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Die
vorliegende Erfindung betrifft Salmonella Bakterien zur Verwendung
in einem Impfstoff, Impfstoffe basierend auf diesen Bakterien, die
Verwendung solcher Impfstoffe zur Herstellung eines Impfstoffes
und Verfahren zur Herstellung solcher Impfstoffe.
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Bakterien
des Genus Salmonella sind berüchtigt
für ihre
Pathogenität
in sowohl Menschen wie auch Tieren. Alleine in den USA übersteigt
auf einer Jahresbasis die Zahl der Menschen, die an Salmonella Infektionen
leiden, zwei Millionen Fälle.
In den meisten Fällen
wird die Infektion durch kontaminierte Nahrung verursacht. Wohlbekannte
Infektionsquellen sind Eier (von sowohl Enten wie auch Hühnern),
Eier-enthaltende Produkte und nicht ausreichend erhitztes Geflügel- und
Schweinefleisch. Vor allem in Säuglingen,
Kleinkindern, älteren
Leuten und immukompromittierten Patienten ist die Fähigkeit
solche Infektionen zu bewältigen
gering. Vor allem in diesen Gruppen ist die jährliche Todesrate aufgrund
von Salmonella Infektionen hoch. Während der letzten Jahrzehnte
führte
die effizientere Grosstierhaltung zu einer gewaltigen Zunahme in
Tierdichte. Als Folge davon wird eine Zunahme in der Zahl von durch
infizierte Nahrung verursachten Infektionen in Tieren und anschliessend
von Infektionen in Menschen beobachtet. Es ist offensichtlich, dass
Tiere die Hauptquelle von Salmonella Infektionen sind. Diese Quelle
ist äusserst
schwer zu kontrollieren. Zuallererst verursachen Salmonella Infektionen
in den meisten Fällen
in gesunden, ausgewachsenen Tieren keine ernsthafte Krankheit; diese
Tiere können
das Bakterium für
einen längeren
Zeitraum tragen. Während
dieser Zeit scheiden sie das Bakterium in ihrem Mist aus. Dies macht
es schier unmöglich,
eine Infektion in den verletzlicheren, jüngeren Tieren zu verhindern.
Zweitens kolonisieren viele Salmonella Spezies mehrere verschiedene
Wirtstierspezies. Gewisse Salmonella Spezies verursachen Primärinfektionen
in spezifischen Wirten, während
andere Salmonella Spezies gar nicht restriktiv sind. S. typhi und
paratyphi werden oft als primäres
infektiöses
Mittel mit Infektionen im Mensch assoziiert. S. typhi verursacht
Diarrhoe und als Folge davon Dehydrierung. Diese Infektion wird
sehr oft in tropischen Gebieten gefunden. S. dublin wird mit Rindern,
vor allem Jungtieren, in Verbindung gebracht, wo es in über 50%
der Fälle
tödliche
Infektionen verursacht. S. abortusequi verursacht Aborte in Pferden.
S. abortus-ovi verursacht Aborte in Schafen. S. choleraesuis ist
die Ursache von tödlicher
Diarrhoe in jungen Schweinen. S. typhimurium und S. enteritidis
verursachen Salmonellosis in Geflügel, Schweinen, Rinder und
Säugetieren.
S. arizonae verursacht ebenso Erkrankung in Truthähnen. Auch
nicht-essbare Tiere wie zum Beispiel Reptilien leiden an Salmonella
Infektionen, wie zum Beispiel S. arizonae.
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Es
besteht offensichtlich ein Bedarf an effizienten Salmonella Impfstoffen.
Impfstoffe werden benötigt, um
Menschen vor Salmonella Infektionen, die von Mensch zu Mensch übertragen
werden, zu schützen.
Ebenso werden Impfstoffe benötigt,
um Menschen vor Nahrungsmittel-übertragenen
Salmonella Infektionen zu schützen.
Und schliesslich werden Impfstoffe benötigt, um Tiere vor Salmonella
Infektionen zu schützen.
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Gegenwärtig sind
einige Impfstoffe gegen verschiedene Salmonella Spezies kommerziell
erhältlich. Diese
Impfstoffe teilen jedoch einen ernsten Nachteil, obwohl sie als
Impfstoff betrachtet manchmal effizient sind. Sie induzieren im
allgemeinen eine Antikörper
Population, die derjenigen einer Infektion mit Wildtyp Bakterien
gleichkommt, da sie die gleiche antigene Ladung wie das Wildtyp
Bakterium besitzen. Deshalb sagt eine Analyse der Antikörper im
Serum eines Salmonella-positiven Tieres nicht aus, wieso das Tier
positiv ist. Dies kann aufgrund der Impfung sein, kann aber genauso
durch eine Infektion mit einem virulenten Feldstamm verursacht sein.
Deshalb wird ein Tier, falls es Salmonella-positiv ist, als infiziert
betrachtet.
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Demzufolge
wäre es
wünschenswert
einen sogenannten Marker-Impfstoff
zu haben. Ein Marker-Impfstoff ist ein Impfstoff, der von einer
Wildtyp-Infektion unterschieden werden kann, z. B. aufgrund eines
charakteristischen Antikörper
Panels, das von einem durch eine Wildtyp-Infektion induzierten Antikörper-Panel
verschieden ist. Ein unterschiedlicher Antikörper-Panel wird z. B. induziert
wenn ein immunogenes Protein, das auf einem Wildtyp-Bakterium vorhanden
ist, in einer Mutante, die zur Impfung verwendet wird, nicht vorhanden ist:
der Wirt wird dann nach der Impfung keine Antikörper gegen das Protein herstellen.
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Ein
Markerantigen hat mindestens folgende Charakteristika:
- – es
kann ohne die Lebensfähigkeit
des Bakteriums ernsthaft zu beeinträchtigen gelöscht werden.
- – es
induziert Antikörper
falls vorhanden.
- – es
trägt,
falls vorhanden, nicht zur Immunogenität des Bakteriums bei.
- – seine
Abwesenheit trägt
vorzugsweise zur Attenuierung bei.
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Auf
der Suche nach geeigneten Markerantigenen, sollten alle bekannten
Salmonella Antigene in Betracht gezogen werden. Ein bekanntes Antigen,
das bei allen Wildtyp Salmonella Spezies mit Ausnahme gewisser S.
pullorum und gallinarum Unterspezies gefunden wird, ist das Flagellum.
