DE69032408T2

DE69032408T2 - Kreuzschützende salmonella impfstoffe

Info

Publication number: DE69032408T2
Application number: DE69032408T
Authority: DE
Inventors: Roy Curtiss; Maryann Munson
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 1989-11-03
Filing date: 1990-11-02
Publication date: 1998-10-08
Anticipated expiration: 2010-11-03
Also published as: JPH05504331A; EP0500699B1; ATE167061T1; CA2072633A1; WO1991006317A1; EP0500699A4; AU6737190A; DE69032408D1; EP0500699A1

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft Stoffe und Methoden zur Immunisierung von Individuen zum Schutz vor Infektionen durch Gram-negative Bakterien, und insbesondere Impfstoffzusammensetzungen, die aus avirulenten Salmonella-Zellen zusammengesetzt sind und nicht nur gegenüber homologen und heterologen Salmonella-Arten Immunität sondern auch gegenüber anderen Gram-negativen Enterobakterien Kreuzschutzimmunität (cross-protective immunity) zu induzieren vermögen.

In der Anmeldung zitierte Literatur

Arnow (1937), J.Biol. Chem., 118:531.
Chart and Griffiths (1985), J. Gen. Microbiol. 131:1503.
Curtiss and Kelly (1987), Infect. Imm. 55:3035.
Ernst et al. (1978), J. Bacteriol. 135:928.
Finlay et al. (1989), Science 234:1059.
Galan and Curtiss III (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6383.
Galan and Curtiss III (1989), Microbial Pathogen. 6:433.
Germanier and Furer (1971), Infect. Immun. 4:663.
Gulig and Curtiss III (1987), Infect. Immun. 55:2891.
Liefson (1936), Am. J. Hyg. 24:423.
Miller et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5054.
Mullis and Faloona (1987), Methods Enzymol. 155:335.
Tanomoto and Homma (1982), J. Biochem. 91:741.
Tsai and Frasch (1983), Anal. Biochem. 119:115.

Hintergrund der Erfindung

Bekannt sind mehr als 1800 Serotypen von Salmonella, die fünf durch O- und H-Antigene definierte größere und viele kleinere Antigengruppen bilden. Dennoch sind viele der Auffassung, daß nur drei Arten von Salmonella existieren: S.typhi, S.choleraesuis und S.enteritidis, wobei letztere den Hauptanteil an Serotypen enthält. Die meisten Serotypen von S.enteritidis, die hier als Arten aufgeführt sind, haben eine relativ geringe Wirtspezifität und können somit eine Vielzahl von Tierarten einschließlich des Menschen infizieren. Salmonellen befallen vorwiegend Menschen in sehr jugendlichem Alter, ältere Menschen und Individuen mit geschwächter Immunität. In den meisten Fällen sind verseuchte Geflügelprodukte die Ursache. wichtig ist außerdem hervorzuheben, daß ein Expertenkomitee des WHO-Überwachungsprogramms für die Bekämpfung von durch Nahrungsmittel übertragenen Infektionen und Intoxikationen zum Thema Salmonellose 1987 festgestellt hat, daß menschliche Salmonellose ein globales Problem ist, das 60 bis 80 % sämtlicher bekannter Fälle nahrungsbedingter Erkrankungen ausmacht. Die sieben häufigsten Salmonella-Arten, die aus Geflügel isoliert wurden und mit Erkrankungen des Menschen in Zusammenhang stehen, sind S.enteritidis, S.typhimurium, S.heidelberg, S.infantis, S.agona, S.saint-paul und S.montevideo. Die meisten dieser Salmonella-Arten verursachen beim Menschen Gastroenteritis bei möglicher Persistenz und fortgesetzter Streuung. Man nimmt jedoch an, daß in den USA weniger als 1 % dieser Salmonella- Infektionen bekannt und sorgfältig diagnostiziert werden. Die meisten Salmonella-Arten werden über die Nahrungskette durch Fäkalkontamination der Kadaver während der Reinigung übertragen. Untersuchungen zur Feststellung des Ausmaßes dieses Problems haben ergeben, daß 1 bis 50 % der Geflügelkadaver verseucht sind. Neuere Untersuchungen betreffen die übertragung von S.enteritidis über das Ei unmittelbar auf den Verbraucher, vermutlich deshalb, weil bestimmte Stämme von S.enteritidis die Ovarien von Legehennen auf Dauer zu infizieren vermögen. Dies nahm in den Nordost- und Mittelatlantikstaaten immer stärker zu und führte nicht nur zu zahlreichen Infektionen, sondern auch zu einigen Todesfällen. Es ist daher klar, daß die Übertragung von Salmonellen auf den Menschen durch ständige Infektion von landwirtschaftlichen Nutztieren sowie die Verseuchung von Fleisch und Eiern für die Gesundheit der Bevölkerung ein gravierendes Problem darstellt. Dies wird noch dadurch erschwert, daß in zunehmendem Maß arzneimittelresistente Salmonellen frei werden, die für 20 bis 25 % der menschlichen Infektionen verantwortlich sind. Man nimmt an, daß subtherapeutische Mengen an Antibiotika im Tierfutter zu einer Selektion auf resistente Bakterien führen, die dann gegebenenfalls den Menschen infizieren und dadurch das Gesundheitsproblem für die Bevölkerung verschärfen.
E.coli-Infektionen der Atemwege bei Geflügel, die Alveolarsacculitis, Pneumonie und Septikämie auslösen, sind der Grund für einen Großteil der Verluste in der Geflügelindustrie. Die Mehrzahl der Fälle von E.coli-induzierter Koliseptikämie beim Geflügel werden durch E.coli-Stämme mit einem der drei O-Antigene 01, 02 und 078 verursacht. Koliseptikämie wird, so nimmt man an, durch Einatmen von fäkalkontaminiertem Staub verursacht. Der genaue Ort, an dem sich E.coli innerhalb der Atemwege festsetzt und die Erkrankung verursacht, ist unbekannt. Abgesehen von ihrem Vermögen, die Atemwege von Vögeln zu besiedeln, zeigen E.coli-Stämme, die Koliseptikämie zu verursachen vermögen, auch noch eine Reihe von Virulenzeigenschaften, die denen von E.coli-Stämmen sehr ähnlich sind, die beim Menschen und anderen Tieren extraintestinale Infektionen verursachen. So z.B. wurden Colicin V (ColV)-Plasmide in einem erheblichen Anteil von Stämmen, die Koliseptikämie bei Hühnern, und von Stämmen, die Meningitis beim Menschen verursachen, gefunden. Die Übertragung von ColV-Plasmiden auf E.coli vermindert deren LD&sub5;&sub0;-Wert bei i.p.-Injektion bei Mäusen und i.v.-Injektion bei Kücken, und die Entfernung der ColV-Plastnide aus pathogenen Stämmen bewirkt eine Verminderung ihrer Virulenz. Die Synthese von Colicin V ist nicht an dieser Zunahme der Letahtät beteiligt. Diese Korrelation zwischen der Anwesenheit von ColV-Plasmiden und der Letalität bewirkt eine weitere Kennzeichnung der ColV-Plasmide. Es wurde gefunden, daß ColV-I- K94, ein Plasmid aus E.coli K 94, einem Stamm, der aus dem Stuhl von mit Salmonella paratyphi B infizierten Patienten isoliert worden war, das iss-Gen enthält, welches die Wirkung, nicht jedoch die Bildung des terminalen Komplementkomplexes blockiert. Die Anwesenheit und Expression von Aerobactingenen, einem wirksamen Fe-Chelatierungssystem, von dem man annimmt, daß es bei der Virulenz eine gewisse Rolle spielt, erwies sich als weitgehend korreliert mit der Virulenz vogelpathogener E.coli-Stämme, sowie mit menschlichen klinischen Isolaten aus Septikämie- und Pyelonephritisinfektionen sowie aus Infektionen der ableitenden Harnwege. Es zeigte sich, daß Aerobactingene sowohl bei vogel- als auch bei humanpathogenen Isolaten auf ColV-Plasmiden vorkommen. Ein weiteres Merkmal, das bei der Virulenz menschlicher extraintestinaler E.coli-Isolate eine Rolle zu spielen scheint, ist das Kapselantigen K1. Circa 80 % der E.coli-Stämme, die Neugeborenenmeningitis verursachen, exprimieren K1, und ein erheblicher Anteil der E.coli- Stämme, die Hamwegsinfektionen verursachen, weisen ebenfalls K1 auf. Man nimmt an, daß das K1-Antigen die Zellen vor dem Aktivierungskomplement abschirmt. Die Rolle von K1 als Virulenzfaktor in vogelpathogenen Stämmen ist nicht untersucht worden, jedoch entfällt ein erheblicher Anteil der Koliseptikämie verursachenden Stämme auf 01:K1 und 02:K1. Die bei 078- Stämmen gefundenen K80-Kapseln können ähnlich wie K1 virulenzverstärkende Eigenschaften aufweisen.
Bei der Haftung von E.coli auf dem Wirtsgewebe und bei der nachfolgenden Pathogenese scheinen Pih eine wichtige Rolle zu spielen. Dies scheint auch für Koliseptikämie verursachende E.coli zu gelten, da aus gereinigten Pili zusammengesetzte Impfstoffe Hühner vor der nachfolgenden Kontrollinfektion (challenge) zu schützen vermögen; Neben ähnlichen Virulenzfaktoren kommt es zwischen Koliseptikämie bei Geflügel und extraintestinale Infektionen beim Menschen verursachenden E.coli-Stämmen auch zu einer Überschneidung der mit diesen Erkrankungen verbundenen Serotypen. Wie oben angegeben, wird die Vogelkoliseptikämie gewöhnlich durch Stämme des Serotyps 0 01, 02 und 078 verursacht. Das K1-Antigen ist gewöhnlich mit den Stämmen 01 und 02 verbunden, weshalb die Serotypen 01:K1 und 02:K1 für einen Großteil der Vogelkoliseptikämie verantwortlich sind. Diese Serotypen stehen außerdem mit Erkrankungen des Menschen in Zusammenhang wie z.B. mit Neugeborenenmeninigitis und Hamwegsinfektionen. Die Klonanalyse von 02: K1-Stämmen, die aus Neugeborenenmeningitis, Hamwegsinfektionen und Vogelkoliseptikämie isoliert wurden, zeigen, daß diese Stämme hinsichtlich ihrer Außenmembranproteinprofile und der elektrophoretischen Beweglichkeit der Enzyme sehr ähnlich sind. Außerdem stehen diese Stämme 01:K1-Stämmen sehr nahe, die aus Hamwegsinfektionen, Septikämie und Neugeborenenmeningitis isoliert wurden.
Es ist daher offensichtlich, daß abgesehen von der hohen Erkrankungs- und Letalitätsrate aufgrund von Koliseptikämie, was für die Geflügelindustrie negative wirtschaftliche Folgen hat, es auch möglich ist, daß das Geflügel ein Reservoir für die Übertragung von E.coli-Stämmen über die Nahrungskette bildet, die beim Menschen extraintestinale Infektionen hervorrufen können. Wenn dies der Fall ist, könnte die Verhinderung dieser Infektionen bei Geflügel auch das angenommene, jedoch noch nicht bewiesene Problem der Gesundheitsgefährdung der Bevölkerung beseitigen.
Infektion und Besiedelung durch Salmonella ist eine Folge der oralen Aufnahme von durch Salmonella kontaminierten Stoffen. Für die Erstbesiedelung scheint ein Wildtyplipopolysaccharid (LPS) mit wiederkehrenden O-Seitenketten entscheidend zu sein, da rauhe Stämme ohne diese O-Seitenketten oder einen Teil des Kerns das die Darmwand auskleidende Mücin und Glycocalyx nicht zu durchdringen vermögen und den Darmtrakt passieren. Obwohl es durchaus möglich ist, daß Pili, Geißeln und verschiedene mannoserestistente Lektine es Salmonella erlauben, sich an die die Darmwand auskleidenden Zellen anzuheften, scheint doch die Abwesenheit eines der genannten Faktoren infolge Mutation ohne Einfluß auf die Darmbesiedelung und die Ätiologie zu sein. Bei S.typhimurium hängt das Eindringen in die Darmmucosazellen von der Aktivität von vier Genen ab, von denen drei ein Operon bilden, und die den Invasionsmechanismus bestimmen. S.typhimurium-Inv&supmin;-Mutanten wandern, abgesehen von ihrer auf ein Hundertstel herabgesetzten Fähigkeit, in Zellen in Kultur einzudringen, in die Darmmucosa in geringerem Umfange ein und haben einen LD&sub5;&sub0;-Wert, der denjenigen der Wildtypstämme bei oralem Infektionsweg um das 60- bis 100-fache übersteigt. Die mv- Gene sind jedoch für die Infektion auf anderem Wege nicht erforderlich, da der LD&sub5;&sub0;-Wert für den Wildtyp und die Inv&supmin;-Mutanten bei intraperitonealer Beimpfung derselbe ist. Es ist bekannt, daß S.typhimurium sich anfänglich anheftet, eindringt und im darmassoziierten lymphatischen System (GALT oder Peyer- Plaques) verbleibt, bevor es die tiefer gelegenen Gewebe wie die Mesenterallymphknoten, die Leber und die Milz erreicht. Die erfolgreiche Besiedelung dieser tiefer gelegenen Gewebe hängt bei bestimmten invasiven Salmonella-Arten von der Anwesenheit eines Virulenzplasmids sowie von einer Anzahl von chromosomalen Genen ab. Nur die Serotypen S.typhimurium, S.enteritidis, S.dublin, S.choleraesuis, S.gallinarum und S.pullorum sind häufig mit einem Virulenzplasmid ausgestattet, welches nach Einsetzen der Infektion auf oralem Wege die Virulenz steuert. Eine Reihe von Untersuchungen hat ergeben, daß Stämme ohne dieses Virulenzplasmid den Darmtrakt zwar noch zu besiedeln in der Lage sind, jedoch nur in geringerem Maße die Leber und die Milz zu erreichen und/oder sie zu besiedeln vermögen. Für diesen Phänotyp von S.typhimurium ist insbesondere ein durch ein 28 kDa-Plasmid kodiertes Protein weitgehend verantwortlich. Die dieses 28 kDa-Plasmid-kodierte Protein kodierende DNA-Sequenz hybridisiert mit derselben Sequenz in den Virulenzplasmiden aus allen oben genannten invasiven Salmonella- Arten. Das 28 kDa-Protein kann bei all diesen invasiven Arten dieselbe Rolle spielen.
Die fortgesetzte Produktion von LPS in vivo ist auch von Bedeutung für die Fähigkeit von Salmonella, invasive Erkrankungen zu verursachen, da die Abwesenheit von LPS Salmonella für unspezifische Abwehrmechanismen des Wirts empfänglich macht.
Mehrere Gene, die an der Gesamtsteuerung anderer Gene teilhaben, sind für Salmonella erforderlich, um tiefer liegende Gewebe besiedeln und eine Erkrankung auslösen zu können. So konnten Curtiss und Kelly zeigen, daß S.typhimurium-Stämme nicht zur Synthese von Adenylatcyclase befähigt sind, und der Cyclo-AMP-Rezeptor war avirulent und immunogen. Später wurde festgestellt, daß S.typhimurium-Stämme mit Mutationen im phoP- Gen, das Gene steuert, welche es Salmonella erlauben, in Makrophagen zu überleben, völlig avirulent und außerdem immunogen sind. Stämme mit Mutationen in phoQ (Miller et al. /1989/) haben denselben Phänotyp wie Mutationen in phoP. Nachfolgend werden alle Stämme mit Mutationen in phoP oder phoQ als phoP- Mutanten bezeichnet.
Die bekannten Merkmale, die mit E.coli-Stämmen verbunden sind, welche Kolibazillose hervorzurufen vermögen, sind oben aufgezählt. Man muß jedoch ganz offensichtlich annehmen, daß diese E.coli-Stämme, welche Alveolarsacculitis hervorzurufen vermögen, ähnlich wie Salmonella über einen Mechanismus zum Durchdringen der Membranen des Alveolarsacks und/oder der Lunge befähigt sind, da es bei fehlender Septikämie zu Pericarditis kommen kann. Es ist zu vermuten, daß äußere Membranproteine am Eindringen beteiligt sind, wie dies auch bei Salmonella und Yersinia der Fall ist. Wie oben ausgeführt, ist ein wichtiges Merkmal von E.coli-Stämmen, die Septikämie verursachen, ein sehr wirksamer Mechanismus der Eisenchelatbildung. Die im Serum festgestellten niedrigen Eisenkonzentrationen von etwa 10&supmin;¹&sup8; M liegen weit unterhalb der für das Bakterienwachstum erforderlichen Konzentration. Eisenentzug führt, wie festgestellt werden konnte; zu Veränderungen im Zellstoffwechsel infolge der Synthese von niedermolekularen Eisenchelatbildnern und äußeren Membranproteinen. Diese sind es nun, welche die Rezeptoren für die eisenbindenden Komplexe und einen Teil des hohe Affinität aufweisenden eisenaufnehmenden Systems von E.coli bilden. In dieser Hinsicht ist es von Bedeutung darauf hinzuweisen, daß Antikörper gegen einen dieser eisengesteuerten äußeren Membranproteine (OMP) Truthühner vor Kolibazillose zu schützen vermögen. Außerdem muß festgestellt werden, daß Sera gegen einen Fe-Enterochelinrezeptor von E.coli mit dem Enterochelinrezeptor und mehreren höhermolekularen Proteinen, die von unter der starken Einwirkung von Eisen stehenden S.typhimurium-Zellen produziert worden waren, eine Kreuzreaktion ergaben.
Bei Mäusen und beim Menschen (und wohl auch bei anderen Vertebraten) liegt in der Mucosa ein einheitliches Immunnetz vor, so daß die Präsentation von Antigenen das GALT dazu veranlassen, für die Vermehrung und den Transport der für diesen Zweck vorgesehenen B-Zellen zu sämtlichen sekretorischen Geweben und Drüsen im Körper und schließlich für die Produktion von Sekretions-IgA (sIgA) zu sorgen. Die sIgA's, die gegen die eine bestimmte Oberfläche aufweisenden Antigene von pathogenen Organismen, welche die Schleimhautoberfläche besiedeln und/oder durchdringen, gerichtet sind, dienen der Verhinderung ihres Festsetzens und Eindringens. Es kann wohl auch angenommen werden, daß die antigenspezifischen sIgA's die antikörperabhängige Cytotoxizität, die durch die Phagozytenzellen vermittelt wird, im Hinblick auf das Darmepithel und die Lamina propria unter Umständen begünstigen. Obwohl eine sekretorische Immunreaktion für eine vollständige Unterdrückung der Infektion durch invasive pathogene Organismen nicht ausreicht, wird dadurch dennoch die Zahl der Mikroorganismen, die erforderlich ist, um eine Erkrankung auszulösen, erhöht. Durch ihre Induktion sollte daher die Wahrscheinlichkeit einer Infektion und einer ansteckenden Ausbreitung von pathogenen Organismen wie Salmonella vermindert werden.
Es wurden avirulente Mutanten von S.typhimurium isoliert, welche die Fähigkeit besitzen, die Schutzimmunität gegenüber Infektion durch virulente Salmonella zu stimulieren. In der Folge hat man festgestellt, daß viele dieser avirulenten Mutanten ihre Fähigkeit bewahren, sich an das GALT anzuheften, in dieses einzudringen und in ihm zu verbleiben. Es wurde berichtet, daß Salmonella-Mutanten, die zur Synthese von Adenylatcyclase nicht befähigt sind und aufgrund der Deletion der (δ)-Mutanten im cya- und crp-Gen das cyclische AMP-Rezeptorprotein nicht aufweisen, vollständig avirulent und im hohen Maße immunogen sind, wenn sie zur oralen Immunisierung von Mäusen verwendet werden. Ferner wurde festgestellt, daß δ-cya- und δ-crp-S.typhimunum-Stämme für Schweine und Schafe avirulent sind und δ- cya- und δ-crp-S.choleraesuis-Stämme für Mäuse avirulent und immunogen sind.
Mit S.typhimurium immunisierte Mäuse zeigen häufig unspezifische Resistenz gegenüber Kontrollinfektion mit heterologen Bakterienstämmen ca. einen Monat nach der Immunisierung, wonach die Immunität für S.typhimurium oder eine andere Art mit demselben Gruppenantigen spezifisch wird. In der unspezifischen Phase der Reaktion scheint das LPS für die Stimulierung der Produktion aktivierter Makrophagen verantwortlich zu sein, was unter Umständen auf Hühner nicht zutrifft, die zumindet gegen LPS-Toxizität unempfindlich sind. Obwohl die Immunreaktion auf T-unabhängige O-Antigendeterminanten für die einzelnen Salmonellagruppen relativ spezifisch ist, ist es wahrscheinlich, daß es eher zu einer immunologischen Kreuzreaktion mit den Oberflächenproteinen in den einzelnen O-Antigengruppen oder mit dem Lipid A-LPS-Kernantigen kommt, das allen Salmonella-Arten gemeinsam ist. In dieser Hinsicht wurde bisher der Möglichkeit der Induktion der Kreuzschutzimmunität in der Mucosa und im humoralen Bereich durch heterologe Salmonella, verursacht durch die Anwesenheit von verteilten Oberflächenproteinantigenen und LPS-Kern-Epitopen, nur wenig Beachtung geschenkt.
Vor über 10 Jahren wurden zahlreiche Untersuchungen zum Immunsyslem von Vögeln veröffenllicht. Hühner verfügen sowohl über GALT und BALT, als auch über die Harder-Drüse, die jeweils ventral und posteriomedial zum Augapfel angeordnet ist, Antikörper sezernierende Zellen enthält und eine wichtige Rolle bei der Produktion sekretorischer Antikörper für die oberen Atemwege spielen kann. Es ist unbekannt, ob die Antikörper sezernierenden Zellen in dieser Drüse durch Antigenstimulierung des GALT oder des BALT oder der Harder-Drüse seltbst entstehen. Angaben zur Existenz eines Immunsystems in der Mucosa von Vögeln fehlen generell. Informationen über ein einheitliches Immunsystem in der Mucosa der Vögel fehlen insgesamt.
Die Europäische Patentanmeldung Nr. 0249449 offenbart einen avirulenten Stamm eines ein gal-Operon enthaltenden Enterobakteriums mit wenigstens einer definierten nicht reversiblen Mutation im galE-Gen und mit wenigstens einer weiteren definierten nicht reversiblen attenuierenden Mutation und einem das interessierende Gen enthaltenden DNA-Fragment. Dieser avirulente Stamm kann als Impfstoffzusammensetzung bereitgestellt werden.

