DE69321655T2

DE69321655T2 - Zweianalytenimmunoassay

Info

Publication number: DE69321655T2
Application number: DE69321655T
Authority: DE
Inventors: Kathy Palmer Hoboken N.J. 07030 Ordonez; Salvatore Joseph Stockton N.J. 08559 Salamone
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1992-06-16
Filing date: 1993-06-07
Publication date: 1999-05-06
Anticipated expiration: 2013-06-08
Also published as: US5501987A; CA2096495C; DK0574782T3; DE69321655D1; ES2123589T3; CA2096495A1; EP0574782A3; EP0574782A2; JP2726793B2; JPH0694711A; EP0574782B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft diagnostische Immunoassays von biologischen Flüssigkeitsproben, die verwendet werden, um mehr als einen Analyten zu einer Zeit zu bestimmen. In der Vergangenheit wurden Doppel-Assays entwickelt (z. B. U.S.- Patent 4 329 281, Europäische Patentanmeldung 165 716, Syva Emit monoklonaler Assay für Amphetamin/Methamphetamin und Roche Abuscreen Radioimmunoassay für Amphetamin/Methamphetamin). Diese Assays sind so ausgebildet, daß zwei Markierungen und zwei oder mehr Antikörper oder Antikörperpopulationen, die für jede Markierung spezifisch sind, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung liefert eine neue Konfiguration für einen Mehranalytimmunoassay einer biologischen Flüssigkeitsprobe, in der nur ein markierter Bindungspartner verwendet wird, der mit der Kombination von Antikörpern und deren entsprechenden Analyten eine Wechselwirkung eingehen kann, um so die Gegenwart der Analyten bei ausgewählten Grenzgehalten allein oder in Kombination nachzuweisen. Es wird ein Assay bereitgestellt unter Verwendung von Methamphetamin- und Amphetamin-Antikörpern und einem einzigen markierten Derivat eines der beiden Analyten, am meisten bevorzugt Amphetamin.
In der vorliegenden Erfindung wird nur ein Analytderivat markiert mit einem Markierungsanteil, z. B. einem Mikroteilchen. Diese Markierung ist so aufgebaut, daß sie eine gewisse Bindungsaffinität für die Antikörper der beiden interessierenden Analyten hat. Immunogene, die von den zwei Analyten stammen, werden dann verwendet, um zwei Antikörper zu erzeugen. Die Immunogene sind so konstruiert, daß sie ein bestimmtes gemeinsames Merkmal distal von den unterscheidenden Strukturmerkmalen der interessierenden Analyten haben. Beide Antikörper können somit die Markierung binden. Jeder Antikörper wird jedoch so ausgewählt, daß er nur durch den entsprechenden Analytbindungspartner verdrängt wird, d. h. er ist nicht kreuzreaktiv mit den anderen Analyten.
Die Vorteile des Mehranalyt-Assays der vorliegenden Erfindung sind, daß nur ein markierter Bindungspartner an der Konfiguration beteiligt ist, statt des üblicherweise verwendeten Paars. Dies läßt ein vereinfachtes Herstellungsverfahren zu. Außerdem bleibt die Spezifität des Tests hoch und der Test kann eine Standardkurve liefern, die so ausgebildet ist, daß sie selektiv empfindlicher für einen Analyten gegenüber dem anderen ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist daher das einzige mit einem Mikroteilchen markierte Derivat ein Amphetaminderivat, das nicht nur den Amphetamin-Antikörper bindet, sondern auch in einem geringeren Ausmaß den Methamphetamin-Antikörper. Die geringere Affinität für Methamphetamin läßt Grenzwerte zu und läßt es zu, daß die Testempfindlichkeit auf die relativen Mengen dieser zwei Arzneimittel zugeschnitten werden kann, gemäß den föderalen Richtlinien für den Nachweis von Drogenmißbrauch.
Die Erfindung kann für jede Art von Immunoassay verwendet werden (z. B. turbidometrischer Agglutinierungsassay, Radioimmunoassay (RIA), Enzymimmunoassay (EIA), Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay). Erforderlich ist nur, daß die Markierungsstruktur einen Teil enthält, der homolog zu jedem der Immunogene ist, die verwendet werden, um die entsprechenden Antikörper zu erzeugen, um die Mehranalyt-, Mehrantikörperwechselwirkung mit dem einzigen Markierungsreagenz zu liefern.
