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Die
vorliegende Erfindung betrifft abgeschwächte Bakterien, die in Impfstoffen
nützlich
sind.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Hinter
dem Impfen steht das Prinzip, dem zufolge eine Immunreaktion im
Wirt herbeigeführt
werden soll, um auf diese Weise Schutz vor späteren Herausforderungen durch
ein Pathogen bereitzustellen. Dies kann durch Einimpfung mit einem
lebenden abgeschwächten
Stamm des Pathogens erreicht werden, d. h. mit einem Stamm, der
eine reduzierte Virulenz aufweist, so dass er nicht die von dem
virulenten Pathogen verursachte Erkrankung auslöst.
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Klassicher
Weise werden lebende abgeschwächte
Impfstoffstämme
von Bakterien und Viren unter Anwendung einer von zwei unterschiedlichen
Methoden ausgewählt.
Mutanten werden entweder durch die Behandlung des Organismus unter
Verwendung von mutagenen chemischen Verbindungen oder durch wiederholtes Überimpfen
des Organismus in vitro erzeugt. Die Verwendung dieser Methoden
führt jedoch
zu abgeschwächten
Stämmen,
in denen der Abschwächungsmodus
unklar ist. Diese Stämme
sind in Bezug auf mögliche
Reversion zum Wildtyp-Stamm besonders schwer zu charakterisieren,
da die Abschwächung
einzelne (leicht reversible) oder mehrere Mutationsereignisse widerspiegeln
kann. Darüber
hinaus ist es aufgrund von mehrfachen Mutationsereignissen schwierig,
solche Stämme
mit optimalen immunogenen Eigenschaften zu erhalten, und es kann
notwendig sein, mehrere Stämme
zu verwenden, um einen Schutz gegen das Pathogen bereitzustellen.
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Unter
Anwendung moderner Gentechniken ist es nun möglich, definierte abgeschwächte bakterielle Stämme gentechnisch
herzustellen, bei denen stabile abschwächende Deletionen erzeugt werden
können. Eine
Reihe von stellengerichteten Salmonella-Mutanten wurden unter Verwendung
dieser Art von Technologie (2, 4, 5, 9, 12, 16, 17, 18) hergestellt.
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Es
wurde von Mutationen einer großen
Anzahl an Genen berichtet, dass sie abschwächend wirken, einschließlich der
aro-Gene (z. B. aroA, aroC, AroD und aroE), pur, htrA, ompR, ompF,
ompC, galE, cya, crp und phoP.
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Salmonella-aroA-Mutanten
wurden nun gut charakterisiert, und es wurde gezeigt, dass sie hervorragende
Lebendimpfstoffe gegen Salmonellose in verschiedenen Tierarten sind.
Außerdem
wurden, um die Wahrscheinlichkeit einer Reversion zu Virulenz durch
ein Rekombinationsereignis zu verringern, Mutationen in zwei unabhängige Gene,
wie z. B. aroA/purA und aroA/aroC, eingeführt. Identische Mutationen
in wirtsadaptierten Salmonella-Stämmen, wie S. typhi (Mensch)
und S. dublin (Rind), haben ebenfalls zur Erzeugung einer Reihe
von Kandidaten-Einzeldosisimpfstoffen
geführt,
welche sich in klinischen (8, 11) Versuchen und in Feldversuchen
(10) als erfolgreich erwiesen haben.
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Ein
Salmonella-Typhimurium-Stamm, der stabile Mutationen sowohl in ompC
als auch ompF enthält, wird
in Chatfield et al (1991, Ref. 21) beschrieben. Bei oraler Verabreichung
an BALB/c-Mäuse
wurde der Stamm abgeschwächt,
wobei die 50% tödliche
Dosis (LD50) um ungefähr
das 1000-fache reduziert wurde. Die intravenöse LD50 wurde jedoch nur um
ungefähr
das 10-fache reduziert, was zeigt, wie wichtig Porin ist, wenn es
darum geht, auf die Bakterien die Fähigkeit zu übertragen, auf dem oralen Weg
zu infizieren.
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Die
Expression der ompC-Gene und der ompF-Gene wird durch ompR reguliert.
Pickard et al (1994, Ref. 13) beschreibt das Klonen von ompR-Operon,
umfassend ompR- und envZ-Gene,
aus einer Salmonella-Typhi-Ty2-Cosmidbank und Charakterisierung
durch eine DNA-Sequenz-Analyse. Die Daten der DNA-Sequenz wurden
verwendet, um geeignete Restriktionsstellen für das Erzeugen einer definierten
Deletion von 517 bp innerhalb des offenen Leserahmens des ompR-Gens
festzustellen. Diese Deletion wurde durch homologe Rekombination
in die Chromosomen von zwei S.typhi-Stämmen eingeführt, die bereits definierte
Deletionen sowohl in den aroC- als auch den aroD-Genen enthielten.
Die S.typhi-ompR-Mutanten wiesen eine deutliche Verringerung bei
der ompC- und ompF-Porinexpression auf, so wie durch Prüfung der
Außenmembranzubereitungen
nachgewiesen. Es wurde ferner gezeigt, dass das ompR-envZ-Zweikomponenten-Regulationssystem
eine wichtige Rolle bei der Regulierung von Vi-Polysaccharidsynthese
in S. typhi spielt.
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In
Tierstudien wurde abgeschwächtes
S. typhimurium als Vehikel für
die Zufuhr von heterologen Antigenen zum Immunsystem (3, 6, 15)
verwendet. Dadurch wird das Potenzial der Entwicklung von mehrwertigen Impfstoffen
zur Verwendung im Menschen (7) erhöht.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung stellt ein Bakterium bereit, das durch eine nicht-revertierende
Knock-out-Mutation in jedem von dem aroC-Gen, dem ompf-Gen und dem
ompC-Gen abgeschwächt
wird, wobei das Bakterium von der Gattung Escherichia, Salmonella,
Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia, Bordetella oder Brucella
ist. Die Erfindung stellt auch einen Impfstoff bereit, welcher das
Bakterium enthält.
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Es
wird angenommen, dass die aroC/ompF/ompC-Kombination von Mutationen
einen Impfstoff mit besseren Eigenschaften ergibt. Zum Beispiel
wird angenommen, dass die aroC/ompF/ompC-Kombination aus zwei Gründen besser
als eine aroC/ompR-Kombination ist:
- 1. Die
ompr-Mutation kann zu höheren
Abschwächungswerten
führen
als die ompF/ompC-Kombination von Mutationen, weil ompR – abgesehen
von ompF und ompC – eine
Reihe von Genen regulieren kann, die für das Überleben des Bakteriums in vivo
wichtig sind. Somit kann die ompF/ompC-Kombination dem Bakterium
ermöglichen,
in dem geimpften Wirt über
einen längeren
Zeitraum hinweg und mit höheren
Werten zu überleben,
was zu einem besseren Schutz führt.
- 2. Die ompR-Mutation kann im Vergleich zur ompF/ompC-Mutationskombination
reduzierte Immunogenizität
verursachen, da ompR die Expression von Antigenen regulieren kann,
die für
die Immunogenizität
wichtig sind.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Für die Erfindung
nützliche
Bakterien
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Die
Bakterien, die verwendet werden, um die Impfstoffe der Erfindung
herzustellen, sind im Allgemeinen solche, welche auf oralem Wege
infizieren. Es kann sich dabei um Bakterien handeln, die in eukaryotische Zellen
eindringen und innerhalb dieser wachsen und/oder Schleimhautoberflächen kolonisieren.
Die Bakterien sind im Allgemeinen gramnegativ.
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Die
Bakterien können
von folgenden Arten sein: Escherichia, Salmonella, Vibrio, Haemophilus,
Neisseria, Yersinia, Bordetella oder Brucella. Beispiele für solche
Bakterien sind Escherichia coli – eine Ursache von Durchfall
bei Menschen; Salmonella typhimurium – die Ursache von Salmonellose
bei verschiedenen Tierarten; Salmonella typhi – die Ursache von Typhus beim
Menschen; Salmonella enteritidis – eine Ursache von Nahrungsmittelvergiftungen
bei Menschen; Salmonella choleraesuis – eine Ursache von Salmonellose
bei Schweinen; Salmonella dublin – eine Ursache einer systemischen
Erkrankung und Durchfallerkrankung beim Rind, insbesondere bei neugeborenen
Kälbern;
Haemophilus influenza – eine
Ursache von Meningitis; Neisseria gonorrhoeae – eine Ursache von Gonorrhoaeae;
Yersinia enterocolitica – die
Ursache eines Spektrums von Erkrankungen bei Menschen, das von Gastroenteritis
bis zu tödlicher
septikämischer
Erkrankung reicht; Bordetella pertussis – die Ursache von Keuchhusten;
und Brucella abortus – eine
Ursache von Fehlgeburt und Unfruchtbarkeit bei Rindern und eines
Zustands, der bei Menschen als undulierendes Fieber bekannt ist.
