BE1028040B1 - Matrixabhängiger Gewebe-Engineering-Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen und Konstruktionsverfahren dafür - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung offenbart einen matrixabhängigen Gewebe-Engineering-Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen und ein Konstruktionsverfahren dafür, wobei die mesenchymalen Stammzellen und die Osteoklastenvorläufer mit einem Verhältnis von 10:1 an einem porösen Knochengerüstmaterial implantiert werden, um einen Gewebe-Engineering-Komplex zu konstruieren, dann wird ein osteogenes Induktionskulturmedium in vitro hinzugefügt, weiteres Kultivieren für 12-14 Tage, Einfrieren für 48-72 Stunden bei -70°C bis -80°C, Gefriertrocknen für 24-30 Stunden, um einen matrixabhängigen Gewebe-Engineering-Knochen zu erhalten. Die In-vivo-Forschungsergebnisse zeigen, dass die vorliegende Erfindung die Bildung neuer Knochen fördern und die Knochendefekt erfolgreich reparieren kann.
Description
Matrixabhängiger Gewebe-Engineering-Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen und Konstruktionsverfahren dafür
TECHNISCHES GEBIET Die vorliegende Erfindung betrifft das technische Gebiet vom Gewebe- Engineering und einen matrixabhängigen Gewebe-Engineering-Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen und ein Konstruktionsverfahren dafür.
STAND DER TECHNIK Die Behandlung großer Knochendefekte ist immer eines der schwierigen Probleme in der klinischen Behandlung. Der autogene Knochen ist der "Goldstandard" für die Knochentransplantation, was allerdings zu einem invasiven Reparaturmodus gehört und den enormen klinischen Bedarf an Knochenreparaturmaterialien nicht decken kann. Nachher wird eine Vielzahl von Knochenersatzmaterialien entwickelt, wie z. B. xenogener Knochen, allogener entkalkter Knochen und künstlicher Knochenersatz usw. Das Vorhandensein von xenogenem Knochen weist jedoch die Mängel auf, dass eine geringe Überlebensrate der Knochentransplantation besteht und er anfällig für eine Abstoßung des Immunsystems und eine Krankheitsausbreitung ist, was die klinischen Bedürfnisse schwer decken kann. Der größte Mangel allogener entkalkter Knochen liegt darin, dass die Krankheitsausbreitung leicht auftritt, ein großer Knochen nach der Transplantation schwer beim Empfänger zu bilden ist und Frakturen und Infektionen leicht auftreten können, und dabei bestehen auch Probleme wie Quellen. Die Entwicklung vom Gewebe-Engineering seit den letzten 20 Jahren eröffnet einen neuen Weg für die Reparatur und Behandlung von Knochendefekten.
Der individualisierte Gewebe-Engineering-Knochen kann eine große Menge an hochaktiven Knochenreparaturmaterialien für Kinder und junge Patienten bereitstellen und hat gute klinische Ergebnisse erzielt und gute Knochenreparaturmaterialien für Patienten mit autogenem Knochenmangel bereitgestellt. Der Vorteil liegt darin, dass nur 10 mL Knochenmark des Patienten entnommen werden sollen, eine große Menge an Keimzellen in vitro wird vermehrt und dann am Gerüstmaterial inokuliert, um den Gewebe-Engineering- Knochen zu konstruieren. Nach der ausgereiften Kultivierung kann eine große Menge an hochaktiven Knochenreparaturmaterialien erhalten werden. Das Verfahren eignet sich für Kinder und Patienten mit starker Vermehrungsfähigkeit von Stammzellen im autogenen Knochenmark, und seine Verwendung auf ältere Menschen, insbesondere auf Patienten mit Grunderkrankungen, ist eingeschränkt. Zu den Einschränkungen gehören: 1) lange Konstruktionszeit, eine In-vitro- Amplifikation und -kultivierung von fast 3 Wochen ist erfordert; 2) hohe technische Anforderungen, die spezialisierten Operationssäle mit 100 Ebenen und qualifizierte Fachkräfte sind erfordert; 3) hohe klinische Kosten, jeder Fall erfordert durchschnittlich hohe Kultivierungskosten. Der Kern der osteogenen Aktivität von diesem herkömmlichen Gewebe-Engineering-Knochen liegt in den Keimzellen, dabei bestehen allerdings Probleme bei der Lagerung und dem Transport des Gewebe-Engineering-Knochens und der Aufrechterhaltung der Keimzellaktivität. Darüber hinaus bestehen viele technische Verbindungen, und eine Qualitätskontrolle ist schwierig zu erreichen. Es wird nur in einzelnen Krankenhäusern und einzelnen Gruppen eingesetzt. Die groß angelegte klinische Anwendung und die Realisierung der Industrialisierung werden beschränkt.
