DE3874623T2 - Analytisches verfahren und element fuer eine proteinprobe. - Google Patents

Analytisches verfahren und element fuer eine proteinprobe.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die klinische Chemie. Ganz speziell betrifft sie Verfahren und Elemente für die Bestimmung von Protein in wäßrigen Flüssigkeiten.
  • Verfahren zur Untersuchung von Proteinen in wäßrigen Flüssigkeiten, wie z.B. biologischen Flüssigkeiten (Blut, Serum und Urin) sind bekannt. Sowohl nasse als auch trockene Methoden sind bekannt. Derartige Untersuchungen werden aus verschiedenen Gründen durchgeführt. Beispielsweise ist die Kenntnis von Proteinkonzentrationen im menschlichen Serum und Urin wichtig für die Diagnose von solchen Zuständen wie viraler oder bakterieller Meningitis.
  • Nasse Methoden sind solche Methoden, bei denen zunächst klinische Reagenzien in einem flüssigen wäßrigen Träger gelöst oder suspendiert werden. Trockene chemische Methoden sind chemische Methoden, die unter Verwendung von Reagenz- Zusammensetzungen durchgeführt werden, die in verschiedene, praktisch "grifftrockene" Elemente, eingearbeitet werden. Zu Beispielen derartiger Elemente gehören Teststreifen vom "Tauch- und Ablestyp" sowie analytische Testelemente mit vielen Zonen. Elemente vom zuletzt genannten Typ werden beispielsweise in der US-PS 4 132 528 beschrieben.
  • Die chemische Reaktion, die extensiv sowohl bei nassen wie auch bei trockenen Protein-Untersuchungsmethoden angewandt wird, ist die "Biuret"-Reaktion. Die allgemeine Reaktion wird beschrieben in "Determination of Serum Protein by Means of the Biuret Reaction", verfaßt von A.G. Gornall und anderen und veröffentlicht in Journal of Biology Chemistry, Band 177, Seite 751 (1949).
  • Im allgemeinen schließt die Biuret-Reaktion ein "Biuret"- Reagens ein, das eine Cupri-Chelatform des Kupfers enthält sowie eine Basen-Zusammensetzung ausreichender Stärke, um einen pH-Wert von über etwa 12 zu erzeugen.
  • Reagiert Protein in einer wäßrigen Flüssigkeit, wie beispielsweise Serum, mit dem Biuret-Reagens, so läuft eine Reaktion zwischen der Cupriform des Kupfers und dem Protein ab, unter Erzeugung eines violetten Farbtones. Die Farbtonintensität ist direkt proportional dem Proteingehalt des Serums. Infolgedessen läßt sich die Proteinkonzentration nach üblichen bekannten kolorimetrischen analytischen Methoden ermitteln.
  • In dem Element der US-PS 4 135 528 ist das analytische Element ein mehrere Zonen aufweisendes analytisches Element. Das Element weist eine Ausbreitzone oder Ausbreitschicht in fluidem Kontakt mit einer Reagenszone oder einer Reagensschicht auf. Die Reagensschicht oder Reagenszone ist auf einen Schichtträger, z.B. aus Polyethylenterephthalat aufgetragen. Die Biuret-Zusammensetzung befindet sich in der Reagenszone. Die Reagenszone enthält weiterhin eine Alkali erzeugende Zusammensetzung von ausreichender Konzentration, um einen pH-Wert von über 12 aufrechtzuerhalten. Dieses Element hat, obgleich es extrem geeignet und gut zu handhaben ist, den Nachteil, daß seine Empfindlichkeit gering ist, so daß sich Proteinkonzentrationen von 100 mg/dl oder darunter nicht ermitteln lassen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine kolorimetrische Methode für die quantitative Bestimmung von Protein bereit, mit der Stufe der Vermischung einer wäßrigen Probe mit dem Protein mit einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von über 12. Gekennzeichnet ist die Methode dadurch, daß das wäßrige Medium enthält.
  • i) ein Cuprisalz und einen Pyridyl-Azofarbstoff; oder
  • ii) einen vorgebildeten Cupri-Pyridyl-Azofarbstoffkomplex.
