JP3368279B2 - 血液凝固検定を行うためのテスト物品及び方法 - Google Patents

血液凝固検定を行うためのテスト物品及び方法

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    • C12Q2337/20—Coumarin derivatives
    • C12Q2337/22—7-Amino-4-methylcoumarin, i.e. AMC, MCA

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 1. 発明の分野 本発明は、一般的に血液凝固テスト、そしてさらに特
に、テスト物品であってこのような検定及びそのテスト
物品からの蛍光又は他の可視シグナルの生成に頼る方法
に必要な試薬を含んで成るテスト物品に関する。
血液凝固テストは、外科手術を経験した患者の出血可
能性の測定及び血塊（blood clots）を防ぐための抗−
血液凝固治療を経験した患者の監視を含む様々な目的の
ために、行われることができる。様々な血液凝固テスト
が現在使用されている。最も一般的なものの１つは、外
因性血液凝固経路の誘導に頼る“プロトロンビン時間”
（PT）テストであり、そして他のものは、内因性血液凝
固経路の誘導に頼る“活性化部分トロンボプラスチン時
間”（APTT）テストである。外因性及び内因性血液凝固
経路の両方が、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換
を触媒するタンパク質分解酵素であるトロンビンの生産
をもたらす。このような変換は、血塊化機構における本
質的な機能である。便利には、トロンビン生産は、トロ
ンビン解裂により活性化されたレポーター分子に解裂可
能な状態で結合された合成トロンビン基質ペプチドに患
者の血液サンプルを晒すことによりモニターされること
ができる。レポーター分子は、観察可能な変化、例え
ば、着色生産物又は蛍光を作り出し；そして（血液凝固
能力の尺度である）トロンビン活性が光学的手段により
評価される。
これまで、このような血液凝固テストは、複雑である
傾向を有しており、実施が一般的に臨床的な実験室に限
定されていた。このような集中的なテストは外科手術患
者に適当であることができるけれども、抗−血液凝固治
療をモニターするために規則的に医院又はクリニックを
訪ねることは、ほとんど受入れられていない。このよう
に便利且つ実用的な家庭用の（practical home）血液凝
固モニタリング・テストの必要性は、明らかである。
しかしながら、患者自身により実施される程十分に簡
単である血液凝固テストを案出することにおける技術的
挑戦が、実質的なものである。テストは、非常に簡単
で、低コストで、丈夫でなければならず、そして広く変
化する容量の全血による使用を許容しなければならな
い。家庭環境における血液サンプリングは、一般的に、
（指がスプリング−装填装置上に載せられた小さな針に
より刺されるような）“フィンガースティック（finger
stick）”法に限定されており、それは、一般的に５か
ら30μｌまでである比較的非制御の全血容量を作り出
す。さらに、血液凝固テストが室温において行われるこ
とができる場合に、骨の折れる温度制御装置の必要性を
取り除くことが望ましいであろう。
首尾よい家庭の血液テストは、他の化学物質、例え
ば、コレステロール及びグルコースのためには案出され
ている。家庭的使用に最も好適な装置の中には、所望の
分析を行うために適当に含浸された領域をもつ吸収材料
の層を含んで成る“テスト・ストリップ（test strip
s）”が在る。例えば、Lifescan,Inc.,Milpitas,Califo
rniaから入手可能な血液グルコース分析を行うためにテ
スト・ストリップは、適用された血液中のグルコース・
レベルに応答する発色反応を作り出す浸潤試薬をもつポ
リアミド膜に１滴の血液を適用することに頼っている。
血液凝固能力を測定するための等価なテスト装置は全く
開発されていない。血液凝固を測定するための特定のテ
スト物品が提案されているけれども、最も簡単なもので
さえ、血液の前もって測定された容量が適用されなけれ
ばならない多層を使用する。
血液凝固経路の性質は、単層テスト・ストリップ血液
凝固検定の実行を問題の多いものにしている。血液凝固
は、一連の複雑且つよく分かっていない酵素反応であっ
て表面界面効果に高く感度のあるものを含んでいる。さ
らに、特定の材料との血液の接触は、その血液凝固経路
の誘導に必要な酵素を失活させることができる。したが
って、ほとんどの先の血液凝固検定は、上記血液凝固経
路の不注意の活性化又は阻害の見込みを減少させるため
に最小の表面積をもつ容器を使用している。これに反
し、テスト・ストリップ検定は、一般的に、非常に大き
な表面積をもつ高く細孔性の材料内において行われる。
したがって、このようなテスト・ストリップ膜は、一般
的に、血液凝固検定における使用のために禁忌を示され
るであろう。
先の理由のために、患者の血液凝固能力を測定するた
めの単純化されたテスト物品及び方法を提供することが
望ましいであろう。このテスト物品及び方法は、訓練を
受けていない患者により、特に家庭内にある患者自身に
よりテストが行われることを許容するのに十分に簡単で
且つ信頼できるものでなければならない。好ましくは、
このテストは、１段階だけ、例えば、血液の滴をテスト
物品に適用し、その後そのテスト結果を自動的に読むこ
とを必要としなければならない。テストは、血液サンプ
ル容量における変化に感受性であってはならず、そして
最小の温度制御又は温度制御を全く伴わずに行われるこ
とができなければねらない。特に、テスト・ストリップ
が測定される血液凝固経路に対し実質的に全く効果を及
ぼさない細孔性膜テスト・ストリップを使用するテスト
物品及び方法を提供することが望ましいであろう。
2. 背景技術の説明 血液凝固検定における使用に好適なトロンビン基質
は、米国特許第3,884,896号及び第4,640,893号中に記載
されている。カルシウム分離から生じる改善された安定
性をもつトロンボプラスチンの錠剤形態が、米国特許第
4,755,461号中に記載されている。液相血液凝固検定に
有用なトロンボプラスチン及びトロンビンから成る乾燥
試薬は、米国特許第4,458,015号中に記載されている。
吸光反応を作り出す試薬に含浸された不活性の細孔性
マトリックスから成る、血液中のグルコースを測定する
ための検定装置が、米国特許第4,935,346号中に記載さ
れている。血液サンプルは、マトリックスの１つの側に
適用され、そして反射率がその反対側上で測定される。
この装置内で使用される膜は、赤血球を破壊（溶解）す
る傾向にある。これは、高レベルのヘモグロビンを膜の
内部に浸透させ；そして高レベルのヘモグロビンがマト
リックスの反対側上で観察されることができる。この'3
46特許は、分析物、例えば、グルコースについては、こ
の効果は、この放出されたヘモグロビンの優勢なスペク
トル上で区別されることができるスペクトルの性質をも
つ光学シグナル作る特定の化学物資を使用し、そしてヘ
モグロビンのスペクトルを補正する２波長光学装置によ
る結果を読むことにより、克服されることができる。こ
のようなアプローチは、非常にデリケートな且つヘモグ
ロビン感受性のトロンビン支持体の血液凝固化学のため
には、役に立たないであろう。血液グルコース、コレス
テロール、及び尿素の測定に好適な他の検定装置は、米
国特許第4,774,192号中に記載されている。必要な試薬
は、不斉膜であることができる構造物、例えば、細孔性
膜又は水分を吸収し易いフィルム内に含浸されている。
この'192号特許は、構造物内のサンプル分布を制御する
ための流れ制御剤の使用についても示唆している。
米国特許第4,861,712号、第4,910,510号、及び第5,05
9,525号は、血液凝固をモニターするのに好適な多層テ
スト物品について記載している。この'712号特許は、繊
維状材料、及びその繊維状材料をコートし且つ含浸する
水溶性非イオン性ポリマーから成る複雑な構造について
記載している。この構造は、トロンボプラスチン及び検
出可能なトロンビン基質を含むことができ、そしてトロ
ンビン時間を含む多数の血液凝固パラメーターをモニタ
ーするのに有用である。
上記の'525号特許は、担体材料を含む血液凝固テスト
のための複雑な乾燥試薬について記載しており、そして
その中で：プロトロンビン（又は因子VII−Ｘ）に応答
性のプロテアーゼ、発色性プロテアーゼ基質、バッファ
ー、及び第二の血液凝固因子が乾燥されている。この乾
燥試薬中にプロテアーゼを含むことは、血液凝固因子、
例えば、因子Ｘであって、それらの酵素活性が測定され
ることができる前にタンパク質分解解裂により最初に活
性化されなければんなないものについて検定を行うのに
有用である。
米国特許第4,756,884号は、トロンビン時間を含む血
液特性を測定するための毛細管流れ装置について記載し
ている。
発明に要約 本発明に従って、簡単なプロトコール及びフォーマッ
