DE69414723T2

DE69414723T2 - Lyophilisierte stammzellenfaktor formulierungen

Info

Publication number: DE69414723T2
Application number: DE69414723T
Authority: DE
Inventors: Susan I. Newbury Park Ca 91320 Hershenson
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Priority date: 1993-12-22
Filing date: 1994-12-21
Publication date: 1999-07-22
Anticipated expiration: 2014-12-22
Also published as: US6288030B1; CN1142771A; AU696860B2; US20020013258A1; EP0732935A1; ES2123951T3; AU1442295A; IL112088A0; NZ278252A; HK1008815A1; CA2182970C; US5965522A; WO1995017206A1; EP0732935B1; US6020469A; CA2182970A1; DE69414723D1; IL112088A; ATE173402T1; ZA9410189B

Description

LYOPHILISIERTE STAMMZELLENFAKTOR-FORMULIERUNGEN

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Stammzellfaktor-Zusammensetzungen und Verfahren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neue lyophilisierte Stammzellenfaktor-Präparate und Verfahren zu deren Herstellung.
Stammzellenfaktor ("SCF") ist ein frühzeitig wirkender hämatopoetischer Faktor; vgl. PCT WO 91/05795 mit dem Titel "Stern Cell Factor". Pharmazeutische SCF-Zusammensetzungen sind bekannt, PCT WO 91/05795, supra, Seiten 20-21, jedoch wäre eine pharmazeutische SCF-Zusammensetzung mit einer erhöhten Haltbarkeitsdauer sowohl für den Erzeuger als auch den Verbraucher des Produkts günstig.
In Lösung ist die SCF-Stabilität durch eine Reihe von Abbaureaktionen begrenzt, einschließlich Spaltung, Deamidierung und Modifikation bei Chromatographie mit RP-HPLC. Gefriertrocknung (Lyophilisierung) wird für die Haltbarmachung vieler biologisch aktiver Materialien, einschließlich Proteinen, als nützlich und wirksam betrachtet. Lyophilisierung verursacht jedoch selbst eine Belastung, einschließlich extremer Konzentration des Proteins während des Gefrierprozesses und Entfernung des Wassers, was zur Instabilität des Produkts führen kann. So kann Lyophilisierung zu erhöhter Vernetzung (kovalente Oligomerbildung) und nicht kovalenter Aggregation führen, zusätzlich zu Deamidierung und Oxidation, die sowohl im lyophilisierten Zustand als auch im flüssigen Zustand auftreten können. So sind schützende Mittel oft erforderlich, um die Stabilität des Arzneistoffs durch eine Reihe an Mechanismen zu verstärken, einschließlich Erhöhung der Glasübergangstemperatur des Präparats (die Temperatur, bei der die Zusammensetzung von einem flüssigen, gummiartigen und reaktiven Zustand in einen festen und daher weniger reaktiven Zustand übergeht); diese Schutzmittel wirken als Cryo- oder Lyoschutzstoffe (das sind schützende Mittel während des Gefrier- und/oder Trockungsprozesses); und/oder sie können gebundene Wassermoleküle ersetzen, die für die konformelle Stabilität des Proteins notwendig sind.
Aminosäuren wurden in manchen Fällen als Stabilisatoren für gefriergetrocknete Proteinprodukte beschrieben. Von Natriumglutamat und Lysin-HCl wurde berichtet, daß sie cryoprotektive Wirkungen auf die Gefrier-Denaturierung eines Proteins, Lactatdehydrogenase, besitzen (Seguro et al., Cryobiology 27, 70-79 (1990)). Hora et al. beschreiben die Verwendung von L- Arginin, L-Carnitinchlorid oder L-Betain als Puffer für rhIL-2 (in Developments in Biological Standardization, Bd. 74, Karger, Basel, 1992). Die mit Betain gepufferten Formulierungen zeigten Dimerbildung in einem beschleunigten Test, während Arginin/Carnitin-gepufferte Formulierungen schlechte mechanische Stabilität zeigten, was zur Aggregation des Proteins während der Herstellung führt. So verstärkt die Verwendung von Aminosäuren nicht vorhersagbar die Stabilität lyophilisierter Proteinprodukte. Andere Molekülklassen, einschließlich Mono- und Disaccharide und Polymere, wie PVP, wurden ebenfalls als Stabilisatoren von lyophilisierten Proteinen beschrieben. Jedoch ist auch hier der Nutzen für irgendein bestehendes Proteinprodukt nicht vorhersehbar.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Präparate aus gefriergetrocknetem SCF, die Aminosäurepuffer beinhalten. Überraschenderweise erhöht eine Zugabe der Aminosäuren Histidin und/oder Glutaminsäure als Puffer die SCF-Stabilität im Vergleich zu Präparaten, in denen anorganische oder andere organische Verbindungen für eine Einstellung und Aufrechterhaltung des pHs verwendet wurden. Bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Präparate sind die mit einer Kombination von Histidin und Glutaminsäure gepufferten Präparate. Die vorliegenden Präparate können gegebenenfalls zusätzliche Stabilisatoren wie Sucrose beinhalten. Derartige Präparate können ebenfalls gegebenenfalls ein Füllmittel und/oder ein die Osmolarität steuerndes Mittel wie Mannit beinhalten.
Der Schutzeffekt des erfindungsgemäßen Aminosäurepuffers ist vorhanden, jedoch ist die genau Wirkweise unbekannt. Eine mögliche Erklärung betrifft die Glasübergangstemperatur von Histidin. Im wesentlichen ist die Glasübergangstemperatur die Temperatur, bei der sich die Zusammensetzung (hier SCF enthaltend) von einem vergleichsweise unbeweglichen, unreaktiven (und daher ziemlich stabilen) Zustand zu einem verhältnismäßig beweglichen, reaktiveren (und daher weniger stabilen) Zustand verändert. Da die Glasübergangstemperatur von Histidin im Vergleich zu Nicht-Amino-Säure-Pufferbestandteilen verhältnismäßig hoch ist, könnte Histidin zur Gesamtstabilität des gefriergetrockneten Präparats beitragen.
Ein weiterer Mechanismus, durch den Aminosäuren SCF schützen könnten, ist der einer Co- Konzentration mit dem Protein während des Gefrierens. Sie dienen so der Verdünnung und dem Schutz des Proteins. Möglicherweise wechselwirken die amphiphilen Aminosäuren spezifisch mit dem Protein, um es gegen Denaturierung während des Gefrierens und/oder der Gefriertrocknung zu schützen.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird erkannt, daß Sucrose eine schützende Wirkung auf lyophilisierte SCF-Präparate hat. Wiederum ist die genaue Wirkweise unbekannt, jedoch betrifft eine mögliche Erklärung die Glasübergangstemperatur; ähnlich wie oben für Histidin beschrieben. Die Gesamt-Glasübergangstemperatur hängt von der Glasübergangstemperatur der Bestandteile des Präparats ab, sowie deren relativen Anteilen und Sucrose besitzt ebenfalls eine verhältnismäßig hohe Glasübergangstemperatur. Da Sucrose mit SCF im gefrorenen Zustand co-konzentriert, könnte es zur Verdünnung von SCF dienen und daher zum Schutz gegen Aggregation.
Eine alternative Erklärung betrifft den Austausch von Wasser. Proteine wie SCF enthalten gebundene Wassermoleküle, wobei der Austausch durch Polyole die Stabilität erhöhen könnte. Sucrose könnte bessere Wasser-Austauscheigenschaften gegenüber arideren Polyolen besitzen.
Die erfindungsgemäßen Präparate unter Verwendung der Aminosäuren Histidin und/oder Glutaminsäure und gegebenenfalls Sucrose und gegebenenfalls eines Füllmittels wie Mannit und weiterhin gegebenenfalls eines die Osmolarität steuernden Mittels, was ebenfalls Mannit sein kann, ermöglichen ein SCF-Präparat mit verbesserter Stabilität. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung derartiger Präparate.