Offenbarung der Erfindung

Die Erfindung betrifft lebende avirulente Salmonella-Zellen und ihre Verwendung als Impfstoffe für die Immunisierung von Individuen zur Induzierung der Kreuzschutzimmunität, um die Infektion und Besiedelung durch homologe und heterologe Salmonella-Serotypen und durch andere Gram-negative Enterobakterien zu reduzieren.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft somit einen Impfstoff zur Behandlung eines Individuums gegen Infektionen durch Gram-negative Bakterien, bestehend aus lebenden avirulenten Salmonella-Zellen, welche gegenüber homologen und heterologen Salmonella-Serotypen und gegenüber anderen Gram-negativen Enterobakterien Immunität zu induzieren vermögen, wobei die Salmonella-Zellen eine Mutation in einem Gen, das Adenylatcyclase (cya) und/oder cyclisches AMP-Rezeptorprotein (crp) kodiert, und ferner eine Mutation in einem Gen, das ein Enzym bei der Lipopolysaccharidsynthese kodiert, aufweisen, was zu einem reversibel rauhen Phänotyp führt, wobei die Menge an lebenden Zellen ausreicht, um die Resistenz des Individuums gegen Infektionen durch Gram-negative Enterobakterien zu verbessern und die Salmonella-Zellen in einem pharmazeutisch verträglichen Träger vorliegen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft einen Impfstoff zur Behandlung eines Individuums gegen Infektionen durch Gram-negative Bakterien, bestehend aus lebenden avirulenten Salmonella-Zellen, welche die Immunität gegenüber homologen und heterologen Salmonella-Serotypen und gegenüber anderen Gram-negativen Enterobakterien zu induzieren vermögen, wobei die Salmonella-Zellen wenigstens eine Mutation in einem Gen, das an der Gesamtsteuerung der Pathogenität von Salmonella teilnimmt, und ferner eine Mutation in einem Gen, das die Synthese der durch Eisen gesteuerten äußeren Membranproteine (OMP) steuert, so daß die Mutation zu einer konstitutiven Expression der durch Eisen gesteuerten OMP's führt, aufweisen, wobei die Menge an lebenden Zellen ausreicht, um die Resistenz des Individuums gegen Infektionen durch Gram-negative Enterobakterien zu verbessern und die Salmonella-Zellen in einem pharmazeutisch verträglichen Träger vörliegen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft einen isolierten avirulenten Salmonella-Stamm, welcher die Immunität gegenüber homologen und heterologen Salmonella-Serotypen und gegenüber anderen Gram-negativen Enterobakterien zu induzieren vermag, wobei der Stamm eine Mutation in einem Gen, das Adenylatcyclase (cya) und/oder cyclisches AMP-Rezeptorprotein (crp) kodiert, und ferner eine Mutation in einem Gen, das ein Enzym bei der Lipopolysaccharidsynthese kodiert, aufweist, was zu einem reversibel rauhen Phänotyp führt.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von lebenden avirulenten Salmonella-Zellen, die wenigstens eine Mutation in einem Gen, das an der Gesamtsteuerung der Pathogenität von Salmonella teilnimmt, und ferner eine Mutation in einem Gen, das ein Enzym bei der Lipopolysaccharidsynthese kodiert, aufweisen, was zu einem reversibel rauhen Phänotyp führt, zur Herstellung eines Medikaments für die Induzierung von Immunität gegenüber heterologen Salmonella-Serotypen oder anderen Gram-negativen Bakterien als Salmonella.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft einen isolierten avirulenten Salmonella-Stamm, welcher die Immunität gegenüber homologen und heterologen Salmonella-Serotypen und gegenüber anderen Gram-negativen Enterobakterien zu induzieren vermag, wobei der Stamm wenigstens eine Mutation in einem Gen, das an der Gesamtsteuerung der Pathogenität von Salmonella teilnimmt, und ferner eine Mutation in einem Gen, das die Synthese der durch Eisen gesteuerten äußeren Membranproteine (OMP) steuert, so daß die Mutation zu einer konstitutiven Expression der durch Eisen gesteuerten OMP's führt, aufweist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der Struktur des Lipopolysaccharids (LPS) von S.typhimurium.
Fig. 2 ist eine Photokopie eines Western-Blots von Ganzbakterienextrakten, sondiert mit einem Serum aus einer mit lebensfähigen Chi3306-Zellen immunisierten Ratten. Die Bakterienextrakte stammen von unterschiedlichen Stämmen von E.coli und Salmonella.
Fig. 3 ist eine Photokopie eines Western-Blots von Ganzbakterienextrakten, sondiert mit einem Serum von mit lebensfähigen Chi3985-Zellen immunisierten Vögeln und von nichtimmunisierten Kontrollvögeln; die Extrakte stammen von E.coli-Chi7122 und von S.typhimurium-Chi3985, wobei beide Stämme in einer Bouilion gezüchtet wurden.
Fig. 4 ist eine Photokopie eines Western-Blots von Ganzbakterienextrakten, sondiert mit einem Serum von einem Kaninchen, das mit dem E.coli-Stamm Chi7122 immunisiert worden war, der seinerseits in einer Bouillon gezüchtet worden war. Die Bakterienextrakte stammen von S.typhimurium und E.coli, die in Anwesenheit einer geringen und einer hohen Eisenkonzentration gezüchtet worden waren.
Fig. 5 ist eine Photokopie eines Western-Blots von Ganzbakterinextrakten, sondiert mit einem Serum von einem Kaninchen, das mit einem Präparat eines äußeren Membranproteins vom E.coli-Stamm Chi7122 immunisiert wurde. Die Bakterienextrakte stammen vom Wildtyp und die fur-Mutanten von S.typhimurium, die in Anwesenheit einer geringen und einer hohen Eisenkonzentration gezüchtet worden waren.