  • Das analytische Verfahren, das durch die Erfindung bereitgestellt wird, um Protein zu bestimmen, ist empfindlicher als analytische Methoden, denen die Biuret-Reaktion zugrundeliegt.
  • Das vorerwähnte analytische Verfahren kann in Form von trockenen chemischen Techniken angewandt werden. Infolgedessen stellt die vorliegende Erfindung auch ein analytisches Element für die Bestimmung von Protein in einem wäßrigen Medium bereit, das ein absorbierendes Material aufweist, das enthält
  • i) ein Cuprisalz und einen Pyridyl-Azo-Farbstoff oder einen vorgebildeten Cupri-Pyridyl-Azo-Farbstoffkomplex und
  • ii) eine Zusammensetzung, die dazu geeignet ist, um einen pH-Wert von über 12 aufrechtzuerhalten, wenn das absorbierende Material mit einem wäßrigen Medium in Kontakt gebracht wird.
  • Ein besonders geeignetes analytisches Element der Erfindung ist ein mehrschichtiges Element mit
  • i) einem Träger, auf den aufgetragen sind,
  • ii) eine Ausbreitschicht,
  • iii) eine oder zwei Reagensschichten in fluidem Kontakt mit der Ausbreitschicht und
  • iv) ein Cuprisalz und ein Pyridyl-Azofarbstoff oder ein vorgebildeter Cupri-Pyridyl-Azofarbstoffkomplex sowie eine Basenzusammensetzung, die dazu geeignet ist, einen pH-Wert aufrechtzuerhalten; wobei das Salz und der Farbstoff in der gleichen oder in verschiedenen Schichten vorhanden sind.
  • Die Erfindung beruht auf der Fähigkeit von Protein Cu&spplus;² aus einem Cupri-Pyridyl-Azofarbstoffkomplex zu verdrängen. Das Cupriion (Cu&spplus;²) wird in einer alkalischen Umgebung mit einem pH-Wert von über 12 mit einem Pyridyl-Azofarbstoff komplex gebunden. Dieser Komplex weist in Lösung eine Absorptionskurve auf, die zu einer höheren Wellenlänge hin verschoben ist, bezüglich der Absorptionskurve des Farbstoffes allein.
  • Wird Protein zu der Lösung zugegeben, so wird das Cupriion aus dem Komplex von dem Protein entfernt. Dies bewirkt eine Nettoverschiebung zu einer niedrigeren Wellenlänge von der Cu&spplus;²-Farbtoffkomplex-Absorptionskurve zur Absorptionskurve des Farbstoffes allein. Wird die Absorptionsdichte bei der Spitze der Cu&spplus;²-Farbstoffkomplex-Konzentration überwacht, so verursacht der Zusatz von Protein einen Dichteverlust, der proportional ist der Konzentration an Protein, das der Lösung zugesetzt wird. Dies bedeutet, daß in wäßrigen Lösungen mit einem Cu&spplus;²-Ion, Protein und einem Pyridyl- Azofarbstoff das Cu&spplus;² eine größere Affinität für das Protein hat als für den Pyridyl-Azofarbstoff. Infolgedessen läßt sich in Zusammensetzungen, in denen sowohl das Cu&spplus;²-Ion wie auch die Farbstoffkonzentrationen bekannt sind, die Konzentration des Proteins in einem unbekannten wäßrigen Flüssigkeit auf kolorimetrischem Wege bestimmen.
  • Repräsentative Pyridyl-Azofarbstoffe, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, haben die Struktur:
  • worin
  • R für einen Elektrondonor steht, wie z.B. OH, NH&sub2;, Dialkylamino, worin Alkyl 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, COOH usw.;
  • R¹ steht für H, OH, NH&sub2;, Dialkylamino, worin Alkyl die gleiche Bedeutung wie für R angegeben hat;
  • R² steht für H, NH&sub2; oder OH;
  • R³ steht für H, C&sub6;H&sub5;NHSO&sub2;, CH&sub3;SO&sub2;, Cl, Br, CN; und
  • R&sup4; steht für H (CH&sub3;)&sub2;NSO&sub2;, OH, NO&sub2;, Dimethylamino oder R&sup4; steht gemeinsam mit R&sup5; und den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, für eine ankondensierte Phenylgruppe.