Detailliere Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Säulendiagramm, was die relative Stabilität in Bezug auf Erhöhung der geringeren SCF-Spezies (Fragmente sind durch Umrißlinien, Dimere durch eine schwarze Ausma lung der Umrißlinien dargestellt) in verschiedenen Präparaten von SCFmet1-165 (bei einer Konzentration von 6,0 mg/ml) in einer beschleunigten Stabilitätsuntersuchung darstellt, die bei hoher Temperatur (45ºC) 4 Wochen durchgeführt wurde. Die erste Säule (auf der linken Seite) stellt eine flüssige Lösung an SCFmet1-165 mit 10 mM Natriumacetat, pH 5,0 und 140 mM NaCl dar (A5N): Die zweite Säule (S5M) stellt 10 mM Natriumsuccinat, pH 5,0, 5% Mannit dar; die dritte Säule (GSM) stellt 10 mM Glutaminsäure, pH 5,0, 5% Mannit dar; die vierte Säule (GH5M) stellt 10 mM Glutaminsäure, 8,35 mM Histidin, pH 5,0, 5% Mannit dar; die fünfte Säule (H6M) stellt 10 mM Histidin, pH 6,0, 5% Mannit dar; und die sechste Säule (HG6M) stellt 10 mM Histidin, 5 mM Glutaminsäure, pH 6,0, 5% Mannit dar. Diese Figur verdeutlicht, daß mit Glutaminsäure oder Histidin gepufferte Proben stabiler als ein vergleichbares mit einer Nicht-Amino-Säure (Succinat) gepuffertes Präparat sind; und daß mit einer Kombination von Histidin und Glutaminsäure gepufferte Präparate weniger vernetzte Dimere enthalten als mit einer einzigen Aminosäure gepufferte Präparate des gleichen pHs.
Fig. 2 ist ein Säulendiagramm, das die relative Stabilität als Aggregation (was vernetzte und nicht-vernetzte Spezies umfassen kann) von verschiedenen SCFmet1-165-Präparaten zeigt. Die Proben und Bedingungen waren die gleichen wie in Fig. 1.
Fig. 3 ist ein Säulendiagramm, das die relative Reinheit in Bezug auf durch RP-HPLC detektierbare Spezies von verschiedenen SCFmet1-165-Präparaten in einer bei erhöhter Temperatur (45ºC) für 12 Wochen durchgeführten beschleunigten Stabilitätsuntersuchung zeigt. Die gezeigten Proben sind die gleichen wie in Fig. 1, mit der Ausnahme, daß die Probe ohne einen Aminosäurepuffer in dieser Figur nicht vorkommt. Die durch kleine Kästchen verdeutlichten Punkte im oberen Bereich der Figur zeigen die Reinheit der Proben bei Beginn der Untersuchung.
Fig. 4 ist eine Photographie eines silber-gefärbten SDS-Gels, das den Grad der Vernetzung in verschiedenen SCFmet1-165-Präparaten nach einer vierwöchigen Inkubation bei 45ºC zeigt. Spur 1 (von links) ist ein Molekulargewichtsstandard, Spur 2 ist frei, Spur 3 ist ein SCFmet1-165-Standard; Spur 4 ist frei, Spur 5 ist ein flüssiges SCFmet1-165-Kontrollpräparat (A5N wie in Fig. 1 beschrieben, jedoch mit 1,5 mg/ml), Spur 6 ist das für Fig. 1 beschriebene HG6M (mit der Ausnahme, daß es SCF mit 1,5 mg/ml enthält), Spur 7 (K6M) ist ein SCFmet1-165-Präparat mit 1,5 mg/ml mit 10 mM K-Phosphat, pH 6,0, 5% Mannit, Spur 8 ist ein SCFmet1-165-Präparat mit 1,5 mg/ml mit 10 mM K-Phosphat, pH 6,0, 0,5% Sucrose, 4,5% Mannit (K6SuM), Spur 9 ist ein SCFmet1-165-Präparat mit 1,5 mg/ml mit 10 mM K-Phosphat, pH 6,0, 0,5% Sucrose, 0,5% Polyethylenglykol-8000 und 4,5% Mannit (K6SuPM).
Fig. 5 ist ein SEC-HPLC-Chromatogramm von verschiedenen SCF-Präparaten nach einer sechswöchigen Inkubation bei 45ºC. Die verwendeten Proben sind die vorstehend für Fig. 4 beschriebenen.