Ausführungsarten der Erfindung

A. Definitionen

Die Mikroorganismen bezeichnenden Ausdrücke "rekombinante Wirtszellen", "Wirtszellen", "Zellen" und andere entsprechende Ausdrücke sind austauschbar und bedeuten Zellen, die als Empfänger für rekombinante Vektoren oder andere transferierte DNA in Frage kommen oder kamen und die Nachkommenschaft der transfizierten Ausgangszellen umfassen Es versteht sich von selbst, daß die Nachkommenschaft einer einzelnen Eltemzelle bedingt durch zufällige oder beabsichtigte Mutationen nicht notwendigerweise im Genomkomplement bzw. im Gesamt-DNA-Komplement mit dem Ausgangselter vollständig identisch sein muß. Die ausreichende Ähnlichkeit der Nachkommenschaft der Eltemzelle mit dem Elter, die durch eine entsprechende Eigenschaft wie z.B. durch einen durch die hier beschriebenen Mutationen bewirkten Phänotyp wie z.B. die Unfähigkeit von δ-cya- oder δ- crp-Salmonella-Mutanten, Kohlehydrate wie Maltose, Mannit, Sorbit, Melibiose, Citrat und Gylcerin zu vergären oder auf ihnen zu gedeihen, zu kennzeichnen ist, ermittelt man durch Plattierung auf einem geeigneten Gärungsindikatormedium wie auf mit 1 % des entsprechenden Kohlehydrats suppiementierten MacConkey-Agar, oder durch das Unvermögen auf einem mit 0,5 % des Kohlehydrats supplementiertem Mineralsalzminimalmedium zu gedeihen, - im Gegensatz zu sämtlichen Salmonella-Wildtypformen, die alle diese Kohlehydrate zu vergären und/oder zu verwerten vermögen.
Der Begriff "Gram-negative Bakterien" umfaßt Kokken, Nicht- Darmstäbchen, Darmstäbchen und Spirillen. Dazu gehören z.B. folgende Gattungen: Neisseria, Spirillum, Pasteurella, Brucella, Yersinia, Francisella, Haemophilus, Bordetella, Eschenchia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Proteus, Vibrio, Pseudomonas, Bacteroides, Acetobacter, Aerobacter, Agribacterium, Azotobacter, Spirilla, Serratia, Vibrio, Rhizobium, Chlamydia, Rikettsia, Treponema, Spirillum und Fusobacterium.
Der Ausdruck "Gram-positive Bakterien" umfaßt Kokken, nichtsporenbildende Stäbchen und sporenbildende Stäbchen. Dazu gehören z.B. folgende Gattungen: Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Erysipelothrix, Lactobacillus, Listena, Mycobacterium, Myxococcus, Nocardia, Staphylococcus, Streptococcus und Streptomyces.
Der Begriff "Enterobacteriaceae" ist ein Sammelbegriff für Darmbakterien und umfaßt Escherichieae, Edwardsielleae, Salmonellae, Yersinia, Providencia, Serratia, Erwiniae, Citrobacterae, Enterobacterae, Shigellae, Klebsiellae und Proteae.
"Mycobakterien" werden durch ihre unterschiedlichen Anfärbungseigenschaften definiert, das heißt sie lassen sich mit angesäuerten organischen Lösungsmitteln nicht entfärben, sowie durch das Vorliegen langkettiger (ca. 60 C-Atome) Mycolsäuren.
Die Gensymbole für die Mutantenstämme, wie sie hier verwendet werden, entsprechen denen von Bachmann (1987) sowie Sanderson und Roth (1987). Die für die Transposone verwendeten Symbole, insbesonder Tn10, entsprechen der von Bukhari et al. (1977) beschriebenen Übereinkunft.
Der Ausdruck "reversibel rauher Phänotyp" bedeutet, daß der Stamm auf einem vollständigen Lipopolysaccharid gedeiht, wenn ein Kohlenhydrat, für das er auxotroph ist, zugeführt wird und einen überzug aus unvollständigem Lipopolysaccharid produziert, wenn das Kohlenhydrat der begrenzende Faktor ist oder überhaupt fehlt, so daß dann der Lipopolysaccharidkern entblößt ist. Methoden zum Nachweis der "rauhen" Überzüge sind aus dem Stand der Technik bekannt, und Beispiele für den Nachweis von Mutanten mit reversibel rauhen Phänotypen werden weiter unten beschrieben.
Der Ausdruck "konstitutive Expression" bedeutet hier die Expression eines Polypeptids unter Bedingungen, unter denen die Expression gewöhnlich reprimiert wird. Die Methoden zum Nachweis der konstitutiven Expression sind aus dem Stand der Technik bekannt, und Beispiele für einiger dieser Methoden werden weiter unten angeführt.
Der Ausdruck "Individuum", das mit einem erfindungsgemäßen Impfstoff behandelt wird, umfaßt hier sämtliche Wirbeltiere, wie z.B. Säugetiere, Haustiere und den Menschen eingeschlossen, sowie verschiedene Arten von Vögeln einschließlich Geflügel, insbesondere solche von landwirtschaftlicher Bedeutung. Mit umfaßt sind außerdem Mollusken und bestimmte andere Wirbellose, die über ein primitives Immunsystem verfügen.
Der Ausdruck "Behandlung" bedeutet die Anwendung des Impfstoffs auf ein Individuum, die eine Immunschutzreaktion gewährleistet und umfaßt Prophylaxe und/oder Therapie.
Der Ausdruck "Transformation" umfaßt hier die Insertion eines exogenen Polynucleotids in eine Wirtszelle, und zwar unabhängig von der angewandten Insertionsmethode, wie z.B. Direktaufnahme, Transduktion oder Konjugation. Das exogene Polynucleotid kann als Plasmid gehalten oder in das Wirtsgenomn integriert werden.
Der Ausdruck "pathogener Mikroorganismus", wie er hier verwendet wird, bedeutet, daß dieser Kranheitssymptome verursacht, wie sie gewöhnlich mit dem pathogenen Organismus verbunden sind.
Der Ausdruck "avirulenter Mikroorganismus" bedeutet einen solchen, der zur Besiedelung und Replikation in einem infizierten Individuum befähigt ist, jedoch nicht die Krankheitssymptome verursacht, wie sie gewöhnlich mit virulenten Stämmen derselben Mikroorganismenart verbunden sind. "Avirulent" bedeutet nicht, daß eine Mikrobe der betreffenden Gattung oder Art nie als pathogen fungieren kann, sondern daß die konkrete zu verwendende Mikrobe in bezug auf das konkrete zu behandelnde Individuum avirulent ist. Die Mikrobe kann einer Gattung oder sogar einer Art angehören, die gewöhnlich pathogen ist, muß jedoch einem avirulenten Stamm angehören. Avirulente Stämme sind nicht fähig, die Gesamtheit der Krankheitssymptome zu induzieren, die gewöhnlich mit ihrem virulenten pathogenen Gegenstück verbunden sind. Avirulente Mikroorganismenstämme können von virulenten Stämmen durch Mutation abgeleitet werden.
Der Ausdruck "Mikrobe" umfaßt hier Bakterien, Protozoen und einzellige Pilze.
Der Ausdruck "Antigen" bedeutet ein Molekül, das ein oder mehrere Epitope enthält, die das Immunsystem eines Wirts stimulieren, um es zu einer sekretorischen, humoralen und/oder zellulären antigenspezifischen Reaktion zu veranlassen. Der Ausdruck "Antigen" ist auch mit dem Ausdruck "Immunogen" austauschbar.
Der Ausdruck "Hapten" bedeutet ein Molekül, das ein oder mehrere Epitope enthält, das selbst jedoch das Immunsystem eines Wirts nicht stimuliert, um es zu einer sekretorischen, humoralen und/oder zellulären Reaktion zu veranlassen.
Der Ausdruck "Epitop" bedeutet eine Stelle an einem Antigen oder Hapten, mit dem ein Antikörper oder Zellrezeptor bindet, der für diese Stelle spezifisch ist. Ein Epitop kann 3 Aminosäuren in einer für das Epitop kennzeichnenden räumlichen Konformation umfassen, besteht jedoch im allgemeinen aus wenigstens 5 Aminosäuren und insbesondere aus wenigstens 8 bis 10 Aminosäuren. Der Ausdruck "Epitop" ist ebenfalls mit dem Ausdruck "Antigen-Determinante" oder "Antigen-Determinantensite" austauschbar.
Eine "immunologische Reaktion" auf eine Zusammensetzung oder einen Impfstoff, der ein Antigen enthält, ist die Auslösung einer zellulären und/oder durch Antikörper vermittelten Immunreaktion auf die jeweilige Zusammensetzung bzw. den jeweiligen Impfstoff. Gewöhnlich besteht die Reaktion darin, daß das Objekt Antikörper, B-Zellen, T-Helferzellen, T-Suppressorzellen und/oder cytotoxische T-Zellen produziert, die spezifisch gegen ein Antigen oder Antigene in der jeweiligen Zusammensetzung bzw. im jeweiligen Impfstoff gerichtet sind.
Unter dem Ausdruck "Impfstoffzusammensetzung" oder "Impfstoff" versteht man ein Mittel zur Stimulierung des Immunsystems eines Individuums, so daß die vorliegende Schädigung abgemildert wird oder ein Schutz vor künftiger Schädigung gewährleistet ist.
Der Ausdruck "Immunisierung" bedeutet den Prozeß der Induzierung eines fortgesetzt hohen Antikörperspiegels und/oder einer Zellimmunreaktion, die gegen ein Antigen gerichtet ist, dem der Organismus vorher ausgesetzt war.

