalitäten auftreten. Zytotoxizitätstests können mit Hilfe einer Vielzahl von supravitalen Farbstoffen durchgeführt werden, um die Zell-Lebensfähigkeit in diesem dreidimensionalen System zu beurteilen, unter Anwendung von Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Die Ermittlung der höchstzulässigen Dosis liefert einen Konzentrationsbereich für weitere Tests.
Sobald ein Testbereich festliegt, werden verschiedene Konzentrationen der Testsubstanz auf ihre Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit, das Wachstum und/oder die Morphologie der verschiedenen Zelltypen, die zusammen die Knochenmarkkultur ergeben, unter Einsatz von Mitteln, die dem Fachmann wohlbekannt sind, untersucht.
Andere dreidimensionale Zellkultursysteme wie in dieser Erfindung offengelegt können für einen Einsatz in Zytotoxizitätstests herangezogen werden.

Errichtung eines dreidimensionalen Zellkultursystems

Diese Erfindung enthüllt ein dreidimensionales lebendes Stromagewebe und dessen Verwendung als Rahmen für ein dreidimensionales mehrschichtiges Zellkultursystem. In Gewebekulturen, wie man sie früher kannte, wurden die Zellen in einer Schicht (Monolayer) gezüchtet. Das US- Patent Nr. 3.997.396 beschreibt ein Verfahren zur Fortpflanzung und Erhaltung von Zellen der Außenoberfläche einer Hohlfaser-Membran. Die auf einem dreidimensionalen lebenden Stromagewebe entsprechend dieser Erfindung gezüchteten Zellen wachsen in mehreren Schichten und bilden eine zelluläre Matrix. Dieses dreidimensionale Zellkultursystem nähert sich den in vivo vorzufindenden physiologischen Bedingungen eher an als früher beschriebene Monolayer-Gewebekultursysteme. In einer Ausführungsart dieser Erfindung kann das dreidimensionale Zellkultursystem auf oder in einen lebenden Organismus übertragen werden.
Die dreidimensionale lebende Stroma((zellkultur; ergänzt vom Übers.)) kann auf jedem beliebigen dreidimensionalen biokompatiblen nichtlebenden Trägermaterial gezüchtet werden, das: 1.) es Zellen gestattet, sich an ihm anzuheften (oder das so modifiziert werden kann, daß es Zellen gestattet, sich an ihm anzuheften), und 2.) es Zellen gestattet, in mehr als einer Schicht zu wachsen. In einer bevorzugten Verkörperung dieser Erfindung handelt es sich bei dem dreidimensionalen Träger um ein Maschenwerk.
Die Anwendbarkeit dieses dreidimensionalen Zellkultursystems auf Knochenmarkzellen, Hautzellen oder Leberzellen oder jede andere Art von Zellen und Geweben ist vorgesehen. Ein dreidimensionales Hautzellen-Kultursystem beispielsweise wird wie folgt hergestellt:
1. Man ermöglichst es Fibroblasten, sich an ein Maschenwerk anzuheften, und läßt sie 7 bis 9 Tage lang wachsen, wobei Kollagen vom Typ I und vom Typ III ausgeschieden wird, wie zuvor im Zusammenhang mit den wachstumsfördernden Fibroblasten beschrieben, die in den In-vitro-Knochenmark-Reproduktionssystemen eingesetzt werden;
2. Es werden Melanozyten auf das behandelte Maschenwerk ausplattiert, wo sie 5 Tage lang wachsen dürfen;
3. Kurz vor dem Zusammenwachsen werden die Melanozyten mit Keratinozyten beimpft.

Claims

1. Ein in vitro hergestelltes, Stromazellen und von den Stromazellen ausgeschiedene Bindegewebsproteine umfassendes dreidimensionales lebendes Stromagewebe, gezüchtet auf einem biokompatiblen nichtlebenden dreidimensionalen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß die Stromazellen auf dem Träger so festhaften und den Träger so umschließen, daß eine dreidimensionale Struktur entsteht.

2. Das lebende Stromagewebe gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Stromazellen um Fibroblasten handelt.

3. Das lebende Stromagewebe gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Stromazellen um eine Kombination aus Fibroblasten und Endothelzellen, Makrophagen, Retikulumzellen, mononukleären Blutzellen oder Fettzellen handelt.

4. Das lebende Stromagewebe gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit Kollagen vorbeschichtet ist.

5. Das lebende Stromagewebe gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Träger um ein Netz handelt.

6. Das lebende Stromagewebe gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Netz aus Nylon besteht.

7. Eine dreidimensionale Zellkultur umfassend auf einem lebenden Stromagewebe gemäß einem der vorgenannten Ansprüche kultivierte Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Zellen um Knochenmarkzellen, Hautzellen oder Leberzellen handelt.

8. Eine dreidimensionale Knochenmarkkultur umfassend auf einem lebenden Stromagewebe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 kultivierte blutbildende Zellen.

