JPH09509846A - トランスフォーミング成長因子αＨ１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトTGFα-H1ポリペプチドおよびこのようなTGFα-H1ポリペプチドをコードするDNA(RNA)が開示される。組換え技術によりこのようなポリペプチドを生成する手順ならびにこのようなポリペプチドに対する抗体およびアンタゴニストを生成する手順も提供される。このようなポリペプチドは、適切な薬学的キャリアまたは希釈剤と組み合わされて、種々の病気に対する診断、治療、および／または予後の効果を提供し得る。治療の目的のために、抗体およびアンタゴニストを用いてTGFα-H1を阻害する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 トランスフォーミング成長因子αH1 本発明は、新たに同定したポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドに よりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチ ドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に関 する。より特定すると、本発明のポリペプチドは、ヒトトランスフォーミング成 長因子α-H1（TGFα-H1）である。本発明はまた、このようなポリペプチドの作 用を阻害することに関する。 TGFα-H1は、表皮成長因子（EGF）ファミリーの新規なメンバーである。EGF成 長因子スーパー遺伝子ファミリーは、αトランスフォーミング成長因子（TGFα ）のサブファミリーを含む非常に多くの医学的に重要な成長因子を含む。 EGFファミリーの成長因子には、TGF-αの他に、アンフィレギュリン（amphire gulin）、クリプト（cripto）、ヘレギュリン（heregulin）、およびヘパリン結 合EGFが含まれる。最も最近発見されたこのファミリーのメンバーは、βセルリ ン（betacellulin）であり、これはマウス膵臓β腫瘍細胞の馴化培地から精製さ れた（Sasadaら、B.B.R.C．190:1173-9(1993)）。この遺伝子は、腎臓および肝 臓の組織、ならびに種々の腫瘍細胞株において発現されることが見いだされた。 精製されそして構造的におよび機能的に特徴づけられたアンフィレギュリンは 、1992年5月19日に発行された米国特許第5,115,096号で開示されている。アンフ ィレギュリンは、新生物細胞におけるDNA合成に強力な阻害活性を示すが、ある 正常細胞の増殖を促進する、二機能性細胞増殖調節因子である。アンフィレギュ リン遺伝子は、クローニングされ、そして形質転換したE.coli細胞で生物活性ア ンフィレギュリンを発現させるプラスミドを構築するために用いられている。 TGFαは、多面発現性の生物学的効果を有する。TGFαファミリーのあるメンバ ーの生成は、しばしば、ガン、皮膚疾患、眼疾患などのある病気の状態において 、および炎症または創傷治癒部位で上昇される。TGFαファミリーのメンバーお よびそれらの同族レセプターは、数年間集中的に研究されており、そして包括的 な 総説が最近刊行された（PrigentおよびLemoine、Progress in Growth Factor Re search 4:1-24(1992)；Schultzら、J．Cell．Biochem 45:346-352(1991)；Deryn ck，R.、Mol．Reprod．and Dev．27:3-9(1990)）。 正常成人におけるTFGαは、皮膚、脳、胃腸内粘膜を含む広範な種々の組織、 ***組織（処女、妊娠中、および授乳中の***を含む）、活性化マクロファージ 、ケラチノサイトで発現され、そしてTGFαは脈管形成活性も有する（Kudlow，J .E.、およびBjorge，J.D.、Seminars in Cancer Biology、1:293-302(1990)）。 種々の疾患における細胞増殖の制御におけるそれらの関連の他に、TGFα成長 因子は、胚発生および正常成熟生理機能の維持に重要である。これらの成長因子 はプロセスの多様性に影響を及ぼす；TGFαが、未受精卵母細胞で、着床前の胚 で、および着床または胎盤発育における役割を果たし得る母性脱落膜で発現され るという、TGFαが胚発生のいくつかの局面に関連することを示唆する証拠があ る。機能的TGFα遺伝子を欠くトランスジェニックマウス（「ノックアウト」マ ウス）は異常な皮膚構築、波状の毛、ちぢれた髭を有し、そしてそれらはしばし ば角膜炎症を発現させる。これらの観察は、TGFαが皮膚構築を決定し、そして 毛の発育を調節するにおいて重要な役割を果たすことを示唆している（Mannら、 Cell 73:249-261(1993)）。αトランスフォーミング成長因子ファミリーの多く のメンバーは、***（TGFα）、結腸（クリプト）、および膵臓（βセルリン） などの多くの組織由来のガン細胞についてのオートクリンおよび／またはパラク リン成長因子である。βセルリンは網膜色素上皮細胞および血管平滑筋細胞に対 する強力なマイトジェンであり（Shingら、Science、259:1604-1607(1993)）； そして、アンフィレギュリン（AR）はテストされる標的細胞およびその細胞に適 用されるARの濃度に依存する成長刺激特性または成長阻害特性のいずれかを有す る（Shoyabら Science 243:1074-1076(1989)）。例えば、ARはヒト***繊維芽細 胞の増殖を刺激するが、ARはA431細胞株の成長を阻害する。 さらに、TGFα成長因子は、以下の疾患の症状に関連する：ａ）腫瘍；最近の 研究は、マウスにおいてTGFα（および／またはそのファミリーメンバー）の活 性と拮抗する薬剤の投与により腫瘍の退行が引き起こされることを示している（ Cookら、Cancer Research、52:3224-3227(1992)）；ｂ）皮膚疾患、例えば乾 癬（Cookら、Cancer Research、52:3224-3227(1992)）；およびｃ）創傷治癒（S chultzら、J．Cell．Biochem 45:346-352(1991)）。 ヒトα型トランスフォーミング成長因子（TGFα）は、50アミノ酸および３つ のジスルフィド結合を含む、小さな６Kdaのマイトジェン性タンパク質である。T GFαはEGFレセプターと相互作用し、その内因性プロテインキナーゼを活性化す る。正常な生理機能におけるTGFαの役割は、Kudlow，J.E.およびBjorge，J.D. 、Cancer Biology、1:293-302(1990)に記載されている。TGFαの発現は、形質転 換された細胞および腫瘍において最も一般的であり豊富であるが、ある正常成熟 組織（脳、ケラチノサイト、上皮細胞、活性化マクロファージ、下垂体）におけ る比較的低または中程度レベルで検出可能でもある。TGFαの発現はまた、特定 の時間における発生中の胚で、ならびに、特定の組織、最も顕著には発育中の脳 、腎臓、および肝臓で検出可能である。 これまでに精製されそしてクローニングされたほとんど全てのこのファミリー のメンバーは、ジスルフィド結合を形成して３つのペプチドループを作る６つの 保存されたシステイン残基を含むことが見出されており、それにより類似の二次 構造を有する。さらに、これらの全ての成長因子は、非常に大きい膜結合された グリコシル化前駆体として合成される。TGFα-H1は、これらの６つ全ての保存さ れたシステイン残基を含む。 このファミリーの成長因子は、c-erb-2およびc-erb-3も含み、そのリガンドが 同定されていないEGFレセプターファミリーと相互作用する（PrigentおよびLemo ine、Prog．in Growth Factor Res.、4:1-24(1992)）。ヒト新形成におけるこれ らのレセプターの関連は広く研究されており、そしてこれらのレセプターの過剰 発現はいくつかの形態のガンに対するあまりよくない予後に関連することが見出 されている（Holmesら、Science、256:1205-1210(1992)）。いくつかの腫瘍細胞 もまた、著しく上昇したレベルのTGFαおよび／またはこのファミリーの他のメ ンバーを合成することが見出されている。 本発明の１つの局面によれば、ヒトトランスフォーミング成長因子αH1（TGF α-H1）である新規成熟ポリペプチドならびにそのフラグメント、アナログ、お よび誘導体が提供される。 本発明の別の局面によれば、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレ オチド（DNAまたはRNA）が提供される。 本発明の他の局面によれば、TGFα-H1の可溶性フラグメント、すなわち、貫膜 部分を有さないTGFα-H1であるポリペプチドが提供される。 本発明のさらに別の局面によれば、このようなポリペプチドを組換え技術によ り生成する手順が提供される。 本発明のなお別の局面によれば、このようなポリペプチド、またはこのような ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、診断および治療の目的で（例え ば、創傷治癒を刺激するために、外傷またはAIDS痴呆後の正常な神経学的機能を 回復するために、眼疾患を処置するために、ある細胞を標的にして殺すために、 腎臓および肝臓疾患を処置するために、および毛嚢の発育を促進するために）利 用する方法が提供される。 本発明の他の局面によれば、TGFα-H1またはその可溶性フラグメントに対する 抗体が提供される。 本発明のさらに他の局面によれば、例えば、腫瘍および乾癬の処置においてな らびに診断的にガンを検出するために、このようなポリペプチドの作用を阻害す るために用いられ得るこのようなポリペプチドに対するアンタゴニストが提供さ れる。 本発明のこれらの局面および別の局面は、本明細書中の教示により当業者には 明らかであるべきである。 以下の図面は、単に本発明の特定の実施態様の例示を意味し、そしていかなる 方法における制限も意図しない。 図１は、TGFα-H1 cDNAのオープンリーディングフレームの推定アミノ酸の翻 訳を示す。番号付けは、１〜６位の合成BamHIリンカー（示していない）が遺伝 子のクローニングに用いられたものであるため、７位から始まる。406位の最終 終止コドンも示す。示される配列は132アミノ酸をコードする。