Fig. 6 ist eine Photographie eines silber-gefärbten SDS-Gels mit verschiedenen SCFmet1- 165-Präparaten (1,5 mg/ml) nach fünfwöchiger Inkubation bei 45ºC. Die Präparate, es sei denn anders erwähnt, sind die aus Fig. 4. Spur 1 (von links) sind Molekulargewichtsmarker, Spur 2 ist frei, Spur 3 ist ein SCFmet1-165-Standard, Spur 4 ist A5N (flüssige Lösung an SCF als Kontrolle), Spur 5 ist HG6M, Spur 6 (H6PM) ist ein SCFmet1-165-Präparat mit 10 mM Histidin, 5 mM Glutaminsäure, pH 6,0, 0,5% PEG-8000 und 5% Mannit, Spur 7 (HG6SuM) ist ein SCFmet1-165-Präparat mit 10 mM Histidin, 5 mM Glutaminsäure, pH 6,0, 0,5% Sucrose und 4,5% Mannit, Spur 8 (HG6SuPM) ist ein SCFmet1-165-Präparat mit denselben Bestandteilen wie HG6SuM und zusätzlich 0,5% Polyethylenglykol-8000, Spur 9 (K6M) ist ein SCFmet1-165-Präparat mit 10 mM K-Phosphat, pH 6,0 und 5% Mannit, Spur 10 (K6PM) ist ein SCFmet1-165-Präparat mit 10 mM K-Phosphat, pH 6,0, 5% Mannit und 0,5% Polyethylenglykol-8000, Spur 11 (K6SuM) ist ein SCFmet1-165-Präparat mit 10 mM K-Phosphat, pH 6,0, 0,5% Sucrose und 4,5% Mannit, Spur 12 (K6SuPM) ist ein SCFmet1-165-Präparat mit 10 mM K-Phosphat; pH 6,0, 0,5% Sucrose, 0,5% Polyethylenglykol-8000 und 4,5% Mannit.
Fig. 7 ist ein Säulendiagramm, das die relative Reinheit als durch Ionenaustausch-HPLC wahrnehmbare Spezies in verschiedenen, wie vorstehend in Fig. 6 beschriebenen SCF-Präparaten nach fünfwöchiger Inkubation bei 37ºC zeigt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft SCF-Präparate mit verbesserter Stabilität. Ein erfindungsgemäßer Aspekt sind lyophilisierte SCF-Präparate, umfassend Histidin und/oder Glutamin säure. Die lyophilisierten Präparate können gegebenenfalls Sucrose beinhalten und ebenfalls gegebenenfalls ein Füllmittel und ein die Osmolarität steuerndes Mittel. In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung derartiger Präparate.
Obwohl jedes SCF hier verwendet werden könnte, werden bevorzugt die in PCT WO 91/05795 gezeigten und beschriebenen verwendet werden und insbesondere rekombinantes SCFmet1-165 des Menschen, in E. coli produziert, wird als aktiver Bestandteil verwendet.
Das Füllmittel ist bevorzugt Mannit, jedoch werden Fachleute weitere zur Bildung eines lyophilisierten "Kuchens" geeignete Mittel mit entsprechendem Gewicht und Osmolarität erkennen. Weitere Mittel beinhalten NaCl, Glycin, Polymere wie Dextran, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, wobei jedoch Mannit wie vorstehend beschrieben bevorzugt ist.
Das SCF-Präparat soll bevorzugt die Aminosäuren Histidin oder Glutaminsäure beinhalten und insbesondere beinhaltet das Präparat Histidin, Glutaminsäure und Sucrose. Wie nachstehend gezeigt, beinhaltet das stabilste und daher am meisten bevorzugte Präparat lyophilisiertes rekombinantes SCFmet1-165 des Menschen, Histidin, Glutaminsäure, Sucrose, ein Füllmittel und ein die Osmolarität steuerndes Mittel, das, wie oben beschrieben, besonders bevor = zugt Mannit ist. Der pH wird vorzugsweise auf zwischen pH 5,0 und pH 6,0 eingestellt, insbesondere pH 6,0.
Ein bevorzugt lyophilisiertes Präparat für SCF ist 10 mM Histidin, 5 mM Glutaminsäure, pH 6,0, 0,5% Sucrose und 4, 5% Mannit. Ein weiteres bevorzugtes lyophilisiertes Präparat für SCF ist 10 mM Histidin, 5 mM Glutaminsäure, pH 6,0, mit 5% Mannit. Zusätzlich ist für alle der bevorzugte aktive Bestandteil SCFmet1-165, wie oben beschrieben, bei einer Konzentration von 0,25 bis 12,5 mg/ml aus Gründen der besten kommerziellen Praktikabilität.
Die vorliegenden Verfahren betreffen die Herstellung der erfindungsgemäßen Präparate. In einem Aspekt betrifft die vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines lyophilisierten SCF-Präparats, umfassend die Schritte:
(a) Mischen des SCFs in einem Puffer, der die Aminosäuren Histidin oder Glutaminsäure enthält; und
(b) Lyophilisieren des SCFs.
Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen weiterhin einen oder mehrere der nachfolgenden Schritte: Einstellen des pHs dieser Mischung auf zwischen pH 5,0 und pH 6,0 vor dem Lyophilisieren, Zugabe von Sucrose zu dieser Mischung vor dem Lyophilisieren, Zugabe von wenigstens einem Mittel, ausgewählt aus einem Füllmittel und einem die Osmolarität regulierenden Mittel zu dieser Mischung vor dem Lyophilisieren. Im letztgenannten Schritt kann das Mittel Mannit, Glycin, NaCl oder Polymere, wie die vorstehend aufgeführten, sein.
