DE69333258T2

DE69333258T2 - Verwendung von lysozymdimer zur herstellung eines arzneimittels zur modulation der natürlichen abwehrvorgänge

Info

Publication number: DE69333258T2
Application number: DE69333258T
Authority: DE
Inventors: Witold Kiczka
Original assignee: Nika Health Products Ltd
Current assignee: NIKA HEALTH PRODUCTS SPOLKA Z.O.O., KATY WROCL, PL
Priority date: 1992-07-13
Filing date: 1993-07-13
Publication date: 2004-08-26
Anticipated expiration: 2013-07-14
Also published as: CZ286725B6; SG52727A1; GR950300039T1; HU218151B; CN1057937C; CN1087278A; AU677786B2; PL173978B1; ES2074037T3; CZ8595A3; HU9500098D0; DK0651654T3; SK282377B6; NZ299377A; TW259710B; SK4095A3; PT651654E; FI950144A0; ZA935046B; NZ254135A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue medizinische Einsatzzwecke von Lysozymdimer und von dieses Dimer enthaltenden Zusammensetzungen. Die neuen Einsatzzwecke betreffen die Behandlung bestimmter Funktionsstörungen von natürlichen Abwehrmechanismen.
Enzyme in ihren monomeren Formen sind bereits seit langer Zeit als bei der Behandlung verschiedenster Krankheiten therapeutisch wirksam bekannt.
Lysozym wurde von Fleming 1922 entdeckt, doch wurden erst 1950 seine enzymatischen Funktionen aufgezeigt. Seit dieser Zeit war die Verbindung Gegenstand intensiver Forschung und es wurde über verschiedene therapeutische Wirkungen berichtet. Es handelte sich hierbei unter anderem um antivirale, antibakterielle, entzündungshemmende und Antihistaminikaeigenschaften. Der therapeutische Einsatz von Lysozym war jedoch aufgrund der negativen Nebenwirkungen der monomeren Form ziemlich eingeschränkt.
Diese Einschränkung des Einsatzes von Lysozym und anderen therapeutisch aktiven Enzymen in der Praxis wurde in den ausgehenden achtziger Jahren überwunden, als entdeckt wurde, daß isolierte dimere Formen von Enzymen unter Erhalt aller vorteilhaften Eigenschaften der bekannten monomeren Formen bei Verwendung in therapeutischen Dosierungen keine negativen Nebeneffekte zeigen. Die als aktiven Bestandteil Lysozymdimer oder andere dimerisierte Enzyme enthaltenden antiviralen und antibakteriellen Zusammensetzungen sind in WO 89/11294 beschrieben. In dieser Anmeldung wurde berichtet, daß das Lysozymdimer in in-vitro-Tests die Proliferation einer Anzahl von Bakterienstämmen, die auf Patienten entnommenen Proben kultiviert wurden, in Konzentrationen von 5–20 mg/ml der Kultur hemmte. Es wurde dort auch berichtet, daß das Dimer bei der Behandlung von Infektionen mit dem Hundeparvovirus (CPV) bei zweimal täglicher oraler Verabreichung mit einer Dosis von 1–2 mg/kg Körpergewicht wirksam war.
Im Zuge der Fortsetzung der Forschungsarbeit durch den Erfinder wurden weitere attraktive Eigenschaften der Lysozymdimere ermittelt und neue therapeutische Einsatzzwecke des Wirkstoffs entwickelt.
Bei zur Bestätigung der antibakteriellen und antiviralen Wirksamkeit von Lysozymdimer durchgeführten klinischen Tests zeigte sich überraschenderweise, daß das Dimer bei der Heilung akuter Formen von Krankheiten des Verdauungs- und Atmungstrakts unerwartet stark wirksam ist. Dementsprechend wurden neue Untersuchungen durchgeführt, um die Wirkung von Lysozymdimer in solchen Stadien unterschiedlicher Krankheiten, in denen die natürlichen Abwehrmechanismen versagen, zu bestimmen.
Bekanntlich stellen Bakterientoxine eine Gruppe von vielen Virulenzfaktoren, durch die Bakterien Krankheiten verursachen, dar. Einige neuere Fortschritte im Wissen über Bakterientoxine betreffen deren Wechselwirkung mit dem Immunsystem des Wirts. Diese Wechselwirkung führt erstens zu einer Immunmodulation und zweitens zur Freisetzung von Cytokinen und anderen Mediatoren, die für viele durch die Toxine verursachten physiologischen Störungen verantwortlich sind. Letztere Wirkung wurde insbesondere im Hinblick auf die Wirkungen von Endotoxin, das bei der Pathogenese einer gramnegativen Sepsis eine wichtige Rolle spielt, untersucht (vgl. D. F. Bayston, J. Cohen: Backterial endotoxins and current concepts in the diagnosis and retreatment of endotoxaemia, J. Med. Microbiol. 1990, 31: 73–83). Obwohl bereits seit langem bekannt ist, daß Exotoxine bei durch Staphylococcus aureus und Streptococcus pyogenes verursachten Infektionen eine Rolle spielen, führte erst das Erkennen des durch Staphylokokken verursachten toxischen Schocksyndroms zum gesteigerten Interesse an den durch diese Organismen erzeugten Exotoxinen.
Toxischer Schock stellt eine durch hohes Fieber, Hypotonie, Kapillarblutungen, diffuse Erythrodermie, Schleimhauterythem, Nierenversagen, Hypokalziämie, Hypoalbuminämie und Exfoliation eines roten Hautauschlags charakterisierte schwere Erkrankung dar. Viele Fälle eines toxischen Schocksyndroms wurden mit der Verwendung von Scheidentampons während der Menstruation in Zusammenhang gebracht, doch wird das Syndrom in zunehmendem Maße bei nichtmenstruellen Gegebenheiten bei beiden Geschlechtern beschrieben, häufig nach chirurgischen Eingriffen, wenn das Tamponagematerial am Ort verbleibt (beispielsweise die Nasentamponage nach einer Rhinoplastik oder schwerem Nasenbluten). Es ist erwiesen, daß die aus der Vagina von Patienten mit toxischem Schocksyndrom (TSS) isolierten Staphylococcus-Stämme das Toxin 1 des toxischen Schocksyndroms (TSST-1) erzeugen, doch kann auch eine unerkannte Infektion die Quelle der TSST-1 erzeugenden Mikroorganismen sein. Die ursprüngliche Bakteriämie mag unscheinbar sein, jedoch Wochen oder Monate später kann sie zur Entwicklung lokaler Infektionen führen. Gleichzeitig mit dem Erscheinen derartiger Infektionen können Anzeichen für ein Sepsissyndrom oder einen septischen Schock auftreten. Eine seltenere, jedoch dramatischere Bakteriämie kann bei Abwesenheit jeglicher Eingangspforte oder assoziierter lokaler Infektionen auftreten. In diesen Situationen können Schock, Endokarditis, disseminative intravaskuläre Koagulopathie und Mehrfachorganversagen vorherrschend sein (vgl. D. L. Stevens et al.: Gram-positive shock; Current Opinions in Infectious Diseases 1992, 5: 355–363).