TGFα遺伝子ファ ミリーの他のメンバーとの比較により、下線を引いた50アミノ酸のみが可溶性の 生物学的に活性な成長因子の生成に必要であると結論し得る（図３を参照のこと ）。 図２は、3,286ヌクレオチドのTGFα-H1 cDNAの完全ヌクレオチド配列を示す。 １位の合成BamHIリンカーおよび3,286位の合成XhoIリンカーを太字で示す。TGF α-H1タンパク質をコードするオープンリーディングフレームに下線を引き、そ の後に最終終止コドン（太字で示す）がある。長い3'非翻訳領域において、配列 中の不確定物を標準IUPACコードを用いて示す。 図３は、TGFα-H1とTGFα遺伝子ファミリーの他のメンバーとの配列比較を示 す。アステリスクはこのファミリーの成長因子分子の生物学的活性に必要な６つ の重要な保存されたシステイン残基の位置を示す。下線を引いたTGFαの50アミ ノ酸残基は、可溶性成長因子の活性に必要であることが示されている残基である 。（Amphi＝アンフィレギュリン） 図４は、本発明のポリペプチドのRNA発現パターンを示すノーザンブロット分 析の結果を示す。 本発明の１つの局面によれば、図１の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプ チドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）、または1994年3月4日に ATCC受託番号75698として寄託されたクローンのcDNAによりコードされる成熟ポ リペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。 本発明のポリヌクレオチドは、ヒト脳組織およびヒト胎児組織に由来するcDNA ライブラリーにおいて発見された。このポリヌクレオチドは、TGFα遺伝子ファ ミリーに構造的に関連している。このポリヌクレオチドは、132アミノ酸の成熟 ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、この成熟ポリ ペプチドはTGFα遺伝子ファミリーの多くのメンバーに顕著な相同性を示す；こ れらのメンバーは、TGFα自体および他のメンバー（例えば、アンフィレギュリ ンおよびクリプト）を含む。さらに、特徴的なモチーフにおいて全てのメンバー に存在する６つのシステイン残基が、TGFα-H1に保存される。 図１において、下線を引いた50アミノ酸は、TGFα-H1の可溶性フラグメント、 すなわち貫膜部分を有さないTGFα-H1である。TGFαと同様に、TGFα-H1の可溶 性形態は、タンパク質分解開裂を介して、より大きなアミノ酸の内在膜糖タンパ ク質前駆体から遊離される（Derynck、Mol．Reprod．Devel.、27:3-9(1990)）。 本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNA（このDNAはcDNA、ゲノムD NA、および合成DNAを包含する）の形態であり得る。DNAは二本鎖または一本鎖で あり得、そして一本鎖はコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る 。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１に示すコード配列または寄 託したクローンのコード配列と同一であり得、あるいはそのコード配列が、遺伝 コードの重複または縮重の結果として、図１のDNAまたは寄託したcDNAと同じ成 熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。 図１の成熟ポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプ チドをコードするポリヌクレオチド、あるいはそれらの可溶性フラグメントは、 以下を包含し得る：成熟ポリペプチドまたはその可溶性形態のコード配列のみ； 成熟ポリペプチドまたはその可溶性形態のコード配列およびリーダー配列もしく は分泌配列またはプロタンパク質配列のようなさらなるコード配列；成熟ポリペ プチドまたはその可溶性形態のコード配列（および必要に応じて、さらなるコー ド配列）および非コード配列（例えば、イントロンまたは成熟ポリペプチドのコ ード配列の5'および/または3'非コード配列）。 したがって、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペ プチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドならびにさらなるコード配列お よび/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。 本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託し たクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドあるいはその可溶性形態の、 フラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌク レオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの 天然の対立遺伝子変異体またはポリヌクレオチドの非天然の変異体であり得る。 したがって、本発明は、図１に示すものと同じ成熟ポリペプチドまたはその可 溶性形態あるいは寄託したクローンのcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプ チドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドの変 異体を包含する。この変異体は、図１のポリペプチドまたは寄託したクローンの cDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログ をコードする。このようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体、お よび付加または挿入変異体を包含する。 本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１に示すコード配列 または寄託したクローンのコード配列の天然の対立遺伝子変異体であるコード配 列を有し得る。当該分野で公知であるように、対立遺伝子変異体は、１以上のヌ クレオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の別の形 態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的には変化させない。 本発明はまた、ポリヌクレオチドを包含し、ここで成熟ポリペプチドのコード 配列は同じリーディングフレーム内で宿主細胞からのポリペプチドの発現および 分泌を補助するポリヌクレオチド配列（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送 を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）に融合され得る。リー ダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、そして宿主細胞によ り切断されてポリペプチドの成熟形態を形成するリーダー配列を有し得る。ポリ ヌクレオチドはまた、成熟タンパク質およびさらなる5'アミノ酸残基であるプロ タンパク質をコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質はプロタンパク質 であり、そしてそれは不活性型のタンパク質である。一旦プロ配列が切断される と、活性な成熟タンパク質が残る。 したがって、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、または プロ配列を有するタンパク質またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の 両方を有するタンパク質をコードし得る。 本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする マーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列 は、細菌宿主の場合にマーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する pQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。または、例 えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が使用される場合 は、ヘマグルチニン（HA）タグであり得る。HAタグは、インフルエンザヘマグル チニンタンパク質由来のエピトープに対応する（Wilson，I.ら、Cell、37:767(1 984)）。 本発明はさらに、配列間に少なくとも50％および好ましくは70％の同一性が存 在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関 する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな 条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられ る用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが配列間に少な くとも95％および好ましくは少なくとも97％の同一性が存在する場合のみに生じ ることをいう。好ましい実施態様において本明細書中上記のポリヌクレオチドに ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１のcDNAまたは寄託したcDNAにより コードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または生物学的活性 を保持するポリペプチドをコードする。 本明細書中でいう寄託物（１つまたは複数）は、特許手続きの目的のための微 生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下に維持される。