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Stämme von
E. coli und Salmonella sind bei der Erfindung besonders nützlich.
Abgesehen davon, dass sie an sich Impfstoffe gegen die Infektion
durch Salmonella sind, können
abgeschwächte
Salmonella als Träger
von heterologen Antigenen aus anderen Organismen zum Immunsystem über den
oralen Weg verwendet werden. Salmonella sind mächtige Immunogene und in der
Lage, systemische und lokale zellulare und Antikörperreaktionen zu stimulieren.
Systeme zum Vorantreiben der Expression von heterologen Antigenen
in Salmonella in vivo sind bekannt; zum Beispiel ist bekannt, dass
die nirB- und htrA-Promotoren die Antigenexpression in vivo effizient
vorantreiben.
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Die
Erfindung kann auf enterotoxigene E. coli („ETEC") angewendet werden. ETEC ist eine Klasse
von E. coli, die Durchfall verursacht. Sie kolonisieren den proximalen
Dünndarm.
Ein standardmäßiger ETEC-Stamm
ist ATCC H10407.
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Infektionen
von ETEC sind die häufigste
Einzelursache für
Reisedurchfall, wobei jährlich
drei bis neun Millionen Fälle
bei Besuchern in Entwicklungsländern
auftreten. In endemischen Gebieten sind ETEC-Infektionen eine bedeutende
Ursache für
dehydrierenden Durchfall bei Säuglingen
und kleinen Kindern, was pro Jahr zu 800.000 Todsfällen weltweit
bei den Unter-Fünfjährigen führt. In
Entwicklungsländern
nimmt die Häufigkeit von
ETEC-Infektionen,
die zu einer klinischen Erkrankung führen, mit dem Alter ab, was
darauf hinweist, dass eine Immunität gegenüber einer ETEC-Infektion erworben
werden kann. Im Gegensatz dazu sind naive Erwachsene aus Industrieländern, die
endemische Gebiete besuchen, für
ETEC-Infektionen höchst
anfällig. Durch
längere
oder wiederholte Besuche in endemischen Gebieten nimmt die Anfälligkeit
für ETEC-Infektionen
jedoch ab, was darauf hinweist, dass sich eine Vorgangsweise mit
einem abgeschwächten
Lebendimpfstoff bei der ETEC-Impfung als erfolgreich erweisen kann.
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Die
Erfinder haben beschlossen, sich mit einem nichttoxigenen Stamm
von ETEC zu beschäftigen,
der als E1392/75/2A bezeichnet wird. E1392/75/2A ergab sich spontan
aus einem toxischen Mutanten durch Deletion von Toxingenen. In Studien
mit Menschen ergab eine orale Impfung mit Lebend-E1392/75/2A 75% Schutz
vor einer Herausforderung mit toxinexprimierenden ETEC aus einem
anderen Serotyp. Bei ungefähr 15%
der geimpften Personen trat jedoch Durchfall als Nebenwirkung des
Impfstoffes auf. Der Stamm muss weiter abgeschwächt werden, um die Nebenwirkungen
zu reduzieren, bevor er als potenzieller Impfstoff in Betracht gezogen
werden kann, und die Erfindung stellt ein Mittel zur Erreichung
dieser Abschwächung
bereit.
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Seq.
Id. Nr. 1 zeigt die Sequenz des E.coli aroC-Gens, Seq. Id. Nr. 3
zeigt die Sequenz des E.coli ompC-Gens und Seq. Id. Nr. 5 die Sequenz
des E.coli ompF-Gens.
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Weitere Mutationen
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Eine
oder mehrere weitere Mutationen können in die Bakterien der Erfindung
eingeführt
werden, um Stämme
zu erzeugen, die Mutationen zusätzlich
zu jenen in aroC, ompC und ompF enthalten. Eine solche weitere Mutation
kann eine (i) abschwächende
Mutation in einem Gen sein, das nicht aroC, ompC und ompF ist, (ii)
eine Mutation, um eine in-vivo-Selektion
für Zellen
bereitzustellen, wobei ein Plasmid beibehalten wird (z. B. ein Plasmid,
das ein heterologes Antigen exprimiert) oder (iii) eine Mutation,
um die Expression eines Toxingens zu vermeiden.
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Die
weitere abschwächende
Mutation kann eine Mutation sein, von der bereits bekannt ist, dass
sie abschwächend
ist. Zu solchen Mutationen zählen
Mutationen in aro-Genen (z. B. aroA, aroD und aroE), pur, htrA,
ompR, galE, cya, crp, phoP und surA (siehe z. B. Referenzen 2, 4,
5, 9, 12, 13, 16, 17 und 18).
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Eine
Mutation zur Bereitstellung einer Selektion zum Beibehalten eines
Plasmids kann dadurch erfolgen, dass ein Gen mutiert wird, das notwendig
ist, damit das Bakterium überlebt.
Ein Plasmid, welches das notwendige Gen trägt, wird dann in das Bakterium
eingeführt,
so dass nur Zellen überleben
können,
welche das Plasmid tragen. Das kann in Fällen nützlich sein, in denen das Plasmid
zum Beispiel ein heterologes Antigen enthält, das vom Bakterium exprimiert
werden soll.
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Eine
Mutation zur Vermeidung der Expression eines Toxingens kann durchgeführt werden,
um etwaige Nebenwirkungen zu verringern, die durch Impfung mit dem
Bakterium hervorgerufen werden. Zum Beispiel kann es im Fall einer
Impfung mit E.coli-Stämmen
wie ETEC wünschenswert
sein, die Gene von hitzelabilem Toxin (LT) oder hitzestabilem Toxin
(ST) zu mutieren, so dass sie nicht exprimiert werden.
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Die Natur
der Mutationen
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Die
in den bakteriellen Impfstoff eingeführten Mutationen führen zu
einem vollständigen
Knockout der Funktion des Gens. Das kann erreicht werden, indem
entweder die Synthese eines beliebigen Polypeptids von dem Gen aufgehoben
wird, oder indem eine Mutation durchgeführt wird, die zur Synthese
von nicht-funktionellem Polypeptid führt. Um die Synthese von Polypeptid
aufzuheben, kann entweder das gesamte Gen oder sein 5'-Ende deletiert werden.
Eine Deletion oder Insertion innerhalb der Codierungssequenz eines
Gens kann verwendet werden, um ein Gen zu erzeugen, das nur nicht-funktionelles
Polypeptid synthetisiert (z. B. Polypeptid, das nur die N-terminate
Sequenz des Wildtyp-Proteins enthält).
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Bei
den Mutationen handelt es sich um nicht-revertierende Mutationen.
Dies sind Mutationen, die im Wesentlichen keine Reversion zum Wildtyp
zurück
zeigen, wenn das Bakterium als Impfstoff verwendet wird. Solche
Mutationen enthalten Insertionen und Deletionen. Insertionen und
Deletionen sind vorzugsweise groß, weisen typischer Weise eine
Länge von
mindestens 10 Nukleotiden auf, zum Beispiel eine Länge von
10 bis 600 Nukleotiden. Vorzugsweise wird die gesamte Codierungssequenz
deletiert.
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Das
in dem Impfstoff verwendete Bakterium enthält vorzugsweise nur definierte
Mutationen, d. h. Mutationen, die charakterisiert sind. Es ist jedenfalls
nicht wünschenswert,
ein Bakterium als Impfstoff zu verwenden, das nicht charakterisierte
Mutationen in seinem Genom aufweist, da dadurch das Risiko bestehen
würde, dass
die nicht charakaerisierten Mutationen auf das Bakterium Eigenschaften. übertragen,
die unerwünschte Nebenwirkungen
auslösen.
