DE69328951T2 - Nukleinsäuresonden für Mykobacterium Tuberkulosis - Google Patents
Nukleinsäuresonden für Mykobacterium TuberkulosisInfo
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Description
- Die hierin beschriebenen und beanspruchten Erfindungen betreffen die Auslegung und die Konstruktion von Nukleinsäure-Sonden für den Mycobacterium tuberculosis- Komplex (TB-Komplex), durch die der Nachweis dieser Organismen in Testproben, z. B. Sputum, Urin, Blut und Gewebeschnitten, Nahrungsmitteln, Erde und Wasser, ermöglicht wird.
- Zwei Einzelstränge der Desoxyribo-("DNA") oder Ribo-("RNA")-Nukleinsäure, wie aus Nukleotiden (einschließlich der Basen Adenin (A), Cytosin (C), Thymidin (T), Guanin (G), Uracil (U) oder Inosin (I)) gebildet, können sich verbinden ("hybridisieren") und dadurch eine doppelsträngige Struktur bilden, in der die beiden Stränge durch Wasserstoffbrücken zwischen Paaren von komplentären Basen aneinander gebunden werden. Generell wird A durch die Wasserstoffbrücke an T oder U gebunden, G dagegen an C. So sind die klassischen Basenpaarungen AT oder AU, TA oder UA, GG oder CG an jedem beliebigen Punkt entlang der Kette feststellbar. Es sind auch AG, GU oder andere "Aussetzer" oder fehlgepaarte Basenpaare antreffbar.
- Enthält ein erster Einzelstrang der Nukleinsäure ausreichend benachbarte komplementäre Basen zu einem zweiten und werden diese beiden Stränge unter Bedingungen zusammengebracht, die ihre Hybridisierung fördern, so führt dies zu einer doppelsträngigen Nukleinsäure. Unter geeigneten Bedingungen entstehen DNA/DNA-, RNA/DNA- oder RNA/RNA-Hybride.
- Bei einer Sonde handelt es sich im allgemeinen um eine einzelsträngige Nukleinsäure-Sequenz, die in bestimmtem Grad zu der Nukleinsäure-Sequenz, die nachgewiesen werden soll ("Ziel-Sequenz"), komplementär ist. Sie kann mit einer nachweisbaren Komponente markiert sein, z. B. einem Radioisotop, Antigen oder einer chemilumineszierenden Komponente. Eine Beschreibung des Hintergrunds der Anwendung der Nukleinsäure-Hybridisierung als ein Verfahren zum Nachweisen bestimmter Nukleinsäure-Sequenzen ist zu finden in US-Patentschrift Nr. 4.851.330 und EP-A-0 272 009 mit dem Titel "Nukleinsäure-Sonden für den Nachweis und/oder die Quantifizierung nicht-viraler Organismen."
- In EP-A-0 272 009 sind auch Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von RNA enthaltenden Organismen in einer Probe, in der solche Organismen vorliegen könnten, beschrieben. Diese Methoden erfordern Sonden, die ausreichend komplementär sind, um an die ribosomale RNA (rmA) einer oder mehrerer nichtviraler Organismen oder Gruppen nicht-viraler Organismen zu hybridisieren. Das Gemisch wird dann unter spezifizierten Hybridisierungsbedingungen inkubiert und bezüglich der Hybridisierung von Sonde und beliebiger Testproben-rmA hin untersucht.
- In EP-A-0 272 009 sind außerdem Sonden beschrieben, die lediglich spezifisch angezielte Sequenzen von rmA-Untereinheiten in bestimmten Organismen oder Gruppen von Organismen in einer Probe selbst in Gegenwart vieler nicht-verwandter Organismen oder in Gegenwart nächster bekannter phylogenetischer Nachbarn detektiert. Spezifische Beispiele für Hybridisierungsassay-Sonden für Mycobacterium tuberculosis werden genannt. Derartige Sonden-Sequenzen zeigen mit Nukleinsäuren anderer Bakterienspezies oder Infektionserregern unter geeignet stringenten Hybridisierungsbedingungen keine Kreuzreaktion.
- In dieser Erfindung sind neuartige Sonden zum Nachweis des Mycobacterium tuberculosis-Komplex beschrieben und beansprucht. Diese Sonden sind in der Lage, zwischen dem Mycobacterium tuberculosis-Komplex und seinen bekannten nächsten phylogenetischen Nachbarn zu unterscheiden. Zum Mycobacterium tuberculosis-Komplex zählen folgende Spezies: M. tuberculosis, M bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti. Diese Sonden detektieren einzelne rmA und für rmA codierende Gen-Sequenzen und können in einem Assay zum Nachweisen und/oder Quantifizieren des Mycobacterium tuberculosis-Komplex verwendet werden.