  • Zu Beispielen von Farbstoffen mit der oben angegebenen Struktur gehören:
  • Die Farbstoffe können hergestellt werden nach Verfahren, wie sie in der US-PS 4 195 994 beschrieben werden.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine qualitative und quantitative Bestimmung von Protein in wäßrigen Flüssigkeiten. Die Erfindung läßt sich verwenden zur Untersuchung biologischer Flüssigkeiten von Menschen oder Tieren, insbesondere jedoch von Menschen. Zu derartigen Flüssigkeiten gehören, ohne sie hierauf zu begrenzen, Blut, Plasma, Serum, Lymphflüssigkeiten, Gallenflüssigkeiten, Urin, spinale Flüssigkeiten, Sputum, Schweiß und dgl., wie auch Stuhl-Sekretionen. Es ist ferner möglich, flüssige Präparationen von menschlichem oder tierischem Gewebe zu untersuchen, wie beispielsweise von Skelettmuskeln, dem Herzen, der Niere, der Lunge, dem Gehirn, dem Knochenmark, der Haut und dgl..
  • Eine teilweise Liste von repräsentativen Cuprisalzen schließt ein Cupriperchlorat, Cuprisulfat, Cupriacetat, Cupributyrat, Cupribromat, Cuprichlorat, Cupribromid, Cuprichlorid, Cuprifluorid, Cupridichromat, Cupriformiat, Cupriiodad, Cuprilactat, Cupriorthophosphat, Cuprilaurat, Cuprisalicylat, Cuprinitrat, Cupritartrat und Cuprioxalat ein. Ein besonders geeignetes Salz ist Cupri-Ethylacetoacetat.
  • Cuprisalz- und Farbstoffkonzentrationen im Bereich von 0,02 bis 0,3 g/m² in den Elementen der Erfindung haben sich als geeignet erwiesen, unter Beachtung der erwarteten Konzentration von Protein in einer Probe unbekannter Zusammensetzung.
  • Zu Verbindungen, die sich als geeignet erwiesen haben, um einen pH-Wert von über 12 aufrechtzuerhalten, gehören stark basische Verbindungen, wie Lithiumhydroxid, Calciumhydroxid, Mischungen hiervon und dgl.. Als besonders vorteilhat hat sich Lithiumhydroxid erwiesen, das leicht aus wäßrigen Beschichtungsansätzen zur Beschichtung verwendet werden kann und das sich, wenn es mit einem geeigneten alkalischen schützenden Polymeren vermischt wird, wie es in der US-PS 4 132 528 beschrieben wird, als bemerkenswert stabil erwiesen hat und einen hohen Alkalinitätsgrad aufrechtzuerhalten vermag. Natürlich lassen sich auch andere im wesentlichen natriumfreie stark basische Verbindungen im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwenden.
  • Wie bereits dargelegt, läßt sich das Verfahren dieser Erfindung auch mit einem trockenen analytischen Element durchführen. Im einfachsten Falle kann das Element aufgebaut sein aus einem absorbierenden Trägermaterial, z.B. einem dünnen Blatt eines selbsttragenden absorbierenden oder saugfähigen Materials, wie beispielsweise Filterpapier oder Streifen, welche die analytische Zusammensetzung dieser Erfindung enthalten. Das Element kann in zwei oder mehr diskrete Zonen unterteilt sein, mit verschiedenen Reagenzien, die in verschiedene Zonen des Trägermaterials eingearbeitet werden. Derartige Elemente sind als Teststreifen bekannt, als diagnostische Elemente, Tauchstreifen oder diagnostische Mittel.
