DE69322092T2

DE69322092T2 - Neue bakterielle impfstoffe unter verwendung von impfstämmen von pathogenen bakterien

Info

Publication number: DE69322092T2
Application number: DE69322092T
Authority: DE
Inventors: Brenda J. Saskatoon Saskatchewan S7H 3C8 Allan; Andrew A. Saskatoon Saskatchewan S7H 3S5 Potter
Original assignee: University of Saskatchewan
Current assignee: University of Saskatchewan
Priority date: 1992-09-04
Filing date: 1993-09-03
Publication date: 1999-07-15
Anticipated expiration: 2013-09-04
Also published as: EP0659086A1; DE69322092D1; ATE173166T1; US5747309A; AU4939193A; CA2143299A1; WO1994005326A1; AU683221B2; EP0659086B1

Description

Bereich der Erfindung:

Die vorliegende Erfindung betrifft Impfstoffe gegen pathogene Bakterien.

Veröffentlichungen:

Die nachfolgenden Veröffentlichungen werden in dieser Anmeldung an den relevanten Stellen der Anmeldung als hochgestellte Zahlen zitiert.
1. Aitken et al., Vaccine, 10:271 (1992).
2. Bouvier et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 81:4139-4143 (1984).
3. Cheville et al., J. Am. Yet. Med. Assoc., 173:584- 587 (1978).
4. Dozois et al., Infection and Immunity, July 1992:2648-2656 (1992).
5. Fairweather et al., Res. Microbiol., 141:769-773 (1990).
6. Fontaine et al., Res. Microbiol., 141:907-912 (1990).
7. Gross, Diseases of Poultry, 9th Ed.:138-144 (1991).
8. Curtiss III et al., Infection and Immunity, 55:3035-3043 (1987).
9. Hormaeche et al., Res. Microbiol., 141:757-764 (1990).
10. Jones et al., Vaccine, 10:280 (1992).
11. Lafont et al., Infection and Immunity, Jan. 1987:193-197 (1987).
12. Leitner et al., Avian Dis., 36:211-220 (1992).
13. Meister, Adv. Enz., 62:315-374 (1989).
14. Mergeay et al., Molec. Gen. Genet., 133:299-316 (1974).
15. Miller et al., Res. Microbiol., 141:817-821 (1990).
16. Moon, Vaccine, 10:269 (1992).
17. Nakamura et al., Vet. Pathol., 2:592-597 (1985).
18. Nyunoya et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 80:4629-4633 (1983).
19. Nyunoya et al., J. Biol. Chem., 259:9790-9798 (1984).
20. Piette et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 81:4134-4138 (1984).
21. Sternberg et al., Methods Enz., 204:18-28 (1991).
22. Stocker, U.S. Patent No. 5,077,044 (1991).
23. Trotta et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 68:2599- 2603 (1971).
24. Vidotto et al., Avian Dis., 34:531-538 (1990).
25. Ron, U.S. Patent No. 4,404,186 (1983).
26. Kunkel, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 82:488-492 (1985).
27. Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Ed.:1.5, 1.74 and 1.75 (1989).
28. Stocker, U.S. Patent No. 5,210,035 (1993).
29. Emery et al., North Central Avian Diseased Conference, 23-34 (1988).
30. Griffin et al., Vaccine, 11:457-462(1993).
31. Nagaraja et al., International Publication No. WO92/12732 (1992).
32. Bagg et al., J. Bact., 161:457-462 (1993).
33. Hantke, FEMS Micro. Letters, 15:83-86 (1982).
34. Hantke, Mol. Gen. Genet., 182:288-292 (1991).
35. Webster, Mol. Microbiol., 5:1005-1011 (1991).
36. Wandersman et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 87:4776-4780 (1990).
37. Davies et al., J. Bact., 123:102-117 (1975).
38. Leyh et al., Arm. J. Vet. Res., 49:687-692 (1988).
39. Heesemann et al., 93rd Gen. Mtg. of A.S.M., Abstract B-295 (1993).
40. Rioux et al., Anal. Biochem., 133:163-169 (1983).
41. Fields et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 83:5189-5193 (1986).
42. Kleckner, Cell, 16:711-720 (1979).
43. Halling et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 79:2608-2612 (1982).
44. Bender et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 89:7996-8000 (1992).

Hintergrund der Erfindung

Die Impfung mit lebenden abgeschwächten Stämmen wird in der Vorbeugung verschiedener viraler Krankheiten des Menschen, wie Polio und Pocken, weitreichend und erfolgreich verwendet. Es gibt jedoch nur wenige solcher Impfstoffe, welche gegen bakterielle Erkrankungen des Menschen oder von Haustieren wirksam sind; BCG-Impfstoff zur Vorbeugung von Tuberkulose, Stamm 19-Impfstoff gegen Rinder-Brucellose und Sternes- Sporenimpfstoff gegen Rinder-Milzbrand sind gut bekannte Beispiele. Die Verwendung von lebenden Impfstoffen ist durch eine Reihe von Faktoren erschwert. Einige Stämme, die zur Verwendung als lebende Impfstoffe in Erwägung gezogen wurden, behalten durch Reversion oder andersartig einen nicht akzeptierbaren Grad an Virulenz. Einige lebende Impfstoffe zeigen eine kurze Immunpersistenz, was auf frühes Verschwinden des Impfstammes aus den Wirtsgeweben zurückgeführt wird, und in einigen Fällen unvollständige Immunität, so daß einige geimpfte Tiere nach Infektion mit einem virulenten Stamm sterben.
Die nicht-virulenten Stämme, die als Impfstoffe verwendet werden, sind auf unterschiedliche Arten erhalten worden. Der BCG-Stamm wurde durch empirische Verfahren während einer verlängerten in vitro-Kultivierung erhalten und seine Nichtvirulenz beruht wahrscheinlich auf zahlreichen nicht identifizierten Mutationen. Sternes Bacillus anthracis - Sporenimpfstoff ist ein Stamm, welcher die Fähigkeit, die Polypeptid-Kapsel zu synthetisieren, verloren hat, welche als eine Determinante der Virulenz, jedoch nicht als ein "schützendes" Antigen wichtig ist. Einige Experimentatoren haben als lebenden Impfstoff lediglich eine subletale Dosis eines "Wildtyp"-Stammes relativ niedriger Virulenz verwendet, in dem Sinne, daß die LD50 eine große Anzahl an Bakterien war - eine Situation, in welcher ein klares Risiko zur Entwicklung einer schweren oder tödlichen Infektion in einigen der geimpften Patienten und zur Übertragung auf andere Wirte existiert.
Da lebende Impfstoffe eine größere Erfolgswahrscheinlichkeit bei der Bereitstellung von Schutz für den Wirt gegen ein nachfolgendes Eindringen eines virulenten Wildstammes haben als abgetötete Impfstoffe oder Impfstoffe aus Untereinheiten, ist es wünschenswert, neue lebende Impfstoffe zu entwickeln, welche die Unzulänglichkeiten der zuvor hergestellten Impfstoffe vermeiden. Da die Immunantwort des Vertebratenwirtes auf Antigene, insbesondere Oberflächenantigene, des pathogenen Mikroorganismus der grundlegende Schutzmechanismus durch Impfung ist, sollte ein lebender Impfstoff das antigene Komplement des Wildtypstammes enthalten. Der lebende Impfstoff sollte nicht virulent sein und im wesentlichen einer anhaltenden Vermehrung im Wirt unfähig sein.
Einige lebende attenuierte Salmonella-Impfstoffe wurden kürzlich gegen intrazelluläre pathogene Salmonellen entwickelt. Diese beinhalten mutierte aroA-Stämme9,10, Stämme mit Mutationen in der phoP-Virulenzregion¹&sup5;, ΔcyaΔcrp-S. typhimurium&sup8; und aroAaroC- Mutanten&sup5;. Man stellte fest, daß Purin-Mutationen zu attenuierend für Immunogenität sind¹&sup5;. Eine aroA-Mutante erwies sich als unwirksam gegen eine orale Infektion, wenn sie oral verabreicht wurde³&sup0;.
Lebende attenuierte Impfstämme der intrazellulären pathogenen bakteriellen Shigella flexneri und S. dysenteriae wurden auch entwickelt&sup6;. Im U.S. Patent Nummer 5.077.044 sind z. B. neue nicht-revertierende lebende Shigella-Impfstoffe offenbart, welche durch die Produktion auxotropher Mutanten eines pathogenen Stammes hergestellt wurden22,28.
Impfstoffe, die zur Vorbeugung gegen Escherichia coli (nachfolgend E. coli)-Infektion entwickelt wurden, beinhalten parenteral verabreichte Impfstoffe, welche Pilus-Antigene enthalten¹&sup6;, und oral verabreichte Impfstoffe, welche rekombinante Enterotoxine enthalten¹. Lebende Impfstoffe, welche mutierte nicht-pathogene Stämme von E. coli verwenden, sind ebenfalls offenbart worden²&sup5;. Eine temperatursensitive Mutante von E. coli, welche unter Verwendung eines chemischen Mutagens hergestellt wurde, ist intravenös und oral verabreicht worden29,31.
Die E. coli-Infektion in Truthähnen und Hühnern manifestiert sich in verschiedenen Formen, wobei die herkömmlichste Colisepsis ist, eine respiratorische Krankheit, welche durch Luftsackentzündung ("airsacculitis"), Pericarditis und Perihepatitis charakterisiert ist&sup7;. Diese Erkrankung ist die Hauptursache wirtschaftlichen Verlustes wegen infektiöser Erkrankungen für Truthahnzüchter in Kanada und den Vereinigten Staaten von Amerika. Die primäre Stelle der Kolonisierung sind die oberen Atemwege, gefolgt von einer Ausweitung in die unteren Atemwege. E. coli wird im allgemeinen durch einen kontaminierten Abfallstaub inhaliert und gelangt daraufhin in den Blutstrom, wahrscheinlich über pulmonale Lymphgefäße. Zirkulierende Bakterien werden dann in den der Zentralvene der Leber benachbarten Sinusoiden und in den Randzonen der periarteriolaren retikulären Hülle der Milz festgehalten. Solche Infektionen entwickeln sich gelegentlich als ein sekundäres Ereignis, welches einer Mykoplasmen- oder viralen Infektion nachfolgt. Die häufigsten primären viralen Wirkstoffe sind das atypische Geflügelpest-Virus und das hämorrhagische Enteritis- Virus (HEV). Somit sollte ein Impfstoff für E. coli, um wirkungsvoll zu sein, sowohl für solche sekundäre Infektionen wie auch gegen den primären Angriff aktiv sein.
E. coli werden im allgemeinen in Geflügelfarmen gefunden. Nur bestimmte Isolate sind jedoch in der Lage, Krankheit zu verursachen, und diese können mit einer Methode, welche Serotypisierung genannt wird, Gruppen zugeordnet werden. Die verbreitetsten Serotypen, die mit Krankheit in Kanada und den Vereinigten Staaten von Amerika assoziiert sind, sind 01, 02 und 0783,17. Jeder Serotyp weist eine Anzahl von Virulenzdeterminanten auf, von welchen gezeigt wurde, daß sie Schutzimmunität hervorrufen, wenn man sie in experimentelle Impfstoffe inkorporiert. Diese beinhalten Fimbrien (Pili), Fortsätze, die von den Bakterien verwendet werden, um sich an das Wirtsgewebe anzuheften, äußere Membranproteine, welche speziell dazu hergestellt werden, Nährstoffe des Wirtes für ihr Wachstum zu binden und zu verwenden, und Toxine, welche fähig sind, die Immunfunktion zu beeinträchtigen. Die Verabreichung dieser als Impfstoffkomponenten erfolgt jedoch im allgemeinen durch Injektion, ein Verfahren, das auf dem Gebiet nicht geeignet ist. Studien über Virulenz-Determinanten, welche mit E. coli assoziiert sind, welche aus coliseptischen Hühnern und Truthähnen isoliert wurden, zeigten, daß die Anwesenheit des Aerobaktinsystems, die Anwesenheit von Anheftungspili, und die Resistenz gegen normales Serum mit E. coli assoziiert waren, welche Colisepsis (in Geflügel) oder Letalität (in einem Tag alten Küken verursachen4,24. In virulenten Stämmen vorhandene andere Charakteristika waren das Eindringen in HeLa- und Hühnerfibroblastenzellen und Colicin V²&sup4;.
Trotz Fortschritten auf dem Fachgebiet besteht noch immer ein Bedarf für einen wirkungsvollen, leicht verabreichbaren Impfstoff gegen Infektionen durch pathogene Bakterien, einschließlich E. coli.