Aus ähnlichen Beobachtungen ist bekannt, dass auch andere grampositive Bakterien beteiligt sind. Beispielsweise ist eine Infektion mit Streptococcus pyogenes mit Schock verbunden, wobei eine Sterblichkeitsrate von 30% besteht. Streptococcus pneumoniae ist eine Ursache von Pneumonie, die als hochgradig resistent gegenüber Penicillin mit Tendenz zur Entwicklung eines Schocksyndroms beschrieben ist. Darüber hinaus treten bei Patienten mit AIDS Pneumokokkeninfektionen häufiger auf als bei der Bevölkerung insgesamt. Infektionen mit gramnegativen Bakterien können ebenfalls zu Sepsis und septischem Schock führen. Gramnegative Bazillen und Vibrionen stellen die Quelle für die wichtigsten Enterotoxine dar. Enterotoxin ist ein Lipopolysaccharid (LPS)-Bestandteil der äußeren Membran der Zellwände gramnegativer Bakterien. Enterotoxine wirken primär auf den Verdauungstrakt und verursachen gewöhnlich Diarrhöe. Die häufigsten Infektionen mit gramnegativen Bakterien bei Tieren und Menschen sind Infektionen mit Escherichia coli. Die mit derartigen Infektionen einhergehende beträchtliche Dehydratation kann zum Tod des infizierten Individuums führen. Laut WHO sterben in den Entwicklungsländern jedes Jahr etwa 3,2 Millionen Kinder an akuter Diarrhöe. Etwa 30 aller Fälle von Sepsis werden durch gramnegative Bakterien verursacht.
Sepsis aufgrund von Infektionen mit grampositiven und gramnegativen Bakterien ist in allen Ländern gleichermassen immer ein ernster Zustand. In den Vereinigten Staaten gibt es pro Jahr etwa 400 000 Fälle mit einer Sterblichkeitsrate von etwa 50%.
In den letzten Jahren waren Sepsis und septischer Schock Gegenstand vieler Veröffentlichungen. Es wurde beobachtet, daß bei der Pathophysiologie von septischem Schock, Endotoxämie und anderen bakteriellen Intoxikationen Mediatoren die Hauptrolle spielen. Diese schliessen den Tumornekrosefaktor (TNF), Interleukin-1 (IL-1), Interferon (IFN), den Plättchenaktivierungsfaktor und Eicosanoide (Derivate der Arachidonsäure) ein; der bedeutendste hiervon ist TNF, der sowohl auf den Stoffwechsel als auch auf das Immun- und das Phagocytensystem wirkt (vgl. F. E. Berkowitz: Bacterial toxins in pathogenesis of infections; Current Opinions in Infectious Diseases, 1991, 4: 332–337). Es wurde nachgewiesen, daß Personen, die einen septischen Schock nicht überlebten, höhere Konzentrationen an TNF und Interleukin-1 aufwiesen. Viele Autoren berichteten über erhöhte Spiegel von TNF-α in Plasma und Blut von Patienten mit septischem Schock. Es wird auch darauf hingewiesen, daß die toxische Wirkung von TNF-α möglicherweise nicht so sehr von den TNF-Konzentrationen als vom Verbleib im Körper abhängt.
Viele Autoren untersuchten die Möglichkeit einer Modulation der Cytokin-Kaskade bei Sepsis und septischem Schock. Bei den bekannten erfolgreichen Vorschlägen wurden monoklonale Anti-TNF-Antikörper eingesetzt bzw. Lipopolysaccharid mit Antilipopolysaccharid neutralisiert. Die Antikörper führen jedoch nicht zu einer verstärkten Beseitigung der Bakterien. Teilweise günstige Wirkungen wurden auch beim Einsatz von Mitteln wie Dexamethason und Pentoxiphyllin, die die TNF-Produktion durch Makrophagen blockieren, beobachtet.
Es ist ferner bekannt, daß auch andere Cytokine zu septischem Schock beitragen. In diesem Falle bieten Behandlungen, welche die Cytokin-Kaskade bei septischem Schock modulierenden, die Möglichkeit, in die Infektionseindämmung einzugreifen, da die Wirtsabwehr von diesen die Entzündung bewirkenden Cytokinen abhängt. Das Herausfinden von Maßnahmen zur Verhinderung von septischem Schock ist wegen des möglichen Nutzens für eine große Zahl von Patienten von höchster Priorität. Für diesen Zweck scheint das Steuern des TNF-Spiegels wesentlich zu sein.
Ähnlich entscheidend ist die Rolle von TNF bei einem anderen Abwehrmechanismus, nämlich Fieber, das eine für praktisch alle höheren Lebewesen und den Menschen typische physiologi sche Antwort auf eine Infektion darstellt. Als die wichtigsten endogenen Mediatoren für die Fieberreaktion werden momentan fünf pyrogene Cytokine angesehen (Interleukin-1, TNF, Interferon, Interleukin-2 und Interleukin-6), die präoptische wärmeempfindliche Neuronen hemmen, die normalerweise die Wärmeabgabe erleichtern und die Wärmeentwicklung im menschlichen Organismus drosseln. Fieber und dessen Mediatoren können sowohl den eindringenden Organismus als auch den Wirt schädigen. In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von Daten gesammelt, die nahelegen, daß Interleukin-1, TNF und Interleukin-6 die pathophysiologischen Abnormalitäten von Infektionen vermitteln. Da endogene Pyrogene zum pathologischen Prozeß verschiedener Infektionen beitragen, wirken sowohl die Mediatoren als auch die Fieberreaktion auf den Wirt möglicherweise negativ. Der überzeugendste Beweis hierfür ergibt sich aus den Untersuchungen von gramnegativer Sepsis. Es wurde auch nachgewiesen, daß endogene Pyrogene systemische und lokale Manifestationen von Sepsis aufgrund grampositiver Bakterien, von AIDS, Spirochaeteninfektionen, Meningitis, des Atemnotsyndroms des Erwachsenen, von suppurativer Arthritis und Mykobakteriose vermitteln. Die angegebenen Daten stehen zwar im Gegensatz zu der Beobachtung, daß die Fieberreaktion selbst die Widerstandsfähigkeit gegenüber einer Infektion bei Versuchstieren erhöht, doch liegt das Wesen des evolutionären Prozesses eher im Erhalt der Art als im Überleben des Individuums. Es ist denkbar, dass die – in Bezug auf das Resultat überbordender Infektionen – schädlichen systemischen Wirkungen pyrogener Cytokine (beispielsweise gramnegative Sepsis), bei weniger fulminanten Infektionen als vorteilhafte lokale Wirkungen in Form von Fieber angepasst sind. Daher erfolgt in der Natur durch das Beschleunigen des Sterbens hoffnungslos infizierter Individuen das Abtöten der für die Art gefährlichen Individuen. Auf diese Weise kann die Art als Ganzes vor epidemisch verlaufenden Krankheiten geschützt werden (vgl. P. A. Mackowiak: Mechanism of Fever; Current Opinions in Infectious Diseases, 1992, 5: 348–354).