トを使用して血液凝固検定を行うためのテスト物品及び
方法を提供する。本テスト物品は、外因性又は内因性の
いずれかの血液凝固経路を開始させることができる血液
凝固開始剤により含浸された透過性膜、及び開始された
血液凝固経路の前選択成分による活性化の間に検出可能
なシグナルを作り出す基質を含んで成る。膜は、赤血球
を溶解しないものであるように選ばれ、そしてサンプル
適用側の反対の膜の光学監視表面側の直下の膜内部の少
なくとも一部からこれらの無傷の赤血球を排除すること
ができる。さらに、膜は、血液凝固経路の開始及び継続
の妨害を実質的に受けてはならず、特に経路の不活性化
又は偽の活性化を導くことができる経路の酵素及び他の
成分との表面相互作用を受けてはならない。このような
膜は、このような表面（相互作用）からそれ自体が自由
である材料から成ることができ、又は不所望の表面相互
作用を減少させるタンパク質又は他の基質によりコート
され又はブロックされる他の材料から成ることができ
る。好ましい膜は、ポリスルホンから成り、特に不斉ポ
リスルホン膜であることができる。
本発明の方法に従って、血液容量は透過性膜の１つの
外面に適用され、そこで、それが血液凝固開始剤及び基
質の存在中で膜の内部に吸収される。このように血液凝
固が開始され、そしてこの血液凝固経路の前選択成分の
生成が、基質の活性化が普通には膜の反対の外面上の検
出可能なシグナルを作り出すことを生じさせる。膜の細
孔寸法は、サンプルの赤血球細胞（erythrocytes）が適
用外面上又は付近で維持され、それらが検出可能なシグ
ナルの生成を妨害することができるであろう膜の観察外
面の直下にある内部の一部へ侵入しないように、選択さ
れる。そのうえ、膜の吸収容量は、それが、過剰の全血
を適用表面上に残しながら、分離された血液血漿の比較
的低い容量を受け入れるであろうように選ばれる。この
方法において、テスト物品が、非常に低いテスト容量に
さえ適合することができ、そしてテスト物品に適用され
た血液サンプルの実際の量は、決定的ではない。
テストの結果は、典型的に、典型的には蛍光性検出可
能シグナルの場合においては蛍光計を含んで成る自動化
検出装置又はテスト装置により読まれるであろう。自動
化検出装置は、普通には、適当な時間における又は適当
なテスト期間にわたる検出を許容するためのタイマーを
含んで成る制御回路、及び血液凝固の“値（value）”
を計算するための手段を含むであろう。普通には、制御
回路は、所定温度においてサンプルを維持するための温
度制御手段を含むであろう。あるいは、自動化検出装置
は、サンプル温度における変化を補正するために最初に
測定された血液凝固“値”を上方又は下方に調整するた
めに温度補正されることができる。
図面の簡単な説明 図１は、本発明の原理に従って構築されたテスト物品
の例示的態様の略図である。
図２は、本発明の原理に従って行われる血液凝固検定
において使用されるときにテスト物品からの結果を読む
のに有用なテスト装置のブロック線図である。
図３は、図１中に示したテスト物品及び図２中に示し
たテスト装置を使用した実験からの結果である。この実
験において、、正常のプロトロンビン時間をもつ全血サ
ンプルを、僅かに延長されたプロトロンビン時間をもつ
全血サンプル及びかなり延長されたプロトロンビン時間
をもつ全血サンプルと比較した。
特定の態様の説明 本発明のテスト物品は、典型的には、３μｌから50μ
ｌまでの、普通には５μｌから30μｌまでのレンジにお
ける小容量において血液を提供し、そして典型的には、
膜の反対側上の膜表面上で可視シグナルを検出すること
に好適な形態における細孔性膜を含んで成る。この膜
は、シート、ストリップ、ディスク、テープ（リー
ル）、等として形成されることができ、そして単一膜が
１以上のテストのために使用されることができる。多数
のテストのために使用されるとき、血液サンプルは、典
型的には、同時に又は逐次的にかのいずれかで、異なる
位置にスポットされるであろう。膜は、典型的には、非
常に薄く、普通には飽和に達するのに必要な血液血漿の
容量を限定するために0.1mmから0.3mmまでの厚さをも
つ。過剰な血液は、それが適用された膜表面上に維持さ
れ、典型的には0.5μｌから２μｌまでのレンジ内にあ
る望ましい容量の血漿のみが膜の内部に侵入するであろ
う。膜又はその選択部分が飽和された後、血液タンパク
質及びテスト試薬が比較的遅く拡散し、以降に詳細に説
明するようなテスト・プロトコールが行われることを許
容するであろう。
本発明の原理に従って構築された例示的テスト物品
（10）を、図１において説明する。このテスト物品（1
0）は、支持構造物（14）、典型的には、ユーザーによ
るテスト物品の操作を許容するためのハンドルの上に載
せられた細孔性膜構造物（12）を含む。テスト物品（1
0）は、細孔性膜（12）のアプリケーター外面（16）に
未測定の血液の滴を適用することにより使用される。血
液血漿の少なくとも一部が膜（12）内に吸収され、そし
て以降に記載するような膜内で開始される血液凝固の結
果として、検出可能なシグナルが膜のインジケーター外
面（18）上に作られ、そこで、そのインジケーター外面
が典型的には上記アプリケーター外面（16）に横方向に
向かい合っている。インジケーター外面（18）上で作ら
れた検出可能なシグナルは、ハンドル（14）を通して可
視化できるであろう。このハンドルは、透明であり、好
適な監視孔（図示せず）、等をもっている。検出可能な
シグナルの観察は、血液凝固反応の連続的な評価及び血
液サンプルの血液凝固能力の測定を可能にする。
細孔性膜構造物（12）は、親水性（水分を吸収す
る）、非膨潤性のポリマー・マトリックス材料であって
血液細胞、特に赤血球細胞を排除しながら、血液血漿及
びタンパク質の侵入を許容する細孔寸法をもつものから
成るであろう。膜は、ミクロン（μｍ）オーダーの幅を
もつチャンネルの曲がりくねったネットワークから成る
フォーム様構造をもつ単一の、連続性のポリマー材料か
ら成らなければならない。チャンネルの曲がりくねった
ネットワークは“密に詰まって”おり、その中では、チ
ャンネルの空の空間により占有された“空隙容量”が全
膜容量の程よいパーセンテージ、典型的には10％以上で
ある。全反応化学、及びその後のシグナル生成がこの空
隙容量内で生じるので、高い空隙容量が強いシグナルを
作るために望ましい。チャンネルの曲がりくねったネッ
トワークは、真っ直ぐで直線的な細孔（例えば、核孔膜
により得られた短い直線的な孔）よりも望ましい。なぜ
なら、より長い平均チャンネル長が、反応化学が生じる
膜の領域と、膜の表面上に残る過剰のサンプルとの間の
増加した隔離を作り出す傾向にあるからである。これ
は、適用されたサンプル容量における変化に感受性の乏
しい装置を与える助けになる。
以下に詳細に討議するように、細孔性膜構造物（12）
は、細孔性マトリックスの内部に侵入する血液血漿中の
血液凝固を誘導し、そして血液の血液凝固能力の指示と
して検出可能なシグナルを作り出すために必要な試薬に
より含浸されるであろう。細孔性膜（12）のポリマー・
マトリックス材料が、誘導されている血液凝固経路の妨
害から実質的に自由であることが本発明にとって特に決
定的なことである。特に、ポリマー・マトリックス材料
は、表面効果、相互作用、及び血液凝固を誘導し又は開
始された経路の成分、例えば、酵素を失活させることが
できる人工産物から自由でなければならない。血液凝固
経路の意図されていない開始は、偽陽性の測定を導き、
一方、酵素の失活は、偽陰性の測定を導くことができる
であろう。それ故、ポリマー・マトリックス材料が膜内
で生じる血液凝固反応に対する非促進又は削減効果をも
つことが重要である。
以下の基準を、膜が本発明のテスト物品及び方法にお
ける使用に許容されるかどうかを決定するために使用す
ることができる： A:膜は、膜の反対側の外面への赤血球の透過を排除する
細孔幾何及びサイズ分布をもたなければならない。
B:膜は、血液サンプルからの血漿が数秒以内、好ましく
は１−２秒間以内にその膜を完全に透過することができ
るように親水性であり（又は親水性になるように処理さ
れ）なければならない。
C:膜は、その膜に適用される全血が溶解しないように血
液細胞適合性であり（又は血液細胞適合性となるように
処理されるかのいずれかで）なければならない。さら
に、膜は、赤血球不含及びヘモグロビン不含血漿だけが
サンプル適用側の反対の膜の側に通過するように血漿か
ら血液細胞を分離する十分な能力をもたなければならな
い。赤血球不含及びヘモグロビン不含血漿を作り出すこ
の能力は、少なくとも30〜55％のヘマトクリット・レン
ジを超える、ヘマトクリットの有用なレンジを超えて持
続しなければならない。
D:膜は、外因性（又は内因性）血液凝固経路の進行を許
容するように十分に血液凝固中性であり（又は血液凝固
中性となるように処理され）なければならない。これ
は、実験的に、（実験セクション中に記載する）反応混
合物によりその膜を透過させ、乾燥させ、そして次に全
血又は血漿のサンプルにより再活性化することにより、
