DE69101784T2

DE69101784T2 - Stabilisierte zusammensetzung enthaltend ein fibroblastwachstumsfaktor.

Info

Publication number: DE69101784T2
Application number: DE69101784T
Authority: DE
Inventors: Marco Adami; Casa Rosanna Dalla; Luciano Gambini; Roberto Magrini; Rosaria Mariani; Giovanni Perrone
Original assignee: Carlo Erba SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1990-07-18
Filing date: 1991-07-16
Publication date: 1994-08-04
Anticipated expiration: 2011-07-17
Also published as: EP0539408B1; ES2055607T3; JP3100058B2; EP0539408A1; AU659997B2; CA2087430A1; GB9015824D0; DE69101784D1; WO1992001442A1; AU8109491A; JPH05508640A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft gefriergetrocknete (lyophilisierte) Zusammensetzungen, die Fibroblasten- Wachstumsfaktor (FGF) mit mitogener Aktivität bei Menschen, und insbesondere menschlichen basischen Fibroblasten- Wachstumsfaktor (bFGF) enthalten. Der bFGF kann ein natürlicher oder ein durch rekombinante Mittel hergestellter sein.
Eine sichere Handhabung und Verabreichung von Protein- Arzneimitteln stellt eine große Herausforderung an pharmazeutische Galeniker dar, weil Proteine einzigartige chemische und physikalische Eigenschaften besitzen, die schwierige Stabilitätsprobleme ergeben: für Proteine existiert eine Vielzahl von Abbau-Wegen, die sowohl mit einer chemischen als auch physikalischen Instabilität verbunden sein können. Aufgrund der Verunreinigung der Lösungen während der Reinigung oder Lagerung besteht für diese Makromoleküle auch das Risiko eines mikrobiellen Abbaus. Diese Überlegungen sind insbesondere für einen Hersteller für Pharmaceutika kritisch, der diese Mittel in Erwartung einer wirtschaftlich günstigen Lagerbeständigkeit formuliert und verpackt. Ein sorgfältiges Vorformulierungsprogramm ist deshalb eine wesentliche Stufe für Protein-Arzneimittel, um ihre möglichen Formulierungsprobleme zu lösen. Zusätzlich sind Stabilitäts- Testverfahren erforderlich, um eine ausreichende Lagerbeständigkeit sicherzustellen.
Viele biologische Materialien, einschließlich Proteine, die sich sogar in tiefgefrorenen Lösungen rasch zersetzen, können durch Lyophilisation des Materials während eines langen Zeitraums in einem wirksamen Zustand erhalten werden. Die Lyophilisierung (auch als Gefriertrocknung bekannt) ist ein Verfahren der Trocknung einer Zusammensetzung, in der Wasser aus der tiefgefrorenen Zusammensetzung sublimiert wird. Die besonderen Vorteile dieses Verfahrens sind es, daß Materialien, die in einer wässerigen Lösung relativ instabil sind, verarbeitet und in flüssigem Zustand in Dosierungsbehälter abgefüllt werden, wobei man vom Vorteil der relativ leichten Verarbeitbarkeit einer Flüssigkeit Gebrauch machen kann; ohne erhöhte Temperaturen getrocknet werden dadurch nachteilige thermische Effekte ausgeschaltet; und die Lagerung in trockenem Zustand bringt relativ wenig Stabilitätsprobleme mit. Das Produkt kann so gegen den Verlust der biologischen Aktivität stabilisiert werden, um eine lange Lagerstabilität zu ergeben.
Oft ist es unpraktisch, Formulierungen herzustellen, die nur auf der Lyophilisierung des Arzneimittels basieren. Der Grund dafür ist der, daß normalerweise die Mengen des in der Formulierung verwendeten Arzneimittels sehr gering sind. Dies schafft ein Problem, weil während des Lyophilisierungsverfahrens das Arzneimittel vom Lyophilisiationsbehälter durch das im Verfahren angewendete Vakuum weggezogen werden kann. Außerdem sind viele Polypeptide relativ instabil, wenn sie in kleinen Konzentrationen lyophilisiert werden. Sie können von der Produktverpackung absorbiert werden und verlieren dann an Aktivität. Viele lyophilisierte pharmazeutische Zusammensetzungen beruhen deshalb auf der Verwendung eines Verdünners oder Streckmittels, um die Menge des während des Lyophilisierungsverfahrens vorhandenen Feststoffs zu erhöhen und dadurch die mit der Lyophilisierung geringer Mengen an Arzneimittel verbundenen Probleme zu eliminieren.
Die EP-A-0308238 beschreibt stabile lyophilisierte Zusammensetzungen, die einen Polypeptid-Wachstumsfaktor mit mitogener Aktivität bei Menschen und ein wasserlösliches oder in Wasser quellbares, pharmazeutisch annehmbares Polymer umfassen, das dazu fähig ist, einer rekonstituierten Lösung der Zusammensetzung Viskosität zu verleihen. Als Wachstumsfaktor wird insbesondere epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) erwähnt.
Die vorliegende Erfindung stellt eine lyophilisierte Zusammensetzung bereit, die einen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und entweder:
(a) ein Alkalimetallsalz einer Carboxyalkylcellulose, oder
(b) einen Polyoxyethylensorbitanfettsäureester und Cystein umfaßt.
Anmeldungsgemäß umfaßt FGF die Klasse der Polypeptide, die eine biologische Aktivität besitzen, die ähnlich der ist, die das natürliche menschliche FGF-Polypeptid zeigt. FGF umfaßt deshalb sauren und basischen FGF, wie z.B. durch rekombinante DNA-Techniken hergestellten oder aus natürlichen Quellen abgeleiteten menschlichen FGF, sowie eng verwandtes FGF von Säugern, z.B. Rinder, Mäusen oder Nagetieren. FGF umfaßt ebenfalls chemisch modifiziertes FGF, wie z.B. FGF, in dem mindestens einer der vier Cystein-Aminosäurereste derivatisiert ist. Ein erfindungsgemäß verwendetes FGF kann deshalb ein carboxymethyliertes FGF sein, worin die SH-Gruppe eines oder mehrerer der Cystein-Reste in eine -S-CH2-COOH- Gruppe überführt wurde. Erfindungsgemäß kann irgendein FGF- Molekül verwendet werden, wie es z.B. in WO 86/07595; WO 87/01728; EP-A-0226181; Abraham et al., EMBO J. 5; 2523-2528; 1986; oder Lobb, Eur. J. Clin. Invest. 18, 321-336, 1988 beschrieben ist.