  • Geeignete absorbierende Trägermaterialien sind unlöslich und behalten ihre strukturelle Integrität bei, wenn sie der Einwirkung von Wasser oder biologischen Flüssigkeiten, wie Blut oder Serum, ausgesetzt werden. Geeignete Elemente lassen sich herstellen aus Papier, porösen, teilchenförmigen Strukturen, porösen polymeren Filmen, Cellulose, Glasfasern, gewebten und nichtgewebten textilen Gebilden (synthetischer und nichtsynthetischer Natur) und dgl.. Geeignete Materialien und Verfahren zur Herstellung solcher Elemente sind bekannt und werden beispielsweise beschrieben in den US-PS 3 092 465; 3 802 842; 3 915 647; 3 917 453; 3 936 357; 4 248 829; 4 255 384; 4 270 920 und 4 312 834.
  • Vorzugsweise ist das absorbierende Trägermaterial des trockenen analytischen Elementes dieser Erfindung eine poröse Ausbreitzone. Diese Zone kann selbsttragend sein (d.h. sie besteht aus einem Material, das stark genug ist, um seine Integrität beizubehalten), vorzugsweise befindet sie sich jedoch auf einem separaten Träger. Solch ein Träger kann aus irgendendeinem dimensionsstabilen und vorzugsweise nichtporören und transparenten (d.h. für Strahlung durchlässigen) Material bestehen, das elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge zwischen 200 und 900 nm durchläßt. Ein Träger der Wahl für ein spezielles Element sollte verträglich sein mit der Art der Reflexionsspektroskopie der Kolorimetrie. Geeignete Träger lassen sich herstellen aus Papier, Metallfolien, Polystyrol, Polyestern, Polycarbonaten, Celluloseestern und anderen bekannten Materialien.
  • Die poröse Ausbreitzone kann hergestellt werden aus einem beliebigen geeigneten fasrigen oder nicht-fasrigen Material oder Mischungen von einem oder beiden. Das Porenvolumen und die durchschnitttliche Porengröße dieser Zone können sehr verschieden sein, je nach dem beabsichtigten Verwendungszweck.
  • Geeignete Ausbreitzonen lassen sich herstellen unter Verwendung fasriger Materialien, entweder vermischt mit einem geeigneten Bindemittel oder zu einem textilen Gebilde verwebt, wie es beispielsweise beschrieben wird in der US-PS 4 292 272, unter Verwendung von polymeren Zusammensetzungen oder teilchenförmigen Materialien, beispielsweise Blush- Polymeren, wie sie beschrieben werden in der US-PS 3 992 158, unter Verwendung von Kügelchen, die mit oder ohne Kleb- Bindemittel zusammengehalten werden, wie es näher beschrieben wird in den US-PS 4 258 001 und 4 430 436 und der Japanischen Patentpublikation 57(1982)-101760. Wünschenswert ist, daß die Ausbreitzone isotrop porös ist, was bedeutet, daß die Porosität in jeder Richtung in der Zone die gleiche ist, was bewirkt wird durch miteinander verbundene Räume oder Poren zwischen den Teilchen, Fasern oder polymeren Strängen.
  • Die Elemente können zwei oder mehrere diskrete Zonen aufweisen, entweder in der gleichen Schicht oder übereinander angeordnet. Mindestens eine der Zonen ist vorzugsweise eine poröse Ausbreitzone. Die anderen Zonen können Reagenszonen sein oder Registrierzonen, wie sie bekannt sind, zusätzliche Ausbreitzonen, die Strahlung blockierende Zonen oder Filterzonen, Haftzonen und Trennzonen. Die Zonen befinden sich im allgemeinen in fluidem Kontakt miteinander, was bedeutet, daß Flüssigkeiten, Reagenzien und Reaktionsprodukte (z.B. Farbstoffe) transportiert werden können zwischen übereinander angeordneten Bereichen von benachbarten Zonen oder diese passieren können. Mit anderen Worten, wird das Element mit einem Fluid in Kontakt gebracht, so werden alle Reagenzien der analytischen Zusammensetzung dieser Erfindung miteinander vermischt und können sich leicht innerhalb des Elementes als Zusammensetzung bewegen. Vorzugsweise besteht jede Zone aus einer separat aufgeschichteten Schicht, obgleich zwei oder mehrere Zonen separate Bereiche in einer einzelnen Schicht des Elementes ein können. Abgesehen von den oben erwähnten Literaturstellen, werden geeignete Element-Komponenten ferner beispielsweise beschrieben in den US-PS 4 042 335; 4 132 528 und 4 144 306.