決定されることができる。多くの膜（Diminic−Hunter
Asypor,Pall corporation Biodyne“C",etc.）が、全体
として外因性（又は内因性）血液凝固経路をクエンチす
る。膜は、正常な血漿及び外因性経路（又は内因性経
路）因子欠損血漿の両方を許容し、首尾よく反応し、そ
して臨床的に正確な結果を作るように、十分に血液凝固
中性でなければならない。
E:膜は、約５から30マイクロリッターまでの凡その量の
レンジにある全血の変化容量により処理されるとき、そ
れが実質的に同様の結果を作り出すように容量抵抗性を
提供し（又は容量抵抗性を提供するように処理され）な
ければならない。
F:膜の光学的性質は、検定において使用される観察波長
と互換性でなければならない。例えば、膜の内因性蛍光
は、反応において使用されるトロンビン基質の蛍光より
優勢であってはならない。
G:膜は、製造の間の正常な加工に耐え、そして反応の経
過の間にテスト結果を変形することを回避するように乾
燥及び湿らせられたとき、十分に寸法的に安定でなけれ
ばならない。
実験セクションにおいてより詳細に討議するが、非常
に少ない膜のタイプがこれらのすべての基準に適合す
る。例として、ポリアミド膜、例えば、Pall Corporati
on Biodyne“A",“B"及び“C"シリーズは、テストＣを
満足しない。負電荷のポリアミド膜、例えば、Biodyne
“C"は、テストＣ及びＤの両方を満足しない。セルロー
ス・ベース不斉細孔性膜、例えば、Dominic Hunterによ
り製造されたAsyporシリーズは、テストＤを満足しな
い。ガラス繊維フィルター材料、例えば、Schlechter
＆ Schuell 34Gは、テストＥを満足しない。これらのす
べての基準に適合することが見つかった１つの非処理膜
タイプは、不斉ポリスルホン膜、例えば、Filterite/Me
mtecから入手可能なBTS−25 0.45μm Asymmetric polys
ulfone membraneである。しかしながら、他の好適な膜
は、先の基準を使用して同定されることができなかっ
た。
また、様々な他の膜材料が先に述べた特定の基準に適
合するように処理される限り使用されることができる。
例えば、全血サンプルよりもむしろ血漿サンプルによる
使用が望ましい場合には、ポリアミドが先に記載したよ
うに血液凝固中性を強化するようにブロックされること
ができる。典型的には、このようなブロッキングは、残
存試薬の導入に先立って又はそれと同時に好適なタンパ
ク質溶液により膜を前インキュベートすることにより達
成されることができる。
ポリマーのマトリックスの細孔寸法は、適用された血
液サンプルからの血液血漿及びタンパク質の吸収を許容
し、一方、細胞血液成分、特に、血液凝固検出化学を妨
害することが見つかっている赤血球細胞を排除するよう
に選ばれるであろう。マトリックスの細孔寸法は、一般
的に0.05μｍから５μｍまでのレンジ内に、典型的に
は、0.1μｍから1.0μｍまでのレンジ内にあるであろ
う。好ましい態様においては、細孔寸法は、不斉に配列
され、より大きな細孔が膜構造物（12）の適用外面（1
6）上に置かれ、そしてより小さい細孔がインジケータ
ー外面（18）上に置かれるであろう。このような不斉細
孔サイズ分布は有益である。なぜなら、それが、より大
きい細孔が血液が適用される表面に存在し、その膜内へ
の血液の速い侵入を容易にするからである。しかしなが
ら、膜の反対外面上のより小さな細孔は、血漿から赤血
球を分離し、そして光学的検出装置に赤血球及びヘモグ
ロビン不含血漿を提示する。好ましくは、膜構造物（1
2）のアプリケーター外面（16）上の細孔寸法は、２μ
ｍから50μｍまでのレンジ内にあるであろうし、そして
インジケータ外面（18）上では、0.1μｍから1.0μｍま
でのレンジ内にあるであろう。
ポリマー・マトリックス材料は、非膨潤性であろう。
すなわち、マトリックスは、普通には、水溶液、例え
ば、血液血漿に晒されたときに実質的には変形されず、
したがってその元の立体形状及びサイズを保持するであ
ろう。典型的には、細孔性膜構造物（12）の容量におけ
る変化は、血液血漿又は他の水性媒質に晒される間、20
％未満、好ましくは10％未満であろう。
上記の要求のすべてに適合する特に好ましいポリマー
・マトリックス材料は、Filterite−Memtec.Memtec Ame
rica,9690 Deeveco Road,Ste.7,Timonium,MD 21093から
入手可能な0.45μｍの不斉ポリスルホン膜材料である。
この好ましい材料は、カタログ番号BTS−25 mediaであ
る。
本発明の血液凝固検定を行うために必要な化学試薬
は、すぐ上に記載したポリマー・マトリックス材料内に
含浸される。必要試薬は、外因性又は内因性血液凝固経
路のいずれかにおいて前選択事件又は段階を開始させる
血液凝固開始剤、及び血液凝固経路のその後の段階にお
いて作られる成分により活性化される基質を含む。ま
た、バッファーは、血液凝固経路に適合するレンジ内で
テストpHを維持するために提供されるであろうし、そし
て付随的な試薬は、膜に浸入する血液タンパク質の発色
団分離を減少させる流れ制御剤、血液凝固経路の化学反
応を持続させ又は強化する補因子、安定性エンハンサ
ー、及びテスト物品の光学特性を強化する顔料を含む。
典型的には、これらの試薬は、ポリマー・マトリックス
材料のすべて又は一部に適用される（先に記載した膜ブ
ロキング剤をさらに含んで成ることができる）１以上の
水溶液中で併合されるであろう。次に、マトリックス材
料が、その中で非共有結合により吸着される試薬をもつ
テスト物品を作るために乾燥又は凍結乾燥され（そして
場合によりハンドル（14）上に載せられ）ることができ
る。幾つかの場合においては、少なくとも幾つかに試薬
を共有結合により付着させることが可能である。但し、
共有結合による付着は、普通には必要でないであろう。
このように調製したテスト物品を、直ぐに使用し又は
その後の使用のために保存することができる。吸収され
た試薬は、血液サンプルを適用することにより再構築さ
れ、これは、血液血漿が細孔性膜マトリックスの内部に
侵入し、そしてその試薬を湿らせることを生じさせる。
様々な好適な血液凝固開始剤を使用することができ
る。これらの開始剤は、医薬テストのために一般的に使
用される標準点において血液凝固経路の引き金を引くで
あろう。例えば、外因性血液凝固経路の開始剤は、因子
Ｘを活性化するために因子VIIとカルシウムと結合する
であろう。内因性血液凝固経路開始剤は、因子XIIを活
性化し、次に因子XIを活性化するであろう。外因性血液
凝固経路の好適な開始剤も、本技術分野においてよく知
られており、そしてエラグ酸（ellegic acid）、カオリ
ン、シリカ、等を含む。これらの及び他の開始剤の記載
は、Laboratory Evaluation of Hemostasis and Thromb
osis（Third Edition）,1983,Marjorie S.Sirridge and
Reaner Shannon,lea ＆ Febiger,Philadelphia;及びHe
mostasis and Thrombosis,a conceptual approach（Sec
ond Edition）,1983,Jack Hirsh and Elizabeth Brain,
Churchill Livingstone,New York（この開示を、引用に
より本明細書中に取り込む。）中に提供されている。選
択された血液凝固開始剤は、血液血漿の予想サンプル容
量において血液凝固を開始させるのに十分な量において
マトリックスに適用されるであろう。例えば、トロンボ
プラスチンの好適な量は、血液血漿中で再構築されると
き、100mg/lから10g/lまでのレンジ内の濃度を提供する
のに十分なものであろう。
血液凝固反応をモニタリングするのに好適な基質は、
外因性及び内因性血液凝固経路の両方において最終事件
として作られるトロンビンにより活性化される特定の誘
導ペプチドを含む。このペプチドは、リポーター分子、
例えば、発色性の、化学発光性の、又は蛍光性の分子に
解裂可能な状態で結合する。トロンビンは、このペプチ
ドを認識し、解裂可能なリンカーを解裂させ、そして検
出可能なシグナル、例えば、色の変化、光放射、又は蛍
光をもたらすリポーター分子の光学特性における変化を
引き起こす。多くの好適なトロンビン基質ペプチドが、
米国特許第3,884,896号；第4,070,245号；及び第4,169,
051号（これらの開示を、全体として引用により本明細
書中に取り込む。）中に記載されている。これらの基質
ペプチドは、一般的に（常にではないが）、Ｂ−Ｘ−Ｙ
−Arg−NH−Ｒ｛ここで、Ｂがブロッキング基であり、
Ｘ−Ｙがジペプチド（しばしば、Val−Pro、Gly−Pro、
Phe−Val、等）であり、そしてＲが加水分解可能なNH結
合によりペプチドに結合したリポーター分子である。｝
を有する。典型的には、Ｒは、NH結合がトロンビンによ
