DE69334173T2

DE69334173T2 - Verfahren zum Nachweis einer Zielnukleinsäure

Info

Publication number: DE69334173T2
Application number: DE69334173T
Authority: DE
Inventors: Tadashi Okamoto; Yoshinori Tomida; Nobuko Yamamoto; Masahiro Kawaguchi; Keisuke Kyoto-shi Makino; Akira Kyoto-shi Murakami
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1992-11-27
Filing date: 1993-11-26
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2013-11-27
Also published as: EP0599338A3; DE69334173D1; US5705346A; JPH06153997A; EP0599338A2; EP0599338B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für den Nachweis und die Identifizierung einer erwünschten Basensequenz einer Nukleinsäure (DNS oder RNS) eines Virus, eines Mikroorganismus, eines Tieres, einer Pflanze oder eines Menschen, oder ein Verfahren für den Nachweis für die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Variante in der Basensequenz, und eine Sonde für die Verwendung in dem Verfahren.
Relevanter Stand der Technik
Viele unterschiedliche Gene wurden aufgrund der Entwicklung der analytischen Technik für Nukleinsäuren gefunden, und verschiedene Arten von Erbkrankheiten auf der Grundlage der Variation von Genen wurden aufgeklärt. Es ist nun ersichtlich, dass in derartigen Erbkrankheiten die Basen des Gens teilweise fehlen oder das Punktmutationen der Basen auftreten, sodass Proteine abweichen und verschiedene Symptome auftreten. Zurzeit werden diese Erbkrankheiten hauptsächlich durch einen Test unter Verwendung eines Enzyms oder einer Immuntechnik unter Verwendung eines Antikörpers gefunden, nachdem die Symptome auftreten. Jedoch ist es vom Gesichtspunkt der frühen Behandlung wichtig, früh die Anwesenheit der Variante des Gens zu finden, bevor die ernsthaften Symptome auftreten.
Als Techniken für den Nachweis der Änderung von DNS oder RNS eines derartigen variierenden Gens gibt es gewöhnlich ein RFLP-(Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus-; restriction fragment length polymorephism)Verfahren und ein Verfahren für die Bestimmung des Basensequenz der DNS. Wenn jedoch eine derartige Erkrankung, wie vorher erwähnt, diagnostiziert wird, werden nur gelegentlich mehrere zehn bis mehrere tausend Kopien von DNS oder RNS erhalten und in dem RFLP und dem Basensequenzbestimmungsverfahren kann eine derartig hohe Empfindlichkeit um eine geringe Anzahl der DNS- oder RNS-Kopien nachzuweisen, nicht erwartet werden.
In den vergangenen Jahren wurden einige Verfahren vorgeschlagen, durch welche DNS oder RNS selbst bei einer kleinen Kopienanzahl nachgewiesen werden kann, aber sie wurden wegen eines geringen Rauschabstands (S/N ratio) oder einer geringen Verlässlichkeit nicht in die praktische Verwendung umgesetzt. Daher wird zurzeit, wenn DNS oder RNS auf der Grundlage einer geringen Anzahl ihrer Kopien nachgewiesen wird, für gewöhnlich die Ziel-DNS oder -RNS vermehrt, amplifiziert.
Als ein Mittel für die Amplifikation von DNS oder RNS wird nun weithin ein PCR-(Polymerasekettenreaktions-)Verfahren verwendet. Zum Beispiel wird die Amplifikation der DNS durch das PCR-Verfahren wie folgt durchgeführt:

(1) Zwei Sorten von Oligonukleotidprimern mit etwa 20 Oligonukleotiden (20-mer) werden bereitgestellt. Diese Primer sind komplementär zu der 5'-Seite jeder Kette einer doppelsträngigen Ziel-DNS, die etwa 200 Basenpaare hat und eine darin nachzuweisende Basensequenz enthält.
(2) In etwa 100 μl einer geeigneten Pufferlösung werden die Ziel-DNS, die vorher erwähnten zwei Sorten von Oligonukleotidprimern (jeweils 100 pmol) und Deoxynukleotidtriphosphorsäuren (jeweils 1,25 mM) von vier Sorten von Basen (Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin) gelöst.
(3) Die Lösung wird auf 94°C für fünf Minuten erwärmt, um die doppelsträngige Ziel-DNS zu denaturieren.
(4) 10 Einheiten einer wärmebeständigen DNS-Polymerase (z. B. Taq-DNS-Polymerase) werden zu der Lösung gegeben.
(5) Die Anlagerung (annealing) erfolgt bei 50°C für 2 Minuten.
(6) Eine Polymerisationsreaktion wird bei 72°C für 3 Minuten duchgeführt.
(7) Die vorhergehenden Schritte (3) bis (6) [ausgenommen der Schritt (4)] werden so häufig wie erforderlich wiederholt (25 bis 30 Zyklen).
(8) Die amplifizierte DNS wird durch eine geeignete Behandlung extrahiert.

Die auf diese Weise amplifizierte DNS wird nachgewiesen und durch das vorher erwähnte RFLP, das Basensequenzbestimmungsverfahren oder ähnliches analysiert.
Wie vorher beschrieben, wird gemäß dem PCR-Verfahren eine derartige Spurenmenge einer Nukleinsäure amplifiziert, wie sie nicht durch gewöhnliche Nachweistechniken nachgewiesen wird, wodurch der Nachweis ermöglicht wird. Jedoch hat dieses Verfahren ebenfalls die folgenden Probleme.

(1) Die Amplifikation und der Nachweis erfolgen durch vollkommen unterschiedliche Mittel, und so ist eine Bearbeitung der Amplifikation, der Extraktion, der Nukleinsäure und des Nachweises bis zum endgültigen Nachweis hintereinander erforderlich, was viel Arbeit und Zeit erfordert.
(2) Das Voranschreiten der Polymerisation ist abhängig von der Basensequenz, der Länge und ähnlichem des Primers, und in einem bestimmten Fall schreitet die Polymerisation überhaupt nicht voran, oder eine Polymerisationsgeschwindigkeit ist extrem gering. Außerdem erfolgt die unnötige Amplifikation aufgrund der Fehlbindungen des Primers. Die Gründe für diese Phänomene sind nicht vollständig verstanden, aber es kann angenommen werden, dass sie mit der Tatsache zusammenhängen, dass die Polymerisationsreaktion mit der Hilfe eines Enzyms erfolgt. Daher ist es zur Auswahl des Primers oftmals notwendig, vielerlei Experimente mit Versuch und Irrtum durchzuführen.
(3) Ein Temperaturzyklus wird für die Amplifikation verwendet und folglich, um einen Temperaturunterschied von 40°C oder mehr bei einer hohen Geschwindigkeit zu ändern, ist eine Vorrichtung notwendig, die die Temperatur mit Bezug auf die Zeit programmieren kann. Konkret sind eine Heizvorrichtung und eine Kühlvorrichtung mit einer großen Kapazität notwendig, was zu einem Anstieg der Kosten führt.
(4) In Übereinstimmung mit der Anforderung auf der Seite des Nachweissystems wird ein Nukleinsäureabschnitt von 200 oder mehr Basen amplifiziert, aber tatsächlich kann die PCR den Nukleinsäureabschnitt von 20 bis 30 Basen im Prinzip nicht amplifizieren. Jedoch kann eine bestimmte Krankheit durch Erkennen der Sequenz von etwa 20 Basen in einem bestimmten Fall ausreichend spezifiziert werden. Wenn das PCR-Verfahren für einen derartigen Fall verwendet wird, wird der Nukleinsäureabschnitt übermäßig amplifiziert, was zu einem Zeitverlust und einer Verschwendung von teueren Reagenzien führt.

ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, Bd. 183, 1989 ORLANDO US, Seiten 231 bis 244, XP 000444616, L.E. MORRISON ET AL. und EP-A-0 232 967 offenbaren einen kompetitiven Hybridisierungstest, wobei komplementär markierte Sonden und Ziel-DNS jeweils hybridisiert werden, und eine Sonde durch ein Fluorophor und die andere mit einem „Quencher" markiert wurde.
EP-A-0 512 334 offenbart verschiedene Verfahren für den Nukelinsäurenachweis unter Verwendung von Amplifizierungsverfahren, wie etwa PCR. Die Verfahren umfassen die Einführung von nachweisbaren DNS bindenden Mitteln in die Amplifizierungsreaktion, wobei die Mittel ein nachweisbares Signal produzieren, das nach Bindung doppelsträngiger DNS verstärkt wird. Derartige Amplifizierungssysteme können zusammen mit Oligonukleotidsonden verwendet werden, wo eine für den Nachweise einer speziellen Zielsequenz spezifische Oligonukleotidsonde in der Amplifizierungsreaktion zusätzlich zu dem DNS bindenden Mittel eingesetzt wird.
NUCLEIC ACIDS SYMPOSIUM SERIES, Bd. 27, 11. November 1992 LONDON GB, Seiten 97 bis 98, T. SHIMIDZU ET AL. offenbart die Synthese von substituierten Oligonukleotidderivaten und ihre Verwendung in Hybridisierungstests. Die Abtastung eines einzelsträngigen Oligonukleotids durch „Quenchen" der Fluoreszenz durch Elektronentransfer wird beschrieben.
Zusammenfassung der Erfindung
Mit Blick auf die vorher erwähnten Probleme der herkömmlichen Techniken wurde die vorliegende Erfindung vorgesehen, und eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren für den Nachweis einer Zielnukleinsäure zur Verfügung zu stellen. Gemäß dem Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung kann eine kleine Menge einer Probe in einem System unter leicht kontrollierbaren Reaktionsbedingungen effizient nachgewiesen werden, ohne vorher die Amplifikation der Zielnukleinsäure durchzuführen, und folglich ist das Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung für die Analyse einer in Spuren vorliegenden Menge der Probe geeignet.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren für den Nachweis einer Zielnukleinsäure zur Verfügung zu stellen, welches die Analyse bei geringen Kosten durch die Verwendung einer einfach aufgebauten Vorrichtung ermöglicht.
Die vorher erwähnten Aufgaben können durch die vorliegende Erfindung erzielt werden.
Das heißt, die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren für den Nachweis einer einzelsträngigen Zielnukleinsäure gerichtet, welches die in Anspruch 1 definierten Schritte umfasst.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine graphische Darstellung, die die Änderung eines Verhältnisses der ESR-Signalintensität, das in Beispiel 1 erhalten wurde, über die Zeit zeigt.
In dieser Zeichnung zeigt ⧠ einen Fall an, wo eine Sonde, eine Ziel-DNS und Fluorescein in einem Reaktionssystem enthalten waren und Lichtbestrahlung erfolgte;
zeigt einen Fall, wo die Sonde, die Ziel-DNS und Fluorescein in dem Reaktionssystem enthalten waren und die Lichtbestrahlung nicht erfolgte; und ⧫ zeigt einen Fall an, wo die Sonde und Fluorescein in dem Reaktionssystem enthalten waren und die Lichtbestrahlung erfolgte.
2 ist eine graphische Darstellung, die die Änderung einer ESR-Signallinienbreite, die in Beispiel 1 erhalten wird, über die Zeit zeigt, in welchem die Sonde, die Ziel-DNS und Fluorescein in dem Reaktionssystem enthalten war, und die Lichtbestrahlung erfolgte.
3 ist eine graphische Darstellung, die die Änderung eines im Beispiel 3 erhaltenen ESR-Signalintensitätsverhältnisses über die Zeit zeigt.
In dieser Zeichnung ⧠ zeigt einen Fall an, wo eine Sonde mit beiden gebundenen Enden, eine Ziel-DNS und Fluorescein in einem Reaktionssystem enthalten waren und Lichtbestrahlung erfolgte;
zeigt einen Fall, wo die Sonde mit beiden gebundenen Enden, der Ziel-DNS und Fluorescein in dem Reaktionssystem enthalten war und die Lichtbestrahlung nicht erfolgte; und ♦ zeigt einen Fall an, wo die Sonde mit beiden gebundenen Enden und Fluorescein in dem Reaktionssystem enthalten waren und die Lichtbestrahlung erfolgte.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Ein Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung basiert auf einem Prinzip, welches ziemlich unterschiedlich von den konventionellen Techniken ist, und es umfasst den Nachweis einer Doppelhelixstruktur selbst, welche ein Hybrid hat, und dann Amplifizierung des nachgewiesenen Signals. Das heißt, die vorliegende Erfindung ist wesentlich unterschiedlich von einem herkömmlichen Verfahren, wie etwa einem PCR-Verfahren, in welchem ein Schritt der Amplifizierung der Anzahl der Kopien einer Zielnukleinsäure und ein Schritt des Nachweises der amplifizierten Zielnukleinsäuren getrennt erfolgt. In der vorliegenden Erfindung wird das nachgewiesene Signal der Doppelhelixstruktur amplifiziert, und so erfolgt die Amplifikation und der Nachweis in einem System, und eine wirkungsvolle Analyse kann durch eine einfachere Vorrichtung bei geringen Kosten erzielt werden.
Außerdem beabsichtigt das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Ausbildung der Doppelhelixstruktur bei der Bildung eines Hybrids nachzuweisen, und gemäß der vorliegenden Erfindung ist es nicht notwendig, überschüssige Sonden von dem Hybrid, der Sonde und der Zielnukleinsäure abzutrennen (B/F-Separation). In der vorliegenden Erfindung kann die Ausbildung des erwünschten Nukleinsäurehybrids durch Einstellung der Bedingungen für den präzisen Nachweis der Doppelhelixstruktur alleine nachgewiesen werden, selbst wenn eine nichtspezifische Adsorption oder eine Fehlpaarung vorhanden ist, und folglich kann die vorliegende Erfindung die Präzision der Messung verbessern.
Die vorliegende Erfindung kann bei der Ausbildung der Doppelhelixstruktur, wie etwa DNS-DNS-Hybridisierung oder DNS-RNS-Hybridisierung angewendet werden.
Nun wird die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben.
Ein Hybridisierung genanntes Phänomen wurde bisher nur als auf einer Wasserstoffbindung zwischen den gegenseitig komplementären Phasen einer Nukleinsäure beruhend angesehen, weil im Allgemeinen nach der Immobilisierung der Nukleinsäure (DNS oder RNS) eine Hybridisierungsreaktion durchgeführt wird. Jedoch kann in dem Fall der Hybridisierungsreaktion in einer Lösung, die Ausbildung der Doppelhelixstruktur erwartet werden, wenn die Nukleinsäure Doppelstränge mit einer bestimmten Länge ausbildet. Die Erfinder legten große Aufmerksamkeit auf die Tatsache, dass die Nukleinsäure mit einem Einzelstrang unterschiedlich von der Nukleinsäure mit den Doppelsträngen (dem Hybrid) in einer Struktur höheren Ordnung und den chemischen Eigenschaften ist, und ihr Nachweissystem wurde etabliert. In der Konsequenz wurde die vorliegende Erfindung vervollständigt.