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Die
abschwächenden
Mutationen können
durch Methoden eingeführt
werden, die Fachleuten wohl bekannt sind (siehe Referenz 14). Zu
geeigneten Methoden gehören
die Klonierung der DNA-Sequenz des Wildtyp-Gens in einen Vektor,
z. B. ein Plasmid, und das Einfügen
eines selektierbaren Markers in die klonierte DNA-Sequenz oder das
Deletieren eines Teils der DNA-Sequenz, was zu ihrer Deaktivierung
führt.
Eine Deletion kann zum Beispiel durch Schneiden der DNA-Sequenz
unter Verwendung von Restriktionsenzymen durchgeführt werden,
welche an zwei Punkten in oder knapp außerhalb der Codierungssequenz
schneiden und die zwei Enden in der verbleibenden Sequenz miteinander
verbinden. Ein Plasmid, das die deaktivierte DNA-Sequenz trägt, kann
durch bekannte Techniken, wie Elektroporation und Konjugation, in
das Bakterium transformiert werden. Danach ist es möglich, durch
geeignete Auswahl einen Mutanten zu identifizieren, wobei die deaktivierte
DNA-Sequenz in das Chromosom des Bakteriums rekombinierte und die
Wildtyp-DNA-Sequenz durch homologe Rekombination nicht-funktionell
gemacht wurde.
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Expression
von heterologen Antigenen
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Das
abgeschwächte
Bakterium der Erfindung kann genetisch hergestellt werden, um ein
Antigen zu exprimieren, das nicht durch das native Bakterium (ein „heterologes
Antigen") exprimiert
wird, so dass das abgeschwächte
Bakterium als Träger
des heterologen Antigens wirkt. Das Antigen kann von einem anderen
Organismus stammen, so dass der Impfstoff Schutz vor dem anderen
Organismus bietet. Ein mehrwertiger Impfstoff kann erzeugt werden,
der nicht nur Immunität
vor dem virulenten Elternteil des abgeschwächten Bakteriums, sondern auch
Immunität
vor dem anderen Organismus bietet. Ferner kann das abgeschwächte Bakterium
hergestellt werden, um mehr als ein heterologes Antigen zu exprimieren,
wobei in diesem Fall die heterologen Antigene aus demselben Organismus
oder aus unterschiedlichen Organismen stammen können.
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Das
heterologe Antigen kann ein vollständiges Protein oder ein Teil
eines Proteins sein, das ein Epitop enthält. Das Antigen kann aus einem
anderen Bakterium, einem Virus, einer Hefe oder einem Pilz stammen. Insbesondere
kann die antigene Sequenz aus E.coli (z. B. ETEC), Tetanus, dem
Hepatitis-A-, Hepatitis-B- oder Hepatitis-C-Virus, dem menschlichen
Rhinovirus, wie Typ 2 oder Typ 14, Herpex-Simplex-Virus, Poliovirus
Typ 2 oder 3, Maul-und-Klauenseuchen-Virus, Influenza-Virus, Coxsackie-Virus
oder Chlamydia trachomatis stammen. Zu nützlichen Antigenen zählen nicht-toxische
Komponenten von E.coli hitzelabilem Toxin, E.coli K88-Antigene,
ETEC-Kolonisierungsfaktorantigene,
P.69-Protein aus B.pertussis und Tetanustoxinfragment C.
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Die
ETEC-Kolonisierungsfaktoren und Komponenten davon sind erstrangige
Kandidaten für
die Expression als heterologe Antigene. Um eine Durchfallerkrankung
auszulösen,
müssen
pathogene ETEC-Stämme
in der Lage sein, den Darm zu kolonisieren und Enterotoxine zu entwickeln.
Für die
meisten ETEC-Stämme wurden
Kolonisierungsfaktoren (CF) identifiziert, die für die Adhäsion an der Darmschleimhaut
erforderlich sind. In beinahe allen Fällen werden CFs als Fibrae
auf der Außenfläche der
Bakterien exprimiert. Eine große Anzahl
an CFs wurde identifiziert, wobei die häufigsten CFAI, CRAII (einschließlich CS1,
CS2, CS3) und CFAIV (einschließlich
CS4, CS5, CS6) sind.
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Ein
ETEC-Impfstoff bietet idealer Weise Schutz vor einer Reihe von Kolonisierungsfaktorantigenen, um
sicherzustellen, dass ein Schutz vor verschiedenen Stämmen erzielt
wird. Um dies zu erreichen, wäre
es möglich,
mehrere Kolonisierungsfaktoren in einem Stamm zu exprimieren. Alternativ
dazu könnten
dieselben Abschwächungen
in einer Reihe von unterschiedlichen ETEC-Stämmen
gemacht werden, jeweils mit einem anderen Kolonisierungsfaktor.
Dies würde
das Deletieren der Toxine aus diesen Stämmen beinhalten.
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Die
DNA, welche das heterologe Antigen codiert, wird aus einem Promotor
exprimiert, der in vivo aktiv ist. Zwei Promotoren, bei denen sich
gezeigt hat, dass sie gut in Salmonella wirken, sind der nirB-Promotor (19,
20) und der htrA-Promotor (20). Für die Expression der ETEC- Kolonisierungsfaktorantigene
könnten
die Wildtyp-Promotoren
verwendet werden.
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Ein
DNA-Konstrukt, das den Promotor umfasst, der wirkungsmäßig mit
der DNA verbunden ist, welche das heterologe Antigen codiert, kann
hergestellt und in das abgeschwächte
Bakterium unter Anwendung herkömmlicher
Techniken transformiert werden. Transformanten, die das DNA-Konstrukt
enthalten, können
zum Beispiel durch die Suche nach einem selektierbaren Marker auf
dem Konstrukt ausgewählt
werden. Bakterien, welche das Konstrukt enthalten, können in
vitro vermehrt werden, bevor sie für die Verabreichung an den
Wirt zu Impfzwecken formuliert werden.
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Formulierung
des Impfstoffes
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Der
Impfstoff kann unter Anwendung bekannter Techniken zum Formulieren
von abgeschwächten bakteriellen
Impfstoffen formuliert werden. Der Impfstoff wird vorteilhafter
Weise zur oralen Verabreichung bereitgestellt, zum Beispiel in einer
gefriergetrockneten eingekapselten Form. Solche Kapseln könne mit
einer enterischen Schicht versehen werden, die zum Beispiel Eudragate „S" (Warenzeichen),
Eudragate „L" (Warenzeichen),
Zelluloseacetat, Zellulosephthalat oder Hydroxypropylmethylzellulose
umfasst. Diese Kapseln können
als solche verwendet werden, oder das gefriergetrocknete Material
kann alternativ vor der Verabreichung rekonstituiert werden, z.
B. als Suspension. Die Rekonstitution wird vorteilhafter Weise in
einem Puffer mit einem geeigneten pH-Wert durchgeführt, um
die Überlebensfähigkeit
der Bakterien zu gewährleisten.
Um die abgeschwächten
Bakterien und den Impfstoff vor der Magensäure zu schützen, wird vor jeder Verabreichung des
Impfstoffes vorteilhafter Weise ein Natriumbikarbonatpräparat verabreicht.
Alternativ dazu kann der Impfstoff für eine parenterale, intranasale
oder intramuskuläre
Verabreichung zubereitet werden.
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Der
Impfstoff kann zum Impfen eines Säugerwirts verwendet werden,
insbesondere eines menschlichen Wirts, aber auch eines tierischen
Wirts. Eine durch einen Mikroorganismus, insbesondere ein Pathogen, ausgelöste Infektion,
kann daher dadurch verhindert werden, dass eine wirksame Dosis eines
Impfstoffes verabreicht wird, der gemäß der Erfindung hergestellt
wird. Die angewendete Dosierung liegt letztendlich im Ermessen des
Arztes, wird aber von verschiedenen Faktoren abhängen, einschließlich der
Größe und des
Gewichts des Wirts und des Typs des formulierten Impfstoffes. Eine
Dosierung, welche die orale Verabreichung von 107 bis
1011 Bakterien pro Dosis umfasst, kann jedoch
für einen
erwachsenen menschlichen Wirt, der 70 kg schwer ist, geeignet sein.
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Beispiele
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Die
in diesem Abschnitt beschriebenen Beispiele dienen der Veranschaulichung
der Erfindung.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
ein System zur Konstruktion von definierten Deletionen in Ziel-Genen
unter Verwendung des Spleiß-Vorgangs
durch Überlappungsextensions-PCR-Mutagenese.
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2 zeigt
die erwarteten Sequenzen von Ziel-Genen nach der Rekombination und
Selektion für
Deletionen.
