DE69933057T2

DE69933057T2 - Analoge des humanen basischen fibroblasten-wachstumsfactors

Info

Publication number: DE69933057T2
Application number: DE69933057T
Authority: DE
Inventors: A. Barry Wilmington SPRINGER; W. Michael Avondale PANTOLIANO; M. Celia Doylestown SHARP
Original assignee: Ortho McNeil Pharmaceutical Inc
Current assignee: Janssen Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2019-12-23
Also published as: EP1248844B1; DE69933057D1; EP1248844A1; AU2376000A; WO2001046416A1; ES2275361T3; EP1248844B8

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Identifizierung von neuen Muteinen eines Human-Basis-Fibroblast-Wachstumsfaktors, die ungewöhnlich starke Stimulatoren für die Zellteilung darstellen.
2. Beschreibung des verwandten Standes der Technik
Fibroblast-Wachstumsfaktoren (FGFs) stellen eine bei der Evolution konservierte große Familie von mitogenen Proteinen dar, welche die Mitose bei der Bildung von mesodermalen und neuroektodermalen Zelllinien stimulieren (C. Basilico und D. Moscatelli, „Advances in Cancer Research" 59: 115 – 165, Eds. G. F. Vande Woude und G. Klein (1992)). Diese Proteine binden auch Heparin und werden in der Literatur häufig als Heparin bindende Wachstumsfaktoren (HBGFs) bezeichnet. Die Familienmitglieder haben gemeinsam einen hohen Grad der Nucleinsäure- und Aminosäure-Sequenz-Homologie.
Komplementäre DNA-Klone, die Basis-FGFs (bFGFs), ein Mitglied der FGF-Familie codieren, wurden bereits isoliert und sequenziert. Das Protein weist, wie gefunden wurde, eine 89- bis 95 %ige Aminosäure-Identität unter mehreren Species einschließlich Menschen, Rindern und Ratten auf (Xenopus bFGF divergiert stärker und weist eine 80 %ige Homologie mit Human-bFGF auf). Dieser Grad der Konservie rung lässt vermuten, dass alle Regionen des Proteins funktionell wichtig sein können. Bei Menschen wird bFGF in vier Formen exprimiert: (1) in einer 18-kDa-Form (155 Aminosäuren), die von einem AUG-Codon initiiiert wird; (2), (3) und (4), bei denen es sich jeweils handelt um die 22-, 22,5- und 24 kDA-Formen, und die alle von den CUG-Codonen initiiert sind, die resultieren in N-terminalen Extensionen variierender Längen, bezogen auf die 18 kDa-Form (R. Z. Florkiewicz und A. Sommer, „Proc. Natl. Acad. Sci." (USA) 86: 3978 – 3981 (1989); H. Pratts, et al. „Proc.Natl. Acad. Sci." (USA) 86: 1836 – 1840 (1988)). Obgleich die verschiedenen Formen von bFGF in verschiedenen Abschnitten der Zellen lokalisiert sind, gibt es darüber hinaus nur begrenzte Informationen in Bezug auf die funktionelle Bedeutung dieser subzellularen Lokalisierung. Die biologische Aktivität von bFGF auf Zellen bei der Transduktion wird bewirkt durch eine Signal-Transduktion nach der Zellenoberflächen-Bindung an einen FGF-spezifischen Rezeptor und an Heparinsulfat-Proteoglycane (D. Moscatelli, „J. Cell Physiology." 131: 123 – 130 (1987)). In allen bisher untersuchten Geweben wird bFGF, wie gefunden wurde, exprimiert, was vielleicht sein breites Spektrum von mitogener Aktivität wiedergibt.
Aufgrund seiner Fähigkeit, die Proliferation einer großen Vielzahl von Zell-Typen zu stimulieren, spielt bFGF eine signifikante Rolle bei vielen biologischen Prozessen: (1) bei der Angiogenese (J. Folkman und M. Klagsbrum, „Science" 235: 442 – 447 (1987); (2) bei der Wundheilung (J. Slavin, „J. Pathology" 178: 5 – 10, 1996; G. S. McGee et al., „J Surg. Research", 45: 145 – 153 (1988); (3) bei der Embryogenese (D. Kimelman et al., „Science" 242: 1050 – 1056 (1988); J. M. Herbert et al., „Dev. Biol." 138: 454 – 463 (1990), und (4) bei der Tumorgenese (R. Ulrich et al., „Cancer Cell" 3 (8): 308 – 311 (1991); M. Nguyen et al., „J. Natl. Cancer. Inst." 86 (5): 356 – 361 (1994); J. A. Wright, et al., „Crit. Rev. Oncogenesis" 4 (5): 473 – 492 (1993)). Es gibt auch ein Anzeichen dafür, dass bFGF für die Behandlung der cerebralen Ischämie therapeutisch verwendet werden kann (M. K. Lyons et al., „Brain Research" 558: 315 – 320 (1991); N. Koketsu et al., „Annals Neurology" 35(4): 451 – 457 (1994), für die Behandlung des cerebralen Aneurysmus (K. Futami, et al. „Stroke" 26 (9): 1649 – 1654 (1995), und bei einer Nervenschädigung (A. Logan und M. Berry, „TIPS" 14: 337 – 343 (1993); F. P. Eckenstein, „J. Neurobiology" 25 (11): 1467 – 1480 (1994); F. Gomez-Pinilla et al., „J. Neuroscience" 15 (3): 2021 – 2029 (1995)), zusätzlich zu seinem therapeutischen Potential bei der Behandlung von Gefäßerkrankungen (J. L. Richard et al., „Diabetes Care" 18 (1): 64 – 69 (1995); V. Lindner et al., „J. Clin. Invest." 85: 2004 – 2008 (1990); D. F. Lazarous et al., „Circulation" 91 (1): 145 – 153 (1995)) und für die Behandlung von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren (J. Folkman et al., „Ann. Surg." 214 (4): 414 – 427 (1991); S. Szabo et al., „Scand J. Gastroenterology", 30 Suppl., 208: 3 – 8 (1995); M. Kitijima et al., „Microvasc. Research" 50: 133 – 138 (199); S. Kusstatscher et al., "J. Pharm. Exp. Therapeutics" 275: 456 – 461 (1995); S. Sazbo et al., „Gastroenterology" 106: 1106 – 1111 (1994); S. J. Konturek et al., „Gut" 34: 881 – 887(1993) verwendet werden kann.
Zum besseren Verständnis dieses weit verbreiteten, biologisch signifikanten Ligand-Rezeptor-Systems hat sich die Grundlagenforschung auf diesem Gebiet fokussiert auf die Aufklärung der Beziehung zwischen der bFGF-Proteinstruktur und ihrer Funktion. Frühe Strukturstudien, in denen synthetische Peptide verwendet wurden, die unterschiedlichen Regionen des bFGF-Proteins entsprechen, dienten dazu, die Heparin-Bindungs- und Rezeptor-Bindungs-Regionen des Proteins grob zu kartieren (Baird et al., „Proc.Natl. Acad Sci. (USA)" 85: 2324 – 2328 (1988); Baird et al. „J. Cell Phys. Suppl." 5: 101 – 106 (1987)). Vor kurzem wurden Röntgenkristallographie-Studien mit hoher Auflösung (Zhu et al., „Science" 252: 90 – 93 (1991); Zhang et al., „Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)" 88: 3446 – 3450 (1991); Eriksson et al., „Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)" 88: 3441 – 3445 (1991)) angewendet bei Struktur-basierten Stellengerichteten Mutagenese-Analysen (Thompson et al. „Biochemistry" 33 (13): 3831 – 3840 (1994); Springer et al., „J Bio. Chem." 269 (43): 26879 – 2688 (1994)) und bei der biophysikalischen Charakterisierung der Wechselwirkungn zwischen bFGF und dem bFGF-Rezeptor und Heparin (Pantoliano et al., „Biochemistry" 33: 10229 – 10248 (1994)), um die funktionellen Domänen des Proteins weiter zu definieren.
Die Untersuchungen von Thompson et al., Springer et al. und Pantoliano et al. haben das Folgende gezeigt: (1) die primäre Rezeptor-Bindungs-Domäne (Stelle 1) ist eine diskontinuierliche Domäne, wobei wichtige Kontaktpunkte die Aminosäuren Y24, R44, N101, Y103, L140 und M142 sind, die einem Lösungsmittel ausgesetzt werden; (2) eine sekundäre Rezeptor-Bindungs-Domäne (Stelle 2) (eine etwa 250-fach schwächere Bindung) ist wichtig für die bFGF-Mitogenizität und umfasst die Aminosäuren 106 – 115, die einen 1β-Schleifen-Typ bilden; und (3) die Heparin-Bindungs-Domäne, die ebenfalls eine diskontinuierliche Domäne ist, deren Schlüssel-Aminosäuren K26, N27, R81, K119, R120, T121, Q123, K125, K129, Q134 und K135 darstellen (es sei darauf hingewiesen, dass die Buchstaben/Ziffern-Bezeichnungen dem Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code mit nachfolgender Angabe der Position in der linearen Aminosäure-Sequenz für bFGF entsprechen, wie von Zhang et al., 1991, beschrieben).
Ein gängiges Modell der bFGF-Wirkung schlägt vor, dass sich der monomere Ligand bFGF an seinen Zellenoberflächen-Rezeptor bindet über die Domäne mit hoher Affinität (Stelle 1) und die Domäne mit niedriger Affinität (Stelle 2), was zu einer Rezeptor-Dimerisierung und einer Signal-Transduktion führt. Die Heparin-Bindung, die bekanntlich wichtig ist für die bFGF-Aktivität, fördert, wie angenommen wird, die Stelle 2-Bindung an den Rezeptor (Pantoliano et al., „Biochemistry" 33: 10229 – 10248 (1994)).
Die Aminosäure-Sequenz von bFGF vom Wild-Typ ist in mehreren Publikationen beschrieben: beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5 155 214; 4 994 559; 5 439 818; 5 604 293; in der Europäischen Patentpublikation Nr. EP 0 237 966 A2 , um nur einige wenige zu nennen.
Eine Struktur/Funktions-Information ist nützlich für die Untersuchung der biologischen Aktivität von Varianten der bFGF-Protein-Sequenz. Infolgedessen besteht ein großes Interesse an der Erzeugung neuer Muteine von bFGF für die Untersuchung. So wurde beispielsweise über Analoga berichtet, in denen mindestens eine Aminosäure substituiert ist, die vorzugsweise gerichtet sind auf Cys-, Asp-, Arg-, Gly- und Val-Reste (Internationale WO-Publikationen Nr. 91/09126). In einer anderen Publikation ist ein Ersatz-Mutein beschrieben, in dem mindestens ein Cystein-Rest durch eine andere Aminosäure substituiert ist, und Deletions-Mutationen, in denen entweder 41 Aminosäuren ab dem Amino-Terminus fehlen, oder 61 Aminosäuren ab dem Carboxyl-Terminus fehlen (US-Patent Nr. 5 478 740). Mutationen in Bezug auf die Heparin-Bindungs-Domäne von Human bFGF sind bekannt dafür, dass sich ihre biologische Aktivität ändert (Heath et al., „Biochemistry" 30 (22): 5608 – 5615 (1991)), und die weitgehend konservierten Arg 40- und Arg 45-Reste sind erforderlich für die Stabilität und Mitogenizität von bFGF (Arakawa et al., „J. Protein Chemistry" 14 (5): 263 – 274 (1995)). Zusätzlich wurde über Analoga mit verbesserter Stabilität berichtet, in denen zwei oder drei Aminosäuren addiert, deletiert oder substituiert sind, wobei eine Serin-Substitution bevorzugt ist für die Cystein-Reste (Europäische Patentpublikation Nr. EP 0 281 822 B2 ).
Wie weiter oben angegeben, ist bFGF ein starkes Mitogen und ein Schlüssel-Regulationsfaktor in vielen biologischen Prozessen: beispielsweise bei der Angiogenese, bei der Wundheilung, bei der Reparatur eines ischämischen Gewebes, bei der Heilung eines Magen- und Zwölffingerdarm-Geschwürs, bei der Tumorgenese und bei der Erhaltung (dem Überleben) und Regeneration von Nervengewebe. Es ist nicht überraschend, dass der therapeutische Wert von bFGF vom Wild-Typ und von Mutein-bFGFs erkannt worden ist und detailliert beschrieben worden ist in dem Stand der Technik, von denen einige Beispiele hier aufgeführt sind. Therapeutische Behandlungen, die sich auf die vorstehend beschriebenen biologischen Prozesse beziehen, wurden bereits beschrieben für bFGF vom Wild-Typ in den US-Patenten Nr. 5 612 211; 5 439 818; 5 604 293; 5 514 566; 4 994 559; 5 514 662 und in der Europäischen Patentanmeldung Nr. EP 0 237 966 A2 . Ähnliche therapeutische Behandlungen, in denen bFGF-Muteine verwendet werden, sind beschrieben in den US-Patenten Nr. 5 132 408; 5 352 589; 5 360 896; 5 371 206; 5 302 702; 5 310 883; 5 478 804; 5 576 288 und in der Europäischen Patentanmeldung Nr. EP 0 281 822 A2 . So sind beispielsweise Ersatz-Muteine, in denen die Schleifenregion von Human-bFGF (die Aminosäurereste 118 – 122) durch ausgewählte Peptide von anderen Mitgliedern der FGF-Familie ersetzt sind, in dem US-Patent Nr. 5 491 220 beschrieben. Diese Muteine sind beschrieben als wertvoll für die Behandlung von Krebs, als Antiproliferations-Agentien oder als Agentien, welche die Vaskularisierung fördern.
Angesichts des potentiellen therapeutischen Wertes des bFGF-Proteins besteht in dem Stand der Technik ein Bedarf für die Entwicklung neuer Analoga von bFGF mit verbesserten biologischen Eigenschaften.
Zusammenfassung der Erfindung
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, Analoga von Human bFGF mit einer Superagonisten-Aktivität zur Verfügung zu stellen. Weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind in der nachstehenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen angegeben und gehen zum Teil aus der Beschreibung hervor oder ergeben sich aus der praktischen Durchführung der Erfindung.
Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Mutein des Human-Basis-Fibroblast-Wachstumsfaktors oder eines biologisch aktiven Peptids davon, das eine gegenüber dem Human-Basis-Fibroblast-Wachstumsfaktor vom Wild-Typ verbesserte mitogene Agonisten-Aktivität aufweist, das umfasst die Substitution einer oder mehrerer der folgenden Aminosäuren:

(a) Glutamat 89;
(b) Aspartat 101; und
(c) Leucin 137

Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Polynucleotid, welches das Mutein codiert, oder ein biologisch aktives Peptid davon gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung.
Gemäß einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung einen Vektor, der die DNA des zweiten Aspekts der Erfindung enthält.
Gemäß einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung einen Vektor, der die RNA des zweiten Aspekts der Erfindung enthält.
Gemäß einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung eine Wirtszelle, die den Vektor des dritten oder vierten Aspekts der Erfindung umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Muteins oder eines biologisch aktiven Peptids davon des ersten Aspekts der Erfindung, wobei das Verfahren umfasst die Expression des Muteins oder biologisch aktiven Peptids davon, das den Vektor des dritten oder vierten Aspekts der Erfindung codiert, aus einer Wirtszelle des fünften Aspekts der Erfindung.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Vektors des dritten Aspekts der Erfindung, wobei das Verfahren umfasst:

(a) die Insertion eines Polynucleotids des zweiten Aspekts der Erfindung in den Vektor; und
(b) die Auswahl und Propagation des Vektors in einer Wirtszelle.

Gemäß einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Vektors des vierten Aspekts der Erfindung, wobei das Verfahren umfasst:

(a) die Erzeugung eines rekombinanten RNA-Moleküls, das eine RNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung enthält; und die Propagation des Vektors in einer Wirtszelle.

Die Erfindung betrifft außerdem ein in vitro-Verfahren zur Stimulierung einer Zellteilung, das umfasst das Inkontaktbringen von Zellen mit einer wirksamen Menge des Muteins oder eines biologisch aktiven Peptids davon gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung.
Die Erfindung betrifft ferner eine pharmakologische Zusammensetzung, die für die Stimulierung einer Zellteilung geeignet ist und umfasst:

(b) eine wirksame Menge des Muteins des Human-Basis-Fibroblast-Wachstumsfaktors oder eines biologisch aktiven Peptids davon gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung; und
(b) einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.

Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung des Muteins oder biologisch aktiven Peptids davon gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung oder des Polynucleotids gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels für die Wundheilung, für die Heilung eines durch ein Trauma oder eine Erkrankung geschädigten Gewebes, für die Behandlung der Ischämie, für die Behandlung einer peripheren Gefäßerkrankung, für die Behandlung einer Nervenschädigung, für die Behandlung eines Magengeschwürs, für die Behandlung eines Zwölffingerdarmgeschwürs oder für die Behandlung einer Herzerkrankung.
Es ist klar, dass sowohl die vorstehende allgemeine Beschreibung als auch die nachfolgende detaillierte Beschreibung nur beispielhaft und erläuternd für die Erfindung sind und dazu dienen, die Erfindung, wie sie weiter unten beansprucht wird, näher zu erläutern.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die DNA- und Aminosäure-Sequenz der 157 Aminosäure-Form des erfindungsgemäß verwendeten bFGF. Das N-terminale initiierende Methionin wird durch E. coli und die gereinigten bFGFs verarbeitet und deshalb fehlt die erste Aminosäure, wie in der 1 angegeben. Die in der 1 dargestellte Nucleinsäure-Sequenz ist repräsentativ für die bFGF DNA-Sequenz vom Wild-Typ nach Modifikationen des Gens, bezogen von der Firma R & D Systems. Die DNA-Modifikationen wurden durchgeführt, um Restriktionsstellen (Schnittstellen) für die Subklonierung und die Kassetten-Mutagenese einzuführen; in allen Fällen blieb die ursprüngliche Aminosäuren-Sequenz unverändert. Die eingekastelten und nummerierten Aminosäuren identifizieren diejenigen, die einer Stellen-gerichteten Mutagenese unterworfen worden sind.
Zu Vergleichszwecken entspricht das Glycin in der Position 1 dieser Sequenz der ersten Aminosäure in der von Sommer et al. in „Biochem. Biophys. Res. Commun." 144 (2): 543 – 550 (1987), beschriebenen Sequenz, das Methionin in der Aminosäu re-Position 3 dieser Sequenz entspricht der ersten Aminosäure, die von Prats et al. in "Proc.Natl. Acad. Sci. (USA)" 86 (6): 1836 – 1840 (1989); in "GenBank Accession Nr. J04513" für die 18 kDA-Form von Human bFGF angegeben worden ist, und das Prolin in der Position 12 dieser Sequenz entspricht der ersten Aminosäure in der Human bFGF-Sequenz, die in 4 des US-Patents Nr. 5 439 818 von Fiddes et al. angegeben worden ist.
2 zeigt die Ergebnisse eines einzelnen Mitogenizitäts-Versuchs, bei dem ein bFGF vom Wild-Typ und ein Mutanten-bFGF gleichzeitig analysiert wurden in Bezug auf Swiss 3T3 Fibroblasten und der repräsentativ ist für die in der Tabelle 1 angegebenen Daten.
Die Konzentration an bFGF vom Wild-Typ und an Mutanten bFGF, die erforderlich war, um die ½-Maximal-Response (ED₅₀) zu ergeben, wurde schematisch dargestellt und errechnet unter Verwendung der folgenden Gleichung: y = (m·x/(x + c))worin y steht für die Extinktion, x steht für die Konzentration des Wachstumsfaktors, m steht für die maximale Response und c steht für ED₅₀. Während jeder Analyse in Bezug auf Mutanten-Proteine wurde eine parallele Analyse für bFGF vom Wild-Typ durchgeführt. Es wurde wiederholt gezeigt, dass der rekombinante Human-bFGF vom Wild-Typ, die von E. coli exprimiert und gereinigt worden war, einen ED₅₀-Wert aufwies, der identisch war mit dem internationalen bFGF-Standard (Code 90/712), wie er von dem National Institute for Biological Standards and Control erhalten wurde.
Die Nummerierung der Aminosäuren basiert auf der Expression einer 157 Aminosäure-Form von bFGF, wie in dem experimentellen Abschnitt und in der 1 beschrieben bzw. dargestellt. Die Aminosäuren sind identifiziert unter Verwendung des Ein-Buchstaben-Codes. Mutationen werden bezeichnet durch den Ein-Buchstaben-Code für die ursprüngliche Aminosäure, gefolgt von der Aminosäure Nummer, gefolgt von dem Ein-Buchstaben-Code für die Ersatz-Aminosäure.
Die in 2 dargestellten Dosis-Response-Daten zeigen, dass die ED₅₀-Werte für die bFGF-Muteine signifikant niedriger sind als diejenigen für die bFGF vom Wild-Typ.
Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Ein Humar-bFGF-Mutein ist definiert als ein solches, das den Human-Basis-Fibroblast-Wachstumsfaktor umfasst, in dem mindestens eine Aminosäure des nativen Proteirs durch eine andere ersetzt worden ist. Dies bedeutet allgemein gesprochen, dass ein Mutein eine modifizierte Eigenschaft, eine modifizierte strukturelle oder funktionelle Eigenschaft, des nativen Proteins aufweist. So kann beispielsweise das Mutein antagonistisch oder agonistisch sein in Bezug auf die normalen Eigenschaften des nativen Proteins. Ein Antagonist ist definiert als eine Substanz, die bis zu einem gewissen Grade die Wirkung einer anderen aufhebt. Ein Beispiel dafür ist ein Molekü1, das sich an einen Zellrezeptor bindet, ohne eine biologische Response (Antwort) auszulösen. Ein Agonist ist definiert als eine Substanz, die eine zelluläre oder physiologische Response (Antwort) induziert. Ein Beispiel dafür ist ein Molekül, das sich an einen Rezeptor- bindet und eine biologische Response (Antwort) auslöst. Eine biologische Response (Antwort) kann beispielsweise sein die Stimulierung der Zellteilung, eine Chemotaxis, eine Angiogenese oder eine Wundreparatur. Eine biologische Response (Antwort) kann andere funktionelle Eigenschaften des nativen Proteins umfassen und dies ist für den Praktiker auf diesem Gebiet allgemein bekannt. Diese Ausdrücke, wie sie hier verwendet werden, stellen keine Beschränkung dar, es ist nämlich durchaus möglich, dass ein gegebenes Mutein antagonistisch gegenüber einer biologischen Response (Antwort) und agonistisch gegenüber einer anderen ist.
Aus Gründen der Klarheit ist die Human-bFGF-Protein-Sequenz in der 1 so dargestellt, dass sie genau anzeigt, welche Aminosäure-Reste mutiert sind. Eine neutrale Aminosäure ist so definiert, dass sie umfasst Serin, Threonin, Alanin, Asparagin, Glutamin, Cystein, Glycin und nicht in der Natur vorkommende Analoga davon. Eine hydrophobe Aminosäure ist definiert als eine solche, die umfasst Tyrosin, Leu cin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Methionin und nicht in der Natur vorkommende Analoga davon.
Da in dem erfindungsgemäßen bFGF-Mutein möglicherweise ein, zwei oder drei bFGF-Reste mutiert sind, sind die folgenden numerischen Permutationen für die Mutein-Protein-Struktur möglich, wobei X steht für eine neutrale oder hydrophobe Aminosäure oder ein in der Natur nicht vorkommendes Analogon davon: Human bFGF [X⁸⁹] Human bFGF [X¹⁰¹], Human bFGF [X¹³⁷], Human bFGF [X⁸⁹, X¹⁰¹], Human bFGF [X⁸⁹, X¹³⁷], Human bFGF [X¹⁰¹, X¹³⁷] und Human bFGF [X⁸⁹, X¹⁰¹, X¹³⁷].
X ist daher definiert als eine neutrale oder hydrophobe Aminosäure. Infolgedessen kann dann wenn ein Mutein mehr als eine der vorstehend beschriebenen Aminosäure-Rest-Mutationen aufweist, die substituierte Aminosäure an einer angegebenen speziellen mutierten Stelle eine neutrale oder hydrophobe Aminosäure sein. So ist beispielsweise bei einer Ausführungsform der Erfindung eine neutrale Aminosäure definiert als Alanin und eine hydrophobe Aminosäure ist definiert als Tyrosin. So ist es für einen Fachmann auf diesem Gebiet unter Bezugnahme auf die vorstehend angegebenen numerischen Permutationen für die bFGF-Mutein-Struktur klar, dass die Anzahl der möglichen Aminosäure-Sequenz-Permutationen davon abhängt, wie X definiert ist: beispielsweise sind Human bFGF [Ala⁸⁹, Tyr¹⁰¹], [Tyr⁸⁹, Ala¹⁰¹] und andere angegeben, wenn X, eine neutrale oder hydrophobe Aminosäure, als Alanin oder Tyrosin definiert ist. Bei einer spezielleren Form gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung umfasst das Mutein des Human-Basis-FGF die Substitution von Alanin für mindestens eine der folgenden Aminosäuren: Glutamat 89, Aspartat 101 oder Leucin 137. Die folgenden Muteine sind in der spezifischen Ausführungsform angegeben für die oben definierte Alanin-Substitution: Human bFGF [Ala⁸⁹], Human bFGF [Ala¹⁰¹], Human bFGF [Ala¹³⁷], Human bFGF [Ala^89,101], Human bFGF [Ala^89,137], Human bFGF [Ala^101,137] und Human bFGF [Ala^89,101,137].
Bei einer weiteren spezifischeren Ausführungsform des ersten Aspekts der Erfindung umfasst das Mutein der Human-Basis-FGF die Substitution (Einführung) von Tyrosin anstelle mindestens einer der folgenden Aminosäuren: Glutamat 89, Aspartat 101 oder Leucin 137. Die folgenden Muteine sind bei der spezifischen Ausführungsform für die oben identifizierte Tyrosin-Substitution angegeben: Human bFGF [Tyr⁸⁹], Human bFGF [Tyr¹⁰¹], Human bFGF [Tyr¹³⁷], Human bFGF [Tyr^89,101], Human bFGF [Tyr^89,137], Human bFGF [Tyr^101,137] und Human bFGF [Tyr^89,101,137].
Das Mutein kann nach irgendeinem Verfahren hergestellt werden, wie es dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist. Zu diesen Verfahren gehören, ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, Labor-Verfahren, wie z.B. solche, die umfasst werden durch rekombinante DNA-Technologien oder die chemische Synthese von Human bFGF, das eine neutrale oder hydrophobe Aminosäure in einer oder mehreren der angegebenen Positionen aufweist (Glutamat 89, Aspartat 101 oder Leucin 137).
Es ist auch zu erkennen, dass das erfindungsgemäße Mutein irgendeine und alle dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannten Mutationen umfasst, so lange mindestens einer der Reste, der erfindungsgemäß identifiziert worden ist, in geeigneter Weise mutiert ist. Zu Beispielen für Mutationen des Standes der Technik, gehören die folgenden: Deletions-Mutein bFGF 1-146, bFGF [Ala⁶⁹, Ser⁸⁷], bFGF [Arg¹⁹], bFGF [Glu¹⁰⁷], bFGF [Glu¹²³], bFGF [Ile¹⁰⁷], bFGF [Glu^107,123] und bFGF [Arg¹⁹, Lys^123,137], wie von W. F. Heath et al. in "Biochemistry" 30: 5608 – 5615 (1991) beschrieben; bFGF [Ser^69,87], wie in der PCT-Publikation WO 91/09126 angegeben; bFGF [Gln¹²⁸], bFGF [Gln¹³⁸], bFGF [Gln^128,138], bFGF [Gln¹²⁹], bFGF [Gln¹³⁴], bFGF [Gln^129,134], wie von L. Lu-Yuan et al. in „Biochemistry" 33: 10999 – 11007 (1994) beschrieben; bFGF-Schleifen-Ersatz-Muteine (Reste 118 – 122) wie von A. P. Seddon et al. in „Biochemistry" 34: 731 – 736 (1995) beschrieben; bFGF [Ala⁹⁶], bFGF [Ala¹⁰⁷], bFGF [Ala oder Phe bei 109 – 114], wie von H. Zhu et al. in „J. Biol. Chem.", 270 (37): 21869 – 21874 (1995), beschrieben. Diese Mutationen weisen ein bestimmtes mitogenes Potential oder eine bestimmte Rezeptor- oder Heparin-Bindungsaktivität auf, die eine Basis für eine antagonistische oder agonistische Aktivität darstellen können oder nicht darstellen können, die in Kombination mit den erfindungsgemäßen Mutationen ein bFGF-Molekül mit neuartigen Eigenschaften ergeben. Weitere Muteine mit spezifischen Mutationen sind bekannt und andere (weitere) werden noch entwickelt. Das erfindungsgemäße Mutein kann eine oder mehrere der folgenden Mutationen aufweisen, die derzeit allgemein bekannt sind.
Das am meisten bevorzugte Verfahren zur Herstellung des Muteins ist eine der rekombinanten DNA-Methoden und es ist dem Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannt. Solche Methoden sind leicht zu finden in den publizierten Labormethoden-Manualen, wie z.B. in „Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons, Inc.). So kann beispielsweise jeder bereits isolierte Klon-codierende Human-Basis-FGF oder Varianten davon als Ausgangspunkt für die Einführung einer oder mehrerer der angegebenen Substitutionen unter Anwendung der Stellen-gerichteten Mutagenese-Methode dienen. Der Ausdruck "Varianten von bFGF" bezieht sich auf alle Muteine, die in dem oben diskutierten Stand der Technik beschrieben sind.
Außerdem umfasst der erste Aspekt der Erfindung ein biologisch aktives Peptid, das von dem hier beschriebenen Mutein abgeleitet ist. Ein solches Peptid enthält mindestens einen der Substituenten, wie sie für das Mutein angegeben sind, und es weist eine biologische Aktivität auf. Das Peptid kann nach irgendeinem und allen Verfahren hergestellt werden, wie sie dem Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind, wobei zu Beispielen dafür gehören, ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, enzymatische Digestions-, chemische Synthese- oder rekombinante DNA-Methoden.
In dem Stand der Technik ist es allgemein anerkannt, dass Fragmente oder Peptide des bFGF-Proteins biologisch aktiv sind. Diesbezüglich vgl. beispielsweise die Heparin-Bindungs- und Rezeptor-Bindungs-Versuche, die von Baird et al. in „Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)" 85: 2324 – 2328 (1988), und in "J. Cell. Phys. Suppl." 5: 101 – 106 (1987), beschrieben sind. Außerdem gibt es genügend Informationen in Bezug auf die Protein-Struktur und die biologische Funktion des bFGF-Proteins, sodass ein Fachmann auf diesem Gebiet weiß, wie solche Peptide auszuwählen sind. Diesbezüglich vgl. z.B. „bFGF schematic relating protein structure and function" von C. Basilico und D. Moscatelli in „Advances in Cancer Research" 59: 115 – 165, Eds. G. F. Vande Woude und G. Klein (1992)).
Die Auswahl von Fragmenten oder Peptiden des Muteins basiert auf Kriterien, die allgemein bekannt sind. Das erste Kriterium basiert auf den strukturellen Anforderungen für mindestens eine der erfindungsgemäß identifizierten Mutationen und eine ausreichende Menge an zusätzlichen Resten für eine vernünftige Erwartung einer biologischen Funktion unter Ausnutzung der Struktur/Funktions-Informationen in der Literatur. Das zweite Kriterium basiert auf einem Funktionstest, um die biologische Aktivität zu bewerten ähnlich demjenigen, der aus dem Stand der Technik allgemein bekannt ist, beispielsweise ein Mitogen-Assay (-Test) oder Heparin-Bindungs-Assay (-Test), wie z.B. der Zellenproliferations-Assay (-Test), wie er von B. A. Springer et al. in "J. Bio. Chem.", 269 (43): 26879 – 26884 (1994), beschrieben ist, und die Heparin-Affinitäts-Chromatographie, wie sie von L. D. Thompson et al. in „Biochemistry" 33 (13): 3831 – 3840 (1993), beschrieben ist.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Polynucleotid, welches das vorstehend beschriebene Mutein codiert, das in Form der RNA oder in Form der DNA verwendet werden kann, wobei die DNA umfasst cDNA, genomische DNA und synthetische DNA. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Die Codierungs-Sequenz, welche das erfindungsgemäße Mutein codiert, kann variieren als Folge einer Redundanz oder Degeneration des genetischen Codes.