In der Doppelhelixstruktur bildet der Basenanteil der Nukleinsäure ein Basenpaar durch eine Wasserstoffbindung, und die Helix der Nukleinsäure ist gewunden, wobei ein Phosphoranteil und ein Sacharidanteil nach außen orientiert sind. Die Nukleinsäurebasen sind miteinander gestapelt bzw. geschichtet, um stabilisiert zu werden, und im Zentrum einer Helixachse angeordnet. Als Sorten der Doppelhelixstruktur sind A-, B-, C- und Z-Typen und ihre Varianten bekannt. Diese Strukturen sind nicht nur in ihrer Basensequenz sondern ebenfalls in einer Pitchlänge, der Symmetrie der Helix, der Breite eines Grabens, der Tiefe des Grabens und ähnlichem unter dem Einfluss einer Ionensorte oder einer Salzkonzentration, die zum Zeitpunkt der Anlagerung verwendet wurde, und selbst wenn die gleiche Basensequenz verwendet wird, wird angenommen, dass die Doppelhelixstrukturen mit den zu verwendenden Bedingungen variieren. Im Allgemeinen nimmt die DNS die Struktur vom B-Typ an, und in diesem Fall ist die Pitchlänge 33,8 Å und die Anzahl der Nukleinsäurebasenpaare pro Pitch ist 10 Basen.
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren für den Nachweis der Ausbildung einer Doppelhelixstruktur durch Verwendung von Reagenzien gerichtet, die eine nachweisbare Änderung durch die Nutzung der Doppelhelixstruktur, welche das Hybrid hat, durchmachen, und dann Messung der chemischen Änderung der Reagenzien.
Als diese Reagenzien werden zwei oder mehrere Sorten von Reagenzien genutzt, durch welche eine Interaktion durch die Doppelhelixstruktur bewirkt wird, um eine nachweisbare irreversible bzw. unumkehrbare Änderung zu erzeugen.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird den Reagenzien ermöglicht, mit einem Reaktionssystem einer Probe und einer Sonde gemeinsam zu existieren, und eine Zielnukleinsäure, die in der Probe enthalten ist, und die Sonde reagieren unter Bedingungen, bei welchen die Ausbildung und Dissoziation des Hybrids wiederholt werden. Danach wird das resultierende, akkumulierte (amplifizierte), nachweisbare Signal nachgewiesen.
Als nächstes wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung in Bezugnahme auf ein typisches Beispiel beschrieben, in welchem der Transfer einer elektrischen Ladung als die Interaktion eingesetzt wird.
Zum Beispiel können als die Reagenzien ein Elektronendonor und ein Elektronenakzeptor verwendet werden, welche den elektrischen Ladungstransfer durch die Doppelhelixstruktur durchführen können, und der Elektronendonor bzw. der Elektronenakzeptor können an beide Enden der Sonde gebunden sein. In diesem Fall müssen der Elektronendonor und der Elektronenakzeptor kombiniert werden, sodass wenigstens einer von ihnen zu einer nachweisbaren Änderung führt, welche als ein Ergebnis der Interaktion (des elektrischen Ladungstransfers) nicht verschwindet.
Wenn zwei Sorten von Reagenzien (der Elektronendonor und der Elektronenakzeptor) mit der Probe reagieren erfolgt der elektrische Ladungstransfer zwischen dem Elektronendonor und dem Elektronenakzeptor durch die Doppelhelixstruktur des Hybrids der Sonde und der Zielnukleinsäure, wobei dieses Hybrid in dem Fall ausgebildet wurde, dass die Zielnukleinsäure in der Probe vorhanden ist. Als ein Ergebnis des elektrischen Ladungstransfers tritt in wenigstens einem des elektrischen Donors und des elektrischen Akzeptors eine nachweisbare Änderung auf. Als nächstes wird dieses Reaktionssystem Bedingungen für die Dissoziation des ausgebildeten Hybrids ausgesetzt, sodass die Zielnukleinsäure wieder in einen freien Zustand gerät. Andererseits wird zu diesem Zeitpunkt die nachweisbare Änderung durch die Interaktion der Reagenzien, welche an die von dem Hybrid dissoziierte Sonde gebunden sind, beibehalten, weil die nachweisbare Änderung irreversibel ist. Danach wird das Reaktionssystem in einem derartigen Zustand Bedingungen zur Wiederausbildung des Hybrids ausgesetzt, und zu diesem Zeitpunkt reagiert die Zielnukleinsäure mit der Sonde, in welche der Elektronendonor und der Elektronenakzeptor gebunden sind, welche nicht an der Interaktion teilgenommen haben. Im Ergebnis wird die Doppelhelixstruktur ausgebildet und die Interaktion zwischen dem Elektronendonor und dem Elektronenakzeptor durch die auf diese Weise ausgebildete Doppelhelixstruktur tritt auf, sodass es wenigstens einer des Elektronendonors und des Elektronenakzeptors zu der nachweisbaren Änderung führt. Außerdem wird die Ausbildung des Hybrids und seine Dissoziation wiederholt durchgeführt und zu diesem Zeitpunkt wirkt die Zielnukleinsäure katalytisch, um nacheinander zu der Interaktion der an die Sonde gebundenen Reagenzien zu führen. In der Konsequenz kann die Molekülanzahl des Reagenz', das die nachweisbare Änderung trägt, erhöht werden, und, mit anderen Worten, kann ein analytisches Signal amplifiziert werden.
Wie vorher beschrieben, beabsichtigt die vorliegende Erfindung das Nachweissignal anstelle der Zielnukleinsäure zu amplifizieren, und daher kann, selbst wenn die Zielnukleinsäure in einer Spurenmenge vorhanden ist, die Analyse mit guter Empfindlichkeit erzielt werden. Da es überdies nicht notwendig ist, die Zielnukleinsäure zu amplifizieren, sind verschiedene Sorten von teuren Reagenzien, die für die Amplifizierung der Zielnukleinsäure erforderlich sind, nicht notwendig. Im Gegensatz zu einem Fall unter Verwendung eines PCR-Verfahrens, bei welchem der Schritt der Amplifizierung der Zielnukleinsäure und der Schritt der Nachweis der amplifizierten Zielnukleinsäure separat ausgeführt werden, kann zusätzlich die Amplifizierung und der Nachweis in einem System erfolgen, was den analytischen Schritt vereinfachen kann.
Um die Ausbildung und die Dissoziation des Hybrids in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zu wiederholen, können verschiedene Techniken benutzt werden. Zum Beispiel können Temperaturbedingungen, durch welche die Ausbildungen wie Dissoziation des Hybrids ins Gleichgewicht gebracht werden, verwendet werden, um die wiederholte Reaktion zu erhalten.
Falls die Temperaturbedingungen verwendet werden, hängt es von der Länge der Sonde oder der Zielnukleinsäure, einer Salzkonzentration in einer Lösung usw. ab, ob dieser Gleichgewichtszustand zu einer einzelsträngigen Seite oder einer doppelsträngigen Seite neigt, und daher sollten die tatsächlichen Bedingungen in geeigneter Weise ausgewählt werden. Im Allgemeinen neigt der Gleichgewichtszustand zu dem doppelsträngigen Zustand bei einer niedrigen Temperatur (30°C oder weniger), und er neigt sich zu dem einzelsträngigen Zustand bei einer hohen Temperatur (70°C). Jedoch ist es vom Standpunkt der guten Effizienz der Amplifikation bevorzugt, die Temperatur eines Schmelzpunkts der Nukleinsäure einzusetzen, bei welchem die Änderung der Nukleinsäure zwischen dem Einzelstrang und dem Doppelstrang schneller erfolgt, eine Nachbarschaft des Schmelzpunktes, oder geeigneter Weise eine Temperatur im Bereich von ±5°C vom Schmelzpunkt.
Bei der Messung des Schmelzpunktes der Nukleinsäure ist ein Fehler oftmals unvermeidlich, und so gibt es manchmal eine Diskrepanz zwischen dem eingestellten Schmelzpunkt und dem tatsächlichen Schmelzpunkt. Außerdem ergibt in der langen Nukleinsäure die Struktur höherer Ordnung ihrer Basensequenz einen Unterschied zwischen dem gemessenen und dem eingestellten Schmelzpunkt und dem tatsächlichen Schmelzpunkt. Um die durch einen Fehler verursacht Störung der Effizienz der Amplifikation zu vermeiden, oder um positiv und stabil die Änderung zwischen dem einzelsträngigen Zustand und dem doppelsträngigen Zustand herbeizuführen, kann die Temperatur in einem bestimmten Temperaturrahmen des Schmelzpunktes der Nukleinsäure fluktuieren, geeigneter Weise in einem Temperaturrahmen von ±5°C vom Schmelzpunkt.