り加水分解された後にその光学状態を変化させるであろ
う。例示的な基質ペプチドは、７−アミド−４−メチル
クマリン・リポーター分子に結合したＮ−ｔ−Boc−Val
−Pro−Argである。この基質は、Sigma Chemical Compa
ny,St.Louis,MOから商業的に入手可能である。
特に好ましいのは、蛍光生成性リポーター分子、例え
ば、７−アミド−４−メチルクマリン、ローダミン11
0、アミノキノリン、アミノナフタレン、ベンゾフラザ
ン、アクリジン、等の使用である。本発明において使用
される細孔性膜のポリマー・マトリックス材料は、典型
的には、非常に薄く、先に記載したように普通には0.1
から0.3mmまでのレンジ内にあるであろうし、これは、
多くの発色性基質を使用するときクリアな色シグナルを
提供するのに不十分な光学経路を定めている。発色性基
質により、検出のための十分なレベルに達した色を増加
させるために、膜内の基質濃度を非生理学的なレベルに
増加させることがしばしば必要である。このような高い
基質濃度、典型的には、10-4以上は、トロンビンのため
の正常なフィブリノーゲン基質の濃度よりも有意に高
く、そして血液凝固経路を妨害する傾向をもつ。さら
に、このような高い基質レベルは、トロンビン酵素が完
全に変換されるための実質的な時間を要する。これらの
効果は、本検定の臨床的な使用を格下げする傾向にあ
る。10-4を下回る基質濃度を使用することにより、これ
らの効果を回避することができ、そして優れた結果を得
ることができる。蛍光リポーター分子を使用することに
より、強いシグナルが10-4Mを下回る、典型的には、10
-5M以下の基質濃度により得ることができることがここ
に発見された。
血液凝固経路に適合するpHを提供するために、ポリマ
ー・マトリックス材料内にバッファーを含浸する。特に
好適なのは、pHがそのマトリックスに依存して約７から
８まで変化するであろうTrisバッファーである。約7.5
においてpHを維持するバッファーが好ましいポリスルホ
ン不斉膜材料及び外因性経路のために好ましい。
血液凝固補因子、例えば、カルシウムを、血液凝固経
路を持続させるために使用することができる。特に、カ
ルシウム・キレート剤により前もって抗血液凝固された
血液サンプルをテストするとき、カルシウムを、塩化カ
ルシウムの形態で、使用することが必要であることがで
きる。カルシウムが必要である場合、試薬の安定性の特
徴を、物理的に分離されるか又はマイクロカプセル化さ
れるかのいずれかにより、膜内のトロンボプラスチンか
らそれを単離することにより改善することができる。
流れ制御剤も、血液血漿の粘度を増加させ、そして反
応成分のクロマトグラフィー分離を限定するために膜内
に含浸されることができる。好適な流れ制御剤は、高分
子量のポリマー、例えば、ヒドロキシプロピルセルロー
ス、ポリビニル・アルコール、等を含む。さらに、マト
リックス内の顔料の包含は、蛍光の放射を強化すること
ができる。好適な顔料は、小さな、光散乱粒子の材料で
あって血液凝固経路を妨害しないものを含む。好適な顔
料は、商標名RopaqueTMOP−84の下で、Rohm ＆ Haas Co
mpany,Philadelphia,PAから入手可能なスチレン−アク
リル・コポリマー粒子から成ることが見つかった。
単一のプロトロンビン時間検定を行うことを意図され
たポリマー・マトリックス材料の部分に含浸される様々
な試薬の例示的な量は以下のようである。
試薬の取り込み 試薬 広いレンジ 狭いレンジ トロンボプラスチン 0.1g/L〜12g/L 3g/L〜9g/L 基質 10-7M/L〜10-3M/L 10-5M/L〜10-4M/L BSA ０〜200g/L 50〜150g/L CaCl2 ０〜2x10-2M/L ０〜1x10-2M/L ヒドロキシプロピル−セルロース ０〜100g/L 25g/L〜75g/L Ropaque TM OP−84 ０〜10％ ０〜10％ Trisバッファー pH7.0〜pH8.3 pH7.2〜pH7.8 使用においては、典型的にフィンガー・スティック装
置により得られた約５〜30μｌの容量をもつ血液サンプ
ルを、細孔性膜構造物（12）のアップリケーション外面
（16）に適用する。サンプルを適用した後、テスト物品
（10）を、血液凝固検定の結果を読むために自動検出装
置又はテスト装置（20）（図２）上に置く。蛍光テスト
物品（10）による使用に好適なテスト装置（20）は、光
源（22）、フィルター素子（24）、及び光検出装置（2
6）を含む。光源（21）は、基質の活性化蛍光リポータ
ー分子において蛍光を誘導するために好適な励起波長に
おける光（22）を作り出す。蛍光は、励起波長に集中し
た好適なバンドについて選択性であるフィルター（24）
を通過する放射光（23）をもたらし、そのフィルターを
通過する光（25）は、検出装置（26）により検出され
る。リポーター分子として４−アミド−７−メチルクマ
リンを使用することを開示された例については、励起波
長は、典型的には、365nmであろうし、一方、検出波長
は、450nmであろう。しかしながら、より長い励起及び
放射波長をもつ他のリポーター分子も可能性がある。一
般的には、より長い波長が好ましい。なぜなら、光源の
コストが小さいからであり、そして検出の効率が改善さ
れることができるからである。テスト装置（20）は、さ
らに、望ましい血液凝固テスト・プロトコール、例え
ば、プロトロンビン・テスト（PT）、活性化部分トロン
ボプラスチン・テスト（APTT）、等に従って時間にわた
り検出装置（26）により検出される光の量を分析する制
御回路（28）を含む。普通には、この制御回路（28）
は、手動で、又は特定の事件、例えば、膜（12）への血
液の適用の結果として開始されることができるタイマー
を含むであろう。場合により、制御回路は、温度におけ
る変化がテスト結果を翻訳するときに考慮に入れられる
ことができるような温度測定能力を含むであろう。ある
いは、テスト装置（20）は、特定の温度、典型的には37
℃において血液を維持するための温度制御チャンバーを
含むことができるであろう。温度制御チャンバーが使用
されるとき、透明支持体材料上に試薬膜を載せ、そして
サンプルの適用前に望ましいテスト温度にこの支持体を
前平衡させることが遊離であろう。これは、適用された
サンプルが所望の温度に速く平衡化することを容易にす
る。場合により、カバーリング層を、速い温度安定化を
さらに容易にするためにサンプルの上に置くことができ
る。上記制御回路は、血液の血液凝固“値”を計算する
ために、さらに計算手段、例えば、マイクロプロセッサ
ーを含むであろう。プロトロンビン時間又は他の血液凝
固値を計算するための多くのアルゴリズムが可能であ
る。以下のものは、反応時間が遅い場合、室温（23℃）
において操作されるように設計された４分間経過プロト
ロンビン時間テストのために最適化された例である。蛍
光データを、10秒の時間点、すなわち、Ｆ（０）、Ｆ
（10）、Ｆ（20）・・・Ｆ（240）において採取する。
この配列Ｆ（ｔ）を、次に試薬のバッチの間の蛍光背景
及び強度における差異について補正するために正常化す
る。この正常化された値F'（ｔ）を、以下のように計算
する： 次に、F'（Ｔ）が最初に50％最大値に達する値ｔを、
F'（ｔ）時間点の間の線型補間により決定する。これ
を、T50として表す。最後に、プロトロンビン時間、PT
を簡単な適合により決定する： PT＝IT50 2＋nT50＋ｍ （２） ｛式中、ｎ、及びｍは、実験的に決定される。｝ 反応を、一定の温度段階において行う場合、温度補正
は、全く必要ない。反応を周囲温度において行う場合、
試薬の温度を、密接した熱伝対により測定し、そしてPT
時間をそれにより調整する。多数の温度調整アルゴリズ
ムも可能である。比較的簡単なものは以下のものであ
る： PT37＝PTambient−ａ（37−tempambient）PT2 ambient −ｂ（37−tempambient）PTambient−ｃ（37−tempambient） （３） ｛式中、Tambientは、（摂氏において測定された）試薬
ストリップの温度であり、PT37は、（37℃対照温度に調
整された）温度補正プロトロンビン時間であり、そして
PTambientは、式（２）から得られたPT結果である。｝
パラメーターａ、ｂ及びｃは、実験的に決定される。さ
らに複雑な温度補正も可能である。より高次の多項式適
合を所望により式（２）及び（３）の両方において使用
することができる。あるいは、式（２）の、係数を温度
補正することができる。
以下の例は、説明的なものであり、限定的なものでは
ない。
実験 一般的方法論 蛍光活性を、サンプルから30cmに保たれた750μW/cm2
（15cmにおける）長の波（365nm）紫外線ランプにより
照らされた暗いチャンバー内の反応膜を観察することに
よりモニターした。すべての反応を、室温（23℃）にお
いて行った。反応速度を、50mmレンズを備えたMinolta
Maxxum 5000 SLR 35mmカメラを使用して所定間隔におい