これらの寄 託物は、便宜上のみ提供され、そして米国特許法第112条の下で寄託が必要とさ れることを容認するものではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、 ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に 参考として援用されており、そして本明細書中の配列の記載とのいかなる矛盾の 場合も制御されている。寄託物を製造し、使用し、または販売するためには実施 許諾が必要とされ得、そしてこのような実施許諾はこれによって与えられるわけ ではない。 本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列を有するまたは寄託したcDNAにより コードされるアミノ酸配列を有するTGFα-H1ポリペプチド、ならびにこのような ポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。 用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１のポリペプ チドまたは寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドをいう場合は、このよ うなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または生物学的活性を保持するポ リペプチドを意味する。したがって、アナログは、プロタンパク質の部分の切断 により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成し得るプロタンパク質を包含 する。 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または 合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。 図１のポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドのフ ラグメント、誘導体、またはアナログは、(i)その中で１以上のアミノ酸残基が 保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そ してこのような置換されるアミノ酸残基が、この遺伝コードによりコードされる アミノ酸残基であり得るかまたはあり得ないフラグメント、誘導体、またはアナ ログ、または(ii)その中で１以上のアミノ酸残基が置換基を含有するフラグメン ト、誘導体、またはアナログ、または(iii)その中で成熟ポリペプチドがポリペ プチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のよう な別の化合物に融合されているフラグメント、誘導体、またはアナログ、または (iv)その中でリーダー配列または分泌配列あるいは成熟ポリペプチドまたはプロ タンパク質配列の精製に用いられる配列のような成熟ポリペプチドにさらなるア ミノ酸が融合されるフラグメント、誘導体、またはアナログであり得る。このよ うなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者 の範囲内にあると考えられる。 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態 で提供され、そして好ましくは均質に精製される。 用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合 は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動 物に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されないが、 天然系において共存する物質の幾らかまたは全部から分離された同一のポリヌク レオチドまたはDNAあるいはポリペプチドが、単離される。このようなポリヌク レオチドは、ベクターの一部であり得、および／またはこのようなポリヌクレオ チドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてさらにこのようなベ クターまたは組成物がその天然の環境の一部ではないため単離される。 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター を用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術によって本発明のポリペ プチドを生成することに関する。 宿主細胞は、本発明のベクター（これは例えば、クローニングベクターまたは 発現ベクターてあり得る）を用いて遺伝子操作（形質導入または形質転換または トランスフェクト）される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、 ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化 し、形質転換体を選択し、またはTGFα-H1遺伝子を増幅するために適切に改変し た従来の栄養培地中で培養され得る。培養条件（例えば、温度、pHなど）は、発 現のために選択される宿主細胞で以前に使用された条件であり、そして当業者に は明らかである。 本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを生成するため に用いられ得る。したがって、例えば、ポリヌクレオチド配列は、種々の発現ビ ヒクルのいずれか１つ、特にポリペプチドを発現するためのベクターまたはプラ スミドに含まれ得る。このようなベクターは、染色体、非染色体、および合成DN A配列を包含し、例えば、SV40の誘導体；細菌性プラスミド；ファージDNA；酵母 プラスミド；プラスミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、 ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のようなウイル スDNAである。しかし、宿主において複製可能で、そして存続可能である限り、 任意の他のプラスミドまたはベクターも使用され得る。 適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配 列は当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入され る。このような手順および他の手順は、当業者に公知の範囲内であると考えられ る。 発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列（１つまたは複数）（プロ モーター）に作動可能に連結され、mRNAの合成を指示する。このようなプロモー ターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：LTRまたはSV40プロモーター 、E.coli lacまたはtrp、λファージP_Lプロモーター、および原核細胞または真 核細胞あるいはそのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが公知である他の プロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位およ び転写ターミネーターを含有する。ベクターはまた、発現を増幅するための適切 な配列を含有し得る。 さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のため の表現型特性（例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼま たはネオマイシン耐性、またはE．coliにおけるテトラサイクリン耐性またはア ンピシリン耐性）を提供する遺伝子を含有する。 本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列また は制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質 を発現させるために用いられ得る。適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙 げられ得る：細菌細胞（例えば、E．coli、Salmonella typhimurium）；Strepto myces ；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細胞（例えば、DrosophilaおよびSf9）； 動物細胞（例えば、CHO、COS、またはBowes黒色腫）；植物細胞など。適切な宿 主の選択は、本明細書中の教示により当業者の範囲内であると考えられる。 さらに詳細には、本発明はまた、上で広範に記載した１以上の配列を含む組換 え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたは ウイルスベクター）を包含し、このベクターの中には本発明の配列が正方向また は逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物はさ らに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを包含する ）を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、 そして購入可能である。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQE70 、pQE60、pQE-9(Qiagen）、pBs、phagescript、pSiX174、pBluescript SK、pBsK S、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233- 3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核性：pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pSG(S tratagene)；pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、宿主において複製 可能で、そして存続可能である限り、任意の他のプラスミドまたはベクターも使 用され得る。 プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベク ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子 から選択され得る。２つの適切なベクターは、pKK232-8およびpCM7である。特に よく知られた細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、P_L、およ びtrpを含む。真核プロモーターは、CMV即時型、HSVチミジンキナーゼ、初期SV4 0および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネインＩ を包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベ ルの範囲内にある。 さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。 宿主細胞は、高等真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核細胞（例え ば、酵母細胞）であり得るか、または原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る 。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE -デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションによ り達成され得る(Davis，L.、Dibner，M.、Battey，I.、Basic Methods in Molec ular Biology、1986)。 宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生する ために、従来の方法で使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来 のペプチド合成機により合成的に生成され得る。 成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプ ロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、このようなタンパク 質を生成するために、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用して用いられ得る 。原核宿主および真核宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび発現 ベクターは、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版（ Cold Spring Harbor、N.Y.、1989）（この開示は、本明細書中に参考として援用 されている）に記載されている。 本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクタ ーにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはDNAの シス作用因子であり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモーターに作用 してその転写を増大させる。例としては、複製起点(bp100〜270)の後期側のSV40 エンハンサー、サイトメガロウイルスの早期プロモーターエンハンサー、複製起 点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包 含する。 一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能と する選択マーカー（例えば、E．coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS．cerevi siaeのTRP1遺伝子）および下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子に由来 するプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、特に解糖酵素（例え ば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、α因子、酸性ホスファターゼ、また は熱ショックタンパク質）をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は 、 翻訳開始配列および翻訳終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質を細 胞周辺腔または細胞外培地へ分泌することを指示し得るリーダー配列と適切な相 内で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現され た組換え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末端同定ペプチドを 含む融合タンパク質をコードし得る。 細菌での使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読 みとり相で、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を適切な翻訳開始シグ ナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入することにより構築される。ベクターは 、１以上の表現型選択マーカー、ならびに、ベクターの維持を保証するため、お よび所望により宿主内での増幅を提供するために複製起点を含有する。形質転換 のために適切な原核宿主は、E．coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimu rium 、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属の種 々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。 代表的な、しかし限定しない例として、細菌での使用に有用な発現ベクターは 、周知のクローニングベクターpBR322（ATCC37017）の遺伝エレメントを含む市 販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌の複製起点を含有し得る。こ のような市販のベクターは、例えば、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals、Up psala、Sweden）およびGEM1(Promega Biotec、Madison、WI、USA)を包含する。 これらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造 配列と組み合わされる。 適切な宿主系統の形質転換および適切な細胞密度への宿主系統の増殖に続いて 、選択されたプロモーターは、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘 導）により脱抑制され、そして細胞はさらなる期間培養される。 細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段に より破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。 タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音 波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法によ り破砕され得る。 種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用い られ得る。哺乳動物発現系の例は、Gluzman、Cell、23: 175(1981)に記載されて いるサル腎臓繊維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の 細胞株（例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）を包含する。哺乳 動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、なら びにまた、任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス ドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終止配列、および５'フラ ンキング非転写配列を含有する。SV40のウイルスゲノムに由来するDNA配列（例 えば、SV40オリジン、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、およ びポリアデニル化部位）は、必要な非転写遺伝エレメントを提供するために使用 され得る。 TGFα-H1またはその可溶性形態は、以前に使用される方法により組換え細胞培 養物から回収され、そして精製される。これらの方法には、硫安沈殿またはエタ ノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸 セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニ ティークロマトグラフィー（例えば、固体支持体上にDNAまたはヌクレオチドを 使用する）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマ トグラフィーが包含される。精製の間に存在する低濃度（約0.1mM〜約5mM）のカ ルシウムイオンを有することが好ましい（Priceら、J．Biol．Chem.、244:917(1 969)）。