Es kann auch eine Mischung von bFGFs verwendet werden. Dies kann sein eine ca. 50:50-Mischung von:
- einem 154 Aminosäuren-menschlichen bFGF mit der Aminosäuresequenz der 155 Aminosäuren-Form, die von Abraham et al. beschrieben wird und in SEQ ID NO:1 gezeigt ist, aber ohne den N-terminalen Met-Rest; und
- einem 153 Aminosäuren-menschlichen bFGF mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Aminosäuresequenz, ohne die N-terminalen Met- und Ala-Reste.
Erfindungsgemäß wird menschlisches basisches FGF, das z.B. durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt ist, bevorzugt. Ein spezifisches carboxymethyliertes FGF zur erfindungsgemäßen Verwendung ist die 146 Aminosäuren-Form von bFGF, wie in WO 87/01728 beschrieben, worin 2 Cysteinreste an den Positionen 69 und 87 durch Carboxymethylgruppen irreversibel blockiert sind, d.h. als -S-CH2-COOH-Gruppen. Dieser spezifische carboxymethylierte FGF wird als CM-FGF bezeichnet. Es ist deshalb ein bFGF, das die Aminosäuresequenz von Position 10 bis Position 155 wie in SEQ ID NO:1 dargestellt aufweist, in der die Cys-Reste an den Positionen 78 und 96 in SEQ ID NO: 1 carboxymethyliert sind.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält die Zusammensetzung außerdem ein Antioxidans, um einer wesentlichen Oxidation des FGF vorzubeugen, wenn die erfindungsgemäße Zusammensetzung während eines verlängerten Zeitraums, z.B. während 1-3 Monaten, gelagert wird. Vorzugsweise ist das Antioxidans Dithiothreitol (DTT). Wenn vorhanden ist das Antioxidans typischerweise in einer Menge von 0.01 % bis 100 %, und vorzugsweise von 0.1 % bis 25 Gew.-% des Trägers vorhanden.
Der Träger ist irgendein Träger, der zur Verwendung in der Gefriertrocknung geeignet ist. Der Träger besitzt im allgemeinen gute Eigenschaften als Versteifungsmittel, um ein Rückschmelzen oder Erweichen des Produkts während der Lyophilisierung zu vermeiden. Geeignete pharmazeutisch annehmbare Träger umfassen Mannit, Lactose, Polyvinylpyrrolidon, Galactit und Trehalose. Von diesen ist Mannit bevorzugt. Die Menge des FGF in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung beträgt typischerweise von 0.01 % bis 5 %, und vorzugsweise 0.1 bis 1 %, bezogen auf das Gewicht des Trägers.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß das FGF in Mischung mit einem Pharmazeutisch annehmbaren Träger in Gegenwart eines Alkalimetallsalzes von Carboxyalkylcellulose, z.B. Carboxy-C1- C4-Alkylcellulose, stabilisiert werden kann. Das Alkalimetallsalz kann z.B. das Natriumsalz oder Kaliumsalz sein. Diese Komponente ist normalerweise in einer Menge von 0.1 % bis 15 %, vorzugsweise von 2.5 % bis 10%, bezogen auf das Gewicht des Trägers, vorhanden. Natriumcarboxymethylcellulose ist bevorzugt. Die Verwendung eines Cellulosesalzes verleiht den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen überraschenderweise Stabilität, die mit neutraler Alkylcellulose, z.B. Methylcellulose, nicht erreicht werden kann.
Erfindungsgemäße Zusammensetzung können auch durch Verwendung eines Polyoxyethylensorbitanfettsäureesters und Cystein stabilisiert sein. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß diese 2 Komponenten synergistisch wirken, um eine erhöhte Stabilität zu verleihen. Beispiele von Polyoxyethylensorbitanfettsäureester umfassen teilweise gesättigte oder ungesättigte C12-C20-Fettsäureester von Sorbit und seinen Mono- und Dianhydriden, copolymerisiert mit Ethylenoxid. Typischerweise sind 10 bis 40, z.B. ca. 20 Mol Ethylenoxid pro Mol Sorbit und seinen Anhydriden vorhanden. Polyoxyethylensorbitanfettsäureester sind im allgemeinen als Polysorbate bekannt. Beispiele für Polysorbate umfassen Polysorbat 20 (Polyoxyethylen 20 Sorbitanmonolaurat, Chemical Abstracts reference Nr. 9305-64-5), das eine Mischung aus Partiellen Laurinsäureestern von Sorbit und seinen Mono- und Dianhydriden, copolymerisiert mit ca. 20 Mol Ethylenoxid pro Mol Sorbit und seinen Anhydriden, ist, Polysorbat 40 (Polyoxyethylen 20 Sorbitanmonopalmitat, CAS Nr. 9005-66-7), Polysorbat 60 (Polyoxyethylen 20 Sorbitanmonostearat CAS Nr. 9005-67-8), Polysorbat 65 (Polyoxyethylen 20 Sorbitantristearat, CAS Nr. 9005-71-4), Polysorbat 80 (Polyoxyethylen 20 Sorbitanmonooleat, CAS Nr. 9005-65-6) und Polysorbat 85 (Polyoxyethylen 20 Sorbitantrioleat, CAS Nr. 9005-70-3). Die Menge des Polyoxyethylensorbitanfettsäureesters beträgt vorzugsweise von 0.01 % bis 25 %, und insbesondere von 0.1 % bis 1 Gew.-% des Trägers. Die Menge an Cystein in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen beträgt vorzugsweise 0.001 % bis 1 %, und insbesondere 0.01 % bis 0.1 Gew.-% des Trägers.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden normalerweise vor der Gefriertrocknung in Lösung formuliert. Die Lösung kann in irgendeiner Menge gefriertrocknet werden, obwohl die Lösung vorzugsweise in aliquote Teile geteilt wird, die 5 bis 500, z.B. 10 bis 100, und vorzugsweise 50 ug FGF enthalten. Diese aliquoten Teile werden getrennt gefriergetrocknet, z.B. in individuellen Glasbehältern. Bevor die Lösung gefriergetrocknet wird, kann sie z.B. durch Filtration sterilisiert werden. Für diesen Zweck kann ein 0.2 um Nylonmembranfilter verwendet werden. Unter Verwendung von HPLC-Analyse, die nach einer solchen Filtration durchgeführt wurde, wurde gefunden, daß FGF durchwegs quantitativ zurückgewonnen wird.