- Die Organismen des TB-Komplex sind für eine erhebliche Erkrankungs- und Sterblichkeitsrate beim Menschen verantwortlich. Bei M. tuberculosis handelt es sich um das am häufigsten von Menschen isolierte Pathogen des TB-Komplex. M. bovis BCG kann von infizierten Tieren auf Menschen übertragen werden. M. africanum verursacht in den tropischen Gebieten Afrikas die Lungentuberkulose und M. microti infiziert in erster Linie Tiere.
- Tuberkulose ist hochgradig ansteckend, weshalb eine schnelle Diagnose der Erkrankung wichtig ist. Den meisten klinischen Laboratorien reicht die Zuordnung eines Isolats zum TB-Komplex, da es extrem unwahrscheinlich ist, daß ein Isolat eine andere Spezies als M. tuberculosis ergibt. Eine Anzahl biochemischer Tests wird zur Spezifizierung des Angehörigen des TB-Komplex empfohlen, sofern eine weitere Differenzierung erforderlich ist.
- Die klassischen Methoden zur Identifizierung der Mycobakterien basieren auf der Anfärbung von Proben auf säurebeständige Bazillen, gefolgt von Züchtung und biochemische Tests. Es könnte zwei Monate in Anspruch nehmen, ein Isolat unter Anwendung dieser Standardmethoden zu spezifizieren. Unter Anwendung der DNA- Sonden dieser Erfindung wird aus Kultur isolierter TB-Komplex in weniger als einer Stunde identifiziert.
- Daher wird bei einer ersten Ausführungsform der Erfindung eine Hybridisierungsassay-Sonde bereitgestellt, mit der die Unterscheidung von Mycobacterium tuberculosis von anderen Mycobacterium-Spezies möglich ist; genauer gesagt ist die Sonde ein Oligonukleotid, das an die rmA der Spezies Mycobacterium tuberculosis an einem Ort hybridisiert, der 23 Basen in der Insertregion entspricht, beginnend beim Äquivalent der Base 270 von E. coli 23S rmA, oder 21 Basen in der Insertregion entspricht, beginnend beim Äquivalent der Base 1415 von E. coli 23S rmA, oder ein dazu komplementäres Oligonukleotid; das heißt, das Oligonukleotid umfaßt, besteht im wesentlichen aus oder besteht in der Sequenz (SEQ ID Nr. 1) GGTAGCGCTGAGACATATCCTCC oder (SEQ ID Nr. 2) CAGAACTCCACACCCCCGAAG oder ein dazu komplementäres Oligonukleotid, mit oder ohne einer Helfer-Sonde, wie nachfolgend beschrieben.
- Mit "besteht im wesentlichen aus" ist gemeint, daß die Sonde als eine gereinigte Nukleinsäure bereitgestellt wird, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit dem gewünschten Organismus, doch nicht mit anderen verwandten Organismen hybridisiert. Diese Sonde kann an andere Nukleinsäuren geknüpft werden, die eine derartige Hybridisierung nicht beeinträchtigen. Allgemein ist eine Länge der Sonde von zwischen 15 und 100 (am bevorzugtesten zwischen 20 und 50) Basen bevorzugt. Sie kann allerdings auch in einem Vektor verfügbar gemacht werden.
- Bei verwandten Ausführungsformen stellt die Erfindung ein zur Hybridisierung an obige Oligonukleotide fähiges Nukleotid-Polymer, ein mit obigen Oligonukleotiden gebildetes Nukleinsäure-Hybrid und eine im wesentlichen dazu komplementäre Nukleinsäure-Sequenz bereit. Solche Hybride sind nützlich, da sie den spezifischen Nachweis der Organismen des TB-Komplex ermöglichen.
- Die Sonden dieser Erfindung ermöglichen ein schnelles, nicht-subjektives Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung des Vorhandenseins spezifischer rmA-Sequenzen in einer Bakterienkolonie, die einzig bei allen Spezies und Stämmen des Mycobacterium tuberculosis-Komplex vorkommt.
- Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüche ersichtlich werden.
- Wir haben einer bestimmten, von Mycobacterium tuberculosis erhaltenen rmA- Sequenzen komplementäre DNA-Sonden entdeckt. Darüber hinaus haben wir diese Sonden bei einem spezifischen Assay zum Nachweis von Mycobacterium tuberculosis erfolgreich eingesetzt, bei dem die Angehörigen des M. tuberculosis- Komplex von ihren bekannten und wahrscheinlich engstverwandten taxonomischen oder phylogenetischen Nachbarn unterschieden werden konnten.