SCF kann zur Behandlung von verschiedenen hämatopoetischen, neurologischen und die Fortpflanzung betreffenden Krankheiten verwendet werden; vgl. WO 91/05795 und US- Anmeldung 07/982,255. So können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung derartiger Krankheiten verwendet werden. Derartige Krankheiten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf die Behandlung von Leukopenie, Thrombozytopenie, Anämie, die Verstärkung der Einbringung von Knochenmark bei der Transplantation, die Verbesserung der Wiederherstellung des Knochenmarks bei der Behandlung von durch Strahlung, Chemikalien oder Chemotherapeutika hervorgerufener Knochenmarksaplasie oder Myelosuppression, AIDS und zur Sensibilisierung von Zellen gegenüber Chemotherapie. Derartige Verwendungen und Zusammensetzungen ermöglichen ebenfalls eine Behandlung eines an einer Nervenschädigung, an Unfruchtbarkeit oder an einer Darmschädigung erkrankten Säugers.
Die erfindungsgemäßen SCF-Präparate können auch in vitro verwendet werden. Zum Beispiel könnte bei einer Gentherapie eine Transfektion einer hämatopoetischen Zelle mit exogener DNA und eine Kultivierung dieser Zelle in Anwesenheit der erfindungsgemäßen SCF-Präparate erwünscht sein. So beinhaltet in einem weiteren Aspekt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Kultivierung hämatopoetischer Zellen in vitro, umfassend:
(i) Animpfen dieser Zellen in ein geeignetes Kulturmedium, wobei das geeignete Kulturmedium erfindungsgemäß formuliertes SCF enthält, und
(ii) Bereitstellung geeigneter Bedingungen für das Wachstum der hämatopoetischen Zellen.
Insbesondere ermöglicht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Transfektion hämatopoetischer Zellen mit exogener DNA umfassend: (i) Kultivierung der hämatopoetischen Zellen mit erfindungsgemäß formuliertem SCF und (ii) Transfektion der kultivierten Zellen mit exogener DNA: Die hämatopoetischen Zellen können z. B. Knochenmarkszellen oder periphere Blut-Vorläuferzellen sein.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Kit bereit, enthaltend Komponenten zur Kultivierung von Zellen oder peripheren Blut-Vorläuferzellen, umfassend:
(i) ein erfindungsgemäßes SCF-Präparat und
(ii) Bestandteile, geeignet zur Herstellung von Medium für die Kultivierung von Knochenmarkszellen oder peripheren Blut-Vorläuferzellen.
Die Verwendungen und Produkte können hier die Verabreichung oder Einverleibung von wenigstens einem zusätzlichen Faktor beinhalten, wobei der Faktor ausgewählt wird aus EPO, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IGF-1, LIF, Interferon (wie α, β, gamma oder Konsensus), neurotrophe Faktoren (wie BDNF, NT-3, CTNF oder Noggin), andere multi-potente Wachstumsfaktoren (wie Stammzellen-Teilungsfaktor und totipotenter Stammzellenfaktor), Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (wie FGF) und Analoga, Fusionsmoleküle oder andere Derivate der vorstehenden Faktoren. Zum Beispiel wurde gezeigt, daß SCF in Kombination mit G-CSF periphere Blut- Vorläuferzellen in vivo mobilisiert. Ex vivo wurde z. B. gezeigt, daß SCF in Kombination mit G-CSF, IL-3 und IL-6 geeignet für eine Vermehrung von peripheren Blutzellen ist.
Die in den vorliegenden Beispielen verwendeten Materialien und Methoden werden zuerst beschrieben. Beispiel 1 zeigt, daß mit Aminosäuren gepufferte SCF-Präparate stabiler über einen bestimmten Zeitraum sind als SCF-Präparate, in denen der pH mit anderen Verbindungen stabil gehalten wird. Beispiel 2 zeigt, daß Sucrose die Stabilität von SCF in Amino- und Nicht-Amino-Säure-Formulierungen erhöht. Es zeigt auch wieder die Verbesserung der Sta bilität, sobald Aminosäurepuffer verwendet werden. Beispiel 3 zeigt die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Präparate.