Das Polynucleotid, das für das in 1 angegebene Mutein codiert, kann umfassen: nur die Codierungs-Sequenz für das Mutein; die Codierungs-Sequenz für das Mutein und zusätzliche Codierungs-Sequenzen, wie z.B. ein funktionelles Polypeptid oder eine Leader- oder Sekretions-Sequenz oder eine Proproteiri-Sequenz; die Codierungs-Sequenz für das Mutein (und gegebenenfalls eine zusätzliche Codierungs-Sequenz) und eine nicht-codierende Sequenz, wie z.B. Introne oder einen nicht-codierende 5'- und/oder 3'-Sequenz der Codierungs-Sequenz für das Mutein. Der Ausdruck "Polynucleotid, das ein Mutein codiert" umfasst somit ein Polynucleotid, das nicht nur die Codierungs-Sequenz für das Mutein umfasst, sowie auch ein Polynucleotid, das eine zusätzliche Codierungs- und/oder Nicht-Codierungs-Sequenz umfasst.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf Varianten des vorstehend beschriebenen Polynucleotids, das Fragmente, Analoga und Derivate des Polypeptids, das die angegebenen Substitutionen enthält, codiert. Die Variante des Polynucleotids kann eine in der Natur vorkommende Allel-Variante der Human bFGF-Sequenz oder eine nicht in der Natur vorkommende Variante sein. Die vorliegende Erfindung umfasst somit auch Polynucleotide, die das oben angegebene Mutein codieren, sowie Varianten dieser Polynucleotide, die ein Fragment, Derivat oder Analogon des angegebenen Muteins codieren. Zu diesen Nucleotid-Varianten gehören Deletions-Varianten, Substitutions-Varianten und Additions- oder Insertions-Varianten, so lange mindestens eine der angegebenen Aminosäure-Substitutionen vorliegt. Diese Nucleotid-Varianten werden in dem Stand der Technik am leichtesten identifiziert als codierende Muteine des bFGF-Proteins (wie oben erläutert).
Wie angegeben, kann das Polynucleotid eine codierende Sequenz aufweisen, die eine in der Natur vorkommende Allel-Variante der in 1 dargestellten Sequenz ist. Wie aus dem Stand der Technik bekannt, ist eine Allel-Variante eine alternative Form einer Polynucleotid-Sequenz, die eine Substitution, Deletion oder Addition eines oder mehrerer Nucleotide aufweisen kann, welche die Funktion des codierten Polypeptids nicht wesentlich verändern.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem Polynucleotide, in denen die Codierungs-Sequenz für das Mutein in dem gleichen Leserahmen mit einer Polynucleotid-Sequenz fusioniert sein kann, welche die Expression und Sekretion eines Polypeptids aus einer Wirtszelle unterstützt. So fungiert beispielsweise eine Leader-Sequenz als Sekretions-Sequenz zur Kontrolle des Transports eines Polypeptids aus der Wirtszelle. Das Polypeptid, das eine Leader-Sequenz aufweist, ist ein Preprotein und kann die Leader-Sequenz enthalten, die von der Wirtszelle abgespalten worden ist zur Bildung der reifen Form des Polypeptids. Die Polynucleotide können auch ein Proprotein codieren, bei dem es sich um das reife Protein plus zusätzliche N-terminale Aminosäure-Reste handelt. Ein reifes Protein, das eine Prosequenz aufweist, ist ein Proprotein und stellt eine inaktive Form des Proteins dar. Wenn einmal die Prosequenz abgespalten ist, bleibt ein aktives reifes Protein zurück. So kann beispielsweise das erfindungsgemäße Polynucleotid codieren das Mutein oder das Mutein, das eine Prosequenz aufweist, oder das Mutein, das sowohl eine Prosequenz als auch eine Presequenz aufweist (Leader-Sequenz).
Das Polynucleotid des Muteins kann außerdem für ein chimäres Molekül codieren, das teilweise oder vollständig die Mutein-Codierungs-Sequenz und die Codierungs-Sequenz irgendeines anderen Gens oder einen Teil davon, wie aus dem Stand der Technik bekannt, enthält. Die Nicht-Mutein-Codierungs-Sequenz kann entweder in der 3'- oder in der 5'-Position der Mutein-Codierungs-Sequenz angeordnet sein. Das resultierende chimäre Protein weist die Eigenschaften sowohl des Mutein-Proteins als auch des Nicht-Mutein-Proteins auf. Zu Beispielen für ein solches chimäres Protein gehören, ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, die Codierungs-Sequenz eines anderen Wachstumsfaktors, ein Protein, welches das FGF-Mutein stabilisiert, oder ein Protein, welches das Peptid einem speziellen Gewebe oder einem speziellen Zellen-Typ zuordnet.
Das erfindungsgemäße Mutein kann auch die Codierungs-Sequenz aufweisen, die im Leserahmen mit einer Marker-Sequenz fusioniert worden ist, welche die Reinigung des erfindungsgemäßen Muteins erlaubt. Die Marker-Sequenz kann ein Hexahistidin-Tag oder das T7-Peptid (Aminosäure-Sequenz: Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly), bereitgestellt durch einen Vektor, um eine Reinigung des Polypeptids zu ergeben, das mit dem Marker im Falle eines Bakterien-Wirtes fusioniert worden ist, sein, oder die Marker-Sequenz kann beispielsweise ein Hämagglutinin (HA)-Tag sein, wenn ein Säugetier-Wirt, beispielsweise COS-7 Zellen, verwendet wird (werden). Das HA-Tag entspricht einem Epitop, das von dem Influenza-Hämagglutininprotein abgeleitet ist (I. Wilson et al., "Cell" 37: 767 (1984)). Andere Marker-Sequenzen, die dem Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind, können für ähnliche Zwecke verwendet werden.
Die geeignete DNA-Sequenz kann durch Anwendung einer Vielzahl von Verfahren in den Vektor eingeführt werden. Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz in eine geeig nete Restriktions-Endonuclease-Stelle eingeführt durch Anwendung allgemein bekannter Verfahren.
Die DNA-Sequenz in dem Expressionsvektor ist operativ verbunden mit einer geeigneten Expressions-Kontroll-Sequenz (Promotor), um eine mRNA-Synthese zu lenken. Als repräsentative Beispiele für solche Promotoren können genannt werden: ein LTR- oder SV40-Promotor, das E. coli-lac oder -trp, der Phage lambda-P_L-Promotor, der T7 Phagen-Promotor und andere Promotoren, die bekannt dafür sind, dass sie die Expression von Genen in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen kontrollieren, oder ihre Viren. Der Expressionsvektor enthält auch eine Ribosomen-Bindungsstelle für die Translations-Initiierung und einen Transkriptions-Terminator. Der Vektor kann außerdem geeignete Sequenzen zur Verstärkung der Expression enthalten.
Zusätzlich enthalten die Expressionsvektoren vorzugsweise ein Gen, das eine phänotypische Eigenschaft für die Auswahl von transformierten Wirtszellen bereitstellt, wie z.B. die Dihydrofolat-Reduktase oder die Neomycin-Resistenz für eukaryontische Zellkulturen oder solche, wie z.B. die Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenz in E. coli.
Der Vektor, welcher die geeignete DNA-Sequenz sowie einen geeigneten Promotor oder eine geeignete Kontroll-Sequenz enthält, wird dazu verwendet, einen geeigneten Wirt zu transformieren, um es dem Wirt zu erlauben, das Protein zu exprimieren. Als repräsentative Beispiele für geeignete Wirte können genannt werden: Bakterien-Zellen, z.B. Zellen von E. coli, Salmonella typhimurium, Streptomyces; Fungi-Zellen, z.B. Hefezellen; Insekten-Zellen, z.B. Zellen von Drosophila und Sf9; tierische Zellen, z.B. CHO-, COS- oder Bowes-Melanom-Zellen; Pflanzenzellen und dgl. Die Auswahl eines geeigneten Wirts liegt, wie angenommen wird, innerhalb des Bereiches des Fachmannes auf diesem Gebiet.
Die vorliegende Erfindung umfasst insbesondere auch rekombinante Konstrukte, die eine oder mehrere der vorstehend breit beschriebenen Sequenzen aufweisen. Die Konstrukte umfassen einen Vektor, wie z.B. einen Plasmid- oder Virus-Vektor, in den eine Sequenz der Erfindung eingeführt (inseriert) werden kann, in einer Vorwärts- oder Rückwärts-Orientierung. Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung umfasst das Konstrukt außerdem Regulations-Sequenzen, wie z.B. einen Promotor, der an die Sequenz operativ gebunden ist. Eine große Anzahl von geeigneten Vektoren und Promotoren ist dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt und solche sind im Handel erhältlich. Die folgenden Vektoren werden als Beispiele genannt:
Bakterien-pET (Novagen), pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBs, phagescript, psi174, pBlueScript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRITS (Pharmacia) und Eukaryontische pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Es können somit diese und beliebige andere Plasmide oder Vektoren verwendet werden, so lange sie in dem Wirt vervielfältigbar und lebensfähig sind.
Promotor-Regionen können aus jedem gewünschten Gen unter Verwendung von CAT (Chloramphenicol-Transferase)-Vektoren oder anderen Vektoren mit selektierbaren Markern selektioniert werden. Zwei geeignete Vektoren sind pKK232-8 und pCM7. Zu besonders bekannten Bakterien-Promotoren gehören laci, lacz, T3, T7, gpt, lambda-P_R, P_L und trp. Zu eukaryontischen Promotoren gehören CMV immediate early, HSV Thymidinkinase, frühes und spätes SV40, LTRs aus einem Retrovirus und Maus-Metallothionein-1. Die Selektionierung des geeigneten Vektors und Promotors liegt innerhalb des Bereiches eines Fachmannes auf diesem Gebiet.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die das vorstehend beschriebene Konstrukt enthalten. Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryontische Zelle, beispielsweise eine Säugetierzelle, oder eine niedere eukaryontische Zelle, beispielsweise eine Hefezelle, sein oder sie kann eine prokaryontische Zelle, beispielsweise eine Bakterienzelle, sein. Die Einführung des Konstrukts in die Wirtszelle kann durch Calciumphosphat-Transfektions-, durch DEAE-Dextran vermittelte Transfektions- oder Elektroporations-Verfahren bewirkt werden, die dem Fachmann allgemein bekannt sind. Die Konstrukte in Wirtszellen können auf konventionelle Weise verwendet werden, um das Genprodukt, das durch die rekombinante Sequenz codiert ist, zu bilden. Alternativ können die erfindungsgemäßen Polypeptide synthetisch hergestellt warden unter Verwendung konventioneller Peptid-Synthesizer.
Das bFGF-Mutein kann in Säugetierzellen, Insekten-, Hefe-, Bakterien- oder anderen Zellen unter der Kontrolle geeigneter Promotoren exprimiert werden. Zellenfreie Translations-Systeme können ebenfalls zur Herstellung solcher Proteine verwendet werden unter Verwendung von RNAs, die von den erfindungsgemäßen DNA-Konstrukten abgeleitet sind. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren für die Verwendung zusammen mit prokaryontischen und eukaryontischen Wirten werden von Sambrook et al. in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", zweite Auflage, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989, beschrieben.
Die Transkription einer DNA, welche das erfindungsgemäße Mutein codiert, durch höhere Eukaryonten wird erhöht (verstärkt) durch Einführung (Insertion) einer Verbesserungs-Sequenz in den Vektor. Verbesserungs-Sequenzen sind cis-wirksame Elemente der DNA, in der Regel mit etwa 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor einwirken, um seine Transkription zu erhöhen (zu verbessern). Zu Beispielen dafür gehören der SV40-Enhancer (-Verstärker) auf der Late-Seite des Replikations-Ursprungs (bp 100 bis 270), ein Cytomegalovirus-Early-Promotor-Enhancer, ein Polyom-Enhancer auf der Late-Seite des Replikations-Ursprungs und Adenovirus-Enhancer (Verstärker).
Im Allgemeinen umfassen rekombinante Expressionsvektoren die Ursprünge von Replikations- und Selektions-Markern, welche die Transformation der Wirtszelle erlauben, beispielsweise das Ampicillin-Resistenz-Gen von E. coli und das S. cerevisiae TRP 1-Gen und einen Promotor, der von einem stark exprimierten Gen abgeleitet ist, um die Transkription einer stromabwärts gelegenen Struktur-Sequenz zu lenken. Diese Promotoren können abgeleitet sein von Operonen, die glycolytische Enzyme codieren, wie z.B. unter anderem 3-Phosphoglycerat-Kinase (PGK), α-Faktor, Säurephosphatase oder Wärmeschock-Proteine. Die heterologe Struktur-Sequenz wird in einer geeigneten Phase zusammengefügt mit Translations-Initüerungs- und Ter minierungs-Sequenzen und vorzugsweise mit einer Leader-Sequenz, die in der Lage ist, die Sekretion eines translatierten Proteins in den periplasmischen Raum oder in ein extrazelluläres Medium zu lenken. Gegebenenfalls kann die heterologe Sequenz ein Fusions-Protein codieren, das ein N-terminates Identifikationspeptid enthält, das die gewünschten Eigenschaften verleiht, wie z.B. eine Stabilisierung oder eine vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts.
Geeignete Expressionsvektoren für die bakterielle Verwendung werden hergestellt durch Inserieren einer Struktur-DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Protein codiert, zusammen mit geeigneten Translations-Initüerungs- und -Terminierungs-Signalen in der operablen Lesephase mit einem funktionellen Promotor. Der Vektor umfasst einen oder mehrere phänotypisch selektionierbare Marker und einen Replikations-Ursprung, um die Aufrechterhaltung des Vektors zu gewährleisten und um gewünschtenfalls eine Verstärkung innerhalb des Wirts zu erzielen. Zu geeigneten prokaryontischen Wirten für die Transformation gehören E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Species innerhalb der Genera Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus, obgleich als Mittel der Wahl auch andere verwendet werden können.
Als ein repräsentatives, die Erfindung jedoch nicht beschränkendes Beispiel können geeignete Expressionsvektoren für die bakterielle Verwendung umfassen einen selektionierbaren Marker und einen Replikationsursprung, der von im Handel erhältlichen Plasmiden abgeleitet ist, die genetische Elemente des allgemein bekannten Klonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) umfassen können. Zu solchen im Handel erhältlichen Vektoren gehören beispielsweise pKK223-3 (der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEMI (der Firma Promega Biotec, Madison, WI, USA). Diese pBR322-"Grundgerüst"-Abschnitte werden mit einem geeigneten Promotor und der zu exprimierenden Struktur-Sequenz kombiniert.
Nach der Transformation eines geeigneten Wirtsstammes und dem Heranwachsen des Wirtsstammes zu einer geeigneten Zelldichte wird der ausgewählte Promotor auf geeignete Weise (beispielsweise durch Temperaturverschiebung oder chemische Induktion) von dem Repressor befreit und die Zellen werden für eine zusätzliche Zeitspanne kultiviert. Die Zellen werden in der Regel durch Zentrifugieren geerntet, auf physikalischem oder chemischem Wege aufgebrochen und der resultierende Rohextrakt wird für die weitere Reinigung gesammelt. Die für die Expression von Fremdproteinen verwendeten Mikrobenzellen können unter Anwendung eines geeigneten Verfahrens, beispielsweise durch einen Einfrier-Auftau-Zyklus, durch Ultraschall-Behandlung, durch mechanisches Zerreißen oder unter Verwendung von Zelllysiermitteln aufgebrochen werden.
Es können auch verschiedene Säugetier-Zellkultur-Systeme verwendet werden, um das Mutein zu exprimieren. Zu Beispielen für Säugetier-Expressions-Systeme gehören die COS-7-Zelllinien von Affennieren-Fibroblasten, beschrieben von Gluzman in „Cell" 23: 175 (1981), und andere Zelllinien, die in der Lage sind, einen kompatiblen Vektor zu exprimieren, wie z.B. die C 127-, 3T3-, CHO-, HeLa- und BHK-Zelllinien. Säugetier-Expressionsvektoren umfassen einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und Verstärker (Enhancer) und außerdem beliebige erforderliche Ribosomen-Bindungsstellen, eine Polyadenylierung-Stelle, Spleißungs-Donor- und – Akzeptor-Stellen, Transkriptions-Terminations-Sequenzen und 5'-flankierende nicht-transkribierte Sequenzen. DNA-Sequenzen, die beispielsweise von dem SV40-Virus-Genom abgeleitet sind, ein SV40-Ursprung, ein Early-Promotor, ein Verstärker (Enhancer), ein Spleißer, und Polyadenylierungs-Stellen können verwendet werden, um die erforderlichen nicht-transkribierten genetischen Elemente bereitzustellen.