Die Verwendung von reichlich vorhandenen Proteinen und Faktoren in der extrazellulären Matrix zur Reparatur von Gewebeschäden ist einer der aktuellen Forschungsschwerpunkte. In einer frühen Stufe wurden ein Knochenmatrixmaterial, das eine große Menge an Proteinen enthält, die von mesenchymalen Stammzellen der Nabelschnur sekretiert werden, sowie ein Herstellungsverfahren (Patent ZL 2013 1 0449152.5) etabliert, und auf dieser Grundlage wurden ein Konstruktionskonzept und -system für einen matrixabhängigen Gewebe-Engineering-Knochen "Matrix Based Tissue Engineering Bone, M-TEB)" entwickelt. Die grundlegende Konstruktionsstrategie lautet wie folgt: die mesenchymalen Stammzellen (mesenchymal stem cells, MSC) werden mit Knochengerüstmaterialien verbunden, Kultivieren für insgesamt 14 Tage, Einfrieren des Zell-Gerüst-Komplexes für 48 Stunden bei - 80°C und Gefriertrocknen für 24 Stunden, um MSC zu ECM-TEB der Keimzellen zu bilden. Bei dieser Konstruktionstechnologie bleiben die Zytokine und
Matrixproteine, die die Zellen autokrin auf das Gerüstmaterial einwickeln, erhalten, obwohl die Zellaktivität entfernt wird. Nach der Transplantation in vivo sind die in die Matrix eingewickelten Zytokine unter Wirkung von Enzymen langsam an der Verletzungsstelle freigesetzt und nehmen an der Knochenregeneration und -rekonstruktion teil. Aufgrund dessen erfüllt das vom dezellularisierten M-TEB geladene und freigesetzte biologisch aktive Protein jeweils die Anforderungen der physiologischen Umgebung.
Die Etablierung von Homòöostase und Knochenrekonstruktion in der Knochenmikroumgebung erfordert mehrere Zellinteraktionen, um physiologische und pathologische Funktionen auszuführen. Analog dazu wird das dynamische Gleichgewicht der Knochenrekonstruktion durch die Zusammenarbeit verschiedener Zellen im Knochengewebe erreicht. Wenn daher verschiedene Zelltypen bei der Konstruktion von ECM-TEB mitkultiviert werden können, wird die Mikroumgebung der Knochenbildung in vivo realistischer simuliert. Die beiden endgültigen funktionellen Zellen, die zur Aufrechterhaltung der Knochenhomòöostase erforderlich sind, sind Osteoblasten und Osteoklasten. Dabei stammen die Osteoblasten (Osteoblast, OB) aus MSCs und sind hauptsächlich für die Synthese der Knochenmatrix und die Ablagerung von Calciumsalzen verantwortlich. Die Osteoklasten (Osteoklasten, OC) sind dadurch gebildet, dass sich die Monozyten/Makrophagen-Zelllinie in hämatopoetischen Stammzellen spalten, und vervollständigen die Knochenabsorption und den Knochenabbau durch lokale Säuresekretion und die Freisetzung von den die Knochenmatrix abbauenden Enzymen. Die beiden Zelltypen arbeiten durch genaue Regulierung eng zusammen, um die Rekonstruktion des Knochengewebes abzuschlieBen und die Knochenhomôostase aufrechtzuerhalten. Die Studien haben gezeigt, dass PDGF-BB, das von Osteoklastenvorläufern (Präosteoklasten, POC) sekretiert wird, die gegenseitige Kopplung von Knochenbildung und Vaskularisation fördern kann, was darauf hindeutet, dass osteoklastenbezogene Zellen eine Schlüsselrolle bei der Knochenreparatur und ihrer Vaskularisation spielen. Dies liefert eine theoretische Grundlage für die Einführung von Osteoklastenvorläufern als "zusammengesetzte" Keimzellen bei der vorliegenden Erfindung, während MSCSs als Keimzellen für die osteogene Differenzierung verwendet werden.
Derzeit gibt es keinen Bericht über Osteoklastenvorläufer als eine der Keimzellen zur Konstruktion von matrixabhängigem Gewebe-Engineering- Knochens und zur Behandlung von Knochendefekten.
INHALT DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG In Anbetracht dessen liegt das Ziel der vorliegenden Erfindung darin, bei gegenwärtiger Verwendung eines großen Gewebe-Engineering-Knochens zur Reparatur großer Knochendefekte eine neuartige Gewebe-Engineering- Knochenkonstruktion zu etablieren, um das Engpassproblem mit der Abhängigkeit von autogen Zellen und lebenden Zellen bei der Verwendung des herkömmlichen Gewebe-Engineering-Knochens und das Problem, dass es unter Verwendung von MSC als einzelne Quelle von Keimzellen schwierig ist, eine realistischere osteogene Mikroumgebung in vivo zu erreichen, zu lösen. Die vorliegende Erfindung stellt einen matrixabhängigen Gewebe-Engineering- Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen und ein Konstruktionsverfahren dafür zur Verfügung. Die vorliegende Erfindung verwendet die folgende technische Lösung:
1. ein Konstruktionsverfahren für einen matrixabhängigen Gewebe- Engineering-Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen, wobei die mesenchymalen Stammzellen und die Osteoklastenvorläufer mit einem Verhältnis von 10:1 an einem porösen Knochengerüstmaterial implantiert werden, um einen Gewebe-Engineering- Komplex zu konstruieren, dann wird ein osteogenes Induktionskulturmedium in vitro hinzugefügt, weiteres Kultivieren für 12-14 Tage, Einfrieren für 48-72 Stunden bei -70°C bis -80°C, Gefriertrocknen für 24-30 Stunden, um einen matrixabhängigen Gewebe-Engineering-Knochen zu erhalten.