Materialien und Methoden

Herstellung von rekombinantem SCFmet1-165

SCFmet1-165 der vorliegenden untersuchten Präparate wurde in E. coli hergestellt (K-12- Stamm). Die verwendete Nukleinsäuresequenz und Aminosäuresequenz ist nachstehend gezeigt. Nach der Fermentation wurde die Zellpaste lysiert. Das SCF wurde solubilisiert, rückgefaltet und oxidiert und mittels mehrerer chromatographischer Schritte gereinigt. Das offensichtliche Molekulargewicht des Proteins ist etwa 18 500.

Herstellung von Präparat-Puffern

Präparat-Puffer wurden aus konzentrierten Stammlösungen hergestellt. Aus Natriumsuccinat, Kaliumphosphat, Glutaminsäure oder Histidin bestehende Puffer wurden, falls nötig, auf den gewünschten pH durch Zugabe von HCl oder NaOH eingestellt.

Pufferaustausch

SCF wurde in 10 mM Na-Acetat; pH 5,0, 140 mM NaCl bereitgestellt. Das Protein wurde in den Präparat-Puffer gebracht durch Dialyse bei 4ºC mit SpectraPor 7-Dialysemembranen, Molekulargewichts-Ausschlußgröße von etwa 3500. Jede Probe wurde bei dreimaligem Austausch des Präparat-Puffers dialysiert, wobei die Puffermenge mindestens das 100fache des Volumens der zu formulierenden Probe betrugt. PEG-8000 wurde aus einer konzentrierten Stammlösung nach der Dialyse zugegeben. Alternativ könnte ein Pufferaustausch durch Diafiltration, Entsalzung über eine GPC-Säule oder irgendeine andere geeignete Methode durchgeführt werden.
Nach dem Pufferaustausch wurde die SCF-Konzentration durch Absorption bei 280 nm festgestellt und durch Verdünnung auf den gewünschten Wert eingestellt. Die SCF-Konzentration kann 0,25 mg/ml oder weniger bis 12,5 mg/ml oder mehr betragen. (Die SCF-Konzentration wird nachstehend für jedes Beispiel genannt.) In einem wirbelfreien Abzug wurden die Proben unter Verwendung von 0,22 Mikron Gelman Acrodisc Spritzenfiltern steril filtriert und in 3 cc Typ I-Glasgefäße gefüllt. Lyophilisierungsstopfen wurden im Abzug auf die Gefäße gesteckt.
Lyophilisieren. Proben wurden in einen VirTis Genesis 12 EL (VirTis, Gardinen N. Y. 12526)-Lyophilsierer gegeben, der auf eine Kammertemperatur von etwa 4ºC vorgekühlt war. Die Proben wurden schnell eingefroren (etwa 1ºC/min bis -50ºC) und mindestens 2 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Gegebenenfalls wurde, um Mannit zu kristallisieren, die Heizplattentemperatur für 2-3 Stunden auf -25ºC erhöht und dann auf -50ºC bei einer Geschwindigkeit von 10ºC/Stunde abgekühlt. Nach einer zusätzlichen Phase von wenigstens 2 Stunden wurde ein Vakuum von etwa 100 mTorr geschaffen. Die Heizplattentemperatur wurde auf eine Temperatur von -45ºC bis -10ºC für eine Primärtrocknung erhöht.
(Primärtrocknungstemperatur wird nachstehend für alle Beispiele genannt.) Primärtrocknung wurde für 24-48 Stunden durchgeführt. Die Heizplattentemperatur wurde dann auf +20ºC bis +25ºC zur Sekundärtrocknung erhöht und das Vakuum wurde soweit wie möglich erniedrigt (typischerweise etwa 25 mTorr). Sekundärtrocknung wurde für 24-72 Stunden durchgeführt. Am Ende der Sekundärtrocknung wurden die Proben unter Vakuum (≤ 25 mTorr) mit einem Stopfen versehen und die Gefäße aus dem Gefriertrockner entnommen. Zur Durchführung der beschleunigten Stabilitätsuntersuchungen wurden einige Proben zur Lagerung in Inkubatoren gegeben. Weitere Proben wurden in einen Gefrierschrank mit -70ºC gegeben, um als Kontrolle zu dienen. Die meisten Gefäße wurden bei 4ºC aufbewahrt. Zum Zeitpunkt der Untersuchung wurden die Proben in sterilem WFI auf die gewünschte Konzentration gebracht.
SDS-PAGE. SDS-PAGE wurde gemäß Standardverfahren durchgeführt (Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)). 15%ige Polyacrylamidgele einer einheitlichen Konzentration wurden für die Trennung verwendet. Zum Laden wurde 7,5 ug Material pro Spur verwendet. Gele wurden mit Coomassie Blue gefärbt und mit einem Molecular Dynamics Personal Densitometer eingelesen. Nach dem Einlesen wurden die Gele entweder getrocknet oder silber-gefärbt.
Reverse-Phase (RP)-HPLC. RP-HPLC wurde auf einem Waters 625 LC-System unter Verwendung einer 5 Mikron C4-Säule von Vydac, Porengröße 300 A durchgeführt. Protein wurde in eine mit 45,6% Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) equilibrierte Säule injiziert und mit einem linearen Gradienten von 45,6 bis 64,6% Acetonitril, 0,1% TFA, eluiert. Protein-Peaks wurden mittels Absorption bei 220 nm aufgezeichnet.
Größenausschluß (SEC)-HPLC. SEC-HPLC wurde auf einem Waters 625 LC-System unter Verwendung einer Phenomenox BioSep SEC-53000-Säule durchgeführt. Der Elutionspuffer hatte 100 mM Phosphat, pH 6,9. Protein wurde durch Absorption bei 280 nm aufgezeichnet.
Ionenaustausch (IEX)-HPLC. IEX-HPLC wurde auf einem Waters 625 LC-System unter Verwendung einer TSK Progel 5P-5PW-Säule bei Raumtemperatur durchgeführt. Proben wurden 6 · in 20 mM Natriumacetat verdünnt und auf eine mit dem gleichen Puffer equilibrierte Säule gegeben. SCF wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0-0,5 M Na&sub2;SO&sub4; eluiert. Protein wurde durch Absorption bei 230 nm aufgezeichnet.
Biologische Aktivität. Bioaktivität wurde unter Verwendung der Wachstumfaktor-abhängigen menschlichen Megakaryozyten-Zellinie UT-7 ermittelt. Bei der Zugabe von SCF tritt ein Teil der Zellen wieder in den Zellzyklus ein und durchläuft ihn bis zur S-Phase (DNA-Synthese). Der vorliegende Test basiert auf dieser Reaktion, die durch Aufnahme an ³H-Thymidin ermittelt wird. UT-7-Zellen wurden zur Entfernung von exogenem Wachstumsfaktor gewaschen und bei Anwesenheit von verschiedenen SCF-Proben, wie in Beispiel 3 beschrieben, ausplattiert. Nach 3 Tagen wurde ein Pulse an ³H-Thymidin für 6 Stunden gegeben. Irrkorporation in DNA wurde durch Waschen, Ernten und Bestimmung des radioaktiven Signals der Zellen auf Glasfaserfiltern gemessen. Die als Units im Vergleich zur Masse der Testproben gemessene Aktivität wurde durch Vergleich mit einer Standardkurve bestimmt.