Zusammenfassung der Erfindung

Es werden Impfstoffe zur Impfung eines Tieres gegen pathogene Bakterien, einschließlich E. coli, bereitgestellt. Die Erfindung beinhaltet auch Verfahren zur Herstellung und Verfahren zur Verwendung von Impfstämmen und Arzneimitteln, die daraus resultieren oder in diesen Verfahren verwendet werden. Demgemäß stellt die Erfindung in einem Aspekt Impfstämme pathogener Bakterien bereit, umfassend mindestens eine Mutation, die ausgewählt ist aus einer Pyrimidinstoffwechselweg-Mutation, einer Eisenstoffwechsel-Mutation und einer Colicintransport- Mutation, wobei die Mutation eine Attenuierung der Virulenz des Bakteriums vermittelt.
Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstammes eines pathogenen Bakteriums bereit, umfassend:
(a) Erzeugen mindestens einer Mutation in einem virulenten Stamm der pathogenen Bakterien, um einen attenuierten Organismus bereitzustellen, wobei die Mutation ausgewählt ist aus einer Pyrimidinstoffwechselweg-Mutation, einer Eisenstoffwechsel- Mutation und einer Colicintransport-Mutation;
(b) Isolierung des attenuierten Organismus; und
(c) seine Verwendung als Impfstamm.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Impfstoffzusammensetzung, umfassend mindestens einen Impfstamm eines pathogenen Bakteriums, das mindestens eine attenuierte Mutation ausgewählt aus einer Pyrimidinstoffwechsel-Mutation, einer Eisenstoffwechsel-Mutation und einer Colicintransport- Mutation, hat.
Noch ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Arzneimittel, umfassend eine wirksame Menge von mindestens einem Impfstamm eines pathogenen Bakteriums, wobei der Impfstamm mindestens eine Mutation umfaßt, die ausgewählt ist aus einer Pyrimidinstoffwechsel-Mutation, einer Eisenstoffwechsel-Mutation und einer Colicintransport-Mutation und, gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.

Beschreibung der Erfindung

A. Definitionen

Die folgenden Begriffe haben, wie sie hierin verwendet werden, die folgenden Bedeutungen:
Antigen: Bezieht sich auf ein Molekül, welches ein oder mehrere Epitope enthält, welches das Immunsystem eines Wirtes dazu stimuliert, eine humorale und/oder zelluläre Antigen- spezifische Antwort zu geben. Für die Zwecke dieser Anmeldung werden "Antigen" und " Immunogen" austauschbar verwendet.
Attenuierung: Verminderung der Virulenz in einem Stamm eines Organismus.
Bakterielle Erkrankung: Eine Krankheit, welche durch ein Bakterium verursacht wird, einschließlich diejenige Krankheiten, welche ausschließlich in Anwesenheit einer prädisponierenden viralen Infektion oder wenn der Wirt unter Streß steht auftreten.
CarAB: Das Operon, welches Carbamylphosphatase codiert. Wenn es in mit nachfolgender Serotypnummer verwendet wird, bezeichnet es die Anwesenheit einer carAB-Mutation in diesem Organismus.
Colicintransport-Mutation: Eine Mutation in einem oder mehreren der Gene, die Proteine codieren, welche in die Erkennung und/oder den Transport von Colicinen in eine Bakterienzelle involviert sind.
Colisepsis: Krankheit, welche durch E. coli-Infektion verursacht wird, einschließend, jedoch nicht eingeschränkt auf, Cellulitis, Luftsackentzündung ("air sacculitis"), und Nabelentzündung. Für die Zwecke dieser Anmeldung werden "Colisepsis" und "Colibacillose" austauschbar verwendet.
Wirkungsvolle Menge: Dosis, welche erforderlich ist um eine Immunantwort zu veranlassen, welche zum Schutz eines Tieres gegen Krankheit ausreichend ist.
Extrazelluläre pathogene Bakterien: Pathogene Bakterien, für welche es nicht erforderlich ist, sich innerhalb einer Wirtszelle zu replizieren, um Krankheit zu verursachen.
fur: Das Gen, welches das fur-Protein codiert, welches als ein allgemeiner Eisenregulator in bakteriellen Zellen funktioniert. Bei Verwendung in mit nachfolgender Serotypnummer, wird die Anwesenheit einer fur-Mutation in diesem Organismus bezeichnet.
Immunantwort: Entwicklung einer zellulären und/oder Antikörper-vermittelten Immunantwort auf ein ausgewähltes Arzneimittel oder einen ausgewählten Impfstoff in dem Wirt. Solch eine Antwort besteht gewöhnlich aus der Herstellung der Antikörper, B-Zellen, T-Helferzellen, T-Suppressorzellen, und/oder cytotoxischen T-Zellen, welche spezifisch gegen ein Antigen oder Antigene gerichtet sind, die in dem ausgewählten Arzneimittel oder Impfstoff enthalten sind.
Immunogen: Fähig, eine Immunantwort zu veranlassen.
Intrazelluläre pathogene Bakterien: Pathogene Bakterien, welche sich innerhalb einer Wirtszelle replizieren müssen, um Krankheit zu verursachen.
Eisenstoffwechsel-Mutation: Eine Mutation in einem oder mehreren der Gene, die Proteine codieren, die an der Eisenaufnahme, -Verwendung, und/oder -Regulation in einer bakteriellen Zelle beteiligt sind. Für die Zwecke dieser Anmeldung beinhaltet Eisenstoffwechsel-Mutation Modifikationen jeglicher metabolischer Funktion, welche durch eines dieser Gene reguliert wird, unabhängig davon, ob diese Funktion auf Eisen bezogen ist.
Erkrankungsrate: Feststellung von Krankheit, einschließlich das Auftreten von Läsionen in Geweben.
Pathogen: Fähig, Krankheit zu verursachen.
Schützend: Fähig, ein Tier gegen Krankheit zu schützen. Pyrimidinstoffwechsel-Mutation: Eine Mutation in einem oder mehreren der Gene, die Enzyme codieren, welche an dem Pyrimidinstoffwechselweg einer Bakterienzelle beteiligt sind.
Stabile Mutanten: Eine Mutante mit einer niedrigen Reversionsfrequenz. Im allgemeinen werden Mutanten mit Reversionsfrequenzen von weniger als 10&supmin;&sup7; als stabil bewertet, mit Reversionsfrequenzen von weniger als 1 · 10&supmin;&sup8; als sichere Impfstämme bewertet.
tolC: Das Gen, welches ein äußeres Membranprotein codiert, welches am Colicintransport, Hämolysintransport, und der Prozessierung anderer Membranproteine sowie der Teilung des Chromosoms beteiligt ist. Wenn in , gefolgt von einer Serotyp- Nummer verwendet, bezeichnet es die Anwesenheit einer tolC- Mutation in diesem Organismus.
Transduktion: Transfer von genetischem Material und seine phänotypische Expression von einer Zelle auf die andere durch virale Infektion.
Impfstamm: Ein normalerweise virulenter Bakterienstamm, welcher derart attenuiert worden ist, daß er nicht länger im Wirt Krankheit verursacht, jedoch die Fähigkeit besitzt, in dem Wirt eine Immunantwort zu veranlassen, um den Wirt vor einem virulenten pathogenen Stamm zu schützen.
Impfstämme können lebend oder tot sein. Abgetötete Impfstämme können für die in ovo-Inokulation oder die parenterale Verabreichung bevorzugt sein; lebende Impfstämme können für andere Verabreichungsformen bevorzugt werden.
Virulent: Fähig, Krankheit zu bewirken.

B. Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Diese Erfindung stellt Impfstämme attenuierter pathogener Bakterien bereit. Bevorzugte Impfstämme dieser Erfindung sind Mutanten, die Deletionen haben, da diese Mutanten nicht revertieren sollten. Besonders bevorzugte Impfstämme dieser Erfindung beinhalten auxotrophe Mutanten, welche eine Pyrimidinstoffwechselweg-Mutation haben, welche in dem Stamm einen Bedarf für Uracil verursacht, z. B. carAB, pyrB, pyrC, pyrD und pyrE. Ebenfalls besonders bevorzugte Impfstämme dieser Erfindung beinhalten Mutanten, die im Eisenstoffwechsel defekt sind, z. B. fur, fhuA (oder tonA), fepA, cir und tonB. Weitere besonders bevorzugte Impfstämme der vorliegenden Erfindung beinhalten Mutanten mit Mutationen im Colicin-transport- Mechanismus, z. B. tolC, tolQ, tolR, tolA, tolB, und tolZ. Die am meisten bevorzugten lebenden Impfstämme dieser Erfindung sind auxotrophe Mutanten, welche ein mutantes carAB-Operon besitzen, welches in den Stämmen einen Bedarf für sowohl Arginin als auch Uracil verursacht. Ebenfalls am stärksten bevorzugt sind Mutanten, welche eine fur-Mutation haben, die eine reduzierte Synthese eines Proteins verursacht, welches an der Regulation der Eisenaufnahme beteiligt ist. Ebenfalls ganz besonders bevorzugt sind Mutanten, welche eine tolC Mutation besitzen, welche die Translokation von Colicinen verhindert und für die Hämolysin-Sekretion notwendig zu sein scheint³&sup6;. Damit werden die lebenden Impfstämme dieser Erfindung, nachdem sie in den Wirt eingebracht wurden, weiterleben und eine vorbeugende Immunantwort veranlassen, aber sie werden unfähig sein, eine Krankheit zu verursachen.
Die Verwendung eines lebenden Impfstammes, der eine solche Mutation besitzt, daß der Bakterienstamm die Bereitstellung von mehr als einem Nährstoff benötigt, reduziert die Möglichkeit, daß der Wirt unbeabsichtigterweise die notwendigen Metaboliten zur Replikation der Bakterien bereitstellen könnte. Die Einführung einer zweiten auxotrophen oder anderen Mutation in den lebenden Impfstamm wird die Möglichkeit der Reversion zum Wildtyp weiter reduzieren. Im Hinblick auf die Tatsache, daß von Purinmutanten vorher herausgefunden wurde, daß sie zu attenuiert sind, um immunogen zu sein¹&sup5;, war es unerwartet und überraschend, daß pathogene Bakterien, die Mutationen im Pyrimidinstoffwechselweg enthalten, als lebende Impfstämme verwendbar sein würden. Es ist ebenso unerwartet, daß Mutationen im Stoffwechselweg des Eisenmetabolismus eine derartige Attenuierung pathogener Bakterien verursachen würden, so daß sie als Impfstämme der vorliegenden Erfindung verwendet wurden. Es ist in ähnlicher Weise unerwartet, daß Colicin-tolerante Mutanten attenuiert sein würden. Damit wird ein Fachmann, indem er die grundlegenden Aspekte dieser Erfindung, wie hierin dargestellt, anwendet, die breite Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung erkennen.
Die Verfahren dieser Erfindung zur Herstellung von Impfstoffen wie auch die Impfstoffe dieser Erfindung haben eine große Zahl von Vorteilen gegenüber bisherigen Verfahren und Impfstoffen. Im Gegensatz zu anderen Impfstoffen stellt der Erfindungsgegenstand die genaue Ursache des Virulenzverlustes bereit. Die Stämme sollten dazu befähigt sein, über längere Zeiträume hinweg im Wirt zu überleben, gewöhnlicherweise Wochen, um die Wirkung des immunisierenden Effektes zu verstärken, indem sie das Immunsystem des Wirtes kontinuierlich stimulieren, bis das Wirtsimmunsystem sämtliche Organismen beseitigt hat. Im Hinblick darauf, daß die Nichtvirulenz nicht von irgendeiner zellulären Funktion des Wirtes abhängt, geht man davon aus, daß die Stämme sogar in immundefizienten Wirten nicht virulent sind. Die Impfstoffe dieser Erfindung können bei einer großen Vielfalt von Tieren, sowie dem Menschen verwendet werden. Das beinhaltet Fische, Vögel, Reptilien, Vogelarten und Säuger. Insbesondere eingeschlossen sind Haustiere, welche heute bereits mit Impfstoffen behandelt werden oder welche behandelt werden könnten, wenn sie für bakerielle Erkrankungen anfällig sind, wie Vogelarten, Hasen, Rinder, Schweine, Pferde, Ziegen, Schafe oder andere Tierarten.
Der Mechanismus und die Regulation von Carbamoylphosphatsynthetase in E. coli ist mehrere Jahre lang intensiv untersucht worden2,13,23. Dieses Enzym katalysiert die erste Reaktion in der Pyrimidin- und Argininbiosynthese und ist das Produkt des carAB-Operon. Zahlreiche Mutationen des carAB- Operon sind bekannt, wovon einige E. coli nicht streng auxotroph für Arginin und Uracil machen¹&sup4;. Die Sequenz der beiden Teile des carAB-Operon, das carA-Gen und das carB-Gen sind in der Literatur beschrieben18,19,20.
Der Mechanismus und die Regulation des Eisentransports in E. coli und Salmonella typhimurium ist untersucht worden³²&supmin;³&sup4;. Mutanten, welche im Eisenstoffwechsel defekt sind, werden für die Synthese von Siderophoren und ihren Rezeptoren konstitutiv dereprimiert. Kürzliche Studien von fur-Mutanten in Yersinia zeigten, daß die fur-Mutation keinen Effekt auf die Virulenz hatte³&sup9;. Damit war es unerwartet, herauszufinden, daß die fur- Mutanten der vorliegenden Erfindungen attenuiert sind. Der Mechanismus und die Regulation von Makromolekülimport in E. coli ist seit vielen Jahren intensiv untersucht worden³&sup5;&supmin;³&sup7;. Bakterien, welche spezifische Mutationen tragen, die die Bindung von Colicinen verhindern sind als colicinresistent bezeichnet worden. Mutationen, welche die normale Bindung von Colicinen erlauben, jedoch die Translokation der Makromoleküle zu ihrem Zielort nicht, sind als colicintolerant (tol) bezeichnet worden. Es sind zahlreiche colicinresistente und colicintolerante Mutamen bekannt³&sup7;.
Die jeweilige Mutation, z. B. die Pyrimidinstoffwechselweg- Mutation, die Eisenstoffwechsel-Mutation, oder die Colicintransport-Mutation, kann mit Hilfe von Konjugation, Transformation, und/oder phagenvermittelter Transduktion in pathogene Bakterien eingeführt werden21,27. Das jeweilige Verfahren der Einschleusung ist nicht kritisch und das bevorzugte Verfahren kann von dem Organismus abhängen, welcher transduziert wird und von der jeweiligen Mutation, welche eingeführt werden soll. Diese Operons können in zahlreiche Bakterien inkorporiert werden. Diese beinhalten gram-positive Bakterien wie Streptomyces- und Bacillusarten. Insbesondere können sie in ein beliebiges gram-negatives Bakterium eingeführt werden und man geht davon aus, daß Escherischia-, Pseudomonas-, Salmonella-, Shigella- und Yersinia-Arten in der vorliegenden Erfindung besonders zweckmäßig sind.
Nachdem die pathogenen Bakterien mit der Mutation transduziert worden sind, werden sie unter Bedingungen gezüchtet, welche die Isolierung der Mutanten erleichtern, entweder unter Bedingungen, unter welchen solche Mutamen einen selektiven Vorteil gegenüber parentalen Bakterien haben oder unter Bedingungen, welche eine leichte Unterscheidung von unveränderten Bakterien oder Mutanten anderer Art erlauben. Die isolierten Mutanten werden cloniert und auf Virulenzverlust und die Fähigkeit, eine Immunantwort in einem Wirt zu induzieren, um den Wirt vor einem virulenten pathogenen Stamm zu schützen, durchmustert. Unter den Bakterien, betrifft der Gegenstand der Erfindung insbesondere eine große Vielfalt von E. coli-Stämmen, besonders bevorzugt die Serotypen 01, 02 und 078. Aridere pathogene Bakterien, für welche der Gegenstand der Erfindung ebenfalls verwendet werden kann, beinhalten, z. B. die Arten Streptomyces, Bacillus, Salmonella, Shigella, Yersinia, Mycoplasma, Chlamydia, Streptococcus und Staphylococcus.
Wir haben herausgefunden, daß bestimmte zusätzliche Kriterien bei der Auswahl, welche pathogenen Bakterien als Impfstämme der vorliegenden Erfindung am zweckmäßigsten sein könnten, verwendet werden können. Die Verwendung dieser zusätzlichen Kriterien erlaubt es, daß eine bessere Selektion erreicht wird. Im einzelnen ist herausgefunden worden, daß extrazelluläre pathogene Bakterien, insbesondere mit Pyrimidinstoffwechsel-Mutationen, für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt werden. Dies kann möglicherweise auf den Unterschied in der Verfügbarkeit des Pyrimidinspiegels außerhalb der Wirtszellen, z. B. im Serum, im Gegensatz zu dem Pyrimidinspiegel innerhalb der Zellen des Wirtes zurückgeführt werden.
Bei der Herstellung von lebenden Impfstämmen führt man im allgemeinen einen Marker in den Impfstamm ein, um die auxotrophen Mutanten, welche von anderen Individuen des Stammes gebildet werden, zu unterscheiden. Verschiedene Markergene können verwendet werden, wie solche für Resistenz gegen antibiotische oder synthetische antibakterielle Wirkstoffe, für eine Blockierung in einem biosynthetischen Stoffwechselweg, der einen Bedarf für eine Aminosäure oder ähnliches verursacht. Die Einschränkung für den jeweiligen Marker ist, daß er den immunogenen Charakter des Mikroorganismus nicht beeinflussen sollte, noch sollte er bei der Herstellung des lebenden Impfstammes in die Prozessierung des Mikroorganismus eingreifen. Das Markergen wird den Phänotyp verändern, um die Erkennung des Mikroorganismus zu gewährleisten.
Bevorzugte pathogene Bakterien zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung haben stabile Mutationen mit wenigen Reversionen. Frequenzen von Reversionsraten von weniger als etwa 10&supmin;&sup7; bezeichnen stabile Mutationen³&sup8;. Es ist gefunden worden, daß viele temperatursensitiven Mutanten, insbesondere diejenigen, die nicht charakterisiert sind, welche die DNA-Synthese beeinflussen, aufgrund der hohen Frequenz von Reversionen, die in diesen Mutanten gefunden werden, für die Verwendung als lebende Impfstämme ungeeignet sein können. Die Verwendung eines transduzierenden Phagen, DNA-vermittelter Transformation und/oder Konjugation kann auch angewendet werden, um zwei oder mehrere unabhängig mutierte Gene in einem einzelnen Wirtsstamm, welcher als Impfstamm verwendet werden soll, nacheinander herzustellen. Die Anwesenheit von zwei vollständig unabhängigen Mutationen, wovon jede eine außerordenlich niedrige Wahrscheinlichkeit zur Reversion hat, stellt eine nahezu absolute Sicherheit bereit, daß der Impfstamm nicht virulent werden kann. Zusätzlich wird jedes ausgewechselte Gen an mindestens einem, und vorzugsweise an mindestens zwei der zellulären Funktionen der Bakterien beteiligt sein, so daß der Mikroorganismus unfähig sein wird, sich ausreichend zu vermehren, um eine Krankheit zu verursachen. Diese Erfindung stellt auch Impfstämme von E. coli bereit, welche eine oder mehrere attenuierende Mutationen enthalten. Während eine Pyrimidinstoffwechselweg-Mutation (wie die carAB-Mutation), eine Eisenstoffwechsel-Mutation (wie die fur-Mutation), oder eine Colicintransport-Mutation (wie tolC-Mutation) bevorzugte Ausführungsformen darstellen, sind attenuierende Mutationen von E. coli, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, nicht auf diese Mutationen eingeschränkt. Andere Mutationen von Interesse beinhalten Mutationen in dem groELES- Operon, dessen Produkte als Chaperonine fungieren und bei der Faltung und Zusammenlagerung von Polypeptiden helfen; Mutationen in htr-Genen, welche für das Wachstum bei erhöhten Temperaturen, jedoch nicht bei 30ºC benötigt werden; und Mutationen im recA- Gen, welches bei der allgemeinen Rekombination und der DNA- Schadensreparatur beteiligt ist.
E. coli-Impfstämme dieser Erfindung werden im allgemeinen wie folgt hergestellt. Ein E. coli-Stamm, welcher die gewünschte Mutation trägt, wird über Nacht gezüchtet, mit einem P1-Phagen inkubiert, dann noch einmal über Nacht in einem ausgewählten Medium, welches Chloramphenicol enthält, gezüchtet. E. coli, welche für P1 lysogen sind, werden isoliert. Ein Lysat wird dadurch hergestellt, daß man die Zellen einem Hitzeschock aussetzt und danach Chloroform verwendet, um die Lyse zu erleichtern. Nach einer Zentrifugation wird das Lysat mit dem E. coli-Stamm inkubiert, der transduziert werden soll, dann auf einem ausgewählten Medium ausplattiert und über Nacht inkubiert. Isolate werden getestet um zu bestätigen, daß sie den gewünschten Phänotyp enthalten.
DNA-vermittelte Transformation und/oder Konjugation kann ebenfalls eingesetzt werden, um eine oder mehrere gewünschte attenuierende Mutationen in einen E. coli-Stamm, der als Impfstamm verwendet werden soll, einzufügen. Alternativ kann ein E. coli-Stamm, der als Impfstamm verwendet werden soll, mit einem chemischen Mutagen behandelt werden, wie Nitrosoguanidin, oder bestrahlt werden, z. B. mit Röntgenstrahlen, und die resultierenden attenuierten Mutanten entsprechend den gewünschten Charakteristika isoliert werden. Zweckmäßige spontane Mutationen können ebenfalls isoliert werden. Andere Verfahren, welche ebenfalls zweckmäßig für die Herstellung von Mutanten sind, beinhalten ortsgerichtete Mutagenese²&sup6; und Restriktionsenzymspaltung und Religierung.
Wie vorstehend diskutiert, können die Impfstoffe in einer großen Vielfalt von Wirbeltieren verwendet werden. Die Impfstoffe werden insbesondere Anwendung finden beim Menschen, Haustieren oder anderen Tieren.
Die Art der Verabreichung eines Impfstammes dieser Erfindung kann weitläufig variiert werden, wobei jedes der herkömmlichen Verfahren zur Verabreichung eines lebenden Impfstoffes geeignet sein kann. Diese beinhalten Aerosol- Verabreichungen, orale Verabreichungen, in Trinkwasser, als feste, physiologisch verträgliche Base, oder in einer physiologisch verträglichen Dispersion, parenteral (z. B., subkutan, intramuskulär, intravaskulär oder intraperitoneal), durch Injektion, durch in ovo-Überimpfung oder ähnliches. Die Dosierung des Impfstoffs (Zahl der Bakterien, Anzahl der Verabreichungen, Zeitraum der Verabreichung, usw.) werden von der Art der Verabreichung abhängen und werden gemäß dem verwendeten Impfstamm, den Arten, Alter, und Größe des zu schützenden Wirtes variieren. Ein Durchschnittsfachmann wird in der Lage sein, die zu verabreichende Dosis derart zu bestimmen, daß eine ausreichende Immunantwort bereitgestellt wird.
Die Formulierung einer Impfstammzusammensetzung kann weitläufig variieren. Man nimmt an, daß pharmazeutisch verträgliche Träger, wie Wasser, für die orale Verabreichung zweckmäßig sind. Für die parenterale, kloakale oder andersartigen Verabreichungsformen können andere pharmazeutisch verträgliche Träger, wie normale Kochsalzlösung, verwendet werden. Für einige Anwendungen kann die Impfstoffzusammensetzung auch in das Essen beigemischt werden.
Es ist nicht beabsichtigt, daß die folgenden Beispiele den Schutzumfang der Erfindung in irgendeiner Art einschränken.