Bevorzugt sind die mesenchymalen Stammzellen mesenchymale Knochenmarkstammzellen, mesenchymale Stammzellen des peripheren Blutes, mesenchymale Stammzellen des Nabelschnurbluts, mesenchymale Fettstammzellen oder mesenchymale Stammzellen der Nabelschnur.
Bevorzugt sind die mesenchymalen Stammzellen mesenchymale Stammzellen der Nabelschnur.
Bevorzugt ist das poröse Knochengerüstmaterial eine dezellularisierte Knochenmatrix oder eine entkalkte Knochenmatrix. Bevorzugt ist das poröse Knochengerüstmaterial eine entkalkte Knochenmatrix.
5 Bevorzugt wird ein Gerüstmaterial mit entkalkter Knochenmatrix genommen, Einweichen von diesem für 48 Stunden im DMEM-Kultursubstrat, Einstellen des pH-Werts auf 7,2; Nehmen der zweiten Generation mesenchymaler Stammzellen in der exponentiellen Wachstumsphase, Waschen dieser mit PBS und Inkubieren für eine Stunde unter Verwendung von 0,1 Gew.-% Kollagenenzymlösung vom Typ L anschlieBendes Zugeben von 0,25 Gew.-% Pankreatin und 0,02 Gew.-% EDTA und Verdauen für 3-5 Minuten, Waschen im DMEM-Kultursubstrat, das 10 Gew.-% fötales Kälberserum enthält, und Resuspendieren, und Mischen mit den Osteoklastenvorläufern mit einem Verhältnis von 10:1 und Durchführen einer Resuspension; Beimpfen der Zellen auf das Gerüstmaterial mit entkalkter Knochenmatrix nach der oben genannten Behandlung, so dass die Zellsuspension nur das Gerüstmaterial infiltriert und das Gerüstmaterial nicht überläuft, in 3 Stunden wird unter aseptischen Betriebsbedingungen die Unterseite des Gerüstmaterials mit entkalkter Knochenmatrix zur Oberseite umgedreht, und die Zellsuspension wird mit dem oben geschilderten Verfahren beimpft; das Zellgerüst hat eine reguläre Größe von 0,5 cm x 0,5 cm x 0,3 cm und die Gesamtanzahl der implantierten Zellen beträgt etwa 10°, in 3 Stunden wird das DMEM-Kultursubstrat hinzugefügt, bis die Oberseite des Gerüstmaterials mit entkalkter Knochenmatrix nur knapp eingetaucht ist, anschlieBendes Kultivieren bei 37°C und 5% CO». Durchführen einer Induktionskultivierung zur osteogenen Differenzierung in 24 Stunden in vitro für 12-14 Tage, Einfrieren bei -70°C bis -80°C für 48-72 Stunden, Gefriertrocknen für 24-30 Stunden und Kryokonservierung für 3 Monate, um die Immunogenität signifikant zu reduzieren, auf die Weise wird ein matrixabhängiger Gewebe-Engineering-Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen gebildet.
Bevorzugt stammen die Osteoklastenvorläufer aus Knochenmarkmonozyten, die für 24 Stunden durch 100ng/mL RANKL und 50ng/mL M-CSF in Osteoklastenrichtung differenziert werden.
2.Mit dem obigen Verfahren wird ein matrixabhängiger Gewebe- Engineering-Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen konstruiert.
Die vorliegende Erfindung hat folgende Vorteile: die vorliegende Erfindung etabliert zum ersten Mal ein Konstruktionsverfahren für einen matrixabhängigen Gewebe-Engineering-Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen, das nicht nur die Konstruktionsverfahren des matrixabhängigen Gewebe-Engineering-Knochens erweitert, sondern auch eine realistischere osteogene Mikroumgebung in vivo konstruieren kann. Die Ergebnisse von In-vivo-Studien zeigen, dass der mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung konstruierte matrixabhängige Gewebe-Engineering- Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen die Knochendefekte in vivo erfolgreich reparieren kann, so dass die vorliegende Erfindung bei der Konstruktion des Gewebe-Engineering-Knochens und der Knochendefektreparatur eine gute Anwendungsperspektive aufweist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG Im Zusammenhang mit den folgenden Figuren wird die vorliegende Erfindung näher erläutert, damit das Ziel, die technische Lösung und die Vorteile der vorliegenden Erfindung klarer werden.
Figur 1 zeigt ein schematisches Diagramm einer Strategie eines Konstruktionsverfahrens für einen matrixabhängigen Gewebe-Engineering- Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen.
Figur 2 zeigt ein Diagramm des Detektionsergebnisses einer gemischten Lymphozytenkulturreaktion (MLR).
Figur 3 zeigt ein Diagramm der Fluoreszenzdetektionsergebnisse von MHC-I und MHC-II eines matrixabhängigen Gewebe-Engineering-Knochens mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen.