BEISPIEL 1

Diese Beispiel zeigt eine Verbesserung der Stabilität von SCF in mit Aminosäuren gepufferten Präparaten. Es zeigt auch weitere Verbesserungen, falls Kombinationen von Aminosäuren verwendet wurden. In diesem Beispiel wurden Präparate ohne Aminosäuren mit Präparaten enthaltend Aminosäuren bei zwei verschiedenen pHs verglichen:
Die SCF-Konzentration betrug 6,0 mg/ml für alle Proben. Alle Präparate wurden unter den gleichen Bedingungen lyophilisiert; die Primär-Trocknungstemperatur für diese Untersuchung betrug -25ºC. Zum Vergleich ist ein flüssiges Präparat (ebenfalls 6,0 mg/ml SCF) gezeigt. Das flüssige Präparat (A5N) enthält 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, 140 mM NaCl.
Die Proben wurden bei einer hohen Temperatur, 45ºC, für wenigstens 4 Wochen inkubiert. Manche Proben wurden 12 Wochen bei 45ºC gehalten. Am Ende wurden die Proben auf Stabilität untersucht.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1, 2 und 3 gezeigt, die zeigen, daß (1) die Aminosäuren-enthaltenden Präparate stabiler über den Zeitraum waren als die ohne Aminosäuren gepufferten; (2) die Präparate mit Aminosäuren bei pH 6,0 besser waren als die bei pH 5,0; (3) die Präparate mit einer Kombination der Aminosäuren Histidin und Glutaminsäure bei pH 6,0 am besten waren, da sie den geringsten Anstieg an zu dem Ausgangsmaterial verschiedenen SCF- Spezies (Fragmente, Aggregate, usw.) wie durch verschiedene analytische Verfahren bestimmt zeigen.
Fig. 1 ist ein Säulendiagramm, das die Menge an vernetzten SCF-Produkten (d. h. SCF-Oligomere, ein Abbauprodukt) nach Inkubation bei einer erhöhten Temperatur (45ºC) zeigt, wie durch die vorstehend beschriebene SDS-PAGE bestimmt. Wie erkennbar, enthielten die lyophilisierten Präparate mit Aminosäuren als Puffer weniger vernetzte Dimere als die Präparate mit Natriumsuccinat als Puffer (S5M). Im allgemeinen wurden in den Präparaten weniger Diniere bei pH 6,0 (H6M und HG6M) bestimmt als in vergleichbaren Präparaten bei pH 5,0 (G5M und GH5M).
Fig. 2 ist ein Säulendiagramm, das den Grad einer nicht-kovalenten Aggregation zeigt, die in den verschiedenen Präparaten auftritt und durch Größenausschlußchromatographie wie vorstehend beschrieben bestimmt wird. Wie erkennbar, besitzt das Präparat mit dem Succinat- Puffer bei pH 5,0 den höchsten Prozentsatz an Aggregation (mehr als 3%) und das mit Histidin und Glutaminsäure gepufferte SCF-Präparat bei pH 6,0 (HG6M) enthielt wiederum in Übereinstimmung mit den in Fig. 1 gezeigten Ergebnissen den niedrigsten Prozentsatz an Aggregation (weniger als 1%).
Fig. 3 ist ein Säulendiagramm, das die prozentuale Reinheit (d. h. den prozentualen Wert des Haupt-Peaks, bestimmt wie vorstehend beschrieben durch Reverse-Phase-HPLC) der verschiedenen SCF-Präparate zeigt. Diese Messung wurde nach 12wöchiger Inkubation bei hohen Temperaturen durchgeführt. Dieses Diagramm zeigt, daß das SCF-Präparat HG6M mit Histidin, Glutaminsäure und Mannit bei pH 6,0 die höchste prozentuale Reinheit von mehr als 90% (wie durch diese Verfahren bestimmt) der getesteten Proben besaß. Die zweithöchste Reinheit wurde ebenfalls für ein Präparat mit einem Puffer einer Aminosäurekombination, GH5M, bei pH 5,0, bestimmt, das ebenfalls eine Reinheit von mehr als 90% besaß. Die flüssige Kontrolle (A5N) besaß eine prozentuale Reinheit von zwischen 60 und 70%. RP-HPLC- Abbau, ein Hauptweg der Instabilität in Lösung, ist wesentlich bei Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren erniedrigt.

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel zeigt in zwei Schritten, daß Sucrose die Stabilität der getesteten Präparate verbessert. Die erste Untersuchung zeigt, daß Sucrose die Stabilität von mit Nicht-Amino- Säuren gepufferten SCF-Präparaten verbessert. Zusätzlich wurde gezeigt, daß Polyethylenglykol in Nicht-Amino-Säure-enthaltenden Puffern mit Sucrose ebenfalls zur Stabilität beiträgt. Diese Untersuchung zeigt auch, daß ein SCF-Präparat unter Verwendung der Amino- Säure-Puffer aus Histidin und Glutaminsäure stabiler als die Nicht-Amino-Säure-gepufferten Präparate ist, selbst wenn die letzteren zusätzliche Stabilisatoren enthalten.