Es können auch RNA-Vektoren für die Expression der hier beschriebenen erfindungsgemäßen Muteine verwendet werden. Diese Vektoren basieren auf positiven oder negativen Strang-RNA-Viren, die sich auf natürliche Weise in einer großen Vielzahl von Eukaryontenzellen vervielfältigen (vermehren) (P. J. Bredenbeek und C. M. Rice, „Virology" 3: 297 – 310 (1992)). Im Gegensatz zu den Retroviren fehlt diesen Viren eine Zwischen-DNA-Lebenszyklus-Phase, die in der RNA-Form vollständig vorliegt. Beispielsweise werden α-Viren verwendet als Expressionsvektoren für Fremd-Proteine, weil sie in einem breiten Bereich von Wirtszellen verwendet werden können und einen hohen Grad der Expression ergeben; zu Beispielen für Viren die ses Typs gehören der Sindbis-Virus und der Semliki Forest-Virus (vgl. S. Schlesinger, „TIBTECH" 11: 18 – 22 (1993); I. Frolov et al., „Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)" 93: 11371 – 11377 (1996)). Wie beispielsweise in dem Invitrogen-Sinbis-Expressionssystem kann der Forscher zweckmäßig das rekombinante Molekül in der DNA-Form (pSinrep5-Plasmid) im Labor am Leben erhalten, die Weiterverbreitung in der RNA-Form ist aber ebenfalls möglich. In der für die Expression verwendeten Wirtszelle liegt der das interessierende Gen enthaltende Vektor vollständig in der RNA-Form vor und kann in diesem Zustand gewünschtenfalls kontinuierlich weiterverbreitet (vermehrt) werden.
Das Mutein wird abgetrennt und gereinigt aus rekombinanten Zellkulturen durch Verfahren, wie sie allgemein bekannt sind, wozu gehören, ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, die Ammoniumsulfat- oder Ethanol-Präzipitation, die Säureexraktion, die Anionen- oder Kationen-Austauschchromatographie, die Phosphocellulosechromatographie, die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, die Affinitätschromatographie, die Hydroxyapatitchromatographie und die Lectinchromatographie. Erforderlichenfalls können auch Protein-Umfaltungsstufen angewendet werden, um die Konfiguration des reinen Proteins zu vervollständigen. Schließlich kann die Flüssigkeits-Hochleistungschromatographie (HPLC) für die Endreinigungsstufen verwendet werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Stimulieren der Zellteilung, indem man Zellen mit den hier beschriebenen bFGF-Muteinen in vitro in Kontakt bringt. In der Regel ist unter der Stimulierung der Zellteilung zu verstehen, dass die Zellen in die Mitose eintreten und diese vollenden. In der Praxis bedeutet dies, dass die Anzahl der Zellpopulation sich verdoppelt und exponentiell erhöht. Das Kontaktieren der Zellen mit dem Mutein wird auf irgendeine geeignete, dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannte Weise erzielt. Der Kontakt tritt in vitro auf. Dies ist besonders nützlich, wenn eine isolierte Population von Zellen eines Patienten oder Donors (eines Menschen oder Nicht-Menschen) in ihrer Anzahl vermehrt werden soll. In diesem Falle können die Zellen in vitro kultiviert werden auf eine dem Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannte Weise in einem Nährmedium, das eine ausreichende Menge eines oder mehrerer der bFGF-Muteine enthält. Vorzugsweise liegt das Mutein in einer Konzentration (Menge) von 0,001 Picogramm bis 1000 Mikrogramm pro Milliliter, besonders bevorzugt in einer Menge von 0,001 Nanogramm bis 1000 Nanogramm pro Milliliter und am meisten bevorzugt in einer Menge von 0,01 Nanogramm bis 100 Nanogramm pro Milliliter vor.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Muteins oder eines biologisch aktiven Peptids davon gemäß dem ersten Aspekt bei der Herstellung eines Arzneimittels zum Heilen einer Wunde, zur Heilung einer Ischämia, einer Herzerkrankung (z.B. einer Coronararterien-Erkrankung), einer peripheren Gefäßerkrankung, eines Magen- oder Zwöffingerdarmgeschwürs, eines Hirnschlags oder einer Neutronenschädigung. Die Erfindung betrifft außerdem eine pharmakologische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines oder mehrerer isolierter bFGF-Muteine der Erfindung und einen pharmakologisch akzeptablen Träger oder Exzipienten dafür enthält. Durch die Verabreichung einer bFGF-Zusammensetzung wird die Heilung von Erkrankungszuständen, wie z.B. einer Wunde, der Ischämie, einer Herzerkrankung (z.B. einer Coronararterienerkrankung), einer peripheren Gefäßerkrankung, eines Magen- oder Zwölffingerdarmgeschwürs, eines Hirnschlags oder einer Nervenschädigung, durch die mitogenen, trophischen, angiogenen, neuroprotektiven oder anderen Eigenschaften, die den hier beschriebenen bFGF-Muteinen eigen sind, gefördert.
Die bFGF-Mutein enthaltenden Zusammensetzungen sollten so formuliert und dosiert werden, dass sie mit einer guten medizinischen Praxis in Übereinstimmung stehen unter Berücksichtigung des klinischen Zustandes des Patienten, der Stelle der Zuführung der bFGF-Mutein-Zusammensetzung, des Verabreichungsverfahrens, des Verabreichungsprogramms und anderer Faktoren, die dem ausführenden Arzt bekannt sind. Die "therapeutisch wirksame Menge" des bFGF-Muteins für die erfindungsgemäßen Verwendungszwecke wird unter Berücksichtigung dieser Umstände bestimmt.
Die bFGF-Muteine und die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auf irgendeine geeignete Weise verabreicht werden, mit der der allgemein gewünschte Zweck erreicht wird: die Förderung der Heilung eines durch ein Trauma oder eine Erkrankung geschädigten Gewebes. Die Verabreichung kann beispielsweise erfolgen auf oralem, okularem, otischem, rektalem, parenteralem, subkutanem, intravenösem, intramuskulärem, intraperitonealem, intravaginalem, topischem (beispielsweise durch Pulver, Salben, Tropfen oder ein Transdermal-Pflaster), bukkalem, intrathecalem oder intracranialem Wege, in Form eines Mund- oder Nasensprays oder in Form von Augen- oder Ohrentropfen. Der hier verwendete Ausdruck "parenteral" bezieht sich auf Verabreichungsformen, die umfassen die intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, intrasternale, subkutane und intraartikulare Injektion und Infusion. Die verabreichte Dosis hängt vom Alter, vom Gesundheitszustand und Gewicht des Empfängers, von der Art der gleichzeitig durchgeführten Behandlung, falls eine solche durchgeführt wird, von der Häufigkeit der Behandlung und der Art des gewünschten Effekts ab. Die Zusammensetzungen innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung umfassen alle Zusammensetzungen, in denen ein bFGF-Mutein in einer Menge vorliegt, die wirksam ist, um den gewünschten medizinischen Effekt zu erzielen für die Behandlung einer Wunde, einer Ischämie, einer Herzerkrankung (z.B. einer Coronararterienerkrankung), einer peripheren Gefäßerkrankung, eines Magen- oder Zwölffingerdarmgeschwürs, eines Hirnschlags oder einer Nervenschädigung. Obgleich die individuellen Bedürfnisse von einem Patienten zu einem anderen variieren können, liegt die Bestimmung der optimalen Bereiche der wirksamen Menge aller Komponenten innerhalb der Fähigkeiten des behandelten Arztes unter Berücksichtigung seines Fachwissens.
Im Allgemeinen werden die Formulierungen hergestellt, indem man ein erfindungsgemäßes bFGF-Mutein mit flüssigen Trägern oder feinteiligen Feststoff-Trägern oder beiden gleichförmig und innig in Kontakt bringt. Dann wird erforderlichenfalls das Produkt in die gewünschte Formulierung eingebracht. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Träger um einen parenteralen Träger, besonders bevorzugt um eine Lösung, die mit dem Blut des Empfängers isotonisch ist. Zu Beispielen für solche Träger-Vehicula gehören Wasser, eine Kochsalzlösung, eine Ringer-Lösung und eine Dextrose-Lösung. Nicht-wässrige Vehicula, wie z.B. feste Öle und Ethyloleat, sind erfindungsgemäß ebenfalls geeignet ebenso wie Liposome. Wässrige und nichtwässrige Vehicula werden vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 3 bis 10 gehalten. Es ist auch selbstverständlich, dass die Verwendung bestimmter der oben genannten Exzipienten, Träger oder Stabilisatoren zur Bildung von bFGF-Mutein-Polypeptidsalzen führen kann.
Für die parenterale Verabreichung werden gemäß einer Ausführungsform die bFGF-Muteine im Allgemeinen formuliert, indem man eines oder mehrere derselben in dem gewünschten Reinheitsgrad zu einer injizierbaren Einheitsdosierungsform (Lösung, Suspension oder Emulsion) mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, d.h. mit einem solchen, der für die Empfänger in den angewendeten Dosen und Konzentrationen nicht toxisch ist und mit anderen Ingredientien der Formulierung kompatibel ist, vermischt. Beispielsweise enthält die Formulierung vorzugsweise keine Oxidationsmittel und andere Verbindungen, die bekannt dafür sind, dass sie schädlich (nachteilig) für Polypeptide sind.
Als allgemeiner Vorschlag gilt, dass die therapeutisch wirksame Gesamtmenge von bFGF-Mutein, das parenteral verabreicht wird, pro Dosis etwa 0,001 pg/kg Körpergewicht bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht beträgt, und in den meisten Fällen wird es in einer Dosierung von etwa 1 pg/kg Körpergewicht bis 5 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht und vorzugsweise beträgt die Dosis etwa 10 pg/kg Körpergewicht bis etwa 1 mg/kg Körpergewicht pro Tag, wobei man die Art der Verabreichung, die Symptome und dgl. berücksichtigt. Bei kontinuierlicher Verabreichung können das (die) bFGF-Mutein(e) entweder durch 1 bis 10 Injektionen pro Tag oder durch kontinuierliche subkutane Infusion, beispielsweise unter Verwendung einer Minipumpe, verabreicht werden. Eine Lösung in einem intravenösen Beutel kann ebenfalls verwendet werden. Der Schlüsselfaktor für die Wahl einer geeigneten Dosis ist das erzielte Ergebnis, das beispielsweise bestimmt wird durch Erhöhung des Gehaltes an zirkulierendem bFGF-Mutein oder durch Bestimmung des Grades, in dem die Heilung gefördert wird. Andere geeignete Messungen zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt. Die Dauer der erforderlichen Behandlung, bis Änderungen auftreten, und der Zeitraum nach der Behandlung bis zum Auftreten von Responses (Antworten) kann in Abhängigkeit von dem gewünschten Effekt variieren.
Pharmazeutische Zusammensetzungen für die erfindungsgemäße Verwendung umfassen ein oder mehrere der isolierten erfindungsgemäßen bFGF-Muteine und sie können gegebenenfalls umfassen einen dafür geeigneten pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Exzipienten, wie oben angegeben.
Bei einer anderen Ausführungsform ist ein lokaler, topischer Auftrag eines oder mehrerer der bFGF-Muteine ein besonders bevorzugter Verabreichungsweg, um die Heilung einer Wunde zu fördern. Außerdem kann auch ein lokaler Auftrag eines oder mehrerer der bFGF-Muteine angewendet werden in einem Behandlungsmuster zur Förderung der Heilung eines geschädigten inneren Gewebes oder des Wachstums eines neuen Gewebes. Für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung kann es sich bei dem inneren Gewebe um Knochen-, Sehnen-, Knorpel-, Muskel-, Nerven- oder andere Gewebe und Zellen handeln, die dem Fachmann auf diesem Gebiet dafür bekannt sind, dass sie auf den Basis-Fibroblast-Wachstumsfaktor ansprechen. Die Schädigung kann resultieren aus einem extrinsischen Prozess, beispielsweise einem Unfall oder einer Operation, oder alternativ kann eine Schädigung das Ergebnis eines intrinsischen Prozesses sein, beispielsweise einer Erkrankung, wie dies beispielsweise im Falle einer Herzerkrankung (z.B. einer Coronararterienerkrankung), eines Myocardinfarkts), einer peripheren Gefäßerkrankung, im Falle von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren, eines Hirnschlags oder einer Nervenerkrankung der Fall sein kann, wie sie beobachtet wird bei einer Alzheimer- oder Parkinson-Erkrankung.
Wenn ein lokaler äußerer Auftrag wünschenswert ist, können die bFGF-Muteine in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie z.B. einer Salbe, eines Gels, oder in Form eines anderen geeigneten bekannten Trägers entsprechend den Richtlinien, wie sie für die oben genannten pharmazeutischen Träger aufgestellt wurden, aufgebracht werden. Eine interne lokale Verabreichung einer bFGF-Mutein- Zusammensetzung kann erzielt werden durch direkte Verabreichung einer weiter oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung oder die bFGF-Mutein-Zusammensetzungen können unter Verwendung eines Systems mit anhaltender Freisetzung verabreicht werden. Zu geeigneten Beispielen für Zusammensetzungen für die anhaltende Freisetzung gehören semipermeable Polymer-Matrices in Form von Formkörpern, wie z.B. Filmen oder Mikrokapseln. Zu Matrices für eine anhaltende Freisetzung gehören Polylactide (US-Patent Nr. 3 773 919; EP 0 058 481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat (vgl. U. Sidman, et al., „Biopolymers" 22: 547 – 556 (1983), Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) (vgl. R. Langer et al., „J. Biomed. Mat. Res." 15: 167 – 277 (1981); R. Langer, „Chem. Tech." 12: 98 – 105 (1982), Ethylen/Vinylacetat (Langer et al., Id.) und Poly-D(-)-3-hydroxybuttersäure ( EP 0 133 988 ). Zu bFGF-Mutein-Zusammensetzungen mit anhaltender Freisetzung können auch gehören in Liposomen eingeschlossene oder absorbierte bFGF-Muteine, die nach irgendeinem einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden können, die auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind (vgl. die US-Patente Nr. 4 485 045 und 4 544 545; Epstein et al., „Proc.Natl. Acad. Sci. (USA)" 82: 3688 – 3692 (1985); Hwang et al., „Proc.Natl. Acad. Sci. (USA)" 77: 4030 – 4034 (1980); EP 0 036 676 ; EP 0 052 322 ; EP 0 088 046 ; EP 0 102 324 ; EP 0 142 641 ; EP 0 143 949 ; DE 3 218 121 und JP 83 118 008 ).
Als allgemeine Regel gilt, dass das therapeutische Ziel bei einem lokalen Behandlungsprotokoll darin besteht, eine Gewebe-Konzentration an bFGF-Mutein zu erzielen, die das 10-fache der normalen bFGF-Gewebe-Konzentration darstellt (5 bis 50 ng/g Nassgewicht des Gewebs) und das 100-fache des normalen Serumgehaltes an bFGF beträgt (vgl. R. Buckley, „Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)" 82: 7340 – 7344 (1985)). Die oben genannten Polymeren mit langsamer Freisetzung können vom Fachmann auf diesem Gebiet unter Berücksichtigung dieser gewünschten Ziel-Konzentration entwickelt werden. Bei einer Wundbehandlung wird diese Konzentration im Allgemeinen erzielt durch Auftrag einer Lösung, einer Salbe, eines Gels und dgl., die (das) 0,1 bis 10 % bFGF-Mutein enthält. Dies bedeutet in der Praxis den Auftrag von 0,1 bis 100 μg bFGF-Mutein(e) pro cm² Wundfläche. Es ist klar, dass die genaue Dosierung variiert in Abhängigkeit von den Behandlungsumständen, bei spielsweise beträgt die anfängliche Behandlung für eine Verbrennung dritten Grades etwa 100 μg/cm² und, wenn sich der Zustand gebessert hat, wird die Auftragsmenge von bFGF-Mutein auf etwa 0,1 μg/cm² herabgesetzt.