Figur 4 zeigt ein Diagramm der Ergebnisse eines In-vitro- Migrationsexperiments von Endothelzellen durch einen Proteinextrakt aus einem matrixabhängigen Gewebe-Engineering-Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen.
Figur 5 zeigt ein Diagramm der Ergebnisse eines MSC-In-vitro- Kratzreparaturexperiments und In-vitro-Osteogen-Differenzierungsexperiments durch einen Proteinextrakt aus einem matrixabhängigen Gewebe-Engineering- Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen.
Figur 6 zeigt ein Diagramm der Ergebnisse eines MSC-In-vitro-Osteogen- Differenzierungsexperiments durch einen Proteinextrakt aus einem matrixabhängigen Gewebe-Engineering-Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen.
Figur 7 zeigt ein Diagramm der Mikro-CT-Untersuchungsergebnisse eines matrixabhängigen Gewebe-Engineering-Knochens mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen in 2 Monaten nach dem Pflanzen zur Reparatur von femoralen Defekten an Ratten.
Figur 8 zeigt ein Diagramm der Ergebnisse der Masson-Färbung eines matrixabhängigen Gewebe-Engineering-Knochens mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen in 2 Monaten nach dem Pflanzen zur Reparatur von femoralen Defekten an Ratten.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG Im Zusammenhang mit Figuren wird die ausführlichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung im Folgenden näher erläutert. In den bevorzugten Ausführungsformen werden die experimentellen Verfahren in spezifischen Bedingungen nicht angegeben, die Experimente werden üblicherweise gemäß herkömmlichen Bedingungen oder gemäß den vom Reagenzienhersteller empfohlenen Bedingungen durchgeführt.
Ausführungsbeispiel 1: Konstruktion eines matrixabhängigen Gewebe- Engineering-Knochens mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen
1. Kultivieren von Nabelschnur-MSC Nehmen einer gesunden fetalen Nabelschnur, Abschneiden der Arterien und Venen und Zerschneiden; Kultivieren unter Verwendung eines Gewebeblocks, Verdauen der Nabelschnur mit Kollagenase vom Typ I; Waschen des Gewebeblocks mit einer Phosphatpufferlösung, Übertragen des Gewebeblocks in einen Kulturkolben und Zugeben des Kultursubstrats, um eine an der Wand anhaftende Kultivierung durchzuführen; Kultivieren in einem Inkubator mit konstanter Temperatur von 37°C und 5% CO», Wechsel des Substrats alle 3 Tage, nach dem Wechsel des Substrats werden das Zellwachstum und die morphologischen Eigenschaften unter einem Umkehrmikroskop beobachtet, wenn die Zellen kurz vor der Fusion stehen, werden sie mit 0,25% Trypsin verdaut, und Weitergeben mit einem Verhältnis von 1:2. Wenn die oben erwähnten kultivierten Knochenmark-MSCs auf etwa 80% fusioniert sind, werden 2,5g/L Trypsin und 0,2g/L EDTA mit einem Verhältnis von 1:1 gemischt und verdaut. Die Zellen werden in einem Subkulturkolben (T25) mit einer Zelldichte von 8,0 x 10%/cm? zur Vermehrung und Kultivierung gebeimpft. Das Zellwachstum und die morphologischen Eigenschaften werden unter einem Umkehrmikroskop beobachtet. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zellen der zweiten Generation gut wachsen und eine einheitliche Morphologie aufwiesen. Die meisten Zellen sind reife mesenchymale Stammzellen in breiten großen Polygonen oder flachen Formen.
2. Kultivieren von Osteoklastenvorläufern Die primären Knochenmarkmakrophagen (BMMs), die aus Knochenmark stammen, werden für die Induktionskultur verwendet. BMMs werden gleichmäßig in eine Zellkulturplatte (5000 Zellen/Pore, 96-Poren-Platte) gebeimpft, RANKL mit einer Konzentration von 100ng/mL und M-CSF mit einer Konzentration von 50ng/mL werden verwendet, um Zellen zur Differenzierung in Osteoklasten zu induzieren. Die Induktionszeit beträgt 24 Stunden, und die Osteoklastenvorläufer werden erhalten, was durch die TRAP-Färbung, die CFA-Färbung, den Fusionstest und den Knochenphagozytentest bewertet und bestätigt. 80% der Zellen in diesem Stadium sind TRAP-positiv, aber sie sind nicht in der Lage, den Knochen zu absorbieren.