Wenn der elektrische Ladungstransfer als die Interaktion genutzt wird, sind, wie vorher beschrieben, die Reagenzien nicht auf den Elektronendonor und den Elektronenakzeptor beschränkt, und wenigstens ein Paar des Elektronendonors und des Elektronenakzeptors kann in dem Reaktionssystem enthalten sein. Die Interaktion zwischen sowohl dem Elektronendonor als auch dem Elektronenakzeptor wird als die Änderung einer chemischen Struktur, die Änderung eines Elektronenzustands des Elektronendonors, des Elektronenakzeptors oder einer dritten Substanz, welche damit interagieren kann, oder die Änderung des Signals aufgrund der geänderten Substanz vor und nach der Ausbildung des Hybrids nachgewiesen werden.
Eine Beziehung zwischen dem Elektronendonor und dem Elektronenakzeptor, welche in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, wird durch eine Relation zwischen den Energiezuständen von beiden entschieden. Daher wird in der vorliegenden Erfindung die Substanz, die allgemein als der Elektronendonor oder der Elektronenakzeptor definiert ist, nicht als solche definiert verwendet, und Substanzen, welche der Elektronendonor und der Elektronenakzeptor werden können, werden selektiv in Kombination von zwei oder mehreren Sorten der Reagenzien verwendet. Zum Beispiel wird Anthracen als der typische Elektronendonor benutzt und sein Oxidations-Reduktions-Potenzial wurde gemessen, und auf der anderen Seite ist gut bekannt, dass bestimmter Eigenschaften von Anthracen dieses ebenfalls als der Elektronenakzeptor angesehen werden kann.
Als die Interaktion des Elektronendonors und des Elektronenakzeptors werden sogenannte durch Raum und durch Bindung in Betracht gezogen. Die erstere enthält z. B. einen Fall, wo der Elektronendonor und Elektronenakzeptor durch die gestapelten Basenpaare der Nukleinsäure interagieren und einen Fall, wo die Interaktion auf einer Nähewirkung (proximity effect) des Elektronendonors und des Elektronenakzeptors mit der Änderung in Richtung der Doppelhelixstruktur basiert. Als die letztere (die durch Bindung) kann der Transfer einer elektrischen Ladung durch die Basen, den Phosphoranteil und den Zuckeranteil angesehen werden, die die Nukleinsäure aufbauen. In jedem Fall wird keine Beschränkung auf die Konfirmation der Interaktion auferlegt, solange die Interaktion des Elektronendonors und des Elektronenakzeptors der Ausbildung der Doppelhelix zuzuordnen ist.
Die Interaktion des Elektronendonors und des Elektronenakzeptors über die gestapelten Basen der Nukleinsäure kann wie folgt erzielt werden. Wenn der Elektronendonor und der Elektronenakzeptor, die an einer Position angeordnet sind, wo sie mit der Doppelhelixstruktur reagieren, voneinander so ausreichend getrennt werden, dass die Interaktion nicht natürlicherweise erfolgen kann, wird ein Elektron, das von dem Elektronendonor abgegeben wird, nacheinander von der Base zu der benachbarten Base durch eine Elektronenwolke geliefert, die sich auf dem Basenpaar der Nukleinsäure verteilt, und erreicht schließlich den Elektronenakzeptor. Ein anderer Mechanismus kann in Betracht gezogen werden, in welchem der Elektronenakzeptor umgekehrt ein Elektron von dem Basenpaar der Nukleinsäure herauszieht, und dieses Verhalten erfolgt nacheinander und schließlich wird das Elektron von dem Elektronendonor aufgenommen. Kurzgefasst ist das Basenpaar der Nukleinsäure ein Vermittler (Mediator) in dem elektrischen Ladungstransfer.
Im Gegensatz dazu kann die Interaktion auf der Grundlage der Nähewirkung des Elektronendonors und des Elektronenakzeptors in einem Fall durchgeführt werden, wo der Elektronendonor und der Elektronenakzeptor näher zueinander in einem derartigen Ausmaß kommen, um die Interaktion aufgrund der Ausbildung der Doppelstrangstruktur zu erlauben. Wenn z. B. sowohl der Elektronendonor als auch der Elektronenakzeptor an die Sonde gebunden sind und diese Sonde in dem Zustand des Einzelstrangs ist interagieren sie nicht, und wenn die Sonde mit der Zielnukleinsäure hybridisiert ist, um die Doppelhelixstruktur auszubilden und dadurch verursacht, dass der Elektronendonor und der Elektronenakzeptor enger zueinander kommen, findet die Interaktion statt. Daher kann die Ausbildung der Doppelhelixstruktur durch das Auftreten der Interaktion nachgewiesen werden.
Nebenbei bemerkt, wenn das Erzielen des elektrischen Ladungstransfers zwischen dem Elektronendonor und dem Elektronenakzeptor über die Doppelhelixstruktur schwierig ist, kann ein Vermittler oder ein Sensibilisator, welcher den elektrischen Ladungstransfer dazwischen vermitteln kann, eingefügt werden.
Wie vorher beschrieben ist es erforderlich, dass der Elektronendonor und der Elektronenakzeptor an der Position angeordnet werden, wo sie mit der Doppelhelixstruktur reagieren, um die Interaktion dazwischen durchzuführen. Um die Reagenzien an der Position wo sie mit der Doppelhelixstruktur reagieren anzuordnen, können sie zwischen dem Basenpaar der Nukleinsäure als eine interkalierende Substanz (intercalator) eingelassen, in dem Graben der Doppelhelixstruktur begraben, oder so angeordnet sein, dass sie sich an die Doppelhelixstruktur schmiegen. In jedem Fall ist es für die vorliegende Erfindung essentiell notwendig, dass sie spezifisch an die Doppelhelixstruktur des von der einzelsträngigen Sonde und der Zielnukleinsäure ausgebildeten Doppelhelixstruktur angeordnet werden.
Von allen ist die interkalierende Substanz am vorteilhaftesten in dem Fall, dass der elektrische Ladungstransfer über die gestapelten Basenpaare genutzt wird. Das heißt, die interkalierende Substanz ist gewöhnlich eine lamellenartige Verbindung mit einer verteilten Elektronenwolke und wird auf einer verlängerten Linie der gestapelten Basenpaare der Nukleinsäure angeordnet, im gleichen Abstand wie der Abstand zwischen den Basenpaaren der Nukleinsäure und in parallele mit den Basenpaaren der Nukleinsäure. Wenn z. B. die interkalierende Substanz als der Elektronendonor und der Elektronenakzeptor auf dem gegenüberliegenden Seiten der Doppelhelixstruktur angeordnet werden, wird das von dem Elektronendonor abgegebene Elektron von der Base zu der benachbarten Base durch jede Elektronenwolke des Basenpaares der Nukleinsäure geliefert, sodass das Elektron direkt in Richtung des Elektronenakzeptors strömt. Wenn alternativ die interkalierende Substanz als der Elektronenakzeptor und der Elektronendonor auf den gegenüberliegenden Seiten der Doppelhelixstruktur angeordnet werden, zieht ein Elektronenloch des Elektronenakzeptors umgedreht ein Elektron von dem benachbarten Basenpaar der Nukleinsäure und dieses Elektronen herausziehende Verhalten wird nacheinander zwischen den anderen Basenpaaren der Nukleinsäure durchgeführt und schließlich wird das Elektron von dem Elektronendonor genommen, um den elektrischen Ladungstransfer zu beenden. Mit Blick auf diesen Mechanismus ist es in dem Fall des elektrischen Ladungstransfers über die gestapelten Basenpaare bevorzugt, dass wenigstens einer des Elektronendonors und des Elektronenakzeptors die interkalierende Substanz ist, und es ist bevorzugt, dass beide von ihnen interkalierende Substanzen sind, weil die Effizienz des elektrischen Ladungstransfers verbessert werden kann.