Das einzige markierte Reagenz ist so aufgebaut, daß es an dem Verbindungsarm zwischen dem Analyt der Wahl (z. B. Amphetamin) und den Markierungsgruppen, (z. B. Chromophor, Mikroteilchen mit Polyaminogruppen oder Enzym etc.) einen wesentlichen Anteil aufweist, der an eine Seite des Analyten gebunden ist, der mit den anderen Analyten gemeinsame Strukturmerkmale aufweist (z. B. der Benzolring der Amphetamine) und distal von den strukturell unterschiedlichen Teilen ist, wobei der Teil des Verbindungsarms mindestens homolog, bevorzugt identisch mit dem Bindungsarm ist, der in dem Immunogen vorhanden ist, das verwendet wird, um die Antikörper für die Zielanalyten zu erzeugen.
Der Rest des Verbindungsarm kann irgendeine reaktive Spacer- Linker-Gruppe sein, die typischerweise im Stand der Technik verwendet wird, um den ausgewählten markierenden Anteil, z. B. eine N-Hydroxysuccinimidyl- oder Isothiocyanatogruppe, zu binden. Im Fall der Bindung eines Proteinanteils eines Markierungskonstruktes ist ein typischer bevorzugter Ansatz eine Thioharnstoffbindung, die mit den Aminogruppen von Lysin an dem Protein durch eine Isothiocyanatogruppierung gebildet wird:
worin X eine fakultative zusätzliche Abstandsgruppe ist, z. B. eine C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkylgruppe oder Phenylniedrig(C&sub1;-C&sub4;-alkyl)gruppe.
Für einen erfindungsgemäßen Methamphetamin/Amphetamin-Latexagglutinierungsimmunoassay sollte der immunologisch reaktive Verbindungsarm am meisten bevorzugt an der para-Position des Benzolrings des Amphetamins oder Methamphetamins gebunden sein. Um eine ausreichende gemeinsame Erkennung durch den selektiven Antikörper des Analyten für das einzige Analytmarkierungsmolekül zu erzeugen, muß der Verbindungsarm mindestens eine funktionelle Heteroatomgruppe enthalten. Bevorzugt enthält der Verbindungsarm des Markierungsmoleküls der vorliegenden Erfindung eine endständige Aminogruppe, die an die fakultative Proteinbindungsgruppe gebunden ist, um so den Amidbindungsanteil der Immunogenmoleküle nachzuahmen. Somit hätte der bevorzugte Bindungsarm für das markierte analytische Derivat die Formel
- NH-CX-(CH&sub2;)n,
worin X = H&sub2;, O, S oder N und n = 1 bis 6,
und die entsprechenden Bindungsgruppen für die Immunogene hätten die Formel -CX-(CH&sub2;)m, worin m ± 1 sein könnte oder wie n sein könnte, unabhängig für jedes Immunogen.
Die Immunogene und Antikörper werden hergestellt mit den im Stand der Technik bekannten Methoden, z. B. U.S.-Patent Nr. 4 329 281. Die Formeln 1 und 2 zeigen die bevorzugten Amphetamin- und Methamphetamin-Immunogene, die erfindungsgemäß verwendet werden, und Formel 3 zeigt das bevorzugte Amphetamin-Mikroteilchen-Markierungsreagenz.
Die in der Amidbindung an dem Protein gezeigte Aminogruppe stammt von dem Protein. Amphetamin-Immunogen 1 Methamhetamin-Immunogen 2 Assaymarkierung 3
Arzneimittelderivate von Analyten, wie Amphetamin und Methamphetamin werden dann kovalent an ein Trägerprotein gebunden über einen geeigneten Bindungsarm mit Methoden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, und diese Konjugate werden Tieren injiziert, um eine Antikörperbildung zu erzeugen. Sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper können in dem Assay der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Monoklonale Antikörper können nach den im Stand der Technik bekannten Methoden erzeugt werden, z. B. mit dem Verfahren von Köhler und Milstein, Nature 256, Seiten 495 bis 497 (1975). Die Hybridomazellkulturüberstände, die monoklonale Antikörper enthalten, werden mit typischen ELISA-Methoden gescreent, wobei im Fall des Amphetamin/Methamphetamin-Assays Amphetamin-Rinderserumalbumin-(BSA)-beschichtete Polystyrol-Mikrotiterplatten für monoklonale Amphetamin-Antikörper und mit Methamphetamin-BSA-beschichtete Polystyrol-Mikrotiterplatten für die monoklonalen Methamphetamin-Antikörper verwendet werden. Die Amphetamin- und Methamphetaminderivate, die für die BSA-Beschichtung verwendet werden, sind die gleichen, wie sie für die Immunogene verwendet werden. Die monoklonalen Antikörper werden unter Verwendung bekannter Methoden nachgewiesen, z. B. mit einem Screening mit einem Antimaus-Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase konjugiert ist. Das endgültige Screening der monoklonalen Antikörper wird mit der ELISA-Methode erreicht, gefolgt von einer Analyse im Assaysystem.