3. Konstruktion eines matrixabhängigen Gewebe-Engineering-Knochens mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen Die Konstruktionsstrategie ist wie in Figur 1 dargestellt, Nehmen eines Gerüstmaterials (Zellgerüst 0,5cmx0,5cmx0,3cm) mit entkalkter Knochenmatrix (decalcified bone matrix, DBM), Einlegen in eine 6-Poren-Platte, Einweichen von diesem für 48 Stunden im DMEM-Kultursubstrat, Einstellen des pH-Werts auf etwa 7,2; Nehmen der zweiten Generation von MSCs in der exponentiellen
Wachstumsphase, Waschen dieser mit PBS für zwei Male und anschließendes Inkubieren für eine Stunde unter Verwendung von 0,1% Kollagenenzym vom Typ I (Col D, anschließendes Zugeben von 0,25% Pankreatin und 0,02% EDTA und Verdauen für 3-5 Minuten, Waschen im DMEM-Kultursubstrat und Resuspendieren, und Mischen mit den Osteoklastenvorläufern mit einem Verhältnis von 10:1 und Durchführen einer Resuspension. Beimpfen der Zellen auf das Gerüstmaterial mit entkalkter Knochenmatrix nach der oben genannten Behandlung, so dass die Zellsuspension nur das Gerüstmaterial infiltriert und das Gerüstmaterial nicht überläuft. In 3 Stunden wird unter aseptischen Betriebsbedingungen die Unterseite des Gerüstmaterials mit entkalkter Knochenmatrix zur Oberseite umgedreht, und die Zellsuspension wird mit dem oben geschilderten Verfahren beimpft, die Gesamtanzahl der implantierten Zellen beträgt etwa 10°. In 3 Stunden wird das DMEM-Kultursubstrat hinzugefügt, bis die Oberseite des Gerüstmaterials mit entkalkter Knochenmatrix nur knapp eingetaucht ist, anschlieBendes Kultivieren bei 37°C und 5% CO». In 24 Stunden wird eine Induktionskultivierung zur osteogenen Differenzierung in vitro für 12- 14 Tage durchgeführt. Das osteogene Induktionsmedium ist: DMEM(H) + 10% FBS+10mmol/L B-Glyceronatriumphosphat+0,1 umol/L Dexamethason + 50 mg/L VitC. Die rasterelektronenmikroskopischen Beobachtungen können zeigen, dass die Zellen erfolgreich auf das zusammengesetzte Gerüstmaterial aus Hydroxylapatit und Kollagen implantiert werden. AnschlieBendes Einfrieren bei - 70°C bis -80°C für 48-72 Stunden, Gefriertrocknen für 24-30 Stunden und Kryokonservierung für 3 Monate, um die Immunogenität signifikant zu reduzieren, auf die Weise wird ein matrixabhängiger Gewebe-Engineering- Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen gebildet.
Ausführungsbeispiel 2 Detektion der Biokompatibilität eines matrixabhängigen Gewebe-Engineering-Knochens mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen
1. Detektion der gemischten Lymphozytenkulturreaktion Mixed lymphocyte reaction, MLR) Erhalten von BALB/c-Milzlymphozyten von Mäusen, Vorbehandeln für 3 Stunden mit 50g/L Mitomycin C und Resuspendieren in RPMI 1640- Kultursubstrat als Stimulatorzellen. Sammeln von C57BL/6 Milzlymphozyten und
Inkubieren mit 0,5 uM CFSE bei 37°C für 15 Minuten, um sie als reaktive Zellen zu markieren. Die beiden werden mit einem Verhältnis von 1:1 in eine 96-Poren- Platte für die Co-Kultur implantiert, 5x10° Zellen/Pore, Resuspendieren in RPMI 1640-Kultursubstrat, dann wird Folgendes zu dem System zugegeben: (1) nur BALB/c-Monozyten werden als negative Kontrollgruppe verwendet; 2) die positive Kontrollgruppe der BALB/c-Milzlymphozyten von Mäusen wird mit Phytohämagglutinin (PHA) behandelt; (3) ein Gewebe-Engineering-Knochen mit MSC als Keimzellen (unter Verwendung von MSC als Keimzellen, die auf das Gerüstmaterial implantiert und dann in 96 Poren für 14 Tage osteogen induziert werden, ohne Gefriertrocknung); (4) ein Gewebe-Engineering-Knochen, der mit den Osteoklastenvorläufern und den mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen gebildet ist (unter Verwendung von POC und MSC als Keimzellen, die auf das Gerüstmaterial implantiert und dann in 96 Poren für 14 Tage osteogen induziert werden, ohne Gefriertrocknung);(5) ein matrixabhängiger Gewebe-Engineering- Knochen nur mit MSC als Keimzellen (über Nacht gefriergetrocknet); (6) ein matrixabhängiger Gewebe-Engineering-Knochens mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen (über Nacht gefriergetrocknet). Nach dem Kultivieren von 5 Tagen wird CCK-8-Reagenz zugegeben. In 4 Stunden wird die Vermehrungsfähigkeit von mononukleären Zellen des peripheren Blutes mit einem Mikroplattenleser bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen. Figur 2 zeigt ein Detektionsergebnis einer gemischten Lymphozytenkulturreaktion (MLR), wie in Figur 2 dargestellt, betragen die Vermehrungsraten der 6 Gruppen jeweils 2,23+0,27, 0,96+0,13, 0,89+0,11, 1,53+0,21, 0,41+0,06 und 0,52+0,07. Statistiken zeigen, dass ein gefriergetrockneter matrixabhängiger Gewebe-Engineering-Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen einen signifikanten Unterschied bezüglich des Stimulationsindexes von mononukleären Zellen des peripheren Blutes im Vergleich zur nicht gefriergetrockneten Zellgruppe aufweist (P<0,05), aber keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zum matrixabhängigen Gewebe-Engineering-Knochen nur mit MSC als Keimzellen. Das zeigt an, dass der durch die vorliegende Erfindung konstruierte Gewebe-Engineering-Knochen eine geringe Immunogenität aufweist.