B. Allgemeine Beschreibung

In der Praxis der vorliegenden Erfindung bedient man sich, wenn nicht anders angegeben, der üblichen Techniken der Zellkultur, Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA und Immunologie, die dem Stand der Technik entsprechen. Die einzelnen Techniken werden in der Literatur umfassend erläutert [siehe z.B. Maniatis, Fritsch and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning, Bd. I und II (D.N. Glover, ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds., 1984); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); die Reihe Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses (R.L. Rodriguez and D.T. Denhardt, eds., 1987, Butterworths); und J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (1972, Cold Spring Harbor Laboratory) sowie Handbook of Experimental Immunology, Bd. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwelif eds., 1986, Blackwell Scientific Publications].
Auf alle Patentschriften, Patentanmeldungen und Veröffentlichungen&sub1; die hier oben und weiter unten erwähnt werden, wird ausdrücklich Bezug genommen.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe umfassen lebende avirulente Salmonella-Stämme mit erhöhter Fähigkeit zur Besiedelung des Darmtrakts des immunisierten Individuums und mit erhöhter Fähigkeit zur Auslösung von Immunreaktionen im Individuum, welche die Wahrscheinlichkeit der Besiedelung und der Persistenz heterologer Salmonella-Stämme verringern und durch Enterobacteriaceae wie z.B. E.coli verursachte Erkrankungen verhindern.
Die Salmonella-Stämme, aus denen die in den Impfstoffen verwendeten Stämme konstruiert werden, sind im allgemeinen aufgrund einer Mutation oder von Mutationen in einem oder mehreren Genen mit "Gesamtsteuerung der Pathogenität", das heißt mit koordinierter Steuerung einer Anzahl von Genen, welche jene umfassen, die bakterielle Virulenzfaktoren kodieren, avirulent. Beispiele für solche "Globalmutanten"-Stämme sind solche, die Mutationen, vorzugsweise Deletionsmutationen (offenes Dreieck) δ-cya und δ-crp aufweisen, welche ihnen die Fähigkeit zur Synthese von Adenylatcyclase (cyclisierende ATP-Pyrophosphatlyase (EC 4.6.1.1) und des cyclischen AMP-Rezeptorproteins (CRP) nehmen. Die Methoden zur Herstellung dieser Stämme sind aus dem Stand der Technik bekannt [siehe z.B. Curtiss and Kelly (1987)] Chi4064 und Chi4062, die Stämme dieser Mutanten, sind bei der Sammlung American Type Culture Collection hinterlegt worden und haben die Zugangsnummern 53.648 bzw. 53.647. Beispiele für "Globalmutanten" sind außerdem die Mutanten (vorzugsweise Deletionsmutanten) im phoP-Gen. phoP-Mutanten von S.typhimurium wurden von Galan und Curtiss (1989) beschrieben und sind in der Sammlung American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer 53.864 und 53.866 für die Stämme Chi3687 bzw. Chi3689 hinterlegt. Ein weiterer Stamm, der eine phoP::Tn10-Mutation aufweist, wobei das Tn10 in das phoP-Gen inseriert wurde, wurde als Chi4126 bezeichnet und ist bei ATCC unter der Zugangsnummer ... hinterlegt worden.
Für den vorliegenden Zweck stehen mehrere hundert Wildtypstämme von Salmonella, die über 40 Arten darstellen und aus einer Vielzahl von infizierten Tierarten erhalten wurden, zur Verfügung. Viele dieser Stämme wurden aus Geflügel isoliert und bestimmte zugängliche Stämme, insbesondere S.enteriditis- Stämme aus Spanien, England und den Vereinigten Staaten, sind dafür bekannt, daß sie von Geflügel übertragen wurden und beim Menschen Erkrankungen verursachen. Einer oder mehrere dieser Stämme können zur Konstruktion der "Globalmutanten"-Stämme verwendet werden.
Obwohl Salmonella und insbesondere S.typhimurium dafür bekannt sind, daß sie eine große Zahl der verschiedensten Tierarten infizieren, bestehen doch Unterschiede in der Fähigkeit der einzelnen Stämme, verschiedene Tierarten zu infizieren und Krankheiten zu verursachen. So ist der zu lebenden avirulenten Impfstoffstämmen genetisch modifizierte Salmonella-Stamm von einem hochvirulenten Stamm abgeleitet, der in die betreffende Art oder eine immunologisch verwandte Modellart des zu immunisierenden Individuums eingebracht worden war. So z.B. ist bei Impfstoffen für Hühner ein genetisch modifizierter lebender avirulenter Impfstoffstamm von einem S.typhimurium-Stamm ARK 101 (auch als Chi3761 bezeichnet) abgeleitet, der in Hühner eingebracht worden war und einen oralen LD&sub5;&sub0;-Wert von ca. 2 x 10&sup4; CFU hat. Chi3761 ist ein Derivat von ARK100 (auch als Chi3663 bezeichnet) nach Einbringung in Hühner. Ein δ-cva-δ- crp-Derivat von Chi3761, d.h. ARK106 (auch als Chi3985 bezeichnet) wird bei Dosen von bis zu 1 x 10&sup9; CFU vertragen, ohne daß eine Krankheit ausgelöst wird. Wird Chi3985 zur Immunisierung von Mäusen verwendet, induziert es hohe Schutzimmunität gegenüber der Kontrollinfektion mit bis zu 1 x 10&sup9; CFU des eiterlichen Chi3761 Die δ-cya-δ-crp-Mutation Chi4064 [Curtiss and Kelly (1987)], ein S.typhimurium-Stamm, ist für Mäuse hochvirulent, jedoch unfähig, 1 Tage alte Kücken durch Beimpfung auf oralem Wege abzutöten. Wie aus den Beispielen hervorgeht, induziert dieser Stamm Kreuzschutzimmunität gegenüber der Kontrollinfektion des kaudalen Alveolarsackes mit 078:K80 E.coli. Chi3985, ein anderer Stamm, induziert ebenfalls Kreuzschutzimmunität gegenüber der Kontrollinfektion mit E.coli- Stämmen, die zur Induzierung von Kolibazillose befähigt sind. Ein weiteres Beispiel für einen virulenten Elternstamm ist ARK201 (auch als Chi3850 bezeichnet), der aus einem Menschen isoliert wurde, der ihn durch eine Infektion infolge einer Übertragung durch Genuß von Ei erhalten hatte.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der "Globalmutanten"-Stamm von Salmonella noch weiter modifiziert, um seine Fähigkeit, Kreuzschutzimmunität zu induzieren, zu verbessern. Durch eine Modifizierungsart wird ein Phänotyp erzeugt, bei dem der Stamm die Fähigkeit hat, Wildtyp-LPS mit mehrfachen O-Antigen-Wiederholungen bei Züchtung in einem Kulturmedium mit einem geeigneten zugesetzten Kohlehydrat zu produzieren, jedoch nicht in der Lage ist, nach Infektion in Tierzellen gleichgültig ob sie sich in einer Kultur befinden oder in einem infizierten Individuum - normales LPS zu prodzuieren. Wenn daher diese Mutanten zur Herstellung von Impfstoffen verwendet werden, werden sie in einem Kulturmedium gezüchtet, welches das geeignete zugesetzte Kohlehydrat enthält, um auf diese Weise das Wildtyp-LPS zu erzeugen und so zu einem glatten Phänotyp zu gelangen, und damit die Mutanten ausreichend invasiv sind, um den Darm und das GALT bzw. BALT zu besiedeln. Nachdem sie jedoch zur Immunisierung eines Individuums verwendet wurden und die entsprechende Stelle besiedeln, werden sie allmählich rauh und lösen eine erhöhte Immunreaktion gegen die freiliegenden äußeren Membranproteine und den LPS-Kern aus. Außerdem können sie im rauhen Zustand gegenüber unspezifischen Schutzreaktionen des Wirts empfindlich sein. Zudem sollten die abgesonderten Zellen sowohl avirulent als auch nichtimmunogen sein und eine geringere überlebenswahrscheinlichkeit in der Natur als glatte Salmonella mit Wildtyp-Konzentrationen an LPS aufweisen. Die Mutation in den beiden Genen galE und pmi vermag diesen Phänotyp auf Salmonella zu übertragen.
Das galE-Gen kodiert UDP-Galactoseepimerase, die UDP-Galactose in UDP-Glucose und umgekehrt umwandelt und es auf Glucose gezüchteten Zellen ermöglicht, UDP-Galactose zu produzieren, die ihrerseits der Vorläufer sowohl für den LPS-Kern als auch für die 0-Antigen-Seitenkette in Salmonella ist. Stämme mit einer Mutation im galE-Gen vermögen nicht, UDP-Galactose zu synthetisieren, wenn sie in Medien mit Glucose gezüchtet werden. Sie vermögen daher nicht, LPS zu synthetisieren, und sind rauh, völlig avirulent [Germanier und Furer (1971)], nicht in der Lage, die Mucin- und Glycocalyx-Auskleidung des Darmtraktes zu durchdringen, und sind äußerst empfindlich gegenüber unspezifischen Schutzmechanismen des Wirts. galE-Mutanten produzieren UDP-Galactose nur, wenn sie mit exogener Galactose versorgt werden. Es scheint jedoch, daß in Säugerzellen der Hauptanteil der Galactose in modifizierter (z.B. phosphorylierter) Form vorliegt. Es wird daher angenommen, daß in einer Säuger- oder Vogelzelle eine galE-Mutante infolge des Mangels an Galactöse nicht normale LPS produziert. Außerdem ist der übrige Kern in den galE-Mutanten dem sämtlicher Darmbakterien überaus ähnlich. Daher kann eine Antikörperreaktion gegen diese Kernkomponente eine stärkere Kreuzschutzwirkung gegen Nicht-Salmonella-Darmbakterien ausüben als eine Antikörperreaktion gegen den. vollständigen Kern.
Das pmi-Gen kodiert Phosphomannoseisomerase, welche Fructose- 6-phosphat in Mannose-6-phosphat und umgekehrt umwandelt. Das Wachstum einer pmi-Mutante in Anwesenheit von Mannose ermöglicht eine normale Synthese der O-Antigen-Seitenkette von Salmonella, wohingegen die Züchtung in einem Glucose oder ein anderes Kohlehydrat enthaltenden Medium zum Fehlen der O-Antigen-Seitenkette führt, jedoch ein normales Kernpolysaccharid bildet.
Die Struktur des Lipopolysaccharids von S.typhimurium ist in Fig. 1 schematisch dargestellt. Die gestrichelten Linien A und B zeigen die Punkte der Beendigung der LPS-Synthese in den folgenden Mutanten: (A) UDP-Galactose-Mangel (UDP-4-galactoseepimerasnegativ); (B) GDP-Mannose-Mangel (Phosphomannoseisomerase).
Die Einführung der galE-Mutation oder pmi-Mutation in die "Globalmutanten"-Stämme kann mit Hilfe bekannter Techniken, wie z.B. durch Transposition erfolgen. Bei S.typhimurium kann die Transposition mit Tn10-Transposonen erfolgen, die mit gale oder pmi eng verknüpft sind, wie z.B. mit den Stämmen Chi3630 (Tn10 inseriert in nadA und verknüpft mit galE) und Chi4149 (Tn10 verknüpft mit pmi). Ein generalisierter Transduktionsphage kann zur Transduktion einer galE- oder pmi-Mutation in einen erwünschten Salmonella-Stamm wie z.B. einen solchen verwendet werden, der eine Gesamtmutation, wie oben beschrieben, enthält, wonach das Tn10 durch Selektion auf Fusarsäureresistenz entfernt wird. Die erhaltenen Stämme sollten, je nachdem, ob dem Züchtungsmedium Galactose oder Mannose zugegeben wurde, um die Synthese des LPS-Kerns und/oder der Seitenketten zu ermöglichen, reversibel rauh sein. Die δ-cya-δ-cpr-S.typhimurium Stämme können auf Galactose und Mannose gedeihen und diese vergären und zeigen eine normale LPS-Synthese. Daher sind die galE- und pmi-Derivate aufgrund ihres Unvermögens, auf Galactose bzw. Mannose zu wachsen oder diese zu vergären, leicht nachweisbar.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein "Globalmutanten"-Stamm von Salmonella oder ein Derivat davon duch eine Mutation (vorzugsweise eine Deletion im Gen fur) weitermodifiziert. Das fur-Gen steuert die Synthese eines Repressors, der, wenn im Medium genügend Eisen vorliegt, die Expression einer Anzahl von Genen einschließlich derer, welche mehrere äußere Membranproteine (OMP) kodieren, verhindert [Ernst et al. (1978)]. In Abwesenheit von Eisen blockiert der fur-Gen-Reperessor die Transkription der eisengesteuerten Gene nicht und ermöglicht dadurch die konstitutive Expression sämtlicher eisengesteuerter OMP's. Die wirksame Fe-Chelatbildung durch Salmonella ist wohl nicht kristisch, wenn der Mikroorganismus im Darmtrakt und im GALT vorliegt - vermutlich infolge der ausreichenden Verfügbarkeit von Eisen. Unter diesen Bedingungen synthetisieren die Wildtypstämme nur geringe Mengen an eisengesteuerten OPM's, weshalb diese Proteine wohl nicht als vorherrschende Antigene für eine Immunreaktion in Frage kommen. Die Verwendung einer Salmonella-fur-Mutation kann die Immunreaktion gegen die eisengesteuerten OPM's verstärken.
Die Eisen-Chelatbildung ist ein wichtiges Virulenzmerkmal von E.coli-Stämmen, die Septikämie zu verursachen vermögen. Die Induzierung einer Antikörperreaktion gegen eisengesteuerte OPM's kann den Grad der Kreuzschutzimmunität gegen E.coli verbessern, da bekanntlich zwischen den eisengesteuerten OPM's von E.coli und S.typhimurium eine starke immunologische Kreuzreaktionsfähigkeit besteht. [Siehe Chart and Griffiths (1985)].
Die Einführung einer Mutation in das fur-Gen kann mit bekannten Techniken erfolgen wie z.B. durch Transposition. Die Methoden zum Nachweis von fur-Mutanten sind aus dem Stand der Technik bekannt. So z.B. wird der Fur-Phänotyp von S.typhimunum durch den Arnow-Test (1937) nachgewiesen. Eine Methode zur Erzeugung von fur::Tn10-Mutationen wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Eine fur::Tn10-Mutation kann in eine Vielzahl von Impfstoffstämmen auf dem Wege der durch P22HTint vermittelten Transduktion eingeführt werden. Die Rezipientenstämme können z.B. solche mit δ-cya-δ-crp-Mutationen und/oder δ-phoP-Mutationen und/oder zusätzlichen Mutationen wie z.B. pmi und/oder galE umfassen. S.typhimurium-fur-Mutanten exprimieren konstitutiv sämtliche eisengesteuerten Außenmembranproteine einschließlich desjenigen, das zum Außenmembranprotein von E.coli homolog ist, das zur Induzierung passiver Schutzimmunität gegen durch E.coli bei Hühnern verursachte Kolibacillose befähigt ist.
Die Erfindung umfaßt außerdem rekombinante Stämme, bei denen lebende avirulente Salmonella-Impfstoffe als Vektoren für die Expression rekombinanter Besiedelungs- und/oder Virulenzantigene aus anderen Pathogenen dienen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das das rekombinante Antigen kodierende Gen in einem ausgewogenen letalen Wirt-Vektor- System exprimiert, wobei das geklonte Gen in einen Asd&spplus;-Vektor inseriert wird, der seinerseits in einen δ-cya-δ-crp-δ-asd-S.typhimurium-Stamm wie z.B. Chi4072 (ATCC-Zugangsnummer 67.538) oder Chi3987 (δ-asd-Derivat von Chi3985) eingeführt wird. Ein ausgewogenes letales System, das den rekombinanten Asd&spplus;-Vektor umfaßt, ist in WO/8903247 beschrieben. pmi- oder galE-Mutationen können in Chi4072 oder Chi3987 nach den oben beschriebenen Methoden eingeführt werden. Diese Stämme sind besonders geeignet für die Expression rekombinanter Besiedelungs- und/oder Virulenzantigene aus anderen Pathogenen, wenn diese Besiedelungs- und/oder Virulenzantigene auf der Oberfläche der avirulenten Salmonella-Zellen freiliegen. So können die rekombinanten Impfstoffstämme in Anwesenheit von Mannose oder Galactose gezüchtet werden, um eine normale LPS-Synthese zu ermöglichen, so daß nach orater Verabreichung an ein zu immunisierendes Tier die Salmonella-Zellen den Darmtrakt und das GALT besiedeln und in diese eindringen und danach allmählich das LPS von ihrer Oberfläche verlieren, um die exprimierten Besiedelungs- und/oder Virulenzantigene dann dem Immunüberwachungsnetzwerk auszusetzen und auf diese Weise eine erhöhte Immunreaktion zu ermöglichen.
Jeder der in diesen Ausführungsformen der Erfindung verwendeten Ausdrücke wird nachfolgend eingehend erläutert:
Unter einem "Impfstoff" versteht man ein Agens, das zur Stimulierung des Immunsystems eines Lebewesens verwendet wird, um auf diese Weise den Schutz vor einer künftigen Schädigung zu gewährleisten. Der Ausdruck "Immunisierung" bedeutet das Verfahren zur Induzierung eines fortgesetzt hohen Niveaus an Antikörpern und/oder einer Zellimmunreaktion, bei der die T- Lymphozyten das Pathogen entweder abtöten und/oder andere Zellen, z.B. Phagozyten; aktivieren, wie z.B. in einem Organismus, wo dies gegen ein Pathogen oder ein Antigen gerichtet ist, dem der Organismus zuvor ausgesetzt war. Obwohl der Ausdruck "Immunsystem" Reaktionen von Einzellern auf die Anwesenheit von Fremdkörpern, z.B. die Interferonproduktion, auch umfassen kann, ist er in der vorliegenden Anmeldung auf die anatomischen Merkmale und Mechanismen beschränkt, durch die ein mehrzelliger Organismus auf ein Antigenmaterial reagiert, das in die Zellen des Organismus oder seine extrazelluläre Flüssigkeit eindringt. Die auf diese Weise erzeugten Antikörper können zu einer beliebigen immunologischen Klasse gehören, wie z.B. zu den Immunogobulinen A, D, E, G oder M. Von besonderem Interesse sind Impfstoffe, welche die Produktion von Immunoglobulin A (IgA) stimulieren, da dies das vom sekretonschen System der Warmblüter erzeugte Hauptimmunoglobulin ist, obwohl die erfindungsgemäßen Impfstoffe nicht auf jene beschränkt sind, welche die IgA-Produktion stimulieren. So z.B. können Impfstoffe von der hier beschriebenen Art in ähnlicher Weise auch zur Erzeugung eines breiten Bereichs von anderen Immunreaktionen zusätzlich zur IgA-Bildung, wie z.B. der Zell- und Humoralimmunität verwendet werden. Die Immunreaktion auf Antigene ist gut erfoscht und wird häufig beschrieben. Eine übersicht über die Immunologie geben Barrett, James T., Textbook of Immunology, 4. Auflage, C.V. Mosby Co., St. Louis, MO (1983).
Unter einem "Wirbeltier" versteht man einen Vertreter des Unterstammes der Vertebrata, des wichtigsten Typs des Stammes der Chordata, der die Fische, Amphibien, Reptilien, Vögel und Säuger umfaßt, die alle durch eine gegliederte knöcherne bzw. knorpelige Wirbelsäule gekennzeichnet sind. Sämtliche Wirbeltiere haben ein funktionelles Immunsystem und reagieren auf Antigene durch Erzeugung von Antikörpern. Sämtliche Wirbeltiere sind somit befähigt, auf Impfstoffe zu reagieren. Obwohl Impfstoffe meist Säugern verabreicht werden, wie z.B. den Menschen oder Hunden (Tollwutvakzine), werden von der Erfindung auch Impfstoffe für Nutztiere darstellende Wirbeltiere aus anderen Klassen, wie z.B. Fische und Vögel, wenn sie von der oben beschriebenen Art sind, mitumfaßt.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung eines avirulenten Derivats einer pathogenen Mikrobe, die sich an das GALT oder BALT heftet, in dieses eindringt und dort als Träger des Genproduktes verbleibt, das zur Stimulierung der Antikörperreaktion auf ein Pathogen oder Allergen verwendet wird. Der Ausdruck "avirulent" bedeutet nicht, daß eine Mikrobe einer bestimmten Gattung oder Art überhaupt nicht als Pathogen zu fungieren vermag, sondern daß die konkrete Mikrobe in bezug auf das konkrete, zu behandelnde Tier avirulent ist. Die Mikrobe kann zu einer Gattung oder sogar zu einer Art gehören, die gewöhnlich pathogen ist, muß jedoch einem Stamm angehören, der avirulent ist. Unter dem Ausdruck "Pathogen" versteht man Mikroorganismen, welche Krankheiten hervorrufen oder die normalen physiologischen Funktionen zu beeinträchtigen vermögen. Avirulente Stämme sind nicht in der Lage, die ganze Gruppe von Kranheitssymptomen, die gewöhnlich mit ihrem virulenten pathogenen Gegenstück verbunden sind, zu induzieren. Unter dem Ausdruck "Mikroben" versteht man hier Bakterien, Protozoen und einzellige Pilze.
Die Techniken der übertragung von genetischem Material von einem ersten Organismus auf einen zweiten, der gewöhnlich mit dem ersten nicht sein genetisches Material austauscht, haben in letzter Zeit breite Anwendung gefunden und sind das Ergebnis der sich rasch ausbreitenden Technik der DNA-Rekombination. In der vorliegenden Anmeldung wird das genetische Material, das von einem Organismus in einen anderen auf eine Weise übertragen wird, daß die Reproduktion des zweiten Organismus Abkömmlinge entstehen läßt, welche dasselbe genetische Material enthalten, als "rekombinantes Gen" bezeichnet. Der Ausdruck "Gen" wird hier in seiner breitesten Bedeutung verwendet und steht für jede biologische Vererbungseinheit. Es ist nicht notwendig, daß das rekombinante Gen ein vollständiges Gen darstellt, wie es im elterlichen Organismus vorliegt, das zur Erzeugung oder Regulierung der Produktion eines Makromoleküls, wie z.B. eines funktionierenden Polypeptids, befähigt war. Erforderlich ist nur, daß das Gen als Matrize im Sinne einer Leitlinie bei der Erzeugung eines antigenen Produkts zu fungieren vermag. Das Produkt kann von einer Art sein, wie sie in genau dieser Form im elterlichen Organismus nicht vorgefunden wurde. Ein ein Polypeptidantigen mit 100 Aminosäureresten kodierendes funktionelles Gen kann z.B. als Teil auf eine Trägermikrobe so übertragen werden, daß durch den zellulären Mechanismus der Wirtszelle ein Peptid aus lediglich 75, ja sogar nur 10 Aminosäureresten erzeugt wird. Ist dieses Genprodukt jedoch ein Antigen, welches die Bildung von Antikörpern gegen ein ähnliches Antigen im elterlichen Organismus auslöst, liegt dieses Gen innerhalb des Bedeutungsumfangs des Ausdrucks "Gen", wie er erfindungsgemäß definiert wird. Andererseits kann, falls die Aminosäuresequenz eines konkreten Antigens oder Fragments davon bekann ist, das DNA-Fragment oder -Anabgon davon mit Hilfe automatisierter Gensynthesizer oder ähnlicher Vorrichtungen chemisch synthetisiert und diese DNA-Sequenz in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut werden. Am anderen Ende des Spektrums liegt ein langer DNA-Abschnitt, der mehrere Gen-Produkte kodiert, von denen eines oder alle Antigencharakter haben können. Ein Gen, wie es hier beansprucht wird, wird daher definiert als eine beliebige Vererbungseinheit, die zur Produktion eines Antigens befähigt ist. Das Gen kann dabei aus Chromosomen, Plasmiden oder Viren stammen.
Damit das Gen eine Immunreaktion wirksam auslöst, muß es exprimiert werden. Der Ausdruck "Expression eines Gens" bedeutet, daß die der Struktur des Gens (die Sequenz der DNA-Basen) innewohnende Information in ein physikalisches Produkt in Form eines RNA-Moleküls, eines Polypeptids oder eines anderen biologischen Moleküls durch den biochemischen Mechanismus der Zelle, in der das Gen lokalisiert ist, umgewandelt wird. Das auf diese Weise erzeugte biologische Molekül wird als Genprodukt bezeichnet. Der Ausdruck "Genprodukt", wie er hier verwendet wird, bedeutet ein beliebiges biologisches Produkt bzw. biologische Produkte, die erzeugt werden durch biochemische Reaktionen, die unter der Kontrolle eines Gens ablaufen. Das Genprodukt kann z.B. ein RNA-Molekül, ein Peptid oder ein unter der Kontrolle eines Enzyms erzeugtes Produkt oder ein anderes Molekül sein, welches das Ausgangsprodukt des Gens, d.h. ein Stoffwechselprodukt darstellt. So z.B. kann ein Gen zuerst die Synthese eines RNA-Moleküls steuern, das dann unter der Wirkung von Ribosomen in ein Enzym übersetzt wird, welches die Bildung von Glycanen im Medium, das die ursprüngliche Zelle, in der das Gen gefunden wurde, umgibt, steuert. Das RNA-Molekül, das Enzym und das Glycan fallen zur Gänze unter den Begriff "Genprodukte". Alle diese Genprodukte und viele andere derartige Genprodukte, wie z.B. Glycoproteine und Polysaccharide, wirken, wenn sie dem Immunsystem eines Tiers zugeführt werden, als Antigene. Für die Verwendung als Antigene in Impfstoffen sind Glycoproteine und Lipoproteine enthaltende Proteingenprodukte die bevorzugten Genprodukte.
Damit ein Impfstoff die Immunisierung eines Individuums wirksame hervorzurufen vermag, muß das Antigenmaterial auf eine Weise freigesetzt werden, daß das Immunsystem des geimpften Tiers zur Wirkung kommen kann. Deshalb muß der lebende avirulente Mikroorganismus dem Tier zugeführt werden. Zur Stimulierung einer bevorzugten Reaktion der GALT- oder BALT-Zellen, wie sie oben beschrieben wurde, wird die Einführung der Mikrobe bzw. des Genprodukts unmittelbar in den Darm bzw. den Bronchus bevorzugt, wie z.B. durch orale Verabreichung, Magenintubation oder in Form von Aerosolen, obwohl auch andere Verfahren zur Verabreichung des Impfstoffs, wie z.B. intravenöse, intramuskuläre, subkutane Injektion oder intramammäre, intrapeniale oder vaginale Verabreichung möglich sind.
Die Techniken der DNA-Rekombination sind heute ausreichend bekannt und so weit verbreitet, daß sie als Routinetechniken angesehen werden können. Allgemein gesprochen besteht das Verfahren in der Übertragung des genetischen Materials - oder insbesondere eines Teils davon - eines Organismus auf einen zweiten Organismus, so daß das übertragene genetische Material zum ständigen Bestandteil des genetischen Materials des Organismus wird, auf den es übertragen wird bzw. mit diesem Material rekombiniert wird. Dieses Verfahren besteht gewöhnlich darin, daß man zuerst aus dem Elternorganismus entweder aus einem Plasmid oder einem Elternchromosom ein kleines Stück DNA gewinnt. Ein Plasmid (auch als extrachromosomales Element bezeichnet) ist eine Vererbungseinheit, die vom Chromosom der Zelle physikalisch getrennt ist. Die DNA kann eine beliebige Größe aufweisen und wird häufig durch Einwirkung eines Restriktionsendonucleaseenzyms gewonnen, das die DNA-Moleküle an bestimmten Basenpaarsites aufspaltet. Nach der Ligierung mit Plasmid-, Phagen- oder Cosmidvektoren unter Bildung rekombinanter Moleküle können diese auf verschiedenem Wege, wie z.B. durch Transformation (Aufnahme der nackten DNA aus dem umgebenden Medium, was duch die Anwesenheit verschiedener chemischer Agentien, wie z.B. Calciumionen, künstlich induziert werden kann) auf eine Wirtszelle übertragen werden. Weitere Verfahren wie die Transduktion sind ebenfalls geeignet, wobei die rekombinante DNA in einem Phagen wie in einem transduzierenden Phagen oder in Cosmidvektoren gepackt wird. Ein weiteres Verfahren zur Einführung von Plasmid-DNA in Salmonella ist das der Elektroporation. Die Technik der Einführung von DNA in Bakterienzellen durch Elektroporation ist dem Fachmann bekannt, und eine dieser Techniken wird in den Beispielen beschrieben. Liegt die rekombinante DNA in der Trägerzelle einmal vor, kann sie weiterhin als getrenntes Stück (im allemeinen gilt dies für vollständige übertragene Plasmide) vorliegen oder sie kann in das Wirtszellenchromosom inseriert und mit dem Chromosom während der Zellteilung reproduziert werden.
Derivate von avirulenten Mikroben werden von der Erfindung auch mitumfaßt. Unter einem "Derivat" versteht man hier auf sexuellem oder asexuellem Wege gewonnene Nachkommen und Mutanten der avirulenten Stämme einschließlich Einbasen- oder Mehrbasensubstitutionen, Deletionen, Insertionen oder Inversionen, welche die Unfähigkeit für die Produktion von funktioneller Adenylatcyclase und AMP-Rezeptorprotein mit natürlich vorkommenden Virulenzplasmiden oder ohne diese aufrechterhalten. So z.B. tragen Stämme wie Chi4062 und Chi4064 die gyrA-Mutation, die Nalidixinsäurebeständigkeit verleiht, die hier als geeigneter Marker verwendet wird. Arzneimittelbeständigkeit ist jedoch keine erwünschte Eigenschaft bei als Impfstoffen zu verwendenden Stämmen. Die gyrA-Mutation kann somit leicht durch Transduktion des Nalidixinsäure-Empfindlichkeit verleihenden gyrA&spplus;-Gens auf die Stämme durch Selektion auf Vererbung eines eng verknüpften Tn10 und nachfolgende Entfernung des Tn10 durch Selektion auf Fusarsäureresistenz entfernt werden.
Die Dosierungen von Lebendimpfstoffen von rekombinanter oder nichtrekombinanter avirulenter Salmonella zur Auslösung einer Immunschutzreaktion hängen von der Antigenizität des Salmonella-Genprodukts oder vom geklonten rekombinanten Genprodukt ab und brauchen nur in einer Menge vorzuliegen, die für die Induzierung einer für die vorliegenden Impfstoffe typischen Immunreaktion ausreicht. Durch Routineversuche kann die erforderliche Menge leicht festgestellt werden. Übliche Anfangsdosierungen für die Impfstoffe können bei 1 x 10&sup7; bis 1 x 10¹¹ CFU je nach Größe und Alter des zu immunisierenden Individuums liegen. Die Verabreichung von Mehrfachdosierungen ist bei Bedarf zur Gewährleistung des erwünschten Schutzgrades an Immunität ebenfalls möglich.
Der pharmazeutische Träger, in dem der Impfstoff suspendiert oder gelöst ist, kann ein beliebiges Lösungsmittel oder ein Feststoff sein, oder er kann in einem Material eingekapselt sein, das für das beimpfte Tier nichttoxisch und mit dem Trägerorganismus bzw. dem antigen wirkenden Genprodukt verträglich ist. Geeignete pharmazeutische Träger sind flüssige Träger wie normale Kochsalzlösung und andere bei physiologischen Konzentrationen oder annähernd solchen Konzentrationen nichttoxische Salze und feste Träger, die beim Menschen nicht verwendet werden, wie z.B. Talk oder Saccharose sowie Futter für Nutztiere. Zur Verstärkung der Antigenizität können, wenn erwünscht, Adjuvantien zugesetzt werden. Bei der Verabreichung über die Bronchien wird der Impfstoff vorzugsweise in Form eines Aerosols gereicht.
Die Immunisierung mit einem aus einem Genprodukt gewonnenen Pathogen kann auch in Verbindung mit einer vorangehenden Immunisierung mit dem avirulenten Derivat eines pathogenen, als Träger wirkenden Mikroorganismus verwendet werden, um das von einem rekombinanten Gen aus einem pathogenen Mikroorganismus festgelegte Genprodukt zu exprimieren. Eine derartige parenterale Immunisierung kann als Booster zur Verstärkung der Expression der sekretorischen Immunreaktion dienen, sobald das sekretorische Immunsystem in bezug auf das aus dem pathogenen Organismus gewonnene Genprodukt durch Immunisierung mit der das aus dem pathogenen Mikroorganismus gewonnene Genprodukt exprimierenden Tragermikrobe stimuliert wurde, um die Lymphzellen der GALT- oder BALT-Gewebe ihrerseits zu stimulieren. Die verstärkte Reaktion ist bekannt als sekundäre Reaktion bzw. Booster- oder anamnestische Reaktion und führt zu einer Verlängerung des Immunschutzes des Wirts. Boosterimmunisierungen können viele Male unter Erzielung günstiger Ergebnisse wiederholt werden.