Die zweite Untersuchung zeigt, daß Sucrose ebenfalls die Stabilität der Aminosäure-gepufferten Präparate erhöht. Es wurde jedoch gezeigt, daß Polyethylenglykol-8000 keine Wirkung auf die Stabilität dieser Präparate hat.
Untersuchung 1. Hier besaßen alle Präparate einen pH von 6,0. Durch Aminosäuren gepufferte Präparate wurden mit durch Kaliumphosphat gepufferten Präparaten ± Sucrose und ± Polyethylenglykol-8000 verglichen:
Alle Präparate enthielten SCFmet1-165 bei 1,5 mg/ml. Alle Präparate wurden unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen lyophilisiert, wobei die Primär-Trocknungstemperatur -25ºC betrugt. Ein flüssiges Präparat (ebenfalls mit 1,5 mg/ml SCFmet1-165) wurde zum Vergleich verwendet und es enthielt 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, 140 mM NaCl.
Fig. 4 zeigt ein silber-gefärbtes SDS-Gel von Proben nach einer vierwöchigen Inkubation bei 45ºC. Unter den Kaliumphosphat gepufferten Präparaten zeigt K6SuPM die Bande mit dem geringsten Molekulargewicht, was die niedrigste Menge an vernetztem (d. h. kovalent dimerisierten) SCF verdeutlicht. Dies zeigt, daß Sucrose und Polyethylenglykol bei Phosphatgepufferten Präparaten zur Stabilität beitragen. Fig. 4 zeigt ebenfalls, daß das Präparat mit dem Aminosäure-Puffer jedoch den geringsten Anteil des Materials eines hohen Molekulargewichts enthält, was verdeutlicht, daß das Histidin/Glutaminsäure-Präparat noch stabiler als das Kaliumphosphat/Sucrose/Polyethylenglykol-Präparat ist.
Fig. 5 zeigt ein Chromatogramm einer Größenausschluß-HPLC (wie vorstehend beschrieben) der vorstehenden Proben (HG6M, K6SuM, K6SuPM und die flüssige Kontrolle, A5N). Die Proben wurden 6 Wochen bei 45ºC inkubiert. Wie erkennbar, zeigt HG6M einen Haupt- Peak und einen kleineren Peak (enthaltend Aggregate). Im wesentlichen Unterschied dazu wiesen die Kaliumphosphat gepufferten Präparate mehrere Peaks auf.
Untersuchung 2. In dieser Untersuchung wurden Sucrose und Polyethylenglykol zu den Aminosäure-gepufferten Präparaten gegeben und mit den Kaliumphosphat gepufferten Präparaten verglichen:
Ähnlich zur Untersuchung 1 in diesem Beispiel, vorstehend, verwendeten alle Präparate SCFmet1-165 bei 1,5 mg/ml. Alle Präparate wurden unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen lyophilisiert, wobei die Primär-Trocknungstemperatur -35ºC betrug. Ein flüssiges Präparat (ebenfalls 1,5 mg/ml SCFmet1-165) wurde zum Vergleich verwendet und es enthielt 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, 140 mM NaCl.
Fig. 6 zeigt ein silber-gefärbtes SDS-Gel der Proben nach fünfwöchiger Inkubation bei einer erhöhten Temperatur von 45ºC. Bei demselben pH (pH 6,0) zeigten die mit der Kombination an Histidin und Glutaminsäure gepufferten Präparate viel weniger Vernetzung als die ebenbürtigen mit Kaliumphosphat gepufferten Präparate. Die Zugabe von 0,5% Sucrose verbesserte wesentlich die Stabilität der Histidin/Glutaminsäure gepufferten sowie der Phosphatgepufferten Präparate. Die Zugabe von Polyethylenglykol-8000 hatte keine Wirkung auf den Grad der Vernetzung; dies kann auf der niedrigeren Temperatur der Primärtrocknung (-35ºC hier im Gegensatz zu -25ºC bei den Proben der Untersuchung 1) beruhen.
Fig. 7 zeigt einen Vergleich der gleichen Präparate durch Ionenaustauschchromatographie. Wiederum zeigen die Histidin/Glutaminsäure gepufferten Präparate höhere Stabilität unter den beschleunigten Inkubationsbedingungen als die entsprechenden Phosphat-gepufferten Präparate. Einverleiben von Sucrose (0,5%) verbessert die Stabilität sowohl der Aminosäure- als auch der Phosphat-gepufferten Präparate.