- Wir haben geeignete variable Regionen der Ziel-Nukleinsäure durch vergleichende Analyse von rmA-Sequenzen, die sowohl der Literatur entnommen als auch von uns selbst bestimmt wurden, identifiziert. Computer und Computer-Programme, die für die hierin beschriebenen Zwecke verwendet oder ihnen angepaßt werden können, stehen kommerziell zur Verfügung. Da die Sequenzevolution an jeder der variablen Regionen (z. B. mindestens 10 Nukleotide umfassend) größtenteils divergent und nicht konvergent verläuft, können wir zuverlässig Sonden auf der Basis einiger weniger rmA-Sequenzen entwerfen, die zwischen dem Ziel- Organismus und seinen phylogenetisch engsten Verwandten unterscheiden können. Wir haben eine ausreichende Variation zwischen dem Ziel-Organismus und den in derselben Probe vorgefundenen engsten phylogenetischen Verwandten festgestellt, um die interessierende Sonde auslegen zu können.
- Wir haben die folgenden nützlichen Richtlinien zur Auslegung von Sonden mit den erwünschten Eigenschaften identifiziert. Da Umfang und Spezifität von Hybridisierungsreaktionen wie z. B. den hierin beschriebenen durch eine Reihe von Faktoren beeinflußt werden, wird die Manipulation eines oder mehrerer dieser Faktoren die exakte Empfindlichkeit und Spezifität einer bestimmten Sonde bestimmen, ob nun perfekt komplementär zu ihrem Ziel oder nicht. Bedeutung und Auswirkung von verschiedenen Assay-Bedingungen, wie hierin außerdem erläutert, sind den Fachleuten des Bereichs bekannt.
- Zunächst sollte die Stabilität des Sonden : Ziel-Nukleinsäure-Hybrids so gewählt werden, daß sie mit den Assay-Bedingungen kompatibel ist. Dies kann durch Vermeidung langer A- und T-reicher Sequenzen, indem die Hybride mit G : C-Basen- Paaren beendigt werden und durch Gestaltung der Sonde auf eine geeignete Tm hin erreicht werden. Die Anfangs- und Endpunkte der Sonde sollten so gewählt werden, daß die Länge und die %G und %C zu einer Tm von etwa 2-10ºC über der Temperatur führen, bei der der Assay schließlich durchgeführt wird. Die Basenzusammensetzung der Sonde ist signifikant, da G-C-Basenpaare im Vergleich zu A-T-Basenpaaren eine größere Wärmebeständigkeit aufgrund zusätzlicher Wasserstoffbrückenbindungen zeigen. Daher erweist sich eine Hybridisierung unter Einbeziehung komplementärer Nukleinsäuren mit höherem G-C-Gehalt bei höheren Temperaturen als beständig.
- Solche Bedingungen wie Ionenstärke und Inkubationstemperatur, die der Verwenung einer Sonde zugrundegelegt werden, sollten bei der Konstruktion einer Sonde ebenfalls in Betracht gezogen werden. Es ist bekannt, daß sowohl die Hybridisierung mit zunehmender Ionenstärke des Reaktionsgemischs zunimmt als auch die Wärmebeständigkeit der Hybride mit zunehmender Ionenstärke steigt. Andererseits erhöhen chemische Reagentien wie Formamid, Harnstoff, DMSO und Alkohole, die Wasserstoffbrückenbindungen zerstören, die Stringenz der Hybridisierung. Eine Destabilisierung der Wasserstoffbrückenbindungen durch solche Reagentien kann die Tm stark senken. Im allgemeinen erfolgt die optimale Hybridisierung von synthetischen Oligonukleotid-Sonden von etwa 10-50 Basen Länge etwa 5ºC unter der Schmelztemperatur eines gegebenen Duplex ein. Eine Inkubation bei Temperaturen unterhalb des Optimums kann zur Hybridisierung fehlgepaarter Basensequenzen und daher zu reduzierter Spezifität führen.
- Erwünscht sind Sonden, die nur unter hochstringenten Bedingungen hybridisieren. Unter diesen Bedingungen werden nur hochgradig komplementäre Nukleinsäure- Hybride gebildet (d. h. solche mit mindestens etwa 14 von 17 Basen in nebeneinanderliegender Serie von komplementären Basen); Hybride ohne ausreichenden Grad der Komplementarität bilden sich dagegen nicht. Demgemäß bestimmt die Stringenz der Assay-Bedingungen den Umfang der erforderlichen Komplementarität zwischen zwei hybridisierenden Nukleinsäure-Strängen. Die Stringenz wird so gewählt, daß der Unterschied der Stabilität von mit dem Ziel gebildetem Hybrid und der nicht-Ziel-Nukleinsäure maximiert wird.