  • Bei ihrer Verwendung wird auf die bevorzugten mehrschichtigen Elemente eine Probe der zu analysierenden Flüssigkeit aufgebracht. In typischer Weise hat ein Element einen solchen Aufbau, daß eine aufgebrachte Probe in Kontakt mit einer Ausbreitschicht gelangt, bevor sie auf die Reagenzschicht gelangt, wobei sie zunächst in Kontakt mit einer solchen Ausbreitschicht an deren Oberfläche gelangt, die am weitesten von der Reagenzschicht entfernt ist. Da eine analytische Genauigkeit der vorliegenden Elemente nicht wesentlich vermindert wird durch Unterschiede im Volumen der aufgebrachten Proben, kann ein Aufbringen der Probe durch Hand oder maschinell erfolgen. Aus Gründen der Einfachheit der Bestimmung eines analytischen Ergebnisses jedoch, kann eine gewisse Übereinstimmung des Probenvolumens wünschenswert sein.
  • Bei einem typischen analytischen Verfahren unter Verwendung der Elemente, das manuell oder auf automatischem Wege durchgeführt werden kann, wird das Element einer Vorratsrolle entnommen, einem Chippaket oder einer anderen Lieferquelle und in eine solche Position gebracht, daß es einen freien Tropfen, einen Kontakt-Spot oder eine andere Form der Flüssigkeitsprobe, z.B. von einem geeigneten Spender aufzunehmen vermag. Nach der Aufbringung der Probe und in wünschenswerter Weise, nachdem die Flüssigkeitsprobe von der Ausbreitschicht aufgenommen worden ist, wird das Element einer Konditionierung unterworfen, wie einem Erhitzen, einer Befeuchtung o.dgl., was wünschenswert sein kann, um die Gewinnung eines Testergebnisses zu beschleunigen oder in anderer Weise zu erleichtern.
  • Nachdem das analytische Ergebnis in Form einer feststellbaren Veränderung erhalten worden ist, wird es gemessen, normalerweise dadurch, daß das Element durch eine Zone geführt wird, in welcher eine geeignete Vorrichtung für eine spektrophotometrische Reflexions- oder Transmissionsmessung vorgesehen ist. Eine solche Vorrichtung dient dazu, um einen Energiestrahl, z.B. einen Lichtstrahl durch den Träger und die Reagensschicht zu leiten. Das Licht wird dann reflektiert, z.B. von einem opakmachenden Mittel in der Ausbreitschicht oder einer die Strahlung blockierenden Schicht im Element, zurück zu einer Meßstelle oder gelangt durch das Element zu einem Detektor, im Falle einer Transmissionsbestimmung. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das analytische Ergebnis in einem Bereich des Elementes ermittelt, der sich vollständig innerhalb des Bereiches befindet, in dem das Ergebnis erzeugt wird. Ganz allgemein hat sich elektromagnetische Strahlung im Bereich von 400 bis 700 nm als geeignet für derartige Messungen erwiesen, obgleich jede Strahlung, für die das Element durchlässig ist und die dazu geeignet ist, die feststellbare, im Element erzeugte Veränderung zu quantifizieren, verwendet werden kann. Verschiedene Kalibriertechniken können angewandt werden, um die Analyse zu überwachen. Beispielsweise kann eine Probe einer Standard-Analytlösung, benachbart zu dem Bereich aufgebracht werden, auf den der Tropfen der Probe aufgebracht wird, um die Verwendung von Differentialmessungen bei der Analyse zu ermöglichen.
  • Die Elemente der Erfindung können ferner ein oder mehrere andere Zusätze enthalten, die üblicherweise in die Elemente eingebracht werden, zum Zwecke der Erzielung verschiedener Herstellungs- und Benutzungsvorteile. Zu derartigen Zusätzen gehören oberflächenaktive Mittel, Puffersubstanzen, Lösungsmittel, Härtungsmittel und andere Materialien, die bekannt sind.
  • Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen.