Als eine Technik für den Nachweis der Änderung der Interaktion von zwei oder mehreren Sorten von Reagenzien, welche durch die Ausbildung der Doppelhelixstruktur verursacht wird, gibt es ein Verfahren für den Nachweis der Änderung des Elektronenakzeptors. Dieses Verfahren kann in Übereinstimmung mit den Nachweismitteln in verschiedene Kategorien klassifiziert werden. Zum Beispiel kann die übertragene elektrische Ladung als eine Änderung des Spektrums in Übereinstimmung mit einem Spin-Entkopplungsverfahren unter Verwendung eines Spin-Markierungsmittels durch ESR oder ähnliche beobachtet werden. Alternativ kann die übertragende elektrische Ladung durch das Auftreten oder die Änderung eines neuen Absorptionspektrums als eine elektrische Ladungstransfer-Absorptionsbande beobachtet werden. In einem System, in welchem eine Lösung als ein Resultat des elektrischen Ladungstransfers gefärbt oder entfärbt wird, kann die Änderung direkt mit dem nackten Auge beobachtet werden, und ist effektiver als das einfache System. Ein lumineszierendes System, wie etwa Fluoreszenz oder Phosphoreszenz, kann ebenfalls verwendet werden. In diesem Fall kann eine Reaktion benutzt werden, durch welche Fluoreszenz oder Phosphoreszenz frisch erzeugt wird, oder eine Reaktion, in welche die Lumineszenz als ein Ergebnis der Interaktion verschwindet. Alternativ kann ein anderes Verfahren genutzt werden, in welchem der Elektronenakzeptor als ein Ergebnis des elektrischen Ladungstransfers chemisch in eine andere Substanz umgewandelt wird, und diese umgewandelte Substanz wird dann nachgewiesen. In diesem Fall kann eine dritte Substanz zu der umgewandelten Substanz zugegeben werden, um chemische Lumineszenz durch die chemische Reaktion durch die beiden Substanzen zu erzeugen. Wenn ein Protein, wie etwa ein Enzym oder ein Antikörper, als die dritte Substanz genutzt wird, ist ein Nachweisverfahren unter Verwendung von biologischer Lumineszenz nutzbar.
Der Nachweis der Interaktion kann durch Nachweis der Änderung des Elektronendonors zusätzlich zu der Änderung des Elektronenakzeptors erzielt werden. Grundlegend können die meisten Verfahren für den Nachweis der Änderung des Elektronenakzeptors direkt eingesetzt werden. Wenn eine lumineszierende Substanz als der Elektronendonor verwendet wird, kann eine direkte Änderung, wie etwa das Verschwinden von Fluoreszenz, durch die Nutzung der Tatsache nachgewiesen werden, dass die Quantenausbeute der Fluoreszenz durch den elektrischen Ladungstransfer verringert wird, oder alternativ kann die aufgetretene Änderung mit einigen Reaktionen kombiniert werden, um so den Nachweis mit dem nackten Auge zu ermöglichen.
In der vorliegenden Erfindung kann der Elektronendonor durch Licht aktiviert werden, um ein Elektron abzugeben, und der elektrische Ladungstransfer kann dann begonnen werden, und zusätzlich zu dieser Weise kann eine dritte Substanz genutzt werden, durch welche der Elektronendonor stimuliert werden kann, um das Elektron abzugeben.
Außerdem kann anstelle des Elektronendonors der Elektronenakzeptor aktiviert werden, um das Elektron aus dem Elektronendonor zu ziehen. In diesem Fall kann, wie in dem Fall des Elektronendonors, jeder Initiator, wie etwa Licht, verwendet werden.
Wie vorher beschrieben, kann ein Vermittler oder Sensibilisator genannte Substanz, welche den elektrischen Ladungstransfer vermitteln kann, als die dritte Substanz zusätzlich zu dem Elektronendonor und dem Elektronenakzeptor eingeschoben werden. Diese Sorte von Substanz interagiert mit der Doppelhelix, um den Elektronendonor oder den Elektronenakzeptor zu drängen, nicht direkt an die Doppelhelix zu binden, um den elektrischen Ladungstransfer durchzuführen.
Unnötig zu erwähnen, dass der ungebundene Elektronendonor und der ungebundene Elektronenakzeptor, welche frei in einem Reaktionssystem sind, ebenfalls nutzbar sind, solange die Interaktion von beiden der freien Reagenzien spezifisch nur an der Position auftritt, wo die Doppelhelixstruktur vorhanden ist.
Jedoch sind in einem bestimmten Fall einer oder beide von dem Elektronendonor und dem Elektronenakzeptor in einem freien Zustand in dem Reaktionssystem vorhanden, und die Interaktion dazwischen tritt unabhängig von der Anwesenheit/Abwesenheit der Doppelhelixstruktur auf, sodass ein Hintergrund auftritt und ein S/N-Verhältnis abnimmt. In einem derartigen Fall ist es bevorzugt, dass einer oder beide von dem Elektronendonor und dem Elektronenakzeptor an die Sonde gebunden sind, wenn sie verwendet werden. Wenn das Auftreten des Hintergrunds durch geeignetes Auswählen spezifischer Konzentrationen dieser freien Reagenzien in dem Reaktionssystem gehemmt werden kann, können die freien Reagenzien bei derartigen Konzentrationen verwendet werden. Wenn der Elektronendonor und/oder der Elektronenakzeptor an die Sonde zum Zeitpunkt der Nutzung gebunden ist, wird, wenn notwendig, die Bindung des Elektronendonors und/oder des Elektronenakzeptors an die Sonde über einen Linker wie etwa (CH₂)_n durchgeführt. In diesem Fall sollte die Positionsbeziehung des Elektronendonors und des Elektronenakzeptors in Betracht gezogen werden, sodass die Interaktion am effektivsten gestaltet werden kann.
Die am besten geeignete Ausführungsform ist ein Fall, in dem, wie vorher beschrieben, beide von dem Elektronendonor und dem Elektronenakzeptor an die Sonde gebunden sind. In diesem Fall ist die Positionsbeziehung zwischen den Reagenzien für die Durchführung der Interaktion definiert und daher kann die Steuerung der Interaktion vorteilhafter Weise durch Regulierung der Positionsbeziehung dieser Reagenzien mit Bezug auf die Sonde erzielt werden. In diesem Fall kann ein Abstand zwischen dem Elektronendonor und dem Elektronenakzeptor auf der Sonde in geeigneter Weise in Übereinstimmung mit den Sorten dieser Reagenzien ausgewählt werden. Wenn ein Vizinaleffekt genutzt wird, z. B. wenn die Interaktion durch den Vizinaleffekt erhalten wird, ist der Abstand zwischen dem Elektronendonor und dem Elektronenakzeptor bevorzugten Bereich von 20 bis 120 Å, bevorzugter von 50 bis 80 Å. Außerdem, wenn der elektrische Ladungstransfer über eine Doppelhelixstruktur erfolgt, ist der Abstand bevorzugt im Bereich von 20 bis 120 Å, bevorzugter von 50 bis 80 Å. Die Positionen auf der Sonde an welche der Elektronendonor und der Elektronenakzeptor gebunden sind, hängen von der Länge der Sonde ab, aber es ist vom Gesichtspunkt der Leichtigkeit der Bindung vorteilhaft, dass sie getrennt an beide Enden der Sonde gebunden sind.
Die Länge der Sonde wird in geeigneter Weise so ausgewählt, dass eine gute Hybridisierung mit der Zielnukleinsäure möglich sein kann und eine stabile Doppelhelixstruktur erhalten werden kann. Wenn jedoch sowohl der Elektronendonor als auch der Elektronenakzeptor an die Sonde gebunden sind und sie nahe zueinander sind, tritt in bestimmten Fällen die Interaktion auf, selbst wenn die Doppelhelixstruktur nicht vorhanden ist. Folglich wird die Länge der Sonde unter Berücksichtigung eines derartigen Falls bestimmt, aber hat zum Beispiel eine Länge von 8 oder mehr Basen, bevorzugt eine Länge von 12 oder mehr Basen.