Die Antikörper, die mit dem ELISA-Mikrotiterplatten-Screening ausgewählt werden, zeigen eine starke Bindung an das Antigen auf der Platte. Zusätzlich zu einer starken Bindung müssen die Antikörper eine gute Verdrängung in Gegenwart von freiem Amphetamin für Amphetamin-Antikörper und freiem Methamphetamin für Methamphetamin-Antikörper zeigen. Schließlich müssen die ausgewählten Antikörper eine geringe Kreuzreaktivität mit mit Amphetamin verwandten frei erhältlichen Arzneimitteln haben.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Mikroteilchenreagenzien verwendet, die Mikroteilchen beinhalten, die mit einer Komponente eines immunologischen Bindungspaars beschichtet sind, wobei das Bindungspaar diagnostisch selektiv für die interessierende Substanz ist. Die Mikroteilchen bleiben monodispergiert. Bei einer kinetischen Wechselwirkung in Gegenwart des komplementären Bindungspartners ballen sich die Mikroteilchen zusammen, was zu Veränderungen der optischen Dichte führt.
Für einen Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay können Antikörper erzeugt werden gemäß U.S.-Patent Nr. 4 868 132 und die entsprechenden fluoreszierenden Markierungen werden aus den gleichen Derivaten synthetisiert, die zur Bildung der Immunogene verwendet werden. Im Fall eines RIA können Antikörper hergestellt werden gemäß U.S.-Patent Nr. 4 329 281. Die entsprechende Markierung könnte erzeugt werden durch Kupplung von Tyramin an das geschützte aktivierte Amphetaminderivat, wie in U.S.-Patent Nr. 4 329 281 beschrieben, Entfernung der Schutzgruppe und Iodierung mit ¹²&sup5;I, gemäß U.S.-Patent Nr. 4 041 076. Im Fall eines EIA können Immunogene gemäß den U.S.-Patenten Nr. 3 878 187 und Nr. 4 069 105 erzeugt werden. Die entsprechenden Markierungen wenden die gleichen Derivate an, nur daß sie an ein Enzym gebunden sind (z. B. Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase, Lysozym), wie in den oben erwähnten Patenten beschrieben. In jedem Fall enthält die Markierung einen Bindungsanteil, der homolog ist zu jedem der Immunogene, die verwendet werden, um die entsprechenden Antikörper zu erzeugen, und die Assayentwicklung folgt den Screening- Verfahren, wie oben beschrieben.
Das Auswahlverfahren betrifft das Auswählen eines Amphetamin- Antikörpers, der an mit Amphetamin-BSA-sensibilisierte Mikrokügelchen binden kann und eine Verdrängung um mehr als 100 Milliextinktionseinheiten (mA) mit Amphetamin im klinisch wichtigen Bereich liefert.
Außerdem sollten die ausgewählten Antikörper eine Kreuzreaktivität bezüglich Amphetamin für mit Amphetamin verwandte Analoga von weniger als 5% haben.
Das Auswahlverfahren zur Auswahl eines Methamphetamin-Antikörpers ist das gleiche, wie das für das Amphetaminverfahren verwendete. Der einzige Unterschied besteht darin, daß das auf dem Mikroteilchen verwendete Derivat ein Methamphetaminderivat ist und die Verdrängung des Antikörpers erreicht wird unter Verwendung von Methamphetamin.
Sowohl im Fall von Amphetamin als auch im Fall von Methamphetamin hatten die Derivate, die für die Immunisierungs- und Screeningverfahren verwendet wurden, strukturelle Ähnlichkeit im Verbindungsarm. Dies zeigt sich bei einem Vergleich von Formel 1 mit Formel 3.
Tabelle 1 führt die typische Kreuzreaktivität von monoklonalen Antikörpern gegen Amphetamin und Methamphetamin auf, die ausgewählt wurden für die vorliegende Erfindung unter Verwendung der Immunogene der Formeln 1 und 2. Tabelle 1
Sobald die geeigneten Antikörper ausgewählt sind, kann der Test zusammengestellt werden, indem bestimmt wird, ob der Methamphetamin-Antikörper die Amphetaminmarkierung bindet oder ob der Amphetamin-Antikörper die Methamphetaminmarkierung bindet. In dem bevorzugten Assay der vorliegenden Erfindung bindet der Methamphetamin-Antikörper die Amphetaminmarkierung ausreichend, um eine Aggregation der Mikroteilchen zu verursachen, und der Amphetamin-Antikörper bindet die Methamphetaminmarkierung nicht ausreichend, um eine Aggregation der Mikroteilchen zu verursachen.