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（refolding）工程が、成熟 タンパク質の配置を完全にするために使用され得る。最終的に、高速液体クロマ トグラフィー(HPLC)が、最終的な精製工程に用いられ得る。 本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物 であり得るか、あるいは原核宿主または真核宿主（例えば、培養物中の細菌、酵 母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から組換え技術により生成され得る 。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、哺乳 動物または他の真核性の糖質でグリコシル化され得るか、あるいはグリコシル化 され得ない。本発明のポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を含み 得る。 本発明のポリペプチドは、EGFRファミリーのEGFレセプターにおいてレセプタ ーを特徴付けするのに用いられ得る。現在、このファミリーは、EGFR1、EGFR2、 EGFR3、およびEGFR4レセプターを含む。EGFR2レセプターはerb-2とも呼ばれ、そ してこの分子は種々の診断および治療の指標に有用である（Prigent，S.A.、お よびLemoine，N.R.、Prog．in Growth Factor Res.、4:1-24(1992)）。TGFα-H1 ポリペプチドは、１以上のこれらのレセプターおよび未だ同定されていない新規 なEGF型レセプターに対するリガンドのようである。TGFα-H1ポリペプチドの使 用は、このようなレセプターの同定、特徴付け、およびクローニングを補助し得 る。 本発明のポリペプチドはまた、外傷または他の損傷を受けている病状（例えば 、AIDS痴呆、老人性痴呆など）の結果として減少される神経学的機能の回復また は増強に用いられ得る。TGFαおよびその相同体は、脳の大部分においてEGF/TGF αレセプターに対する最も豊富なリガンドであることが見出されている（Kaser ら、Brain Res Mol Brain Res: 16:316-322、(1992)）。より狭く分離した領域 に存在するのみであるEGFと対比して、TGFαは脳の種々の領域において広範囲に 分布するようである。これは、TGFαが脳組織で生理学的役割を果たし得ること を示唆する。脳におけるTGFαに対するこれらの多数のレセプター部位は、TGFが 正常脳細胞の分化および機能を促進するに重要な有用性を有することを示唆する 。したがって、神経学的機能が減少される場合、本発明のポリペプチドの投与は 、脳を刺激して適切な生理学的機能を増強し得る。 TGFα-H1またはその可溶性形態はまた、眼疾患（例えば、角膜炎症）の処置に 用いられ得る。種々の実験は、このような病状におけるTGFα遺伝子ファミリー のメンバーを包含している。最近の論文は、眼病においてこれらの成長因子が果 たす役割に関連するいくつかのデータを要約している（Mannら Cell 73:249-261 (1993)）。最近の実験は、TGFα遺伝子を欠く多くのマウスが、眼の固有質への 白血球および他の細胞の浸潤のため、角膜炎症を表すことを示している。 さらに、TGFα成長因子のその標的細胞に対する特異性は、標的細胞を破壊す るメカニズムとして利用され得る。例えば、TGFα-H1またはその可溶性形態は、 毒性分子：例えば、標的細胞を不活性化する放射性薬剤に（広範な種々の方法に より）結合され得る。これらの成長因子−トキシン融合物は標的細胞（そしてあ る場合には、種々の「バイスタンダー（bystander）」効果により近隣の細胞） を殺す。このようなトキシン−融合遺伝子の最近の例はMesriら、J．Biol．Chem ．268:4853-62(1993)により公表されている。 これと同様の方法で、TGFα-H1は抗新形成化合物として用いられ得る。インビ ボでの使用については、本発明のポリペプチドは、種々の方法で投与され得、こ の方法には、注射、注入、局所的、非経口的などが包含されるが、これらに限定 されない。投与は、リン酸緩衝化生理食塩液、生理食塩液、滅菌水などを包含す る任意の生理学的に受容可能なキャリア中であり得る。TGFα-H1および関連分子 はまたリポソーム中にカプセル化され得、そして腫瘍特異的抗原または細胞特異 的抗原を認識してこれらに結合する抗体に複合化され得、これにより「標的され ている」細胞に対する手段が提供され得る。 腎臓においてこれらの成長因子が発現することが見出されているので、TGFα- H1ポリペプチドフラグメントはまた、ある腎臓疾患を処置するために使用され得 る。したがって、これらの因子はこの器官の適切な生理学的維持に必要であり得 る。 TGFαおよびその相同体ならびに肝細胞成長因子が、部分的肝切除後および急 性肝細胞壊死後に肝細胞の再生を引き起こすので、処置はまた、肝再生／肝機能 障害に関連し得る（Masuhara，M.ら、Hepatology 16:1241-1249(1992)）。 TGFα-H1の重要な用途は創傷治癒に関する。本発明の組成物は、実質的に全て の皮膚創傷、角膜創傷、および身体の上皮に沿って並んだ腔（hollow）器官への 損傷を包含する広範な種々の創傷を処置するために使用され得る。処置に適切な 創傷は、火傷、擦傷、および切り傷などの外傷、ならびに外科的切開および皮膚 移植などの外科的手順から生じる創傷を包含する。本発明のポリペプチドでの処 置に適切な他の状態は、慢性潰瘍、糖尿病性潰瘍、および他の非治癒（栄養性） 症状などの慢性状態を包含する。 TGFα-H1またはその可溶性フラグメントは、罹患した領域へ適用するための生 理学的に受容可能なキャリア中に混合され得る。キャリアの性質は広く変化し得 、そして意図する適用位置に依存する。皮膚への適用については、クリームまた は軟膏基剤が通常好ましく；適切な基剤としては、ラノリン、Silvadene（Mario n）（特に火傷の処置に対して）、Aquaphor（Duke Laboratories、South Norwal k，Conn.）などが挙げられる。所望であれば、創傷のペプチドへの連続的曝露を 提供するために、包帯および他の創傷治療材料中に組成物を含むTGFα-H1を混合 することが可能である。エアロゾル適用もまた使用が見られ得る。 処置組成物中のTGFα-H1濃度は重要ではないが、上皮細胞増殖を誘導するに十 分であるべきである。組成物は、罹患した領域に局所的に、代表的には、眼に対 しては点眼剤、あるいは皮膚に対してはクリーム剤、軟膏剤、またはローション 剤として適用され得る。眼の場合には、頻回処置が望ましく、通常４時間以下の 間隔で適用される。皮膚においては、治癒の間、１日当たり２〜４回またはそれ より頻繁に処置組成物を適用して、罹患した領域上に処置組成物を連続的に維持 することが望ましい。 本発明のポリペプチドの使用量は、投与方法、他の活性化合物の使用などで変 化し、一般に、約１μg〜100μgの範囲である。本発明のポリペプチドは、生理 食塩液、リン酸緩衝化生理食塩液などの生理学的に受容可能なキャリアとともに 用いられ得る。用いられる化合物の量は、本発明のポリペプチドまたは本発明の ポリペプチドを含む処方物に対するインビトロでの細胞の応答および実験動物の 応答に基づき、実験的に決定される。 TGFα-H1またはその可溶性フラグメントは、血管新生、骨再吸収、免疫応答、 ならびにシナプス性およびニューロン性エフェクター機能の調節に用いられ得る 。TGFα-H1はまた、アラキドン酸カスケードの調節に用いられ得る。 TGFα-H1またはその可溶性フラグメントはまた、末端分化に関連する適用にも 用いられ得る。多くのTGFα因子およびその相同体は、それらの標的細胞におけ る末端分化を誘導する。この特性は、因子を投与しそして標的細胞の死を誘導す ることによりインビボで利用され得る。この投与法は、ガンおよび他の増殖性疾 患のような医学的に望ましくない細胞型の過増殖に関連する疾患（例えば、炎症 、乾癬など）について考慮される。インビボ投与の他に、インビトロ投与が保証 され得る種々の状況がある。例えば、骨髄は、成長因子および／またはその誘導 体で細胞を処置することにより、インビトロでの望ましくない細胞集団を追放し 得る。 適用はまた、脱毛症、毛髪喪失、および毛嚢の発育に影響を与える他の皮膚症 状に関連する。いくつかの方針の証拠は、このような状態に関連するTGFα成長 因子を包含する。上記のように、TGFα遺伝子におけるヌル（null）変異を含む ように操作された「ノックアウト」マウスは、量的および質的な毛髪合成に関す る異常を示す。さらに、マウスにおけるマッピング研究は、毛髪生育に影響を与 えるいくつかの変異がTGFα遺伝子座に対してマッピングされることを示してい る（Mannら、Cell 73:249-261(1993)）。TGFα-H1またはその誘導体の局所的適 用または全身的適用は、いくつかの形態の脱毛症および毛髪喪失を処置するため に使用され得、そしてこれらの請求の範囲は本発明の範囲内である。 ある病気の病状は、TGFα-H1成長因子の全身的臨床投与により部分的にまたは 完全に改善され得る。この投与は、遺伝子治療の形態であり得（以下を参照のこ と）；あるいは、TGFα-H1 DNAの組換え構築物からまたはペプチド化学合成から 合成されたペプチドまたはタンパク質の投与を介する（Wooら、Protein Enginee ring 3:29-37(1989)）。 遺伝子治療は、インビボでの本発明のポリペプチドの発現である。 従って、例えば、骨髄細胞のような細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌ クレオチド（DNAまたはRNA）を用いてエクソビボで操作され得、次いで、操作さ れた細胞はポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は 当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRN Aを含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって 操作され得る。 