Beispiele von Salmonella Spezies, die Flagella in ihrer Wildtyp-Form
tragen, sind S. typhimurium, enteritidis, choleraesuis, dublin,
typhi, abortus-ovi, abortusequi, paratyphi A und B, derby, hadar,
heidelberg, agona und arizonae. Flagella sind lange Strukturen,
die von der Zelloberfläche
hervorragen, und die eine wichtige Rolle in der Motilität und Invasion gewisser
Wirtszellen spielen. Flagella bestehen aus langen Polymeren des
Proteins genannt Flagellin. Es ist bekannt, dass diese Flagella
hohe Antikörperniveaus
induzieren. Es ist ebenso bekannt, dass die Abwesenheit von Flagella
die Lebensfähigkeit
des Bakteriums ausserhalb des Wirtes nicht wesentlich beeinträchtigt:
Flagella-lose Mutanten sind von praktisch allen Salmonella Spezies
bekannt und können
in vitro gezüchtet
werden. Nichtsdestotrotz wurden flagellare Proteine von Salmonella
nie als geeignete Marker in Betracht gezogen, da sie nicht oder
nur teilweise drei der vier Marker-Voraussetzungen erfüllen:
- – obwohl
für das Überleben
ausserhalb des Wirtes nicht wesentlich, spielen sie eine bedeutende
Rolle im Überleben
und Persistenz der Bakterien in Wirt-Makrophagen, die in der Induktion
von Immunität
involviert sind. (Methner, U. und Barrow, P. A., Berl. Münch. Tierärztl. Wschr.
110: 391–396
(1997), Weinstein et al., Infect. Immun. 46: 819–825 (1984)).
- – sie
tragen bedeutend zu der Immunogenität des Bakteriums bei, ein Grund
wieso sie sogar als Trägerproteine
für kurze
heterologe Aminosäurensequenzen
verwendet werden (Joys, T. M., SAAS Bulletin: Biochem & Biotech. 4: 56–59 (1991),
Newton, S. M. C. et al., Science 244: 70–72 (1989)).
- – ihre
Abwesenheit trägt
nicht zur Attenuierung bei (Lockman, H. A. und Curtiss, R., Infect. & Immun. 58: 137–143 (1990),
Methner, U. und Barrow, P. A., Berl. Münch. Tierärztl. Wschr. 110: 391–396 (1997).
- – flagellierte
Salmonella Bakterien hemmen die Bindung von anderen flagellierten
Salmonellas. Flagella-lose Salmonella Bakterien zeigen jedoch ein
herabgesetztes Hemmpotential gegenüber anderen flagellierten Salmonellas
und erhöhen
deshalb sogar den insgesamten Grad der Salmonella Infektion (Methner,
U. und Barrow, P. A., Berl. Münch.
Tierärztl.
Wschr. 110: 391–396
(1997), Weinstein et al., Infect. Immun. 46: 819–825 (1984)).
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Im
Englischen Patent GB 1,109,179 beschrieb Ephraim Saul Anderson Impfstoffe
auf der Basis von inaktivierten Salmonella typhi oder paratyphi,
die frei von Flagella sind. Diese Impfstoffe wurden ohne Adjuvans gegeben.
Wie von Anderson einige Jahre später
beschrieben wurde (Wandan, M. et al., 1975, Bull. World Health Organisation),
stellen diese Impfstoffe keinerlei Schutz bereit. Zudem betonte
dieses Schriftstück
einmal mehr die Wichtigkeit von Flagella in Impfstoffen.
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Aufgrund
dieser kombinierten Gründe,
wurde das Flagellum nie als geeignetes, löschbares Markerantigen für Salmonella
Impfstoffe in Betracht gezogen.
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Überraschend
wurde nun gefunden, dass die Abwesenheit von Flagella im Gegensatz
zur allgemeinen Annahme das Impfpotential von Salmonella nicht beeinträchtigt.
Dies ist besonders überraschend
hinsichtlich der Tatsache, dass in Wildtyp Salmonella infizierten
Tieren grosse Mengen an Antikörper
gegen Flagella gefunden werden, was einmal mehr deren Antigenität beweist.
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Es
ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Bakterien des Genus Salmonella
bereitzustellen, die, wenn sie in inaktivierter Form zusammen mit
einem Adjuvans vorkommen, in ihrer Wildtyp-Form Flagella tragen
aber nicht mehr fähig
sind, Antikörper
gegen mindestens eine antigene Determinante von Flagellin oder Flagella
zu induzieren, zur Verwendung in einem Impfstoff für den Schutz
von Menschen oder Tieren gegen Salmonellosis.
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Flagelline
sind Proteine von ungefähr
500 Aminosäuren,
die mehrere antigenen Determinanten umfassen, d. h. es bestehen
mehrere Regionen auf den Flagellinen gegen welche Antikörper im
Wirtstier hervorgerufen werden. Diese antigenen Determinanten wurden
von T. M. Joys (Joys, T. M., SAAS Bulletin: Biochem & Biotech. 4: 56–59 (1991)
identifiziert und lokalisiert. Zwecks der vorliegenden Erfindung
werden Bakterien, die nicht mehr fähig sind, Antikörper gegen
mindestens eine antigene Determinante von Flagellin oder Flagella zu
induzieren, als Bakterien betrachtet, die Flagellin oder Flagella,
welches nach wie vor alle antigenen Determinanten besitzt, nicht
umfassen. Es ist nicht notwendig, alle antigenen Determinanten zu
entfernen: es genügt,
eine der antigenen Determinanten zu löschen. Ein Screening nach Antikörper gegen
diese antigene Determinante im Serum von seropositiven Tieren würde dann
eine Diskriminierung zwischen Marker-geimpften und Wildtyp-infizierten
Tieren erlauben. Solche Antikörper
würden
in geimpften Tieren nicht gefunden werden, während sie in natürlich infizierten
Tieren vorhanden wären.
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Ein
Screening kann leicht mittels einfacher diagnostischer Hilfsmittel
routinemässig
wie im folgenden beschrieben durchgeführt werden.
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Viel
ist gegenwärtig über die
Synthese von Flagellin und die anschliessende Reifung zu Flagella
bekannt. (Z. B. in Escherichia coli und Salmonella typhimurium.
Kapitel 10: Flagella and motility. Hrsg. Frederick C. Neidhardt
et al. 2te Ausgabe ISBN 1-55581-084-5
(1996) und in Macnab, R. M.; Genetics and biogenesis of bacterial
flagella (Annual Review of Genetics 26: 131–158 (1992)). Der flagellare
Biogeneseprozess benötigt die
konzertierte Wirkung einer grossen Zahl von Genen, nicht nur des
Flagellin-kodierenden Gens, aber ebenso einer grossen Zahl von Genen,
die in der Synthese des Flagellums und des flagellaren Motors involviert sind.
Prinzipiell gibt es zwei Vorgehen um Bakterien gemäss der vorliegenden
Erfindung herzustellen. Zuallererst können Mutationen im Gen, das
das Flagellin-Protein kodiert, erstellt werden, um eine oder mehrere
antigenen Determinanten zu mutieren. Zweitens können ein oder mehrere Gene,
die in der Biogenese des Flagellums involviert sind, mutiert werden.
Dies verhindert die Biosynthese von Flagellin oder sogar des gesamten Flagellums
und in vielen Fällen
sogar den Transport des Flagellins durch die bakterielle Membran.