Durch Verwendung der mit dem Amphetaminderivat markierten Mikroteilchen kann daher ein Doppel-Assay erstellt werden durch Verwendung sowohl von Amphetamin- als auch von Methamphetamin-Antikörpern.
Die Antikörper werden in einer Verdünnung in dem Test verwendet, die die geeignete Empfindlichkeit mit jedem der zu bestimmenden Analyten zuläßt. In diesem speziellen Assay wurden die Antikörperkonzentrationen so eingestellt, daß die Methamphetamin enthaltende Probe, die bei dem Test zugegeben wurde, selbst normalerweise keinen positiven Wert erzeugen würde. Die Kurve basiert auf d-Amphetamin-Standards (0 bis 2000 ng/ml) und positive Werte werden nur erreicht, wenn eine Probe Amphetamin allein enthält oder Methamphetamin in Gegenwart einer geringen Menge von Amphetamin.
Diese Konfiguration gibt eine geringere falsch-positive Rate, indem die Kreuzreaktivität vieler frei erhältlicher Medikamente, die strukturverwandt mit Methamphetamin sind, gesenkt wird. Fig. 1 zeigt die Dosis-Wirkungs-Kurve des Assays für Amphetamin allein und für Methamphetamin in Gegenwart von Amphetamin. Die Dosis-Wirkungs-Kurven werden für Amphetamin allein und für Amphetamin in Kombination mit 500 ng/ml Methamphetamin erzeugt unter Verwendung eines Latex-Agglutinations-Immunoassays. Während die Dosis-Wirkung für Methamphetamin alleine sehr gering ist, ist die Dosis-Wirkung für Methamphetamin in Gegenwart von Amphetamin sehr hoch.
Vorschriften für das Testen von Drogen erfordern die Gegenwart von Amphetamin in methamphetaminhaltigem Urin, um die Probe positiv zu machen. Dies ist erforderlich, damit falschpositive Ergebnisse minimiert werden und in der Erkenntnis, daß Methamphetamin teilweise zu Amphetamin metabolisiert wird (R.C. Basalt, Disposition of Toxic Drugs and Chemicals in Man, 3. Ausgabe, Year Book Medical Publishers, Inc., 1989).
Überraschenderweise zeigt der Methamphetamin-Antikörper eine beträchtliche Bindung an die Amphetaminmarkierung von Formel 1, obwohl die Kreuzreaktivität des Methamphetamin-Antikörpers an freies Amphetamin gering ist (Tabelle 1).
Tatsächlich gibt es eine beträchtliche Bindung des Methamphetamin-Antikörpers an die Amphetaminmarkierung unter Erzeugung einer Aggregation. Ohne den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung auf irgendeinen theoretischen Mechanismus einzuschränken, kann diese Bindung erklärt werden, indem die Struktur des Methamphetamin-Immunogens (Formel 2) untersucht wird und mit der Amphetamimuarkierung verglichen wird. Während Amphetamin selbst nicht wesentlich an den Methamphetamin-Antikörper bindet, kann eine zusätzliche Erkennung der Seitenkette, die das Amphetaminderivat an das Protein bindet, auftreten. Die Spezifität des Methamphetamin-Antikörpers bleibt jedoch hoch bezüglich Methamphetamin.
Die Immunoassay-Reagenzien und die Methode der vorliegenden Erfindung können geeigneterweise für jeden agglutinometrischen Test angewendet werden, der geeignet ist für eine instrumentelle Methode zur Messung von Veränderungen, die durch die Agglutinierungsreaktion erfolgen. Sowohl manuelle als auch automatisierte Vorrichtungstests können geeigneterweise für solche agglutinometrischen Analysen angewendet werden. Typischerweise wird ein automatisiertes Gerät eingesetzt unter Verwendung einer Mehrzahl von Reagenzbehältern oder Vorratsbehältern, aus denen die geeignete Menge jedes Reagenzes für die Zugabe zu der Probe pipettiert wird. Für Immunoassays, wie den vorliegenden Agglutinationsassay, beinhaltet dies gewöhnlich mindestens zwei solche Behälter; typischerweise einen für ein Antikörperreagenz und den anderen für die an Mikroteilchen gebundenen entsprechenden antigenen Determinanten. Zusätzliche Behälter/Vorratsbehälter können in einigen Geräten vorhanden sein, die Verdünnungsmittel, Puffer und/oder Additive für eine geeignete Behandlung der Probe enthalten.