Hinterlegung der Stämme

Biologisch reine Kulturen der nachfolgend genannten Stämme wurden bei der Sammlung American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, hinterlegt. Die Festlegung der angeführten Zugangsnummer erfolgte nach erfolgreichem Test auf Lebensfähigkeit und nachdem die erforderlichen Gebühren bezahlt worden waren. Der Zugang zu den genannten Kulturen ist während des gesamten Erteilungsverfahrens bezüglich dieser Patentanmeldung für jeden möglich, der vom Präsidenten der Sammlung hierzu unter 37 CFR 1.14 und 35 USC 122 berechtigt wurde. Alle Einschränkungen betreffend die Zugänglichkeit dieser Kulturen für die Öffentlichkeit werden nach Erteilung des Patents aufgrund dieser Anmeldung unwiderruflich aufgehoben. Die angeführten Hinterlegungen werden für einen Zeitraum von 30 Jahren, beginnend mit dem Hinterlegungstag, bzw. für 5 Jahre nach der letzten Aufforderung auf Hinterlegung bzw. für die Laufzeit des Patents, welche Zeit auch immer länger sein mag, aufrechterhalten. Sollte eine Kultur ihre Lebensfähigkeit verlieren oder zufällig zerstört werden oder sollten Plasmide enthaltende Stämme ihr Plasmid verlieren, würde eine solche Kultur durch eine lebensfähige Kultur bzw. lebensfähige Kulturen mit derselben taxonomischen Beschreibung ersetzt werden.
Die obigen Stämme wurden zur Erleichterung des Arbeitens angeführt, sind jedoch für die Durchführung der Erfindung nicht unbedingt erforderlich.

Beispiele

Beispiel 1

Konstruktion von S.typhimurium δ-crp-δ-cya-Stamm Chi3985

Ein Wildtyp eines virulenten S.typhimurium-Stammes wurde nach den von Curtiss und Kelly (1987) beschriebenen Methoden modifiziert. Die Vorgangsweise bestand dabei in der Mobilisierung von Deletionen der crp- und cya-Gene, die isoliert und in S.typhimurium SL1344 Chi3339 gekennzeichnet worden waren, indem man das Transposon Tn10 in die Nähe der Deletion (zhb::Tn10, verknüpft mit crp und zid::Tn10, verknüpft mit cya) brachte und die verknüpften Merkmale in einen hochvirulenten S.typhimurium-Stamm Chi3761 unter Selektion auf Tetracyclinresistenz mit einem maltose-negativen Phänotyp transduzierte. Chi3761 wurde drei Tage nach der oralen Infektion eines einen Tag alten Kückens aus der Milz isoliert. Chi3761 hatte bei einen Tag alten Kücken einen oralen LD&sub5;&sub0;-Wert von 3 x 10³ CFU. Die Transduktion der Gendeletionen mit dem begleitenden Transposon, das Tetracyclinresistenz kodiert, wurde dadurch erleichert, daß man zuerst ein Lysat mit hohem Titer des Bacteriophagen P22HTint herstellte, der die δ-crp-11- zhb::Tn10- oder die δ-cya-12-zid::Tn10-Mutation in transduzierende Teilchen packte. Das erhaltene P22HTint-Lysat wurde dann zur Infizierung und Transduktion der genetischen Merkmale in andere Empfänger-Salmonella bei einer Multiplizität der Infektion von 0,3 verwendet. Das Phagen-Bakterien-Infektionsgemisch wurde 10 min bei 37ºC inkubiert, wonach 100 ul-Proben auf Mac- Conkey-Agar (Difco Laboratories, Detroit, MI) mit 1 % Maltose (Endkonzentration), suppiementiert mit 12,5 ug Tetracyclin/ml, verteilt wurden. Zur Transduktion des virulenten Stammes Chi3761 auf Mal&supmin; Tetr wurde der auf Chi3773 (δ-crp-11- zhb::Tn10) vermehrte Phage P22HTint verwendet. Nach ca. 18- stündiger Inkubierung bei 37ºC wurden die Transduktanten aufgenommen und auf denselben Medien gereinigt. Der erhaltene Stamm wurde mit Chi3828 bezeichnet und hat den Genotyp δ-crp-11- zhb::Tn10. Eine Kultur von Chi3828 wurde im Verhältnis 1:10 in gepufferter Salzlösung mit Gelatine (BSG) verdünnt, wonach 100 ul auf Fusarsäure enthaltende Medien (Maloy und Nunn, 1981) verteilt und ca. 36 Std. bei 37ºC inkubiert wurden. Die fusarsäureresistenten Kolonien wurden aufgenommen, auf denselben Medien gereinigt und auf den Verlust von Tn10 (Tetracyclinempfindlichkeit), P22HTint-Empfindlichkeit und Prototrophie geprüft. Der neue Stamm wurde mit Chi3954 bezeichnet und hat den Genotyp δ-crp-11-δ- [zhb::Tn10]. Eine Kultur von Chi3954 wurde dann mit dem auf Chi3670 vermehrten P22HTint transduziert, um das Plasmid pSD110 einzuführen, das das Wildtyp-crp&spplus;- Gen aus E.coli und Ampicillinresistenz aufweist. Die Selektion erfolgte an MacConkey-Agar + 1 % Maltose + 100 ug Ampicillin/ml. Eine ampicillinresistente Mal&spplus;-Kolonie wurde aufgenommen, auf denselben Medien gereinigt, auf P22-Empfindlichkeit geprüft, mit Chi3961 bezeichnet und hat den Genotyp δ-crp-11-δ- [zhb::Tn10] pSD110&spplus;. Eine Kultur von Chi3961 wurde dann mit dem auf Chi3712 vermehrten P22HTint transduziert, um die δ-cya-12- und zid::Tn10-Mutationen einzuführen. Die Selektion erfolgte an Macconkey-Agar + 1 % Maltose + 100 ug Ampicillin/ml + 12,5 ug Tetracyclin/ml. Eine ampicillin- und tetracyclinresistente MAL-Kolonie wurde aufgenommen, in denselben Medien gereinigt, auf P22-Empfindlichkeit geprüft, mit Chi3962 bezeichnet und hat den Genotyp δ-crp-11-δ-[zhb::Tn10]-pSD110&spplus;-δ-cya-12- zid::Tn10. Eine in L-Bouillon mit einem Gehalt von 100 ug Ampicillin/ml + 12,5 ug Tetracyclin/ml gezüchtete Kultur von Chi3962 wurde im Verhältnis 1:10 in BSG verdünnt. 100 ul-Proben wurden auf Fusarsäure enthaltende Medien verteilt und ca. 36 Std. bei 37ºC inkubiert. Fusarsäurerestistente Kolonien wurden aufgenommen, in denselben Medien gereinigt und auf den Verlust von Tn10 (Tetracyclinempfindlichkeit), P22HT-int-Empfindlichkeit und Prototrophie geprüft. Zwei von zehn ausgewählten Kolonien hatten ebenfalls das Plasmid pSD100&spplus; verloren und eine davon wurde als Chi3985 bezeichnet, die den Genotyp δ-crp-11-δ-[zhb::Tn10]-δ-cya-12-δ-[zid::Tn10]-δ-cya-12-δ- [zid: :Tn10] aufweist. Der Stamm Chi3985 kann von seinem Wildtypelter durch folgende Phänotypischen Merkmale unterschieden werden: Unvermögen, die C-Quellen Maltose, Mannit, Sorbit, Melibiose, Citrat und Glycerin zu vergären bzw. darauf zu gedeihen, und verminderte Motilität.

Beispiel 2

Bestimmung der vergleichenden Virulenz attenuierter Mutanten und Wildtyp-Salmonella-Stämme

Ermittelt wurde die Attenuierung der Virulenz von Wildtyp-Salmonella-Stämmen bei Hühnern durch Mutation in cya und/oder crp. Die Methode zur Erzeugung des attenuierten Stammes war der in Beispiel 1 beschriebenen analog, nur wurde der Wildtyp- Stamm in diesem Beispiel durch die nachfolgend angegebenen Stämme ersetzt. Die Wildtyp-Stämme waren S.typhimurium Chi3306, Chi3663, Chi3761 und Chi3739 sowie S.enteritidis Chi3700. Chi3761 wurde aus der Milz eines Kückens, das drei Tage zuvor mit Chi3663, einem hochvirulenten S.typhimurium- Stamm oral beimpft worden war, der seinerseits aus einem infizierten Pferd isoliert worden war, isoliert. Chi3739 stammte aus 386ºC, der von Robert C. Clarke, University of Guelph, bezogen wurde.
Die Bakterien für die Beimfpung wurden als Übernacht-Kulturen bei 37ºC in L-Bouillon gezüchtet. Diese wurden in vorgewärmte L-Bouillon 1.20 verdünnt und bei 37ºC zwei bis drei Stunden bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm von ca. 0.8 bis 1,0 belüftet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 8.000 x g während 10 min bei Raumtemperatur 20fach konzentriert, wonach in gepufferter Salzlösung + Gelatine (BSG) suspendiert wurde. Befruchtete Eier von Hennen der Rasse Weiße Leghorn (SPAFAS, Roianoke, IL) wurden in Brutkästen vom Typ Humidaire incubator-hatcher ausgebrütet. Den ausgebrüteten Kücken wurden über die Mikropipettenspitze vor der Fütterung und der Wassergabe 100 ul einer entsprechenden Salmonella-Verdünnung verabreicht. Die Fütterung und die Wassergabe an die beimpften Kükken erfolgte 30 min nach der Infizierung. Die Kücken wurden täglich auf Anzeichen einer Erkrankung (z.B. Diarrhoe, verminderte Entwicklung, Appetitlosigkeit, Gewichtsverlust, Reaktionslosigkeit und Verenden) geprüft. Die infizierten Kücken wurden dann in modifizierte Meerschweinchenkäfige mit Filterhaubenabdeckung, Drahtgeflechtboden und thermostatisch geregelten Temperaturen in einen Tierhaltungsraum mit dem Sicherheitsgrad P2 gegeben. Alle Stoffe, die aus diesem Raum gebracht wurden, wurden vor ihrer weiteren Behandlung und vor dem Spülen der Gefäße autoklaviert. Die Ergebnisse der Untersuchung, die in Tabelle 1 zusammengefaßt sind, zeigen, daß eine große Zahl unterschiedlicher δ-cya-δ-crp-Mutanten von S.typhimurium und S.enteritidis bei 1-Tage-alten Kücken avirulent ist. Tabelle 1 Virulenz des Salmonella-Wildtyps und attenuierter Mutanten bei oral beimpften 1-Tag-alten Kücken

Beispiel 3

Konstruktion des phoP::Tn10-S.typhimurium-Stammes Chi4126

Das phoP-Gen von S.typhimurium steuert wenigstens eine der unspezifischen sauren Phosphatasen und mehrere andere Gene, von denen eines oder mehrere für die Virulenz von Bedeutung sind. Es wurde ein phoP::Tn10-Stamm konstruiert:
Chi3688 ist ein S.typhimurium-SL1344-Stamm mit einer phoP12- Punktmutation und einem purB::Tn10, das zu 90 % mit der Punktmutation kotransduzierbar ist. Mit diesem Stamm wurde ein P22HTint-Lysat hergestellt, wonach der S.typhimurium-LT2-Z- Stamm Chi3000 mit dem Lysat auf Tetracyclinresistenz transduziert wurde. Die entsprechenden Transduktanten wurden nach folgenden Methoden auf PhoP&spplus; geprüft. Getestet wurde auf die Fähigkeit, 5-Brom-4-chlor-3-indoyl-phosphat (X-P) zu spalten; weiße Kolonien zeigten dabei auf X-P-Platten eine PhoP&supmin;-Mutante an. Außerdem wurden X-P-positive Kolonien auf die Produktion unspezifischer saurer Phosphatasen nach der Methode von Galan und Curtiss (1989) getestet; das Fehlen orangefarbener Kolonien zeigte dabei die Abwesenheit dieser Phosphatasen wie z.B. PhoP&supmin; an. Ein als Chi4123 bezeichneter PhoP&spplus;-purB:: Tn10-Transduktant, der außerdem auf P22-Empfindlichkeit und das Vermögen, auf einem lediglich mit Purinen supplementierten minimalen Medium zu gedeihen, geprüft. Durch Selektion auf Fusarsäureresistenz wie z.B. Tetracyclinempfindlichkeit und PhoP&spplus; wurde eine Deletions-(δ)-Mutation erzeugt und als Chi4124 bezeichnet. Die Transduktion von Chi4124 mit auf einer S.typhimurium Tn10-Bilbiothek vermehrtem P22HTint bei gleichzeitiger Selektion auf PurB&spplus; auf einem Tetracyclin enthaltenden Minimalmedium selektierte PurB&spplus;-Transduktanten mit eng verknüpften Tn10-Insertionen. Diese wurden dann auf X-P-Minimalmedium auf PhoP&supmin; und auf P22-Empfindlichkeit getestet, um den phoP::Tn10-Stamm Chi4125 zu ergeben. Ein P22HTint-Lysat wurde auf Chi4125 hergestellt und der virulente S.typhimurium-Wildtyp-Stamm Chi3761 wurde mit dem Lysat auf Tetracyclinempfindlichkeit und PhoP&supmin; transduziert. Dieser PhoP::Tn10-Stamm wurde als Chi4126 bezeichnet. Deletions-(δ)-Mutationen konnten mit diesem Stamm durch Selektion auf Fusarsäureresistenz hergestellt werden.