Im Falle dass keine Flagella hergestellt werden, sind die antigenen
Determinanten, die durch die spezifische Faltung des Flagellins
in Flagella be stimmt werden, nicht vorhanden. Falls das Flagellin
selber nicht durch die Membran transportiert wird und demzufolge
innerhalb des Bakteriums verbleibt, wird keine Induktion von Antikörpern gegen
Flagellin auftreten. Alle Arten von Genen oder Gen-Clustern, von denen
bekannt ist, dass sie im Zusammenbau und Export, wie zum Beispiel
dem morphologischen Assembly Pathway und einem Flagellum-spezifischen
Export Pathway, involviert sind, können Ziele für eine Mutation
darstellen. Diese führen
alle entweder zu Bakterien, denen Flagellin oder zumindest Flagella
fehlen. Der Klarheit halber werden alle Wege, die im gesamten Syntheseprozess
der endgültigen
Flagella involviert sind, im weiteren als flagellare Biogenese Wege bezeichnet.
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Demzufolge
ist das Bakterium in einer bevorzugten Variante aufgrund einer Mutation
in einem Gen des flagellaren Biogenese Weges nicht fähig, Antikörper gegen
mindestens eine antigene Determinante von Flagellin oder Flagella
zu induzieren.
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Von
einem praktischen Standpunkt her, kann es jedoch wünschenswert
sein, das ganze (oder Teil des) Flagellin-Gen(s) von den im Impfstoff
zu verwendenden Bakterien, einfach mittels Löschung des das flagellare Protein
kodierenden Gens, zu löschen.
Die Gene, die die flagellaren Proteine der verschiedenen Salmonella Spezies
kodieren, sind bekannt. Sie sind alle eng verwandt und demzufolge
in höchstem
Masse homolog. Flagellin Gene wurden u. a. für Salmonella enterica (Li,
J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 2552–2556 (1994)), Salmonella enteritidis
(Selander, R. K. et al., J. Bacteriol. 174, 3587–3592 (1992)), Salmonella dublin
(Masten, B. J. and Joys, T. M., J. Bacteriol. 175, 5359–5365 (1993)),
Salmonella typhimurium (de Vries, N. et al., Appl. Environ. Microbiol.
64, 5033–5038
(1998)), Salmonella abortus-equi (Hanafusa, T. et al., Mol. Gen.
Genet. 236, 260–266
(1993)) beschrieben. Flagellin Gene von neuen Salmonella Spezies
können leicht
basierend auf ihrer Homologie mit allen existierenden und bekannten
Salmanella Flagellin Genen gefunden werden: Standard Hybridisierungs-Methoden
genügen,
um das Flagellin-Gen zu lokalisieren.
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Es
gibt zwei Flagellin Gene in Wildtyp Flagellum tragenden Salmonella
Bakterien. Nur eines dieser Gene wird angeschaltet, d. h. produziert
Flagellin zu jeder Zeit. Augrund eines Mechanismus genannt flagellare
Phasenvariation tauschen die Gene auf einer Zeitskala in der Grössenordnung
von 103 bis 105 Generationen
die Rollen sodass das nicht-exprimierte exprimiert wird und umgekehrt.
((Z. B. beschrieben in Escherichia coli und Salmonella typhimurium.
Kapitel 10: Flagella and motility. Hrsg. Frederick C. Neidhardt
et al. 2te Ausgabe ISBN 1-55581-084-5 (1996)). Um zu vermeiden,
dass Stämme
gemäss
der Erfindung, nach einer gewissen Generationenzahl Flagellin zu
exprimieren beginnen, müssen
beide Flagellin-Gene nicht funktionstüchtig gemacht werden. Andrerseits
genügt
es das Flagellin Gen, das zu der Zeit exprimiert wird, auszuschalten, falls
der Phasen-Umschalt-Mechanismus nicht funktionstüchtig gemacht wird.
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Ein
nicht funktionstüchtiges
Gen ist ein Gen, das nicht mehr ein Flagellin kodiert. Dies kann
ein Gen sein, von dem ein Teil der Kodierungssequenz, die eine antigene
Determinante kodiert, entfernt wurde.
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Ein
möglicher
Weg, das Flagellin-Gen oder jegliches der anderen bekannten Gene,
die in der Flagellin-Biosynthese involviert sind, nicht-funktionstüchtig zu
machen, geschieht mittels klassischer Verfahren wie zum Beispiel
Behandlung der Wildtyp-Bakterien
Flagella-produzierenden Bakterien mit mutagenen Wirkstoffen, wie
zum Beispiel Basenanalogen, Behandlung mit ultraviolettem Licht
oder Temperaturbehandlung (Anderson, P. 1995. Mutagenesis, S. 31–58 in Methods
in Cell Biology 48. H. F. Epstein and D. C. Shakes (Hrsg)). Andere
Verfahren zur Herstellung von Flagella-losen Mutanten verschiedener
Bakterien, von welchen der Wildtyp Flagella besitz, wurden u. a.
von Liu, S. L. et al. (Infect. Immun. 1988 Aug; 56(8): 1967–73), Haas,
R. et al., (Mol. Microbiol. 1993 May; 8(4): 753–60) und Graf, J. et al. (J.
Bacteriol. 1994 Nov; 176(22): 6986–91) beschrieben.
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Die
Selektion für
Flagella-lose Bakterien kann sehr leicht mittels lichtmikroskopischer
Analyse auf die Absenz oder Präsenz
von Flagella erfolgen. Die Selektion für Bakterien, denen mindestens
eine antigene Determinante von Flagellin oder Flagella fehlt, kann
mittels Bindungsassays mit monoklonalen Antikörpern gegen Flagellin oder
Flagella erfolgen. Solche anti-flagellaren oder anti-flagellinen
monoklonalen Antikörper
können gemäss Standardmethoden,
u. a. durch Immunisieren (mit Flagella) von Inzucht Mäusen mittels
wohlbekannter Verfahren (Kohler und Milstein, Nature, 256, 495–497, 1975)
hergestellt werden. So erhaltene Monoklonale können in Bindungsassays mit
den mutierten Bakterien verwendet werden und diese Bakterien, die
nicht an ein spezifisches Monoklonal binden, sind die Bakterien,
denen mindestens eine antigene Determinante von Flagellin oder Flagella
fehlt.
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Die
Beschaffenheit der mittels klassischer Mutationsverfahren verursachten
Mutation ist unbekannt. Dies kann eine Punktmutation sein, die,
obwohl dies unwahrscheinlich geschieht, möglicherweise zum Wildtyp revertieren
kann. Deshalb stellt eine Transposon Mutagenese eine gute Alternative
dar. Mutation mittels Transposon Mutagenese ist ebenso ein in Fachkreisen
wohlbekanntes Mutagenese-Verfahren. Dies ist eine Mutation, die
an einer lokalisierten Stelle im Chromosom vollzogen wird.
