DE69309760T2 - Kolorimetrische Methoden und Reagenzien zum Nachweis von Calcium in einer Testprobe - Google Patents
Kolorimetrische Methoden und Reagenzien zum Nachweis von Calcium in einer TestprobeInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verfahren und Reagentien zur Messung von Calciumionen, insbesondere von Calciumionen in Blut und weiteren physiologischen Flüssigkeiten.
- Calcium ist ein wichtiger Elektrolyt, dessen Überwachung dem Arzt bei der Bewertung des Gesundheitszustandes eines Patienten hilft. Änderungen beim Calcium-Gehalt, der gewöhnlich relativ stabil in den meisten Körperflüssigkeiten ist (in Blut beträgt er 8,2 bis 10,3 mg/dl), kännen das Vorliegen verschiedener pathologischer Zustände aufzeigen. Calcium-Gehaltsmengen, die deutlich unterhalb der Normalwerte liegen, können Hypoparathyroidisums, Vitamin-D-Mangel oder Nephristis anzeigen. Größere als die Normalwerte kännen Hyperparathyroidismus, Vitamin-D-Intoxikation oder Myeloma anzeigen. Somit hat, zum frühen Nachweis eines Krankheitszustands, der sich durch einen abnormen Calcium- Gehalt zeigen würde, das Verfahren zur Calcium-Messung sehr genau und präzise zu sein.
- Es ist eine Anzahl chemischer und pyhsikalischer Verfahren zur Bestimmung von Calcium bekannt. Direkte kolorimetrische Verfahren sind gegenüber aufwendigen Fällungsverfahren, gravimetrischen oder titrimetrischen Verfahren bevorzugt. Im allgemeinen beinhalten derartige kolorimetrische Verfahren die Komplexierung eines Farbstoffs mit Calciumionen, um eine meßbare Verschiebung bei der Farbstoff-Absorption zu ergeben.
- Ein potentielles Problem bei der Bestimmung von Calciumionen in den meisten Flüssigkeiten ist das Vorliegen potentiell störender Ionen (z.B. von Magnesium oder Eisen) oder großer Moleküle (z.B. von Proteinen oder Bilirubin). Magnesiumionen ergeben ein besonders schwieriges Problem, weil bei ihnen eine Tendenz dazu besteht, daß sie mit denselben Verbindungen Komplexe bilden, welche mit Calciumionen komplexieren. Demzufolge sind gemäß dem Stand der Technik Verfahren entwickelt worden, bei denen Magnesiumionen physikalisch aus der Testprobe vor der Calcium-Bestimmung entfernt oder mit einem Magnesium-spezifischen Komplexierreagens maskiert werden können.
- Hochselektive Verbindungen für Calciumionen sind von Tsien in Biochem. 19, S. 2396-2404 (1980) beschrieben. Die darin beschriebene Ausgangsverbindung ist 1,2-Bis (ω- aminophenoxy) ethan-N,N,N'-tetraessigsuäure die allgemein als BAPTA bekannt ist. Diese Verbindungen absorbieren im UV- Bereich des elektromagnetischen Spektrums. Dies stellt einen beachtlichen Nachteil dar, da weitere Species wie Bilirubin, Hämoglobin und weitere Prophyrin-Species sowie metabolische Nebenprodukte von Porphyrinen, welche in Analyt-Lösungen wie blutplasma, Rückenmarksflüssigkeit, Urin und weiteren Körperflüssigkeiten aufgefunden werden, ebenfälls im UV- und kurzwelligen sichtbaren Wellenlängenbereich des elektromagnetischem Spektrums absorbieren und eine Hintergrund-Interferenz bei kolorimetrischen Standard- Ausrüstungen und -Verfahren erzeugen. Daher wurde es als wünschenswert erachtet, hochselektive Calcium- Komplexierverbindungen zur Verfügung zu haben, die bei längeren Wellenlängen nachweisbar und zu anderen Wellenlängen hin verschoben wären, wenn sie mit Calcium komplexiert sind, um dadurch eine quantitative Analyse für Calcium zu ermöglichen, und zwar ohne Interferenz von UV- und kurzwelliges sichtbares Licht absorbierenden Species. In US 4,795,712 von Toner et al sind derartige Calcium- Komplexierfarbstoffe beschrieben. Chromogene Derivate von 1,2-Bis (ω-aminoaryloxy)ethan-N,N,N'-N'-tetrassigsäure eignen sich zur Bestimmung von Calciumionen und sind als Bestandteile in sowohl Lösungs- als auch Trocken- Assayverfahren offenbart. Diese Verbindungen weisen einen Farbstoff-Rest auf, der direkt konjugiert zum mit Essigsäure substituierten Stickstoffatom vorliegt, wodurch die Verbindungen dazu befähigt sind, eine Maximalabsorption bei einer Wellenlänge von im allgemeinen mehr als 400 nm vor der Komplexierung aufzuweisen. Werden die Verbindungen mit Calciumionen komplexiert, verschiebt sich die Absorption zu einer kürzeren Wellenlänge.