Die Lyophilisierung besteht im wesentlichen aus den folgenden Stufen. Zuerst wird die zu gefriertrocknende Lösung bei einer Temperatur unterhalb ihrer eutektischen Temperatur in einer Vakuumkammer tiefgefroren. Die Kammer wird dann evakuiert, normalerweise auf weniger als 13.3 Pa (0.1 Torr). An einer kalten Kondensationsoberfläche wird Eis bei einer Temperatur unterhalb der des Produkts sublimiert, wobei die Kondensationsoberfläche innerhalb der Kammer oder in einer damit verbundenen Kammer vorhanden ist. Dann wird dem Produkt unter kontrollierten Bedingungen Hitze zugeführt, wodurch Energie zur Sublimation mit einer Geschwindigkeit bereitgestellt wird, die das Produkt unterhalb seiner eutektischen Temperatur hält. Ein typischer Gefriertrocknungs- Zyklus ist folgender:
(a) Einfrieren bei mindestens - 45 ºC, und aufrechterhalten dieser Temperatur während 4 Stunden.
(b) Primäres Trocknen bei mindestens - 45 ºC bis +25 ºC während ca. 12 Stunden, mit einem Vakuum von weniger als 13.3 Pa (0.1 Torr) und einer Kondensator-Temperatur von - 60 ºC.
(c) Sekundäres Trocknen bei + 25 ºC während ca. 11 Stunden, mit gleichem Vakuum und Kondensator-Temperatur wie vorstehend unter (b) beschrieben. Es wurde gefunden, daß dieser Gefriertrocknungs-Zyklus zur Herstellung von erfindungsgemäß erzeugten FGF geeignet ist. Für einen Fachmann auf diesem Gebiet ist es jedoch offensichtlich, daß Variationen dieser Vorschrift möglich sind, die die Stabilität des FGF nicht wesentlich verändern.
Aliquote Teile der erfindungsgemäßen Zusammensetzung können in sterile Behälter abgefüllt werden. Sterile Glasampullen sind geeignet. Es ist bekannt, daß Proteine an Glassoberflächen anhaften, und es wurde gefunden, daß, wenn die lyophilisierten erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in einem Glasbehälter rekonstituiert werden, ein Verlust an Protein aufgrund der Adhäsion auftritt. Es wurde jedoch gefunden, daß die Beschichtung der Glasbehälter mit einer Silikonemulsion (mit pharmazeutischer Qualität) zur Verhinderung der Anhaftung dieses Problem erfolgreich löst.
Es wurde auch beobachtet, daß, wenn die Glasbehälter mit konventionellen Gummipfropfen verschlossen sind, aufgrund der Absörption des FGF an den Gummioberflächen ein Verlust an Protein auftreten kann. Die Verwendung von Fluorharzlaminiertern Butylkautschukpfropfen verhindert diesen Absorptionsprozess.
Die erfindungsgemäßen lyophilisierten Zusammensetzungen können an der Luft oder im Vakuum gelagert werden. Vorzugsweise werden sie jedoch unter einem Inertgas, z.B. Stickstoff, aufbewahrt.
Die erfindungsgemäße lyopilisierte Zusammensetzung besteht im wesentlichen aus einem FGF, einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und entweder (a) einem Alkalimetallsalz von Carboxalkylcellulose oder (b) einem Poiyoxyethylensorbitanfettsäureester und Cystein.
Die erfindungsgemäße gefriergetrocknete Zusammensetzung kann unter Verwendung irgendeines pharmazeutisch annehmbaren Lösungsmittels rekonstituiert werden. Vorzugsweise wird mit dem Lösungsmittel eine rekonstituierte Lösung mit einem pH- Wert von zwischen 5.0 und 7.0 bereitgestellt. Insbesondere ist eine 0.9 %-ige Lösung von Natriumchlorid (d.h. eine physiologische Kochsalzlösung) das Rekonstitutionslösungsmittel. Gegebenenfalls enthält die Lösung eine wirksame Menge eines antimikrobiellen Konservierungsmittels. Hierfür ist Benzalkoniumchlorid mit einer Konzentration von ca. 0.005 Gew.-% besonders geeignet, da seine Wirksamkeit gut bekannt ist, und weil es allgemein in pharmazeutischen Formulierungen verwendet wird, z.B. als opthalmologisches Konservierungsmittel. Es wurde gefunden, daß 0.005 Gew.-% Benzalkoniumchlorid die mikrobielle Aktivität von rekonstituierten erfindungsgemäßen Lösungen wirksam inhibiert.
FGF ist ein Wachstumsfaktor, der bei der Regulierung des Wachstums normaler menschlicher Zellen eine Rolle spielt. FGF wird zur Stimulierung der Wundheilung und dem Wachstum von Fibroblasten-Zellen verwendet. Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Kit bereit, der die vorstehend beschriebene lyophilisierte Zusammensetzung in einem sterilen Behälter und ein steriles Verdünnungsmittel zur Rekonstitution der lyophilisierten Zusammensetzung enthält. Erfindungsgemäß wird auch ein Verfahren zur Herstellung einer wässerigen FGF-Lösung umfaßt, die die Rekonstitution der erfindungsgemäßen gefriergetrockneten Zusammensetzung mit einem wässerigen Lösungsmittel, z.B. den vorstehend beschriebenen pharmazeutisch annehmbaren Lösungsmitteln, umfaßt. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen oder Kits sind in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers brauchbar, z.B. zur Behandlung bei der Wundheilung.
Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen erfindungsgemäße Aspekte.
In den nachfolgenden Beispielen sind die verwendeten FGFs basisches FGF FCE 26184, das ein rekombinantes Protein- Arzneimittel ist, erhältlich von Farmitalia Carlo Erba Biotechnology Development Department, und CM-FGF, das ein chemisch modifiziertes aus bFGF erhaltenes Protein (146 Aminosäure-Form) ist. Ihre Herstellung wird nachstehend in den Herstellungsbeispielen beschrieben. bFGF und CM-FGF sind als gefrorene Lösung mit einer Wirkstoffkonzentration von ca. 2.0 mg/ml für bFGF und 1.1 mg/ml für CM-FGF erhältlich (diese Konzentration ist als Proteingehalt ausgedrückt, gemessen durch die Biuret-Reaktion, und der pH-Wert des Lösungsmittels beträgt 6.0, erhalten mit einem 10 uM-Phosphatbuffer).
Es wurde beobachtet, daß das Auftauen dieser Lösungen und ihre Verdünnung auf eine Konzentration von ca. 50 ug/ml unter Verwendung einer 2 %-igen Mannit-Lösung die Proteinstabilität nicht beeinträchtigt. HPLC-Analysen der verdünnten Lösungen zeigen, daß der Wirkstoff (bFGF oder CM-FGF) quantitativ erhalten bleiben.