BEISPIEL 3

Biologische Aktivität. Alle Proben der Aminosäure-enthaltenden Puffer zeigten biologische Aktivität ähnlich zu SCF in Lösung. Die vorstehenden Proben aus Beispiel 1 wurden auf biologische Aktivität nach 4 Wochen (bei 2-8ºC) getestet und wiederum nach 1 Jahr (aufbewahrt bei 2-8ºC) unter Verwendung des vorstehend beschriebenen UT-7-Bioassays. Die nachstehende Tabelle zeigt die Konzentration des aktiven Materials in verschiedenen Proben.
Wie erkennbar, ist die biologische Aktivität von allen Proben zu der des Ausgangsmaterials vergleichbar.

Sequenzprotokoll

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(1) ANMELDER:
(A) NAME: Amgen Inc.
(B) STRASSE: One Amgen Center Drive
(C) STADT: Thousand Oaks
(D) STAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 91320-1789
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Lyophilisierte Stammzellenfaktor-Formulierungen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 501 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 166 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

Claims

1. Ein lyophilisiertes Stammzellenfaktor ("SCF")-Präparat, enthaltend Histidin und/oder Glutaminsäure als Puffer und Stabilisator.

2. Lyophilisiertes SCF-Präparat nach Anspruch 1, wobei das Präparat Sucrose enthält.

3. Lyophilisiertes SCF-Präparat nach Anspruch 1 oder 2, enthaltend ein Füllmittel.

4. Lyophilisiertes SCF-Präparat nach Anspruch 3, wobei das Füllmittel Mannit ist.

5. Lyophilisiertes SCF-Präparat nach Anspruch 4, enthaltend 10mM Histidin, 5mM Glutaminsäure, 0,5% Sucrose und 4,5% Mannit und eingestellt auf einen pH-Wert zwischen 5,0 und 6,0.

6. Lyophilisiertes SCF-Präparat nach Anspruch 4, enthaltend 10mM Histidin, 5mM Glutaminsäure und 5% Mannit und eingestellt auf einen pH-Wert von 6.0

7. Verfahren zur Herstellung eines lyophilisierten Stammzellenfaktor-Präparats, umfassend die Schritte:

a) Vermischen von SCF in einem Histidin und/oder Glutaminsäure enthaltenden Puffer und

b) Lyophilisieren des Gemisches.

8. Verfahren nach Anspruch 7, weiter umfassend das Einstellen des pH-Wertes des Präparats auf einen Wert zwischen pH 5,0 und 6,0 vor der Lyophilisation.

9. Verfahren nach Anspruch 7, weiter umfassend das Zusetzen von Sucrose zum Präparat vor der Lyophilisierung.

10. Verfahren nach Anspruch 9, weiter umfassend das Zugeben mindestens eines Mittels ausgewählt aus einem Füllmittel und einem die Osmolarität steuernden Mittel zum Präparat vor der Lyophilisation.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Füllmittel Mannit ist.