Beispiel 1

Herstellung der Amhetamimnarkierung

Herstellung von (S)-N-(1-Methyl-2-phenylethyl)fluoracetamid (1):

Zu einer Mischung von d-Amphetaminsulfat (20,0 g, 0,108 Mol) in Triethylamin (75 ml), die mit Stickstoff gespült wurde und in einem Eisbad gekühlt wurde, wurde Trifluoressigsäureanhydrid (31 ml) tropfenweise 15 Minuten lang zugegeben. Der Ansatz wurde bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Die Lösungsmittel wurden dann im Vakuum verdampft und der Rückstand in Methylenchlorid (200 ml) gelöst, mit 5% wäßriger Weinsäure (3 · 250 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und im Vakuum eingeengt zu einem gelben Öl. Das Material wurde in einer Hexan-Ether-Mischung kristallisiert, was 14 g des Produktes lieferte. Die NMR stimmte mit der vorhergesagten Struktur überein.

Herstellung von (S)-4-[2-Methyl-2-[(trifluoracetyl)amino]ethyl]-p-oxobenzolbutansäure (2):

Zu einer gerührten Lösung von (1), (12,0 g, 0,05 Mol) in Methylenchlorid (210 ml) unter Argon, wurde Bernsteinsäureanhydrid (8,0 g, 0,08 Mol) zugeben. Der Ansatz wurde in einem Eisbad gekühlt und dann mit Aluminiumchlorid (28,0 g, 0,21 Mol) portionsweise 5 Minuten lang versetzt. Der Ansatz wurde bei 0 bis 5º 2 Stunden lang gerührt und dann über Nacht bei Raumtemperatur. Salzsäure (3 n, 120 ml) wurde dann langsam zugegeben und die Lösung eine weitere Stunde lang gerührt. Das Methylenchlorid wurde im Vakuum entfernt und die wäßrige Phase wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und die Lösungsmittel verdampft, was einen lohfarbenen Rückstand lieferte, der beim Verreiben mit Ether 10,5 g Produkt lieferte. IR, NMR und Mas senspektrum stimmten alle mit der vorhergesagten Struktur überein.

Herstellung von (S)-4-[2-Methyl-2-[(trifluoracetyl)amino]ethyl]benzolbutansäure (3):

Eine Mischung von (2) (9,2 g, 0,027 Mol) und 10% Palladium auf Aktivkohle (4,0 g) in Essigsäure (400 ml) wurde mit 50 psi 24 Stunden lang hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert, das Filtrat im Vakuum eingeengt und der Rückstand mit Ether verrieben, was 7,0 g eines weißen Produktes lieferte. IR, NMR-Spektren und Massenspektrometrie (MS) stimmten mit der Struktur überein.

Herstellung von (S)-N-[2-{4-{4-{(2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy}-4-oxobutyl}phenyl}-1-methylethyl]-2-trifluoracetamid (4):

Zu einer gerührten Lösung von (3) (5,4 q, 0,019 Mol) in Methylenchlorid (150 ml), Tetrahydrofuran (150 ml) und Dimethylformamid (50 ml) wurden N-Hydroxysuccinimid (2,7 g, 0,023 Mol) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (6,0 g, 0,031 Mol) zugegeben. Der Ansatz wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und dann im Vakuum eingeengt. Der entstehende Rückstand wurde in Methylenchlorid gelöst, filtriert und mit Silicagelchromatographie (7% Ether- Methylenchlorid als Elutionsmittel) gereinigt, was ein gelbes Öl lieferte, das in einem Ether kristallisiert wurde, was 3,7 g eines weißen Produktes lieferte. IR, NMR und MS stimmten mit der Struktur überein.

Herstellung von (S)-N-(4-Isothiocyanatophenyl)ethyl)-4-4-(2- trifluoracetamido)propyl)benzolbutamid:

Zu einer Lösung des N-Hydroxysuccinimidderivats (4) (200 mg, 0,48 mmol) in 8 ml CH&sub2;Cl&sub2; wird p-Aminophenethylamin (65,7 mg, 0,48 mmol) und 0,5 ml Pyridin zugegeben. Die Reaktionsmischung wird 24 Stunden lang gerührt und CH&sub2;Cl&sub2; dann bei vermindertem Druck entfernt, was einen beigen Feststoff liefert. Der Feststoff wird auf eine präparative Silicagelplatte (2,0 mm Dicke) gegeben und mit einer Mischung aus CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (95 : 5) entwickelt. Eine gewünschte Bande wird isoliert, das Silicagel mehrere Male mit absolutem Ethylalkohol in einem Büchner-Trichter extrahiert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt, was einen beigen Feststoff liefert, 125 mg (60%). Rf: 0,35 (95 : 5 CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH).
Das Aminophenethylamidaddukt oben (94 mg, 0,22 mmol) wird in 3 ml THF, 3 ml H&sub2;O und 1 ml gesättigter NaHCO&sub3; gelöst. Nach 15-minütigem Kühlen in einem Eisbad wird Thiophosgen (33 mg, 0,28 mmol) zu der Mischung zugegeben. Diese wird weitere 30 Minuten lang gerührt und verdünnte HCl (0,1 n) wird zugegeben, bis der pH der Lösung 3,0 erreicht. Dann wird THF unter vermindertem Druck entfernt. Die wäßrige Lösung wird dreimal mit CHCl&sub3; extrahiert, die vereinigten organischen Phasen werden mit H&sub2;O gewaschen und mit wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels liefert einen beigen Feststoff, 63 mq (60%). Rf = 0, 59 (95 : 5 CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH). Das NMR stimmte überein mit der angegebenen Struktur.