Herstellungsbeispiel 1: Herstellung von bFGF (FCE 26184)

Die Konstruktion der synthetischen DNA-Sequenz für bFGF und die des Expressionsplamsids, das eine solche Frequenz trägt, wurde gemäß dem in EP-A-363675 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Das Fermentations- und Reinigungsverfahren wurde wie folgt durchgeführt:

(a) Fermetationsverfahren

Ein Bakteriumstamm von E. coli Typ B von der Sammlung des Institute Pasteur wurde mit einem Plamid, das das für bFGF kodierende menschliche Gen und das Gen für die Tetracyclinresistenz trägt, transformiert. Dieser transformierte Stamm wurde zur Produktion von rekombinantem nicht-glycosyliertem h-bFGF (menschliches bFGF) verwendet. Eine Master Cell Bank (15 gefriergetrocknete Behälter) und eine Working Cell Bank (W.C.B) (70 in flüssigem Stickstoff bei - 190 ºC gelagerte Behälter) dieses Stamms wurde hergestellt. Der Inhalt eines Behälters der W.C.B. wurde als Inokulum für die Fermetationsphase verwendet.
Das Fermetationsverfahren wurde in 10 l Fermentern, die mit 4 l Kulturmedium gefüllt waren, durchgeführt. Zum Medium wurde Tetracyclinhydrochlorid zugefügt, um die Bedingungen der Stammselektion aufrechtzuhalten. Nach 20 Stunden Wachstum bei 37 ºC betrug die Biomasse 42±2 g/l Trockengewicht, und die Produktion von bFGF betrug 2500 ± 500 mg/l, gemessen durch Vergleichs-Gelelektrophorese.
Während der Fermentationsphase war eine Anreicherung in reinem Sauerstoff erforderlich, um ein starkes Bakteriumwachstum zu erlauben.

(b) Anfangsreinigung

Die Zellen (Mikroorganismen) wurden von der gesamten Fermentationsbrühe durch Zentrifugation abgetrennt. Das resultierende Pellet wurde in einem Natriumphosphatbuffer, der Natriumchlorid enthielt, resuspendiert. Für ein wirksames Zerbrechen der Zellen war ein Minimum von 3 Durchgängen durch einen Hochdruck-Homogenisator erforderlich. Das resultierende Zell-Lysat wurde durch Zentrifugation geklärt und der Überstand für das weitere Verfahren gesammelt.

(c) Reinigung

Der geklärte Überstand wurde auf eine Säule von Sepharose (Handelsmarke) S Fast Flow (Kationaustauscher) aufgebracht und das Produkt aus diese Säule unter Verwendung eines Gradienten mit ansteigenden Natriumchloridkonzentrationen in Phosphatbuffer aus dieser Säule eluiert. Das Produkt wurde weiter an einer Heparin Sepharose (Handelsmarke) 6B Säule durch Elution mit einem Gradienten anstiegender Natriumchloridkonzentration in Phosphatbuffer gereinigt. Schließlich wurde an Sephadex (Handelsmarke) G25 Harz ein Bufferaustausch durchgeführt, um das Produkt im Produktbuffer (Natriumphoshphat -EDTA) zu erhalten.

(d) Säulendesinfektion

Sepharose S Fast Flow- und Sephadex G25-Säulen wurden durch Waschen mit Natriumhydroxidlösungen desinfiziert. Heparin Sepharose wurde abwechselnd mit Lösungen bei pH = 8.5 und pH = 5.5, die 3M Natriumchlorid enthielten, gewaschen.
Auf diese Weise wurde bFGF, bezeichnet als FGE 26184, erhalten. Dies ist eine ca. 50:50-Mischung aus:
- einem 154-Aminosäuren-menschlichen bFGF mit der Aminosäuresequenz der 155-Aminosäure-Form, die von Abraham et al. beschrieben wird und in SEQ ID NO:1 dargestellt ist, aber ohne den N-terminalen Met-Rest; und
- einem 153 Aminosäuren-menschlichen bFGF mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr: 1 dargestellt ist, aber ohne die N-terminalen Met- und Ala-Reste.

Herstellungsbeispiel 2: Herstellung von CM-FGF

Zu einer Lösung von 100 mg des rekombinanten menschlichen bFGF (146 Aminosäuren-Form), erhalten wie in WO 87/01728 beschrieben, in 110 ml 25 mM Phosphatbuffer, pH = 8.0/5 mM EDTA, wurden 400 mg Iodessigsäure in 110 ml des gleichen Buffers zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang im Dunkeln stehengelassen. Die Reaktionsmischung wurde dann direkt auf eine MonoS-Säule (HR 10/10, Pharmacia), die mit einem 25mM-Phosphatbuffer, pH = 7.5, equilibriert war, aufgebracht. Um den Reagentienüberschuß zu eliminieren wurde die Säule mit dem Equilibrierungsbuffer extensiv gewaschen und das carboxymethylierte bFGF (CM-FGF) wurde mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1 M NaCl in 25 mM Phosphatbuffer, pH = 7.5, eluiert. Die CM-FGF enthaltenden Fraktionen wurden an einer Sephadex G-25-Säule (Pharmacia), die in 10 mM Phosphatbuffer, pH = 6.0/0.1 mM EDTA equilibriert war, entsalzt.