Ein fundamentales Konzept der Pathogene für Fieber besteht darin, daß exogene Pyrogene ungeachtet ihrer Herkunft oder Struktur Fieber verursachen, indem sie Wirtszellen (primär Makrophagen) dazu veranlassen, endogene Pyrogene zu erzeugen. Dementsprechend können auf dem Einsatz von Antikörpern gegen endogenes Pyrogen und von Antagonisten für Rezeptoren von endogenem Pyrogen beruhende Therapiemethoden wirksam sein. Eine der Möglichkeiten besteht in der Blockade der Biosynthese von TNF. Untersuchungen bei Tieren zeigen, daß TNF in der Infektionsreaktionskaskade vor IL-1 und anderen Cytokinen erzeugt werden kann. Laut vieler Wissenschaftler bedeutet die Hemmung der Biosynthese von TNF auch das Stoppen der Biosynthese von IL-1. Die Hemmung der Biosynthese von TNF bedeutet jedoch auch das Beenden der schädlichen Wirkungen einiger fulminanter und hoffnungsloser Infektionen.
Bekanntlich ist TNF auch einer der Mediatoren von Entzündungsprozessen. Eine Entzündung ist in vielen Fällen das erste Stadium einer Erkrankung, in deren natürlichem Verlauf sich ein septischer Schock entwickelt. Im Falle, daß der durchgängige Verlauf von Geweben unterbrochen ist, beispielsweise in infektionsgefährdeten Wunden, kriegsähnlichen Wunden, insbesondere Bauchwunden (Peritonitis), Erkrankungen im Gastrointestinaltrakt, wie eine Appendizitis begleitenden akuten Infektionen, akuten bakteriellen und viralen Infektionen, wie bei Pneumonie nach einer Influenza, neoplasmischen Erkrankungen, insbesondere in der Phase des Abbaus von Tumoren und dergleichen, ist eine Entzündung das erste Symptom. der Steigerung der TNF-Produktion. Das Steuern des TNF-Spiegels wäre daher eine wünschenswerte Behandlungsform derartiger Infektionen.
Noch wichtiger ist die Rolle von TNF bei AIDS selbst. AIDS läßt sich durch eine tiefgreifende Abwehrschwäche charakterisieren. Kennzeichen von AIDS ist eine verringerte Zahl von CD4+ Lymphocyten. Die Zahl der mit HIV, dem ätiologischen Agens von AIDS, infizierten Zellen ist selbst in den mononukleären Zellen von peripherem Blut (PBMC) von AIDS-Patienten relativ klein (< 1 in 100–1000). Während zwar bevorzugt CD4+ Lymphocyten infiziert werden, sind diese Zellen aber nicht das ausschließliche Ziel einer HIV-Infektion. In letzter Zeit wurde deutlich, daß das Spektrum der HIV-Zielzellen ganz breit sein kann. Es wurden deutliche Unterschiede beim Auftreten einer HIV-Infektion in Monocyten/Makrophagen gegenüber T-Lymphocyten beobachtet. Die T-Lymphozyten werden eher zerstört, während die Monocyten/Makrophagen ein Fortbestehen der Infektion erlauben. HIV kann daher durch Monocyten/Makrophagen sowie andere Zellen im Körper als Reservoir erhalten bleiben. Die Antwort auf eine HIV-Infektion vom Typ der Monocyten/Makrophagen könnte für die nachgewiesene Latenz im Wirt verantwortlich sein; diese Antwort kann auch aus von den infizierten Zellen erzeugten löslichen Faktoren sich ergebende pathogene Folgen verursachen (vgl. Toshifumi Matsuyama et al.: Cytokines and HIV infection: Is AIDS a Tumor Necrosis Factor disease?; AIDS 1991, 5: 1405–1417). Viele Wissenschaftler berichteten, daß mit HTLV-1 infizierte menschliche T-Zellinien für eine HIV-Infektion hochempfänglich sind und im Zusammenhang mit einer verstärkten Replikation von HIV eine dramatische cytopathische Wirkung zeigen. Darüberhinaus sind mit HIV infizierte Zellen einer Schädigung durch den Überstand dieser Zellen zugänglich. Ein Test des Virustiters nach der Behandlung mit diesem Überstand ergab, daß der durch T-Zellen (MT-2) erzeugte Faktor die Replikation von HIV verstärkte. Der Faktor wurde als TNF-β identifiziert. Diese Erkenntnis ist mit Berichten, daß T-Zellen (MT-2) TNF-β erzeugen, konsistent. Der gleiche Effekt wurde bei Verwendung von TNF-α beobachtet. TNF-α und TNF-β töteten selektiv HIV-infizierte Zellen ab und verstärkten die Replikation von HIV.
Ferner wurde berichtet, daß HIV-infizierte T-Zellinien und aus HIV-infizierten Individuen frisch isolierte PBMC auf TNF reagierten, was zu erhöhten Konzentrationen führte. Dies legt nahe, daß die gleiche Verstärkung der HIV-Expression wahrscheinlich in vivo erfolgt. Tatsächlich konnte die verstärkende Aktivität von TNF durch Anti-TNF-Antikörper neutralisiert werden. Die Verstärkung der HIV-Replikation nach einer Behandlung mit TNF-α und TNF-β beträgt das bis zu Zehnfache (vgl. A. Yakarnam et al.: Tumor necrosis factors (α, β) induced by HIV-1 in peripheral blood monocellular cells potentate virus replication; AIDS 1990, 421–427).
Es wurde ferner bestätigt, daß verschiedene Cytokine die HIV-Produktion beeinflussen können. Bei der Anwendung gereinigter mononukleärer Phagocyten aus normalem peripherem Blut wurde innerhalb weniger Stunden nach der Exposition mit dem HIV-Virus sowohl eine IL-6- als auch eine TNF-α-Induktion beobachtet. Diese Cytokin-Induktion wurde auch bei Verwendung von hitzeinaktiviertem HIV beobachtet. Auf der Grundlage vieler Beobachtungen sind Toshifumi Matsuyama et al. (aaO) der Überzeugung, daß AIDS eine Cytokin- oder TNF-Erkrankung darstellt. In dem Cytokin-Netzwerk von AIDS scheinen TNF-α und TNF-β entscheidende Moleküle zu sein, die die Replikation von HIV verstärken sowie ihre eigene Expression und die anderer Cytokine induzieren. TNF-α stimuliert nachgewiesenermaßen die Freisetzung anderer Cytokine in verschiedenen Zelltypen und ist daher ein Schlüsselcytokin der Cytokin-Kaskade im ersten Abwehrmechanismus.