Jedoch hat zusätzlich zu der Länge der Sonde die Basensequenz selbst als auch eine Salzkonzentration und eine Ionenintensität in dem Reaktionssystem einen großen Einfluss auf die Stabilisierung der Doppelhelixstruktur. Ein G-C-Basenpaar enthält mehr Wasserstoffbindungen als ein A-T-Basenpaar und daher kann in der Sequenz, die viele G-C-Basenpaare enthält, die stabilere Doppelhelixstruktur ausgebildet werden. Es wird angenommen, dass wenn die molare Konzentration von KCl von 0,01 M auf 1 M erhöht wird, der Schmelzpunkt der DNS um etwa 30°C steigt. Zusätzlich trägt die Anwesenheit der interkalierenden Substanz ebenfalls stark zu der Stabilität der Doppelhelixstruktur bei. Daher ermöglicht die geeignete Nutzung dieser stabilisierenden Faktoren die Verwendung der Sonde mit einer Länge von weniger als 8 Basen.
Typische Beispiele der Reagenzien, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind wie folgt:
Beispiele des Spin-Markierungsmittels schließen 4,4 Dimethyloxazolidin-N-oxyl (DOXYL), seine Derivate, 2,2,5,5-Tetramethylpyrrolidin-N-oxyl (PROXYL), und seine Derivate, und 2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-N-oxyl (TEMPO), und seine Derivate, ein.
Beispiele der fluoreszierenden interkalierenden Substanz enthalten Acridin, Anthracen, Pyren, Ethidiumbromid, Pyrylium, Proflavin, Porphyrin, Thiazolorange-Dimer (TOTO), Oxazolgelb (YOYO) und Derivate davon.
Beispiele der anderen allgemein fluoreszierenden Farbstoffe enthalten Cyanin, Azulen, trinukleäre Farbstoffe, Dansyl, Fluourescein, Eosin, Rhodamin und Riboflavin.
Diese Verbindungen können geeigneter Weise als der Elektronendonor, der Elektronenakzeptor und der Vermittler zum Zwecke der Bewertung des Oxidations-Reduktionspotenzials und ähnliches verwendet werden.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde unter Bezugnahme auf den Fall beschrieben, wo der Elektronendonor und der Elektronenakzeptor für die Durchführung des elektrischen Ladungstranfers als die Reagenzien verwendet werden, aber diese Reagenzien sind nicht auf Substanzen für die Durchführung der Interaktion durch den elektrischen Ladungstransfer beschränkt. Folglich können die optionalen Reagenzien genutzt werden, solange sie zu einer nachweisbaren und unumkehrbaren Änderung durch die Interaktion über die Doppelhelixstruktur führen.
Nun wird die vorliegende Erfindung ausführlich unter Bezugnahme auf Beispiele beschrieben, aber der Umfang der vorliegenden Erfindung sollte nicht auf diese Beispiele beschränkt werden.
Beispiel 1
[1] Herstellung einer 20-mer Oligonukleotidsonde, kombiniert mit einem Spin-Markierungsmittel TEMPO (4-Hydroxy-2,2,6,6-Tetramethylpiperidin)
(1) Synthese von 4-Aminohexylamino-2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-N-oxyl(4-Aminohexylamino-TEMPO)
0,5 mmol 4-Oxo-TEMPO und 5 mmol Hexamethylendiamin Dihydrochlorid wurden in 30 ml Methanol gelöst und 0,4 mmol Natriumcyanborhydrid und Molekularsiebe 3A wurden dann dazugegeben. Danach wurde die Mischung bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt, um sie reagieren zu lassen. Als nächstes wurde die Reaktionslösung durch einen Glasfilter filtriert, um die Molekularsiebe zu entfernen und das Lösungsmittel wurde aus dem Filtrat unter reduziertem Druck entfernt. Zu dem auf diese Weise erhaltenen Rückstand wurden 30 ml 1-N Chlorwasserstoffsäure hinzugegeben und es wurde darin gelöst, gefolgt durch Extraktion mit Chloroform. Die resultierende Chloroformphase wurde mit Wasser gewaschen und Chloroform wurde dann unter reduziertem Druck abdestilliert. Danach wurde Wasser zu dem resultierenden Rückstand gegeben und unlösliches Material durch Filtration entfernt. Das resultierende Filtrat wurde wieder einer Destillation unter reduziertem Druck unterzogen, um das Lösungsmittel zu entfernen, dadurch wurde ein rötliches ölförmiges Produkt erhalten.
(2) Synthese eines Oligonukleotids
Ein 20-mer Oligonukleotid, dessen Basensequenz komplementär zu einem Abschnitt der M13mp18 DNS als eine Ziel-DNS (ein Einzelstrang) ist, wurde mit einer 381A DNS automatischen Synthesevorrichtung, hergestellt durch ABI Co., Ltd., synthetisiert. In diesem Fall wurde eine 5'-therminale Dimethoxytritylgruppe auf der automatischen Synthesevorrichtung entfernt. Ihre Basensequenz war wie folgt:
(3) Synthese einer spin-markierten Oligonukleotidsonde
Das in dem vorher erwähnten Schritt (2) synthetisierte Oligonukleotid (1 μmol) wurde in eine gasdichte Spritze überführt, während es an einen CPG-Halter gebunden war. Die nachfolgenden Aktionen wurden in der Spritze durchgeführt. Als nächstes wurde 1 ml Dioxan, in welchem 50 mg Carbonyl-N,N'-Diimidazol (CDI) gelöst war, zu der CPG-Halter gegeben und die Lösung wurde dann bei Raumtemperatur für eine Stunde stehengelassen. Nach Waschen mit Dioxan und dann Trocknen unter reduziertem Druck wurde eine DMSO-Lösung (0,4 ml von 0,2 M) von 4-Aminohexylamino-TEMPO hinzugegeben und die Lösung wurde bei 55°C für 24 Stunden stehengelassen, mit DMSO, Dioxan und Methanol in dieser Reihenfolge gewaschen und dann unter reduziertem Druck getrocknet.
Das Oligonukleotid mit Spin-Markierung wurde ausgeschnitten und die Schutzgruppe mit konzentriertem wässrigem Ammoniak in einer herkömmlichen Art und Weise eliminiert, gefolgt durch Reinigung mit RPLC.
[2] Ausbildungsreaktion eines Hybrids einer TEMPO-Sonde und M13mp18 DNS.
0,2 μM einer Oligonukleotidsonde mit TEMPO, die in dem vorher erwähnten [1] zubereitet wurde und M13mp18 DNS (0,2 pM, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden auf 80°C in 1 mM Phosphorpufferlösung (pH = 7,0)/145 mM NaCl/5 mM KCl erwärmt und die Lösung wurde dann langsam auf einen Schmelzpunkt (63°C) des Hybrids abgekühlt, so dass die Sonde und die Ziel-DNS in dem Gleichgewichtszustand eines Einzelstranges und eines Doppelstranges gehalten wurden. Als nächstes wurde Fluorescein (hergestellt von Kodak Co., Ltd.) zu dieser Reaktionslösung gegeben, so dass eine finale Konzentration 10 μM sein könnte, um die gleichen 7 Proben insgesamt herzustellen. Diese Proben wurden unter Bedingungen zur Erhaltung des Gleichgewichtszustands des Einzelstranges und des Doppelstranges gehalten, d. h. bei einer konstanten Temperatur von 63°C, und dann wurden sie mit Licht von 490 nm für 0, 20, 40, 60, 80, 100 und 120 Minuten durch die folgende Belichtungsvorrichtungen bestrahlt. Danach wurden die Proben auf Raumtemperatur gekühlt und die Messung von ESR wurde dann durchgeführt.
Außerdem wurde das gleiche Vorgehen wie vorher beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass M13mp18 DNS nicht verwendet wurde, um die Proben (Sonden allein) für die Messung des ESR-Spektrums herzustellen, und die Messung von ESR erfolgte in der gleichen Art und Weise.
[3] Messung des ESR-Spektrums
Die Messung des ESR-Spektrums in jeder der Proben wurde durch Abtasten der Probe alle 20 Minuten durchgeführt, und das Intensitätsverhältnis und die Linienbreite wurden dann gemessen. In der vorher erwähnten ESR-Messung wurde eine durch JEOL, Ltd. hergestellte Messvorrichtung verwendet und eine flache Zelle aus künstlichem Quarz wurde verwendet.
Die ESR-Messvorrichtung und Beleuchtungsvorrichtung wurde wie folgt eingestellt: Tabelle 1