Herstellung von Amphetamin-BSA-Konjugat

Materialien:

BSA, Fraktion V, Reagenzienqualität, Amphetaminderivat, Molekulargewicht 477,55 mq/mM, Dimethylsulfoxid (DMSO), 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH = 8,0 (RPi-Puffer), 50 mM Natriumcarbonatpuffer (pH 11,3), Vorratslösung von Amphetamin (5 mg/ml): 5 mg Amphetaminderivat in 1,0 ml DMSO, Dialysemembran 25 000 MWCO.

Methode:

Das zu konjugierende BSA wird vorbereitet, indem 69 mg in 1,24 ml Phosphatpuffer (pH 8) gelöst werden. Sobald das Protein sich vollständig gelöst hat, wird die Lösung in einem Eisbad gekühlt. Unter Rühren wird DMSO (1,51 ml) tropfenweise zu der Proteinlösung zugegeben, die dann auf Raumtemperatur erwärmen gelassen wird. Zu diesem Zeitpunkt kann die Vorratslösung des Amphetaminderivats frisch hergestellt werden (siehe oben). Die Vorratslösung (0,10 ml) des Amphetaminderivats wird zu dem Protein in DMSO/Puffer zugegeben. Die Reaktion wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Konjugat wird anfangs bei Raumtemperatur gegen 15 ml DMSO, verdünnt mit 35 ml KPi-(pH 7,5)-Puffer und dann gegen 5 ml DMSO, verdünnt mit 45 ml KPi-Puffer, dialysiert. Die Dialyse geht dann bei 4ºC gegen KPi-Puffer weiter. Das gewonnene Konjugat wird bezüglich der Proteinkonzentration bei 280 nm ausgewertet.
Das Proteinkonjuqat wird dann auf eine Konzentration von 12,0 mg/ml in KPi-(pH 7,5)-Puffer verdünnt und in dem Carbonatpuffer (pH 11,3) dialysiert (8-faches Volumen, neunmal über einen Zeitraum von 3 Tagen). Das Konjugat wird dann gegen einen zweiten Carbonatpuffer dialysiert (8-faches Volumen, sechsmal über einen Zeitraum von 3 Tagen).

Herstellung von sensibilisierten Mikroteilchen, die Amphetamin-BSA-Konjugat enthalten

Materialien:

Carboxylierte Polystyrolmikroteilchen (Durchmesser 0,1 bis 0,13 um, hergestellt von Seradyn, Inc.), N,N-Dimethylformamid (DMF), 1-Hydroxybenzotriazol (NHB; H&sub2;O), 1-Cyclohexyl-3-(2- morpholinoethyl)carbodiimidmetho-p-toluolsulfonat (CMC), Triton® X-100, Amphetamin-BSA-Konjugat, 50 mM Natriumbicarbonat pH 8,6, BSA-Fraktion V, Reagenzienqualität, Puffer von 10 mM KPi, pH 7,5, 0,1% Natriumazid und 0,1% Triton® X-100 (Mikroteilchen-Lagerpuffer).

Methoden:

Die carboxylierten Mikroteilchen (8,0 ml mit 10% Feststoff) werden, wie vom Hersteller geliefert, gewaschen, um das Detergenz auszutauschen. Triton® X-100, 0,1% in deionisiertem Wasser wird für eine Gesamtverdünnung von mehr als 1 : 1 000 000 bezogen auf Volumen verwendet. Der gewaschene Latex in 0,1% Triton® X-100 wird auf 3% Feststoffgehalt eingestellt in 0,1% Triton® X-100 aus einer Standardkurve der Latexkonzentration bei 500 nm.
Eine Vorratslösung von NHB wird hergestellt, indem 31 mg NHB in 0,5 ml DMF gelöst werden, und deionisiertes Wasser (0,75 ml) zugegeben wird (25 mg NHB/ml). Während die hergestellte Mikroteilchenlösung (20 ml) bei Raumtemperatur schnell gerührt wird, wird die NHB-Lösung (1,25 ml) schnell tropfenweise zugegeben. Die Lösung wird 10 Minuten lang gerührt, während die Vorratslösung von CMC vorbereitet wird.
Die Vorratslösung von CMC wird hergestellt, indem 86 mg CMC in 1,73 ml (50 mg CMC/ml) deionisiertem Wasser gelöst werden. Unter schnellem Rühren werden 1,73 ml schnell tropfenweise zu der oben hergestellten Mikroteilchenlösung zugegeben. Nach dieser Zugabe wird der Ansatz 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Überschüssige Aktivierungsreagenzien werden entfernt, indem das Mikroteilchenpräparat wiederum mit 0,1% Triton® X-100 gewaschen wird auf eine Gesamtverdünnung von 1 : 1 000 000. Die. Mikroteilchen werden auf, einen Feststoffgehalt von 2% eingestellt durch Vergleich mit einer Standardkurve der Mikroteilchenkonzentration bei 500 nm.
Das vorher hergestellte BSA-Konjugat wird auf folgendem Weg verwendet, um die Mikroteilchen zu sensibilisieren. Das Konjugat (15,6 mg) wird auf 5 mg Konjugat BSA/ml mit 50 mM Natriumbicarbonat pH 8,5 verdünnt. Die Rinderserumalbuminfraktion V, Reagenzienqualität (109,4 mg) wird in 21,88 ml Natriumbicarbonat (5 mg BSA/ml) pH 8,5 gelöst. Die BSA-(21,88 ml)- und BSA-Konjugat-(3,12 ml)-Lösungen werden dann vereinigt auf insgesamt 25 ml Volumen mit 5 mg BSA/ml. Während die Proteinlösung heftig gemischt wird, werden die aktivierten Mikroteilchen (25 ml) schnell zugegeben. Der Ansatz wird über Nacht gemischt. Nicht gebundenes BSA-Konjugat wird dann durch intensives Waschen entfernt. Die fertige Latexsuspension wird mit 10 mM RPi, 0,1% Triton® X-100, 0,1% Natriumazid, pH 7,5 und 10 mM KPi, 0,1% Natriumazid, pH 7,5 verdünnt für ein fertiges Mikroteilchenreagenz mit einem Feststoffgehalt von 0,7% in 10 mM RPi, 0,10% Triton® X-100, 0,1% Natriumazid, pH 7,5. Der Feststoffanteil der Mikroteilchen wird bestimmt durch Vergleich mit einer Standardkurve der Mikroteilchenkonzentration bei 500 nm.

Beispiel 2

Amphetamin/Methamphetamin-Assay

Herstellung des Antiserumreagenzes für den Test:

Monoklonale Mausantikörper, die selektiv gegen Amphetamin und Methamphetamin sind, wurden aus Immunogenen erzeugt, die gemäß den Verfahren der Beispiele 6, 13 und 14 von U.S.- Patent Nr. 4 329 281 hergestellt wurden, unter Verwendung von Rinderthyroglobulin als Trägerprotein. Die monoklonalen Antikörper wurden dann in geeigneter Weise in einer wäßrigen Lösung mit pH 7,5 verdünnt:
1. 0,05 M Kaliumphosphat
2. 0,01% Rinderserumalbumin
3. 0,5% Natriumchlorid
4. 0,1% Natriumazid
Der Anteil und die Konzentration der Amphetamin- und Methamphetamin-Antikörper werden so eingestellt, daß eine ungefähre Spanne von 200 Milliextinktions-(mA)-Einheiten erreicht wird zwischen 0 und 1000 ng/ml d-Amphetamin und daß eine ungefähre Spanne von 45 mA erreicht wird zwischen 1000 und 2000 ng/ml. Außerdem ergeben 200 nq/ml d-Amphetamin mit 500 ng/ml d-Methamphetamin-Standard einen Ablesewert, der gleich ist dem 1000 ng/ml d-Amphetamin-Standard.
Eine Reihe von Titern werden dann gegen Verdünnungen von Amphetamin- und Methamphetamin-Antikörpern durchgeführt gemäß dem folgenden Gitter.
Die so identifizierten Konzentrationen sind "feingetuned", indem kleine Veränderungen der Konzentration rund um einen speziellen Punkt getestet werden, um die gewünschten Grenzempfindlichkeiten zu erreichen (siehe Fig. 1).