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Eine
Möglichkeit,
eine Mutation an einer vorbestimmten Stelle eher vorsätzlich als
zufallsmässig
einzuführen,
wird durch die rekombinante DNA-Technologie angeboten. Solch eine
Mutation kann eine Insertion, eine Deletion, eine Ersetzung eines
Nukleotides durch ein anderes oder eine Kombination davon darstellen, mit
dem Vorbehalt, dass das mutierte Gen nicht mehr funktionstüchtiges
Flagellin kodiert. Solch eine Mutation kann z. B. durch Deletion
einer Zahl von Basenpaaren hergestellt werden. Sogar sehr kleine
Deletionen wie zum Beispiel Strecken von 10 Basenpaaren können Flagellin
bereits nicht-funktionstüchtig
machen. Sogar die Deletion eines einzigen Basenpaares kann bereits
zu einem nicht-funktionstüchtigen
Flagellin führen,
da als Folge solch einer Mutation die anderen Basenpaare nicht mehr
im korrekten Leserahmen sind. Jede Deletion oder Insertion einer
durch drei unteilbaren Anzahl von Basenpaaren verursacht eine Verschiebung
des Leserahmens (Frameshift). Mehr bevorzugt wird eine längere Strecke
entfernt, z. B. 100 Basenpaare. Noch mehr bevorzugt wird das ganze
Flagellin Gen gelöscht.
Es ist klar ersichtlich, dass insbesondere Mutationen, die ein Stop-Codon
im offenen Leserahmen einführen,
oder Mutatianen, die einen Frameshift im offenen Leserahmen verursachen, äusserst
geeignet sind, einen Stamm, der nicht mehr Flagellin kodiert, zu
erhalten. Orstspezifische Mutagenese ist das ausgewählte Verfahren
um ein Flagellin-Gen, dem eine oder mehrere spezifische antigene
Determinanten fehlt, herzustellen. Aufgrund der von Joys (Joys,
T. M., SAAS Bulletin Biochem & Biotech.
4: 56–59
(1991)) erstellten Karten der antigenen Determinanten können mutante
Flagellin-Gene erstellt werden, von denen eine oder mehrere spezifische
antigene Determinanten entfernt wurden. Alle rekombinanten DNA-Methoden
zur Konstruktion von Flagellin-negativen Mutanten sind wohlbekannte
Standardverfahren. Diese betreffen das Klonieren der Flagellin-Gene,
Modifikation der Gensequenz mittels ortsspezifischer Mutagenese,
Restriktionsenzym-Abbau gefolgt von Religation oder PCR-Vorgehen
und den anschliessenden Ersatz des Wildtyp Flagellin-Gens mit dem
mutierten Gen (Allelen-Austausch oder Allelen-Ersatz). Standard
rekombinante DNA-Methoden wie zum Beispiel das Klonieren des Flagellin
Gens in ein Plasmid, die Verdauung des Gens mit einem Restriktionsenzym
gefolgt von Behandlung mit einer Endonuklease, Religation und homologe
Rekombination im Wirtsstamm, sind alle in Fachkreisen bekannt und
u. a. beschrieben in Maniatis/Sambrook (Sambrook J. et al. Molecular
cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6). Ortsspezifische
Mutationen können
z. B. mittels in vitro ortsspezifischer Mutagenese unter Verwendung
des von Clontech verkauften Transformer® Kits
hergestellt werden. PCR-Verfahren sind ausführlich in Dieffenbach & Dreksler; PCR
Primers, a laboratory manual. ISBN 0-87969-447-5 (1995) beschrieben.
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Demzufolge
betrifft diese Variante der Erfindung in einer mehr bevorzugten
Form ein Bakterium, das aufgrund einer Mutation im Flagellin Gen
nicht fähig
ist, ein Flagellin zu exprimieren.
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Am
meisten bevorzugt sind die Bakterien ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus S. typhimurium, enteritidis, choleraesuis, dublin, typhi, abortus-ovi,
abortus-equi, paratyphi A und B, derby, hadar, heidelberg, agona
und arizonae.
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Es
ist ein weiteres Ziel der Erfindung, geeignete Marker-Impfstoffe für den Schutz
von Menschen und Tieren gegen Salmonellosis bereitzustellen. Das
charakteristische Merkmal der erfindungsgemässen Impfstoffe ist, dass sie
die hierin zuvor definierten Bakterien sowie einen pharmazeutisch
verträglichen
Träger
umfassen. Der Hauptvorteil der erfindungsgemässen Impfstoffe ist, dass damit
geimpfte Menschen und Tiere von sowohl nicht-geimpften Menschen und Tieren wie auch
Wildtyp Salmonella infizierten Menschen und Tieren aufgrund ihrer
Antikörper
Panel unterschieden werden können.
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Erfindungsgemässe Impfstoffe
können
in einer lebenden attenuierten oder einer inaktivierten Form vorkommen.
In beiden Fällen
führt die
Abwesenheit von mindestens einer antigenen Determinante von Flagella
oder Flagellin nach der Impfung zu einem Antikörper Panel, der leicht von
demjenigen, der nach einer Wildtyp Infektion induziert wurde, unterschieden
werden kann.
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Inaktivierte
Impfstoffe haben den Vorteil gegenüber Lebendimpfstoffen, dass
sie inhärent
sicher sind. Demzufolge betrifft eine bevorzugte Form der Erfindung
Impfstoffe, in welchen die Bakterien in einer inaktivierten Form
vorliegen.
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Erfindungsgemässe Impfstoffe,
die auf lebenden Salmonella Bakterien basieren, haben jedoch den Vorteil
gegenüber
Impfstoffen, die inaktivierte Bakterien umfassen, dass sie die natürliche Infektion
besser nachahmen können
und demzufolge das Immunsystem besser auslösen können. Wie im folgenden erläutert besitzen
sie zudem einen zusätzlichen
wichtigen Vorteil. Die Entwicklung von lebenden attenuierten Impfstoffen
ist im allgemeinen schwierig und zeitaufwendig. Zudem ist die Feineinstellung
des Abschwächungsgrades von
komplexer Natur: eine hohe Virulenz verursacht Erkrankung und eine
geringe Virulenz induziert ungenügenden
Schutz. Überraschenderweise
zeigen die erfindungsgemässen
Impfstoffe im Vergleich zu ihren Flagella-tragenden Gegenstücken keine
bedeutungsvollen Unterschiede in der Virulenz. Mit anderen Worten
wird der Abschwächungsgrad
durch das Entfernen des Flagellin Gens nicht bedeutend geändert. Dies
hat den unerwarteten Vorteil, dass sowohl zukünftige wie auch zugelassene
existierende lebende attenuierte Salmonella Stämme, die für die Verwendung in Impfstoffen
geeignet sind, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können sobald
sie unfähig
gemacht werden, Antikörper
gegen mindestens eine antigene Determinante von Flagellin oder Flagella
zu induzieren. Deshalb umfassen die erfindungsgemässen Impfstoffe
in einer weiteren bevorzugten Form lebende attenuierte Bakterien.