Frequenz 9,42 GHz

Modulation 100 kHz, 0,1 mT

Feld 335 mT

Zeit konstant 0,3 sec

Leistung 10 mW

Abtastzeit 8 min

Empfänger-Verstärkung 1,25 × 1000

Belichtungsvorrichtung

Monochrometer 490 nm

Stromzufuhr 88,5 V–89 V/22 A
Die 1 zeigt eine Änderung der Intensität des ESR-Signals über die Zeit in einem Fall, wo die TEMPO-Oligonukleotidsonde alleine mit Licht bestrahlt wurde, in einem Fall wo Fluorescein/eine TEMPO-Oligonukleotidsonde/M13mp18 DNS mit Licht bestrahlt wurde, und in einem Fall, in dem nicht belichtet wurde. Zusätzlich zeigt 2 eine Änderung der Linienbreite des ESR-Signals über die Zeit in dem Fall, dass Fluorescein/eine TEMPO-Oligonukleotidsonde/M13mp18 DNS mit Licht bestrahlt wurde.
Wie aus den 1 und 2 verständlich, wurde in dem Fall der TEMPO-Oligonukleotidsonde allein die Änderung des Intensitätsverhältnisses nicht beobachtet, selbst wenn die Lichtbestrahlung durchgeführt wurde. Überdies wurde ebenfalls in dem Fall der Fluorescein/der TEMPO-Oligonukleotidsonde/M13mp18 DNS die Änderung des Intensitätsverhältnisses nicht beobachtet, wenn keine Belichtung erfolgte.
Im Gegensatz dazu nahm in dem Fall, dass Fluorescein/die TEMPO-Oligonukleotidsonde/M13mp18 DNS mit Licht (490 nm), bestrahlt wurde, die Intensität des ESR über die Zeit ab (1), und daher stieg die Menge an TEMPO, in welchem die Spins entkoppelt waren über die Zeit an. Folglich wurde bestätigt, dass ein Detektionssignal amplifiziert wurde. Außerdem kann, der Tatsache nach zu urteilen, dass eine Änderung der Linienwalze nicht beobachtet wurde (2), angenommen werden, dass die Intensitätsänderung im ESR nicht von einer chemischen Änderung herrührt. Demgemäß kann verstanden werden, dass die Spins von TEMPO als ein Ergebnis des Transfers der Ladung von Fluorescein zu TEMPO über die Sonde/M13 DNS-Doppelstränge entkoppelt wurden, wodurch das Nachweissignal amplifiziert wird.
Beispiel 2
Das gleiche Experiment wie in Beispiel 1 wurde durchgeführt mit der Ausnahme, dass die folgende Sequenz als die Basensequenz einer Sonde verwendet wurde.
Diese Sequenz der Sonde war die der Sonde verwendet in Beispiel 1, in welcher die 10. Base von dem 5'-Ende von C zu G geändert wurde, und daher war die in diesem Beispiel verwendete Sondensequenz unterschiedlich zu der in Beispiel 1 verwendeten in einer Base, um mit M13mp18 DNS eine Fehlpaarung (mismatch) aufzuweisen.
Zu 0,2 μM der Sonde mit dieser fehl gepaarten Sequenz wurde 0,2 pM M13mp18 DNS hinzugegeben und die Lösung wurde bei einem Schmelzpunkt durch dasselbe Vorgehen wie in Beispiel 1 angeordnet. Als nächstes wurde Fluorescein zu der Lösung gegeben, und diese Lösung wurde mit Licht bestrahlt und dann auf Raumtemperatur gekühlt. Danach wurden Änderungen über die Zeit des Intensitätsverhältnisses und der Linienbreite eines ESR-Signals geprüft.
Im Ergebnis wurde die in Beispiel 1 gesehene Intensitätsänderung nicht beobachtet und die gleiche Intensität wie in Fällen der TEMPO-Oligonukleotidsonde allein wurde aufrecht erhalten. Diese Tatsache zeigt an, dass eine normale doppelsträngige Kette nicht in einem Hybrid mit der fehlpaarenden Oligonukleotidsonde und der DNS ausgebildet wurde, und eine elektrische Ladung wurde nicht übertragen, so dass ein Signal nicht amplifiziert wurde.
Beispiel 3
Synthese einer (5'-TEMPO, 3'-FIFTC) Oligonukleotidssonde markiert an beiden Enden
(1) Synthese eines Oligonukleotids kombiniert mit einer 3'-Aminogruppe
Ein 20-mer Oligonukleotid, dessen Basensequenz komplementär zu einem Abschnitt einer einzelsträngigen M13mp18 DNS als ein Modell der im Beispiel 1 verwendeten Ziel-DNS war, wurde mit 381A, hergestellt von ABI Co., unter Verwendung von 3'-Amino-modifizierter CPG (1 μmol) hergestellt durch Gren Research Co., Ltd. als ein Halter synthetisiert. Eine 5'-terminale Dimethoxytritylgruppe wurde auf der automatischen Synthesevorrichtung entfernt.
(2) Synthese einer spin-markierten Oligonukleotidsonde
Ein in dem vorher erwähnten Schritt (1) synthetisiertes Oligonukleotid (1 μmol) wurde in eine gasdichte Spritze überführt, während es auf einem CPG-Halter gebunden war. Die nachfolgenden Reaktionen erfolgten in der Spritze. Als nächstes wurde 1 ml Dioxan, in welchem 50 mg Carbonyl-N,N'-diimidazol (CDI) gelöst war, zu dem CPG-Halter gegeben und die Lösung wurde dann bei Raumtemperatur für eine Stunde stehengelassen. Nach Waschen mit Dioxan und dann Trocknen unter reduziertem Druck wurde eine DMSO-Lösung (0,4 ml von 0,2 M) von 4-Aminohexylamino-TEMPO, die in Beispiel 1 gezeigt wird, zugegeben, und die Lösung wurde bei 55°C für 24 Stunden stehengelassen, mit DMSO, Dioxan und Methanol in dieser Reihenfolge gewaschen und dann unter reduziertem Druck getrocknet.
Das Schneiden und das Entschützen eines spin-markierten Oligonukleotids erfolgte mit konzentriertem wässrigem Ammoniak in einer herkömmlichen Art und Weise, gefolgt durch Reinigung mit RPLC, um das spin-markierte Oligonukleotid zu erhalten, in welchem TEMPO an einem 5'-Ende markiert war.
(3) Synthese einer an beiden Enden markierten Oligonukleotidsonde
An das 3'-Ende eines spin-markierten Oligonukleotids, das in dem vorher erwähnten (2) synthetisiert wurde, wurde eine 3-Amino-2-Hydroxygruppe gebunden und daher wurde das folgende Vorgehen durchgeführt, um diese Aminogruppe mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat, hergestellt durch Sigma Co., Ltd.) zu kombinieren.
0,2 μmol (700 μl der wässrigen Lösung) des spin-markierten Oligonukleotids, das in dem vorher erwähnten (2) synthetisiert wurde, wurde mit 100 μl einer 1 M Natriumcarbonatpufferlösung (pH = 9) gemischt, und eine DMF-Lösung, die 2 mg FITC enthält, wurde zu der resultierenden Lösung hinzugegeben und die Reaktion erfolgte bei 35°C bei 24 Stunden. Danach wurde die Reaktionslösung durch eine Gelfiltrationssäule NAP-25 hergestellt durch Falmasia Co., Ltd. behandelt, um einen großen Überschuss an FITC zu entfernen, und dann durch RPLC gereinigt, um eine Sonde zu erhalten, in welcher TEMPO an ein 5'-Ende und FITC an ein 3'-Ende gebunden war.
(4) Messung des ESR-Spektrums
0,2 μm dieser Probe und 0,2 pm M13mp18 DNS wurden verwendet, und die Änderung des Intensitätsverhältnisses und der Linienbreite eines ESR-Signals wurden in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 über die Zeit geprüft. Zwischen der Sonde allein und einem Hybrid der nicht mit Licht bestrahlten Sonde und einer Zielnukleinsäure bei einer Änderung der Intensität nicht beobachtet. Im Gegensatz dazu, nahm nur wenn das Hybrid der nicht mit Licht bestrahlten Sonde und der Zielnukleinsäure mit Licht von 490 nm, welches die Anregungswellenlänge von Fluorescein ist, bestrahlt wurde, ein Signal mit der Zeit ab, wodurch der Transfer der elektrischen Ladung bestätigt werden konnte (2).
Außerdem war der Grad der Spinentkopplung höher als in dem Fall, in dem das Fluorescein nicht an die Sonde gebunden wurde, was bedeutet, dass wenn der Elektronendonor und der Elektronenakzeptor an beide Enden der Sonde gebunden waren, der Elektronentransfer effizienter ablief und in der Konsequenz eine wirkungsvolle Signalamplifikation der Nukleinsäuresonde erzielt wurde.
Beispiel 4
Ein Oligonukleotid (die gleiche Sequenz wie in Beispiel 2) mit einer Basensequenz, welche unterschiedlich zu der von M13-DNS in einer Base in der Mitte einer Sonde war, wurde synthetisiert, und der gleiche Vorgang wie in Beispiel 3 wurde ausgeführt, um TEMPO und Fluorescein an beide Enden der Sonde zu binden. Nachdem 0,2 μM dieser Sonde und 0,2 pM M13mp18 DNS in einer gewöhnlichen Weise verwendet wurden, wurde die Änderung des Intensitätsverhältnisses und der Linienbreite eines ESR-Signals über die Zeit in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 geprüft. Selbst wenn ein Sonden/DNS-Verbundstoff mit Licht von 490 nm, welches die Anregungswellenlänge von Fluorescein war, bestrahlt wurde, wurden Änderungen der Intensität des ESR-Signals und der Linienbreite nicht beobachtet, wie in den Fällen der Sonde alleine und dem nicht mit Licht bestrahlten Sonde/DNS-Verbundstoff.
Erfindungsgemäß kann der Nachweis einer doppelsträngigen Struktur durch eine Nukleinsäuresonde durch das Amplifizieren eines Nachweissignals in einem System erfolgen, wodurch eine Zielnukleinsäure mit hoher Empfindlichkeit durch einen sehr einfachen Vorgang nachgewiesen werden kann.
Da außerdem die Amplifikation durch eine rein chemische Reaktion ohne Nutzung eines Enzyms wie in einem PCR-Verfahren durchgeführt wird, können Probleme, wie etwa die unkorrekte Amplifikation oder die Verlangsamung der Amplifikation, welche durch eine Enzymreaktion verursacht werden, vermieden werden.
Insbesondere in dem Fall, dass die Interaktion von zwei oder mehreren Substanzen als ein Ergebnis des Transfers in einer elektrischen Ladung über die gestapelten Basen der Nukleinsäure möglich ist, wird das Voranschreiten der Amplifikation durch die Anwesenheit einer Fehlpaarung in einer Basensequenz beeinträchtigt, und in der Konsequenz ist es möglich, die eine Fehlpaarung nachzuweisen.
Da außerdem die Streuung einer Temperatur zum Zeitpunkt der Amplifikation nicht vorhanden ist, oder wenn überhaupt, etwa 5°C ist, kann eine preiswerte Vorrichtung mit einer geringen Kapazität vorgesehen werden.
Zusätzlich kann im Prinzip erfindungsgemäß die Nukleinsäure mit 20 bis 30 Basen amplifiziert werden, und so kann das herkömmliche Problem, dass eine kurze Nukleinsäure etwa durch PCR nicht amplifiziert werden kann, gelöst werden.