C. Beispiele für Ausführungsformen der Erfindung

Wenn nicht anders bezeichnet, werden im allgemeinen die folgenden Materialien und Verfahren in diesen Beispielen verwendet.
(1) Tiermodell für Colisepsis:
Um die Durchführbarkeit der oralen Impfung und die Wirksamkeit der lebenden Impfstoffstämme dieser Erfindung zu testen, war es notwendig, ein experimentelles Modell der Erkrankung zu etablieren. Da Colisepsisausbrüche beim Haushuhn oft nach Infektion mit dem hämorrhagischen Enteritis-Virus (HEV) beobachtet werden, wurde diesem Modell eine Infektion HEVA- infizierten Vögeln mit E. coli zugrunde gelegt. Ähnliche Modelle wurden auch von anderen verwendet, um Colisepsis im Haushuhn zu studieren11,12.
Truthähne wurden von der Firma Hybrid-Turkeys, Inc., Kitchener, Ontario, Kanada, als einen Tag altes Geflügel erhalten. Sie wurden mit Zugang zu Wasser und sogenannter Truthahn- Starterration (Co-op Nahrungsmittel) und nach den Richtlinien, welche vom kanadischen Tierschutzverbandes erlassen wurden gehalten.
Während der Infektionsexperimente wurde einzelnen Vögeln im Alter von 7 Wochen HEVA oral verabreicht. Die Dosis an HEVA, die verwendet wurde, betrug 100 · die ED&sub9;&sub5;. Die ED&sub9;&sub5; wurde als die Dosis definiert, die in 95% der Milzen 6 Wochen alter Vögel HEVA-Antigen produzierte.
E. coli wurde auf drei Arten verabreicht: (1) intravenöse Injektion über eine Flügelvene, (2) direkte Injektion in den Luftsack mit einer kleinen Injektionsnadel oder (3) intratracheale Injektion zwischen die Rippenbögen mit einer kleinen Injektionsnadel. Die Impfung mit E. coli wurde bei 4 Wochen alten Geflügeln durchgeführt, indem diese den einzelnen Vögeln oral oder über Trinkwasser verabreicht wurden. Nach Infektion mit HEVA und E. coli wurden die Vögel täglich auf klinische Krankheitsanzeichen getestet (blutige Diarrhö, Appetitlosigkeit, Arthritis) und 7 Tage nach der bakteriellen Infektion wurden alle Vögel durch zervikale Dislokation getötet. Es wurden Obduktionen durchgeführt. Organproben wurden für E. coli kultiviert und die Identität aller Isolate wurde durch biochemische Tests bestimmt.
(2) Entwicklung von E. coli-Mutanten:
E. Coli der Serotypen 01 (EC222), 02 (EC317) und 078 (EC234) wurden als Wirtsstämme verwendet. EC234 (Serotyp 078:K80:H9) ist ein Feldisolat, welches von Dr. L. Arp von der Iowa State University, U.S.A. erhalten wurde. EC222 (Serotyp 01:H, nicht typisierbar) wurde aus der Leber eines Hähnchens isoliert und von der Animal Health Division of Alberta Agriculture, Kanada erhalten. EC317 (Serotyp 02: nicht bewegungsfähig) wurde von einem erkrankten Truthahn erhalten und von Dr. C. Riddel vom Western College of Veterinary Medicine, Saskatoon, Saskatchewan, Kanada zur Verfügung gestellt.
Die Quelle der carAB-Mutation war der E. coli-Stamm CGSC6181 (ursprünglich NK6034 genannt; in unserer Sammlung EC322). Er wurde vom E. coli-Genetic Stock Center, Yale University, U.S.A. erhalten. Er wurde ursprünglich von N. Kleckner hergestellt. Es handelt sich um car96::Tn10, Δ(gpt-lac)5, re1A1, spoT1, thi-1, λ-.
Die Quelle des fur-Genes war der E. coli-Stamm EC399, welcher BN4020 entspricht, der von Dr. Neiland, University of California, Berkeley, U.S.A. erhalten wurde. Es handelt sich um his arg thi lac Δ U169 galK&supmin; fur::TnS(KnR).
Die Quelle für das tolC-Gen war der Stamm E. coli-EC532, welcher GC7459 entspricht, der von Dr. A. Jaffé, Institut Jacques Monod, Centre National de la Recherche Scientifique, Université Paris 7, 2 Place Jussieu, 75251 Paris Cedex 05, France erhalten wurde. Es handelt sich um tolC::Tn10.
Der allgemein transduzierende Phage Plcml, clr100 wurde vom Cold Springs Harbor Laboratory oder von M. Theisen von der Veterinary Infections Disease Organization, Saskatoon, Saskatchewan, Kanada erhalten. Es handelt sich um eine Mutante des Phagen P1, welche die Gene für die Chloramphenicolresistenz trägt und temperatursensitiv ist. Bei 42ºC werden klare Plaques produziert, während sich bei 30ºC trübe Plaques ausbilden.
Die E. Coli-Stämme EC322, EC399, oder EC532 wurden über Nacht bei 37ºC in LB + 5 mM CaCl&sub2; gezüchtet. Zu 0,5 ml E. coli wurden 25 ul P1 zugegeben. Nach 30 Minuten Inkubation bei 30ºC wurden 100 ul dieses Gemisches auf jede LB-Platte, die 12,5 ul pro ml Chloramphenicol enthielt, verteilt. Die Platten wurden über Nacht bei 30ºC inkubiert. Die Kolonien, die gewachsen waren, wurden getestet, um sicher zu sein, daß der Stamm jetzt temperatursensitiv war. (Stämme, die lysogen für diesen Phagen sind, sollten bei 42ºC nicht wachsen). LB-Platten, die Chloramphenicol enthielten, wurden auf 43ºC vorgewärmt und dann mit dem Stamm angeimpft, von dem erwartet wurde, daß er für P1 lysogen ist. Um den Vergleich mit dem Wachstum bei 30ºC zu erleichtern, wurde eine einzelne Kolonie in normaler Salzlösung suspendiert und 100 ul dieser Suspension wurden auf einer vorgewärmten (welche bei 42ºC inkubiert worden war) und auf einer ungewärmten Platte (welche bei 30ºC inkubiert worden war) verteilt. Nach Übernachtinkubation wurde das Wachstum auf den Platten miteinander verglichen. Die Kulturen, die temperatursensitiv waren, wurden bei -70ºC gelagert.
Der E. coli-Stamm, welcher lysogen ist für P1, wurde bei 30ºC in LB + 10 mM MgSO&sub4; über Nacht gezüchtet. Eine 1 : 200-Verdünnung dieser Kultur wurde im gleichen Medium hergestellt (50 ml in einem 500 ml-Kolben). Die Kultur wurde unter Schütteln bei 30ºC bis zur mittleren logarithmischen Phase (carAB) oder bis zu einer Extinktion von 0,2 bei OD&sub6;&sub6;&sub0; (fur und tolC) inkubiert. Die Kultur wurden dann auf 40ºC (carAB) oder 42ºC (fur und tolC) gebracht und 40 Minuten (carAB) oder 20 Minuten (fur und tolC) unter Belüftung inkubiert. Der fur- und tolC-Temperaturwechsel wurde unter Verwendung eines 42ºC-Wasserbades sehr schnell durchgeführt. Danach wurde die Kultur auf 37ºC übertragen und für 1 bis 2 Stunden inkubiert. Partielle Lysis trat auf und es wurden 5 ml Chloroform zugegeben, um die Lyse zu erleichtern. Nach weiteren 10 Minuten bei 37ºC wurden die Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt (10.000 Upm für 10 Min. in einem SS34- Rotor). Der Überstand wurde vorsichtig in ein steriles 0,5 ml Chloroform enthaltendes Schraubdeckelröhrchen übertragen. Das Lysat wurde bei 4ºC aufbewahrt.
Der zu transduzierende Stamm (EC234, EC222, EC317) wurde über Nacht unter Schütteln in 5 ml LB + 5 mM CaCl&sub2; bei 37ºC gezüchtet. Für carAB wurden gleiche Volumina Phagenlysat und Zellen gemischt. Das Phagenlysat wurde entweder 10fach verdünnt oder unverdünnt verwendet. Das Gemisch wurde bei 30ºC 30 Min. inkubiert und dann auf LB, enthaltend 5 oder 10 ug/ml Tetracyclin, ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37ºC oder 42ºC inkubiert. Die Bakterienkolonien wurden entnommen und auf LB + Tetracyclinplatten ausgestreift, um sie auf Reinheit zu testen. Für fur und tolC wurden die Zellen durch Zentrifugation pelletiert und im ursprünglichen Volumen 100 mM MgSO&sub4; und 5 mM CaCl&sub2; resuspendiert. Die Zellen wurden für 15 Min. bei 37ºC belüftet. Gleiche Volumina Phagenlysat und Zellen wurden gemischt. Das Phagenlysat wurde entweder unverdünnt oder 10 · verdünnt verwendet. Die Gemische wurden für 30 Min. bei 30ºC inkubiert und dann auf LB, enthaltend 50 ug/ml Kanamycin (fur), oder LB, enthaltend 10 ug/ml Tetracyclin (tolC), ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert. Auf jeder Platte waren einige wenige große Kolonien und auch einige punktförmige Kolonien sichtbar. Die großen Bakterienkolonien wurden entnommen und auf LB + Kanamycin- Platten (fur) oder LB + Tetracyclin-Platten (tolC) ausgestreift, um auf Reinheit zu testen. Diese Kulturen wurden bei 4ºC aufbewahrt, bis der Phänotyp bestimmt werden konnte.