同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分 野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発 明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するた めの産生細胞は、インビボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチ ドの発現のために患者に投与され得る。 このような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法ま たは他の方法は、本発明の教示により当業者には明らかであるべきである。例え は、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス粒子以外のもの（例 えば、アデノウイルス）であり得る。これは、適切な送達ビヒクルと組み合わせ た後インビボで細胞を操作するために使用され得る。 遺伝子治療の代替方法において、ポリペプチドの投与が裸のまたはカプセル化 された（例えばリポソームなど）TGFα-H1 DNAの直接的注射を介して達成され得 る。 本発明のポリペプチドは、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る 。このような組成物は、治療有効量のタンパク質、および薬学的に受容可能なキ ャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、生理食塩液、緩衝化 生理食塩液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの 組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投与の態様に合わ せるべきである。 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１以上の成分で満たされた１以上の容 器を含有する薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器は、薬剤ま たは生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定され た形式の通知と関連し得、この通知はヒトへの投与についての製造、使用、また は販売における機関による認可を反映する。さらに、本発明のポリペプチドは、 他の治療的化合物と併用して用いられ得る。 TGFα-H1に対して感受性の標的細胞集団の増殖を誘導または阻害するために最 も有効な濃度は、種々の量のTGFα-H1を細胞に添加してそれらの応答をモニター することにより決定され得る。さらに、TGFα-H1の生成を増強または抑制する薬 学的物質が、目的の薬剤で処置された細胞によるTGFα-H1メッセージまたはタン パク質の合成をモニターすることにより評価され得る。 本発明の配列はまた、染色体の同定に有益であり得る。この配列は、個々のヒ ト染色体上の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置でハイブリダイズ し得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染 色***置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標 識試薬はほとんどない。本発明に記載のDNAの染色体へのマッピングは、これら の配列と疾患に関する遺伝子とを相関させることにおいて重要な、第１の工程で ある。 簡略に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を 調製することにより染色体にマップされ得る。cDNAのコンピューター解析が、ゲ ノムDNA内で１より多いエキソンにまたがらず、したがって増幅プロセスを複雑 化しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプラ イマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニン グに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するこれらのハイブリ ッドのみが増幅フラグメントを生じる。 体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当て るための迅速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーと共に 使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式の大きな ゲノムクローンのプールを用いて部分的位置決め(sublocalization)が達成され 得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピング戦略は、イ ンサイチュハイブリダイゼーション、標識したフローサイトメトリーで選別した （flow-sorted）染色体でのプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライ ブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ選択を包含する。 cDNAクローンの中期染色体展開物への蛍光インサイチュハイブリダイゼーショ ン(FISH)は、１工程で正確な染色***置を提供するために使用され得る。この技 術は、500または600塩基ほどの短いcDNAで使用され得る；しかし、2,000bpより も大きいクローンの方が、簡便な検出では十分なシグナル強度で独特の染色*** 置に結合しやすい。FISHは、ESTが由来するクローンの使用を必要とし、そして このクローンは長いほど好ましい。例えば、2,000bpが良好であり、4,000bpはよ り良好であり、そして4,000bpを超える長さは、当節の適度な割合で（a resonab le percentage of the time）良好な結果を得るためにおそらく必ずしも必要で ない。この技術の総説としては、Vermaら、Human Chromosomes: a Manual of Ba sic Techniques．Pergamon Press、New York(1988)を参照のこと。 一旦配列が正確な染色***置にマップされると、配列の染色体上での物理的な 位置を遺伝的地図のデータと相関させ得る。（このようなデータは、例えば、V ．McKusick、Mendelian Inheritance in Man に見出される(Johns Hopkins Univ ersity Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である))。次いで、同 一の染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的 に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。 次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する 必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個体 には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であると思われる。 物理的マッピングおよび遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関 する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的原因遺 伝子の１つであり得る。（これは、１メガ塩基のマッピング解像度で、そして20 kbあたり１遺伝子と仮定する。） 罹患個体と非罹患個体との比較は、一般に、まず染色体の構造変化（例えば、 染色体展開物から目視可能であるか、あるいはそのcDNA配列に基づくPCRを使用 して検出可能である欠失または転座）を探す工程を包含する。最終的には、変異 の存在を確認し、そして変異を多型から区別するために、数個体由来の遺伝子を 完全に配列決定する工程が必要とされる。 本発明はさらに、アンチセンス技術の使用によるインビボでのTGFα-H1の阻害 に関する。アンチセンス技術は、３重ヘリックスの形成あるいはアンチセンスDN AまたはアンチセンスRNAを介して遺伝子発現を制御するために使用され得る。こ れらの方法は両方とも、DNAまたはRNAへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例 えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５'コー ド部分が、10塩基対〜40塩基対の長さのアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを 設計するために使用される。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関わる遺伝子の 領域に相補的であるように設計され（３重ヘリックス-Leeら、Nucl．Acids Res. 、6:3073(1979)；Cooneyら、Science、241:456(1988)；およびDervanら、Scienc e、251:1360(1991)を参照のこと）、その結果TGFα-H1の転写および生成を防ぐ 。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボでmRNAにハイブリダイズし 、そしてTGFα-H1へのmRNA分子の翻訳をブロックする（アンチセンス-Okano、J ．Neurochem.、56:560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitor s of Gene Expression、CRC Press、Boca Raton、FL(1988)を参照のこと）。 あるいは、上記のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスRNAまたはアンチセン スDNAがインビボで発現されて上記の様式でTGFα-H1の生成を阻害し得るように 、当該分野の手順により細胞に送達され得る。 