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Im
Hinblick auf die grosse Anzahl an Impfstoffen, die heutzutage sowohl
Haustieren wie auch Landwirtschaftstieren gegeben werden, ist es
offensichtlich, dass eine kombinierte Verabreichung von mehreren Impfstoffen
wünschenswert
wäre, wenn
auch nur aufgrund reduzierter Impfkosten. Es ist demnach äusserst verlockend,
lebende attenuierte Bakterien als rekombinanten Träger für heterologe
Gene zu verwenden, die Antigene ausgewählt von anderen pathogenen
Mikroorganismen oder Viren kodieren. Eine Verabreichung solch eines
rekombinanten Trägers
hat den Vorteil, dass eine Immunität gleichzeitig gegen zwei oder
mehrere Krankheiten induziert wird. Lebende attenuierte Bakterien
zur Verwendung in einem erfindungsgemässen Impfstoff stellen sehr
geeignete Träger
für heterologe
Gene dar. Prinzipiell können
solche heterologen Gene in das bakterielle Genom an jeglicher nicht-wesentlichen
Stelle eingefügt
werden.
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Deshalb
betrifft eine andere Variante der Erfindung erfindungsgemässe Bakterien,
in welchen ein heterologes Gen eingefügt wurde. Solch ein heterologes
Gen kann wie hierin zuvor erwähnt
z. B. ein Gen darstellen, das ein Antigen ausgewählt von anderen pathogenen
Mikroorganismen oder Viren kodiert. Solche Gene können z.
B. von pathogenen Herpesviren (z. B. Genen, die die Strukturproteine
der Herpesviren kodieren), Retroviren (z. B. dem gp160 Hüllprotein),
Adenoviren und ähnlichen
hergeleitet werden.
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Ebenso
kann ein heterologes Gen von pathogenen Bakterien erhalten werden.
Als Beispiel stellen Gene, die bakterielle Toxine wie zum Beispiel
Actinobacillus pleuropnomoniae Toxine, Clostridium Toxine, äussere Membranproteine
und ähnliche
kodieren, äusserst
geeignete heterologe Gene dar.
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Eine
andere Möglichkeit
besteht darin, ein Gen, das ein in der Auslösung des Immunsystems involviertes
Protein, wie zum Beispiel ein Interleukin, Tumor Nekrosis Faktor
oder ein Interferon oder ein anderes in der Immunregulierung involviertes
Gen kodiert, einzufügen.
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Die
Verwendung des Flagellin Gens als eine Insertionsstelle besitzt
den Vorteil, dass keine Notwendigkeit besteht, eine neue Insertionsstelle
für das
heterologe Gen zu finden, und gleichzeitig das Flagellin Gen inaktiviert
wird sowie das neu eingefügte
heterologe Gen exprimiert werden kann (gemeinsam mit den homologen
bakteriellen Genen). Die Konstruktion solcher rekombinanter Träger kann
routinemässig
unter Verwendung von standardmässigen
Molekularbiologie-Methoden wie zum Beispiel dem Allelenaustausch,
durchgeführt
werden.
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Deshalb
wird in einer bevorzugten Form dieser Variante das heterologe Gen
in das Flagellin Gen eingefügt.
Das heterologe Gen kann irgendwo in das Flagellin Gen eingefügt werden
oder es kann an der Stelle des Flagellin Gens eingefügt werden,
während
dieses Gen teilweise oder vollständig
gelöscht
wurde.
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Ein
erfindungsgemässer
Impfstoff enthält
ebenso zusätzlich
zu dem hierin zuvor beschriebenen Bakterium einen pharmazeutisch
verträglichen
Träger.
Solch ein Träger
kann so einfach wie Wasser sein, aber er kann z. B. ebenso Kulturflüssigkeit,
in welcher das Bakterium gezüchtet
wurde, umfassen. Ein weiterer geeigneter Träger ist z. B. eine Lösung von
physiologischer Salzkonzentration.
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Die
zu verabreichende, nützliche
Dosis hängt
vom Alter, Gewicht und zu impfenden Tier, dem Verabreichungsmodus
und -route und dem Typ des Pathogens gegen welches eine Impfung
ersucht wird, ab. Der Impfstoff kann jegliche Dosis an Bakterien
umfassen, die ausreichend ist, eine Immunantwort hervorzurufen. Dosen,
die zwischen 103 und 1010 Bakterien
variieren, sind äusserst
geeignete Dosen.
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Falls
der erfindungsgemässe
Impfstoff inaktivierte Bakterien umfasst, müssen eine oder mehrere Verbindungen
mit Adjuvansaktivität
hinzugefügt
werden. Falls der erfindungsgemässe
Impfstoff lebende abgeschwächte
Bakterien umfasst, ist die Verwendung eines Adjuvans fakultativ.
Adjuvantien sind nicht-spezifische Stimulatoren des Immunsystems.
Sie verstärken
die Immunantwort des Wirts gegenüber
dem Impfstoff. Beispiele von in Fachkreisen bekannten Adjuavntien
sind das Freund's
Komplette und Inkomplette Adjuvans, Vitamin E, nicht-ionische Blockpolymere,
Muramyldipetide, ISCOMs (immune stimulating complexes, siehe zum Beispiel
das Europäische
Patent
EP 109942 ), Saponine,
Mineralöl,
Pflanzenöl
und Carbopol. Adjuvantien, die für
eine muköse
Anwendung besonders geeignet sind, sind z. B. das E. coli hitzelabile
Toxin (LT) oder das Cholera Toxin (CT). Andere geeignete Adjuvantien
sind zum Beispiel Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat oder Aluminiumoxid, Öl-Emulsionen
(z. B. von Bayol F
® oder Marcol 52
®),
Saponine oder Vitamin E Solubilisate.
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Andere
für die
vorliegende Erfindung nützliche
Beispiele pharmazeutisch verträglicher
Träger
oder Verdünnungsmittel
umfassen Stabilisatoren wie z. B. SPGA, Carbohydrate (z. B. Sorbitol,
Mannitol, Stärke, Sucrose,
Glukose, Dextran), Proteine wie zum Beispiel Albumin oder Casein,
Protein-enthaltende Wirkstoffe wie zum Beispiel bovines Serum oder
fettarme Milch und Puffer (z. B. Phosphatpuffer). Insbesondere wenn solche
Stabilisatoren zum Impfstoff hinzugegeben werden, ist der Impfstoff äusserst
geeignet zur Gefriertrocknung oder Sprühtrocknung.
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Demzufolge
ist der Impfstoff in einer mehr bevorzugten Form in einer gefriergetrockneten
oder sprühgetrockneten
Form.
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Zur
Verabreichung an Tiere oder Menschen kann der erfindungsgemäösse Impfstoff
unter anderem intranasal, mittels Sprühen, intradermal, subkutan,
oral, mittels Aerosol, oder intramuskulär gegeben werden. Zur Anwendung
bei Geflügel
ist zusätzlich
eine Wing-Web- und Augentropfen-Verabreichung geeignet.