2. MHC-I- und MHC-II-Fluoreszenzdetektion
In diesem Experiment wird die Expression von Klasse-I- und Klasse-II- Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (major histocompability complex, MHC) eines matrixabhängigen Gewebe-Engineering-Knochens mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen erforscht. Die Expression von MHCI und MHCI wurde durch Immunfluoreszenz-Histochemietechnik detektiert. Figur 3 zeigt die Expressionsergebnisse von MHC-I und MHC-II. Die Ergebnissen zeigen, dass ein gefriergetrockneter matrixabhängiger Gewebe-Engineering-Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen einen signifikanten Unterschied bezüglich der MHC I- und MHC II-Expression im Vergleich zur nicht gefriergetrockneten Zellgruppe aufweist (P<0,05), aber keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zum matrixabhängigen Gewebe- Engineering-Knochen nur mit MSC als Keimzellen. Das zeigt an, dass der durch die vorliegende Erfindung konstruierte Gewebe-Engineering-Knochen eine geringe Immunogenität aufweist.
Ausführungsbeispiel 3 Erkennung der In-vitro-Migration, Reparatur und osteogenen Differenzierung eines matrixabhängigen Gewebe-Engineering- Knochens mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen
1. In-vitro-Migrationsexperiment: eine 24-Poren-Platte wird für das Zellmigrationsexperiment verwendet. Knochenmark-MSCs werden in die obere Kammer des Transwell-Kultursystems mit 10° Zellen/mL von 500 uL implantiert, und die untere Kammer ist ein mit der vorliegenden Erfindung konstruierter matrixabhängiger Gewebe-Engineering-Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen (MSC+POC-Gruppe), und ein matrixabhängiger Gewebe-Engineering-Knochen nur mit MSC als Keimzellen wird als Kontrolle verwendet (MSC-Gruppe) verwendet. In 24 Stunden werden die Zellen, die zur Unterseite der Filtermembran wanderten, mit 4% Paraformaldehyd fixiert und mit DAPI gefärbt. Die Ergebnisse sind in Figur 4 dargestellt, die Anzahl der Zellmigrationen in der MSC+POC-Gruppe beträgt 144,37+12,83, die Anzahl in der MSC-Gruppe beträgt 76,42+8,54, dabei ist die Anzahl in der MSC+POC-Gruppe signifikant höher als die in der MSC-Gruppe (P<0,01).
2. In-vitro-Kratzreparaturexperiment: Beimpfen der Endothelzellen (10° Zellen/Pore) auf eine 6-Poren-Platte, und weiteres Inkubieren bei 37°C, wenn die Zellen eine Wachstumsdichte von 90% erreichen, wird die Oberfläche der Zellen mit einer 200-ul-Pipettenspitze gekratzt und abgewischt, abschließendes Waschen der Zellen mit PBS, um Splitter zu entfernen. Jeweiliges Verwenden eines mit der vorliegenden Erfindung konstruierten matrixabhängigen Gewebe-Engineering- Knochens mit den Osteoklastenvorläufern und den mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen (MSC+POC-Gruppe) und eines matrixabhängigen Gewebe- Engineering-Knochens nur mit MSC als Keimzellen (MSC-Gruppe), die beiden Proteinextrakte und das Kultursubstrat, das 2% Serum enthält, werden im Verhältnis von 1: 1 gemischt, um die Kultur fortzusetzen. Beobachten der Veränderungen im verkratzten Bereich, Beobachten mit einem Mikroskop bei t=0 und 12 Stunden und Messen der Größe des verkratzten Bereichs mit Image J. Kratzheilungsrate (%) = (A0-A12)/A0 x 100%, wobei AO für den anfänglichen gekratzten Bereich (t = 0 Stunde) und A12 für den endgültigen gekratzten Bereich bei t = 12 Stunden steht. Figur 5 zeigt die Ergebnisse eines MSC-In-vitro- Kratzreparaturexperiments und In-vitro-Osteogen-Differenzierungsexperiments durch einen Proteinextrakt aus einem matrixabhängigen Gewebe-Engineering- Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen, Wie in Figur 5 dargestellt, beträgt der Anteil der Gewebereparatur in der MSC+POC-Gruppe etwa 92% und in der MSC-Gruppe etwa 78%. Die MSC+POC-Gruppe ist signifikant besser als die MSC-Gruppe (P<0,01).