Beispiel 1

Es wurde gefunden, daß die Gegenwart eines Antioxidans, z.B. vom 1,4-Dithiothreitol (DTT), wirksam ist zum Schutz des Proteins in Lösung gegenüber Oxidation.
Trotz seiner guten Schutzwirkung in Lösung inhibiert DTT aber nicht den Abbau des Proteins in gefriertrocknetem Zustand wenn es über einen langen Zeitraum gelagert wird. Eine 50 ug gefriertrocknete Formulierung von bFGF, die Mannit als Träger und DTT als Antioxidans enthielt, ergab tatsächlich keine annehmbare Stabilität: ein Wirksamkeitsverlust (HPLG-Methode) von ca. 10 % wurde nach einer Lagerung von einer Woche bei 35 ºC und 25 G beobachtet. Es bestand deshalb die Notwendigkeit, ein Schutzmittel in die Formulierung einzubauen.
Gemäß P.P. De Luca und M.W. Townsend (Journal of Parenteral Science and Technology, Band 42, Nr. 6, November-Dezember 1988, Seite 190) kann eine Vorbeugung und Verringerung von Konformations-Modifikationen in Proteinen aufgrund von Gefrieren, Trocknen, oder verlängerter Lagerung durch die Verwendung von Lyo- oder Kryo-Schutzmitteln erreicht werden. Ein Lyo-Schutzmittel wird als eine Verbindung definiert, die stabilisierend wirkt und den Abbau eines Proteins sowohl während der Gefriertrocknung als auch danach während der Lagerung verhindert, während ein Kryo-Schutzmittel nur einen Schutz gegenüber einem Schaden durch Gefrieren verleiht.
Auf der Basis dieser theoretischen Überlegungen wurden experimentelle Arbeiten unternommen, um die Schutzfähigkeit für FCE 26184 und CM-FGE einer Zahl von Verbindungen, die als Lyo-Schutzmittel dienen können, zu bestimmen.
Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), Natriumcarboxymethylcellulose (NaCMC), Methylcellulose (MC), Hydroxyethylcellulose (HEC), Polyvinylalkohol (PVA), Natriumchlorid, Glycin, Cystein und Albumin wurden als mögliche Schutzmittel ausgewählt. Lösungen, die bFGF (50 ug/ml), Mannit (20 mg/ml) als Träger, DTT (entweder 0.5 oder 0.1 mg/ml) als Antioxidans, und eine geeignete Konzentration von jedem potentiellen Stabilisator enthielten, wurden aseptisch hergestellt, in Behälter (nominelles Volumen: 1.0 ml) gefüllt und gefriergetrocknet. Durch beschleunigte Stabilitätsuntersuchungen (35 ºC) wurde die Wirkung der Lagerung auf die Protein-Wirksamkeit in der endgültigen gefriertrockneten Formulierung geprüft.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Wie bereits erwähnt unterlag die gefriergetrocknete Formulierung, die Mannit und DTT enthielt, einem 10 %-igen Wirksamkeitsverlust nach einer 1-wöchigen Lagerung.
Ein Verlust von gleichem Ausmaß wurde beobachtet, wenn Cystein mit dem Ziel seinen Synergismus mit DTT auszuwerten zugegeben wurde.
Die Gegenwart eines Lyo-Schutzmittels, wie z.B. NaCMC, verbesserte die Proteinstabilität beträchlich. Andere Cellulosederivate (HPMC, HEC, MC) erwiesen sich als Stabilisatoren wirkungslos (die Daten sind in Tabelle 1 nur für MC angegeben, aber andere Derivate verhielten sich ähnlich).
PVA, Natriumchlorid, Glycin und Albumin erwiesen sich als mit bFGF sehr inkompatibel. Polysorbat 80 oder Cystein erwiesen sich als unwirksam, wenn sie allein verwendet wurden. Die Kombination von Polysorbat 80 und Cystein wirkte jedoch überraschend gut als Stabilisator. Außerdem wirkte entweder Polysorbat 80 oder Cystein mit NaCMC synergistisch.
Die in Tabelle 1 angegebenen Daten zeigen die Schlüsselrolle der Lyo-Schutzmittel als Stabilisatoren für das Protein im gefriergetrockneten Zustand. Ein möglicher Mechanismus für die Schutzwirkung dieser Verbindungen könnte in ihrer Fähigkeit liegen, die Abscheidung von Wasser aus dem Protein im gefriergetrockneten Präparat zu verhindern. In jeder getesteten gefriergetrockneten Formulierung ist Wasser (als Restfeuchtigkeit) in einem Ausmaß vorhanden, das das des Arzneimittels übersteigt und ausreicht, um das Protein in einer hydratisierten Konformation zu erhalten. Irgendeine Veränderung (niedrige oder hohe Temperaturen; Lösungsmittel), die die Wasserhülle, die durch die Proteinstruktur lose koordiniert wird, zerstört, ruft eine Proteininaktivierung durch Denaturierung und Aggregation hervor. Stabilisatoren, wie z.B. NaCMC, sind dazu fähig, die Wassermoleküle durch die hydrophile Struktur oder ihrer polaren Carboxylgruppe fest koordinativ anzulagern. Als Folge davon erhalten sie die Protein-Mikroumgebung in einem hydratisierten Zustand.
Andere Cellulosederivate, wie z.B. HPMC, MC und HEC, die als Schutzmittel getestet wurden, zeigten sich als unwirksam, vermutlich aufgrund des Fehlens der Carboxylgruppe.
Die geringe stabilisierende Wirksamkeit von Polysorbat 80 könnte aufgrund der geringen koordinativen Anlagerungskraft dieses Zusatzes gegenüber Wassermolekülen erwartet werden. Im Gegensatz dazu ist die synergistische Wirkung von Polysorbat 80 mit Cystein und NaCMC sehr überraschend. Tabelle 1 FCE 26184 Preformulierüngsuntersuchungen, Ergebnisse der beschleunigten Stabilität verschiedener gefriergetrockneter Formulierungen, die bFGF (50 mcg), Mannit (20 mg), und DTT (0.1 mg) enthalten Zusammensetzung Restliches FCE 26184 % (HPLC Untersuchung) nach 1 Woche bei Cystein Polysorbat 80
Die experimentellen Ergebnisse für CM-FGF sind in Tabelle 2 zusammengestellt, in der "n.d." "nicht bestimmt" bedeutet. Lösungen, die CM-FGF (50 ug/ml), Mannit (20mg/ml) als Träger, DTT (0.1 mg) und eine geeignete Konzentration von jedem der potentiellen Stabilisatoren enthielten, wurden aseptisch hergestellt, in Behälter (nominelles Volumen 1.0 ml) eingefüllt und gefriergetrocknet. Die Wirkung der Lagerung auf die Proteinwirksamkeit in der endgültigen gefriergetrockneten Formulierung wurde durch beschleunigte Stabilitätsuntersuchungen (35 ºC/45 ºC) geprüft. Wie bereits für bFGF angegeben, verbessert Na-CMC die CM-FGF Stabilität beträchlich. Tabelle 2 CM-FGF Preformulierungsuntersuchungen. Beschleunigte Stabilitätsergebnisse verschiedener gefriergetrockneter Formulierungen, die CM-FGF (50 ug) und Mannit (20 mg) enthalten. Zusammensetzung (mg/Behälter) Restliches CM-FGF (HPLC Untersuchung) CYSTEIN Polysorbat 80 Tage
Die HPLC-Untersuchung der Proben wurde unter Verwendung der folgenden Materialien, Ausrüstung und Lösungen unter den nachstehend angegebenen Bedingungen durchgeführt.

Materialien:

bFGF-gefrorene Lösung, Arbeitsstandard
CM-FGF-gefrorene Lösung, Arbeitsstandard
Acetonitril, HPLC-Qualität
Wasser, HPLC-Qualität
Trifluoressigsäure, analytische Qualität
1,4-Dithiothreitol, analytische Qulität

Ausrüstung:

. Flüssigchromatograph Milton Roy Model CM 4000, oder ein Equivalent, ausgestattet durch:
.. chromatographische Säule: (Länge 250 mm, Innendurchmesser 4.6 mm), gefüllt mit Vydac 218TP54 300 A (durchschnittliche Teilchengröße 5mcm), oder ein Equivalent davon
.. Injektionsventil: Rheodyne Model 7125, oder ein Equivalent davon, ausgerüstet mit einer 100 mcl Probenschleife
.. Detektor Shimadzu Model SFD 6A, oder ein Equivalent davon,
.. integrierter Rekorder: SP 4270 (Spectra-Physics), oder ein Equivalent davon,
. Membranfilter, 0.22 um Porösität, Millipore Durapore GVWP, oder ein Equivalent davon
. Hochpräzizions-Laboratoriumsglas
. Kunststoff-Pipettenspitzen (Gilson)
. automatische Pipetten (Gilson)
. Einweg-Kunststoffmikroröhrchen, Kapazität 2.5 ml (Eppendorf)