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Eine
weitere Variante der Erfindung betrifft die Verwendung von Bakterien
gemäss
der Erfindung zur Herstellung eines Impfstoffes für den Schutz
von Menschen und Tieren gegen eine Infektion mit einem Salmonella
Bakterium oder den pathogenen Auswirkungen der Infektion.
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Die
Erfindung betrifft ebenso Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemässen Impfstoffes.
Solche Verfahren umfassen das Beimischen von erfindungsgemässen Bakterien
und einem pharmazeutisch verträglichen
Träger.
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Ein
diagnostischer Test zur Überprüfung auf
die Abwesenheit/Anwesenheit von Salmonella anti-Flagellin oder anti-Falgella Antikörpern in
Seren kann z. B. ein einfacher ELISA-Test sein, in welchem die Wand der
Vertiefungen einer Elisa-Platte mit Flagella oder gereinigtem Flagellin
oder einem kurzen Polypeptid umfassend ein antigenes Fragment davon
beschichtet wird. Inkubation mit Serum von zu testenden Menschen oder
Tieren, gefolgt von z. B. Inkubation mit einem markierten Antikörper gegen
den relevanten menschlichen oder tierischen Antikörper kann
dann die Anwesenheit oder Abwesenheit der Antikörper gegen Flagellin auf zeigen.
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Ein
weiteres Beispiel eines diagnostischen Testsystems ist z. B. die
Inkubation eines Western Blots umfassend Flagellin mit Serum von
zu testenden Menschen oder Tieren, gefolgt von Analyse des Blots.
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Die
diagnostischen Tests zum Nachweis von Antikörpern gegen Salmonella Flagellin
sind vorzugsweise in Form eines Kits umfassend Flagellin in gereinigter
Form. Das Flagellin könnte
z. B. mittels standardmässiger
Proteintrennungsverfahren über
eine geeignete Säule
gereinigt werden. Eine weitere Möglichkeit
ist die Trennung auf einem PAGE Gel gefolgt von Western-Blotting.
Auf dem Western Blot wird das Flagellin eine spezifische Bande bilden,
die von den anderen Salmonella Proteinbanden getrennt ist und demzufolge
ebenso als gereinigt betrachtet wird. Ebenso kann eine reine Form
des Proteins durch Expression von Flagellinkodierenden Nukleinsäuresequenzen
erhalten werden.
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Prinzipiell
ist der einfachste Weg zur Herstellung eines solchen diagnostischen
Testsystems, die Verwendung von gereinigtem ganzen Flagellin wie
hierin zuvor erläutert.
Es ist jedoch sehr gut möglich
nur Teil des Flagellin zu verwenden. Dies unter der Massgabe, dass
das verwendete Fragment immer noch eine antigene Determinante des
Proteins umfasst. Alle antigenen Determinanten des Flagellin werden
gemäss
Definition Antikörper
induzieren. Deshalb wird die Verwendung eines Flagellin Fragmentes,
das sogar eine einzige antigene Determinante des Flagellin umfasst,
fähig sein
an anti-Flagellin Antikörper
zu binden.
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Ein
Test, der fähig
ist, zwischen Serum von nicht-infizierten, infizierten und geimpften
Menschen und Tieren zu unterscheiden, umfasst z. B. eine Vertiefung
A beschichtet mit Flagellin und eine Vertiefung B beschichtet mit
einem anderen Salmonella Immunogen oder möglicherweise ganze Salmonella
Zellen. Serum, das mit den Vertiefungen A und B reagiert, weist
auf eine Feldinfektion oder Impfung mit einem klassischem Impfstoff
hin, während
Serum, das nur mit der Vertiefung B reagiert, darauf hinweist, dass
das getestete Tier mit dem Markerimpfstoff geimpft wurde.
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BEISPIEL 1
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Der
Salmonella typhimurium Stamm STMP, ein attenuierter Stamm, der als
lebender Impfstoff in Geflügel
und Schweinen getestet wurde und gute Schutzniveaus bereitstellt,
wurde als Ausgangsmaterial für
die chemische Mutagenese verwendet.
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Chemische Mutagenese
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S.
typhimurium STMP wurde auf Blutagar-Medium gezüchtet und auf eine positive
O-Antigen Gruppe B Agglutination und H-Antigen Typ 2 Agglutination
geprüft.
Eine Kolonie wurde in LB Medium inokuliert und für 20 Std bei 37°C unter Belüftung inkubiert.
Zehn μl
der über
Nacht gehaltenen Kultur wurde in 10 ml LB verdünnt (3 Kulturen) und bei 37°C für 6 Std
unter Belüftung
inkubiert bis die Kultur eine O. D. bei 600 nm von 0.5 erreichte.
Eine Probe wurde entnommen, um die Zahl dem lebensfähigen Bakterien
zu bestimmen. Zu jeder der drei 10 ml Kulturen wurde 100 μl Trioxalen
(chemisches Mutagen von Sigma; 3 mg/ml in DMSO) hinzugegeben und
die Suspension wurde in eine 10 cm ⌀ Petrischale gegossen. Die
Suspension wurde mit U. V. (Transilluminator UVP; Wellenlänge 365
nm) für
5, 10 oder 15 Min in einer Distanz von 20 cm bestrahlt. Zehn μl wurden in
10 ml 0.9% NaCl übertragen,
1/10 Verdünnungen
wurden zubereitet und 100 μl
wurden auf Blutagar-Platten plattiert,
um die Überlebensrate
von Bakterien in mutierten Kulturen zu bestimmen. Kulturen mit Überlebensraten
von ungefähr
3% und 20% wurden in 100 ml LB bis zu einem OD bei 600 nm von 0.5
gezüchtet.
Die Bakterien wurden mittels Zentrifugation gesammelt, in 5 ml LB
resuspendiert und in 30% Glycerol bei –70°C aufbewahrt.
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Selektion für eine nicht-bewegliche,
nicht-flagellierte Mutante
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Die
mutierten Bakterien (3% Überleben;
zwischen 5'000 und
10'000 unabhängige Mutanten)
wurden vom Glyzerol Stocklösung
auf je 3 Blutagar-Platten inokuliert. Die Bakterien wurden in LB
ge sammelt und die OD bei 600 nm wurde auf 2.17 eingestellt. Sechs
10-fache Verdünnungen
wurden in LB gemacht und danach wurden 50 μl H2-Antiserum (Difco) zu 450 μl bakterieller
Suspension hinzugegeben. Dieser Selektionsschritt mit H-Antiserum
wurde miteingeschlossen, um die Mutanten-Suspension mit nicht-flagellierten
Bakterien anzureichern. Diese Suspension wurde bei 37°C für 6 Std
unter Rühren
(250 rpm) inkubiert und dann für
1 Min bei 1000 rpm in einer Eppendorf Minizentrifuge zentrifugiert,
um den Agglutinationskomplex zu entfernen. Vom Überstand wurden 1, 10 und 100 μl auf Blutagar-Platten
plattiert und bei 37°C
für 20
Std inkubiert.