Es wurde vorgeschlagen, daß viele der mit AIDS assoziierten Symptome durch die Freisetzung von Cytokinen unterschiedlicher biologischer Funktionen erklärt werden können. Eine verstärkte Produktion von IL-1 und TNF-α, den beiden gut bekannten Pyrogenen, könnte das bei AIDS-Patienten auftretende Fieber erklären. TNF-α könnte an mit AIDS assoziierter Kachexie beteiligt sein. Sowohl TNF-α als auch TNF-β fungieren als Immunmodulatoren und Effektormoleküle bei durch Monocyten vermittelter Cytotoxizität. Des weiteren ist TNF für die Aktivierung der Immunantwort verantwortlich und es kann HIV-infizierte Zellen direkt abtöten und dadurch die Replikation von HIV verstärken. Auch ein immunologischer Mechanismus wurde zur Erklärung der Verarmung an CD4-T-Zellen bei AIDS vorgeschlagen (Matsuyama et al., aaO). Es wurde auch berichtet, daß das mit AIDS in Zusammenhang stehende Kaposi-Sarkom ebenfalls durch TNF-α induziert wird: TNF-α kann von Keratinocyten durch physiologische Stimuli, wie UV-Licht, erzeugt werden, was zur Induktion von IL-6 in Haut und zur Entwicklung des Kaposi-Sarkoms bei AIDS beitragen kann. Bei in-vitro-Tests kann TNF-α – Myelin und Oligodendrocyten schädigen; auch sind einige von Gliomen abgeleitete Zellinien der Antiproliferationswirkung von TNF-α zugänglich. Hieraus läßt sich folgern, daß die Funktionsstörung des Zentralnervensystems bei AIDS-Patienten ein Ergebnis der Beteiligung von TNF-α ist. Mehrere Berichte zeigten, daß die Serumspiegel von TNF-α und IL-1 bei der Entwicklung von AIDS und ARC (mit AIDS verwandter Komplex) beträchtlich erhöht sind, während sie bei Tests des Serums von symptomfreien Trägern von HIV in den Bereich gesunder Kontrollwerte fielen. Nach Matsuyama et al. (aaO) ist AIDS ebensosehr eine TNF-Erkrankung wie es eine HIV-Erkrankung ist. Dies zeigt, daß das Erreichen einer Kontrolle über die TNF-Induktion zur Entwicklung einer wirksamen Therapie für AIDS-Patienten führen kann.
Die folgenden grundlegenden Erkenntnisse ermöglichten es, die genannten Probleme zu lösen und neue therapeutische Einsatzzwecke des Lysozymdimers bei den genannten pathologischen Störungen zu finden:

1. Lysozymmdimer hemmt die Synthese von TNF,
2. Lysozymdimer stimuliert die Synthese von IFN-α,
3. Lysozymdimer verstärkt die Phagocytenaktivität.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung von Lysozymdimer zur Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen, zur Behandlung von Erkrankungen, die – wie oben beschrieben – mit exzessiv hohen Konzentrationen von TNF (Tumornekrosefaktor) verbunden sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung von Lysozymdimer zur Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen zur Prophylaxe von Erkrankungen, die – wie oben beschrieben – mit exzessiv hohen Konzentrationen von TNF verbunden sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung von Lysozymdimer zur Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen und von Hygieneprodukten, zur Therapie und Abwehr von Erkrankungen, die mit zunehmenden und exzessiv hohen TNF-Spiegeln verbunden sind.
Erfindungsgemäß lassen sich die im Vorhergehenden gestellten Aufgaben durch die folgenden neuen Einsatzzwecke der dimerisierten Form von Lysozym und von Lysozymdimer als aktiven Bestandteil enthaltenden pharmazeutischen Zubereitungen erreichen:

– Verwendung von Lysozymdimer zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Biosynthese des Tumornekrosefaktors bei Tieren und Menschen;
– Verwendung von Lysozymdimer zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung von Erkrankungen, die mit exzessiv hohen Tumornekrosefaktor-Spiegeln verbunden sind;
– Verwendung von Lysozymdimer zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Prophylaxe von Erkrankungen, die mit exzessiv hohen Tumornekrosefaktor-Spiegeln verbunden sind;
– Verwendung von Lysozymdimer zur Herstellung eines Medikaments zur Steuerung der HIV-induzierten Freisetzung von Tumornekrosefaktor bei symptomfreien Trägern und Patienten mit dem mit AIDS verwandten Komplex;
– Verwendung von Lysozymdimer zur Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen zur Behandlung von AIDS;
– Verwendung von Lysozymdimer zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Verhinderung und/oder Behandlung von Sepsis und septischem Schock;
– Verwendung von Lysozymdimer zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Verhinderung und/oder Behandlung von Kachexie;
– Verwendung von Lysozymdimer zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Verhinderung und/oder Behandlung von Fieber;
– Injektionen mit Lysozymdimer in einer Menge von 0,01–10 mg/ml, vorzugsweise 0,1–1,0 mg/ml einer apyrogenen sterilen Zusammensetzung, die ein physiologisch akzeptables Lösungsmittel und ein pharmazeutisch geprüftes Konservierungsmittel umfaßt;
– Injektionen wie zuvor zur i. v. Verabreichung in einer einzigen oder einer Wiederholungsdosis von 0,02 mg/kg Körpergewicht;
– Tampons und antiseptische Auflagen imprägniert mit wirksamen Dosen von Lysozymdimer, sowie Salben und Gele mit wirksamen Dosen von Lysozymdimer, zur Verhinderung von Sepsis und septischem Schock und zur Behandlung infizierter Wunden;
– Scheidentampons, die mit einer wirksamen Dosis von Lysozymdimer getränkt sind, zum Einsatz während der Menstruation.

Als dimerisierte Form von Lysozym wird bevorzugt das isolierte gereinigte Lysozymdimer verwendet. Bei einigen Applikationen ist es möglich, Zusammensetzungen anzuwenden, die neben Lysozymdimer auch kleine Fraktionen des Trimers und höherer Oligomere des Enzyms enthalten.
Die erfingungsgemäßen Injektionen können auch intramuskulär und hypodermal verabreicht werden. Bei einigen Applikationen kann es auch günstig sein, die gleiche flüssige Zusammensetzung (gleichzeitig oder unabhängig voneinander) intrauterin und in das Euter – oder lokal – eventuell zusammen mit anderen topischen Zubereitungen zu verabreichen.
Bevorzugte apyrogene sterile Zusammensetzungen mit mindestens einem physiologisch akzeptablen Lösungsmittel und/oder mindestens einem pharmazeutisch geprüften Konservierungsmittel bestehen aus apyrogenem sterilem Wasser oder einer PBS-Wasser-Lösung als Lösungsmittel und Thiomersal als geprüftem Konservierungsmittel für pharmazeutische Proteinzubereitungen.
Die dimerisierte Form von Lysozym läßt sich durch einen Prozess einer gesteuerten Polymerisation des Enzymmonomers und die anschließende sorgfältige Reinigung, insbesondere das Entfernen der monomeren Form mit den berichteten toxischen Nebenwirkungen und der Fraktionen mit Trimeren und höheren Oligomeren des Gemischs nach der Reaktion erhalten. Beliebige bekannte Polymerisationsverfahren können zur Gewinnung der dimeren Form des Enzyms geeignet sein. Ein Herstellungsverfahren, das Reinigungsstufen umfasst, wurde in WO 91/10731 beschrieben.
Frühere präklinische Tests des Lysozymdimers zeigten weder mutagene noch teratogene Wirkung und keine oder nur sehr geringe Toleranzeffekte. Die Toxizität LD₅₀ einer Einzeldosis bei oraler/dermaler Applikation war nicht meßbar (> 2000 mg/kg). Bei i. v. Applikation betrug die LD₅₀ > 1000 mg/kg.
Die in der vorliegenden Erfindung beschriebene, neue Applikation von Lysozymdimer erwies sich in in-vitro-Tests als stark fundiert und als wirksam bei klinischen in-vivo-Applikationen. Einige Vergleichsstudien wurden ebenfalls durchgeführt.