9. Eine dreidimensionale Hautkultur umfassend auf einem lebenden Stromagewebe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 kultivierte Melanozyten und Keratinozyten.

10. Die dreidimensionale Hautkultur gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Stromazellen zusammenwachsend sind.

11. Eine dreidimensionale Leberkultur umfassend auf einem lebenden Stromagewebe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 kultivierte Leberzellen.

12. Ein Verfahren zur In-vitro-Kultivierung von Zellen, umfassend:

(a) Beimpfen von lebendem Stromagewebe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 mit Knochenmarkzellen, Hautzellen oder Leberzellen;

und

(b) Kultivieren des beimpften lebenden Stromagewebes, so daß die beimpften Zellen wachsen.

13. Ein Verfahren zur In-vitro-Kultivierung von Knochenmarkzellen, umfassend:

(a) Beimpfen von lebendem Stromagewebe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 mit blutbildenden Zellen;

und

14. Ein Verfahren zur In-vitro-Kultivierung von Hautzellen, umfassend:

(a) Beimpfen von lebendem Stromagewebe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 mit Melanozyten und Keratinozyten;

und

15. Das Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem lebenden Stromagewebe um zusammenwachsende Stromazellen handelt.

16. Ein Verfahren zur In-vitro-Kultivierung von Leberzellen, umfassend:

(a) Beimpfen von lebendem Stromagewebe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 mit Leberzellen;

und

17. Die Verwendung von in vitro kultivierten Knochenmarkzellen, Hautzellen oder Leberzellen zur Herstellung eines Transplantats; dadurch gekennzeichnet, daß das Kultivieren folgendes umfaßt:

und

18. Die Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei die Zellen der Transplantation von Knochenmarkzellen gewonnen durch Invitro-Kultivierung von blutbildenden Zellen dienen, so daß die blutbildenden Zellen wachsen.

19. Die Verwendung von Hautzellen gemäß Anspruch 17, gewonnen durch In-vitro-Kultivierung von Melanozyten und Keratinozyten, so daß die Melanozyten und Keratinozyten wachsen.

20. Die Verwendung von Leberzellen gemäß Anspruch 17, gewonnen durch In-vitro-Kultivierung von Leberzellen zur Herstellung eines Transplantats.

21. Die Verwendung von lebendem Stromagewebe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Transplantats.

22. Ein Verfahren zur Prüfung der Zytotoxität einer Testsubstanz, umfassend:

(a) Aufbringen der Testsubstanz auf eine dreidimensionale Zellkultur, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der dreidimensionalen Zellkultur um Knochenmarkzellen, Hautzellen oder Leberzellen handelt, gezüchtet auf einem lebenden Stromagewebe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6;

und

(b) Ermitteln der Wirkung der Testsubstanz durch Beobachten von etwaigen Änderungen in den Zellen.

23. Das Verfahren zur Prüfung der zytologische Wirkung einer Testsubstanz gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Zellen um blutbildende Zellen handelt.

24. Das Verfahren zur Prüfung der Zytotoxität einer Testsubstanz gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Zellen um Melanozyten und Keratinozyten handelt.

25. Das Verfahren zur Prüfung der Zytotoxität einer Testsubstanz gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Zellen um Leberzellen handelt.

26. Ein Verfahren zum Nachweis von metastatischen Zellen, umfassend:

(a) Gewinnen einer Knochenmarkzell-, Hautzell- oder Leberzellprobe;

(b) Beimpfen eines lebenden Stromagewebes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 mit Zellen aus der Probe;

(c) Kultivieren das beimpften lebenden Stromagewebes in einem Nährmedium, so daß die beimpften Zellen wachsen;

und

(d) Ermitteln des Vorhandenseins von metastatischen Zellen in der gezüchteten Zellkultur.

27. Das Verfahren zum Nachweis von metastatischen Zellen gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Zellen um blutbildende Zellen handelt.

28. Das Verfahren zum Nachweis von metastatischen Zellen gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Zellen um Melanozyten und Keratinozyten handelt.

29. Das Verfahren zur Diagnose einer Chromosomenanomalie gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Zellen um Leberzellen handelt.

30. Ein Verfahren zur In-vitro-Herstellung eines Stromazellen und von den Stromazellen ausgeschiedene Bindegewebsproteine umfassenden, dreidimensionalen lebenden Stromagewebes, beinhaltend das Züchten des Stromagewebes auf einem biokompatiblen nichtlebenden dreidimensionalen Träger, wobei die Stromazellen auf dem Träger so festhaften und den Träger so umschließen, daß eine dreidimensionale Struktur entsteht.

31. Das Verfahren gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Stromazellen um Fibroblasten handelt.

32. Das Verfahren gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Stromazellen um eine Kombination aus Fibroblasten und Endothelzellen, Makrophagen, Retikulumzellen, mononukleären Blutzellen oder Fettzellen handelt.

33. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit Kollagen vorbeschichtet ist.

34. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Träger um ein Netz handelt.

35. Das Verfahren gemäß Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß das Netz aus Nylon besteht.