3. Osteogenes In-vitro-Differenzierungsexperiment: Nehmen der zweiten Generation von Knochenmark-MSCs, wenn sie eine Wachstumsdichte von 80% bis 90% erreichen, werden sie mit Pankreatin für 5 Minuten verdaut, Zentrifugieren für 3 Minuten bei 1000 U/min, Herstellen der Zellsuspensionen mit F12-Kultursubstrat, Beimpfen in eine 24-Poren-Platte mit 2x10°/Pore, jeweiliges Verwenden eines mit der vorliegenden Erfindung konstruierten matrixabhängigen Gewebe-Engineering-Knochens mit den Osteoklastenvorläufern und den mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen (MSC+POC-Gruppe) und eines matrixabhängigen Gewebe-Engineering-Knochens nur mit MSC als Keimzellen (MSC-Gruppe), die beiden Proteinextrakte und das Kultursubstrat, das 10% Serum enthält, werden im Verhältnis von 1:1 gemischt, um die Kultur fortzusetzen, in 21 Tagen werden eine Alizarinrot-Färbung und eine ALP-Färbung durchgeführt, und die Bildung von Calciumknollen wird mit einem Umkehrmikroskop beobachtet und grob fotografiert. Die Ergebnisse sind in Figur 6 dargestellt. Mit der Alizarinrot-Färbung wird die osteogene Differenzierungsfähigkeit von zwei Sorten von matrixabhängigem Gewebe- Engineering-Knochen bewertet. Das Mineralisierungsverhältnis der MSC-Gruppe beträgt etwa 40% und das Mineralisierungsverhältnis der MSC+POC-Gruppe beträgt etwa 48%, dabei bestehen offensichtliche Unterschiede. Mit der ALP- Färbung wird die osteogene Differenzierungsfähigkeit von zwei Sorten von matrixabhängigem Gewebe-Engineering-Knochen bewertet. Das Mineralisierungsverhältnis der MSC-Gruppe beträgt etwa 32% und das Mineralisierungsverhältnis der MSC+POC-Gruppe beträgt etwa 39%, dabei bestehen offensichtliche Unterschiede.
Ausführungsbeispiel 4 Verwenden eines matrixabhängigen Gewebe- Engineering-Knochens mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen zur Reparatur von Knochendefekten Tiermodellvorbereitung und experimentelle Gruppierung: Nehmen gesunder SD-Ratten, die 2 Monate alt sind, mit einem Körpergewicht von (200+20)g. Nach der Anästhesie werden die bilateralen Femurkondylen unter aseptischen Bedingungen exponiert und mit einem Zahnbohrer wird ein Knochendefekt mit einem Durchmesser von 3 mm hergestellt. Die Ratten erhalten jeweils die folgenden 3 Gruppen von Implantaten zur Reparatur von Knochendefekten: (1) Blindkontrollgruppe: nur bei dem Defekt wird die Debridement-Behandlung durchgeführt; (2) Kontrollgruppe: ein matrixabhängiger Gewebe-Engineering- Knochen nur mit MSC als Keimzellen; (3) Experimentgruppe: ein matrixabhängiger Gewebe-Engineering-Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen gemäß der vorliegenden Erfindung. Wiederholtes Zugeben von Wasserstoffperoxid, lodophor und physiologischer Kochsalzlösung, um den Defekt zu waschen und in Schichten zu nähen, und die Versuchstiere werden nach dem Aufwachen in Käfigen gezüchtet und mit Penicillin-Streptomycin injiziert, um eine Infektion zu verhindern. Zwei Monate nach der Operation wird Mikro-CT durchgeführt, in Übereinstimmung mit der Knochenvolumenfraktion (BV/TV), der Knochentrabekeldicke (Tb.Th), der Anzahl der Knochentrabekel (Tb.N) und der Trabekelknochentrennung (Tb.Sp) wird die Reparatur von Knochendefekten bewertet. Zur histologischen
Beobachtung wird eine Masson-Färbung durchgeführt, um die Bildung von neuem Knochen an der Defektstelle zu bewerten. Figur 7 zeigt die Ergebnisse der Mikro-CT-Untersuchung 2 Monate nach der Implantation, die Ergebnisse zeigen, dass 2 Monate nach der Operation die Defektreparatur in der Experimentgruppe im Wesentlichen abgeschlossen ist und in der Kontrollgruppe eine etwas neue Knochenbildung besteht und jedoch keine vollständige Knochenstruktur an der Defektstelle gesehen wird, wobei fast keine neue Knochenbildung in der Blindkontrollgruppe besteht. In Bezug auf die Knochenvolumenfraktion (BV/TV) und die Knochentrabekelzahl (Tb.N) ist die Experimentgruppe signifikant besser als die beiden anderen Gruppen. Figur 8 zeigt die Ergebnisse der Masson-Färbung 2 Monate nach der Implantation, die Masson-Färbung der Experimentgruppe zeigt eine große Menge an neuem Knochengewebe 2 Monate nach der Operation, die trabekuläre Knochenstruktur kann gesehen werden, und relativ viele Osteoblasten und Chondrozyten können partiell gesehen werden. In der Kontrollgruppe besteht eine kleine Menge an Lamellenknochentrabekelstruktur, eine kleine Menge an Osteoblasten und Chondrozyten besteht. In der Blindkontrollgruppe kommt die fibröse Gewebestruktur häufiger vor und kein offensichtlicher neuer Knochen wird gesehen.