Vermutlich ist die Hemmwirkung auf die Freisetzung von TNF aufgrund des breiteren Aktivitätsspektrums des Lysozymdimers, d. h. seine Fähigkeit zur Induzierung der Freisetzung von IFN und seine Verstärkungswirkung auf Phagocytose, derart wirksam. Die beiden eben genannten Eigenschaften sind zwei wichtige Faktoren in natürlichen Abwehrmechanismen. Daher werden die therapeutischen und prophylaktischen Wirkungen der im vorherigen definierten neuen Einsatzzwecke von Lysozymdimer durch dessen stärkenden Effekt auf die natürlichen Abwehrmechanismen unterstützt.
Die vorliegende Erfindung wird in den Beispielen weiter erläutert, wobei auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen wird, welche die Testergebnisse von besonderem Interesse erläutern:
1 zeigt die in-vitro-Drosselung der TNF-Freisetzung in einer suboptimal mit ConA stimulierten Lymphocytenkultur in Gegenwart von Lysozymdimer in verschiedenen Verdünnungen.
Beispiel 1:
Zum Zwecke der Bestimmung der Immunaktivität des Lysozymdimers wurde ein Test bezüglich der Lymphocyten in humanem peripherem Blut mit FACS-Analyse durchgeführt.
Mitogenstimulation in humanen peripheren Lymphocyten ist ein geläufiges Verfahren zum Testen der Reaktivität der wichtigsten Zellen des Immunsystems. Zum Testen der Einflüsse therapeutischer Substanzen auf die Aktivierung und Proliferation von Lymphocyten von gesunden Blutspendern, wird das Mitogen in einer suboptimalen Dosis zugesetzt und die Lymphocytenantwort schließlich quantitativ mit immunrelevanten Parametern gemessen. Die Ergebnisse werden mit dem ohne Medikation gemessenen Kontrollwert verglichen.
Zur Stimulierung der Lymphocyten wurde ConA in einer Konzentration von 20 μg/ml Medium verwendet. Die Anfangszellkonzentration betrug 10⁶ Zellen/ml. Die Kurzzeitkultivierungen in einem CO₂-Inkubator wurden einen Tag lang (IL-2-Rezeptoren auf Lymphocyten und HLA-Dr) oder zwei Tage lang (alle anderen Tests) durchgeführt. Die folgenden Parameter wurden als Kriterien für die Zellaktivierung gemessen:

– Neopterin (Marker für die Immunaktivierung)
– β-2-Mikroglobulin (ebenfalls ein Aktivierungsmarker)
– Interleukin-2 (von T-Helferlymphocyten abgeleitete autokrine und parakrine Substanz)
– Interleukin-6 (Zelldifferenzierungshormon)
– Tumornekrosefaktor TNF (vasoaktives, multipotentes Interleukin)
– Interferon-α (Differenzierungsfaktor insbesondere für B-Lymphocyten)
– Thymidinkinase (in Proliferationszellen hochreguliertes Enzym)
– Lymphocyten-Interleukin-2-Rezeptor (Akzeptormolekül für autokrines und parakrines IL-2)
– Lymphocyten-Ki-67 (in aktivierten und Proliferationszellen exprimiertes Antigen)
– Lymphoczyten-HLA-Dr (während der Immunreaktion hochreguliertes Histokompatibilitätsantigen der Klasse II)

Es wurden folgende Beobachtungen bezüglich Zellprodukten im Kulturüberstand gemacht:
Neopterin – das von T-Lymphocyten während der Immunantwort und in stimulierten Kulturen erzeugt wird – war in den vorliegenden Experimenten durch das Lysozymdimer gegenüber dem Kontrollwert in mit ConA stimulierten Zellen ohne das getestete Dimer nicht deutlich erhöht. Bei zunehmender Konzentration des getesteten Dimers lagen die Neopterinwerte etwas höher.
In ähnlicher Weise fluktuierten die β-2-Mikroglobulin-Werte bei allen Konzentrationen des Lysozymdimers um den Kontrollwert.
Die IL-2-Rezeptoren – die während der Kultur von der Lymphocytenoberfläche abgestossen werden und eine Information über die gesamte IL-2-Rezeptor-Umwandlung liefern – lagen auf vergleichbarer Höhe mit den IL-2-Rezeptoren auf der Lymphocytenoberfläche (siehe unten) und zeigten eine klare Suppression bei der höchsten Konzentration des getesten Dimers.
Interleukin-6 zeigte bei höheren Konzentrationen eine klare Tendenz zu dosisabhängigen höheren Werten. Dieses Molekül ist bei Hämatopoese, Zelldifferenzierung und Immunreaktion sehr wichtig. Im Test mußten die ersten drei Werte extrapoliert werden, da der höchste Standard nur 2000 pg/ml betrug.
Die Ergebnisse bezüglich der übrigen Moleküle sind in der im folgenden angegebenen Tabelle 1 aufgezeigt. Im Gegensatz zu Interleukin-6 war TNF-α in Kulturüberständen in drastisch verringerten Konzentrationen vorhanden, mit Ausnahme der letzten beiden Verdünnungsstufen, die sich als ineffektiv für eine Suppression der TNF-Konzentration erwiesen.
Tabelle 1: Einfluß von Lysozymdimer auf die Lymphocyten in humanem peripherem Blut
Einfluß von Lysozymdimer auf die Lymphocyten von humanem peripherem Blut
Thymidinkinase wird nach dem Einfrieren und Auftauen des Zellpellets im Lymphocytencytoplasma gemessen. Thymidinkinase wird in sich teilenden Zellen hochreguliert, wodurch sie einen guten Marker für eine Zellproliferation darstellt. Die Daten der Tabelle 1 zeigen durch die höchsten getesteten Lysozymdimerkonzentrationen eine Depression; in den anderen Verdünnungsstufen ist keine klare Tendenz festzustellen. Interferon-α hingegen zeigt unter den gleichen Bedingungen bei höheren Konzentrationen Werte, die über den Kontrollwerten von ConA allein liegen. Eine sichtbare Zunahme erfolgt vom zweiten Wert zur dritten Verdünnung.
Lymphocytenmarker:
HLA-Dr/CD3, ein Histokompatibilitätsmarker, wird während der Immunreaktion auf aktivierten T-Lymphocyten exprimiert. Die erzielten Ergebnisse zeigen einen gewissen Prozentsatz aktivierter T-Zellen in der Kontrollkultur; bei verschiedenen Konzentrationen von Lysozymdimer in den Kulturen variieren die Werte um den Kontrollwert.