- Zweitens sollten die Sonden so positioniert sein, daß die Stabilität des Sonden nicht- Ziel-Nukleinsäure-Hybrids minimiert ist. Dies kann durch Minimierung der Länge der perfekten Komplementarität mit nicht-Ziel-Organismen erreicht werden, indem G- und C-reiche Regionen von Homologie zu nicht-Ziel-Sequenzen vermieden werden und die Sonde so positioniert wird, daß sie soviele destabilisierende Fehlpaarungen wie möglich umfaßt. Ob eine Sonden-Sequenz zum Nachweis lediglich einer spezifischen Art von Organismus nützlich ist, hängt großteils von der Differenz bei der Wärmebeständigkeit zwischen den Sonden : Ziel-Hybriden und den Sonden nicht- Ziel-Hybriden ab. Beim Entwurf von Sonden sollten die Differenzen bei diesen Tm- Werten so groß wie gehalten werden (z. B. mindestens 2ºC und bevorzugt 5ºC).
- Die Länge der Ziel-Nukleinsäure-Sequenz und entsprechend die Länge der Sonden- Sequenz kann ebenfals wichtig sein. In einigen Fällen können es mehrere Sequenzen aus einer bestimmten, in Ort und Länge variierenden Region sein, die Sonden mit den gewünschten Hybridisierungs-Eigenschaften ergeben. In anderen Fällen kann eine Sequenz beträchtlich besser als eine andere sein, die sich lediglich durch eine einzige Base unterscheidet. Zwar ist die Hybridisierung von Nukleinsäuren, die nicht perfekt komplementär sind, möglich, doch bestimmt normalerweise vor allem die längste Strecke mit perfekt homologer Basensequenz die Hybridstabilität. Es können zwar Oligonukleotid-Sonden von unterschiedlicher Länge und Basenzusammensetzung verwendet werden, doch sind die bei dieser Erfindung bevorzugten Oligonukleotid-Sonden zwischen etwa 10 und 50 Basen lang und ausreichend übereinstimmend mit der Ziel-Nukleinsäure.
- Drittens sind Regionen der rmA, die für die Bildung starker innerer Strukturen mit hemmender Wirkung auf die Hybridisierung bekannt sind, weniger bevorzugt.
- Entsprechend sollten auch Sonden mit umfangreicher Selbstkomplementarität vermieden werden.
- Wie oben erläutert, versteht man unter Hybridisierung die Verbindung zweier Einzelstränge komplementärer Nukleinsäuren zu einem durch Wasserstoffbrücken verbundenem Doppelstrang. Es versteht sich, daß bei vollständiger oder teilweiser Beteiligung eines der beiden Stränge an einem Hybrid dieser weniger an der Bildung eines neuen Hybrids partizipieren kann. Im Falle von rmA ist das Molekül dafür bekannt, daß es sehr stabile intramolekulare Hybride bildet. Durch derartige Auslegung einer Sonde, daß ein wesentlicher Teil der Sequenz von Interesse einzelsträngig ist, lassen sich Rate und Umfang der Hybridisierung stark erhöhen. Ist das Ziel die der rmA entsprechende Genom-Sequenz, so wird diese natürlich in doppelsträngiger Form vorliegen, wie auch bei dem Produkt der polymerase chain reaction (PCR) der Fall. Diese doppelsträngigen Ziele sind von Natur aus inhibitorisch gegenüber einer Hybridisierung mit einer Sonde. Schließlich können intramolekulare und intermolekulare Hybride innerhalb einer Sonde entstehen, wenn eine ausreichende Selbstkomplementarität vorliegt. Solche Strukturen können durch sorgfältiges Sonden-Design vermieden werden. Für die Suche nach dieser Art von Wechselwirkung stehen Computer-Programme zur Verfügung.
- Ist eine wahrscheinlich einzigartige Sequenz einmal identifiziert, so wird ein komplementäres DNA-Oligonukleotid hergestellt. Dieses einzelsträngige Oligonukleotid dient als Sonde für die Hybridisierungsreaktion. Definierte Oligonukleotide können mittels einer von mehreren wohlbekannten Methoden hergestellt werden, einschließlich der automatisierten chemischen Festphasen- Synthese unter Verwendung von Cyanomethylphosphoramidit-Vorläufern. Barone et al., 12 Nucleic Acids Research 4051,1984. Natürlich können auch andere wohlbekannte Methoden zur Herstellung synthetischer Oligonukleotide angewandt werden. Sambrook et al., 2 Molecular Cloning 11 (2te Aufl. 1989).
- Einmal synthetisiert, können ausgewählte Oligonukleotid-Sonden auch mittels einer von mehreren wohlbekannten Methoden markiert werden. Sambrook et al., supra. Nützliche Marker umfassen sowohl Radioisotope als auch nicht-radioaktive Reportergruppen. Zu isotopen Markern zählen ³H, ³&sup5;S, ³²P, ¹²&sup5;I, Kobalt und ¹&sup4;C. Die meisten Methoden der Isotopenmarkierung involvieren die Verwendung von Enzymen und umfassen bekannte Methoden wie die Nick-Translation, Endmarkierung, Zweitstrang-Synthese und reverse Transkription. Bei Verwendung radiomarkierter Sonden kann die Hybridisierung mittels Autoradiographie, Szintillationszählung oder Gammazählung nachgewiesen werden. Die ausgewählte Nachweismethode hängt von den Hybridisierungsbedingungen und dem speziell zur Markierung verwendeten Radioisotop ab.