Diese Kulturen wurden getestet, um zu bestätigen, daß sie den richtigen Phänotyp enthalten (z. B., carAB, fur oder tolC). Um den carAB-Phänotyp zu bestimmen, wurde M9-Salz-Agar (mit 0,2 oder 0,5% Casaminosäuren) hergestellt und mit Uracil ergänzt (Endkonzentration 20 ug/ml). M9 Salz-Medium wird das Wachstum der Kulturen, welche die carAB-Mutation enthalten, nicht fördern, wird jedoch das Wachstum der aus Vögeln isolierten eingesetzten E. coli fördern. Die Ergänzung von Uracil erlaubt das Wachstum von Isolaten, welche die carAB-Mutation enthalten. Stämme, die auf M9 Salz-Agar mit Uracil gut wachsen, die jedoch nicht in M9 Salz-Medium wachsen, werden als carAB angesehen. Alternativ wird M9 Salz-Medium, enthaltend 50 ng/ml Nicotinsäure, ergänzt mit Uracil und Arginin, das Wachstum der Bakterien, die carAB Mutationen enthalten, fördern, während das gleiche Medium ohne Nicotinsäure ihr Wachstum nicht fördern wird.
Um die Anwesenheit der fur Mutation zu bestimmen, wurden die Kulturen in LB oder LB + 200 uM 2,2'-Dipyridyl (DIP) bei 37ºC unter Schütteln in 5 ml-Röhrchen 20 Stunden gezüchtet. Die Extinktion bei OD&sub6;&sub6;&sub0; wurde bestimmt. Die Zellen wurden unter Verwendung einer Laborzentrifuge mit Deckel pelletiert und das Pellet wurde verworfen. Die Überstände wurden bei -20ºC aufbewahrt, bis die Testreihen gemacht wurden. Das Verfahren von Rioux et al.&sup4;&sup0; wurde verwendet um die Catecholsiderophoren in den Überständen zu bestimmen. Die Ergebnisse wurden als Extinktionsverhältnis OD&sub5;&sub1;&sub0;/OD&sub6;&sub6;&sub0; dargestellt. Diese Verhältnisse wurden mit denen des Kontroll-Wildtypstammes verglichen. Wenn das Verhältnis der Mutanten, welche in eisenreichem Medium gezüchtet wurden, höher war als das des Wildtyps, wurden die Stämme unter Verwendung von Präparationen der äußeren Membran für weitere Tests verwendet. Zur Präparation der äußeren Membran wurden die Zellen mit oder ohne DIP in LB bis zu einer Extinktion von etwa 1 bis 2 bei OD&sub6;&sub6;&sub0; gezüchtet. Das Kulturvolumen betrug 100 ml. Die Zellen wurden durch Zentrifugation aufgearbeitet, zweimal mit normaler Salzlösung gewaschen und bei -20ºC bis zur Verwendung aufbewahrt. Die Zellen wurden in 5 ml Hepespuffer resuspendiert (10 mM, pH 7,4), in ein 15 ml-Röhrchen übertragen und mit Ultraschall aufgebrochen. Das Material wurde in ein 37 ml-Röhrchen übertragen (für den SS34 Rotor) und bei 10.000 Upm 10 Minuten zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Die Überstände (gewöhnlich 4 ml) wurden in ein Oakridge-Röhrchen für den Typ 50-Rotor übertragen und 1,5 ml 4% Sarkosyl (N-Lauroylsarkosin, Natriumsalz) wurden zugegeben. Das wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert. Die sarkosylunlösliche Fraktion wurde durch Zentrifugation in einer Ultrazentrifuge für eine Stunde, bei 15- 20ºC und 35.000 upm pelletiert. Der Überstand wurde verworfen. Das kleine und klare bis leicht trübe Pellet wurde in 5 ml 2% Sarkosyl, unter Verwendung einer Einweg-Schlinge resuspendiert. Es wurde dann 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und in einer Ultrazentrifuge eine Stunde bei 15-20ºC und 35.000 Upm erneut zentrifugiert. Dieses Pellet wurde in 250 ul Hepespuffer gelöst und bei -20ºC bis zur Verwendung aufbewahrt. Die Proteine wurden durch diskontinuierliche Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamid-Gelelektrophorese (gewöhnlich 10%) aufgetrennt und mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt. Die Mutanten wurden aufgrund ihrer Überproduktion von Catecholen und eisenregulierter äusserer Membranproteine als fur-Mutationen enthaltend identifiziert.
Um den tolC-Phänotyp zu bestimmen, wurden Isolate auf Tetracyclinresistenz und Unfähigkeit, in LB, enthaltend 5 mg/ml Natriumdodecylsulfat (SDS), zu wachsen, selektiert. Wildtyp-E. coli wachsen gut bei diesen Konzentrationen von SDS, während tole-Mutanten dies nicht können³&sup7;.
Tetracyclinsensitive Derivate wurden in Medium, enthaltend Chlortetracyclin und Fusarmsäure, selektiert (J. Bacteriol. 145:1110-1112, 1981). Tetracyclinresistente carAB-Mutanten wurden über Nacht in 5 ml Gehirn-Herz-Infusions (BHI)- Brühe bei 37ºC kultiviert. Die Zellen wurden einmal mit Minca-Medium gewaschen und zu einer OD&sub6;&sub6;&sub0; von 0,05 resuspendiert. Es wurden Verdünnungen von 10&supmin;¹ bis 10&supmin;³ gemacht und pro Platte wurden 0,1 ml ausplattiert. Die Platten wurden 48 Stunden bei 37ºC inkubiert. Große Kolonien wurden entnommen und auf BHI-Platten ausgestrichen. Die Tetracyclinsensitivität und die Anwesenheit der carAB-Mutation wurde bestimmt.
Wenn vorhanden, wurden spontane rifampicinresistente Mutanten selektiert, bevor tetracyclinsensitive Derivate selektiert wurden. Dies wurde gemacht, indem man carAB-Mutanten auf Platten, welche einen Gradienten von Rifampicin enthielten (von 50 bis 100 ug/ml), ausstrich und bei 37ºC über Nacht inkubierte. Die Kolonien, welche gewachsen waren, wurden überprüft, um sicher zu sein, daß sie noch tetracyclinresistent waren und den carAB-Phänotyp hatten.
Die Bakterienstämme wurden in 25% Glycerin und 50% BHI- Brühe bei -70ºC aufbewahrt.
Impfstoffstämme, welche wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung virulenter Stämme von E. coli, die durch Insertion der carAB-Mutation in E. coli-CDSC6181 attenuiert wurden und welche tetracyclinresistent sind, hergestellt wurden, sind bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt. Diese Stämme sind: (1) EC 645, ATCC Hinterlegungsnummer 55345, welcher aus EC 234 (Serotyp 078) erhalten wurde; (2) EC 644, ATCC Hinterlegungsnummer: 55347, welcher aus EC 317 (Serotyp 02) erhalten wurde; und (3) EC 643, ATCC Hinterlegungsnummer: 55349, welcher aus EC 222 (Serotyp 01) erhalten wurde.
Rifampicinresistente carAB-Mutatanten, welche tetracyclinresistent sind, sind identifiziert und isoliert worden. Diese Stämme beinhalten: (1) EC 749, welcher aus EC644 (Serotyp 02, carAB::Tn10 in EC317) erhalten wurde; (2) EC750, welcher aus BA4 (Serotyp 01, carAB::Tn10 in EC222) erhalten wurde; und (3) EC769, welcher aus EC645 (Serotyp 078, carAB::Tn10 in EC234) erhalten wurde.
Stabile tetracyclinsensitive rifampicinresistente carAB- Mutanten sind isoliert und identifiziert worden. Diese Stämme beinhalten: (1) BA57 (EC752), welcher aus EC234 (Serotyp 078) erhalten wurde; (2) BA74, welcher aus EC234 (Serotyp 078) erhalten wurde; (3) BA83 (EC753), welcher aus EC234 (Serotyp 078) erhalten wurde; (4) BA95 (EC751) welcher aus EC317 (Serotyp 02, ATCC Hinterlegungsnummer: 69402) erhalten wurde; (5) BA96 (EC754), welcher aus EC317 (Serotyp 02) erhalten wurde; (6) BA101 (EC755), welcher aus EC317 (Serotyp 02) erhalten wurde; (7) BA104, welcher aus EC222 (Serotyp 01) erhalten wurde; (8) BA105, welcher aus EC222 (Serotyp 01) erhalten wurde; und (9) BA108, welcher aus EC222 (Serotyp 01) erhalten wurde.
Einige Mutanten wurden isoliert und aufgrund ihrer Überproduktion von Catecholen und eisenregulierten äußeren Membranproteinen in eisenhaltigem Medium als die fur-Mutation enthaltend identifiziert. Diese Stämme beinhalten: (1) EC655, welcher aus EC317 (Serotyp 02) erhalten wurde; (2) EC656, welcher aus EC222 (Serotyp 01) erhalten wurde; (3) EC657, welcher aus EC222 (Serotyp 01) erhalten wurde; (4) EC658, welcher aus EC222 (Serotyp 01) erhalten wurde; (5) EC662, welcher aus EC234 (Serotyp 078) erhalten wurde; und (6) EC663, welcher aus EC234 (Serotyp 078) erhalten wurde.
Einige Mutanten wurden isoliert und aufgrund ihrer Tetracyclinresistenz und ihrer Unfähigkeit, in LB, enthaltend 5 mg/ml SDS, zu wachsen, als die tolC-Mutation tragend identifiziert. Diese Stämme beinhalten: (1) BA142, welcher aus EC317 (Serotyp 02) erhalten wurde; (2) BA143, welcher aus EC317 (Serotyp 02) erhalten wurde; (3) BA144, welcher aus EC222 (Serotyp 01) erhalten wurde; (4) BA145, welcher aus EC222 (Serotyp 01) erhalten wurde; (5) BA146, welcher aus EC234 (Serotyp 078) erhalten wurde; u. (6) BA147, welcher aus EC234 (Serotyp 078) erhalten wurde.