IL-2-Rezeptoren auf Lymphocyten: Interleukin-2 ist ein Cytokin, das von T-Helferlymphocyten nach der Aktivierung durch IL-1 gebildet wird. IL-2 ist autokrin und parakrin. T-Helferlymphocyten erzeugen nicht nur IL-2, sondern werden durch dieses Molekül auch zur Proliferation angeregt. Die Rezeptoren für IL-2 auf der Oberfläche von T-Helferlymphocyten werden bei Aktivierung hochreguliert. Aus Tabelle 1 wird deutlich, daß bei der höchsten Konzentration von Lysozydimer eine deutliche Drosselung der IL-2-Rezeptoren auf Lymphocyten erfolgt, während sich die übrigen Werte um nicht mehr als im Rahmen der biologischen Bandbreite unterscheiden. Die Tabelle 1 enthält auch Daten bezüglich Ki-67/CD8 und Ki-67/CD4. Ki-67 ist ein in sich in Mitose befindlichen Zellen auftretendes Proliferationsmolekül. Ki-67 stellt einen wichtigen Parameter zum Nachweis stimulierter Zellen und bei der Tumordiagnose dar. Bei den angegebenen Ergebnissen ist eine leichte Hemmung der Zellproliferation in Ki-67⁺-Suppressor (CD8)-Zellen bei den beiden höchsten Dosen an Lysozymdimer zu sehen. Bei Helfer(CD4)-Lymphocyten tritt bei der höchsten Dosis eine beträchtliche Zunahme des Prozentsatzes positiver Zellen auf. Bei geringeren Dosen liegt der Prozentsatz der Ki-67/CD4 exprimierenden Zellen etwas über dem Kontrollwert.
Die deutliche Drosselung von TNF ist in 1 angegeben.
Die im Vorhergehenden aufgelisteten und wegen ihrer möglichen Bedeutung bei der Immunantwort gewählten immunologischen Parameter wurden mit einem Verfahren analysiert, das auf dem Messen des Einflusses einer Testsubstanz auf suboptimal mit ConA stimulierte humane periphere Lymphocyten, die erwiesenermaßen empfindlich sind und die Bewertung vieler verschiedener Parameter erlauben, beruht. Bei einigen Konzentrationen von Lysozymdimeren bestehen deutliche Unterschiede bei den Testergebnissen im Vergleich mit den Werten für die mit ConA allein stimulierten Lymphocyten, während in Bezug auf beispielsweise TNF und IFN-α die beobachteten Effekte klar innerhalb des Bereichs aller getesteten Verdünnungen liegen.
Beispiel 2:
Es wurden Laborversuche zur Bestimmung der Wirkung von Lysozymdimer auf die Phagocytenaktivität von Milch und Blutzellen in vitro durchgeführt. Es wurde früher bereits festgestellt, daß Lysozymdimer im Standard-in-vitro-Test die Proliferation der aus infizierten Milchdrüsen von Kühen isolierten Mikroorganismen nicht hemmt. Da der klinische Einsatz von ins Euter und gleichzeitig intravenös verabreichtem Lysozymdimer die Infektion von Milchdrüsen in Kühen eliminiert, war klar, daß der hauptsächliche antibakterielle Mechanismus in Milchdrüsen von Kühen Phagocytose ist. Dementsprechend wurden Blut und Milch von sowohl gesunden als auch infizierten Kühen bei in-vitro-Tests mit dem Ziel der Bestimmung der Wirkung von Lysozymdimer auf Phagocytose verwendet. Zum Vergleich wurden die Experimente mit der gleichen Testsubstanzkonzentration und der gleichen Inkubationszeit unter Verwendung der aus gesunden und infizierten Kühen oder sogar aus einem infizierten und einem gesunden Abschnitt der Milchdrüse derselben Kuh isolierten Zellen durchgeführt, um Unterschiede eines individuellen Ansprechens zu eliminieren.
Bei den durchgeführten Tests wurden sowohl die gereinigte dimere Form als auch ein Gemisch aus Dimer und kleinen Fraktionen trimerer und höherer Oligomere von Lysozym dem Blut oder der Milch der gesunden und infizierten Kühe in Konzentrationen von 25–0,25 μg/ml zugesetzt und das Gemisch 0,5–24 h lang bei 37°C inkubiert. Der Prozentsatz an Phagocytosezellen (Phagocytoseindex gemäß dem Verfahren von Wisniewski et al.) und der Prozentsatz NBT-positiver Granulocyten (gemäß Park) wurden für jede Probe bestimmt.
Das Lysozymdimer verstärkt bei in-vitro-Tests die Phagocytenaktivität von Leukocyten. Die Effekte hängen von der Dosis und der Inkubationszeit ab. Im Vergleich zu Blutleukocyten sind zur Aktivierung von Milchleukocyten höhere Konzentrationen von Lysozymdimer notwendig. Ausnehmend hohe Konzentrationen des Dimers verringern die Phagocytenaktivität in vitro in geringem Maße. Ausgewählte Ergebnisse – die haupsächlich zeigen, daß, sofern das Gemisch nach der Polymerisationsreaktion keine cyto-toxische monomere Form des Dimers enthält, für hochgereinigtes und weniger reines dimerisiertes Lysozym vergleichbare Ergebnisse erhalten werden – sind in den folgenden Tabellen 2 und 3 angegeben. In diesen wird der Ausdruck "Lysozymdimer+" zur Kennzeichnung einer Zusammensetzung, die eine kleine Fraktion Trimere und höhere Oligomere von Lysozym entsprechend den vorherigen Angaben in der Beschreibung enthält, verwendet.
Tabelle 2: Wirkung von Lysozymdimer auf die Phagocytenaktivität von Leukocyten in Milch aus gesunden Kühen (Konzentration des Dimers: 20 μg/ml, Inkubationszeit: 3 h)
Tabelle 3: Wirkung von Lysozymdimer auf die Phagocytenaktivität von Leukocyten in Milch aus infizierten Kühen (Konzentration des Dimers: 20 μg/ml, Inkubationszeit: 30 min)
Es ist klar, daß der Reinigungsgrad von Lysozymdimer auf die beobachtete Phagocytenaktivität von Milchleucocyten keine deutliche Wirkung hat. Offensichtlich sind ferner die Effektorzellen Granulocyten.
In den weiteren Beispielen werden Ergebnisse von in-vivo-Untersuchungen berichtet. Für die klinischen Tests wurde eine Zubereitung von 2 mg Lysozymdimer in 10 ml PBS-Lösung verwendet. Diese Zubereitung wird als KLP-602 bezeichnet.
Beispiel 3:
Es zeigte sich, daß KLP-602 bei intravenöser Verabreichung die Phagocytenaktivität von Blutgranulozyten in gesunden und kranken Kälbern und in gesunden Fohlen sowie in Milchkühen nach Applikation ins Euter stimulierte. Diese Wirkung manifestiert sich in einer erhöhten Zahl von Neutrophilen und der erhöhten Fähigkeit zur Absorption von Staphylokokken und Reduzierung von NBT. Dieses Phänomen tritt primär während der ersten 12–24 h nach der Injektion der Zubereitung auf. Die Wirkung von KLP-602 auf die Phagocytenaktivität im Euter hing von der Dosis und der Form des Wirkstoffs und dem Ansprechen des einzelnen Tieres ab.
Lysozymdimer wurde in der Therapie von Infektionskrankheiten bei Rindern, Schweinen, Pferden und Hunden eingesetzt. Die Zubereitung wurde in unterschiedlichen Dosierungen und unterschiedlichen Zeitabständen intravenös, intramuskulär, subkutan, ins Euter und intrauterin verabreicht. Das Medikament wurde an 346 Kühe, 274 Kälber, 110 Säue und männliche Schweine, 294 Ferkel, 709 Spanferkel, 35 Fohlen und 107 Hunde verabreicht. Eine Alternativbehandlung wurde zur Kontrolle durchgeführt. Aufgrund der Natur der Testtiere wurde aus moralischen Gründen keines ohne therapeutische Behandlung gelassen: Dennoch konnten die Folgerungen im Vergleich mit dem klinischen Bild der behandelten Erkrankungen aus der tiermedizinischen Literatur gezogen werden.