てサンプルの写真を撮ることによりモニターした。この
写真は、f5.6において１−又は２−秒間の露出でASA 40
0 Kodak Goldカラー・プリント・フィルムを使用した。
コントラストを改善するために、幾つかの写真を、Cori
on Corporation S40−450−R 450nmフィルター（40nmバ
ンド幅）を使用して撮影した。フィルターは、それ以下
の波長を減少させながら、７−アミド−４−メチルクマ
リン蛍光団の460nmの蛍光放射が通過するのを許容す
る。時間計測は、ストップウオッチにより手動により行
った。特にことわらないかぎり、すべての試薬は、Sigm
a Chemical Company,St.Louis,MOから得た。機器を備え
た観測は、原型の機器を使用して行った。光学装置ブロ
ックは、25ナノメーターのバンド幅をもつCorion Corpo
ration S25−450−A 450ナノメーター・フィルターの下
に設置されたSiemens BPW−34B光検出装置を使用した。
Edmund Scientific 10mm x 10mm R32,601プリズム・キ
ューブ・ビーム・スプリッターを、フィルターの直上に
載せた。試薬をビーム・スプリッターの上に置き、そし
て365nm波長のUV光を使用して下から照らした。光検出
装置からの出力を、（IC User Casebook,1988,by Josep
h Car,Haward Samms ＆ Companyの89ページに記載され
た）機器増幅装置により増幅し、12ビットのアナログ〜
ディジタル変換器によりディジタル化し、そしてIBM互
換性パーソナル・コンピューター上に記録した。温度制
御を（これを使用するとき）Fisher model 147等温乾燥
浴を使用して維持した。
試薬透過膜を、晒された膜セクションを全体的に飽和
させるために膜へ十分な液体試薬混合物を添加すること
により調製した。次に、過剰の液体試薬を取り除き、そ
して飽和された膜を、約50℃において30分間熱風ブロア
ーの下で空気乾燥させた。乾燥された膜を、使用するま
で室温においてシリカ・ゲル乾燥剤と共に、気密容器内
に保存した。
最初の実験を、血液凝固中性テスト（先の討議した基
準Ｄ）に集中した。これらの研究は、血漿のみを使用
し、そしてSigma C−7916レベルＩ血液凝固対照（正常
限界内の活性化部分トロンボプラスチン時間及びプロト
ロンビン時間）、Sigma C−8916レベルII血液凝固対照
（活性化部分トロンボプラスチン時間及びプロトロンビ
ン時間についての穏やかに高められた値）、又はSigma
C−9916レベルIII血液凝固対照（活性化部分トロンボプ
ラスチン時間及びプロトロンビン時間についてのかなり
高められた値）の、15μｌサンプルを使用してテストさ
れた。後者の実験は、血漿対照に加えて全血を使用し
た。全血サンプルは、フィンガースティック・サンプル
から得られた非抗血液凝固フレッシュ・サンプル、又は
８時間未満のクエン酸添加抗血液凝固静脈血液のいずれ
かであり、そして使用するまで冷蔵された。これらの実
験において使用されたトロンボプラスチンは、20mg/ml
の濃度におけるSigma T−0263ウサギ脳トロンボプラス
チンであった。使用したウシ血清アルブミン（BSA）
は、Sigma A−3294、プロテアーゼ不含画分Ｖ粉末であ
った。トロンビン基質は、Sigamから得られたＮ−ｔ−B
oc−Val−Pro−Arg−７−アミド−４−メチルクマリン
であった。使用したヒドロキシプロピルセルロースは、
Aqualon Corporationから得られたKlucelEFであっ
た。
実施例1:プロトロンビン時間反応に対する様々な膜の効
果 液体試薬混合物を、以下のものを組み合わせることに
より調製した： 1200μl 0.2M Trisバッファー,pH8.3 600μｌトロンボプラスチン 100μl 100mM CaCl2 100mg BSA 100μｌの1mg/ml N−ｔ−Boc−Val−Pro−Arg−７−ア
ミド−４−メチルクマリン。
試薬混合物のアリコット（100μｌ）を、以下の５つ
の異なる膜にスポットした： Pall Corporation 1.2 micron Biodyne“B"（第四アン
モニア誘導体化ポリアミド） Pall Corporation 1.2 micron Biodyne“C"（カルボキ
シ誘導体化ポリアミド） Dominic Hunter 0.8μm Asypor不斉セルロース膜 Whatman 3MMフィルター紙 Schleicher ＆ Schuell 593フィルター紙 Whatman GF/Cガラス繊維フィルター紙。
コートされた膜を、対照Ｉ血清によりテストし、10分
間反応に供し、そして視覚的に評価した。結果は、以下
のようであった： 膜 反応 Pall Corporation 1.2 micron Biodyne“B" ＋（明るい環） Pall Corporation 1.2 micron Biodyne“C" −（反応せず） Dominic Hunter 0.8μm Asypor − Whatman 3MMフィルター紙 − Schleicher ＆ Schuell 593フィルター紙 − Whatman GF/Cガラス繊維フィルター紙 ＋（明るい環） Whatman GF/Cガラス繊維フィルター紙は、陽性対照と
して作用した。なぜなら、ガラス繊維材料が特定の血液
凝固経路に適合性であることが知られているからであ
る。この結果は、これらの条件の下では、多くの膜が外
因性血液凝固経路と適合性がないということを示した。
また、これらの結果は、反応性膜上の蛍光強度が適用さ
れたサンプルの溶媒前面に一致する薄い環上に濃縮され
るということを示した。これは、トロンビン基質の実質
的なクロマトグラフィーがこれらの条件下で生じたこと
を示していた。これは、望ましいことではない。なぜな
ら、蛍光の不均一な分布は、反応速度の翻訳を複雑にす
るからである。
実施例2:様々な流れ制御剤の効果 液体試薬混合物を、以下のものを組み合わせることに
より調製した： 2000μl 0.2M Trisバッファー,pH8.3 1mlトロンボプラスチン 150μl 100mM CaCl2 150mg BSA 150μｌの1mg/ml N−ｔ−Boc−Val−Pro−Arg−７−ア
ミド−４−メチルクマリン。
混合物を３つの、1mlアリコットに分けた。第一アリ
コットには何も添加しなかった。50mgの高分子量（Sigm
a D−5501 5,000,000−40,000,000モル重量）デキスト
ランを第二アリコットに添加し、そして50mgのAqualon
KlucelEF（ヒドロキシプロピルセルロース）を、第三
アリコットに添加した。これらのアリコットを、完全に
溶解するまで混合し、そして1.2 micron Pall Corporat
ion Biodyne B膜上にスポットした。
コートされた膜を、対照Ｉ血漿によりテストし、そし
て視覚的に評価した。10分後の結果は、以下のようであ
った： 流れ制御剤 反応 無し ＋（明るい環） デキストラン −（反応せず） KlucelEF ＋（明るい均一な環） 流れ制御剤の不存在においては、蛍光基質は、先のよ
うにサンプル溶媒の前面と共に移動し続けた。これに反
し、デキストラン添加は、プロトロンビン時間反応を阻
害した。しかしながら、KlucelEF（ヒドロキシプロピ
ルセルロース）は、反応を阻害することなくクロマトグ
ラフィーを減少させるのに十分にその反応混合物を濃縮
した。この結果は、より均一な蛍光シグナルであった。
この実験の結果として、KlucelEFは、定例的に本配合
品に添加された。また、この実験は、血液凝固中性ポリ
マーを使用する重要性について説明している。
実施例3:プロトロンビン時間反応に対するカルシウム及
びトロンボプラスチンの効果 １つの関心は、先の実験において観察された明らかな
“プロトロンビン時間”反応が実際には幾つかの種の非
生理学的“人工産物”であったということであった。観
察された反応が実際に純粋なプロトロンビン時間反応で
あるかどうかを見るために、その反応がカルシウム及び
トロンボプラスチンが進行する必要があるかどうかを見
るための実験を行った。さらに、その反応が、正常対照
血漿と、延長されたPT時間をもつ異常対照血漿との間を
識別する能力についてテストした。これを行うために、
カルシウム及びトロンボプラスチンを伴う、又は伴わな
い多くの異なる膜ケースを調製した。
液体試薬混合物を、以下のものを組み合わせることに
より調製した： 2ml 0.2M Trisバッファー,pH8.3 150mg BSA 150mg Klucel EF 150μｌの1mg/ml N−ｔ−Boc−Val−Pro−Arg−７−ア
ミド−４−メチルクマリン。
混合物を２つの、1mlアリコットに分けた。0.5mlのト
ロンボプラスチン溶液を、１つのアリコットに添加し、
そして0.5ml 0.2M Trisバッファー,pH8.3を他のものに
添加した。これらは、（＋／−）トロンボプラスチンの
ケースであった。