Bei einer anderen Ausführungsform können die bFGF-Muteine in einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit einem anderen Wachstumsfaktor, beispielsweise dem vasculären Endothelzellen-Wachstumsfaktor, dem epidermalen Wachstumsfaktor, dem von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor oder irgendeinem anderen Cytokin, das dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, das die Heilung der oben genannten Ziel-Gewebe fördert, kombiniert werden.
Die für die therapeutische Verabreichung zu verwendenden bFGF-Muteine müssen steril sein. Die Sterilität wird leicht erzielt durch Filtrieren durch Sterilfiltrationsmembranen (beispielsweise durch 0,2 μm-Membranen) oder durch γ- oder UV-Bestrahlung nach allgemein bekannten Verfahren. Therapeutische bFGF-Mutein(e)-Polypeptid-Zusammensetzungen werden im Allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung eingeführt, beispielsweise in einen intravenösen Lösungsbeutel oder in eine Phiole mit einem Stopfen, der durch eine hypodermische Injektionsnadel durchbohrt werden kann.
Die therapeutischen Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemäßen bFGF-Muteine enthalten, müssen üblicherweise in Einheits- oder Mehrfachdosis-Behältern aufbewahrt werden, beispielsweise in versiegelten Ampullen oder Phiolen, in Form einer wässrigen Lösung oder in Form einer lyophilisierten Formulierung für das Wiederanrühren. Als ein Beispiel für eine lyophilisierte Formulierung können 10 ml-Phiolen verwendet werden, die mit 5 ml einer steril filtrierten 1 % gew./vol%igen wässrigen bFGF-Mutein-Lösung gefüllt werden, und die resultierende Mischung wird lyophilisiert. Die Infusionslösung wird hergestellt durch Anrühren des lyophilisierten bFGF-Muteins unter Verwendung von U. S. P. Wasser, das für die Injektion geeignet ist.
Die Erfindung betrifft außerdem einen pharmazeutischen Pack oder Kit, der umfasst einen oder mehrere Behälter, die mit einem oder mehreren der Bestandteile der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen gefüllt sind. Diese Behälter können kombiniert sein mit einem Hinweis in der von einer Behörde vorgeschriebenen Form zur Regulierung der Herstellung, der Verwendung und des Vertriebs von pharmazeutischen und biologischen Produkten, wobei dieser Hinweis die Genehmigung der Herstellung, der Verwendung oder des Vertriebs für die Human-Verabreichung durch die Behörde enthält. Außerdem kann ein erfindungsgemäßes Mutein in Kombination mit anderen therapeutischen Verbindungen verwendet werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können ein oder mehrere der isolierten Nucleinsäure-Moleküle der Erfindung, die ein Polynucleotid umfassen, das eine oder mehrere bFGF-Muteine oder ein Fragment davon codiert, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Heilung einer Wunde, einer Ischämie, einer Herzerkrankung (z.B. einer Coronararterien-Erkrankung), einer peripheren Gefäßerkrankung, eines Magen- oder Zwöffingerdarmgeschwürs, eines Hirnschlags oder einer Nervenschädigung verwendet werden. Dieses Verfahren, allgemein bekannt als "Gentherapie", ist im Allgemeinen auf somatische Zellen als Mittel zur Behandlung von ererbten Erkrankungen, von Krebs und erworbenen Störungen gerichtet (vgl. A. Bank, „Bioassays" 18 (12): 999 – 1007 (1996)). Dieser Aspekt dient dazu, den Grad der bFGF-Mutein-Genexpression zu erhöhen in und um das Gewebe und die Zellen herum, wobei das medizinische Ziel darin besteht, die Heilung oder das Wachstum von neuem Gewebe zu fördern.
Die anfängliche Forschung auf dem Gebiet der Gentherapie war konzentriert auf einige wenige gute charakterisierte und stark publizierte Störungen: die Cystenfibrose – M. L. Drumm et al., „Cell" 62: 1227 – 1233 (1990); R. J. Gregory et al., „Nature" 347: 358 – 363 (1990); D. P. Rich et al., „Nature" 347: 358 – 363 (1990); und die Gaucher-Erkrankung – J. Sorge et al., „Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)" 84: 906 – 909 (1987); J. K. Fink et al., „Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)" 87: 2334 – 2338 (1990); und auf bestimmte Formen der Hämophilie – F. A. Bontempo et al., „Blood" 69: 1721 – 1724 (1987); T. D. Palmer et al., „Blood" 73: 438 – 445 (1989); J. H. Axelrod et al., „Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) " 87: 5173 – 5177 (1990); D. Armentano et al. „Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)" 87: 6141 – 6145 (1990) und die Muskeldystrophie – T. A. Partridge et al., „Nature" 337: 176 – 179 (1989); P. K. Law et al., „Lancet" 336: 114 – 115 (1990); J. E. Morgan et al., „J. Cell Biol." 111: 2437 – 2449 (1990).
Neuerdings schreitet die Anwendung die Gentherapie fort in Bezug auf die Behandlung einer breiteren Vielzahl von Störungen, beispielsweise: Krebs (I. B. Runnebaum, „Anticancer Res." 17 (4B): 2887 – 2890 (1997), Herzerkrankungen (D. J. Rader, „Int. J. Clin. Lab. Res." 27(1): 35 – 43 (1997); S. Malosky, „Curr. Opin. Cardiol." 11 (4): 361 – 368 (1996)), Störungen und Schädigungen des Zentralnervensystems (K. Yang, et al., „Neurotrauma J." 14 (5): 281 – 297 (1997); B. V. Zlokovic, et al., „Neurosurgery" 40 (4): 789 – 803 (1997); B. V. Zlokovic et al., „Neurosurgery" 40 (4): 805 – 812 (1997), Gefäßerkrankungen (A. W. Clowes, „Throb. Haemost." 78 (1): 605 – 610 (1997), Muskelstörungen (J. T. Douglas et al., „Neuromuscul. Disord." 7 (5): 284 – 298 (1997); J. Huard et al., „Neuromuscul. Disord." 7 (5): 299 – 313 (1997)), rheumatoide Arthritis (C. H. Evans et al., „Curr. Opin. Rheumatol" 8 (3): 230 – 234 (1996)) und Epithelgewebe-Störungen (D. A. Greenhalgh et al., „Invest Dermatol. J." 103 (5 Suppl.): 63S – 93S (1994)).
Bei einem bevorzugten Verfahren werden ein oder mehr isolierte Nucleinsäure-Moleküle dem Tier verabreicht oder in dieses eingeführt. Diese isolierten Nucleinsäure-Moleküle können in einen Vektor oder in ein Virion, das für die Einführung der Nucleinsäure-Moleküle in die Zellen oder Gewebe des zu behandelnden Tieres geeignet ist, eingeführt werden zur Bildung eines Transfektions-Vektors. Methoden zur Bildung von Vektoren oder Virionen, welche die bFGF-Mutein codierenden Nucleinsäure-Moleküle umfassen, sind aus dem Stand der Technik allgemein bekannt und allgemein beschrieben in „Working Toward Human Gene Therapy", Kapitel 28 in „Recombinant DNA", 2. Auflage, J. D. Watson et al., Eds. New York: „Scientific American Books", Seiten 567 – 581 (1992). Ein Überblick über geeignete Vektoren oder Virionen ist zu finden in einem Artikel von J. M. Wilson in „Clin. Exp. Immunol." 107 (Suppl. 1): 31 – 32 (1997)). Diese Vektoren sind abgeleitet von Viren, die RNA enthalten (vgl. R. G. Vile et al., „Br. Med Bull." 51 (1): 12 – 30 (1995)) oder DNA (M. Ali et al., „Gene Ther." 1 (6): 367 – 384 (1994)). Zu beispielhaften Vektor-Systemen, die in dem Stand der Technik verwendet werden, gehören die folgenden: Retroviren (R. G. Vile, supra.), Adenoviren (S. L. Brody et al., „Ann. N.Y. Acad. Sci." 716: 90 – 101 (1994)), adenovirale/retrovirale Chimären (G. Bilbao et al., „FASEB J." 11 (8): 624 – 634 (1997), adeno-assoziierte Viren (T. R. Flotte und B. J. Carter, „Gene Ther." 2 (6): 357 – 362 (1995)), das Herpes simplex-Virus (D. S. Latchman „Mol. Biotechnol." 2 (2): 179 – 195 (1994)), das Parvovirus (E. Shaughnessy et al., „Semin Oncol." 23 (1): 159 – 171 (1996)) und das Reticuloendotheliosis-Virus (R. Donburg, „Gene Therap." 2 (5): 301 – 310 (1995)). Ebenfalls von Interesse in dem Stand der Technik ist die Entwicklung von extrachromosomalen Replikationsvektoren für die Gentherapie (M. P. Calos, „Trends Genet." 12 (11): 463 – 466 (1996)).
Es können auch andere nicht-virale Verfahren für den Gentransfer, die aus dem Stand der Technik bekannt sind (B. Abdallah et al., „Biol. Cell" 85 (1): 1 – 7 (1995)), für die Einführung von bFGF-Muteinpolynucleotiden in Target-Zellen verwendet werden; beispielsweise sind Rezeptor-vermittelte DNA-Zuführungs- (S. C. Philips, „Biologicals" 23 (1): 13 – 16 (1995)) und Lipid-Vektor-Systeme (R. J. Lee und L. Huang, „Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst." 14 (2): 173 – 206 (1997)) vielversprechende Alternativen zu Zuführungssystemen auf Virus-Basis.
Generalle Verfahren für die Herstellung von Gentherapie-Vektoren und für die Einführung derselben in erkrankte Tiere für therapeutische Zwecke können aus den oben genannten Publikationen ersehen werden. Bei einem solchen generellen Verfahren werden Vektoren, welche die erfindungsgemäßen isolierten Polynucleotide aufweisen, direkt in Target-Zellen oder -Gewebe des erkrankten Tieres eingeführt, vorzugsweise durch Injektion, Inhalation, Ingestion oder Einführung in eine Schleimhautmembran mittels einer Lösung; ein solches Verfahren wird allgemein als „in vivo"-Gentherapie bezeichnet. Alternativ können Zellen, Gewebe oder Organe, insbesondere solche, die im Zusammenhang stehen mit einer Wunde, einer Ischämie, einer Herzerkrankung (beispielsweise einer Coronararterien-Erkrankung), einer peripheren Gefäßerkrankung, einem Magen- oder Zwöffingerdarmgeschwür, einem Schlaganfall oder einer Nervenschädigung, aus dem erkrankten Tier entnommen und in eine Kultur eingeführt werden unter Anwendung von Verfahren, wie sie dem Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind; die Vektoren, welche die bFGF-Mutein-Polynucleotide aufweisen, können dann in diese Zellen oder Gewebe nach irgendeinem der vorstehend allgemein beschriebenen Verfahren zur Einführung von isolierten Polynucleotiden in eine Zelle oder in ein Gewebe eingeführt werden und nach einer ausreichenden Zeitdauer, um die Einarbeitung der bFGF-Mutein-Polynucleotide zu ermöglichen, können dann die Zellen oder Gewebe wieder in das erkrankte Tier eingesetzt werden. Da die Einführung des bFGF-Muteins außerhalb des Körpers des erkrankten Tieres durchgeführt wird, wird dieses Verfahren allgemein als „ex vivo"-Gentherapie bezeichnet.
Sowohl bei der in vivo- als auch bei der ex vivo-Gentherapie können die isolierten bFGF-Mutein-Polynucleotide der Erfindung alternativ operativ verbunden werden mit einer regulatorischen DNA-Sequenz, bei der es sich um einen bFGF-Mutein-Promotor oder einen Verstärker (Enhancer) handeln kann, oder mit einer heterologen regulatorischen DNA-Sequenz, beispielsweise einem Promotor oder Verstärker (Enhancer), der von einem anderen Gen, einer anderen Zelle oder einem anderen Organismus abgeleitet ist, zur Bildung eines genetischen Konstrukts, wie vorstehend beschrieben. Dieses genetische Konstrukt kann dann in einen Vektor inseriert werden, der dann in einem Gentherapie-Versuch verwendet wird. Die Notwendigkeit von transkriptionell gezielten und regulierbaren Vektoren, die Zelltypen-spezifische und induzierbare Promoteren ergeben, ist in dem Stand der Technik allgemein anerkannt (N. Miller und J. Whelan, „Hum. Gene Therap." 8 (7): 803 – 815 (1997); und W. Walther und U. Stein, „Mol. Med. J." 74 (7): 379 – 392 (1996)).
Das Konstrukt/der Vektor kann unter Anwendung eines in vivo-Gentherapie-Verfahrens in das Tier eingeführt werden, beispielsweise durch direkte Injektion in das Target-Gewebe oder in die Zellen oder Gewebe des erkrankten Tieres unter Anwendung eines ex vivo-Verfahrens. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungsgemäße genetische Konstrukt in die Zellen oder Gewebe des Tieres entweder in vivo oder ex vivo in Form eines Molekular-Konjugats mit einem Virus (beispielsweise einem Adenovirus oder einem Adeno-assoziierten Virus) oder mit viralen Komponenten (beispielsweise viralen Capsid-Proteinen; vgl. WO 93/07283) eingeführt werden. Alternativ können die transfektierten Wirtszellen, die homolog oder heterolog sein können, in einer semipermeablen Sperrschicht-Einrichtung eingekapselt und dem erkrankten Tier implantiert werden, um so den Übergang von bFGF-Mutein-Polypeptiden in die Gewebe und in den Blutkreis des Tieres zu ermöglichen, jedoch einen Kontakt zwischen dem Immunsystem des Tieres und den transfektierten Zellen zu verhindern (vgl. WO 93/09222). Diese Verfahren führen zu einer erhöhten Produktion von bFGF-Mutein durch das behandelte Tier über eine (a) Random-Insertion des bFGF-Mutein-Gens in das Wirtszellen-Genom oder (b) durch Einarbeitung des bFGF-Mutein-Gens in den Kern der Zellen, in dem es als ein extrachromosomales genetisches Element vorliegen kann. Generelle Beschreibungen dieser Verfahren und Methoden für die Gentherapie sind zu finden beispielsweise in dem US-Patent Nr. 5 578 461; in WO 94/12650 und in WO 93/09222.
Die Erfindung ist besonders gut geeignet für die medizinische Behandlung einer Wunde, einer Ischämie, einer Herzerkrankung (beispielsweise einer Coronararterien-Erkrankung), einer peripheren Gefäßerkrankung, von Magen- oder Zwöffingerdarmgeschwüren, eines Schlaganfalls oder einer Nervenschädigung bei einem Tier, vorzugsweise bei Säugetieren und besonders bevorzugt bei Menschen. Es ist für den Fachmann auf diesem Gebiet ohne weiteres ersichtlich, dass auch andere geeignete Modifikationen und Adaptationen an die hier beschriebenen Verfahren und Anwendungen vorgenommen werden können, ohne dass der Bereich der Erfindung oder irgendein Aspekt oder eine Ausführungsform derselben verlassen wird. Nachdem die vorliegende Erfindung vorstehend im Detail beschrieben worden ist, wird sie unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele, die lediglich der Erläuterung der Erfindung dienen, ohne sie jedoch darauf zu beschränken, noch besser verständlich.
Beispiele
Generelle Materialien und Verfahren
Chemikalien und Reagenzien: alle Restriktionsenzyme, T4 DNA-Ligase, T4 Polynucleotid-Kinase und Litmus-Vektoren wurden bezogen von der Firma New England Biolabs (Beverly, MA). Die Oligonucleotid-Synthese wurde durchgeführt von der Firma Gibco BRL (Gaithersburg, MD); die pET-Expressionsvektoren und die BL21 (DE3)-Kompetenz-Zellen wurden bezogen von der Firma Novagen (Madison, WI) und das Sculptor^TM in vitro-Mutagenese-System wurde bezogen von der Firma Amersham (Arlington Heights, IL). Die DNA-Präparate wurden hergestellt unter Verwendung von Qiagen-Produkten und Versuchsprotokollen (Chatsworth, CA). Die Protease-Inhibitoren PMSF, Leupeptin und Pepstatin A wurden von der Firma Sigma (St. Louis, MO) bezogen und DTT wurde von der Firma Pierce (Rockford, IL) bezogen. Der CellTiter^® 96 Aq-nicht radioaktive Zell-Proliferations-Assay (-Test) wurde bezogen von der Firma Promega (Madison, WI). Die Zellkultur-Reagenzien wurden bezogen von der Firma Gibco (Grand Island, NY).
Abkürzungen:

bFGF

= Basis-Fibroblast-Wachstumsfaktor;

DTT

= Dithiothreit;

PMSF

= Phenylmethanesulfonylfluorid;

Hepes

= (2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-2-ethansulfonsäure;

EDTA

= Ethylendiamintetraessigsäure;

SDS-PAGE

= Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese;

IPTG

= Isopropyl-p-D-thiogalactopyranosid;

DMEM

= Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium.

Beispiel 1: Herstellung von bFGF-Muteinen
Ein synthetisches Gen für den Human-Basis-Fibroblast-Wachstumsfaktor (bFGF) wurde bezogen von der Firma R & D Systems (Minneapolis, MN) und es basiert auf der publizierten cDNA-Sequenz (J. A. Abraham, „EMBO J." 5 (10): 2523 – 2328 (1986)). Es wurden zahlreiche Modifikationen dieses Gens hergestellt durch Stellengerichtete Mutagenese (gerichtete Mutagenese), um neuartige Restriktionsenzym-Stellen einzuführen. In allen Fällen blieb die translatierte Aminosäure-Sequenz unverändert. Die resultierende DNA- und Aminosäure-Sequenz ist in der 1 dargestellt.
Die gerichtete Mutagenese des bFGF-Gens wurde erzielt durch Subklonierung der bFGF-Sequenz in den Phagemid-Vektor Litmus 28 (der Firma New England Biolabs, Beverly, MA). Eine Einzelstrang-DNA-Matrize wurde von dem Phagen gereinigt, danach mit einem Helfer-Phagen infiziert. Die anfänglichen Mutationen an den Aminosäure-Positionen E89 und D101 wurden durchgeführt durch Einzelstrang-DNA-gerichtete Mutagenese unter Verwendung des Sculptor^TM in vitro-Mutagenese-Systems (der Firma Amersham, Arlington Heights, IL) nach den Empfehlungen des Herstellers. Die E89A-, E89Y- und D 101 A-Einzelstellen-Mutantionen wurden erzielt unter Anwendung dieses Verfahrens. Dann wurden mutante DNA-Konstrukte in den pET-Vektor zurücksubkloniert zur Expression des Proteins (vgl. die nachstehenden Ausführungen).
Alle anderen Mutationen, die in der Tabelle 1 angegeben sind, wurden erzeugt unter Anwendung einer Kassetten-Mutagenese. Die L137A-Mutation wurde durchgeführt durch Inserieren von komplementären Oligonucleotiden in die AflII und ApaI-Stellen, in denen das CTT-Codon für Leucin ersetzt wurde durch das GCT-Codon für Alanin (1). Eine HindIII-Stelle (nicht dargestellt) wurde entfernt zur Erleichterung der Reihendurchsuchung auf positive Ergebnisse. Die DNA-Sequenz für die oben genannten Mutationen unterscheidet sich etwas von derjenigen, die in der 1 angegeben ist, obgleich die Aminosäure-Sequenz identisch bleibt, mit Ausnahme der eingeführten Stellen-gerichteten Mutationen. Die DNA-Sequenz für die E89A-, E89Y, D101A- und L137A-Mutanten unterscheidet sich von derjenigen, wie sie in 1 angegeben ist, nur zwischen den KpnI- und ApaI-Restriktionsenzym-Stellen. Mit Ausnahme der eingeführten Mutation (eingekasteltes Codon in der 1) ist die folgende DNA-Sequenz zwischen den KpnI- und ApaI-Stellen repräsentativ für die E89A-, E89Y-, D101A- und L137A-Mutanten:
CTGGCTATGAAGGAAGATGGAAGATTACTGGCTTCTAAATGTGTTA
CGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAACGATTGGAATCTAATAACTACAAT
ACTTACCGCTCGAGAAAATACACCAGTTGGTATGTGGCACTTAAGC
GTACCGGTCAGTACAAGCTTGGTTCTAAAACGGGCC. Die E89A- und D101A-Doppelmutation, die in der Tabelle 1 angegeben ist, wurde erzeugt durch Inserieren von komplementären Oligonucleotiden in die KpnI- und XhoI-Stellen (1). Die E89A-, D101A- und L137A-Dreifach-Mutante wurde hergestellt durch Kombinieren der E89A- und D101-A-Doppel-Mutanten mit der L137A-Einzel-Mutanten unter Verwendung der in die DNA-Sequenz eingeführten Restriktions-Enzymstellen (vgl. 1). Alle Mutationen wurden bestätigt durch DNA-Sequenzierung der Plasmid-DNA. Eine Kassetten-Mutagenese wurde durchgeführt unter Verwendung des bFGF Expressions-Konstrukts (vgl. die nachstehende Ausführung), sodass keine weitere Subklonierung erforderlich war.
Beispiel 2: Expression und Reinigung von bFGF Muteinen
Die Expression von Proteinen vom Wild-Typ und von Mutanten-Proteinen wurde durchgeführt unter Verwendung eines modifizierten pET-Expressionsvektors, wie von Squires et al. in „J. Biol. Chem." 263: 16297 – 16302 (1989) beschrieben, unter Anwendung des Zwei-Cistron-Verfahrens, wie es ursprünglich von Schoner et al. in „Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)" 83: 8506 – 8510 (1986) beschrieben worden war. Die DNA wurde transformiert in kompetente BL21 (DE3) Escherichia coli-Zellen und einzelne Kolonien wurden ausgewählt zur Erzielung eines Wachstums in größerem Maßstab. Fermentationen wurden durchgeführt entweder in einem 5 L-Maßstab mit einem BioFlo II-Fermenter der Firma New Brunswick im Bioprocessing Resource Center an der Penn State University (University Park, PA), oder im Hause unter Verwendung von 2 L-Schüttelkolben, die mit Prallflächen ausgestattet waren.
Nach der Fermentation in dem New Brunswick-Fermenter wurden 50 ml Luria-Broth (10 g Trypton, 5 g Hefe-Extrakt, 5 g NaCl pro Liter), die 50 μg/ml Carbenicillin enthielt, mit dem Konstrukt der Wahl inokuliert, das in BL21 (DE3) transformiert und über Nacht wachsen gelassen worden war. Die 50 ml Übernachtkultur wurde dann verwendet zum Inokulieren eines 5 L-Volumens der Super-Broth (35 g Trypton, 20 g Hefe-Extrakt, 5 g NaCl pro Liter), das 50 μg/ml Carbenicillin enthielt. Das Wachstum wurde fortgesetzt, bis die OD_600mm einen Wert zwischen 8 und 10 erreicht hatte, wobei zu diesem Zeitpunkt IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) bis zu einer Endkonzentration von 1,0 mM zugegeben wurde, um die Expression des T7 Polymerase-Gens in den BL21 (DE3)-Zellen zu induzieren. Die Zellen wurden 5 h nach der Induktion unter Verwendung einer Zentrifuge mit kontinuierlichem Strom (T-1-P Sharples) geerntet und die resultierende Paste wurde bei –70 °C aufbewahrt.
Nach dem Wachsenlassen in 2 L Schüttelkolben, die mit Prallflächen ausgestattet waren, wurde eine 250 ml-Kultur, die das interessierende Konstrukt enthielt, über Nacht in einem 500 ml-Schüttelkolben mit Prallflächen in Terrific Broth wachsen gelassen (12 g Trypton, 24 g Hefe-Extrakt, 4 ml Glycerin pro Liter), die 50 μg/ml Carbenicillin enthielt. Am nächsten Tag wurden die 2 L Schüttelkolben mit Prallflächen, die 800 ml Terrific Broth mit 100 μg/ml Ampicillin und 0,2 % Glucose enthielten, mit 12 ml der Übernacht-Kultur inokuliert und wachsen gelassen in einem New Brunswick-Inkubator-Schüttler bei 240 UpM, bis die OD_600mm einen Wert von 0,8 erreicht hatte, wobei zu diesem Zeitpunkt IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1,0 mM zugegeben wurde. Die Kulturen wurden weitere 5 h lang nach der Induktion wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren geerntet und bei –70 °C aufbewahrt. Die Kulturen wurden stets bei 30 °C wachsen gelassen, um eine Expression von bFGF in der löslichen E. coli-Fraktion zu ermöglichen.
Die Mutanten- und Wild-Typ-Proteine wurden gereinigt, indem zuerst die E. coli-Zellenpaste (die bei –70 °C gelagert worden war) in einem Load-Puffer (50 mM HE-PES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM Dithiothreit (DTT), 1 mM EDTA) wieder suspendiert wurde, der dann die folgenden Protease-Inhibitoren zugesetzt wurden: 1 mM PMSF, 1 μg/ml Pepstatin A und 1 μg/ml Leupeptin. In der Regel wurden 50 g Zellenpaste in 300 ml Puffer wieder suspendiert und auf Eis unter Verwendung einer Branson Ultraschall-Behandlungs-Vorrichtung 450 (Danbury, CT) mit Ultraschall behandelt, bis die Zellen vollständig lysiert waren. Die lysierte Zellensuspendion wurde dann in einer Beckman Avanti^TM J-25-Zentrifuge bei 4 °C und 75 000 × g 30 min lang zentrifugiert. Die überstehenden Flüssigkeiten wurden miteinander vereinigt und durch ein 0,8 uM Filter filtriert. Die gesamte Probe wurde dann mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/min auf eine 5 ml HiTrap SP-Kolonne (der Firma Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) aufgegeben, die vorher mit dem Load-Puffer äquilibriert worden war, und an ein GradiFrac-System (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) gebunden. Nachdem die Probe auf die Kolonne aufgegeben worden war, wurde sie mit dem Load-Puffer gewaschen, bis der A₂₈₀-Wert des Eluats zu der Basislinie zurückgekehrt war. 5 ml HiTrap-Heparin wurde gleichzeitig an die SP-Kolonne gebunden und das gebundene Protein wurde aus der SP-Kolonne in die Heparin-Kolonne gepumpt unter Verwendung einer 0,6 M NaCl-Lösung in dem Load-Puffer. Unter diesen Bedingungen wurde der bFGF aus dem SP-Harz eluiert und spezifisch an die Heparin-Affinitäts-Kolonne gebunden. Nach einem gründlichen Waschen der HiTrap-Heparin-Kolonne unter Verwendung einer 0,6 M NaCl-Lösung zur Entfernung von nicht-spezifisch gebundenem Protein wurde bFGF eluiert mit einem linearen Lösungsgradienten von 0,6 M NaCl bis 3,0 M NaCl. Die Wild-Typ- und Mutanten-Proteine wurden routinemäßig gereinigt bis auf > 95 % unter Anwendung dieses Verfahrens, was durch SDS-PAGE bestimmt wurde. Außerdem wurden alle Mutanten-Proteine bei den gleichen NaCl-Konzentrationen wie das bFGF vom Wild-Typ eluiert, was anzeigt, dass die Mutationen die Affinität für Heparin nicht verändert hatten. Es wurde früher bereits darüber berichtet, dass eine gute Korrelation besteht zwischen der NaCl-Elution aus einer Heparin-Affinitäts-Kolonne und dem K_d für die Heparin-Bindung an bFGF, bestimmt durch isotherme Titrationskalorimetrie (Thompson et al., „Biochemistry" 33: 3831 – 3840 (1994)). Eine ähnliche Bindungsaffinität für Heparin für jede dieser Mutanten, verglichen mit dem Wild-Typ-Protein, ist auch eine unabhängige Bestätigung dafür, dass keine starken Strukturstörungen erhalten wurden durch die eingeführten Mutation(en).
Die Protein-Konzentrationen wurden bestimmt durch Messung der Extinktion bei 280 nm und unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 16,766 M^–1 cm^–1, wie von Pantoliano et al. in „Biochemistry" 33: 10229 – 10248 (1994) angegeben). Für Mutationen, bei denen zusätzliches Tyrosin bei der Stellen-gerichteten Mutation eingeführt wurde, wurde der Extinktionskoeffizient errechnet durch Addition der einzelnen Extinktionskoeffizienten für die Tryptophane und Tyrosine.
Beispiel 3: Mitogenizität des bFGF Muteins
Um die Superagonisten-Wirkung zu demonstrieren, wurden Versuche in Bezug auf die mitogene Aktivität der bFGF-Mutanten-Proteine durchgeführt, um die Mutein- und Wild-Typ bFGF-Stimulation des Fibroblasten-Wachstums direkt miteinander zu vergleichen. NIH 3T3 Maus-Embryo-Fibroblast (1658-CRL)-, 3T3 Swiss-Albinomaus-Fibroblast (CCL-92)- und Balb/c 3T3-Klon A31-Maus-Embryo-Fibroblast (9163-CCL)-Zelllinien wurden erhalten von der ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD). Die Zellen wurden in T-75- oder T-150-Gewebes-Kulturkolben in einem Dulbecco's modifizierten Eagle-Medium (DMEM) aufbewahrt, das L-Glutamin, wenig Glucose,110 mg/l Natriumpyruvat, Pyridoxinhydrochlorid enthielt und ergänzt worden war mit 10 vol/vol.%igem durch Wärme inaktivierten Kalbsserum (Gibco, Grand Island, NY). Zur Durchführung der Assays (Tests) wurden die Zellen in Platten mit 96 Vertiefungen in Dulbecco's modifizierter Eagle-Medium-Nährstoffmischung der Firma F-12 Ham überimpft (DMEM/F12 1 : 1-Mischung), die L-Glutamin, 15 mM Hepes, Natriumbicarbonat enthielt und mit Phenolrot (Sigma, St. Louis, MO) angefärbt war, ergänzt durch 0,5 vol/vol.%iges oder 1,0 vol/vol.%iges Kalbsserum.
Die Förderung der Zellenproliferation der verschiedenen Fibroblast-Zelllinien wurde bestimmt unter Verwendung des CellTiter 96^® AQUeous nicht-radioaktiven Zellen-Proliferations-Assays (Promega, Madison, WI). Dieser Assay (Test) beruht auf Mitochondrien-Dehydrogenase-Enzymen, die eine lösliche Tetrazolium-Verbindung zu Formazan reduzieren in Gegenwart eines Elektronenkupplungsmittels (Dunigan et. al., „Biotechniques" 19: 640 – 649 (1995)). Die Menge des Formazan-Produkts ist direct proportional zur Anzahl der lebensfähigen Zellen in der Kultur und kann durch die Extinktion bei 490 nm leicht überwacht werden. Dieses Verfahren ist, wie sich gezeigt hat, äquivalent zu anderen Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Zellenproliferation (Gieni et al., „Immun. Methods J." 187: 85 – 93 (1995); Roehm et al., „Immun. Methods J." 142: 257 – 265 (1991); Drummond et al., „Biochem. Biophys. Methods J." 31: 123 – 134 (1996)).
Es wurden Assays (Tests) durchgeführt in Platten mit 96 Vertiefungen nach den Angaben des Hersteller-Protokolls (Promega, Technical Bulletin #169) unter Verwendung entweder von Falcon #3072- oder Costar #3596 Gewebe-Kulturplatten mit einem Deckel zur geringen Verdampfung (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Es wurden Verdünnungen (in der Regel in dem Bereich von 100 bis 0,001 ng/ml) der Wild-Typ- und Stellen-gerichteten Mutanten-bFGF untersucht, die seriell hergestellt wurden in Platten mit 96 Vertiefungen unter Verwendung von geringen Mengen Serum und dann auf 37 °C erwärmt. Die Fibroblast-Zellen wurden von den T-150-Platten abgelöst durch Verwendung von 0,25 % Trypsin (Gibco, Grand Island, NY) für 3 min. Das Trypsin wurde inaktiviert durch Zugabe von DMEM, ergänzt durch ein 10 %iges Kälberserum und 1-stündiges Stehenlassen. Dann wurden die Zellen zweimal mit Medien mit niedrigem Serumgehalt gewaschen, ausgezählt und in einer Dichte von 5 × 103 Zellen/Vertiefung in den Platten mit 96 Vertiefungen, die Verdünnungen von bFGF enthielten, ausgestrichen. Die Zellen wurden in Gegenwart von bFGFs 18 bis 20 h lang bei 37 °C unter 5 % CO₂ inkubiert und die Platten wurden nach den Vorschriften des Herstellers behandelt. Die Extinktion wurde bei 490 nm (minus 700 nm zur Korrektur für den Hintergrund) unter Verwendung eines SPECTRAmax^TM 250 Mikroplatten-Spektrophotometers (der Firma Molecular Devices, Sunnyvale, CA) bestimmt. Jede Verdünnung wurde in vierfacher Ausfertigung hergestellt und alle Platten wiesen eine Negativkontrolle, ebenfalls in vierfacher Ausfertigung, auf (Zellen in einem Medium mit niedrigem Serumgehalt ohne Zugabe des Wachstumsfaktors), die von dem Mittelwert jedes Vierfach-Wertes abgezogen wurde.
Ein beispielhafter Versuch ist in der 2 dargestellt, welche die niedrigeren ED₅₀-Werte der bFGF-Muteine zeigt. Die Daten der Versuche, die ähnlich denjenigen waren, die in der 2 dargestellt sind, wurden zur Aufstellung der Tabelle 1 verwendet. Die Mutanten-Bezeichnungen sind die gleichen wie in der detaillierten Beschreibung der 2 angegeben und ED₅₀ ist definiert als die Konzentration des Wachstumsfaktors, die erforderlich ist, um die Hälfte der maximalen Stimulierung einer definierten Zelllinie zu erzielen.
Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt die Superagonisten-Mitogenizität der bFGF-Muteine. Die Mutein ED₅₀-Werte sind angegeben als die Verhältnisse zwischen den Wild-Typ-bFGF, um die Variation von Versuch zu Versuch zu kompensieren und um ein Maß für die bFGF-Mutein-Mitogenizität in Bezug auf den Wild-Typ bFGF zu erhalten. Die angegebenen Werte wurden erhalten unter Verwendung von rekombinanten Wild-Typ-bFGF, exprimiert und gereinigt aus E. coli, und von Mutanten- Formen von bFGF, exprimiert und gereinigt auf identische Weise, bezogen auf das Wild-Typ-Protein. Die Werte zeigen die X-fach erhöhte Aktivität gegenüber dem Wild-Typ-Protein (X = das in der Tabelle 1 angegebene Verhältnis). N bezieht sich auf die Anzahl der durchgeführten Versuche. Für alle Mutanten-bFGF-Daten, die in der Tabelle 1 angegeben sind, wurden drei Fibroblast-Zelllinien verwendet (Swiss 3T3, NIH 3T3 und Balb/c 3T3). Obgleich die absoluten ED₅₀-Werte für bFGF vom Wild-Typ und für Muteine variierten, stimmte das Verhältnis zwischen den Wild-Typ ED₅₀ und den Mutant ED₅₀ bei allen drei getesteten Zelllinien überein.
Tabelle 1 Mitogene Aktivität von bFGF-Superagonisten
Wie aus den in der 2 und in der Tabelle 1 angegebenen Daten hervorgeht, sind alle Mutanten-bFGF-Proteine signifikant stärker mitogen als das Wild-Typ-bFGF-Protein.
Sequenzliste