それゆえ、TGFα-H1に対するアンチセンス構築物は、抗腫瘍治療に用いられ得 る。なぜなら、最近の研究が、マウスにおける腫瘍細胞によるTGFα（またはそ の相同物）の分泌または生成の阻害が、腫瘍の退縮を引き起こすことを示してい るからである。このようなインヒビターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、 モノクローナル抗体などであり得る。アンチセンスヌクレオチドは細胞による成 長因子の生成を妨害するが、抗体は、表面に結合した成長因子または分泌された 成長因子に結合して中和する。 このポリペプチド、そのフラグメント、または他の誘導体、またはそれらのア ナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を生成させるた めの免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体 またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体お よびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物 を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメン トの生成のために使用され得る。 本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体またはそのイン ビボレセプターは、動物へのポリペプチドの直接注射により、または動物へのポ リペプチドの投与により得られ得る。この動物は、好ましくはヒトではない。次 いで、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このよう にして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも、天然のポ リペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、このよ うな抗体は、ポリペプチドを発現する組織からそのポリペプチドを単離するため に使用され得る。 モノクローナル抗体の調製のために、細胞株の連続培養により産生される抗体 を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術（Kohl erおよびMilstein、1975、Nature、256: 495-497）、トリオーマ技術、ヒトＢ細 胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、1983、Immunology Today 4:72）、およびヒ トモノクローナル抗体を生成するためのEBVハイブリドーマ技術（Coleら、1985 、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R．Liss，Inc.、77-96頁 ）が挙げられる。 単鎖抗体を生成するために記載された技術（米国特許第4,946,778号）を、本 発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得 る。 TGFαに特異的な抗体が、ガンの診断および治療に用いられ得る。なぜなら、 多くのタイプのガン細胞が、新形成または過形成のプロセスの間に種々のメンバ ーのTGFαファミリーをアップレギュレートするからである。これらの抗体はTGF α-H1に結合してTGFα-H1を不活性化する。TGFα（および／またはそのファミリ ーメンバー）に対するモノクローナル抗体は、過形成および新形成増殖異常を含 む（しかしこれらに限定されない）特定の疾患の診断および治療のために臨床使 用される。新形成組織による成長因子発現のアップレギュレーションは、罹患患 者の血液中の成長因子の増加を検出する種々の血清アッセイについての基準を形 成する。これらのアッセイは、代表的には、診断のセッティングに適用されるの みでなく、（手術、化学療法などの後の隠れた腫瘍細胞の存在を検出するため） 予後のセッティングにも適用される。 さらに、TGFα-H1レセプターを発現する悪性細胞は、レセプター結合アッセイ において標識したTGFα-H1またはTGFα-H1関連分子を用いることにより、あるい はTGFα-H1レセプター自体に対する抗体を用いることにより検出され得る。細胞 は、TGFα-H1に対するレセプターの存在および密度に従って区別され得、これに より、このような細胞のTGFα-H1の生物学的活性に対する感受性を予測するため の手段が提供され得る。 本発明はまた、本発明のポリペプチドのアンタゴニスト/インヒビターに関す る。アンタゴニスト/インヒビターは、ポリペプチドの機能を阻害または排除す るものである。 したがって、例えば、アンタゴニストは本発明のポリペプチドに結合し、そし てその機能を阻害または排除する。このアンタゴニストは、例えば、ポリペプチ ドまたはある場合ではオリゴヌクレオチドに結合するポリペプチドに対する抗体 であり得る。インヒビターの例は、ポリペプチドの触媒部位に結合してこれを塞 ぎ、それにより触媒部位を基質に接近不能にし、その結果正常な生物学的活性が 妨害される、小分子である。小分子の例は、小ペプチドまたはペプチド様分子を 包含するが、それらに限定されない。 あるいは、本発明のポリペプチドが正常に結合するレセプターに結合する、本 発明のポリペプチドに対するアンタゴニストが用いられ得る。アンタゴニストは 、天然のタンパク質のレセプター部位を認識してそれに結合するような密接に関 連したタンパク質であり得る。しかし、これらはポリペプチドの不活性形態であ り、その結果レセプター部位が塞がれているのでTGFα-H1の作用を妨害する。こ れらの方法により、アンタゴニスト/インヒビターは、特定の皮膚疾患（例えば 、乾癬）の処置のために治療的に使用され得る。最近の研究は、乾癬病変などの 病気から得た皮膚生検中でこれらの成長因子の発現レベルが上昇していることを 見出している（Cookら、Cancer Research 52:3224-3227(1992)）。 アンタゴニスト/インヒビターはまた、ガンを検出するために診断的に用いら れ得る。なぜなら、TGFα-H1がいくつかのタイプのガン細胞によりアップレギュ レートされ得、そしてアンタゴニストがTGFα-H1の上昇したレベルを測定するた めのアッセイに使用され得るからである。これらのアンタゴニスト／インヒビタ ーは、ガンの処置にも使用され得る。なぜなら、それらが腫瘍におけるTGFα-H1 レセプター部位をブロックし、そしてマウスにおいてTGFαまたはその相同物の 活性の阻害が腫瘍の退縮を引き起こすからである。 アンタゴニスト/インヒビターは、例えば本明細書中上記のような薬学的に受 容可能なキャリアを有する組成物中で用いられ得る。 本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はこのよ うな実施例に限定されないことを理解されたい。すべての部または量は、他に明 記しない限り重量基準である。 以下の実施例の理解を容易にするために、現れる頻度の高い特定の方法および ／または用語を記載する。 「プラスミド」は、小文字のｐの前および／または後の大文字および／または 数字により示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であり、制限基準な く公的に入手可能であり、または公表された手順に従って人手可能なプラスミド から構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラスミドが当該分 野で公知であり、そして当業者には明らかである。 DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触 媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市 販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者 に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１μgのプラスミドまた はDNAフラグメントが約２単位の酵素とともに約20μlの緩衝溶液中で使用される 。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的には、代表的には５ 〜50μgのDNAが20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化される。特定の 制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37℃ での約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、しかしこれは供給 者の説明書に従って変動し得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直 接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。 切断されたフラグメントのサイズ分離は、Goeddel，D.ら、Nucleic Acids Res .、8:4057(1980)により記載された８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行わ れる。 「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相 補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成さ れ得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５'リン酸を有さず、従ってキ ナーゼの存在下でリン酸とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに連 結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに 連結する。 