それぞれのケースをさらに、２つの追加のサブ−ケー
スにサブ分割した。これらの１つは、カルシウムをも
ち、そしてこれらの１つは、（カルシウムと結合する）
EDTAをもっていた。これは、それぞれのケースを２つの
0.5mlサンプルに分割することにより行った。（＋）カ
ルシウム・ケースは、25μｌの100ミリモルの塩化カル
シウムを受け取った。（−）カルシウム・ケースは、25
μｌの100mM Na2EDTAを受け取った。全部で、４つの最
終的なケースが生じた。これらは、以下のものであっ
た： （＋）トロンボプラスチン（＋）CaCl2 （＋）トロンボプラスチン（＋）EDTA （−）トロンボプラスチン（＋）CaCl2 （−）トロンボプラスチン（＋）EDTA。
それぞれの溶液のサンプルをPall Corporation 1.2 m
icron Biodyne B上にスポットし、そして乾燥させた。
次に４つのすべてのケースを、対照Ｉ及び対照II血漿に
より同時に挑戦させ、そして観察した。
強い蛍光が、対照Ｉ（正常PT時間）サンプルによる
（＋）トロンボプラスチン（＋）CaCl2ケースにおいて
のみ顕色された。他のすべてのケースは、陰性であっ
た。
この実験は、観察された反応がカルシウムとトロンボ
プラスチンの両方が作用することを要求し、そして正常
なプロトロンビン時間の血漿と異常なプロトロンビン時
間の血漿とを区別することができ、その装置が生理学的
に重要なプロトロンビン時間反応を行っている良好な証
拠を提供することを、証明している。
実施例4:正常及び異常プロトロンビン時間血漿による試
薬動態： 他の実験（示さず）は、試薬混合物のpHが延長された
プロトロンビン時間をもつサンプルに向かう装置の相対
感度に対する効果をもっていたことを示した。一般的
に、7.5に近いpHは、延長されたプロトロンビン時間を
もつサンプル検出するためのより高い感度をもつ傾向に
ある。このように、反応カクテルのpHは、その後の実験
のために7.5に変更された。
以下の実験においては、対照Ｉ及び対照II血漿の間の
相対蛍光強度が時間推移写真によりモニターされた。
液体試薬混合物を、以下のものを組み合わせることに
より調製した： 1200μl 0.2M Trisバッファー,pH7.5 600μｌトロンボプラスチン 100μl 100mM CaCl2 100mg BSA 100mg Klucel EF 100μｌの1mg/ml N−ｔ−Boc−Val−Pro−Arg−７−ア
ミド−４−メチルクマリン。
試薬を、普通には、Pall Corporation 1.2 micron Bi
odyne B上にスポットした。次に、乾燥膜を対照Ｉ及び
対照II血漿により挑戦させ、そして１分毎に写真を撮っ
た。結果は、以下のようであった： 時間（分） 対照Ｉ 対照II ０ − − １ − − ２ − − ３ ＋ − ４ ＋ − ５ ＋＋ − ６ ＋＋ − ７ ＋＋ − ８ ＋＋ ＋ ９ ＋＋ ＋＋ これらの結果は、試薬膜上で生じた生理学的に重要な
プロトロンビン時間反応と再び一致した。予想されたよ
うに、異常（対照II）サンプルにおける蛍光シグナルの
出現時間は、正常サンプルの時間の約２倍であった。
実施例5:プロトロンビン時間反応に対するタンパク質前
処理の効果 先の実験において得られたプロトロンビン時間反応
は、許容できない程に長かった。長い反応時間は、膜上
の不安定な血液凝固因子の失活によると推定された。さ
らに、この失活が装置に過剰の結合適合性タンパク質を
添加することによりブロックされることができたと推定
された。
この推定をテストするために、0.05M Tris pH7.5及び
２％プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン（BSA）を含
む“ブロッキング溶液”を調製し、そして膜サンプル
を、室温における12時間の上記溶液により処理するか、
又は非処理でテストするかのいずれかを行った。
以下の膜を、前処理した： Pall Corporation 1.2 micron Biodyne“B" Gelman Super 800 Filterite/Memtec 0.45 micron不斉ポリスルホン Dominic Hunter 0.8μm micron Asypor Schleicher ＆ Schuell 34 Gガラス繊維フィルター紙。
この実験、及び以下の実験においては、反応カクテル
のBSA成分を、BSAが血液凝固因子に対する保護効果をも
つという観察に基づき、先のケースの２倍にした。
液体試薬混合物を、以下のものを組み合わせることに
より調製した： 1200μl 0.2M Trisバッファー,pH7.5 600μｌトロンボプラスチン 200μl 100mM CaCl2 200mgプロテアーゼ不含BSA 100mg Klucel EF 100μｌの1mg/ml N−ｔ−Boc−Val−Pro−Arg−７−ア
ミド−４−メチルクマリン。
これらの膜、及び対応する未処理膜のサンプルを、テ
スト・スタンドに固定し、そして試薬混合物により飽和
させ、そして普通に風乾させた。
次にサンプルを、レベルＩ及びII血液凝固対照に晒
し、そしてテストした。反応時間は、劇的に減少され
た。前処理の効果は、レベルII、（延長されたPT時間）
対照について最も表明された。レベルＩ対照（示さず）
は、反対してより速く（典型的には、このシリーズにお
けるすべてのサンプルについて２分間）、そして前処理
の存在又は不存在により顕著に影響されなかった。
すべてのサンプルについて、反応混合物からトロンボ
プラスチンを省くことが、いずれのシグナルをも生じさ
せないというとに、注目のこと。
結果（レベルII対照）： １分 ２分 ３分 ４分 ５分 ６分 非処理： Biodyne − − − − − − Super − − − − − − Asymmetric − − ＋ ＋ ＋ ＋ Asypor − − − − − − 34 G − − ＋ ＋ ＋ ＋ 処理： Biodyne − − − ＋ ＋ ＋ Super − − − − − − Asymmetric − − ＋ ＋ ＋ ＋ Asypor − − − − − − 34 G − − ＋ ＋ ＋ ＋ 前処理の存在においては、Biodyne Bは、本質的に、
６分目までの間、レベルII対照に非反応性であったこと
に、注目のこと。これに対して、前処理が、検出可能な
反応がここで４分目まで生じるように、レベルII対照に
対するBiodyne Bの感度を増加させた。
しかしながら、不斉ポリスルホンは優れた血液凝固中
性を示した。これは、血液凝固因子のより少ない失活が
上記膜支持体上で生じることを示す、より速いレベルII
PT反応により示される。前処理の前に既に良好な、上
記膜の血液凝固中性は、前処理後も測定可能なほど変更
されなかった。
また、膜を、正常なプロトロンビン時間をもつ全血サ
ンプルにより挑戦させた。結果は以下のようであった： １分 ２分 ３分 ４分 ５分 ６分 膜 （非処理）： Biodyne − − − − − − Super − − − − − − Asymmetric − − − ＋ ＋ ＋ Asypor − − − − − − 34 G − − − − − − 膜 （処理）： Biodyne − − − − − − Super − − − − − − Asymmetric − − ＋ ＋ ＋ ＋ Asypor − − − − − − 34 G − − − − − − 結果は、Biodyne“B"及びSuper−800膜が正常なレベ
ルＩの血液凝固対照血漿により良好なシグナルを与える
けれども、それらが全血により蛍光シグナルを全く与え
ないということを示している。これに対して、不斉ポリ
スルホンはシグナルを与え続ける。より長い（10分間）
の時間点において、Schleicher ＆ Schuell 34G、血漿
から赤血球を濾過するガラス繊維材料も、全血による陽
性シグナルを与えた。このように、テストされた材料の
中では、不斉ポリスルホンが全血検定について最良であ
った。
実施例6:不斉ポリスルホン上のプロトロンビン時間反応
に対するヒドロキシプロピルセルロース（流れ制御試
薬）の効果 不斉ポリスルホンに対するヒドロキシプロピルセルロ
ースの効果をテストした。
液体試薬混合物を、以下のものを組み合わせることに
より調製した： 1200μl Trisバッファー,pH7.5 600μｌトロンボプラスチン 200μl CaCl2 200mg BSA。
混合物を、２つの、1mlアリコットに分けた。50mgのK
lucelEFを、１つに添加し、そして他のものには、何
も添加しなかった。KlucelEFを溶解した後、50μｌの
1mg/ml N−ｔ−Boc−Val−Pro−Arg−７−アミド−４−
メチルクマリンを両方のサンプルに添加した。
それぞれのケースを、開孔側上の0.45ミクロン不斉ポ
リスルホン膜のサンプルに適用した。過剰のサンプルを
除去し、そして膜を普通に風乾した。
次に４つのすべてのケースを、対照Ｉ、対照II及び対
照III血漿により同時に挑戦させた。次に上記ケースを
普通に観察した。