- Auch nicht-isotope Stoffe können zur Markierung verwendet und intern in die Sequenz oder an das Ende der Sequenz eingebaut werden. Modifizierte Nukleotide können enzymatisch oder chemisch eingebaut werden, wobei chemische Modifikationen der Sonde während oder nach Synthese der Sonde beispielsweise durch Verwendung nicht-nukleotider Linkergruppen vorgenommen werden können. Zu nicht-isotopen Markern zählen fluoreszierende Moleküle, chemilumineszierende Moleküle, Enzyme, Cofaktoren, Enzymsubstrate, Haptene oder andere Liganden. Wir ziehen derzeit die Verwendung von Acridiniumestern vor.
- Im Anschluß an die Synthese und Reinigung einer bestimmten Oligonukleotid- Sequenz können verschiedene Verfahrensweisen zur Bestimmung der Annehmbarkeit des Endprodukts angewandt werden. Die erste ist die Polyacrylamid- Gelelektrophorese, die zur Bestimmung der Größe angewandt wird. Sambrook et al., supra. Derartige Verfahrensweisen sind im Fachbereich wohlbekannt. Über die Polyacrylamid-Gelelektrophorese hinaus können auch Hochdruck- Flüssigchromatographie ("HPLC")-Verfahrensweisen zur Bestimmung von Größe und Reinheit des Oligonukleotid-Produkts angewandt werden. Diese Verfahrensweisen sind den Fachleuten des Bereichs ebenfalls bekannt.
- Es wird für Fachleute des Bereichs erkennbar sein, daß Faktoren, die die Wärmebeständigkeit beeinflussen, auch die Sonden-Spezifität beeinflussen können und daher kontrolliert werden müssen. Deshalb sollte das Schmelzprofil, einschließlich der Schmelztemperatur (Tm) des Oligonukleotid/Ziel-Hybrids, bestimmt werden. Die bevorzugte Methode ist bei Arnold et al., WO 890247, eingereicht am 21. September 1988 mit dem Titel "Homogener Schutz-Assay", beschrieben.
- Zur Tm-Messung unter Verwendung eines Hybridisierungs-Schutz-Assay (HPA) wird folgende Technik angewandt. Ein Sonden : Ziel-Hybrid wird bei einem Überschuß an Ziel in einer Lithiumsuccinat-gepufferten Lösung, enthaltend Lithiumlaurylsulfat, hergestellt. Teilmengen dieses Hybrids werden im Hybridisierungs-Puffer verdünnt und fünf Minuten lang bei verschiedenen Temperaturen, ausgehend von unterhalb der erwarteten Tm (typischerweise 55ºC) und fortgesetzt in Erhöhungen von 2-5 Grad inkubiert. Diese Lösung wird dann mit einem mild alkalischen Borat-Puffer verdünnt und bei niedrigerer Temperatur (z. B. 50ºC) 10 Minuten lang inkubiert. Unter diesen Bedingungen wird der an eine einzelsträngige Sonde gebundene Acridiniumester hydrolysiert, wohingegen der an hybridisierte Sonde gebundene Acridiniumester relativ geschützt vor Hydrolyse ist. Die Menge an verbleibender Chemilumineszenz ist proportional zur Menge an Hybrid und wird in einem Luminometer durch Zugabe von Wasserstoffperoxid, gefolgt von Alkali, gemessen. Die Daten werden als Prozentzahl des maximalen Signals (gewöhnlich von der niedrigsten Temperatur) versus Temperatur aufgetragen. Die Tm ist als der Punkt definiert, bei dem 50% des maximalen Signals verbleiben.
- Über die obige Methode hinaus kann die Schmelztemperatur des Oligonukleotid/Ziel- Hybrids auch mittels den Fachleuten des Bereichs wohlbekannter isotoper Methoden bestimmt werden. Es sollte zur Kenntnis genommen werden, daß die Tm für einen gegebenen Hybrid in Abhängigkeit von der verwendeten Hybridisierungslösung variiert, da die Wärmebeständigkeit von der Konzentration verschiedener Salze, Detergentien und anderer gelöster Stoffe, die die relative Hybridstabilität während der Wärmedenaturierung beeinflussen, abhängt. Sambrook et al., supra.