Beispiel 4:
In den an Kälbern durchgeführten Tests wurde die Blutkonzentration von INF und TNF für eine Gruppe gesunder und infizierter Tiere bestimmt, wobei letztere in den ersten 12 h einer Infektion unbehandelt blieben, anschließend mit Antibiotika behandelt und mit Lysozymdimer in hochgereinigter Form geheilt wurden.
In der mit Lysozymdimer behandelten Gruppe heilten eine oder zwei Injektionen von KLP-602 über 90% der an Gastroenteritis leidenden Kälber und über 85% der Fälle von akuter Bronchopneumonie. Das prompte Verschwinden von Symptomen wie Fieber und Diarrhöe war sehr charakteristisch. Zur Behandlung mit diesem Medikament war es nicht erforderlich, die Tiere mit zusätzlicher Flüssigkeit zu versorgen. Die Zeit und die Geschwindigkeit der Erholung waren besser als bei der mit Antibiotika behandelten Kontrollgruppe.
Beispiel 5:
KLP-602 war bei der Behandlung von Erkrankungen bei Schweinen äußerst wirksam. 100% oder nahezu 100% der Tiere erholten sich von den folgenden Krankheiten: Post-partum-Agalaktie (MMA-Syndrom), Dysenterie, eitrige Gebärmutterentzündung, Influenza und Kolibazilleninfektion. Bei der Applikation des Medikaments im Falle einer Ödemerkrankung und von Bronchopneumonie ergaben sich etwas weniger hervorragende, aber immer noch deutlich bessere Ergebnisse als sie bei alternativen Therapien erhalten wurden. Es konnte ein prompter Rückgang von Diarrhöe (gewöhnlich während der ersten 24 h) und von Fieber sowie das Wiederauftreten der Milchsekretion, das in Fällen von nachgeburtlichen Euter- und Uterusentzündungen besonders wichtig ist (und das Leben der Ferkel rettet), beobachtet werden. Die Wirksamkeit einer Therapie mit KLP-602 im Vergleich zu alternativen Behandlungen ist in der im weiteren angegebenen Tabelle 4 gezeigt.
Beispiel 6:
Bei Behandlung mit KLP-602 erholten sich 100% der an Enteritis leidenden Fohlen und 83,3% der an Bronchopneumonie leidenden Fohlen schneller als die Kontrollgruppe mit bekannten Zubereitungen.
Beispiel 7:
KLP-602 wurde bei der Behandlung einiger Krankheiten bei Hunden, beispielsweise bei Follikulitis (100% Wirksamkeit), Infektion des oberen und unteren Atmungstrakts und einer sich durch Diarrhöe manifestierenden Infektion des Gastrointestinaltrakts, getestet. In dieser Gruppe war Parvovirose, eine bekanntlich praktisch unheilbare Erkrankung, vorherrschend. Dennoch wurde in den Parvovirosefällen eine Erholungsrate von etwa 75% beobachtet.
Bei den Tests, die – wie oben beschrieben – an den von natürlich auftretenden Krankheiten betroffenen Tieren durchgeführt wurden, wurden mehrere wichtige Beobachtungen gemacht:

1. Die Therapie erwies sich bei der Behandlung von Erkrankungen mit multifaktorieller Ätiologie und Pathogenese (derartige Erkrankungen sind bei Tierpopulationen vorherrschend und schwer handzuhaben, insbesondere in Zuchtfarmen, wo sich Krankheiten sehr leicht epidemisch ausbreiten) als wirksam und sehr einfach. Diese Erkenntnisse beweisen die Modulationswirkung des Lysozymdimers auf die natürlichen Abwehrmechanismen.
2. Die Therapie erwies sich als wirksam bei Erkrankungen, in deren natürlichem Verlauf endotoxischer Schock oder andere Störungen wie hohes und langandauerndes Fieber, auftreten, die den Zustand eines Tieres über eine lange Zeit nach der Wiederherstellung hinweg beeinflussen und somit äußerst schädlich sind für Tiere wie z. B. Pferde (Fohlen), die für Rennen und andere Sportarten gezüchtet werden, sowie solche, die hauptsächlich für die Nahrungsmittelindustrie gezüchtet werden, wobei in diesem Falle die Produktionskosten den kritischen Punkt darstellen. Rasche Wiederherstellung erlaubt eine signifikante Verminderung der Kosten für die Behandlung einer solchen Erkrankung.
3. Die in vivo beobachteten Ergebnisse bestätigen unterdrückte TNF-Spiegel bei verschiedenen natürlich vorkommenden Infektionen, die mit Lysozymdimeren behandelt wurden, und stützen damit die Erfindung gemäß den Ansprüchen.

Beispiel 8:
Untersucht wurde die Wirkung von Lysozymdimer auf die Aktivität von Antibiotika gegenüber mehreren verschiedenen Mikroorganismen mit dem Ziel, Bakterien für weitere Tests auszuwählen, die wirksamsten Antibiotikadosierungen für die ausgewählten Mikroorganismen zu bestimmen und den Bereich der Lysozymdimerkonzentrationen herauszufinden, innerhalb dessen die erwarteten Effekte zu beobachten sein werden. In den Experimenten wurden zwei Chargen von lyophilisiertem gereinigtem Lysozymdimer verwendet, von denen die eine 1991, die andere 1992 hergestellt wurde. In den Experimenten wurden Antibiotika eingesetzt, die in Polen im Handel erhältlich sind, geliefert von Polfa, einem polnischen Hersteller von Arzneimitteln wie Penicillin, Neomycin, Erythromycin, Cephalosporin (SEFRIL).
Die zu testenden Antibiotika wurden in einer gepufferten NaCl-Lösung (PBS-Biomed) oder in einem Rinderserum suspendiert. Dann wurde die Suspension derart mit einem Lysozymdimer versetzt, daß die Konzentration des-Dimers in den Testproben stets 5 μg/ml betrug. Die Konzentrationen der getesteten Antibiotika waren aufgrund der unterschiedlichen Empfindlichkeit der verwendeten Mikroorganismen in jedem Test anders.
Die Wirkung des Antibiotikums allein oder in Kombination mit einem Lysozymdimer wurde in einer PBS- oder Rinderserumsuspension in vitro an Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus und Streptococcus uberis, die aus kranken Tieren isoliert wurden, getestet. Laborstämme von Sarcina lutea 9341 ATCC und Staphylococcus aureus 209 P wurden ebenfalls in den Experimenten verwendet.
Wegen des vorläufigen Charakters der Tests wurde jedes Antibiotikum gegen 1, 2 oder 3 verschiedene Bakterienarten wie folgt getestet:
1. Präparation der Platten
Eine 0,05-ml-Portion einer 18 h alten Nährlösungskultur des zu testenden Bakterienstamms wurde zu einer 14-ml-Probe von angereichertem Agar (Biomed) gegeben. Das Gemisch wurde gerührt und auf einer Platte von 10 mm Durchmesser ausgegossen. Nach dem Erkalten und Festwerden des Agars wurden auf diesen sterile Zylinder gesetzt. Diese wurden mit den zu testenden Antibiotikalösungen gefüllt.