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3 zeigt
die Klonierung von Deletionskassetten in das Plasmid pCVD442.
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4 zeigt
eine SDS-PAGE-Analyse von Außenmembranen,
die aus ETEC-Stämmen
unter Bedingungen mit niedriger (L-Brühe
ohne Salz) und hoher (L-Brühe
ohne Salz + 15 Sucrose) Osmolarität zubereitet werden. M = Marker;
Probe 1 = PTL010; Probe 2 = PTL002; Probe 3 = PTL003; Probe 4 = ΔaroCΔompC; Probe 5
= ΔompF.
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5 zeigt
die Expression von CS1 und CS3 in Deletionsstämmen nach der Vermehrung auf CFA-Agar.
Gleiche Mengen von Zellen aus jedem Stamm wurden auf ein 15 SDS-PAGE-Gel
geladen und mit monospezifischen anti-CS1 oder anti-CS3 polycionalen
Antikörpern
einem Western-Blotting-Verfahren
unterzogen. Kontrollgruppen für
die Antikörperspezifizität waren
ganze ces11-Lysate von TG1-Zellen,
welche das Haupt-Pilinprotein von CS1 oder gereinigtes Haupt-Pilinprotein
aus CS3 exprimieren. Lane M, Regenbogen-Marker mit niedriger Molekularmasse;
Lane 1, induzierte TG1-Zellen mit pKK223; Lane 2, induzierte TG1-Zellen
mit pKKCs1; Lane 3 CS1-ETEC-Stamm; Lane 4 PTL010; Lane 5 PTL001;
Lane 6 PTL002; Lane 7 PTL003; Lane 8 gereinigtes CS3 Haupt-Pilinprotein.
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6 zeigt
ein Southern Blot von mutanten Loci. Chromosomale DNA wurde aus
dem Wildtyp-ETEC (E1392/75-2A),
PTL001 (htrA aroC), PTL002 (aroC ompR) und PTL003 (aroC ompC ompF)
wie angeführt
extrahiert, mit Restriktionsendonuklease EcoRV digeriert und gepulst
feldelektrophoresiert durch 1% Agarose. DNA wurde aus dem Gel auf
Hybond N+ Nylonmembrane (Amersham) geblottet und mit DNA-Sonden
hybridisiert, die aus aroC, htrA, ompR, ompC oder ompF Loci wie
dargestellt gewonnen wurden. Die Bandenmuster sind mit den mutanten
Loci, die Deletionen sind, konsistent.
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7 zeigt
die IgA-Reaktionen bei Freiwilligen, die einen Impfstoff gemäß der Erfindung
verabreicht bekommen haben.
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BEISPIEL 1: KONSTRUKTION
UND STAMMCHARAKTERISIERUNG GEMÄSS
DER ERFINDUNG
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Design von Deletionen
und Konstruktion von Plasmiden pCVDΔAroC, pCVDΔOmpC und pCVDΔOmpF
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Es
wurden Deletionen gestaltet, um den gesamten offenen Leserahmen
des Zielgens zu entfernen. Unter Verwendung der E.coli-Genomsequenz
als Template wurden PCR-Primer entwickelt, um Fragmente von 500–600 Basenpaaren
zu verstärken,
welche den offenen Ziel-Leserahmen flankieren (siehe Tabelle 1 bezüglich Primersequenz).
Das Spleißen
durch Überlappungsextension
unter Verwendung von PCR wurde verwendet, um die zwei flankierenden
Sequenzen zu fusionieren, wodurch ein PCR-Produkt erzeugt wurde,
bei dem das gesamte Gen deletiert ist (1). Die
Wildtyp-Sequenzen
um die Deletionsstelle herum und die vorausgesagten Sequenzen nach
der Deletion werden in 2 dargestellt.
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Für jedes
Gen wurden zwei unterschiedliche Restriktionsstellen in die Spleißregion
eingeführt
(siehe Tabelle 2 unten). Diese wurden für das Identifizieren von Deletionsklonen
verwendet. Die PCR-Primer an jedem Ende des PCR-Fragmentes führten einzigartige
Restriktionsstellen ein, welche verwendet wurden, um das Fragment
in die mehrfache Klonierungsstelle von pCVD442 zu klonieren (3).
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PCR-Produkte
wurden unter Verwendung eines Quiagen (Warenzeichen)-Gel-Extraktionskits
gelgereinigt und mit den relevanten Restriktionsenzymen vor dem
Verbinden mit dem Suizid-Plasmid pCVD442(22) digeriert, das mit
demselben Enzym digeriert ist, und mit Alkalinphosphatase behandelt,
um Vektorenselbstverbindung zu verhindern (3). Der
Verbindungsmix wurde in SY327λpir
transformiert und auf L-Ampicillin (100 μg/ml)-Platten plattiert. Plasmide
aus Ampicillin-resistenten Transformanten wurden auf die Gegenwart von
Deletionskassetten mit Hilfe der Restriktionsdigestion untersucht.
Folgende Plasmide wurden erzeugt:
pCVDΔAroC
pCVDΔOmpC
pCVDΔOmpF
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Das
Suizidplasmid kann nur in Zellen replizieren, die das pir-Gen enthalten.
Beim Einführen
in nicht-pri-Stämme
ist pCVD442 nicht in der Lage, zu replizieren, und die Ampicillin-Resistenz,
die durch das Plasmid übertragen
wird, kann nur aufrechterhalten werden, wenn das Plasmid in das
Chromosom durch ein einzelnes homologes Rekombinationsereignis integriert
wird. Das Plasmid weist auch ein sacB-Gen auf, das Levansucrase
codiert, die für
gramnegative Bakterien in der Gegenwart von Sucrose toxisch ist.
Das kann dazu verwendet werden, um Klone auszuwählen, die einem zweiten Rekombinationsereignis
unterzogen wurden, bei dem das Suizidplasmid herausgeschnitten wird.
Solche Zellen sind gegenüber
Sucrose resistent, aber Ampicillin-empfindlich.
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Konstruktion und Charakterisierung
des ΔAroCΔOmpCΔOmpF-Stamms
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Dieser
Abschnitt erläutert
die Chronologie für
die Konstruktion sowie die Geschichte eines ΔAroCΔOmpCΔOmpF-Stammes. In diesem Abschnitt bezieht
sich „ETEC" insbesondere auf
den Stamm E1392/75/2A oder seine Derivate.
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ΔAroCΔOmpCΔOmpF-Deletionen
wurden in E1392/75/2A in folgender Reihenfolge eingeführt:
ΔAroC-ΔAroCΔOmpC-ΔAroCΔOmpCΔOmpF
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Konstruktion von ETECΔAroC
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- 1) E1392/75/2A aus ursprünglichem Mikrobank-Stock wurde
auf L-Agar plattiert.
- 2) Elektroporationskompetente Zellen wurden aus diesen Zellen
hergestellt. 100 μl
Aliquote wurden gefroren.
- 3) pCVDΔAroC
wurde aus SY327pir-Zellen unter Verwendung eines Oiagen-Quiafilter
(Warenzeichen) Midiprep gereinigt. Das Plasmid wurde ungefähr 10-fach
durch Ethanolpräzipitation
konzentriert. Die Konstruktion von pCVDΔAroC wird oben beschrieben.
- 4) 5 μl
konzentriertes Plasmid wurden mit 100 μl entfrosteten Zellen vermischt
und elektroporiert. Die gesamte Transformation wurde auf eine L-Ampicillin-Platte
(50 μg/ml)
plattiert und über
Nacht bei 37°C
inkubiert.
- 5) Eine einzelne ampicillinresistente Kolonie wuchs heran.
- 6) Die Kolonie wurde auf eine L-Ampicillin-Platte (100 μg/ml) ausgestrichen
und über
Nacht bei 37°C
vermehrt („Merodiploidplatte").
- 7) PCR unter Verwendung der Primer TT19 und TT20 (spezifisch
für das
aroC-Gen) und eine Kolonie, die aus der Merodiploidplatte ausgewählt wurde,
amplifizierten zwei Banden, mit Größen, die jener des Wildtyps
und der ΔaroC-Gene
entsprechen. Die Sequenzen der Primers werden in Tabelle 1 unten
dargestellt.
- 8) Eine Kolonie aus der Merodiploidplatte wurde über einen
Zeitraum von 7 Stunden in a) einer L-Ampicillinbrühe (100 μg/ml) und b) einer L-Brühe vermehrt.