- Die Rate der Hybridisierung läßt sich durch Bestimmung des C&sub0;t1/2 messen. Die Rate, bei der eine Sonde an ihr Ziel hybridisiert, stellt ein Maß der Wärmebeständigkeit der Ziel-Sekundärstruktur in der Sondenregion dar. Die Standardmessung der Hybridisierungsrate ist der C&sub0;t1/2, der als Mol Nukleotid pro Liter mal Sekunden gemessen wird. Folglich ist sie die Konzentration der Sonde mal der Halbwertszeit der Hybridisierung bei jener Konzentration. Dieser Wert wird durch Hybridisierung verschiedener Mengen an Sonde an eine Konstantmenge an Hybrid über einen festgelegten Zeitraum hinweg bestimmt. Zum Beispiel werden 0,05 pMol Ziel mit 0,0012, 0,025, 0,05, 0,1 und 0,2 pMol Sonde über 30 Minuten hinweg inkubiert. Die Menge an Hybrid nach 30 Minuten wird mittels HPA, wie oben beschrieben, gemessen. Das Signal wird dann als ein Logarithmus des Prozentsatzes des Maximums an Relativen Licht-Einheiten (RLU) (von der höchsten Sondenkonzentration) versus Sondenkonzentration (Mol Nukleotid pro Liter) aufgetragen. RLU sind ein Maß der Photonenmenge, wie durch die markierte Sonde abgestrahlt und mittels des Luminometers gemessen. Der C&sub0;t1/2 wird aus der Konzentration entsprechend 50% der maximalen Hybridisierung, multipliziert durch die Hybridisierungsdauer in Sekunden, graphisch ermittelt. Diese Werte liegen im Bereich von 9,0 · 10&sup6; bis 9 · 10¹ wobei die bevorzugten Werte unter 3,5 · 10&sup5; liegen.
- Wie von Kohne und Kacian, EP 229442, eingereicht am 10. Juni 1986, beschrieben, können weitere Methoden zur Nukleinsäure-Reassoziation angewandt werden.
- Das folgenden Beispiel gibt zu einer einzigartigen rmA-Sequenz, oder dem entsprechenden Gen, eines Ziel-Organismus, Mycobacterium tuberculosis, komplementäre synthetische Sonden und deren Verwendung in einem Hybridisierungsassay wieder.
- Eine für M. tuberculosis spezifische Sonde wurde durch Sequenzierung mit einem zu 16S rmA komplementären Primer identifiziert. Die folgenden Sequenzen wurden charakterisiert und als spezifisch für Mycobacterium tuberculosis gezeigt; (SEQ ID Nr. 1) GGTAGCGCTGAGACATATCCTCC und (SEQ ID Nr. 2) CAGAACTCCACACCCCCGAAG. Verschiedene phylogenetisch nahe Nachbarn, umfassend M. kansasii, M. asiaticum und M. avium, wurden als Vergleiche zur Sequenz von M. tuberculosis verwendet. SEQ ID Nr. 1 ist 23 Basen lang und hybridisiert an die 23S rmA von M. tuberculosis entsprechend den Basen 270-293 von E. coli. SEQ ID Nr. 2 ist 21 Basen lang und hybridisiert an die 23S rmA von M. tuberculosis entsprechend den Basen 1415-1436 von E. coli.
- Um die Reaktivität und Spezifität der Sonde für M. tuberculosis nachzuweisen, wurde sie in einem Hybridisierungsassay verwendet. Die Sonde wurde zunächst mit einem nicht-nukleotiden Linker synthetisiert, dann mit chemilumineszierendem Acridiniumester markiert, wie beschrieben in EPO-Patentanmeldung Nr. EP 3122481 mit dem Titel "Acridiniumester-Markierung und Reinigung von Nukleotid-Sonden", eingereicht am 5. Oktober 1988. Der an unhybridisierte Sonde gebundene Acridiniumester wird unter mild alkalischen Bedingungen nicht-chemiluminszierend gemacht, während der an hybridisierte Sonde gebundene Acridiniumester relativ resistent ist. Auf diese Weise ist es möglich, die Hybridisierung von Acridiniumestermarkierter Sonde durch Inkubation mit einem alkalischen Puffer, gefolgt durch Nachweis der Chemilumineszenz in einem Luminometer, zu untersuchen. Die Ergebnisse sind in RLU angegeben, die durch die markierte Sonde emittierte Photonenmenge wird mittels des Luminometers gemessen. Die Bedingungen der Hybridisierung, Hydrolyse und des Nachweises sind beschrieben bei Arnold et al., 35 Clin. Chem. 1588, 1989.
- Die Nukleinsäure-Hybridisierung wurde durch Verwendung von "Helfer-Sonden" gefördert, wie beschrieben bei Hogan et al., US-Patentschrift Nr. 5.030.557. RNA wurde an die Acridiniumester-markierte Sonde in Gegenwart einer unmarkierten Helfer-Sonde hybridisiert. Die Sonde entsprechend der Oligonukleotid-SEQ ID Nr. 1 mit Helfern:
- (SEQ ID Nr. 3) CCGCTAACCACGACACTTTCTGTACTGCCTCTCAGCCG UND
- (SEQ ID Nr. 4) CACAACCCCGCACACACAACCCCTACCCGGTTACCC.