    • Beispiel 1
  • Das Verfahren dieser Erfindung wird veranschaulicht unter Verwendung eines mehrschichtigen analytischen Elementes mit einem Pyridyl-Azofarbstoff in der Reagensschicht und einem Cu&spplus;²-Salz in der Ausbreitschicht. Das Element wurde, wie in der US-PS 4 357 363 beschrieben, hergestellt. Struktur eines Elementes für die Bestimmung von Protein in einer Cerebrospinal-Flüssigkeit Geeigneter Bereich g/m² Ausbreitschicht Poly[m+p]-vinyltoluol (64:36)-co-t-Butylstyrol-co-Methacrylsäure] (20-40u) Poly(N-isopropylacrylamid) (Bindemittel) PVP K-90 (Bindemittel) TX-100 (Oberflächenaktives Mittel) Cu&spplus;²-(Ethylacetoacetat)&sub2; (Kupferlieferant für Farbstoff) Reagensschicht Poly(acrylamid-co-N-Vinyl-2-pyrolidon) (50:50) (Bindemittel) LiOH (Puffer) Zonyl FSN (Handelsbezeichnung) (Oberflächenaktives Mittel) 2-Amino-3-hydroxy-5-N&sub1;-phenylsulfanyl-6-[2¹-hydroxy-4¹-nitro]phenylazo-pyridin
  • Das beschriebene Element wurde unter Verwendung einer Anzahl verschiedener wäßriger Flüssigkeiten mit bekannten Mengen an Protein getestet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt. Tabelle I Mittel Bezugswert (mg/dl) Anzahl von Versuchen Vorbestimmter Wert (mg/dl) Präzision (Prozent CV) DR = Reflexions-Dichte bei 670 nm Vorbestimter Wert = Proteinkonzentration, wie bestimmt durch die Ergebnisse der Kalibrierung gegen den Referenz-Wert CV = Variationskoeffizient.
  • Die oben angegebenen Ergebnisse zeigen, daß das Element einen guten dynamischen Bereich und eine gute Präzision bei der Bestimmung von proteinkonzentrationen aufweist. Die Standardabweichung bei 40 mg/dl betrug 1,5 mg/dl. Die oben angegebenen Daten zeigen ferner, daß die Empfindlichkeit des Elementes im normalen Bereich bei 0,195 DR/100 mg/dl liegt. Der normale Bereich ist die Konzentration des Proteins, die im Serum normaler Subjekte gefunden wird. Dieser Bereich liegt bei 15 bis 45 mg/dl. Dies entspricht einer etwa 30mal größeren Empfindlichkeit gegenüber der Empfindlichkeit der bekannten Biuret-Technik für die Bestimmung von Gesamtprotein.
  • Bei den durchgeführten Untersuchungen, die in Tabelle I angegeben sind, erfolgten sämtliche kolorimetrischen Ablesungen 5 min nachdem die Probe bei jedem Test zunächst auf die Ausbreitschicht des Elementes aufgebracht worden war. Diese 5 min währende Inkubationsperiode wurde als ausreichende Zeit befunden für den Ablauf der beteiligten chemischen Reaktionen und die Ausbildung einer ausreichend stabilen Farbdichte, um genaue und präzise Messungen der Proteinspiegel in jeder zu testenden Probe durchführen zu können.
    • Beispiel 2
  • Unter Verwendung des Elementes von Beispiel 1 wurden ferner Untersuchungen mit menschlichem Serumalbumin durchgeführt, das ein Molekulargewicht von 60000 hatte und menschlichem Gamma-Globulin mit einem Molekulargewicht von 150000. Es wurde gefunden, daß beide Proteine zur gleichen Veränderung der Reflexionsdichte für jedes mg/dl Protein führte. Dies bedeutet, daß Proteine von verschiedenem Molekulargewicht die gleiche Reaktivität zeigten. Infolgedessen messen das Verfahren und die analytischen Elemente der Erfindung die Konzentration aller Proteine mit der gleichen Präzision und Genauigkeit.

Claims (12)

1. Kolorimetrische Methode zur quantitativen Bestimmung von Protein mit der Stufe des Vermischens einer wäßrigen, das Protein enthaltenden Probe mit einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von über 12, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Medium enthält:
i) ein Cuprisalz und einen Pyridyl-Azofarbstoff; oder
ii) einen vorgebildeten Cupri-Pyridyl-Azofarbstoff-Komplex.