Die auf L-Ampicillin vermehrte Kolonie wurde in einer Mikrobank
aufbewahrt.
- 9) Serielle Verdünnungen
der L-Brühenkultur
wurden eingerichtet auf:
- a) L-Agar ohne Salz
- b) L-Agar ohne Salz + 5% Sucrose.
Die Platten wurden über Nacht
bei 30°C
inkubiert.
- 10) Die Koloniezahlen zeigten, dass 104 mehr
Kolonien auf L-Agar als auf L-Agar + 5% Sucrose gewachsen sind,
was zeigte, dass die Sucroseselektion funktionierte.
- 11) Sucroseresistente Kolonien wurden auf die Gegenwart von ΔaroC-Gen
durch PCR untersucht. Die für die
Untersuchung ausgewählten
Kolonien wurden auf eine L-Agarplatte angeordnet und über Nacht
bei 37°C
vermehrt. Diese Platte wurde bei 4°C gelagert, während. weitere
Tests durchgeführt
wurden.
- 12) 50% von 90 getesteten Kolonien hatten nur ΔaroC.
- 13) Kolonien wurden auf Vermehrung überprüft, und zwar auf:
- a) M-9 Minimalmediumplatten
- b) M-9 Minimalmedium- + Aromixplatten
- c) L-Amp (100 μg/ml)
ΔaroC-Kolonien
sollten nicht auf M-9 Minimalmedien ohne Aromix oder auf L-Amp wachsen.
Aromix
ist eine Mischung aus aromatischen Verbindungen wie folgt: Diese
Verbindungen werden in Wildtypbakterien hergestellt, aber die aroC-Mutation
verhindert ihre Synthese.
- 14) 13/14 putative ΔAroC-Kolonien
benötigten
Aromix für
die Vermehrung auf M-9 Minimalmedien und waren für Ampicillin anfällig.
- 15) 3 Kolonien (Nr. 1, 2, 3) wurden auf die Gegenwart des CS1
Haupt-Pilinprotein-Gens durch PCR unter Verwendung der Primer MGR169
und MGR170 untersucht. Alle 3 Kolonien ergaben PCR-Produkte der
erwarteten Größe (700
bp.). Die Sequenzen der Primer werden in Tabelle 1 angeführt.
- 16) Die Kolonien 1, 2 und 3 von der Untersuchungs-Masterplatte wurden
auf L-Agar gestrichen und über Nacht
bei 37°C
vermehrt. Die Zellen von diesen Platten wurden verwendet, um Mikrobankröhren zu
inokulieren.
- 17) Kolonie 1, die in einer Mikrobank aufbewahrt war, wurde
für weitere
Arbeiten verwendet.
- 18) Für
permanente Aufbewahrung wurde eine Perle aus dem Mikrobank-Tray
in 1 ml L-Brühe
inokuliert, 4 Stunden lang unter Schütteln bei 37°C vermehrt
und verwendet, um Agarschrägen
herzustellen, die verwendet wurden, um gefriergetrocknete Stocks
zu erzeugen. Der gefriergetrocknete Stock von E1392/75/2AΔAroC wurde
als PTL004 bezeichnet. 20 ml L-Brühe wurden zum Rest der 1 ml
Kultur hinzugefügt,
und die Kultur wurde über
Nacht bei 30°C
inkubiert. 1 ml der Übernacht-Kultur
wurden auf jede von drei Cryophiolen übertragen und in Flüssigstickstoff
gelagert.
-
Konstruktion von ETECΔAroCΔOmpr
-
- 1) Zubereitung von pCVDΔOmpC-Plasmid-DNA zur Elektroporation:
Eine
Kolonie von SY327λpir,
die pCVDΔOmpC
enthält,
wurde über
Nacht bei 37°C
in 100 ml L-Ampicillinbrühe (100 μg/ml) vermehrt.
Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von 2 Quiagen Quiafilter (Warenzeichen)
Midipreps gereinigt. Die DNA wurde durch Ethanolpräzipitation
weiter konzentriert. Die Konstruktion von pCVDΔOmpC wird oben beschrieben.
- 2) Herstellung von elektrokompetenten Zellen: ETECΔAroC-Zellen
aus dem Mikrobank-Tray, hergestellt in Schritt 17 des vorhergehenden
Abschnitts, wurde auf L-Agar ausgestrichen, bei 37°C über Nacht vermehrt und
danach bei 4°C über einen
Zeitraum von maximal einer Woche gelagert, vor einer Verwendung
für das Inokulieren
von Kulturen zur Herstellung von elektrokompetenten Zellen.
- 3) ETECΔAroC-Zellen
wurden mit 5 μl
konzentrierter pCVDΔOmpC-DNA
elektroporiert, und jede Transformation wurde auf eine einzelne
L-Ampicillin-Platte
(50 μg/ml)
plattiert und über
Nacht bei 37°C
vermehrt.
- 4) 17 ampicillinresistente Kolonien (putative ETECΔAroC/pCVDΔOmpC-Merodiploide)
wurden erhalten.
- 5) Diese Kolonien wurden auf eine Master-L-Ampicillin (100 μg/ml)-Platte
getüpfelt
und als Templates für PCR
mit Primern TT7/TT8 verwendet. Die Masterplatte wurde bei Raumtemperatur über das
Wochenende vermehrt. Die Sequenzen der Primer sind in Tabelle 1
unten angeführt.
- 6) Eine einzelne Kolonie (Nr. 7) wies das ΔompC-Gen auf.
- 7) Die Kolonie wurde 5 Stunden lang in L-Brühe vermehrt.
- 8) Serielle Verdünnungen
der L-Brühen-Kultur
wurden eingerichtet auf:
- a) L-Agar ohne Salz,
- b) L-Agar ohne Salz + 5% Sucrose.
Die Platten wurden über Nacht
bei 30°C
inkubiert.
- 9) Die Koloniezahlen zeigten, dass 104 mehr
Kolonien auf L-Agar gewachsen sind als auf L-Agar + 5% Sucrose,
was zeigte, dass die Sucroseselektion funktionierte.
- 10) 45 sucroseresistente Kolonien wurden mit Hilfe von PCR unter
Verwendung der Primer TT7 und TT8 auf ΔompC untersucht. 9 Kolonien
wiesen das ΔompC-Gen
auf, aber die meisten hatten Spuren des w.t. ompC-Gens. Die Sequenzen
der Primer sind in Tabelle 1 unten angeführt.
- 11) Um putative ETECΔAroCΔOmpC-Kolonien
weiter zu charakterisieren, wurden sie in 1 ml L-Brühe 5 Stunden
lang vermehrt und plattiert auf:
- a) L-Agar + 100 μg/ml
Ampicillin
- b) L-Agar
- c) L-Agar + 5% Sucrose
ΔOmpC-Kolonien
sollten gegenüber
Sucrose resistent und gegenüber
Ampicillin empfindlich sein.
- 12) Nur 1 Kolonie (Nr. 1) war ampicillinempfindlich und sucroseresistent.
- 13) Kolonie 1 wurde auf die Gegenwart von ΔaroC, ΔompC und CS1-Gene mit Hilfe
von PCR unter Verwendung der Primer TT19/TT20, Tt7/TT8 und MGR169
und 170 untersucht. Die Sequenzen der Primer sind in der Tabelle
1 unten angeführt.
- 14) Kolonie 1 ergab einzelne PCR-Produkte der erwarteten Größe für ΔaroC, ΔompC und
CS1-Gene.
- 15) Die Kolonie wurde in einer Mikrobank aufbewahrt.
- 16) Für
eine dauerhafte Aufbewahrung wurde eine Perle aus der Mikrobank
in 1 ml L-Brühe
inokuliert, 4 Stunden lang unter Schütteln bei 37°C vermehrt
und verwendet, um Agar-Schrägen
zu erzeugen, die gefriergetrocknet wurden. Der gefriergetrocknete
Stock von E1392/75/2AΔAroCΔOmpC wurde
als PTL008 bezeichnet. 20 ml L-Brühe wurden zum Rest der 1 ml
Kultur hinzugefügt,
und die Kultur wurde über
Nacht bei 30°C
inkubiert. 1 ml der Übernacht-Kultur
wurde auf jede von drei Cryophiolen übertragen und in Flüssigstickstoff
gelagert.