- Die Sonde entsprechend der Oligonukleotid-SEQ ID Nr. 2 mit Helfern: (SEQ ID Nr. 5)
- TGATTCGTCACGGGCGCCCACACACGGGTACGGGAATATCAACCC und
- (SEQ ID Nr. 6) CTACTACCAGCCGAAGTTCCCACGCAGCCC und
- (SEQ ID Nr. 7) GGAGTTGATCGATCCGGTTTTGGGTGGTTAGTACCGC und
- (SEQ ID Nr. 8) GGGGTACGGGCCGTGTGTGTGCTCGCTAGAGGCTTTTCTTGGC.
- Im folgenden Experiment wurde aus einer Kolonie oder > 10&sup8; Organismen freigesetzte RNA untersucht. Ein Beispiel dieser Methode ist bei Murphy et al. (EP 873036412, eingereicht am 24. April 1987 und veröffentlicht als EP-A-0 288 618, wiedergegeben. Ein RLU-Wert von größer 30.000 RLU zeigt eine positive Reaktion an, ein RLU-Wert von kleiner 30.000 eine negative Reaktion.
- Die folgenden Daten zeigen, daß die Sonden nicht mit Organismen eines breiten phylogenetischen Querschnitts kreuzreagierten. Die Proben wurden auch mit einer Sonde (ALL BACT.) getestet, die eine sehr breite Spezifität ausweist, um eine positive Kontrolle bereitzustellen. Ein positives Signal von dieser Sonde liefert die Bestätigung für die Eignung der Probe.
- Die obigen Daten bestätigen, daß die hierin beschriebenen und beanspruchten neuartigen Sonden zur Unterscheidung von Angehörigen des Mycobacterium tubercuiosis-Komplex von ihren bekannten nächsten phylogenetischen Nachbarn in der Lage sind.
- Weitere Ausführungsformen sind in den folgenden Ansprüchen zu finden.
- (1) ALLGEMEINE INFORMATION:
- (i) ANMELDER: GEN-PROBE INCORPORATED
- 9880 CAMPUS POINT DRIVE,
- SAN DIEGO, CALIFORNIA 92121, U. S. A.
- (ii) TiTEL DER ERFINDUNG: NUKLEINSÄURE-SONDEN FÜR MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
- (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 8
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 1:
- (I) SEQUENZ-MERKMALE:
- (A) LÄNGE: 23
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (II) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 1:
- GGTAGCGCTG AGACATATCC TCC 23
- (3) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 2:
- (i) SEQUENZ-MERKMALE:
- (A) LÄNGE: 21
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (II) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 2:
- CAGAACTCCA CACCCCCGAA G 21
- (4) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 3:
- (i) SEQUENZ-MERKMALE:
- (A) LÄNGE: 38
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (II) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 3:
- CCGCTAACCA CGACACTTTC TGTACTGCCT CTCAGCCG 38
- (5) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 4:
- (I) SEQUENZ-MERKMALE:
- (A) LÄNGE: 36
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (II) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 4:
- CACAACCCCG CACACACAAC CCCTACCCGG TTACCC 36
- (6) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 5:
- (i) SEQUENZ-MERKMALE:
- (A) LÄNGE: 45
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (II) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 5:
- TGATTCGTCA CGGGCGCCCA CACACGGGTA CGGGAATATC AACCC 45
- (7) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 6:
- (i) SEQUENZ-MERKMALE:
- (A) LÄNGE: 30
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (II) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 6:
- CTACTACCAG CCGAAGTTCC CACGCAGCCC 30
- (8) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 7:
- (I) SEQUENZ-MERKMALE:
- (A) LÄNGE: 37
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (II) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 7:
- GGAGTTGATC GATCCGGTTT TGGGTGGTTA GTACCGC 37
- (9) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 8:
- (i) SEQUENZ-MERKMALE:
- (A) LÄNGE: 43
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (II) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 8:
- GGGGTACGGG CCGTGTGTGT GCTCGCTAGA GGCTTTTCTT GGC 43
Claims (15)
1. Hybridisierungsassay-Sonde, mit der der Nachweis des Vorhandenseins von
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis
BCG und Mycobacterium africanum möglich ist, umfassend ein gereinigtes
Oligonukleotid, das mindestens 14 von 17 benachbarten Basen enthält, die
perfekt komplementär zu einer Nukleinsäure-Sequenz sind, gewählt aus
GGTAGCGCTGAGACATATCCTCC (Sequenz ID Nr. 1) und der dazu
komplementären Sequenz;
wobei unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen die Sonde an
Nukleinsäure von Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis,
Mycobacterium bovis BCG und Mycobacterium africanum hybridisiert und
dabei einen nachweisbaren Sonden : Ziel-Duplex bildet, und
wobei unter diesen Bedingungen diese Sonde Nukleinsäure von
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis
BCG und Mycobacterium africanum von Nukleinsäure von Mycobacterium
avium, Mycobacterium asiaticum und Mycobacterium kansasii unterscheidet.