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Resultate
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Identifizierung einer
nicht-beweglichen Mutante von S. typhimurium STMP
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Die
Selektion für
nicht-flagellierte Bakterien mittels Inkubation mit H2 Antiserum
führte
zu Wachstum von ungefähr
40 Kolonien auf Platten (106 Verdünnung),
die mit der Serum-behandelten Mutanten Suspension (3% Überleben)
inokuliert worden waren, während
keine Kolonien auf Platten (106 Verdünnung) wuchsen,
die mit der Serum-behandelten STMP Suspension inokuliert worden
waren. Dieses Resultat deutete darauf hin, dass Mutanten vorhanden
waren, die mit dem H2-Antiserum nicht agglutinierten, wobei diese
möglicherwiese nicht-flagelliert
sind.
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Die
40 Kolonien wurden mittels Lichtmikroskopie auf H2-Agglutination und
Motilität
getestet. Alle Mutanten waren negativ für H2-Agglutination, jedoch
schien wie mittels Lichtmikroskopie beobachtet nur eine Mutante
nicht-beweglich zu sein. Diese nicht-bewegliche Mutante war positiv
für die
Gruppe B O-Antigen
Agglutination. Die Mutante wurde STM2000 benannt.
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In vitro Stabilität von STM2000,
einer nicht-beweglichen Mutante von S. typhimurium STMP
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Die
phenotypische Stabilität
von STM2000 wurde mittels 12 in vitro Passagen auf Blutagar-Platten
getestet. Im selben Experiment wurde ebenso der Elternstamm, STMP,
12 mal passagiert. Diese Kulturen wurden mittels Lichtmikroskopie
beobachtet und alle Bakterien in der Mutanten-Kultur waren immer
noch nicht-beweglich.
STMP Bakterien waren beweglich, obwohl nicht alle Zellen denselben
Grad an Beweglichkeit zeigten. Ein elektronenmikroskopischer vergleich
von STMP und STM2000 bestätigte,
dass keine Flagella auf den mutanten Bakterien vorhanden waren.
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In vitro Stabilität von STM2001,
einer nicht-beweglichen Mutante von S. typhimurium STMP
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In
einem andersartigen Experiment wurde S. typhimurium SL3261 (Hinterlegungsnummer
SGSC 439, Salmonella Genetic Stock Centre, University of Calgary,
Alberta, Canada) chemisch mit NTG mutiert und nicht-bewegliche Mutanten
wurden wie hierin zuvor beschrieben selektiert. Eine Mutante, STM2001,
zeigte keine Reaktion mit einem Flagellin-spezifischen monoklonalen
Antikörper.
Nach 2D Protein Gelelektrophorese zeigte sich, dass STM2001 im Vergleich
zu seinem Elternstamm der Flagellin Punkt bei 51 kDa und pI 4.7
fehlte.
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Die
genetische Stabilität
dieses Stammes wurde durch Züchten
von mindestens 50 Generationen getestet. Nach dieser Zeitspanne
wurden immer noch keine Revertanten gefunden: alle Bakterien waren
nach wie vor nicht-beweglich.
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Der
Stamm STM2001 wurde beim Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS),
Oosterstraat 1, PO.Box 273, 3740 AG Baarn, Niederlande, unter der
Zugangsnummer CBS 108955 hinterlegt.
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BEISPIEL 2
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Experimentelles Design
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Impfstoffe
wurden von einem flagellierten und einem nicht-flagellierten S. enteritidis (S. e.)
Phagentyp 4 Stamm hergestellt. Die Bakterien wurden in Tryptosephosphat
Brühe kultiviert,
durch die Zugabe von Formalin zu einer Endkonzentration von 0.5%
inaktiviert, gefolgt von Ernten der bakteriellen Zellen mittels
Zentrifugation. Die Zellen wurden wieder in Phosphatpuffer Salzlösung suspendiert
und als Wasser-in-Öl-Emulsions-Impfstoffe
mit 5 × 109 Bakterien/ml formuliert. Fünf Hühner wurden
intramuskulär
mit dem S. e. fla+ Impfstoff injiziert und
5 Hühner
erhielten den S. e. fla– Impfstoff. Die Tiere
wurden mit 0.5 ml Impfstoff im Alter von 14 und 18 Wochen geimpft.
Im Alter von 22 Wochen wurde den Hühnern Blut entnommen und das
Serum wurde in einem doppelten Antikörper Sandwich Hemm-ELISA System
spezifisch für
Antikörper
gegen das g, m Flagellin von S. e. getestet (Zijderveld, F. G. van
et al. (1993) Vet. Quart. 15, 135–137).
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Tiere
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Kommerzielle
Hennen vom Typ Legehennen im Alter von ungefähr 14 Wochen wurden von einer
Salmonella-freien Herde erhalten.
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Resultate
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Alle
5 Hühner,
die den S. e. fla+ Impfstoff erhalten hatten,
serokonvertierten im g, m spezifischen ELISA (Prozent Hemmung > 60%), während die
5 Hühner,
die mit dem S. e. fla– Impfstoff geimpft wurden,
seronegativ blieben.
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BEISPIEL 3
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Experiment 1
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Experimentelles Design
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Zur
Einschätzung
der Sicherheit wurden Fleischhühner
oral (1 ml), subkutan (0.5 ml) und intramuskulär (0.5 ml) mit Flagella-positivem Salmonella
typhimurium Stamm STMP, Flagella-negativem Salmonella typhimurium
Stamm STM2000 oder Wildtyp S. typhimurium (Salmonella typhimurium)
inokuliert. Die Tiere wurden für
eine Woche nach der Inokulation beobachtet gefolgt von einer post-mortem Untersuchung
der überlebenden
Hühner.
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Tiere
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Kommerzielle
Fleischhühner
im Alter von drei Wochen wurden von einer Salmonella-freien Herde
erhalten.
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Resultate
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Nach
der Inokulation starben 8 der 10 Tiere, die das Wildtyp Salmonella
typhimurium erhalten hatten (Tabelle 1). Bei der Nekropsie hatten
die 2 überlebenden
Hühner,
die mit dem Wildtyp Stamm inokuliert worden waren, geschwollene
Leber mit nekrotischen Herden, geschwollenen Milzen und perikardiale Ödeme. Eines der
STMP inokulierten Hühner
hatte eine leicht geschwollene Leber und ein mit STM2000 inokuliertes
Huhn hatte eine leicht geschwollene Milz. Keine weitere Abnormalitäten wurden
in diesen zwei Gruppen beobachtet.