-
Konstruktion von ETECΔAroCΔOmpCΔOmpF
-
Eine
Konjugation wurde verwendet, um pCVDΔOmpF in E1392/75/2AΔAroCΔOmpC einzuführen.
- 1) Konjugationsspenderzellen SM10λpir wurden
mit pCVDΔOmpF
transformiert. Die Konstruktion von Plasmid pCVDΔOmpF wird oben beschrieben.
- 2) ETECΔAroCΔOmpC-Zellen
wurden mit SM10λpir/pCVDΔOmpF-Zellen konjugiert.
Das pCVD442-Plasmid weist einen Transferursprung auf, der es ermöglicht,
dass das Plasmid von einem Spenderstamm, der die RP4-Transfergene (z.
B. SM10λpir)
enthält,
zu einem Empfängerstamm
(z. B. ETEC) übertragen
wird. ETECΔaroCΔompC-Zellen
und E.coli-Stamm SM10ypir, der PcvdΔompF rekombinant enthält, wurden
auf L-Agar-Platten
quer aufgestrichen, so dass sie eine Fläche von ungefähr 10 cm2 bedeckten. Die Platten wurden 20 Stunden
lang bei 37°C
inkubiert, danach wurde die Vermehrung mit 4 ml L-Brühe abgewaschen und
die Suspension auf McConkey-Agari (Difco) plattiert, das Streptomycin
zu 20 μg
ml–1 und
Ampicillin zu 300 μg
ml–1 enthielt.
Die Platten wurden über
Nacht bei 37°C
inkubiert, und die resultierenden Kolonien wurden durch PCR mit
Hilfe von geeigneten Oligonukleotiden als Primer auf Merodiploidie überprüft.
- 3) Putative ETEC-Transkonjuganten wurden überprüft. 10 Kolonien wurden aus
McConkey-Agarplatten ausgesucht und über Nacht auf L-Ampicillin
(100 μg/ml)
Agar vermehrt. Mittels PCR mit den Primern TT1/TT2 wurde überprüfst, ob ΔompF-Gen
vorhanden ist. Die Sequenzen der Primer sind in Tabelle 1 unten
angeführt.
- 4) Die Kolonien wurden 5 Stunden lang in L-Brühe vermehrt.
- 5) Serielle Verdünnungen
der L-Brühen-Kultur
wurden eingerichtet auf:
- a) L-Agar ohne Salz,
- b) L-Agar ohne Salz + 5% Sucrose.
Die Platten wurden über Nacht
bei 30°C
inkubiert.
- 6) Die Koloniezählungen
zeigten, dass 105 mehr Kolonien auf L-Agar
wuchsen als auf L-Agar + 5% Sucrose, was zeigte, dass die Sucroseselektion
funktionierte.
- 7) Sucroseresistente Kolonien wurden mittels PCR mit den Primern
TT1/TT2 auf ΔompF-Gene
untersucht. Die Sequenzen der Primers sind in Tabelle 1 unten angeführt. Die
untersuchten Kolonien wurden über Nacht
auf L-Agar vermehrt. Drei Kolonien von 47 wiesen das ΔompF-Gen
ohne Nachweis für
das Wildtyp-ompF-Gen
auf.
- 8) Um putative ETECΔAroCΔOmpCΔOmpF-Kolonien
weiter zu charakterisieren, wurden sie plattiert auf:
- a) L-Agar + 100 μg/ml
Ampicillin,
- b) L-Agar,
- c) L-Agar + 5% Sucrose.
ΔompF-Kolonien
sollten sucroseresistent und ampicillinempfindlich sein.
- 9) Alle drei ΔompF-Kolonien
waren ampicillinempfindlich und sucroseresistent.
- 10) Die Kolonien wurden in einer Mikrobank verwahrt, und eine
Kolonie wurde als Masterstock ausgewählt.
- 11) Für
eine dauerhafte Aufbewahrung wurde eine Perle aus dem Masterstock
in 1 ml L-Brühe
inokuliert, vier Stunden lang unter Schütteln bei 37°C vermehrt
und verwendet, um Agarschrägen
herzustellen, die für die
Erzeugung von gefriergetrockneten Stocks verwendet wurden. Der gefriergetrocknete
Stock von E1392/75/2AΔaroCΔompCΔompF wurde
als PTL003 bezeichnet. 20 ml L-Brühe wurden zum Rest der 1 ml Kultur
hinzugefügt,
und die Kultur wurde über
Nacht bei 30°C
inkubiert. 1 ml der Übernacht-Kultur
wurde auf jede von drei Cryophiolen übertragen und in Flüssigstickstoff
gelagert.
-
Charakterisierung von
E1392/75/2AΔAroCΔOmpCΔOmpF
-
- 1) Vermehrungsanforderungen:
Zellen, die
aus dem Masterstock, der in Schritt 10 des vorangegangenen Abschnitts
erzeugt worden ist, genommen wurden, wurden auf eine L-Agar-Platte
aufgestrichen. Gleichzeitig wurden 8 ml L-Brühe für eine chromosomale DNA-Zubereitung
für Southern-Blots
inokuliert. Sowohl die Platten- als auch die flüssige Kultur wurden über Nacht
bei 37°C
vermehrt.
Zellen aus der vermehrten Platte wurden auf folgende
Medien aufgestrichen und über
Nacht bei 37°C
vermehrt. Wie erwartet
waren die Zellen Amp-empfindlich. Die Zellen waren gegenüber Sucrose,
Streptomycin und Sulfathiazol resistent, benötigten jedoch Aromix, um sich
auf Minimalmedien zu vermehren.
- 2) LPS-Analyse von PTL003:
- a) Eine gefriergetrocknete Phiole PTL003 wurde aufgebrochen.
Die Kultur wurde in L-Brühe
resuspendiert und zur Vermehrung auf L-Agar plattiert. Einige Zellen
wurden abgeschabt und in der Mikrobank aufbewahrt.
- b) Mehr Zellen wurden abgeschabt, und das LPS-Profil wurde analysiert.
Es gab keinen sichtbaren Unterschied zwischen dem LPS-Profil von
PTL003 und dem ursprünglichen
E1392/75/2A-Stamm.
- 3) Bestätigung
von Deletionen durch PCR:
- a) Eine Abschabung von Zellen wurde bei der Platte durchgeführt, die
in 2a) hergestellt wurde, und auf L-Agar aufgestrichen und über Nacht
vermehrt.
- b) Frisch vermehrte Zellen wurden für PCR mit Primern verwendet,
welche folgende Gene flankieren: aroC, htrA, ompC, ompF, ompR.
- c) Es zeigte sich, dass PTL003 Deletionen in aroC, ompC und
ompF-Genen aufwies, aber nicht in htrA oder ompR.
- 4) Analyse des Außenmembranproteinprofils
von PTL003:
Außenmembranproteinfraktionen
wurden aus den Stämmen
PTL010 (E1392/75/2A) und den Deletionsstämmen PTL002 und PTL003 hergestellt.
Ein Stamm mit einer einzelnen ompF-Deletion und ein Stamm mit aroC-
und ompC-Deletion wurden ebenfalls analysiert. Stämme wurden
unter Bedingungen geringer Osmolarität (L-Brühe
ohne Salz) und hoher Osmolarität
(L-Brühe
ohne Salz + 15% Sucrose) vermehrt. Das OmpF-Proteinprodukt wird normalerweise bei
geringer Osmolarität
exprimiert, während
das OmpC-Produkt bei hoher Osmolarität exprimiert wird. Das OmpC-Protein
und das OmpF-Protein weisen ähnliche
elektroporetische Mobilitäten
auf. Sowohl bei hoher als auch bei niedriger Osmolarität fehlt
es dem Stamm PTL003 an Proteinen in der OmpC/OmpF-Region, im Vergleich
zu dem Wildtyp-E1392/75/2A-Stamm oder zu den ΔAroCΔOmpC- oder ΔOmpF-Deletionsstämmen. Die
Ergebnisse werden in 4 dargestellt.
- 5) Expression von CS1 und CS3 pili auf CFA-Agar: Die Expression.
von CS1 und CS3 pili in den Deletionsstämmen wurde untersucht. Gleiche
Mengen (2 A600nm Einheiten) von Bakterienstämmen PTL010,
PTL001, PTL002 und PTL003, die über
Nacht bei 37°C
auf CFA-Agar vermehrt wurden, wurden SDS-PAGE unterzogen und durch
Western-Blotting mit monospezifischen polyklonalen Antikörpern gegen
CS1 oder CS3 analysiert. CS1 und CS3 pili wurden gleich gut in vier
Stämmen
(5) exprimiert.