Herstellung der Probenverdünnung für den Test:

Der Reaktionspuffer ist eine wäßrige Lösung mit pH 7,0
1. 0,05 M PIPES [1,4-Piperazinbis(ethansulfonsäure) und Dinatriumsalz]
2. 2,5% PVP (Polyvinylpyrrolidon) 360
3. 2,0% Natriumchlorid
4. 0,1% Natriumazid
5. 0,025% Foamaster, FLD

Assay für Amphetaminmißbrauch:

Der diagnostische Screeningassay wird durchgeführt an einem ROCHE COBA. S MIRA. Standards werden hergestellt durch Zugabe von d-Amphetamin zu drogenfreiem Normalhumanurin, der 0,1% Natriumazid enthält. Der klinische Analysator pipettiert die entsprechenden Reagenzien und Proben in eine Küvette, wo die kompetitive Agglomerierungsreaktion erfolgt und die Trübungsmessung erfolgt. Der Reagenzientransfer wird in zwei Stufen durchgeführt: Stufe 1 : 20 ul Urinprobe werden mit 75 ul Probenverdünnungsmittel in die Küvette pipettiert und anschließend sofort 100 ul Antikörperreagenz und gemischt. Der spektrophotometrische Anfangswert wird aufgenommen. 25 Sekunden später, Stufe 2 : 30 ul Mikroteilchenreagenz mit 65 ul Wasser werden in die Küvette überführt und der Ansatz gemischt. Etwa 150 Sekunden nach Stufe 2 erfolgt die endgültige Messung der Trübung. Die Gesamtänderung der Trübung in dem Ansatz wird verglichen mit einer Kalibrierungskurve und die Ergebnisse sind in ng/ml angegeben.
Diese Assaykomponenten und der Antikörpertiter liefern eine Standardkurve mit den gewünschten Leistungseigenschaften rund um den NIDA-Grenzwert von 1000 nq/ml d-Amphetamin und 200 ng/ml d-Amphetamin mit 500 ng/ml d-Methamphetamin (Fig. 1). Außerdem zeigt Tabelle 2 die Kreuzreaktivität, die dieser Assay mit einigen mit Amphetamin verwandten Arzneimitteln hat. Die folgenden strukturell verwandten Verbindungen wurden auf Kreuzreaktivität getestet. Die Verbindungen wurden in gepooltem Humanurin hergestellt. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als Konzentration des Arzneimittels, das eine Reaktion erzeugt äquivalent zu 1000 nq/ml d-Amphetamin. Tabelle 2

Claims

1. Immunoassay für zwei Analyten zum Nachweis von Amphetamin und Methamphetamin unter Verwendung eines Antikörpers, der für Amphetamine selektiv ist, und eines Antikörpers, der für Methamphetamin selektiv ist, umfassend, daß man nur ein markiertes Derivat von einem der beiden Analyten verwendet, wobei das markierte Derivat mit unterschiedlicher Affinität an beide Antikörper binden kann.

2. Immunoassay nach Anspruch 1, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

3. Immunoassay nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Analytderivat ein markiertes Mikroteilchen ist und der Test agglutinometrisch ist.

4. Immunoassay nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist, der für Amphetamin selektiv ist, der mit einem Immunogen der Formel

erzeugt wurde, und worin der monoklonale Antikörper, der für Methamphetamin selektiv ist, mit einem Immunogen der Formel

erzeugt wurde und das markierte Derivat ein Arnphetaminderivat der Formel:

ist, worin P eine Poly(aminosäure) mit reaktiven Aminogruppen ist, L eine nachweisbare markierende Einheit ist, A eine Bindungsgruppe ist, die an L physikalisch oder chemisch binden kann, X H&sub2;, O, S oder N ist, n 1 bis 6 ist, m 1 bis 6 ist und q gleich n und m ist oder n und m ± 1 ist.

5. Immunoassay nach Anspruch 4, worin Z ein Latexmikroteilchen ist und A eine Gruppe P-Z- ist, worin P eine Poly(aminosäure) mit reaktiven Aminogruppen ist und Z ein Verbindungsanteil ist, der unter Bildung einer Amidbindung mit den Aminogruppen reagieren kann.

6. Immunoassay nach Anspruch 4 oder 5, worin A eine Gruppe Protein

ist und X ein C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkylrest oder Phenylniedrig (C&sub1;-C&sub4;)- Alkylrest ist.

7. Immunoassay nach Anspruch 6, worin das Amphetamin-Immunogen, das Methmphetamin-Immunongen und das markierte Derivat die Formel 1, 2 und 3 aufweisen:

Amphetamin-Immunogen 1

Methamphetamin-Immunogen 2

Testmarkierung 3