Lösungen:

. Mobile Phase (A), bestehend aus Wasser, enthaltend 0.1 % Trifluoressigsäure (W/V), gefiltert durch das Membranfilter und entlüftet
. Mobile Phase (B), bestehend aus 95 % Acetonitril-5 % Wasser, enthaltend 0.1 % Trifluoressigsäure (W/V), gefiltert durch das Membranfilter und entlüftet
. 1,4-Dithiothreitol-Lösung
Es wurde eine Lösung hergestellt, die ca. 1 mg/ml in Wasser von HPLC-Qualität enthielt.
. Standardlösung
Es wurde ein entsprechendes Volumen der Vorratslösung von bFGF oder CM-FGF-Arbeitsstandard, genau abgemessen, in ein Einweg-Kunststoffmikroröhrchen eingebracht.
Es wurde mit einem geeingeten Volumen 1,4-Dithiothreitol- Lösung verdünnt, um eine Endlösung zu erhalten, die ca. 50 mcg/ml bFGF oder CM-FGF enthielt.
Die Standardlösung muß frisch hergestellt werden und innerhalb eines Arbeitstags verarbeitet werden.
. Probelösung
Unter Verwendung von mindestens 5 gefriergetrockneten Behältern wurde eine Probelösung hergestellt.
Der Inhalt jedes Behälters mit einer Dosierung von 50 mcg bFGF oder CM-FGF wird in 1.0 ml Wasser von HPLC-Qualität gelöst, und dann mit allen hergestellten Lösungen ein Pool hergestellt.

Chromatographische (HPLC)-Bedingungen:

Die Standard- und Probelösung werden abwechselnd mindestens 3 mal in den Flüssigchromatograph unter den folgenden experimentellen Bedingungen eingespritzt:
Säulentemperatur : Raumtemperatur (22 ± 2 ºC)
Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase : 1 ml/min
Analytische Wellenlänge : 210 ± 1 nm Gradientenbedingungen Zeit (min)
Detektorsensibilität : der Detektor "Computer"- Auslaß ist zur maximalen Empfindlichkeit mit dem Integrator verbunden
Einspritzvolumen : 100 mcl
Dämpfung des integrierten Rekorders : 256
Blattgeschwindigkeit : 0.5 cm/min Beispiel 2 (a) Formulierung einer mit Natriumcarboxymethylcellulose stabilisierten bFGF-Zusammensetzung Pro Behälter*** Pro 2000 Behälter*** Natriumcarboxymethylcellulose 1,4-Dithiothreitol Mannit Wasser zur Injektion** auf * einschließlich 15 % Überschuß, um Verluste während der Herstellung zu kompensieren ** während des Gefriertrocknens wird Wasser zur Injektion entfernt *** einschließlich eines 5 %-igen Überschußes der bFGF/Natriumcarboxymethylcellulose/DTT/Mannit-Lösung (b) Formulierung einer mit Polysorbat 80 und Cystein stabilisierten bFGF-Zusammensetzung Pro Behälter*** Pro 2000 Behälter*** Cystein 1,4-Dithiothreitol Mannit Polysorbat 80 Wasser zur Injektion** auf * einschließlich 15 % Überschuß, um Verluste während der Herstellung zu kompensieren ** während des Gefriertrocknens wird Wasser zur Injektion entfernt *** einschließlich eines 5 %-igen Überschußes der bFGF/Natriumcarboxymethylcellulose/DTT/Mannit-Lösung
Beide Formulierungen wurden gefriergetrocknet und unter Stickstoff in individuellen Gefäßen verschlossen. ( c) Formulierung einer mit Natriumcarboxymethylcellulose stabilisierten CM-FGF-Zusammensetzung Pro Behälter*** Pro 2000 Behälter*** Natriumcarboxymethylcellulose 1,4-Dithiothreitol Mannit Wasser zur Injektion** auf
* einschließlich 15 % Überschuß, um Verluste während der Herstellung zu kompensieren
** während des Gefriertrocknens wird Wasser zur Injektion entfernt
*** einschließlich eines 5 %-igen Überschußes der bFGF/Natriumcarboxymethylcellulose/DTT/Mannit-Lösung (d) Formulierung einer mit Polysorbat 80 und Cystein stabilisierten bFGF-Zusammensetzung Pro Behälter*** Pro 2000 Behälter*** Cystein Mannit Polysorbat 80 Wasser zur Injektion** auf * einschließlich 15 % Überschuß, um Verluste während der Herstellung zu kompensieren ** während des Gefriertrocknens wird Wasser zur Injektion entfernt *** einschließlich eines 5 %-igen Überschußes der bFGF/Natriumcarboxymethylcellulose/DTT/Mannit-Lösung
Beide Formulierungen wurden gefriergetrocknet und unter Stickstoff in individuellen Gefäßen verschlossen.
(e) Formulierung einer mit Polysorbat 80 und Cystein stabilisierten bFGF-Zusammensetzung Pro Behälter*** Pro 2000 Behälter*** Cystein 1,4-Dithiothreitol Mannit Polysorbat 80 Wasser zur Injektion** auf * einschließlich 15 % Überschuß, um Verluste während der Herstellung zu kompensieren ** während des Gefriertrocknens wird Wasser zur Injektion entfernt *** einschließlich eines 5 %-igen Überschußes der bFGF/ Natriumcarboxymethylcel lulose/DTT/Mannit-Lösung
Beide Formulierungen wurden gefriergetrocknet und unter Stickstoff in individuellen Gefäßen verschlossen.