Beispiel 4

Einführung einer galE-Mutation in eine δ-cya- δ-cro-Nutante von S.typhimurium

Der generalisierte transduzierende Phage P22HTint wurde auf Chi3630 (Tn10 verknüpft mit gale) vermehrt und zur Transduktion des δ-cya-δ-crp-S.typhimurium-Stammes Chi3985 verwendet; die Selektion auf Eingliederung des Tn10 erfolgte anhand der Tetracyclinrestistenz. Die Anwesenheit der galE496-Mutation wurde anhand der Empfindlichkeit der Zellen gegenüber hohen Galactosekonzentrationen (eine Eigenschaft von Stämmen mit galE-Mutationen) und der Resistenz des Bakteriophagen P22 bei Züchtung auf einem Glucose enthaltenden Medium (ein Phänotyp, der mit der Unfähigkeit zur Produktion von LPS verbunden ist) überprüft. Der erhaltene Stamm Chi4136 wurde in einem Medium mit 0,05 % Galactose gezüchtet, um eine normale LPS-Synthese zu ermöglichen, und dann mit einem auf dem prototrophen S.typhimurium-LT-2-Stamm Chi3000 vermehrten P22HTint-Lysat transduziert. Das Transduktionsgemisch wurde dann auf 0,5 % Glucose enthaltendem Minimalagar plattiert, um NadA&spplus; Transduktanten zu selektieren. Der erhaltene Stamm Chi4137 wurde auf Galactoseempfindlichkeit, Rauhigkeit und P22-Resistenz bei Züchtung in Abwesenheit von Galactose überprüft. Er war ebenfalls glatt und P22-empfindlich bei Züchtung in einem Medium mit 0,05 % Galactose und besaß immer noch δ-cya-δ-crp- Mutationen.

Beispiel 5

Einführung einer pmi-Mutation in eine δ-cya- δ-crp-Mutante von S.typhimurium

Der Chi3985-pmi-Derivatstamm wurde durch Transduktion von Chi3985 mit P22HTint, vermehrt auf Chi4149 (Tn10 verknüpft mit pmi) konstruiert. Es wurden Transduktanten auf Tetracyclinresistenz auf MacConkey-Agar, das 1 % Mannose enthielt, selektiert, um auf pmi-Kotransduktanten, die zur Vergärung von Mannose unfähig sind, hin auszuwählen. Der erhaltene Stamm Chi4151 wurde mit auf Chi3000 vermehrtem P22HTint unter Selektion auf ein fusarsäureresistentes und tetracyclinempfindliches Derivat transduziert. Beim erhaltenen Stamm Chi4152 wurde festgestellt, daß er eine pmi-Mutation aufweist, tetracyclinempfindlich ist und weiterhin die δ-cya-δ-crp-Mutationen besitzt.

Beispiel 6

Einführung einer fur-Mutation in eine δ-cya- δ-crp-Mutante von S.typhimurium

Die fur-Mutation in Chi3657 kann durch Kotransduktion mit einem mit dem fur-Gen eng verknüpften Tn10 in andere Stämme eingeführt werden. Chi3627 besitzt die nadA540::Tn10-Insertion, und das auf Chi3627 vermehrte P22HTint wurde zur Transduktion von Chi3657 auf Tetracyclinresistenz transduziert, um den Stamm Chi4130 zu ergeben. Die Kotransduktionsfrequenz zwischen fur und diesem Tn10 beträgt ca. 10 %. Eine Tn10-Insertion auf der anderen Seite des fur-Gens liegt in Chi3010 vor. Die Vermehrung von P22HTint auf diesem Stamm und die Transduktion von Chi3657 ergaben den Stamm Chi4131, der links von fur ein Tn10 besitzt und ebenso mit fur bei einer Frequenz von 10 % kotransduzierbar ist. P22HTint kann sowohl auf Chi4130 als auch auf Chi4131 vermehrt und zur Transduktion eines beliebigen S.typhimurium-Impfstoffstammes auf Tetracyclinresistenz-fur verwendet und das inserierte Tn10 kann entweder durch Transduktion oder durch Selektion auf Fusarsäureresistenz entfernt werden.
Eine alternative Methode zur Erzeugung von fur-Mutationen durch Inaktivierung des fur-Gens durch Insertion von Tn10 besteht in der Anwendung einer verwandten Vorgehensweise. Ein fusarsäureresistentes Derivat von Chi3627 wurde selektiert, um das Tn10 zu entfernen und die flankierenden Sequenzen im nadA- Gen abzuspalten. Der Stamm Chi4132 besitzt eine δ-nadA-Mutation. Die Transduktion von Chi4132 mit auf einer S.typhimurium Tn10-Bibliothek vermehrtem P22HTint bei gleichzeitiger Selektion auf NadA&spplus; auf einem 0,5 % Glucose und Tetracyclin enthaltenden Ninimalagar selektierte Nad-Transduktanten mit eng verknüpften Tn10-Insertionen. In bestimmten Fällen wurde das Tn10 in das verknüpfte fur-Gen inseriert, wodurch dieses inaktiviert wurde.
Der fur-Phänotyp von S.typhimurium-fur-Mutanten läßt sich anhand des Arnow-Tests /Arnow (1937)/ nachweisen. Dabei werden die Zellen in einem Mineralsalzminimalmedium mit 10 uM FeCl&sub3; und 0,5 % Glucose gezüchtet. Die Zellen werden dann sedimentiert, wonach 0,5 ml des flüssigen Kulturüberstandes nacheinander (unter Mischen zwischen den Zugaben) folgende Komponenten zugegeben werden: 0,1 ml 5 M HCl, 0,5 ml Molybdännitratreagens (hergestellt durch Zugabe von 1 g Natriummolybdat zu 1 g Natriumnitrat in 5 ml entionisiertem destilliertem Wasser) sowie 0,1 ml 10 N NaOH. Die konstitutive Siderophorsynthese durch die fur-Mutanten wird dann durch Ablesen der Absorption bei 515 nm quantifiziert.

Beispiel 7

Nachweis der LPS-Synthese oder des LPS-Verlustes bei in Kultur gezüchteten galE- oder pmi-Mutantenstämmen von S.typhimurium

Mehrere Stämme von S.typhimurium werden in Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen bei einer Generationszeit von drei bis vier Stunden gezüchtet. Die CHO-Zellen werden in mit 10 % (V/V) fötalem Kalbsserum (FCS), Penicillin (100U/ml) und Streptomycm (100 ug/ml) supplementiertern Eagle's minimal essential medium gezüchtet und mit Bakterien in Hank's balanced salt solution (HBSS) infiziert. Diese Medien enthalten keine Galactose bzw. Mannose. Auf diese Weise mußte die für die LPS-Synthese von den galE- oder pmi-Mutanten benötigte Galactose bzw. Mannose durch endogene Synthese aus diesen Substraten durch die CHO-Zellen gebildet werden.
Die Chi4137-(galE)- bzw. Chi4152-(pmi)-Derivatmutanten werden in L-Bouillon gezüchtet, die glucosefrei ist, jedoch 0,05 % Galactose oder 0,5 % Mannose und 300 mM NaCl enthält. Dieses Medium verstärkt die Expression von S.typhimurium-inv-Genen, deren Steuerung von der Osmolarität abhängt. Die Infektion der CHO-Zell-Monoschichten erfolgt durch Beimfpung mit S.typhimurium-Zellen bei einer Multiplizität der Infektion von 10 Bakterien pro Zelle. Nach 2 Stunden in HBSS werden die Monoschichten darin gewaschen und dann mit Eagle's minimum essential medium (MEM), das Gentamicin (100 ug/ml) enthält, inkubiert, um extrazelluläre Bakterin zu entfernen. Unter Verwendung des Wildtypstamms Chi3761 und von pmi- und galE-Derivaten von Chi3761 werden Kontrolluntersuchungen durchgeführt. In bestimmten Abständen nach dem Anheften und der Invasion werden Proben der CHO-Zellen entnommen. Die Zellen werden durch Zugabe von 0,1 %-igem Natriumdesoxycholat in PBS lysiert und dann eisgekühlt, wonach man die S.typhimurium-Zellen nach den von Finlay et al. (1989) beschriebenen Verfahren abtrennt. Die abgetrennten Zellen werden gezählt und es wird die Proteinmenge ermittelt. Die LPS-Fraktionen werden mit Hilfe des Limulus- Tests /Tanamoto und Homma (1982)/ und durch Densitometrie von mit Silber angefärbten LPS-Fraktionen nach Gelelektrophorese /Tsai und Frasch (1983)/ quantifiziert. Western-Blotting ist auch ein sehr empfindlicher Test, mit dessen Hilfe die unterschiedlichen Geschwindigkeiten für die Synthese des LPS-Kerns einerseits und der LPS-Seitenketten andererseits ermittelt werden können.
Sind Galactose und Mannose die beschränkenden Faktoren in den CHO-Zellen, ist die Zunahme der Gesamtzahl an LPS-Seitenketten nur gering, wohingegen ein erhebliches Ansteigen der Mengen an S.typhimurium-Protein und LPS-Kern (auf ca. die 8- bis ca. 32- fache Menge in 24 Stunden) zu erwarten ist.

Beispiel 8

Einführung der Kreuzschutzimmunität durch galE- und pmi- Mutanten gegenüber der Besiedelung durch homologe und heterologe Salmonella-Serotypen

Die Impf stoffstämme, die miteinander verglichen werden, sind Chi3985, der δ-cya-δ-crp-Mutationen aufweist, und Derivate von Chi3985, die eine pmi-Mutation (Chi4152) oder eine galE-Mutation (Chi4137) besitzen. Einen und drei Tage alte Kücken werden mit diesen Stämmen immunisiert und zwei sowie vier Wochen danach mit einem Derivat von Chi3761, das eine Rifampicinresistenzmutation (rpoB1911) aufweist, oder mit einem Derivat des Wildtypstammes S.enteritidis (Phagentyp 4), das heißt mit Chi3850, das ebenfalls die rpoB1911-Allele aufweist, kontrollinfiziert. Die rpoB1911-Mutation ist ohne Wirkung auf die Virulenz von S.typhimurium oder S.enteritidis. Da Chi3761 und seine Derivate mit der galE- und der pmi-Mutation antibiotikaempfindlich sind, wird durch Transduktion mit dem auf Chi3456 vermehrten Bacteriophagen P22HTint ein Tnmini-tet-Marker in das Virulenzplasmid inseriert [s. Gulig und Curtiss (1987)] bezüglich der Methode der Insertion des Markers in das Plasmid) . Dieser Marker ermöglicht die unterschiedliche Quantifizierung des Impfstoffstammes einerseits und der Kontrollinfektionsstämme andererseits im Kot oder bei der Nekropsie.
Einen und drei Tage alte Kücken werden mit 1 x 10&sup9; CFU Chi3761 oder Chi4152 (gezüchtet in 0,5 % Mannose enthaltender L-Bouillon) oder Chi4137 (gezüchtet in 0,05 % Galactose enthaltender L-Bouillon) peroral immunisiert. Zwei und vier Wochen nach der peroralen Immunisierung werden Gruppen zu je 5 Kücken peroral mit 1 x 10² bzw. 1 x 10³ bzw. 1 x 10&sup4; rifampicinresistentem (Rifr) Derivat von S.typhimurium, d.h. Chi3761, bzw. mit Rifr- Derivaten von S.enteritidis, d.h. Chi3850 peroral beimpft. Kotproben der beimpften Kücken werden täglich gesammelt und die gemessenen aliquoten Anteile werden zur Quantifizierung des in der Probe enthaltenen Kontrollinfektionsstammes von S.typhimurium oder S.enteritidis verwendet. Die Quantifizierung erfolgt durch Plattierung auf MacConkey-Agar mit 1 %-iger (Endkonzentration) Laktose und 50 ug Rifampicin pro ml.
Sind die Titer zu niedrig, um auf diese Weise den Nachweis führen zu können, kann die An- oder Abwesenheit des Kontrollinfektionsstammes durch Bebrüten über Nacht bei 37ºC eines aliquoten Anteils des Stuhls in Selenite-Bouillon [Fa. Liefson (1936)], die 50ug Rifampicin/ml enthält, nachgewiesen werden, wonach auf Rifr-Chi3761- oder -Chi3850-Zellen geprüft wird. Die Anwesenheit des Impfstoffstammes wird durch Plattierung auf Difco MacConkey-Agar (Difco Laboratories, Detroit, MI) mit 1 % Maltose und 12,5 ug/ml Tetracyclin nachgewiesen. Nichtimmunisierte Kücken werden als Kontrolltiere zur Ermittlung der Minimaltiter von Rifr-Chi3761 und -Chi3850 zur Auslösung der Besiedelung, persistenten Infektion und Streuung verwendet.
Zwei bzw. vier Wochen nach der Kontrollinfektion mit den Wildtypstämmen werden die Kücken getötet und die Titer der Wildtypkontrollinfektions- und Impfstoffstämme in der Milz und der Inhalt von Dünn-, Blind- und Dickdarm durch Plattierung ahquoter Anteile der Proben auf MacConkey-Agar mit 1 % Lactose und Rifampicin bzw. Macconkey-Agar mit 1 % Maltose und Tetracyclin quantifiziert. Der Rifr-Kontrollinfektionsstamm, der Mal&spplus; Tcs Lac&supmin; Rifr ist, gedeiht lediglich auf dem ersten Medium, während die Impfstoffstämme die Mal&supmin; Tcr Lac&spplus; Rifs sind, lediglich auf dem zweiten Medium gedeihen.