2. Herstellung der Antibiotikalösungen
Eine 10-mg-Probe des zu testenden Antibiotikums wurde zunächst in PBS gelöst; dann wurde das erforderliche Volumen dieser Lösung zum vorgegebenen Volumen von PBS oder Rinderserum zum Erzielen einer der MIC (minimalen Hemmkonzentration) möglichst nahen Antibiotikakonzentration gegeben; es wurden immer Lösungen dreier unterschiedlicher Konzentrationen hergestellt.
3. Herstellung der Lysozymdimerlösung
10 mg lyophilisiertes Lysozymdimer wurde ursprünglich in 10 ml PBS gelöst. Die weiteren Verdünnungen wurden entweder mit PBS oder Rinderserum hergestellt und den zuvor wie im Vorhergehenden geschildert hergestellten Antibiotikalösungen zugesetzt. Die folgenden Kombinationen wurden getestet:

– Antibiotikum/PBS
– Antbiotikum/PBS + Lysozymdimer
– Antibiotikum/Serum
– Antibiotikum/Serum + Lysozymdimer

Die Antibiotikakonzentration war in jedem Zylinder die gleiche; die Konzentration des Lysozymdimers betrug 5 μg/ml. Nach dem Füllen der Zylinder mit den Lösungen wurden die Platten 2 h lang auf Raumtemperatur gehalten; anschließend wurden die Kulturen bei 37°C inkubiert.
4. Ablesen der Ergebnisse und Bewerten der Aktivität:
Die Platten wurden nach 18stündiger Inkubation aus der Heizvorrichtung entnommen und es wurde der Durchmesser der Bakterienwachstumhemmzone (Fehlen von Kolonien) rings um die Zylinder gemessen.
Es zeigte sich kein Unterschied in der Größe der Bakterienwachstumhemmzonen rings um die mit den Antibiotikasuspensionen in PBS ohne und mit Zugabe von Lysozymdimer in einer Konzentration von 5 μg/ml gefüllten Zylinder. Die Größe der Hemmzone nahm jedoch rings um die mit der Antibiotikasuspension in Rinderserum gefüllten Zylinder ab, nahm aber rings um die mit den Suspensionen von Antibiotikum + Lysozymdimer in Rinderserum gefüllten Zylinder zu. Die Zonen waren größer als die rings um mit PBS-Suspensionen gefüllten Zylinder sowie größer als die rings um mit Serumsuspensionen von Antibiotika allein, ohne Lysozymdimer, gefüllten Zylinder.
Das Phänomen trat bei den Tests mit Penicillin, das gegen Sarcina lutea verwendet wurde, auf. Ampicillin zeigte in Kombination mit Lysozymdimer Synergismus bei der Hemmung des in-vitro-Wachstums von Escherichia coli, Salmonella enteritidis und Staphylococcus epidermidis. Es zeigte sich ein Zunahme der Aktivität von Erythromycin in Gegenwart von Lysozymdimer gegenüber Staphylococcus aureus 209 P und Streptoococcus uberis sowie von SEFRIL gegenüber Staphylococcus aureus 209 P. Escherichia coli und Salmonella enteritidis waren gegenüber diesem Antibiotikum resistent.
Die Zunahme der antibakteriellen Aktivität der getesteten Antibiotika war nur bei Verwendung von Rinderserum als Lösungsmittel zu beobachten. In der Regel betrug die Zunahme im Mittel 50%, in einigen Fällen führte jedoch die Gegenwart von Lysozymdimer zu einer 100%igen Zunahme der Aktivität der Antibiotika.
Schlußfolgerungen:
Lysozymdimer (ohne ein Konservierungsmittel) zeigt in Konzentrationen von 5 μg/ml in vitro Synergismus mit einigen Antibiotika, die in MIC (minimaler Hemmkonzentration) in Gegenwart von Rinderserum zur Hemmung des Bakterienwachstums eingesetzt werden. Die bisher erzielten Ergebnisse machen deutlich, daß weitere Untersuchungen notwendig sind.
Beispiel 9: Synergismus mit AZT bei der Behandlung von AIDS-Patienten:
Ito et al. berichteten vor kurzem, daß TNF-α gegenüber der Anti-HIV-Aktivität von AZT antagonistisch wirken kann (M. Ito et al.: Tumor necrosis factor antagonizes inhibitory effect of azidothymidine on human immunodeficiency virus (HIV) replication in vitro; Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990, 166; 1095–1101). AIDS-Patienten in fortgeschrittenem Stadium leiden an vielen zufälligen Infektionen. Einige infektiöse Agentien können die Erhöhung von TNF-α, IL-6 und anderer Cytokine induzieren, die entweder immunsuppressiv sein können oder die HIV-Replikation fördern können.
Daher ist die Behandlung mit AZT allein nicht ausreichend wirksam. Zur Steigerung der Anti-HIV-Aktivität von AZT wird daher eine Kombination der AZT-Behandlung mit der Verabrei chung von Lysozymdimer zur Hemmung der Synthese von TNF – dem auf eine Anti-HIV-Aktivität von AZT antägonistisch wirkenden Faktor – vorgeschlagen.

Claims

Verwendung einer dimerisierten Form von Lysozym zur Herstellung eines Medikaments zur Stärkung natürlicher Abwehrmechanismen durch Modulation dieser natürlichen Abwehrmechanismen mit wenigstens einer der folgenden Aktionen: Hemmung der Freisetzung von Tumornekrosefaktor (TNF), Senkung eines TNF-Spiegels, Verstärkung der Phagocytose, Steigerung der Freisetzung von Interferon, Anhebung von Interleukin-6-Werten, bei Tieren oder Menschen.
Verwendung nach Anspruch 1 zur Senkung eines TNF-Spiegels, der höher als 13,75 pg/ml ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung des dimersierten Lysozyms in einer einzelnen oder wiederholten Dosis von 0,3 μg bis 1 mg pro 10⁶ Leukocyten.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur prophylaktischen oder therapeutischen Anwendung, vorzugsweise zur Prävention oder Behandlung mindestens einer der folgenden Erkrankungen: Sepsis, septischer Schock, Kachexie, AIDS und mit AIDS in Zusammenhang stehende Infektionen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Medikament das dimerisierte Lysozym in Kombination mit einem Antibiotikum und/oder AZT enthält.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Medikament in Form einer Injektionslösung vorliegt, welche das dimerisierte Lysozym in einer Menge von 0,01–10 mg/ml, vorzugsweise 0,1–1,0 mg/ml, einer apyrogenen sterilen Zusammensetzung mit mindestens einem physiologisch akzeptablen Lösungsmittel und/oder mindestens einem pharmazeutisch anerkannten Konservierungsmittel, enthält.
Verwendung nach Anspruch 6 zur Verabreichung einer einzelnen oder wiederholten Dosis von 0,02 mg/kg Körpergewicht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament in Form einer der folgenden Zusammensetzungen vorliegt: als Gel oder Salbe enthaltend eine wirksame Dosis der dimerisierten Form von Lysozym, oder als ein mit einer wirksamen Dosis der dimerisierten Form von Lysozym getränkter, antiseptischer Wundverband oder Tampon.