Ein CFA-II-negativ Derivat
von E1392/75/2A wurde zur Verwendung als Kontrollgruppe konstruiert.
Dies erfolgte durch spezifisches Kurieren der CS codierenden Plasmide
aus dem ETEC-Stamm E1392/75-2A. Ein kurzes Fragment von DNA wurde
aus dem cooB-Gen amplifiziert, unter Verwendung von PCR mit den
Oligonukleotiden CSA01 und CSA02 als Primer und in den pGEM-T Easy
Plasmidvektor (Warenzeichen, Promega) verbunden, der für das Klonieren
von PCR-Produkten
entwickelt wurde. Das Fragment wurde durch die SalI- und SphI-Restriktionsenzymstellen
in pCVD442 subkloniert. Das pCVD442-cooB-Derivat wurde in den ETEC-Stamm
E1392/75/2A durch Konjugation aus SM10λpir eingeführt. Ampicillinresistente Transkonjuganten
sind höchstwahrscheinlich
das Ergebnis der Fusion des pCVD422-cooB-Derivats mit einem cooB-tragenden
Plasmid. Solche Transkonjugate wurden danach auf L-Agar vermehrt,
ergänzt
mit 5% Sucrose, um für
Verlust des sacB-Gens von pCVD442 zu selektieren. Resultierende
Kolonien wurden auf Ampicillinempfindlichkeit und mit Hilfe von
PCR unter Verwendung von CSA01 und CSA02 als Primer getestet. Drei
Kolonien von E1392/75/2A wurden als positive Kontrollgruppen unter
diesen PCRs aufgenommen. Zwei sucroseresistente Kolonien, die kein
Produkt bei der PCR ergaben, wurden auf frisches L-Agar aufgestrichen,
ergänzt
mit 5% Sucrose, um reine Kulturen zu erhalten. Diese wurden danach
in L-Brühe
bei 37°C
ungefähr
16 Stunden lang vermehrt und bei –70°C in einer Mikrobank aufbewahrt.
Der Verlust von CS1, das Plasmid codiert, wurde durch die Analyse
der Plasmidprofile der Derivate unter Verwendung von Agarosegelelektruphorese
bestätigt.
Zwei Derivate erwiesen sich als CS1 negativ, waren aber noch immer SC3+.
- 6) Southern-Blotting von PTL003:
Struktur von Deletionsmutationen.
Die Gesamt-DNA wurde aus Kulturen der drei Deletionsmutanten extrahiert,
die aus den Stocks in der Mikrobank vermehrt wurden, mit Restriktionsendonuklease-EcoRV
digeriert, und die digerierte DNA wurde gepulster Feld-Agarosegel-Elektrophorese
unterzogen. Die DNA wurde aus den Gels auf Hybond N+ (Warenzeichen)-Nylonmembranen geblottet
und mit geeigneten DNA-Sonden
gemäß Standardverfahren
hybridisiert. Die Ergebnisse (6) zeigen,
dass die hybridisierenden chromosomalen DNA-Fragmente der Mutanten
kürzer
als der Wildtyp sind, in Übereinstimmung
mit den Mutationen, die Deletionen sind.
Bestätigung der
Abwesenheit von hitzestabilen (ST) und hitzelabilen (LT) Toxingenen
in E.coli-Stamm E1392/75-2A. Zu diesem Zweck wurden die ST- und
LT-AB-Gene als DNA-Sonden
gegen die Gesamt-DNA aus E1392/75-2A verwendet. Die Gesamt-DNA aus
dem toxinpositiven ETEC-Stamm E1393/75 wurde als positive Kontrollgruppe
aufgenommen, während
jene von dem Labor-E.coli-Stamm JM109 als negative Kontrollgruppe
aufgenommen wurde. Hybridisierte Membrane wurden eine Stunde lang
unter Hyperfilm-ECL (Warenzeichen) gelassen, um die maximale Signalmenge
zu erhalten. Sonden wurden unter Verwendung von PCR mit Plasmid-DNA
hergestellt, die aus E1392/75-2A als Template extrahiert wurde,
und Oligonukleotide EST01 und EST02 als Primer für ST oder LT-R1 und LT-03 für LT-AB.
Es gab keine bedeutende Hybridisierung mit der Gesamt-DNA unter
Verwendung der LT-AB- oder der ST-Sonde, obwohl ein sehr intensives
Signal aus der positiven Kontroll-Gesamt-DNA erhalten wurde.
Bestätigung der
Abwesenheit von pCVD442-Sequenzen aus dem Chromosom von Deletionsmutanten. Plasmid- pCVD442 wurde markiert
und auf Gesamt-DNA aus Deletionsmutanten PTL001, PTL002 und PTL003,
digeriert mit EcoRV, hybridisiert. Gesamt-DNA aus dem ETEC-Stamm
E1392/75-2A wurde als Kontrollgruppe aufgenommen. Ein komplexes
Muster von hybridisierenden DNA-Fragmenten wurde erhalten. Aber
es gab keinen bedeutenden Unterschied zwischen dem Muster, das für den Wildtyp
erhalten wurde, und dem Muster für
die Mutanten, was zeigt, dass wahrscheinlich keine restlichen pCVD442-Nukleotidsequenzen
in den Genomen der Mutanten übrig
waren. Das komplexe Muster von hybridisierenden Fragmenten war höchstwahrscheinlich
auf die pCVD442-Sonde zurückzuführen, die
mit den Plasmid-DNA-Komponenten des E1392/75-2A-Stammes und mutanten
Derivaten hybridisiert.
-
-
-
-
-
Beispiel 2: Sicherheit
und Immunogenizität
von abgeschwächtem
Impfstoffstamm von enterotoxigener E.Coli (ΔaroC/ΔompC/ΔompF) in menschlichen Freiwilligen
-
Die
Studie wurde entworfen, um einen Kandidaten für einen lebenden abgeschwächten Impfstoffstamm
von enterotoxigener E. coli, nämlich ΔaroC/ΔompC/ΔompF PTL003,
der oben beschrieben wurde, zu evaluieren.
-
Zubereitung
der Impfstoffimpfchargen
-
Der
bakterielle Stamm wurde auf MacConkey-Agar zwecks Reinheit und Bestätigung der
Identität
plattiert, und 5 Kolonien wurden verwendet, um einen Kolben zu inokulieren,
der 200 ml Luriabrühe
enthielt. Nach acht Stunden Inkubation bei +37°C wurden 30 ml steriles Glycerol
zur Brühenkultur
hinzugefügt
und Aliquote hergestellt (1 ml pro Phiole). Einhundert solcher Phiolen
wurden bei –70°C gefroren.
Diese Phiolen stellten die Impfcharge für den Impfstoffstamm dar.
-
Die
Reinheit der Impfcharge wurde dadurch gewährleistet, dass zehn willkürliche Phiolen
ausgewählt und
diese auf bakterielle Reinheit und darauf untersucht wurden, ob
sie frei von Pilzen waren. Weitere drei Phiolen wurden getestet,
um die Anzahl von Bakterien in den Phiolen unter Anwendung von standardmäßigen Plattenzählmethoden
mit seriellen Verdünnungen
der Kulturbrühe
zu bestimmen.
-
Zubereitung
des Impfstoffs
-
Der
Impfstoff wurde vor jeder Impfung frisch zubereitet, und alle Schritte
bei der Zubereitung des Inokulum wurden in einem Sicherheitsschrank
durchgeführt.
Am Tag vor der Impfung wurden 0,2 ml auf die Oberfläche von
Luria-Agarplatten
unter Verwendung von sterilen Wattebäuschen aufgetragen, um den
Bakterienrasen vorzubereiten. Dieselbe Kulturbrühe wurde auf MacConkey und
Luria- Agarplatten
zur Reinheit aufgestrichen. Die Agarplatten wurden 18 Stunden lang
bei 37°C
in einem versiegelten Behälter
mit nicht manipulierbarem Indikatorband inkubiert, um sicherzustellen,
dass die Platten während
der Inkubation nicht manipuliert wurden. Nach der Inkubation wurde
der Bakterienrasen mit 5 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)
geerntet und die optische Dichte der Suspension gemessen. Das für diese
Suspension geeignete Volumen, in Entsprechung zur gewünschten
Dosis, wurde danach in die Einheitsdosisflaschen mit 30 ml Bikarbonatpuffer
gegeben und den Freiwilligen verabreicht. Eine Extradosis Impfstoff
wurde zubereitet und im Labor gelassen, und unmittelbar nachdem
die Freiwilligen geimpft worden waren, wurde die tatsächliche
Anzahl an Bakterien in jeder Impfstoffdosis mit Hilfe von standardmäßigen Koloniezählverfahren
mit zehnfachen Verdünnungen
des Impfstoffes validiert.