「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形 成するプロセスをいう(Maniatis，T.ら、前出、146頁)。他に提供されていなけ れば、連結は、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフラグメント0.5μgあたり10 単位のT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）とともに、公知の緩衝液および条件を用 いて達成され得る。 他に記載しない限り、形質転換はGraham F.およびVan der Eb，A.、Virol.、5 2:456-457(1973)の方法に記載されるように行った。 実施例１ TGFα-H1の細菌発現および精製 TGFα-H1由来のオープンリーディングフレームを、これが挿入されているBlue scriptに基づくベクターから取り出して、pQE9と呼ばれる新タイプのクローニン グベクター中に配置し得る（以下を参照のこと）。このベクターはBamHI-HindII Iフラグメントを受容し得る。BamHI-HindIII適合性制限フラグメントを、挿入フ ラグメントを合成するために、DNAの5'末端および3'末端に対応するPCRオリゴヌ クレオチドプライマーを用いることにより、TGFα-H1から生成し得る。5'オリゴ ヌクレオチドプライマーは、配列5'-ATTCTAGTTGGATCCGATGGACTACAATATCGACCA-3' を有し、BamHI制限部位（下線部）、続いて21ヌクレオチドのTGFα-H1コード領 域を含む；3'の配列5'-CTCCCTCAAAGGAAGCTTTTAAGAGC-3'は、TGFα-H1遺伝子の3' 非翻訳部分内に天然に存在するHindIII部位（下線部）に相補的な配列を含む。B amHIおよびHindIII部位は、細菌発現ベクターpQE9（Qiagen，Inc．9259 Eton Av e、Chatsworth CA 91311）上のBamHIおよびHindIII部位と適合可能である。この プラスミドベクターは、抗生物質耐性（Amp^r）、細菌の複製起点（ori）、IPTG- 制御可能プロモーター／オペレーター（P/O）、リボソーム結合部位（RBS）、6- ヒスチジンタグ（6-His）、および制限酵素クローニング部位をコードする。次 いで、連結混合物を用いて、E．coli M15/rep4株（m15/rep4の商標でQiagenから 入手可能）を形質転換した。M15/rep4は、プラスミドpREP4の多数のコピーを含 み、lacIリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性（Kan^r）も与える。形 質転換体は、AmpとKanとの両方を含むLBプレートで増殖するそれらの能力により 同定される。所望の構築物を含むクローンを、Amp（100μg/ml）とKan（25μg/m l）との両方を補充したLB培地で液体培地中で一晩（O/N）増殖させた。O/N培養 物を用いて1:100〜1:250の比で大きな培養物を接種する。細胞を、600の吸光度 （O.D.⁶⁰⁰）が0.4と0.6との間になるまで増殖させた。次いで、IPTG（「イソプ ロピル-B-D-チオガラクトピラノシド」）を加えて１mMの最終濃度にした。IPTG をlacIリプレッサーを不活性化することにより誘導し、P/Oを明らかにして遺伝 子発 現を増加させる。細胞をさらに３〜４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離 により採取した。細胞ペレットをカオトロピック剤である６MグアニジンHCLで可 溶化した。澄明になった後、可溶化されたTGFα-H1を、6-Hisタグを含むタンパ ク質により堅く結合させる条件下でNickel-Chelateカラムでのクロマトグラフィ ーによりこの溶液から精製した。（Hochuli，E.ら、Genetic Engineering、Prin ciple & Methods、12:87-98 Plenum Press、New York(1990)）。TGFα-H1（95％ 純粋）を、６MグアニジンHCL pH 5.0でカラムから溶出し、そして再生の目的の ために、３MグアニジンHCL、100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオン（還元 型）、および２mMグルタチオン（酸化型）に調整した。この溶液で12時間インキ ュベーションした後、タンパク質を50mMリン酸ナトリウムに対して透析した。 本発明の多くの改変および変形が、上記の教示を考慮すれば可能であり、した がって、特に記載がなければ、添付の請求の範囲の範囲内で本発明は実施され得 る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＤＳ 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/495 Ｃ０７Ｈ 21/04 9356−4Ｈ 16/22 Ｃ０７Ｋ 14/495 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 16/22 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 1/21 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/08 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/36 ＡＤＵ // Ｇ０１Ｎ 33/53 9051−4Ｃ 37/64 ＡＣＳ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 フルドナー， レベッカ アメリカ合衆国 メリーランド 20838, バーネスビル，ピー．オー．ボックス 306， バーネスビル ロード 18040 (72)発明者 アダムス， マーク ディー. アメリカ合衆国 メリーランド 20878, ノース ポートマック，ダフィーフ ド ライブ 15205

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．TGFα-H1をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、 （ａ）図１の推定アミノ酸配列を有するTGFα-H1ポリペプチド、あるいは該ポリ ペプチドの活性なフラグメント、アナログ、または誘導体をコードするポリヌク レオチド； （ｂ）ATCC受託番号第75698号に含まれるcDNAによりコードされるアミノ酸配列 を有するTGFα-H1ポリペプチドあるいは該ポリペプチドの活性なフラグメント、 アナログ、または誘導体をコードするポリヌクレオチド、 からなる群から選択される、ポリヌクレオチド。 ２．前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド 。 ３．前記ポリヌクレオチドがTGFα-H1の可溶性フラグメントをコードする、請 求項１に記載のポリヌクレオチド。 ４．前記ポリヌクレオチドがRNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド 。 ５．前記ポリヌクレオチドがゲノムDNAである、請求項１に記載のポリヌクレ オチド。 ６．前記ポリヌクレオチドが図１の推定アミノ酸配列を有するTGFα-H1をコー ドする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 ７．前記ポリヌクレオチドがATCC受託番号第75698号のcDNAによりコードされ るTGFα-H1ポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 ８．図１に示されるTGFα-H1のコード配列を有する、請求項１に記載のポリヌ クレオチド。 ９．ATCC受託番号第75698号として寄託されるTGFα-H1のコード配列を有する 、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 １０．請求項２に記載のDNAを含むベクター。 １１．請求項１０に記載のベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞。 １２．請求項１１に記載の宿主細胞から前記DNAによりコードされるポリペプ チドを発現させる工程を包含する、ポリペプチドを生成するためのプロセス。 １３．請求項１０に記載のベクターを用いて細胞を遺伝子操作する工程を包含 する、ポリペプチドを発現し得る細胞を生成するためのプロセス。 １４．請求項２に記載のDNAにハイブリダイズ可能でありかつTGFα-H1活性を 有するポリペプチドをコードする、単離されたDNA。 １５．(i)図１の推定アミノ酸配列を有するTGFα-H1ポリペプチド、ならびに その活性なフラグメント、アナログ、および誘導体、および(ii)ATCC受託番号第 75698号のcDNAによりコードされるTGFα-H1ポリペプチド、ならびに該ポリペプ チドの活性なフラグメント、アナログ、および誘導体、からなる群から選択され るポリペプチド。 １６．前記ポリペプチドが図１の推定アミノ酸配列を有するTGFα-H1である、 請求項１５に記載のポリペプチド。 １７．請求項１５に記載のポリペプチドに対する抗体。 １８．請求項１５に記載のポリペプチドに対するアンタゴニスト／インヒビタ ー。 １９．TGFα-H1の必要を有する患者の処置のための方法であって、患者に治療 有効量の請求項１５に記載のポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。 ２０．TGFα-H1を阻害する必要を有する患者の処置のための方法であって、患 者に治療有効量の請求項１８に記載のアンタゴニスト／インヒビターを投与する 工程を包含する、方法。 ２１．請求項１５に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを 含有する、薬学的組成物。 ２２．前記ポリペプチドがTGFα-H1の可溶性フラグメントである、請求項１５ に記載のポリペプチド。 ２３．前記ポリペプチドの治療有効量が、患者に該ポリペプチドをコードする DNAを提供し、そして該ポリペプチドをインビボで発現させることにより投与さ れる、請求項１９に記載の方法。