Beispiel 9

Wirkung der konstitutiven Expression eisengesteuerter OMP's durch S.tymphimurium auf das Wachstum in Säugerzellen

Derivate von S.typhimurium-Chi3761 und -Chi3905, welche die fur::Tn10-Mutation enthalten, werden für diese Untersuchungen verwendet. Als Kontrollen werden die Chi3761- und Chi3985-Elternzellen verwendet. Die CHO-Zellen dienen als Modell für Vertebraten bei der Messung des Invasionsvermögens und der Lebensfähigkeit des fur-Mutantenstammes. Das Wachstum der CHO- Zellen ist wie oben beschrieben. S.typhimurium wird in L- Bouillon mit 0,1 % Glucose und 300 mM NaCl gezüchtet. Nach Sedimentation und erneuter Suspendierung in abgepufferter Salzlösung werden die Zellen für das Anheften und die Invasion der CHO-Zellen in der Kultur, wie oben beschrieben, verwendet. Von Zeit zu Zeit werden die Zellen erneut suspendiert und lysiert und es wird die Zahl der intrazellulären Zellen von S.typhimurium ermittelt.

Beispiel 10

Wirkung der konstitutiven Exoression eisengesteuerter OMP's durch S.tymphimurium auf die Virulenz bei Kücken

Der Chi3761-fur::Tn10-Stamm und sein Chi3761-Elternstamm werden, wie oben beschrieben, in L-Bouillon mit 0,1 % Glucose und 300 mM NaCl gezüchtet. Einen Tag alte Kücken werden oral mit 100 ul Bakteriensuspension in gepufferter Salzlösung beimpft. Zur Beimpfung von Gruppen fünf Tage alter Kücken mit 1 x 10³ CFU, 5 x 10³ CFU bzw. 2,5 x 10&sup4; CFU werden Mikropipetten verwendet. Die toten Kücken werden markiert, um festzustellen, ob sie an durch S.typhimurium verursachte Septikämie verendet sind.
Drei bis vier Wochen nach der Kontrollinfektion werden die Sera der überlebenden Kücken gesammelt, so daß die Titer der gegen eisengesteuerte Proteine gerichteten Antikörper festgestellt werden können. Die Antikörpertitration erfolgt nach der ELISA-Methode und/oder durch Western-Blot-Analyse auf die durch einen fur-S.typhimurium-Stamm produzierten Proteine. Quantifiziert werden kann außerdem die Reaktionsfähigkeit der Seren mit äußeren Membranproteinfraktionen des 078:K80-E.coli- Stammes Chi7122, der auf Eisen und unter Begrenzung der Eisenmenge gezüchtet wurde. Der Grad der Reaktionsfähigkeit auf Antikörper in den Western-Blots wird mit Hilfe eines Densometers vom Typ Molecular Dynamics Densitometer quantifiziert.

Beispiel 11

Induktion der Kreuzschutzimmunität durch fur::Tn10-Mutanten gegenüber der Besiedelung durch homologe und heterologe Salmonella-Serotypen

Diese Untersuchungen ähnelten denen, die mit galE- und pmi- Mutanten durchgeführt wurden, nur trug der Derivatstamm eine fur::Tn10-Mutation, welche die konstitutive Expression von eisengesteuerten OMP's ermöglicht. Die fur::Tn10-Mutation wird in die Eltemstämme, die sowohl virulent als auch avirulent sind, durch P22HTint-Transduktion eingeführt. Die Besiedelung des Wildtyps Rifr von S.typhimurium und S.enteritidis in den einzelnen Gruppen immunisierter Kücken wird, wie oben beschrieben, durch die Quantifizierung der lebensfähigen Salmonellazellen in Kotproben bestimmt.
Geprüft wurden die Induktion und die Kreuzschutzreaktonsfähigkeit der eisengesteuerten OMP's von E.coli und Salmonella. Figur 4 zeigt die Ergebnisse des Western-Immunoblotting von Ganzbakterienextrakten an 7,5 % SDS-Polyacrylamidgel, transferiert auf Nitrocellulose und sondiert mit Serum aus einem Kaninchen, das mit dem durch Formalin abgetöteten 078:K80-E. coli-Stamm Chi7122 immunisiert worden war, der seinerseits in tryptischer Sojabouillon gezüchtet worden war. Die einzelnen Banden bedeuten dabei folgendes: Bande a - vorgefärbte Molekulargewichtsmarker, Bande b - in tryptischer Sojabouillon mit hohem Eisengehalt (10 uM FeCl&sub3;) gezüchteter Chi7122, Bande c - in tryptischer Sojabouillon mit niedrigem Eisengehalt (300 uM α,α'-Dipyridyl) gezüchteter Chi7122, Bande d - in tryptischer Sojabouillon mit hohem Eisengehalt gezüchteter S.typhimurium- Stamm Chi4064 und Bande e - in tryptischer Sojabouillon mit niedrigem Eisengehalt gezüchteter Chi4064.
Figur 5 zeigt die Ergebnisse eines Western-Immunoblots von Ganzbakterienextrakten an 7,5 % SDS-Polyacrylamidgel, transferiert auf Nitrocellulose und sondiert mit einem Kaninchenserum aus einem Kaninchen, das zweimal mit einem Außenmembranpräparat aus dem 078:K80-E.coli-Stamm Chi7122 immunisiert wor den war, der seinerseits in einer tryptischen Sojabouillon mit niedrigem Eisengehalt (300 uM α,α'-Dipyridyl) zur Expression eisengesteuerter OMP's gezüthtet worden war. Die einzelnen Banden bedeuten dabei folgendes: Bande a - vorgefärbte Molekulargewichtsmarker, Bande b - in tryptischer Sojabouillon mit hohem Eisengehalt gezüchteter Chi7122, Bande c - in tryptischer Sojabouillon mit niedrigem Eisengehalt gezüchteter Chi7122, Bande d - in tryptischer Sojabouillon mit hohem Eisengehalt gezüchteter S.typhimurium-RBLB, ein fur-Mutant, und Bande e - in tryptischer Sojabouillon mit niedrigem Eisengehalt gezüchteter RBLB, Bande f - ein in tryptischer Sojabouillon mit hohem Eisengehalt gezüchteter S.typhimurium LT-2 Chi3000 und Bande g - ein in tryptischer Sojabouillon mit niedrigem Eisengehalt gezüchteter Chi3000. Die Pfeile markieren die Position der in den Banden c, d, e und g zu sehenden eisengesteuerten OMP's im Gel.

Beispiel 12

Orale Immunisierung von Kücken mit einem δ-cva-δ-crp- S.typhimurium-Stamm: Schutzwirkung gegen die Besiedelung durch einen virulenten Wildtyp-S.typhimurium-Stamm

Bei dieser Untersuchung werden die Immunisierungs- und Kontrollinfektonsstämme bis zur log-Phase gezüchtet, sedimentiert und in gepufferter Kochsalzlösung mit Gelatine suspendiert. Die orale Beimpfung erfolgt mit 100 ul-Proben von S.typhimurium-Stämmen.
Drei Tage alte Kücken werden mit 1 x 10&sup9; Zellen vom S.typhimurium-Stamm Chi3985 immunisiert, der eine δ-cya-δ-crp-Mutante ist. Im Alter von fünf Wochen werden sowohl die immunisierten als auch die nicht immunisierten Kücken oral mit 1 x 10&sup6; Zellen des virulenten Stammes Chi3761 kontrollinfiziert. Die Titer der abgeschiedenen Zellen werden durch Plattierung auf Brilliant Green Agar (ermöglicht den Nachweis bei 1 x 10²/cm³) quantifiziert. Das Fehlen einer Streuung wird durch die Unfähigkeit angezeigt, Chi3761-Zellen durch Selenitbouillon-Anreicherung nachzuweisen. Die Ergebnisse, die in Tabelle 2 zusammengefaßt sind, zeigen, daß die Immunisierung mit dem δ,cya-δ- crp-Impfstoffstamm die anfängliche Besiedelung sowie die Dauer der Persistenz des invasiven virulenten Kontrollinfizierungstammes erheblich vermindert. Tabelle 2 Orale Immunisierung von Kücken mit einem δ-cya-δcrp- S.typhimurium-Stamm zum Schutz gegen die Besiedelung durch einen virulenten Wildtyp-S.typhimurium-Stamm

Beispiel 13

Kreuzschutzimmunität gegen virulente E. coli, induziert durch einen phoP::Tn10-Stamm von S.typhimurium

Einen Tag alte Kücken werden oral mit dem S.typhimurium-Stamm Chi4126, der ein phoP::Tn10-Mutantenstamm ist, beimpft. Zwei Wochen später werden die überlebenden Kücken mit dem virulenten 078:K80-E.coli-Stamm Chi7122 kontrollinfiziert. Die Kontrollinfektion erfolgt durch Injektion von 7,3 x 10&sup5; CFU in den rechten kaudalen Alveolarsack. Der Wildtypelter von Chi4126 zeigt einen oralen LD&sub5;&sub0;-Wert von 3 x 10³-CFU bei einen Tag alten Kücken. Der LD&sub5;&sub0;-Wert von Chi7122 bei zwei Wochen alten Kücken beträgt 5 x 10&sup4; CFU. Die Ergebnisse der Untersuchung sind in Tabelle 3 zusammengefaßt und zeigen die relative Avirulenz des phoP::Tn10-S.typhimurium-Stamms und auch die Tatsache, daß die Immunisierung mit diesem Stamm gegen eine Infektion durch virulente E.coli zu schützen vermag. Tabelle 3 Avirulenz einer oral verabreichten phoP::Tn10-S.typhimurium- Mutante und Induktion der Kreuzschutzimmunität gegenüber der Kontrollinfektion mit virulenter E.coli

Beispiel 14

Schutz durch orale Immunisierung mit S.typhimurium- δ-cya-δ-crp-Stämmen gegenüber der Kontrollinfektion mit virulenter 078:K80-E.coli

Die beiden δ-cya-δ-crp-S.typhimurium-Stämme Chi4064 und Chi3985, die sich bei Kücken als avirulent erwiesen, werden zur oralen Immunisierung getrennter Gruppen von 1 Tage alten Kücken mit 10&sup9; Bakterien verwendet Die immunisierten Kücken und die Kontrollgruppen werden mit dem E.coli-078:K80:H9-Stamm Chi7122, der Alveolarsacculitis, Pneumonie und Septikämie verursacht und bei 2 Wochen alten Kücken einen LD&sub5;&sub0;-Wert von 4 x 10&sup4; CFU und bei 4 Wochen alten einen LD&sub5;&sub0;-Wert von 7 x 10&sup5; CFU aufweist, kontrollinfiziert. Die Kontrollinfektion erfolgte durch Injektion von E.coli in den rechten kaudalen Alveolarsack.
Die in Tabelle 4 zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß zwei Wochen nach der Immunisierung mit beiden Stämmen die Kücken gegen 10X bis 100X des LD&sub5;&sub0; geschützt waren. Vier Wochen nach der Immunisierung waren die Kücken vor bis zu 100X des LD&sub5; geschützt. Circa die Hälfte der nichtimmuniserten Kontrollkükken überlebten die Kontrollinfektion mit 1X LD&sub5;&sub0;. Keines der Kontrollkücken überlebte jedoch höhere Kontrollinfektionsdosen. Der LD&sub5;&sub0;-Wert für Chi7122, mit dem der kaudale Alveolarsack beimpft wurde, beträgt 4 x 10&sup4; CFU bei zwei Wochen alten Kücken bzw. 7 x 10&sup4; CFU bei vier Wochen alten Kücken. In der Tabelle bedeutet das Symbol (*), daß die Kücken im Alter von drei Tagen oral immunisiert wurden. Tabelle 4 Schutz von Kücken durch orale Immunisierung mit S.typhimurium- δ-cya-δ-crp-Impfstoffstämmen gegenüber der Kontrollinfektion mit virulenter E.coli
Eine Stunde nach der Beimpfung des Alveolarsackes ist Chi7122 im Blut nachweisbar. Zur Feststellung, ob die Immunisierung 1 Tag alter Kücken mit dem Impfstoffstamm δ-cya-δ-crp-S.typhimunum Chi3985 das Vermögen von E.coli, in das Kreislaufsystem einzudringen und/oder zu überleben, vermindert, wurden Untersuchungen an 1 Tage alten Kücken, die mit 6,4 x 10&sup9; CFU S.typhimurium Chi3985 peroral immunisiert worden waren (die Kontrollkücken waren nicht immunisiert), durchgeführt. Zwei Wochen später wurden beide Gruppen mit 10 LD&sub5;&sub0;-Werten des virulenten E.coli-Stammes Chi7122 durch Injektion in den kaudalen Alveolarsack kontrollinfiziert. Zu jedem Zeitpunkt wurden 100 ul Blut durch Venenpunktur in die Flügelvene entnommen und die Bakterienzahl festgestellt. Die Ergebnisse in Tabelle 5 zeigen, daß die Immunisierung 1 Tage alter Kücken mit Chi3985 zu einer ausgeprägten Verminderung der Bakterämie führt und bei zwei Wochen später erfolgender Kontrollinfektion Septikämie verhindert. In der Tabelle bedeutet das Symbol (b), daß zwei Kücken vor dem vierten Tag verendeten; die Durchschnittszahl gilt für die übrigen beiden Kücken. Tabelle 5 Durchschnittszahl an E.coli im Blut in Abhängigkeit von der Zeit nach der Kontrollinfektion des kaudalen Alveolarsackes mit virulentem Chi7122 bei immunisierten und nichtimmunisierten Kücken
Der Impfstoffstamm S.typhimurium Chi4062 ist fähig, eine rasche Produktion aktivierter Phagozyten im Bereich der Atemwege auszulösen und auf diese Weise ein unspezifisches Mittel für die Resistenz gegen Infektionen durch E.coli unmittelbar nach der Immunisierung bereitzustellen. Das überleben auf die Kontrollinfektion des kaudalen Alveolarsackes mit E.coli Chi7122 hin zwei bis vier Wochen nach der oralen Immunisierung mit Chi4064 oder Chi3985 beruht vermutlich auf einem anderen Mechanismus. Um festzustellen, worauf die Fähigkeit von Impfstoffstämmen von S.typhimurium, Kreuzschutzimmunität gegen verschiedene Arten von Enterobacteriaceae zu induzieren, beruht, wurden Proteinantigene von E.coli und Salmonella auf SDS-Gele aufgebracht und mit verschiedenen präimmunen, absorbierten und nichtabsorbierten Antisera gegen E.coli Chi7122, die in Kaninchen erzeugt wurden, und gegen S.typhimurium Chi3306 (der Elternstamm zu Chi4064), der in Ratten erzeugt wurde, umgesetzt. Die Ergebnisse sind in Figur 2 dargestellt. Diese zeigt die Ergebnisse des Western-Immunoblotting von Ganzbakterienextrakten an 7,5 % SDS-Polyacrylamidgel, transferiert auf Nitrocellulose und sondiert mit Serum aus einer Ratte, der i.p. 10&sup6; lebendige Chi3306-Zellen injiziert wurden, die zweimal (4 und 6 Wochen danach) mit 10&sup7; lebensfähigen Chi3306-Zellen verstärkt wurden. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurde dann Blut entnommen. Das Serum wurde bei -20ºC in 50 %-igem Glycerin gelagert. In der Figur bedeuten die einzelnen Banden folgendes: Bande a - Chi7027 E.coli 02a:K-iKH5 (Truthahn), Bande b - Chi7010 E.coli 036:K (Truthahn), Bande c - Chi7011 E.coli 0143:K-:H27 (Truthahn), Bande d - Chi7112 E.coli 01:K1:H7 (menschliche Septikämie), Bande e - Chi7110 E.coli 01:K1 (menschliche UTI), Bande f - Chi7122 E.coli 078:K80:H9 (Kücken), Bande g - Chi3663 S.typhimurium (Pferd), Bande h - CH13700 S.enteritidis (Mensch), Bande i - Chi3202 S.albany (Mensch), Bande j - Chi3214 S.infantis (Mensch), Bande k - Chi3210 S.hadar (Mensch), Bande l - Chi3749 S.heidelberg (Kücken), Bande m - Chi3750 S.agona (Kükken) und Bande n - vorgefärbte Molekulargewichtsmarker.
Die Ergebnisse in Figur 2 zeigen, daß Antikörper gegen S.typhimunum, die in Ratten erzeugt wurden, mit einer großen Anzahl von Proteinen in den verschiedensten Salmonellaarten und in verschiedenen E.coli-Stämmen reagieren, die für verschiedene Krankheitszustände bei Individuen bei einer großen Zahl von Arten, die Säuger und Vögel umfassen, verantwortlich sind. Umgekehrt gilt auch, daß gegen E.coli-Proteine produzierte Antikörper mit Proteinen aus einer großen Zahl von E.coli- Stämmen sowie gegen eine große Zahl von Salmonellaarten reagieren. Die Ergebnisse bilden somit eine Basis für das Vermögen von S.typhimurium-Impfstoffstämmen Kreuzschutzimmunität gegen verschiedene Arten von Enterobacteriaceae zu induzieren.
Um festzustellen, ob die Kreuzschutzwirkung der Immunisierung mit Impfstoff stämmen von Salmonella auf der Immunogenität der Stämme beruht, wurden die Titer der zirkulierenden Antikörper in den Sera von Kücken, die mit Chi3985 immunisiert worden waren, die mit den Oberflächenproteinen sowohl von E.coli- Chi7122 als auch des Impfstoffstammes Chi3985 reagieren, geprüft. Figur 3 zeigt die Ergebnisse des Western-Immunoblottings von Ganzbakterienextrakten an 7,5 % SDS-Polyacrylamidgel, transferiert auf Nitrocellulose und sondiert mit Serum sowohl von immunisierten als auch nichtimmunisierten (Kontrolle) 3 Wochen alten Kücken. Die Blots 1, 2 und 3 sind mit dem Serum aus drei nichtimmunisierten Kücken sondiert. Die Blots 4, 5 und 6 sind mit dem Serum aus drei 1 Tage alten immunisierten Kücken sondiert. Die Immunisierung erfolgte peroral mit 1 x 10&sup9; CFU des δ-cya-δ-crp-S.typhimurium-Stammes Chi3985. In den Blots bedeuten die Bande a vorgefärbte Molekulargewichtsmarker, Bande b - E.coli Chi7122 (078:K80:H9), gezüchtet in Bouillon und Bande c - S.typhimurium Chi3985, gezüchtet in Bouillon.
Die Ergebnisse in Fig. 3 zeigen, daß Sera aus mit Chi3985 immunisierten Kücken hohe Titer an zirkulierenden Antikörpern enthalten, die mit den Oberflächenproteinen sowohl in E.coli Chi7122 als auch im Impfstoffstamm Chi3985 reagieren. Diese Antikörper wurden in Sera aus nichtimmunisierten Kücken nicht nachgewiesen.