Beispiel 1

Orale Verabreichung von E. coli-Impfstoffen

Wie vorstehend diskutiert, wären diejenigen attenuierten Bakterien, welche in Trinkwasser verabreicht werden könnten, ideal zur Verwendung in einem Impfstoff. Der erste Schritt in diesem Verfahren war, zu testen ob es möglich ist, Geflügel mit oral verabreichten E. coli zu impfen.
Zwei Gruppen von 8 Vögeln wurden im Alter von 4 Wochen mit 5 · 10&sup8; koloniebildenden Einheiten (Colony forming units; CFU) Wildtyp-E. coli-Serotyp 01 oder 02, wie in Tabelle 1 gezeigt, immunisiert. Alle Gruppen wurden in getrennten Räumen gehalten und vier nicht immunisierte Vögel wurden zusätzlich in jedem Raum gehalten, um zu bestimmen ob die E. coli durch Verbreitung weitergegeben werden können. Nach 3 Wochen wurden die Vögel mit HEVA infiziert, und nachfolgend sieben Tage später mit 5 · 10¹&sup0; CFU Wildtyp-E. coli-01 oder 02. Die Ergebnisse, welche in Tabelle 1 zusammengefaßt sind, zeigen, daß die orale Immunisierung mit jedem der Serotypen wirksam war, um Schutz gegen eine Infektion beider Serotypen zu induzieren. Deshalb ist es erforderlich, nur einen von diesen beiden Serotypen in eine Impfstofformulierung einzubringen. Darüberhinaus wurden ungeimpfte Kontrolltiere, welche in den gleichen Räumen wie die geimpften Vögel gehalten wurden, ebenfalls geschützt, was bedeutet, daß die E. coli durch fäkale Verbreitung übertragen werden können. Ein ähnliches Experiment wurde mit den Serotypen 02 und 078 (Tabelle 2) durchgeführt. In diesem Fall wurde keine Überkreuz-Schutzreaktion beobachtet, was bedeutet, daß beide der Serotypen in einem Impfstoff enthalten sein sollten, um ein breites Spektrum an Schutz bereit zu stellen. Tabelle 1 Orale Immunisierung von Truthähnen mit E. coli-Serotypen 01 und 02.
¹Krankheitsrate = Vögel mit E. coli-Läsionen nach Autopsie.
²ND = nicht durchgeführt
³Gruppen mit gleichem Buchstaben wurden in demselben Raum gehalten. Tabelle 2 Orale Immunisierung von Truthähnen mit E. coli-Serotypen 02 und 078
¹Gruppen mit gleichem Buchstaben wurden im gleichen Raum gehalten.
²Erkrankungsrate = Vögel mit E. coli-Läsionen nach Autopsie.

Beispiel 2

Attenuierung von E. coli-Serotypen 01 und 078 unter Verwendung der carAB-Mutation.

Da die orale Immunisierung von Vögeln mit lebenden E. coli möglich zu sein scheint, wurde die Attenuierung von Serotyp 01 und 078 Stämmen initiiert. Mutationen in dem carAB-Operon resultierten in Stämmen, welche Arginin plus Uracil für das Wachstum benötigten. E. coli-Laborstämme, welche Insertionen des Arzneistoffresistenten Transposon Tn10 (Tetracyclinresistenz) in diesem Operon tragen, wurden als Mutationsquelle verwendet. Sie wurden durch Transduktion in die Serotypen 01 und 078 übertragen und die Tn10-Sequenz wurde eliminiert. Details der Verfahren wurden früher bereits diskutiert in (2), Entwicklung von E. coli-Mutanten. Diese Stämme wurden danach unter Verwendung von einem Tag alten Hühnern auf Virulenz getestet. Es ist bekannt, daß einen Tag alte Hühner für eine Infektion mit Wildtyp-E. coli empfänglich sind. Die Ergebnisse für 5 carAB Mutanten sind in Tabelle 3 aufgelistet. Die Dosis an Bakterien in diesem Experiment war 5 · 10&sup4; CFU. Da der LD&sub5;&sub0;-Wert des Serotyp 01- Stammes EC222 1 · 10² CFU beträgt, hatte die carAB-Mutation diese Stämme signifikant attenuiert. Dieses Experiment wurde einmal wiederholt, mit Ergebnissen die den vorstehend beschriebenen ähnlich waren. Tabelle 3 Virulenz von carAB-Mutanten der Serotypen 01 und 078 in einem Küken-Modell
¹Stämme mit dem Namensvorsatz "EC" sind Feldisolate; BA103, BA104 und BA105 sind carAB-Mutanten, welche aus EC222 erhalten wurden; und BA74 und BA73 sind carAB-Mutanten, die aus EC234 erhalten wurden.
²Gesamtanzahl von Vögeln pro Gruppe = 10.

Beispiel 3

Immunisierung mit carAB-Mutanten von E. coli-Serotyp 078

Ein Experiment wurde durchgeführt, um zu bestimmen ob carAB-mutante Stämme von E. coli fähig waren, Schutz vor einer Infektion mit dem Wildtypstamm bereitzustellen. Truthähne wurden, wenn sie 4 Wochen alt waren, mit 5 · 10&sup9; cfu Bakterien oral immunisiert, dann im Alter von 6 Wochen dem Standardinfektionsmodell von HEVA ausgesetzt, im Alter von 7 Wochen gefolgt von einer intratrachealen Infektion durch Wildtypbakterien.
Vögel der Gruppe A wurden mit Wildtyp-E. coli-Serotyp 078 immunisiert. Gruppe B erhielt E. coli-Serotyp 078 mit der carAB- Mutation. Gruppe C wurde mit E. coli-Serotyp 078 mit carAB und Rifampicinmutationen immunisiert. Vögel aus der Gruppe D wurden nicht immunisiert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Alle Vögel in den Gruppen A, B, und C blieben gesund. Nach Autopsie konnten keine Läsionen beobachtet werden. 6 der 8 Vögel in der Kontrollgruppe D starben innerhalb von 4 Tagen nach der Infektion. Diese Ergebnisse zeigen, daß hohe Dosen der Mutantenstämme von E. coli-Serotyp 078, die eingesetzt wurden, einen effektiven Schutz gegen Infektion mit dem Wildtypstamm bereitstellten. Tabelle 4 Orale Immunisierung von Truthähnen mit E. coli-Serotyp 078.