2. Methode nach Anspruch 1, in der der Farbstoff der folgenden Struktur entspricht
worin
R für einen Elektronendonor steht;
R¹ darstellt H, OH, NH&sub2; oder Dialkylamino;
R² steht für H, NH&sub2; oder OH;
R³ bedeutet: H oder C&sub6;H&sub5;NHSO&sub2;, CH&sub3;SO&sub2;, Cl, Br, oder CN;
R&sup4; darstellt: H, (CH&sub3;)&sub2;NSO&sub2;,OH,NO&sub2; oder Dimethylamino, oder R&sup4; gemeinsam mit R&sup5; und den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, eine ankondensierte Phenylgruppe.
3. Methode nach Anspruch 2, in der R für OH, NH&sub2; oder COOH steht.
4. Methode nach Anspruch 1, 2 oder 3, in der der Farbstoff der folgenden Formel entspricht:
und das Cuprisalz gleich Cu&spplus;²(Ethylacetoacetat)&sub2; ist.
5. Analytisches Element für die Bestimmung von Protein in einem wäßrigen Medium mit einem absorbierenden Material, das enthält:
i) ein Cuprisalz und einen Pyridyl-Azofarbstoff oder einen vorgebildetenen Cupri-Pyridyl-Azofarbstoff-Komplex und
ii) eine basische Zusammensetzung, die einen pH-Wert von über 12 zu erzeugen vermag, wenn das absorbierende Material mit einem wäßrigen Medium in Kontakt gebracht wird.
6. Mehrschichtiges analytisches Element zur Bestimmung von Protein in einem wäßrigen Medium mit
i) einem Träger, auf den aufgetragen sind
ii) eine Ausbreitschicht,
iii) ein oder zwei Reagensschichten in fluidem Kontakt mit der Ausbreitschicht; und
iv) einem Cuprisalz und einem Pyridyl-Azofarbstoff oder einem vorgebildeten Cupri-Pyridyl-Azofarbstoff-Komplex und einer basischen Zusammensetzung, die einen pH-Wert von über 12 zu erzeugen vermag, worin
das Salz und der Farbstoff in der gleichen Schicht oder verschiedenen Schichten untergebracht sein können.
7. Element nach Anspruch 6, in dem sich das Cuprisalz in der Ausbreitschicht befindet und der Pyridyl-Azofarbstoff in der Reagensschicht.
8. Element nach Anspruch 6, in dem der Farbstoff und das Cuprisalz oder ein vorgebildeter Cupri-Pyridyl-Azofarbstoff- Komplex in der Reagensschicht untergebracht sind.
9. Element nach einem der Ansprüche 5 bis 8, in dem der Pyridyl- Azofarbstoff der folgenden Struktur entspricht:
worin
R für einen Elektronendonor steht;
R¹ darstellt H, OH, NH&sub2; oder Dialkylamino;
R² steht für H, NH&sub2; oder OH;
R³ bedeutet: H oder C&sub6;H&sub5;NHSO&sub2;, CH&sub3;SO&sub2;, Cl, Br, oder CN;
R&sup4; darstellt: H, (CH&sub3;)&sub2;NSO&sub2;,OH,NO&sub2; oder Dimethylamino, oder R&sup4; gemeinsam mit R&sup5; und den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, eine ankondensierte Phenylgruppe.
10. Element nach einem der Ansprüche 5 bis 9, in dem das Cuprisalz Cu&spplus;²(Ethylacetoacetat)&sub2; ist und der Farbstoff der folgenden Formel entspricht:
11. Element nach einem der Ansprüche 5 bis 10, in dem die basische Zusammensetzung eine Mischung aus Lithiumhydroxid und Poly(acrylamid-co-N-vinyl-2-pyrolidon) ist.
12. Element nach einem der Ansprüche 5 bis 11, mit 0,02 bis 0,3 g/m² des Kupfersalzes und 0,02 bis 0,3 g/m² des Pyridyl- Azofarbstoffes.
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