結果： １分 ２分 ３分 ４分 ５分 ６分 （−）Klucel EF 対照Ｉ − 環＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 対照II − − 環＋ ＋ ＋ ＋ 対照III − − − − 環＋ 環＋ （＋）Klucel EF 対照Ｉ − ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 対照II − − ＋ ＋ ＋ ＋ 対照III − − − − ＋ ＋ 上記２ケースの速度及び蛍光強度は非常に類似してい
たけれども、（−）Klucel EFケースは、溶媒前面に
おける環内で最初に顕色する蛍光をもち、そしてその
後、サンプルじゅうに均一な顕色をもつ傾向があった。
こえに対して、（＋）Klucel EFケースは、環を形成
する傾向を伴わずに最初から均一に顕色した。このよう
に、KlucelEFは、配合物中に維持され、クロマトグラ
フィー効果を減少させた。
実施例7:プロトロンビン時間“テスト−ストリップ” 本発明は、正常（レベルＩ）対照を、穏やかに異常な
（レベルII）対照から、かなり異常な（レベルIII）対
照から区別することができるして単層組成物が製造され
ることができ、そしてこの単層組成物が小さな滴の全血
を使用して機能することができるであろうことを証明し
た。さらに本実験は、この反応がトロンボプラスチンが
機能することを要求するであろうことを証明した。
本実験は、再び、Filterite/Memtec Corpotationから
得られた0.45ミクロンの細孔サイズ不斉ポリスルホン膜
を使用した。生体適合性を強化するために、膜を、12時
間pH7.5における0.05M Trisバッファー中の２％プロテ
アーゼ不含ウシ血清アルブミンの溶液に晒し、その後風
乾することにより前処理した。
この不斉膜は全血により陽性の蛍光シグナルを与えて
いたけれども、そのシグナルの強度は、未だ血清単独に
満たなかった。顔料が全血シグナルをさらに強化するこ
とができるかどうかを見るために、この実験は、Rohm
＆ Haas Corporationにより製造されたスチレン／アク
リル酸ポリマーの小さな、中空の、0.5ミクロン・サイ
ズの粒子から成る顔料であるRppaque による膜のドー
ピング効果についても調査した。
液体試薬混合物を、以下のものを組み合わせることに
より調製した： 800μｌの0.2M Trisバッファー,pH7.5 200μｌの100mM CaCl2 200mgのBSA 100mg Klucel EF 100μｌの1mg/ml N−ｔ−Boc−Val−Pro−Arg−７−ア
ミド−４−メチルクマリン。
混合物を２つの、550μｌアリコットに分けた。300μ
ｌのトロンボプラスチン溶液を、１つのアリコットに添
加し、そして300μｌのH2Oを他のものに添加した。これ
らは、＋／−トロンボプラスチンのケースであった。そ
れぞれのアリコットを今度は、２つの、400μｌのアリ
コットに分けた。１つのアリコットは、100μｌの50％R
opaque 懸濁液を受け取り、そして他のアリコット
は、100μｌのH2Oを受け取った。これらは、（＋／−）
Ropaque ケースであった。全部で、４つの最終的なケ
ースが生じた。これらは、以下のものであった： （＋）トロンボプラスチン（＋）Ropaque （＋）トロンボプラスチン（−）Ropaque （−）トロンボプラスチン（＋）Ropaque （−）トロンボプラスチン（−）Ropaque。
それぞれのケースを、開孔側上の0.45ミクロン不斉ポ
リスルホン膜のサンプルに適用した。過剰のサンプルを
除去し、そして膜を普通に風乾した。
次に４つのすべてのケースを、対照Ｉ、対照II及び対
照III血漿、並びに正常な全血のサンプルにより同時に
挑戦させた。次に上記ケースを普通に観察した。蛍光
は、（＋）トロンボプラスチン・ケースにおいては、以
下の表に従って顕色した： （＋）トロンボプラスチン・ケース １分 ２分 ３分 ４分 ５分 ６分 （−）Ropaque 対照Ｉ − ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 対照II − − ＋ ＋ ＋ ＋ 対照III − − − − ＋ ＋ 血液 − − 環＋ 環＋ 環＋ 環＋ （＋）Ropaque 対照Ｉ − ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 対照II − − ＋ ＋ ＋ ＋ 対照III − − − − ＋ ＋ 血液 − − ＋ ＋ ＋ ＋ （−）トロンボプラスチン・ケース １分 ２分 ３分 ４分 ５分 ６分 （−）Ropaque 対照Ｉ − − − − − − 対照II − − − − − − 対照III − − − − − − 血液 − − − − − − （＋）Ropaque 対照Ｉ − − − − − − 対照II − − − − − − 対照III − − − − − − 血液 − − − − − − 蛍光は、（−）トロンボプラスチン・ケースのいずれ
においても顕色せず、トロンボプラスチンが本反応に必
要であることを示している。
（＋）Ropaqueケースは、一般的に（−）Ropaque
ケースよりも強い蛍光シグナルを与え、そしてより均一
な蛍光分布を与える傾向をさらにもっていた。このよう
に、Ropaque は、有益であるようであった。
実施例8:カルシウムの効果 プロトロンビン時間反応に対するカルシウムの効果を
研究し、そしてRopaque が全血による蛍光シグナルを
一貫して強化することを確認するために、先の実験と並
行な実験を行った。
液体試薬混合物を、以下のものを組み合わせることに
より調製した： 800μｌの0.2M Trisバッファー,pH7.5 600μｌのトロンボプラスチン 200mgのBSA 100mg Klucel EF 100mgの1mg/ml N−ｔ−Boc−Val−Pro−Arg−７−アミ
ド−４−メチルクマリン。
混合物を２つの、0.75ミリリッターのアリコットに分
けた。100μｌの100mM CaCl2を１つに添加し、100μｌ
のH2Oを他のものに添加した。それぞれのアリコットを
さらに２つの、0.4ミリリッターのアリコットに分け
た。100μｌの50％Ropaque 懸濁液を１つのアリコッ
トに添加し、そして100μｌのH2Oを他のアリコットに添
加した。全部で、４つの最終的なケースが生じた。これ
らは、以下のものであった： （＋）CaCl2（＋）Ropaque （＋）CaCl2（−）Ropaque （−）CaCl2（＋）Ropaque （−）CaCl2（−）Ropaque。
それぞれのケースを、開孔側上の0.45ミクロン不斉ポ
リスルホン膜のサンプルに適用した。過剰のサンプルを
除去し、そして膜を普通に風乾した。
次に４つのすべてのケースを、対照Ｉ、対照II及び対
照III血漿、並びに正常な全血のサンプルにより同時に
挑戦させた。次に上記ケースを普通に観察した。
（＋）CaCl2ケース １分 ２分 ３分 ４分 ５分 ６分 （−）Ropaque 対照Ｉ − ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 対照II − − ＋ ＋ ＋ ＋ 対照III − − − − ＋ ＋ 血液 − − ＋ ＋ ＋ 環＋ （＋）Ropaque 対照Ｉ − ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 対照II − − ＋ ＋ ＋ ＋ 対照III − − − − ＋ ＋ 血液 − − ＋ ＋ ＋ ＋ （−）CaCl2ケース １分 ２分 ３分 ４分 ５分 ６分 （−）Ropaque 対照Ｉ − − − − − − 対照II − − − − − − 対照III − − − − − − 血液 − − ＋ ＋ ＋ 環＋ （＋）Ropaque 対照Ｉ − − − − − − 対照II − − − − − − 対照III − − − − − − 血液 − − ＋ ＋ ＋ ＋ 本実験における（−）CaCl2ケースと、先の実験にお
ける（−）トロンボプラスチン・ケースとの間の重要な
差異に注目のこと。（−）トロンボプラスチン・ケース
における全血により反応は全く得られなかったけれど
も、正常な反応が（−）CaCl2ケースにおける全血によ
り得られた。これは、ここで使用された新たな全血が、
余分のカルシウムを試薬に添加する必要性を伴わずに外
因性経路の引き金を引くのに十分なカルシウムを含んで
いたからである。反対に、カルシウム・キレート剤の使
用により消耗されたそれらのカルシウム・レベルをもつ
血漿対照は（−）CaCl2ケースにおいて非反応性であっ
た。
これは、優れた試薬安定性がカルシウムがトロンボプ
ラスチンと共に共存されない場合に達成されることがで
きるということを示す従来技術の視点において、有用な
発見であった。家庭テストは、良好な安定性を必要と
し、そして全血により排他的に機能するであろうから、
配合品がカルシウムを含まない場合に優れた結果を得る
ことができる。
Ropaque は、いくぶん、蛍光シグナルの強度を増強