2. Sonde nach Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid eine Nukleotidsequenz
enthält, gewählt aus GGTAGCGCTGAGACATATCCTCC und der dazu
komplementären Sequenz.
3. Sonde nach Anspruch 2, wobei das Oligonukleotid in einer Nukleotidsequenz
besteht, gewählt aus GGTAGCGCTGAGACATATCCTCC und der dazu
komplementären Sequenz.
4. Sonde nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Oligonukleotid zwischen
20 und 50 Basen lang ist.
5. Hybridisierungsassay-Sonde, mit der der Nachweis des Vorhandenseins von
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis
BCG und Mycobacterium africanum möglich ist, umfassend ein gereinigtes
Oligonukleotid, die mindestens 14 von 17 benachbarten Basen enthält, die
perfekt komplementär zu einer Nukleinsäure-Sequenz sind, gewählt aus
CAGAACTCCACACCCCCGAAG (Sequenz ID Nr. 2) und der dazu
komplementären Sequenz;
wobei unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen die Sonde an
Nukleinsäure von Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis,
Mycobacterium bovis BCG und Mycobacterium africanum hybridisiert und
dabei einen nachweisbaren Sonden : Ziel-Duplex bildet, und
wobei unter diesen Bedingungen diese Sonde Nukleinsäure von
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis
BCG und Mycobacterium africanum von Nukleinsäure von Mycobacterium
avium, Mycobacterium asiaticum und Mycobacterium kansasii unterscheidet.
6. Sonde nach Anspruch 5, wobei das Oligonukleotid eine Nukleotidsequenz
enthält, gewählt aus CAGAACTCCACACCCCCGAAG und der dazu
komplementären Sequenz.
7. Sonde nach Anspruch 6, wobei das Oligonukleotid in einer Nukleotidsequenz
besteht, gewählt aus CAGAACTCCACACCCCCGAAG und der dazu
komplementären Sequenz.
8. Sonde nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, wobei das Oligonukleotid zwischen
20 und 50 Basen lang ist.
9. Nukleinsäure-Hybrid, gebildet zwischen einem Oligonukleotid nach einem der
Ansprüche 1 bis 8 und einer dazu komplementären Nukleinsäure.
10. Sondengemisch, umfassend ein Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1
bis 4 und eine Helfer-Sonde.
11. Sondengemisch nach Anspruch 10, wobei die Helfer-Sonde ein
Oligonukleotid ist, umfassend die als SEQ ID NRN. 3 oder 4 gezeigte
Oligonukleotid-Sequenz oder eine dazu komplementäre Sequenz.
12. Sondengemisch, umfassend ein Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 5
bis 8 und eine Helfer-Sonde.
13. Sondengemisch nach Anspruch 12, wobei die Helfer-Sönde ein
Oligonukleotid ist, umfassend die als SEQ ID NR. 5, 6, 7 oder 8 gezeigte
Oligonukleotid-Sequenz oder eine dazu komplementäre Sequenz.
14. Verfahren zur Bestimmung des möglichen Vorhandenseins von
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis
BCG und Mycobacterium africanum in einer Probe, umfassend die folgenden
Schritte:
a) Zusammenbringen dieser Probe mit einer Hybridisierungsassay-Sonde
nach einem der Ansprüche 1 bis 8 unter hochstringenten
Hybridisierungsbedingungen; und
b) Nachweisen des Vorhandenseins von Sonden : Ziel-Duplex, wie unter
diesen Hybridisierungsbedingungen gebildet, als einen Hinweis auf das
mögliche Vorhandensein von Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium
bovis, Mycobacterium bovis BCG oder Mycobacterium africanum in der
Probe.
15. Verfahren zur Bestimmung des möglichen Vorhandenseins von
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacferium bovis, Mycobacterium bovis
BCG und Mycobacterium africanum in einer Probe, umfassend die folgenden
Schritte:
a) Zusammenbringen dieser Probe mit einem Sondengemisch nach einem
der Ansprüche 10 bis 13 unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen;
und
b) Nachweisen des Vorhandenseins des Hybridisierungsonden : Ziel-Duplex,
wie unter diesen Hybridisierungsbedingungen gebildet, als einen Hinweis auf
das mögliche Vorhandensein von Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis BCG oder Mycobacterium
africanum in der Probe.
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