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Gruppen
mit verschiedenen hochgestellten Zeichen in einer Reihe sind verschieden
(p < 0.5, Fisher's exakter Test)
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Experiment 2
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Experimentelles Design
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Zur
Einschätzung
von sowohl Sicherheit wie auch Wirksamkeit wurden Fleischhühner im
Alter von 3 und 15 Tagen oral mit entweder STMP oder STM2000 inokuliert,
gefolgt von einer Challenge Infektion mit einem Tetrazyklin-resistenten
Wildtyp Salmonella typhimurium Stamm im Alter von 22 Tagen.
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Die
Sicherheit wurde durch klinische Beobachtung nach der Impfung und
Bestimmung der Gewichtszunahme eingeschätzt. Ebenso wurden nach 10
und 22 Tagen Tupferproben der Kloake entnommen, um das Vorhandensein
der Impfstoff-Stämme
im Verdauungstrakt zu bestimmen. Die Tupferproben wurden verwendet,
um Brilliant Green Agar (BGA) direkt und nach Anreicherung in Rappaport
Vassiliades Brühe
(RVB) zu inokulieren.
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Die
Tiere wurden für
eine Woche nach der Challenge Infektion beobachtet, gefolgt von
einer post-mortem Untersuchung der überlebenden Hühner. Die
Leber, Milzen, Tupferproben der Kloake und Tupferproben der Blinddarm-Inhalte
der überlebenden
geimpften Hühner
wurden für
den Challenge-Stamm durch direkte Inokulation auf Tetrazyklin-enthaltendem
BGA (BGAtet) kultiviert. Zusätzlich
wurden die Tupferproben in einem Voranreicherungsmedium (gepuffertes
Peptonwasser enthaltend Tetrazyklin) inkubiert, gefolgt von Plattieren auf
BGAtet.
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Tiere
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Kommerzielle
Fleischhühner
im Alter von drei Tagen wurden von einer Salmonella-freien Herde
erhalten.
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Resultate
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Keine
klinischen Abnormalitäten
wurden nach den oralen Impfungen im Alter von 3 und 15 Tagen beobachtet.
Ebenso unterschieden sich die durchschnittlichen Gewichtszunahmen
in den geimpften Gruppen nicht von der Kontrollgruppe (Tabelle 3).
Beide Stämme
waren in den Tupferproben der Kloake der geimpften Tiere, die 7
Tage nach der Inokulierung entnommen wurden, vorhanden (Tabelle
2). Die Tatsache, dass ein grösserer
Anteil der Hühner
in der STMP inokulierten Gruppe nach direktem Plattieren kulturpositiv
war, weist darauf hin, dass dieser Stamm den Verdauungstrakt in
grösseren
Zahlen kolonisiert als der STM2000 Stamm.
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Gruppen
mit verschiedenen hochgestellten Zeichen in einer Reihe sind verschieden
(p < 0.5, Fisher's exakter Test)
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Ein
Huhn in der STMP Gruppe starb nach der Challenge Infektion (7%),
verglichen mit keiner Mortalität in
der STM2000 Gruppe und 80% Mortalität in den nicht-geimpften Kontrollen
(Tabelle 3). Die überlebenden Hühner in
der Kontrollgruppe nahmen ebenso bedeutend weniger Gewicht zu als
die Geimpften. Die Gewichtszunahme der STM2000 geimpften Gruppe
nach der Challenge Infektion war bedeutend höher als die Gewichtszunahme
der STMP geimpften Gruppe.
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Gruppen
mit verschiedenen hochgestellten Zeichen in einer Reihe sind verschieden
(p < 0.5, Fisher's exakter Test (Mortalität) oder
Zwei-Proben T-Test (Gewichtszunahme))
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Wie
in Tabelle 4 aufgezeigt bestand kein Unterschied in den Resiolationsraten
des Challengeorganismus von der Milz und der Leber. Die Kolonisierung
im Verdauungstrakt, wie sie durch die Reisolation von Tupferproben
der Kloake und der Blinddarm-Inhalte
eingeschätzt
wurde, war in der mit STM2000 geimpften Gruppe bedeutend geringer.
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Gruppen
mit verschiedenen hochgestellten Zeichen in einer Reihe sind verschieden
(p < 0.5, Fisher's exakter Test)
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BEISPIEL 4
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Experimentelles Design
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Zur
Einschätzung
der Wirksamkeit wurden Schweine oral mit STMP (109.0 CFU)
oder STM2000 (109.0 CFU) inokuliert, gefolgt
von einer oralen Challenge Infektion mit einem Streptomycin-resistenten
Wildtyp Salmonella typhimurium Stamm (1011.0 CFU)
2 Wochen später.
Das Ausscheiden des Challenge-Stammes wurde durch Kultivieren fäkaler Proben
5 und 8 Tage nach dem Challenge gemessen. Ungefähr 5 Gramm Fäkalien wurden
in Peptonwasser gelegt und für
2 Stunden inkubiert. Danach wurden zehnfache Serienverdünnungen in
Streptomycin enthaltendem RVB Medium ausgeführt, über Nacht inkubiert, gefolgt
von Plattieren in Streptomycin enthaltender Tryptosephosphat Brühe. Die
maximale Verdünnung,
die den Challenge Stamm enthielt, wurde verwendet, um den Reisolations-Wert
(reziprok der maximalen positiven Verdünnung) berechnet.
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Acht
STMP geimpfte Schweine und 8 nicht-geimpfte Kontrollen wurden in
einem ersten Experiment verwendet. In einem zweiten Experiment wurden
9 Schweine mit STM2000 geimpft und 9 nicht-geimpfte Kontrollen verwendet.
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Tiere
-
Sechs
Wochen alte SPF Schweine wurden in beiden Experimenten verwendet.
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Resultate
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Wie
in Tabelle 5 aufgezeigt waren beide Impfstoff-Stämme fähig, fäkales Ausscheiden des Challenge-Stammes
bedeutend zu reduzieren.
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Gruppen
mit verschiedenen hochgestellten Zeichen sind verschieden (p < 0.5, Mann-Whitney
U-Test)
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Legende zu
den Figuren
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1:
Proteinprofil Analyse von STM2000 und dessen Elternstamm S. typhimurium
STMP. Bahnen 1, 11 und 12 Molakulargewichtsmarker wie angegeben;
Bahnen 2, 5 und 8, S. typhimurium STMP 12 × auf Blutagar Medium passagiert;
Bahnen 4, 7 und 10, STM2000 2 × auf
Blutagar Medium passagiert. Bahnen 2, 3 und 4, totales Proteinprofil;
Bahnen 5, 6 und 7, Pellet nach Sonikation und Zentrifugation; Bahnen
8, 9 und 10, Überstand
nach Sonikation und Zentrifugation. Proteine wurden mit Coomassie
Brilliant Blue gefärbt.
-
2: Photographien von elektronmikroskopischer
Untersuchung von S. typhimurium STMP (A) und dessen nicht-beweglicher
Mutante STM2000 (B).