Claims

Mutein des Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktors oder ein biologisch aktives Peptid davon, das eine gegenüber dem Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktor vom Wild-Typ verbesserte mitogene Agonisten-Aktivität aufweist, das umfasst die Substitution einer oder mehrerer der folgenden Aminosäuren: (a) Glutamat 89; (b) Aspartat 101; und (c) Leucin 137 durch eine neutrale und/oder hydrophobe Aminosäure.
Mutein oder ein biologisch aktives Peptid davon nach Anspruch 1, in dem eine neutrale Aminosäure definiert ist als Alanin und eine hydrophobe Aminosäure definiert ist als Tyrosin.
Mutein oder ein biologisch aktives Peptid davon nach Anspruch 1 oder 2, bei dem es sich handelt um den Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktor [Ala⁸⁹], den Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktor [Ala¹⁰¹], den Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktor [Ala¹³⁷], den Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktor [Ala^89,101], den Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktor [Ala^89,137], den Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktor [Ala^104,137], den Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktor (Ala^89,101,137], den Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktor [Tyr⁸⁹], Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktor [Tyr¹⁰¹], Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktor [Tyr¹³⁷], den Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktor [Tyr^89,101], den Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktor [Tyr^89,137], den Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktor [Tyr^101,137] und den Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktor [Tyr^89,10,137].
Polynucleotid, welches das Mutein oder ein biologisch aktives Peptid davon, das eine verbesserte mitogene Agonisten-Aktivität gegenüber dem Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktor vom Wild-Typ aufweist, nach Anspruch 1, 2 oder 3 codiert.
Polynucleotid nach Anspruch 4, bei dem es sich um eine DNA handelt.
Polynucleotid nach Anspruch 5, bei dem es sich um eine genomische DNA oder eine cDNA handelt.
Polynucleotid nach Anspruch 4, bei dem es sich um eine RNA handelt.
Vektor, der die DNA nach Anspruch 5 oder Anspruch 6 enthält.
Vektor, der die RNA nach Anspruch 7 enthält.
Wirtszelle, die den Vektor nach Anspruch 8 oder nach Anspruch 9 umfasst.
Verfahren zur Herstellung des Muteins oder eines biologisch aktiven Peptids davon nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Verfahren umfasst das Exprimieren des Muteins oder eines biologisch aktiven Peptids davon, das durch den Vektor nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 codiert wird, aus der Wirtszelle nach Anspruch 10.
Verfahren zur Herstellung des Vektors nach Anspruch 8, das umfasst: a) die Insertion des Polynucleotids nach Anspruch 5 oder nach Anspruch 6 in den Vektor und b) die Selektion und Propagation des Vektors in einer Wirtszelle.
Verfahren zur Herstellung des Vektors nach Anspruch 9, das umfasst: (a) die Erzeugung eines rekombinanten RNA-Moleküls, das die RNA-Sequenz nach Anspruch 7 enthält; und (b) die Selektion und Propagation des Vektors in einer Wirtszelle.
In vitro-Verfahren zur Stimulierung einer Zellteilung, das umfasst das Inkontaktbringen von Zellen mit einer wirksamen Menge des Muteins oder eines biologisch aktiven Peptids davon, das eine gegenüber dem Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktor vom Wild-Typ verbesserte mitogene Agonisten-Aktivität aufweist, nach Anspruch 1, 2 oder 3.
Pharmakologische Zusammensetzung, die für die Stimulierung einer Zellteilung geeignet ist und umfasst: (a) eine wirksame Menge des Muteins des Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktors oder eines biologisch aktiven Peptids davon, das eine gegenüber dem Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktor vom Wild-Typ verbesserte mitogene Agonisten-Aktivität aufweist, nach Anspruch 1, 2 oder 3 und (b) einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Verwendung des Muteins oder eines biologisch aktiven Peptids davon, das eine gegenüber dem Human-Basisfibroblast-Wachstumsfaktor vom Wild-Typ verbesserte Agonisten-Aktivität aufweist, nach Anspruch 1, 2 oder 3 oder des Polynucleotids nach Anspruch 4, 5, 6 oder 7 bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Heilung einer Wunde, für die Heilung eines durch ein Trauma oder eine Erkrankung geschädigten Gewebes, für die Behandlung der Ischämie, für die Behandlung einer peripheren Gefäßerkrankung, für die Behandlung einer Nervenschädigung, für die Behandlung eines Magengeschwürs, für die Behandlung eines Zwöffingerdarmgeschwürs oder für die Behandlung einer Herzerkrankung.