Beispiel 4

Attenuierung von E. coli-Serotyp 0.1 unter Verwendung der fur-Mutation.

Details der Verfahren, welche verwendet wurden, um fur- Mutanten herzustellen, wurden bereits früher diskutiert in (2), Entwicklung von E. coli-Mutanten.
Zwei Stämme (EC656 und EC657) wurden unter Verwendung des Küken-Modells auf Virulenz getestet. Die Ergebnisse für diese beiden für-Mutanten sind in Tabelle 5 gezeigt. Neugeschlüpfte Hühner wurden von einem Brutplatz vor Ort erhalten. Diese Küken wurden in 6 Gruppen von jeweils 20 aufgeteilt und getrennt gehalten. Am Tag 0 wurde jede Gruppe von Küken mit 0,25 ml Bakterien (enthaltend etwa 10&sup4; cfu oder 10² cfu - siehe Tabelle 5 für die exakte Dosierung) infiziert. Die Infektion wurde als eine subkutane Injektion von 0,25 ml gesetzt. Zur Vermeidung einer Kreuzkontamination während der Verabreichung der Infektion wurden die üblichen Sicherheitsmaßnahmen beachtet. Die Hühner wurden während 6 Stunden nach Infektion und dann während 7 Tagen, alle 12 Stunden hinsichtlich der Sterblichkeitsrate beobachtet. Nach 7 Tagen wurden die verbleibenden Vögel getötet. Da die Sterblichkeitsrate der Gruppe, die den Serotyp 01-Wildtyp erhalten hat, nach 3 und 7 Tagen 55 bzw. 80% war (8 · 10² cfu's, niedrige Dosis) und 100% nach 3 Tagen (8 · 10 cfu's, hohe Dosis), hatte die fur-Mutation diese Stämme signifikant attenuiert. Tabelle 5 Virulenz von fur-Mutanten durch Serotyp 01 in einem Kükenmodell
*Dieser Vogel war vor der Infektion nicht gesund.
¹EC656 und EC657 sind fur-Mutanten welche aus EC222 (Serotyp 01) erhalten wurden.
²Die Dosis war wie folgt:
EC222, niedrige Dosis 8 · 10² cfu's hohe Dosis 8 · 10&sup4; cfu's EC656, niedrige Dosis 7 · 10² cfu's hohe Dosis 7 · 10&sup4; cfu's EC657, niedrige Dosis 5 · 10² cfu's hohe Dosis 5 · 10&sup4; cfu's.

Beispiel 5

Attenuierung von E. coli-Serotyp 02 unter Verwendung der tolC-Mutation.

Details der Verfahren, welche verwendet wurden, um tolC-Mutanten herzustellen, wurden bereits früher diskutiert in (2), Entwicklung von E. coli-Mutanten. Zwei Stämme (BA142 und BA143) wurden unter Verwendung des Kükenmodells, welches in Beispiel 4 beschrieben ist, auf Virulenz getestet. Ein carAB-Mutantenstamm (BA95) wurde als eine attenuierte Kontrolle ebenfalls eingesetzt. Alle Vögel erhielten 1 · 10&sup4; cfu's Bakterien. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Da die Gesamtmenge der Vögel, die betroffen waren in der Gruppe, welche den Serotyp 02 Wildtyp erhielt, 50% war, hatte die tolC-Mutation den Stamm BA142 signifikant attenuiert. Der Stamm BA143 schien in diesem Test nicht attenuiert zu sein. Tabelle 6 Virulenz der tolC-Mutanten des Serotyp 02 in einem Kükenmodell.

Beispiel 6

Attenuierung des E. coli-Serotyp 02 unter Verwendung der carAB-Mutation.

Details der Verfahren, die verwendet wurden, um carAB- Mutanten herzustellen, wurden bereits früher diskutiert in (2), Entwicklung von E. coli-Mutanten. Stamm BA95 wurde unter Verwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Kükenmodells getestet. Alle Vögel erhielten etwa 5 · 10&sup9; cfu's Bakterien durch subkutane Injektion. Der LD&sub5;&sub0;-Wert des Wildtyps EC317 (Serotyp 02) beträgt 6 · 10² cfu's. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Die carAB-Mutation hatte die Stämme BA95, BA96, und BA101 signifikant attenuiert. Alle drei Stämme sind tetracyclinsensitive, rifampicinresistente carAB-Mutanten, welche aus EC317 (Serotyp 02) erhalten wurden. Tabelle 7 Virulenz der crAB-Mutanten vom Serotyp 02 in einem Kükenmodell.

Beispiel 7

Immunisierung mit carAB-Mutanten vom E. coli-Serotyp 02.

Es wurde ein Experiment durchgeführt, um zu bestimmen, ob die carAB-Mutantenstämme von E. coli befähigt waren, Schutz vor einer Infektion mit dem Wildtypstamm zu gewähren. Truthähne wurden im Alter von 4 Wochen mit 5 · 10&sup8; cfu Bakterien oral immunisiert, danach im Alter von 6 Wochen mit dem Standardinfektionsmodell von HEVA infiziert, um die Vögel für E. coli empfänglich zu machen. Daraufhin folgte eine Infektion mit 5 · 10&sup8; cfu Wildtypbakterien in 0,2 ml, welche im Alter von 7 Wochen intratracheal verabreicht wurden.
Vögel der Gruppe C wurden mit Wildtyp E. coli-Serotyp 02 immunisiert. Gruppe B erhielt E. coli-Serotyp 02 mit der carAB- Mutation. Vögel der Gruppe A wurden nicht immunisiert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt. Alle Vögel in den Gruppen B und C blieben gesund. Nach Obduktion wurden keine Läsionen beobachtet. Zwei der 10 Vögel aus der Kontrollgruppe A starben innerhalb von 7 Tagen nach der Infektion; 7 der 10 Vögel in Kontrollgruppe A zeigten Krankheitssymptome und/oder Sterblichkeit. Diese Ergebnisse zeigen, daß hohe Dosen, der Mutantenstämme von E. coli-Serotyp 02, welche verwendet wurden, einen effektiven Schutz gegen Infektion mit dem Wildtypstamm gewähren. Tabelle 8 Orale Immunisierung von Truthähnen mit E. coli-Serotyp 02

Beispiel 8

Durchmusterung nach Stabilität von E. colicarAB- Mutanten.

Ein vorläufiger Test wurde wie folgt durchgeführt: 68 Bakterienstämme mit carAB-Mutationen wurden über Nacht in BHI- Brühe bei 37ºC unter Schütteln gezüchtet. Die Zellen wurden zweimal in normaler Kochsalzlösung gewaschen und zehnfach konzentriert, dann wurden 0,1 ml der Präparation, enthaltend etwa 10&sup9; Bakterien, in M9-Medium gegeben, welches 50 ng/ml Nicotinsäure enthielt, und 48 Stunden bei 37ºC inkubiert. Für jeden Mutantenstamm wurden 2 Platten hergestellt. Da zwei der Wildtypstämme Nicotinsäure für ihr Wachstum benötigen, wurde es in das Minimalmedium in vitro mit einbezogen. Die 33 Stämme, die kein Wachstum auf diesen Platten zeigten, d. h., keine Reversion zum Wildtyp zeigten, wurden für eine zweite Durchmusterung ausgewählt.
Die zweite Durchmusterung nach Stabilität der carAB- Mutanten wurde wie folgt durchgeführt: Die 33 Stämme wurden in L-Brühe (5 ml pro Teströhrchen) bei 37ºC über Nacht unter Schütteln gezüchtet. Die Kultur wurde 10:100 ml BHI-Brühe verdünnt und unter den gleichen Bedingungen über Nacht gezüchtet. Dieser Schritt wurde wiederholt dann wurden 50 ml der Kultur pelletiert und zweimal mit normaler Kochsalzlösung gewaschen. Das endgültige Pellet wurde in 1 ml Kochsalzlösung resuspendiert (eine 50fache Konzentration); dann wurden 0,1 ml des Konzentrats, enthaltend ungefähr 10¹¹ cfu's, auf jeder der beiden M9-Minimalagarplatten, die mit Nicotinsäure supplementiert worden waren, ausgebreitet. Die Platten wurden 48 Stunden bei 37ºC inkubiert und nach 24 und 48 Stunden auf Wachstum überprüft. 9 der 33 durchmusterten Stämme zeigten keine Reversion.
Die zweite Durchmusterung wurde ein oder zwei zusätzliche Male mit den 9 Stämmen, welche in der ersten sekundären Durchmusterung kein Wachstum zeigten, wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Die Reversionsfrequenz wurde als Gesamtzahl von Revertanten geteilt durch die Gesamtzahl von ausplattierten cfu's berechnet. Diese Daten zeigen, daß E. coli- carAB-Mutationen stabil sind, mit Reversionsfrequenzen von weniger als 1 · 10&supmin;&sup9;. Tabelle 9 Reversionsfrequenzen von carAB-Mutanten.
AGesamtanzahl von Revertanten auf zwei Platten. Jede Platte erhielt 1,8 · 10¹&sup0; cfu's.
BDie Reversionsfrequenz wird in allen Versuchen als die Gesamtanzahl von Revertanten geteilt durch die Gesamtanzahl von ausplattierten cfu's ausgedrückt.

Beispiel 9

Wachstum von carAB-Mutanten in Truthahnserum.