Beispiel 3

Stabilität von erfindungsgemaßen Zusammensetzungen

Gefriergetrocknete Behälter, die erfindungsgemäße Zusammensetzungen mit ca. 50 ug bFGF enthielten, wurden zur Langzeitstabilität während verschiedener Zeiträume bei verschiedenen Temperaturen geprüft. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 bis 22 angegeben. Es wurden die folgende Parameter untersucht und die akzeptierbaren Standards sind ebenfalls angegeben:
Ausssehen: farblose Glasbehälter, die einen kompakten, weißen gefriergetrockneten Kuchen oder eine Masse enthalten, bestimmt durch visuelle Prüfung.
Identifizierung: * gleiche Molekulargewichtsbande wie ein Arbeitsstandard von FCE 26184 oder CM-FGF, sowohl unter reduzierenden als auch denaturierenden Bedingungen, durch Electrophorese (SDS PAGE) unter Verwendung des Phast System (eingetragenes Warenzeichen), erhältlich von Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden.
RP-HPLC-Untersuchung: 90-110 % der markierten Menge
Bioassay (Stimulierung der DNA-Synthese in 3T3-Zellen): R = 1.0 + 0.35, wenn die Werte als Titer der Formulierung ausgedrückt sind, berechnet durch eine parallele Untersuchung, gemessen an 3H-Tdr-Einbau in BALB/3T3-Zellen, unter Verwendung eines FTCE internen Standards von FCE 26184.
Sterilität: steril
Wasser: nicht mehr als 3 % Aussehen nach Rekonstituierung: klare und reine farblose Lösung, frei von sichbaren Partikeln eines fremden Stoffs
pH nach Rekonstituierung: 5.0 - 7.0
* Der Behälterinhalt wird in 5 ml des erforderlichen Lösüngsmittels gelöst. Tabelle 3 Beschleunigte Stabilitätsdaten von FCE 26184, gefriergetrocknete Behälter - Ansatz P8199/10/C Wirkstoffansatz Nr. OP49 Zusammensetzung des Beispiels 2(a) Test Anfangskontrolle 1 Woche Wochen Aussehen SDS PAGE RP-HPLC Untersuchung mcg/Behälter % anfänglich Bioassay Wasser % rekonstituierte Lösung entspricht unverändert A = intensive Bande beim korrekten Molekulargewicht n.d. = nicht bestimmt Tabelle 4 Beschleunigte Stabilitätsdaten von FCE 26184 gefriergetrocknete Behälter - Ansatz P8199/10/C Wirkstoffansatz Nr. OP49 Zusammensetzung des Beispiels 2(a) Test Anfangskontrolle 1 Woche Wochen Aussehen SDS PAGE RP-HPLC Untersuchung mcg/Behälter % anfänglich Bioassay Wasser % rekonstituierte Lösung entspricht unverändert A = intensive Bande beim korrekten Molekulargewicht n.d. = nicht bestimmt Tabelle 5 Langzeitstabilitätsdaten von FCE 26184, gefriertrocknete Behälter - Ansatz TF/23600, Wirkstoffansatznummer OP51/A Zusammensetzung des Beispiels 2(a) Test Anfangskontrolle Aussehen SDS PAGE RP-HPLC Untersuchung mcg/Behälter % anfänglich Bioassay Wasser % rekonstituierte Lösung entspricht unverändert innerhalb der Grenzen A = intensive Bande beim korrekten Molekulargewicht n.d. = nicht bestimmt Tabelle 6 Langzeitstabilitätsdaten von FCE 26184, gefriertrocknete Behälter - Ansatz TF/23600, Wirkstoffansatznummer OP51/A Zusammensetzung des Beispiels 2(a) Test Anfangskontrolle Aussehen SDS PAGE RP-HPLC Untersuchung mcg/Behälter % anfänglich Bioassay Wasser % rekonstituierte Lösung Sterilität entspricht innerhalb der Grenzen steril unverändert A = intensive Bande beim korrekten Molekulargewicht n.d. = nicht bestimmt Tabelle 7 Langzeitstabilitätsdaten von FCE 26184, gefriertrocknete Behälter - Ansatz TF/23600, Wirkstoffansatznummer OP51/A Zusammensetzung des Beispiels 2(a) Test Anfangskontrolle Aussehen SDS PAGE RP-HPLC Untersuchung mcg/Behälter % anfänglich Bioassay Wasser % rekonstituierte Lösung entspricht innerhalb der Grenzen unverändert A = intensive Bande beim korrekten Molekulargewicht n.d. = nicht bestimmt Tabelle 8 Langzeitstabilitätsdaten von FCE 26184, gefriertrocknete Behälter - Ansatz TF/23600, Wirkstoffansatznummer OP51/A Zusammensetzung des Beispiels 2(a) Test Anfangskontrolle Aussehen SDS PAGE RP-HPLC Untersuchung mcg/Behälter % anfänglich Bioassay Wasser % rekonstituierte Lösung entspricht innerhalb der Grenzen unverändert A = intensive Bande beim korrekten Molekulargewicht B = Gegenwart sekundärer Banden, beide bei höherem Molekulargewicht n.d. = nicht bestimmt Tabelle 9 Beschleunigte Stabilitätsdaten von FCE 26184, gefriertrocknete Behälter - Ansatz TF/23600, Wirkstoffansatznummer OP51/A Zusammensetzung des Beispiels 2(a) Test Anfangskontrolle Tage Aussehen SDS PAGE RP-HPLC Untersuchung mcg/Behälter % anfänglich Bioassay Wasser % rekonstituierte Lösung entspricht innerhalb der Grenzen unverändert A = intensive Bande beim korrekten Molekulargewicht B = Gegenwart sekundärer Banden, beide bei höherem Molekulargewicht n.d. = nicht bestimmt Tabelle 10 Beschleunigte Stabilitätsdaten von FCE 26184, gefriertrocknete Behälter - Ansatz TF/23600, Wirkstoffansatz Nr. OP51/A Zusammensetzung des Beispiels 2(a) Test Anfangskontrolle Tage 1 Monat Aussehen SDS PAGE RP-HPLC Untersuchung mcg/Behälter % anfänglich Bioassay Wasser % rekonstituierte Lösung entspricht innerhalb der Grenzen unverändert LTC = Temperatur der Lichtkammer (28 º ± 2 º C) F.C. = Foot Candles A = intensive Bande beim korrekten Molekulargewicht n.d. = nicht bestimmt Tabelle 11 Langzeitstabilitätsdaten von FCE 26184, gefriertrocknete Behälter - Ansatz TF/23625, Wirkstoffansatz Nr. OP49 Zusammensetzung des Beispiels 2(a) Test Anfangskontrolle Aussehen SDS PAGE RP-HPLC Untersuchung mcg/Behälter % anfänglich Bioassay Wasser % rekonstituierte Lösung entspricht innerhalb der Grenzen unverändert A = intensive Bande beim korrekten Molekulargewicht n.d. = nicht bestimmt Tabelle 12 Langzeitstabilitätsdaten von FCE 26184, gefriertrocknete Behälter - Ansatz TF/23625, Wirkstoffansatz Nr. OP48 Zusammensetzung des Beispiels 2(a) Test Anfangskontrolle Aussehen SDS PAGE RP-HPLC Untersuchung mcg/Behälter % anfänglich Bioassay Wasser % rekonstituierte Lösung Sterilität entspricht innerhalb der Grenzen steril unverändert A = intensive Bande beim korrekten Molekulargewicht n.d. = nicht bestimmt Tabelle 13 Langzeitstabilitätsdaten von FCE 26184, gefriertrocknete Behälter - Ansatz TF/23625, Wirkstoffansatz Nr. OP48 Zusammensetzung des Beispiels 2(a) Test Anfangskontrolle Aussehen SDS PAGE RP-HPLC Untersuchung mcg/Behälter % anfänglich Bioassay Wasser % rekonstituierte Lösung entspricht innerhalb der Grenzen unverändert A = intensive Bande beim korrekten Molekulargewicht n.d. = nicht bestimmt Tabelle 14 Langzeitstabilitätsdaten von FCE 26184, gefriertrocknete Behälter - Ansatz TF/23625, Wirkstoffansatznummer OP48 Zusammensetzung des Beispiels 2(a) Test Anfangskontrolle Aussehen SDS PAGE RP-HPLC Untersuchung mcg/Behälter % anfänglich Bioassay Wasser % rekonstituierte Lösung entspricht innerhalb der Grenzen unverändert A = intensive Bande beim korrekten Molekulargewicht n.d. = nicht bestimmt Tabelle 15 Langzeitstabilitätsdaten von FCE 26184, gefriertrocknete Behälter - Ansatz TF/23625, Wirkstoffansatznummer OP48 Zusammensetzung des Beispiels 2(a) Test Anfangskontrolle Aussehen SDS PAGE RP-HPLC Untersuchung mcg/Behälter % anfänglich Bioassay Wasser % rekonstituierte Lösung entspricht innerhalb der Grenzen unverändert A = intensive Bande beim korrekten Molekulargewicht n.d. = nicht bestimmt Tabelle 16 Beschleunigte Stabilitätsdaten von FCE 26184, gefriertrocknete Behälter - Ansatz TF/23625, Wirkstoffansatz Nr. OP48 Zusammensetzung des Beispiels 2(a) Test Anfangskontrolle 15 Tage Aussehen SDS PAGE RP-HPLC Untersuchung mcg/Behälter % anfänglich Bioassay Wasser % rekonstituierte Lösung entspricht innerhalb der Grenzen unverändert A = intensive Bande beim korrekten Molekulargewicht n.d. = nicht bestimmt Tabelle 17 Langzeitstabilitätsdaten von FCE 26184, gefriertrocknete Behälter - Ansatz P8199/10/I, Wirkstoffansatz Nr. OP49 Zusammensetzung des Beispiels 2(b) Test Anfangskontrolle 1 Woche Wochen Aussehen SDS PAGE RP-HPLC Untersuchung mcg/Behälter % anfänglich Bioassay Wasser % rekonstituierte Lösung entspricht unverändert A = intensive Bande beim korrekten Molekulargewicht n.d. = nicht bestimmt Tabelle 18 Beschleunigte Stabilitätsdaten von FCE 26184, gefriertrocknete Behälter - Ansatz P8199/10/I, Wirkstoffansatz Nr. OP49 Zusammensetzung des Beispiels 2(b) Test Anfangskontrolle 1 Woche Wochen Aussehen SDS PAGE RP-HPLC Untersuchung mcg/Behälter % anfänglich Bioassay Wasser % rekonstituierte Lösung entspricht unverändert A = intensive Bande beim korrekten Molekulargewicht n.d. = nicht bestimmt Tabelle 19 Langzeitstabilitätsdaten von FCE 26184, gefriertrocknete Behälter - Ansatz TF/23607, Wirkstoffansatz Nr. OP51/A Zusammensetzung des Beispiels 2(b) Test Anfangskontrolle Aussehen SDS PAGE RP-HPLC Untersuchung mcg/Behälter % anfänglich Bioassay Wasser % rekonstituierte Lösung entspricht innerhalb der Grenzen unverändert A = intensive Bande beim korrekten Molekulargewicht n.d. = nicht bestimmt Tabelle 20 Langzeitstabilitätsdaten von FCE 26184, gefriertrocknete Behälter - Ansatz TF/23607, Wirkstoffansatz Nr. OP51/A Zusammensetzung des Beispiels 2(b) Test Anfangskontrolle Aussehen SDS PAGE RP-HPLC Untersuchung mcg/Behälter % anfänglich Bioassay Wasser % rekonstituierte Lösung entspricht innerhalb der Grenzen unverändert A = intensive Bande beim korrekten Molekulargewicht n.d. = nicht bestimmt Tabelle 21 Beschleunigte Stabilitätsdaten von FCE 26184, gefriertrocknete Behälter -Ansatz TF/23607, Wirkstoffansatznummer OP51/A Zusammensetzung des Beispiels 2(b) Test Anfangskontrolle Tage Aussehen SDS PAGE RP-HPLC Untersuchung mcg/Behälter % anfänglich Bioassay Wasser % rekonstituierte Lösung entspricht innerhalb der Grenzen unverändert A = intensive Bande beim korrekten Molekulargewicht n.d. = nicht bestimmt Tabelle 22 Beschleunigte Stabilitätsdaten, gefriertrockneter Behälter - Ansatz P4, Wirkstoffansatznummer 910116-CM Zusammensetzung des Beispiels 2(c) Test Anfangskontrolle 15 Tage 1 Monat RP-HPLC Untersuchung mcg/Behälter % anfänglich n.d. = nicht bestimmt Eine ähnliche Stabilität konnte für die Zusammensetzung der Beispiele 2(d) und 2(e) beobachtet werden.