Claims

Verfahren für den Nachweis einer einzelsträngigen Zielnukleinsäure mit den Schritten: a) Bereitstellen einer Probenlösung, welche eine einzelsträngige Zielnukleinsäure umfassen kann; b) Bereitstellen einer Sonde mit einer Basensequenz, die komplementär zu jener der einzelsträngigen Zielnukleinsäure ist; c) Bereitstellen von zwei oder mehreren Sorten von Reagenzien, von denen zwei miteinander interagieren, wenn ein doppelsträngiges Nukleinsäurehybrid zwischen der einzelsträngigen Zielnukleinsäure und der Sonde ausgebildet wird, wobei wenigstens eines der Reagenzien sich durch die Interaktion in dem doppelsträngigen Zustand unumkehrbar ändert, wobei eine nachweisbare Änderung eines analytischen Signals erzeugt wird; d) Zugeben der Sonde und der Reagenzien zu der Probenlösung und Aussetzen der Probenlösung mit den folgenden Bedingungen, i) so dass das doppelsträngige Nukleinsäurehybrid zwischen der Sonde und der einzelsträngigen Nukleinsäure ausgebildet wird; und ii) so dass das doppelsträngige Nukleinsäurehybrid zwischen der einzelsträngigen Zielnukleinsäure und der Sonde denaturiert wird, e) Wiederholen des Aussetzens der Probenlösung mit den Bedingungen i) und ii), so dass die Ausbildung und Dissoziation des doppelsträngigen Nukleinsäurehybrids wiederholt wird, um eine Anhäufung des unumkehrbar geänderten Reagenzien zu verursachen, wodurch die nachweisbare Änderung des analytischen Signals anstelle der einzelsträngigen Zielnukleinsäure vervielfältigt wird; und f) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit des angehäuften, unumkehrbar geänderten Reagenz', um die Anwesenheit oder Abwesenheit der einzelsträngigen Nukleinsäure in der Probenlösung nachzuweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt d) den Unterschritt des Aussetzens der Probenlösung mit Bedingungen umfasst, so dass die Temperatur der Probenlösung zwischen oberhalb und unterhalb eines Schmelzpunktes des doppelsträngigen Nukleinsäurehybrids schwankt, bei welchem das doppelsträngige Nukleinsäurehybrid denaturiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Schritt d) den Unterschritt des Aussetzens der Probenlösung mit Bedingungen umfasst, so dass die Temperatur der Probenlösung zwischen +5°C vom Schmelzpunkt des doppelsträngigen Nukleinsäurehybrids und –5°C vom Schmelzpunkt des doppelsträngigen Nukleinsäurehybrids schwankt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Schritt d) den Unterschritt des Aussetzens der Probe mit Bedingungen umfasst, so dass die Ausbildung des doppelsträngigen Nukleinsäurehybrids und die Dissoziation des doppelsträngigen Nukleinsäurehybrid in einem Gleichgewichtszustand sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Interaktion zwischen den Reagenzien durch Anordnung der Reagenzien an einer Position verursacht wird, wo sie in der Lage sind, durch die Ausbildung des doppelsträngigen Nukleinsäurehybrids miteinander zu interagieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Interaktion eine Ladungstransferreaktion zwischen den Reagenzien ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Ladungstransfer durch den Stapel der Basenpaare des doppelsträngigen Nukleinsäurehybrids auftritt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, wobei eines der Reagenzien, welche miteinander interagieren, ein Elektronendonor und das andere ein Elektronenakzeptor ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Elektronenakzeptor ein Spin-Markierungsmittel ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei wenigstens eines der Reagenzien eine interkalierende Substanz ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei der Ladungstransfer durch Bestrahlung mit Licht initiiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die nachweisbare Änderung eine chemisch nachweisbare Änderung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die nachweisbare Änderung eine optisch nachweisbare Änderung ist.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei eines der Reagenzien ein Spin-Markierungsmittel ist, und das andere ein Elektronendonor ist, und die nachweisbare Änderung eine Änderung in der Stärke eines Elektronenspin-Resonanzspektrums ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt c) ein erstes Reagenz und eine Sonde bereitgestellt wird, an welche ein zweites Reagenz gebunden ist, und in Schritt d) werden das erste Reagenz und die Sonde zu der Probenlösung gegeben.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reagenzien, welche miteinander interagieren, an die Sonde gebunden werden, und in Schritt d) die Sonde zu der Probenlösung gegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Reagenzien, welche miteinander interagieren, an beide Enden der einzelsträngigen Nukleinsäure der Sonde gebunden werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei der Schritt d) den Unterschritt des Aussetzens der Probenlösung mit Bedingungen umfasst, so dass die Temperatur der Probenlösung zwischen oberhalb und unterhalb eines Schmelzpunktes des doppelsträngigen Nukleinsäurehybrids schwankt, bei welchem das doppelsträngige Nukleinsäurehybrid denaturiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei der Schritt d) den Unterschritt des Aussetzens der Probenlösung mit Bedingungen umfasst, so dass die Temperatur der Probenlösung zwischen +5°C vom Schmelzpunkt des doppelsträngigen Nukleinsäurehybrids und –5°C vom Schmelzpunkt des doppelsträngigen Nukleinsäurehybrids schwankt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei der Schritt d) den Unterschritt des Aussetzens der Probe mit Bedingungen umfasst, so dass die Ausbildung des doppelsträngigen Nukleinsäurehybrids und die Dissoziation des doppelsträngigen Nukleinsäurehybrid in einem Gleichgewichtszustand sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 20, wobei die Interaktion eine Ladungstransferreaktion zwischen den Reagenzien ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Ladungstransfer durch den Stapel der Basenpaare des doppelsträngigen Nukleinsäurehybrids auftritt.
Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei eines der Reagenzien, welche miteinander interagieren, ein Elektronendonor ist und das andere ein Elektronenakzeptor ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Elektronenakzeptor ein Spin-Markierungsmittel ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei wenigstens eines der Reagenzien eine interkalierende Substanz ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei, bei Abhängigkeit von Anspruch 15 oder 16, der Schritt e) den Schritt des Nachweises eines Signals umfasst, das die Menge des Spinn-Markierungsmittels darstellt, dessen Spins entkoppelt sind.
Verfahren nach Anspruch 24 oder 26, wobei das Spin-Markierungsmittel 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Elektronendonor Fluoreszein ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 28, wobei die Sonde wenigstens eine Länge von 8 Basen hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 29, wobei der Ladungstransfer durch Bestrahlung mit Licht initiiert wird.