Schließlich wird es hingewiesen, dass die obigen bevorzugten Ausführungsbeispiele dazu verwendet werden, die technische Lösung der vorliegenden Erfindung zu erläutern, statt sie zu beschränken, obwohl im Zusammenhang mit den obigen bevorzugten Ausführungsbeispielen die vorliegende Erfindung näher erläutert werden, soll der Fachmann auf diesem Gebiet verstehen, dass verschiedene Änderungen in Hinsicht auf die Form und Details ausgeführt werden können, ohne von dem durch die Ansprüche der vorliegenden Erfindung definierten Umfang abzuweichen.
Claims (8)
1. Konstruktionsverfahren für einen matrixabhängigen Gewebe-Engineering- Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen, dadurch gekennzeichnet, dass die mesenchymalen Stammzellen und die Osteoklastenvorläufer mit einem Verhältnis von 10:1 an einem porösen Knochengerüstmaterial implantiert werden, um einen Gewebe-Engineering- Komplex zu konstruieren, wobei dann ein osteogenes Induktionskulturmedium in vitro hinzugefügt wird, weiteres Kultivieren für 12-14 Tage, Einfrieren für 48-72 Stunden bei -70°C bis -80°C, Gefriertrocknen für 24-30 Stunden, um einen matrixabhängigen Gewebe-Engineering-Knochen zu erhalten.
2. Konstruktionsverfahren für einen matrixabhängigen Gewebe-Engineering- Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die mesenchymalen Stammzellen mesenchymale Knochenmarkstammzellen, mesenchymale Stammzellen des peripheren Blutes, mesenchymale Stammzellen des Nabelschnurbluts, mesenchymale Fettstammzellen oder mesenchymale Stammzellen der Nabelschnur sind.
3. Konstruktionsverfahren für einen matrixabhängigen Gewebe-Engineering- Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mesenchymalen Stammzellen mesenchymale Stammzellen der Nabelschnur sind.
4. Konstruktionsverfahren für einen matrixabhängigen Gewebe-Engineering- Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das poröse Knochengerüstmaterial eine dezellularisierte Knochenmatrix oder eine entkalkte Knochenmatrix ist.
5. Konstruktionsverfahren für einen matrixabhängigen Gewebe-Engineering- Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als
Keimzellen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das poröse Knochengerüstmaterial eine entkalkte Knochenmatrix ist.
6. Konstruktionsverfahren für einen matrixabhängigen Gewebe-Engineering- Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Gerüstmaterial mit entkalkter Knochenmatrix genommen wird, Einweichen von diesem für 48 Stunden im DMEM-Kultursubstrat, Einstellen des pH-Werts auf 7,2; Nehmen der zweiten Generation mesenchymaler Stammzellen in der exponentiellen Wachstumsphase, Waschen dieser mit PBS und Inkubieren für eine Stunde unter Verwendung von 0,1 Gew.-% Kollagenenzymlösung vom Typ I, anschlieBendes Zugeben von 0,25 Gew.-% Pankreatin und 0,02 Gew.-% EDTA und Verdauen für 3-5 Minuten, Waschen im DMEM-Kultursubstrat, das 10 Gew.- % fötales Kälberserum enthält, und Resuspendieren, und Mischen mit den Osteoklastenvorläufern mit einem Verhältnis von 10:1 und Durchführen einer Resuspension, Beimpfen der Zellen auf das Gerüstmaterial mit entkalkter Knochenmatrix nach der oben genannten Behandlung, so dass die Zellsuspension nur das Gerüstmaterial infiltriert und das Gerüstmaterial nicht überläuft; und wobei in 3 Stunden die Unterseite des Gerüstmaterials mit entkalkter Knochenmatrix unter aseptischen Betriebsbedingungen zur Oberseite umgedreht wird, und wobei die Zellsuspension mit dem oben geschilderten Verfahren beimpft wird; und wobei das Zellgerüst eine reguläre Größe von 0,5 cm x 0,5 cm x 0,3 cm hat und die Gesamtanzahl der implantierten Zellen etwa 10° beträgt, und wobei in 3 Stunden das DMEM-Kultursubstrat hinzugefügt wird, bis die Oberseite des Gerüstmaterials mit entkalkter Knochenmatrix nur knapp eingetaucht ist, anschlieBendes Kultivieren bei 37°C und 5% CO»; Durchführen einer Induktionskultivierung zur osteogenen Differenzierung in 24 Stunden in vitro für 12-14 Tage, Einfrieren bei -70°C bis -80°C für 48-72 Stunden, Gefriertrocknen für 24-30 Stunden und Kryokonservierung für 3 Monate, um die Immunogenität signifikant zu reduzieren, wodurch ein matrixabhängiger Gewebe- Engineering-Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen gebildet wird.
7. Konstruktionsverfahren für einen matrixabhängigen Gewebe-Engineering- Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Osteoklastenvorläufer aus Knochenmarkmonozyten stammen, die für 24 Stunden durch 100 ng/mL RANKL und 50 ng/mL M-CSF in Osteoklastenrichtung differenziert werden.
8. Matrixabhängiger Gewebe-Engineering-Knochen mit Osteoklastenvorläufern und mesenchymalen Stammzellen als Keimzellen, der mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 konstruiert ist.
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