Von Truthähnen, welche nicht immunisiert worden sind, wurde Serum gesammelt. Dies wurde bis zur Verwendung tiefgefroren aufbewahrt. Das Serum wurde 30 Minuten bei 56ºC erhitzt, um das Komplement zu inaktivieren. Es wurde danach 5 Minuten in einer Eppendorfzentrifuge zentrifugiert, um partikuläre Substanzen zu entfernen und sterilfiltriert.
Bakterienstämme wurden unter Schütteln über Nacht bei 37ºC in BHI (5 ml in einem 15 ml Teströhrchen) gezüchtet; dann wurden 0,1 ml der Übernachtkultur in 5 ml BHI in einem 15 ml Teströhrchen zugegeben und 3 Stunden bei 37ºC unter Schütteln gezüchtet. Die Zellen wurden zweimal mit normaler Kochsalzlösung gewaschen und in 5 ml normaler Kochsalzlösung resuspendiert. Die Extinktion bei OD&sub6;&sub6;&sub0; nm wurde abgelesen, um die Zelldichte zu bestimmen, und die Bakterien wurden mit normaler Kochsalzlösung auf eine Konzentration von etwa 10&sup6; cfu's/ml verdünnt.
Alle carAB-Mutanten, welche verwendet wurden, wurden wie in Beispiel 8 beschrieben auf Stabilität getestet. Die carAB- Mutanten wurden vom Wildtypstamm des gleichen Serotypen erhalten. Die Bakterienstämme wurden wie in Tabelle 10 dargestellt verwendet.
Die Bakterien wurden in Truthahnserum gezüchtet, unter Verwendung der folgenden Verfahren: 0,2 l der verdünnten Zellsuspension wurde zu 0,4 ml Serum gegeben und bei 37ºC inkubiert. Nach 0, 1.5, 3 und 6 Stunden Inkubation wurden Proben entnommen. Die Verdünnungen wurden in normalem Kochsalz gemacht und 0,025 ml Volumen verschiedener Verdünnungen wurden auf eine BHI-Agarplatte aufgebracht. Nach 18 Stunden Inkubation bei 37ºC wurde die Anzahl der Kolonien gezählt.
Alle getesteten Stämme wuchsen in normalem Serum zu etwa ähnlicher Rate. Diese Daten zeigen, daß carAB-Mutanten fähig sind in normalem Serum zu wachsen. Dies ist hinsichtlich früherer Arbeit, welche lehrt, daß Pyrimidinspiegel im Serum limitierend sein können&sup4;¹, unerwartet. Tabelle 10 Bakterienstämme, welche in Truthahnserum gewachsen sind.

Beispiel 10

Kartierung von Tn10-carAB-Verbindungen.

Die Lokalisierung von Tn10 durch Southern-Blot-Analyse wurde wie folgt ausgeführt: Aus EC317, EC222, EC234, EC749, EC750 und EC769 wurde unter Verwendung der Methode von Stauffer et al. (Gene 14:63-72, 1981) die chromosomale DNA isoliert.
Das Plasmid pLLK12 wurde mit PvuII geschnitten und die Fragmente auf Agarosegelen aufgetrennt. Unter Verwendung des GeneClean®Kit (Bio 101 Inc. Box 2284, La Jolla, California, U.S.A.) wurden die DNA-Fragmente aus dem Agarosegel, nach den Anweisungen des Herstellers, isoliert. Die Fragmente B und C wurden in dem Gel nicht gut aufgetrennt und wurden deshalb zur Herstellung einer einzigen Sonde verwendet. Die für Tn10 spezifische Sonde wurde durch Spaltung eines Plasmids, welches Tn10 enthält, mit BglII hergestellt. Die DNA wurde unter Verwendung des Oligolabeling-Kit (Pharmacia LKB Biotechnology) mit [α-³²P]-dCTP markiert. Die Southern-Blot-Analyse wurde nach Standardverfahren durchgeführt (Sambrook et al., 1989).
Es wurde gefunden, daß Tn10 in das PvuII-E-Fragment des carAB-Operon insertiert war. Die Southern-Blot-Analyse der PvuII-Spaltungen chromosomaler DNA der Insertionsmutante EC749 ergab ein identisches Muster, unabhängig davon, ob das BglII- Fragment von Tn10, welches das Tetracyclinresistenzgen enthält, oder das PvuIIE-Fragment des carAB-Operons aus pLLK12 als Sonde verwendet wurde. Die Hybridisierung der chromosomalen Spaltungen mit entweder dem Fragment D oder einem Gemisch von den Fragmenten B und C ergab dramatisch unterschiedliche Muster.
Das Transposon scheint in allen drei Stämmen, in denen die carAB::Tn10 den Zellen durch Transduktion mit P1 übertragen wurde, an derselben Stelle insertiert worden zu sein. Es ist jedoch offensichtlich, daß ein Restriktionslängenpolymorphismus des mit PvuII-geschnittenen carAB-Operons in den Wildtypstämmen EC222, EC317, und EC234 auftritt, da unterschiedliche Muster beobachtet wurden, wenn die PvuII-geschnittene chromosomale DNA mit dem carAB-Fragment E hybridisiert wurde.
Das carAB-Operon wurde wie folgt cloniert: DNA aus EC750 wurde verwendet. Dieser Stamm wurde hergestellt, indem, wie früher schon beschrieben, das mit Tn10 markierte carAB-Operon von EC322 in EC222 übertragen wird.
Die chromosomale DNA wurde aus EC750 isoliert, indem die Methode von Stauffer et al. (Gene 14:63-72, 1981) verwendet wurde. Die chromosomale DNA wurde mit PvuII geschnitten und in die HincII-Stelle von pUC19 unter Verwendung der Technik von Sambrook at al²&sup7; ligiert.
Subclonierungseffiziente kompetente E. coli-DH5α (Gibco BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland, U.S.A.) wurden unter Verwendung von 1-3 Mikrolitern (uL) des Ligierungsgemisches gemäß den Angaben des Herstellers transformiert und Transformanten wurden auf Platten, welche 50 mg Ampicillin enthielten, selektioniert. Die Clone, welche auch resistent gegen Tetracyclin waren, wurden durch Replikaausplattierung auf Platten, enthaltend Tetracyclin, selektioniert. Für weitere Studien wurde ein Plasmid, welches das Leseraster des carAB-Operon in der gleichen Orientierung wie der Vector (pJK931) hatte, ausgewählt. Der Stamm, welcher pJK931 enthält, ist EC745.
Sequenzanalysen wurden wie folgt durchgeführt: Die Sequenz für beide Stränge der DNA wurde unter Verwendung synthetischer Primer erhalten. Da die Sequenz von sowohl Tn10 als auch vom carAB-Operon bekannt sind18,42,45, war es möglich, die genaue Insertionstelle von Tn10 in das Operon zu bestimmen. Das Transposon Tn10 wurde an der 5'-GGCTTTGCC-3'-Position, Nucleotide 3139 bis 3147 von carAB, insertiert¹&sup8;. Die Tn10- Insertion beinhaltet das Erkennen, Schneiden und Duplizieren einer spezifischen Neun-basenpaar (bp)-Ziel-Konsensus-Sequenz, 5'-NGCTNAGCN-3' &sup4;&sup4;. Ein Vergleich der carAB-Zielsequenz mit der herkömmlichen Konsensussequenz ergibt einen Unterschied lediglich an Position 6, wo A durch T ersetzt ist. Die 6 Konsensusbasenpaare umfassende zwei-unterbrochene-3-bp-inverse Symmetrie ist jedoch erhalten.

Claims

1. Impfstoffstamm eines pathogenen Bakteriums, umfassend mindestens eine Mutation, die ausgewählt ist aus einer Pyrimidinsyntheseweg-Mutation, einer Eisenstoffwechsel-Mutation und einer Colicintransport-Mutation, wobei die Mutation eine Attenuierung der Virulenz des Bakteriums vermittelt.

2. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffstammes eines pathogenen Bakteriums, umfassend:

(a) Erzeugen mindestens einer Mutation in einem virulenten Stamm der pathogenen Bakterien, um einen attenuierten Organismus bereitzustellen, wobei die Mutation ausgewählt ist aus einer Pyrimidinsyntheseweg-Mutation, einer Eisenstoffwechsel-Mutation und einer Colicintransport-Mutation;

(b) Isolieren des attenuierten Organismus, der mindestens eine der Mutationen enthält; und

(c) Verwenden des isolierten Organismus als Impfstoffstamm.

3. Verfahren nach Anspruch 2, das die Auswahl einer mit einem Markergen assoziierten attenuierten Mutation umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Markergen ein Antibiotikaresistenzgen ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Organismus eine E. coli-Mutante ist, die zur Antibiotikasensitivität revertiert.

6. Impfstoffzusammensetzung, umfassend mindestens einen Impfstoffstamm eines pathogenen Bakteriums, das mindestens eine attenuierte Mutation, ausgewählt aus einer Pyrimidinsyntheseweg-Mutation, einer Eisenstoffwechsel-Mutation und einer Colicintransport-Mutation, hat.

7. Arzneimittel, umfassend eine wirksame Menge von mindestens einem Impfstoffstamm eines pathogenen Bakteriums, wobei der Impfstoffstamm mindestens eine Mutation umfaßt, die ausgewählt ist aus einer Pyrimidinsyntheseweg-Mutation, einer Eisenstoffwechsel-Mutation und einer Colicintransport-Mutation und, gegebenenfalls, einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.

8. Arzneimittel nach Anspruch 7 zur Verhütung einer bakteriellen Krankheit in einem Tier.

9. Arzneimittel nach Anspruch 8, wobei die Krankheit Coliseptikämie und das pathogene Bakterium E. coli umfaßt.

10. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 7 bis 9 zur oralen Verabreichung.

11. Arzneimittel nach Anspruch 10 zur Verabreichung an eine Vogelart.

12. Ausführungsform nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Impfstoffstamm ein lebender Impfstoffstamm ist.

13. Ausführungsform nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Mutation ausgewählt ist aus carAB, fur und tolC.

14. Ausführungsform nach einem der Ansprüche 1 bis 13, die mindestens zwei der Mutationen umfaßt.

15. Ausführungsform nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der Stamm eine Reversionshäufigkeit von weniger als etwa 10&supmin;&sup7; hat.

16. Ausführungsform nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das pathogene Bakterium ein extrazelluläres pathogenes Bakterium umfaßt.

17. Ausführungsform nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das pathogene Bakterium E. coli umfaßt.

18. Ausführungsform nach Anspruch 17, wobei das E. coli vom Serotyp 01, 02 oder 078 ist.

19. Ausführungsform nach Anspruch 18, wobei der Impfstoffstamm ausgewählt ist aus Serotyp 01 [carAB], Serotyp 02 [carAB], Serotyp 078 [carAB], Serotyp 01 [fur], Serotyp 02 [fur], Serotyp 078 [fur], Serotyp 01 [tolC], Serotyp 02 [tolC], Serotyp 078 [tolC], E. coli Stamm EC645 ATCC-Hinterlegungsnummer 55345, E. coli Stamm EC644 ATCC-Hinterlegungsnummer 55347, E. coli Stamm EC643 ATCC-Hinterlegungsnummer 55349 und E. coli Stamm EC751 ATCC- Hinterlegungsnummer 69402.