することにより、そしてそのシグナルの均一性を増加さ
せることにより、全血による、有用な効果をもち続け
た。しかしながら、適当な結果がRopaque によらずに
得られたことにも注目すべきである。
実施例9:可変サンプル・サイズの研究 良好な家庭テストは、試薬に添加された全血の量にお
ける変化において抵抗性であろうし、そして好ましく
は、約５μｌまでの非常小さなサンプル・サイズを使用
して働くであろう。本実験においては、実験８から持ち
越された（−）CaCl2（−）Ropaque及び（＋）CaCl2
（＋）Ropaque材料を５、10及び20μｌの全血により
挑戦させた。両方のケースにおいて、蛍光反応の反応速
度及び強度は、すべてのサンプル・サイズについて同一
であった。反対に、同一の実験をSchleicher ＆ Schuel
l 34G又はWhatman GF/Cガラス繊維フィルター紙により
行ったとき、５μｌ及び10μｌの全血サンプルによって
は、反応は全く観察されなかった。
実施例10:全血サンプルによる定量的研究 本実験の目的は、装置の最適化を容易にするために試
薬の性能に対する定量的なデータを得ることである。
液体試薬混合物を、以下のものを組み合わせることに
より調製した： 2400μl Tris,pH7.5 1200μｌトロンボプラスチン 400μl 100mM CaCl2 400mg BSA 200mg Klucel EF 200μｌの1mg/ml N−ｔ−Boc−Val−Pro−Arg−７−ア
ミド−４−メチルクマリン。
これを、開孔側上の0.45ミクロン不斉ポリスルホン膜
のサンプルに適用した。過剰サンプルを除去し、そして
膜を普通に風乾させた。
この膜を別個の試薬ストリップに加工した。これを、
10mil厚の硬質不透明支持体上に1/2"幅の3M Scotch TMC
at.136両面テープのストリップを置き、そしてそのテー
プの中心を通して及び支持体を通して1/4"直径の孔をパ
ンチングすることにより行った。次に処理された膜をテ
ープにラミネートし、孔サイズを狭くした。この試薬ス
トリップを、次に便利なサイズにカットし、そして先に
記載した機器の観察領域の上に置いた。
血液サンプルを先に記載したように得た。これらのサ
ンプルを、上記試薬ストリップに適用し、そして全部で
４分間（240秒間）にわたり10秒間隔において観察し
た。この実験は、室温（25℃）において行われた。
正常血液サンプル（Ａ）、僅かに延長されたプロトロ
ンビン時間をもつ血液サンプル（Ｂ）、及びかなり延長
されたプロトロンビン時間をもつ血液サンプル（Ｃ）に
ついて得た結果を図３中に示す。
この結果は、装置が様々な全血サンプルの間をはっり
と区別することができることを示している。
前述の発明を、理解の容易にするために、例示及び実
施例によりいくぶん詳細に記載してきたけれども、特定
の変更及び修正が添付の範囲内で行われることができる
ことは明らかであろう。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｚ 21/75 21/75 Ｄ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98

Claims (28)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】テスト物品であって： 血液凝固経路を実質的に妨害しない、対向する位置にお
    いてアプリケーション外面及びインジケーター外面をも
    つ透過性膜； その膜内に含浸された血液凝固開始剤；及び その血液凝固経路の成分による活性化の間に検出可能な
    シグナルを作り出す、その膜内に含浸された基質； を含んで成り、それにより、全血がその膜のアプリケー
    ター外面に適用され、そして検出可能なシグナルがその
    血液凝固経路成分の生成の結果としてそのインジケータ
    ー外面上に作り出されるような、テスト物品。
  2. 【請求項２】透過性膜が、血液凝固経路を妨害しない親
    水性の非膨潤性材料から成る、請求項１に記載のテスト
    物品。
  3. 【請求項３】材料が、ポリスルホンである、請求項２に
    記載のテスト物品。
  4. 【請求項４】ポリスルホンが、不斉構造である、請求項
    ３に記載のテスト物品。
  5. 【請求項５】透過性膜が、血液凝固経路の妨害を阻害す
    るように処理された親水性の非膨潤性材料である、請求
    項１に記載のテスト物品。
  6. 【請求項６】血液凝固開始剤が、外因性血液凝固経路を
    開始させる、請求項１に記載のテスト物品。
  7. 【請求項７】血液凝固開始剤が、トロンボプラスチン、
    又は他の因子VII活性化物質から成る群から選ばれてい
    る、請求項６に記載のテスト物品。
  8. 【請求項８】血液凝固開始剤が、内因性血液凝固経路を
    開始させる、請求項１に記載のテスト物品。
  9. 【請求項９】血液凝固開始剤が、エラグ酸、カオリン、
    シリカ、又は他の因子XII活性化物質から成る群から選
    ばれている、請求項８に記載のテスト物品。
  10. 【請求項１０】基質を活性化する血液凝固経路成分が、
    トロンビンである、請求項１に記載のテスト物品。
  11. 【請求項１１】トロンビン基質が、リポーター分子に共
    有結合したペプチドであり、ここで、トロンビンがその
    ペプチドに結合し、そしてそのペプチドからリポーター
    分子を解裂させ、検出可能なシグナルを作り出すよう
    な、請求項10に記載のテスト物品。
  12. 【請求項１２】検出可能なシグナルが、蛍光である、請
    求項11に記載のテスト物品。
  13. 【請求項１３】血液凝固経路及び膜材料に適したpHを維
    持する膜内に含浸されたバッファーをさらに含んで成
    る、請求項１に記載のテスト物品。
  14. 【請求項１４】膜内に含浸されたカルシウムをさらに含
    んで成る、請求項１に記載のテスト物品。
  15. 【請求項１５】膜内に含浸された顔料をさらに含んで成
    る、請求項１に記載のテスト物品。
  16. 【請求項１６】膜内に含浸された流れ制御剤をさらに含
    んで成る、請求項１に記載のテスト物品。
  17. 【請求項１７】テスト物品であって： 透過性不斉ポリスルホン膜； その膜内に含浸されたトロンボプラスチン；及び その膜内に含浸されたトロンビン基質であって、蛍光リ
    ポーター分子に共有結合したトロンビン結合ペプチドを
    含んで成り、それによりトロンビンがその基質から蛍光
    リポーターを放出するようなトロンビン基質； を含んで成り、 それにより、全血がその膜の１つの外面に適用されるこ
    とができ、そして蛍光がそのトロンビン基質のトロンビ
    ン仲介解裂の結果としてその反対側の外面上で検出され
    るような、テスト物品。
  18. 【請求項１８】血液凝固経路及び膜材料に適したpHを維
    持する膜内に含浸されたバッファーをさらに含んで成
    る、請求項17に記載のテスト物品。
  19. 【請求項１９】膜内に含浸されたカルシウムをさらに含
    んで成る、請求項17に記載のテスト物品。
  20. 【請求項２０】膜内に含浸された顔料をさらに含んで成
    る、請求項17に記載のテスト物品。
  21. 【請求項２１】膜内に含浸された流れ制御剤をさらに含
    んで成る、請求項17に記載のテスト物品。
  22. 【請求項２２】患者の血液凝固能力の測定方法であっ
    て： 全血サンプルを、透過性膜のアプリケーション外面に適
    用すること、ここで、その膜が血液凝固経路を実質的に
    妨害せず、そして血液凝固開始剤、及びその血液凝固経
    路の成分による活性化の間に検出可能なシグナルを作り
    出す基質が、その膜内に含浸されており； 並びに その膜のインジケーター外面上で視覚的シグナルを検出
    すること、ここで、そのインジケーター外面が上記アプ
    リケーター外面に対向した位置にあり、そしてその視覚
    的シグナルが、上記血液凝固開始剤及び血液の相互作用
    によりその膜内で開始された血液凝固経路成分の生成か
    ら生じる、 を含んで成る方法。
  23. 【請求項２３】全血サンプルが、適用に先立って測定さ
    れない、請求項22に記載の方法。
  24. 【請求項２４】全血サンプルが、指を刺すこと（finger
    prick）により得られる、請求項23に記載の方法。
  25. 【請求項２５】室温において行われる、請求項22に記載
    の方法。
  26. 【請求項２６】制御温度において行われる、請求項22に
    記載の方法。
  27. 【請求項２７】検出可能なシグナルが蛍光である、請求
    項22に記載の方法。
  28. 【請求項２８】検出可能なシグナルが温度補正される、
    請求項22に記載の方法。
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