Beispiel 15

Bewertung der galE-Mutation, pmi-Mutation oder fur-Mutation bezüglich Schutz durch orale Immunisierung mit S. typhimurium-δ-cya-δ-crp-Stämmen gegen Kontrollinfektion mit virulenter 078:K80-E.coli

In Beispiel 14 wurde gezeigt, daß die Immunisierung von 1 Tag alten Kücken mit 1 x 10&sup9; CFU eines δ-cya-δ-crp-Stammes von S.typhimurium eine Zunahme der Immunität gegenüber der Kontrollinfektion des kaudalen Alveolarsackes mit einem 078:K80- E.coli-Stamm bewirkte. Die Wirkung der Aufnahme von galE-, pmi- oder fur-Mutationen auf die induzierte Immunität wird folgendermaßen geprüft:
1 und 3 Tage alte Kücken der Weiße Leghorn-Rasse werden mit 1 x 10&sup9;-Zellen von Impfstoffstämmen immunisiert, die in L-Bouilion mit 0,1 % Glucose, L-Bouillon mit 0,05 % Galactose (bei galE-Stämmen) und L-Bouillon mit 0,1 % Mannose (bei pmi-Stämmen) und 300 mM NaCl gezüchtet wurden. Fünf Impfstoffstämme werden verglichen. Diese sind der δ-cya-δ-crp-S.typhimurium- Impfstoff stamm Chi3985 und vier Chi3985-Derivate mit pmi- (Chi4152), pmi- und fur-, galE- (Chi4137) und galE- und fur- Mutationen.
Gruppen zu jeweils fünf Kücken werden mit 1 x 10&sup9;-CFU jedes Impfstoffstammes immunisiert. Die Impfstoffstämme werden in mit dem entsprechenden Kohlehydrat und 300 mM NaCl supplementierter L-Bouillon gezüchtet und nach Entnahme in gepufferter Salzlösung mit Gelatine erneut suspendiert. Die Gruppen der immunisierten Kücken werden zwei bzw. vier Wochen nach der Immunisierung mit 1 x 10&sup6;, 1 x 10&sup7; und 1 x 10&sup8; CFU Chi7007-E.coli-078:K80 kontrollinfiziert. Vor der Kontrollinfektion wird der Kontrollinfektionsstamm in tryptischer Sojabouillon gezüchtet, entnommen und in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) suspendiert. Die Kontrollinfektion erfolgt durch Beimpfung des kaudalen Alveolarsacks mit 100 ul der Suspension. Die Gruppen der nichtimmunisierten Kücken werden zur Kontrolle vewendet. Die verendeten Kücken werden markiert, um zu überprüfen, ob sie aufgrund der Infektion durch E.coli verendeten. Die Uberprüfung erfolgt anhand des Vorliegens der typischen für Alveolarsacculitis, Pericarditis, Pneumonie usw. kennzeichenenden fibrösen Ablagerungen.

Beispiel 16

Aufnahme von Plasmid-DNA in Salmonella durch Elektroporation

Ein Mittel zur Einführung von Plasmid-DNA in Salmonella ist die Elektroporation. Eine 10 ml Kultur, gezüchtet in L-Bouilion, von S.typhimurium als Empfängerstamm wird bis zur log- Phase (d.h. bis zu einer Absorption bei 60 nm von 0,5 - 0,8) gezüchtet. Die Zellen werden dann 15 bis 30 min eisgekühlt und durch Zentrifugieren bei 5000 x g während 15 min bei 4ºC sedimentiert. Das Pellet wird in 10 ml eiskaltem 1 mM HEPES (auf pH 7 gepuffert) suspendiert. Die Zentrifugierung und die erneute Suspension in HEPES werden wiederholt, wonach die Zellen sedimentiert und in 1,25 ml 10 %-igem Glycerin suspendiert werden. Die Zellen werden dann weiter durch Abzentrifugieren konzentriert und schließlich in 125 ul 10 %-igem Glycerin bei einer Zellkonzentration von ca. 3 x 10¹&sup0; CFU/ml suspendiert. 40 ml Zellen auf Eis werden mit 5 - 10 ul DNA, suspendiert in auf pH 8 abgepuffertem Tris-EDTA, gemischt und auf Eis während ca. 1 min stehen gelassen. Das Gene Pulsar-Gerät wird bei 25 uF und 2,5 kV mit einem Impuiskontroller bei 200 o eingeschaltet. Das Gemisch aus Zellen und DNA wird dann in eine kalte 0,2 cm-Elektroporationsküvette verbracht. Die Suspension wird bis zur Erreichung des Bodens der Küvette geschüttelt, wonach diese in den unteren Teil der Kammer gelegt wird. Danach wird während 4,5 bis 5 msec ein Einzelimpuls gesetzt, wonach die Küvette aus der Kammer entfernt wird und ihr 1 ml SOC-Medium (mit 2 % Bactotrypton, 0,5 % Bacto-Hefe, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgSO&sub4; und 20 mM Glucose) zugegeben werden, um die Zellen unter Verwendung einer Pasteurpipette rasch zu suspendieren. Die Zellsuspension wird dann in ein Glasrohr gegeben und bei 37ºC unter rascher Belüftung während 1 h bebrütet. 100 ul-Proben einer 1:10-Verdünnung und unverdünnte 100 ul- Proben werden auf ein geeignetes selektives Medium wie z.B. MacConkey-Agar mit 1 % Maltose + 100 ug Ampicillin/ml plattiert, um das crp&spplus;-Plasmid pSD110 in einen Stamm mit einer δ- crp-Mutation einzuführen.

Beispiel 17

Bewertung des Vermögens nichtimmunisierter Käfigkreuzungen durch immunisierte Kücken immunisiert zu werden

Die S.typhimurium-Impfstämme δ-cya-δ-crp-pmi und δ-cya-δ-crp- gale sind reversibel rauh und können den LPS-Kern und die Seitenketten nur dann synthetisieren, wenn ihnen von außen Mannose bzw. Galactose zugeführt wird. Es ist davon auszugehen, daß se bzw. Galactose zugeführt wird. Es ist davon auszugehen, daß diese Zucker im Darminhalt nicht in einer hohen Menge vorliegen. Daher ist anzunehmen, daß S.typhimurium-Stämme mit pmioder galE-Mutationen den Darm für eine kürzere Zeitdauer besiedeln als ihre Wildtypeltern und in einer rauhen Form, die sowohl avirulent als auch nichtimmunogen ist, ausgeschieden werden.
Der Impfstoffstamm Chi3985 (8-cya-8-crp) und seine pmi- bzw. galE-Derivate Chi4152 bzw. Chi4137 werden in L-Bouillon mit den entsprechenden Kohlehydraten zur Ermöglichung der LPS-Synthese sowie in Anwesenheit von 300 mM NaCl zur Verbesserung des Invasionsvermögens gezüchtet. Die erhaltenen Zellen werden in gepufferter Salzlösung + Gelatine suspendiert und zur peroralen Beimpfung 1 Tag alter Kücken verwendet. Gruppen zu je fünf Kücken, die mit jedem Stamm immunisiert wurden, werden jeweils mit einer Gruppe von fünf nichtimmuniserten Kücken zusammengebracht. Die Kücken werden beringt, um von den einzelnen Individuen die entsprechenden Daten zu sammeln. Zur Quantifizierung der Ausscheidungsmenge und -dauer sowie zur Bestimmung der möglichen Besiedelung nichtimmunisierter Kücken werden Kloakenabstriche verwendet. Sämtlichen Kücken werden im Alter von vier Wochen Blut und die Titer der Antikörper gegen Salmonella-LPS entnommen und die äußeren Membranproteinantigene nach der ELISA-Methode bestimmt.

Gewerbliche Verwendbarkeit

Impfstoffe aus avirulenten Stämmen von Salmonella, die gegenüber homologen und heterologen Salmonella-Serotypen und anderen Gram-negativen Enterobakterien Immunität zu induzieren vermögen, eignen sich für die Behandlung von Säugetieren und Vögeln bzw. Geflügel zur Verbesserung der Wirkung auf Erkrankungen von Populationen, die virulenten Stämmen dieser Gramnegativen Bakterien ausgesetzt sind. Zu solchen Populationen zählen Säuger und insbesondere Vögel, die nicht nur häufig von Glied in der Übertragungskette auf den Menschen sind.
Oben wurden avirulente Salmonella-Stämme beschrieben&sub1; die wenigstens eine Mutation in einem Gen aufweisen, das für die Gesamtsteuerung der übrigen Gene verantwortlich ist und außerdem noch wenigstens eine andere Mutation aufweist, und zwar eine solche in einem ein Enzym für die Lipopolysaccharidsynthese kodierenden Gen, was zu einem reversiblen rauhen Phänotyp führt, oder in einem die Synthese eisengesteuerter OMP's steuerndem Gen, wobei diese Mutation zur konstitutiven Expression dieser Proteine führt. Derartige Stämme sind für die Herstellung der erwähnten Impfstoffe geeignet.

Claims

1. Impfstoff zur Behandlung eines Individuums gegen Infektionen durch Gram-negative Bakterien, bestehend aus lebenden avirulenten Salmonella-Zellen, welche gegenüber homologen und heterologen Salmonella-Serotypen und gegenüber anderen Gramnegativen Enterobakterien Immunität zu induzieren vermögen, wobei die Salmonella-Zellen eine Mutation in einem Gen, das Adenylatcyclase (cya) und/oder cyclisches AMP-Rezeptorprotein (crp) kodiert, und ferner eine Mutation in einem Gen, das ein Enzym bei der Lipopolysaccharidsynthese kodiert, aufweisen, was zu einem reversibel rauhen Phänotyp führt, wobei die Menge an lebenden Zellen ausreicht, um die Resistenz des Individuums gegen Infektionen durch Gram-negative Enterobakterien zu verbessern und die Salmonella-Zellen in einem pharmazeutisch verträglichen Träger vorliegen.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, bei dem die avirulenten Salmonella-Zellen eine Mutation in einem galE-Gen, welches die UDP- Galactose-epimerase kodiert, aufweisen.

3. Impfstoff nach Anspruch 1, bei dem die Salmonella-Zellen eine Mutation in einem pmi-Gen, das die Phosphomannose-isomerase kodiert, aufweisen.

4. Verwendung von lebenden avirulenten Salmonella-Zellen, die wenigstens eine Mutation in einem Gen, das an der Gesamtsteuerung der Pathogenität von Salmonella teilninimt, und ferner eine Mutation in einem Gen, das ein Enzym bei der Lipopolysaccharidsynthese kodiert, aufweisen, was zu einem reversibel rauhen Phänotyp führt, zur Herstellung eines Medikaments für die Induzierung von Immunität gegenüber heterologen Salmonella-Serotypen oder anderen Gram-negativen Bakterien als Salmonella.

5. Verwendung gemäß Anspruch 4, bei der die Salmonella-Zellen eine Mutation in einem PhoP-Gen aufweisen, das Gene steuert, die es Salmonella ermöglichen, in Macrophagen zu überleben.

6. Verwendung nach Anspruch 4, bei der die Salmonella-Zellen eine Mutation in einem galE-Gen aufweisen, das UDP-Galactoseepimerase kodiert.

7. Verwendung nach Anspruch 4, bei der die Salmonella-Zellen eine Mutation in einem pmi-Gen aufweisen, das Phosphomannoseisomerase kodiert.

8. Impfstoff zur Behandlung eines Individuums gegen Infektionen durch Gram-negative Bakterien, bestehend aus lebenden avirulenten Salmonella-Zellen, welche gegenüber homologen und heterologen Salmonella-Serotypen und gegenüber anderen Gramnegativen Enterobakterien Immunität zu induzieren vermögen, wobei die Salmonella-Zellen wenigstens eine Mutation in einem Gen, das an der Gesamtsteuerung der Pathogenität von Salmonella teilnimmt, und ferner eine Mutation in einem Gen, das die Synthese der durch Eisen gesteuerten äußeren Membranproteine {OMP) steuert, so daß die Mutation zu einer konstitutiven Expression der durch Eisen gesteuerten OMP's führt, aufweisen, wobei die Menge an lebenden Zellen ausreicht, um die Resistenz des Individuums gegen Infektionen durch Gram-negative Enterobakterien zu verbessern und die Salmonella-Zellen in einem pharmazeutisch verträglichen Träger vorliegen.

9. Impfstoff nach Anspruch 8, bei dem die avirulenten Salmonella-Zellen Mutationen in Genen aufweisen, die Adenylatcyclase (cya) und/oder cyclisches AMP-Rezeptorprotein (crp) kodieren.

10. Impfstoff nach Anspruch 8, bei dem die Salmonella-Zellen eine Mutation in einem phop-Gen aufweisen, das die Gene steuert, die Salmonella das Überleben in Macrophagen ermöglichen.

11. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3 bzw. 8 bis 10 zur Verwendung in einem Verfahren zur Immunisierung eines Individuums gegen Infektionen durch Gram-negative Bakterien.

12. Isolierter avirulenter Salmonella-Stamm, welcher gegenüber homologen und heterologen Salmonella-Serotypen und gegenüber anderen Gram-negativen Enterobakterien Immunität zu induzieren vermag, wobei der Stamm eine Mutation in einem Gen, das Adenylatcyclase (cya) und/oder cyclisches AMP-Rezeptorprotein (crp) kodiert, und ferner eine Mutation in einem Gen, das ein Enzym bei der Lipopolysaccharidsynthese kodiert, aufweist, was zu einem reversibel rauhen Phänotyp führt.

13. Isolierter Stamm nach Anspruch 12, wobei Salmonella wie in Anspruch 2 oder 3 definiert ist.

14. Isolierter avirulenter Salmonella-Stamm, welcher gegenüber homologen und heterologen Salmonella-Serotypen und gegenüber anderen Gram-negativen Enterobakterien Immunität zu induzieren vermag, wobei der Stamm wenigstens eine Mutation in einem Gen, das an der Gesamtsteuerung der Pathogenität von Salmonella teilnimmt, und ferner eine Mutation in einem Gen, das die Synthese der durch Eisen gesteuerten äußeren Membranproteine (OMP) steuert, so daß die Mutation zu einer konstitutiven Expression der durch Eisen gesteuerten OMP's führt, aufweist.

15. Isolierter Stamm nach Anspruch 14, wobei Salmonella wie in Anspruch 8 bis 10 definiert ist.

16. Isolierte Salmonella-Zellen nach Anspruch 13, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus ATCC Nr. 68165 und ATCC Nr. 68167.