Sequenzliste

(1) Information für SEQ ID NO: 1;
(i) Sequenzcharakteristika:
(A) Länge: 155 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(C) Strängigkeit: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Molekulartyp: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 1

Claims

1. Lyophilisierte Zusammensetzung enthaltend einen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und entweder

(a) ein Alkalimetallsalz einer Carboxyalkylcellulose, oder

(b) einen Polyoxyethylensorbitanfettsäureester und Cystein.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich ein Antioxidans enthält.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Antioxidans Dithiothreitol ist.

4. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger Mannit, Lactose, Polyvinylpyrrolidon, Galactit oder Trehalose ist.

5. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkalimetallsalz der Carboxyalkylcellulose Natriumcarboxymethylcellulose ist.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Polyoxyethylenfettsäureester Polysorbat 80 ist.

7. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einem verschlossenen sterilen Glasbehälter vorliegt.

8. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Fibroblasten- Wachstumsfaktor basisches FGF ist.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Fibroblasten-Wachstumsfaktor basisches FGF mit einer Aminosäuresequenz von Position 10 bis Position 155, wie in SEQ ID NO:1 dargestellt ist, in der die Cys-Reste an den Positionen 78 und 96 in der SEQ ID NO:1 carboxymethyliert sind.

10. Kit umfassend

(a) eine Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, und

(b) eine sterile Lösung zur Rekonstituierung dieser Zusammensetzung.

11. Verfahren zur Herstellung einer lyophilisierten Zusammensetzung, die einen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer wässerigen Lösung FGF, einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und entweder (a) ein Alkalimetallsalz einer Carboxymethylcellulose, oder

(b) einen Polyoxyethylensorbitanfettsäureester und Cystein mischt und die wässerige Lösung lyophilisiert.

12. Verfahren zur Herstellung einer wässerigen FGF- Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 mit einem sterilen wässerigen Verdünnungsmittel rekonstituiert.