-
Das
Verfahren zum Verdünnen
der Bakterien wurde während
Vorstudien unter Verwendung von Rasenkulturen festgelegt, die genauso
hergestellt und inkubiert wurden wie für die Impfstoffzubereitungen,
die den Freiwilligen verabreicht wurden. Suspensionen wurden erzeugt
und die Anzahl von lebensfähigen
Bakterien durch Koloniezählung
von seriellen Verdünnungen
ermittelt und zur bestimmten optischen Dichte in Relation gesetzt.
Auf der Grundlage dieser Vorstudien wurde ein Standardverfahren
zur Herstellung und Validierung der korrekten Verdünnungen
von Bakterien entwickelt, um die angeführten Dosen zu erreichen.
-
Zubereitung
des Puffers
-
Es
wurde ein aus Natriumbikarbonat in Wasser bestehender Puffer verwendet.
Für jede
Impfstoffdosis wurden 150 ml entionisiertes Wasser, das 2 Gramm
Natriumbikarbonat enthielt, hergestellt und filtersterilisiert. 30
ml des Puffers wurden in 50 ml sterile Phiolen gegeben, und die
Dosis der Impfstoffbakterien wurden zu den Phiolen hinzugeführt. Die
restlichen 120 ml Puffer wurden in getrennte sterile Flaschen gegeben.
Zum Zeitpunkt der Impfung erhielten die Freiwilligen zuerst 120
ml Puffer, danach eine Minute später
30 ml Puffer, der den Impfstoff enthielt.
-
Impfplan
-
Es
wurden Gruppen von Freiwilligen in einer Dosiseskalierungsform untersucht.
Die erste Gruppe von Freiwilligen erhielt eine Dosis von ungefähr 5 × 107 Bakterien, die zweite eine Dosis von ungefähr 5 × 109 und die dritte Gruppe eine Dosis von ungefähr 5 × 108
-
Die
Freiwilligen erhielten Ciprofloxacin 500 mg zwei Mal täglich für drei Tage,
beginnend mit dem vierten Tag. Sie wurden am Tag 6 entlassen, wobei
aus Sicherheitsgründen
eine Hämatologie-
und Chemieprüfung
durchgeführt
wurde. Das Serum wurde für
die Antikörpermessung
aufgehoben.
-
Am
Tag 9 und am Tag 14 kehrten die Freiwilligen zu Nachfolgeuntersuchungen
in der Ambulanz zurück,
wobei zu diesem Zeitpunkt eine Intervallgeschichte erstellt und
eine Blutprobe für
serologische Tests entnommen wurde. Insgesamt wurde für die Serologie
drei Mal Blut (40 ml) entnommen, vor dem Impfen und am Tag 9 und
Tag 14 nach der Impfung.
-
Labortestverfahren
-
Bis
zu zwei Fäkalproben
wurden jeden Tag kultiviert, während
die Freiwilligen sich im Krankenhaus befanden. Zwecks qualitativer
Kultur wurde ein Fäkalbausch
in ein Cary-Blair-Transportmedium gegeben und zum Labor gebracht,
wo er direkt auf MacConkey-Agar und auf Mac-Conkey-Agar, das Antibiotika selektiv
für den
Impfstoffstamm enthielt, inokuliert wurde. Es wurde gezeigt, dass
bis zu fünf
Kolonien agglutiniert waren, unter Verwendung von Antisera, die
für den
Impfstoffstamm spezifisch sind. Zwecks quantitativer Kultur (nur erste
Probe an jedem Tag) wurden Fäkalproben
gewogen und in PBS verdünnt,
mit seriellen 10-fachen Verdünnungen
bis zu 10–4,
und danach wurden 100 μl
jeder Verdünnung
auf MacConkey-Agar mit Antibiotika aufgestrichen. Verdächtige Kolonien
wurden durch Agglutinierung mit Anti-O-Serum bestätigt.
-
Das
Serum wurde gesammelt und für
eine anschließende
Prüfung
auf Antikörper
gegen CFA-II-Antigene durch ELISA und bakterizide Antikörper gegen
den Impfstoffstamm aufbewahrt.
-
Periphere
Blutmononuklearzellen wurden von dem Vollblut getrennt, in Citrat
gesammelt und gewaschen. Diese Zellen wurden mit einer Dichte von
107 Zellen pro ml in RPMI-Gewebekulturmedium
48 Stunden lang bei 37°C
kultiviert. Nach 48 Stunden wurde die Überstandsflüssigkeit zu einer Cryophiole
transferiert und bei –20°C gefroren,
bis sie auf IgG- und IgA-Antikörper
gegenüber
CFA II durch ELISA untersucht werden konnte.
-
Tabelle
3 – Zusammenfassung
der Verfahren des Protokolls
-
-
Ergebnisse:
-
Bei
allen tatsächlichen
Dosen von 6,8 × 107 und 3,7 × 108 cfu
wurden keine Symptome festgestellt. Bei der höheren Dosis von 4,7 × 109 kam es bei 1/6 der Freiwilligen zu Durchfall
und bei 2/6 zu leichten Krämpfen im
Abdomen. Bei allen Freiwilligen wurde bakterielles Shedding bei
der 5 × 109 cfu Dosis von Tag 1 nach der Impfung festgestellt,
bis – gemäß Protokoll – am Tag
4 nach der Impfung mit der Verabreichung von Ciprofloxacin begonnen
wurde. Das deutet auf gute Darmkolonisierung hin, die ein Zeichen
des Potenzials für
das Herbeiführen
einer guten Immunreaktion ist. Bei den zwei geringeren Dosen wurde
ein Impfstoffstamm von allen Freiwilligen zu mindestens einem Zeitpunkt
nach der Impfung gewonnen, aber die Dauer der Absonderung war im
Vergleich zu jener, die bei der höchsten Dosis festgestellt wurde,
kürzer.
-
Zum
Zeitpunkt der Einreichung der Anmeldung war die Analyse der durch
den Impfstoff erzeugten Immunreaktionen noch nicht abgeschlossen.
Die IgA-Anti-CFA-II-Reaktionen in den Kultur-Überstandsflüssigkeiten von PBMNC, gereinigt
aus dem Blut der Empfänger
der höchsten
Dosis des Impfstoffes am Tag 0 (vor der Impfung) und an den Tagen
7 und 10 nach der Impfung, wurden hingegen analysiert (siehe 7).
Die Überstandsflüssigkeiten
wurden durch ELISA auf Assay-Platten analysiert, die mit gereinigtem
CFA-II-Antigen beschichtet waren. Die OD-Werte, die bei den Proben von Tag 7
und Tag 10 beobachtet wurden, waren wesentlich höher als jene aus den Proben
vor der Impfung, was das Herbeiführen
einer spezifischen IgA-Reaktion zu diesen Zeitpunkten beweist. Wie
erwartet zeigen die Reaktionen am Tag 7 einen Höhepunkt und sind am Tag 10
reduziert, wobei dies mit dem Homing von primed IgA sekretierende
B-Zellen aus dem Blut zu den Schleimhaut-Effektorstellen des darmassoziierten
lymphatischen Gewebes in Einklang steht.
-
Schlussfolgerungen
-
Es
hat sich gezeigt, dass der abgeschwächte Lebendstamm von ETEC (Δaroc/ΔompC/ΔompF) bei gesunden
erwachsenen Freiwilligen gut vertragen wird und den Darm in einer
Weise kolonisiert, die mit seiner Nützlichkeit als oraler Impfstoff
zum Schutz vor Reisedurchfall in Einklang steht. Ferner wurde gezeigt,
dass er eine spezifische Schleimhautimmunreaktion hervorruft.
-
Referenzen
-
- 1. Bacon, G. A., Burrows, T. W. and Yates, M. (1950) Br.
J. Exp. Pathol., 31, 714-24
- 2. Chatfield, S. N., Charles, I. G., Makoff, A. J. et al (1992a)
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