- Über fluoreszierende intrazelluläre Calcium-Indikatoren auf Basis von Tetracarboxyl-Verbindungen ist in US 4,849,362 berichtet. Die Verbindungen weisen längere Absorptionswellenlängen-Charakteristika auf, wodurch sie sich für zytometrische Multiparameter-Fließ-Analysen intrazellulärer Calciumionen-Konzentrationen in gemischten Zellpopulationen eignen.
- Das o-Cresolphthalein-Komplexon-Verfahren (CPC-Verfahren) auf Basis eines Tetracarboxylsäure-Chelats, das zuerst von A.G. Flaschka et al, Helv.Chim.Acta 1954, 37, 113, beschrieben worden ist, wird als das am besten geeignete Calcium- Verfahren von klinischen Laboratorien erachtet. Trotz einer weit verbreiteten Anwendung weist das Verfahren Mängel bezüglich einer relativ kurzen Reagensstabilität, seiner Empfindlichkeit gegenüber Kohlendioxid sowie seiner von der Stöchiometrie abhängigen Nicht-Linearität am niedrigen Ende auf. Ausserdem ist bei diesem Verfahren der Probendurchsatz (Anzahl von Analysen oder Tests pro Stunde) an automatisierten klinischen Analysegeräten erniedrigt. Die homogenen Ionophoren der vorliegenden Erfindung ermöglichen die Entwicklung eines Einzelreagensverfahrens bei verlängerter Stabilität des Reagens sowie einer gegebenen Linearität im gesamten Bereich.
- Einen wichtigeren Faktor, der bei Entwurf und Planung möglicher synthetischer Kandidaten für neue Calcium- Chromoionophore zu berücksichtigen ist, stellt die bathochrome Verschiebung des Wellenlängenmaximum bei Komplexierung mit Calcium dar. Eine große Anzahl von in der Literatur beschriebenen Verbindungen ist aus 1,2-Bis(ω- aminophenox)ethan-N,N,N',N-tetraessigsäure abgeleitet, die allgemein als BAPTA bekannt ist. Die chromogenen Analoga dieser Strukturen enthalten Chromophore, die in para-Position zum als Sensor fungierenden Stickstoffatom vorliegen und eine hypsochrome Verschiebung des Wellenlängenmaximum bei Calcium- Bindung ergeben. Dies stellt an sich eine unerwünschte Eigenschaft wegen der möglichen spektralen Interferenzen dar, die bei kürzeren Wellenlängen auftreten. Ausserdem ist die Ausgangsabsorption des Reagens gewöhnlich sehr hoch.
- Beim CPC-Verfahren gelangt eine Tetracarboxylsäure-Verbindung zur Anwendung, die zwei Phenol-Untereinheiten und ein Chromophor aufweist, das in para-Stellung zu den phenolischen Hydroxylgruppen gebunden ist. Diese Konfiguration der ein Chelat bildenden Stellen und das Chromophor-System garantieren die bathochrome Verschiebung bei Komplexierung mit Calcium, da das Kation den angeregten Zustand des Liganden stabilisiert. Somit wäre es bei der Entwicklung neuer Verbindungen von Vorteil, eine ähnliche Chromophor- Anordnung beizubehalten, jedoch in die Struktur die relativ starren Tetra- und Triaryl-Gerüste einzubauen. Die Tetra- und Triaryl-Untereinheiten sind schon früher mit Erfolg bei Entwicklung und Aufbau von Natrium- und Kalium-selektiven Bindungsagentien eingesetzt worden und versprechen einen hohen Grad an Vororganisation der Chelat-bildenden Stellen bezüglich der phenolischen Sensoratome, die ein polares "Nest" bilden, das komplementär mit dem Calciumion ist. Neue Strukturen unter Einsatz von Carboxylsäure-Resten als die Chelat-bildenden Gruppen wurden gewählt.
- Die Verbindungen der vorliegenen Erfindung können ganz allgemein als chromogene achtzähnige Tetracarboxyl-Diphenol- und -Phenol-Verbindungen beschrieben werden, die eine Farbänderung im sichtbaren Bereich bei Wechselwirkung mit Calciumionen erzeugen. Das Chromoiongphor unterscheidet sich strukturell von anderen bekannten Calcium- Komplexierverbindungen. Es enthält vier (4) Essigsäure- Chelatbildungsgruppen und ein (1) oder zwei (2) Nitrophenylazophenyl-Chromophore, die eingebaut und an ein starres Tetraaryl- oder Triaryl-Gerüst gebunden sind. Die chromogene Verbindung reagiert mit Calciumionen, um eine bathochrome Verschiebung und eine Erhöhung der Absorption bei 550 nm in Abhängigkeit der Calcium-Konzentrationen zu ergeben.
- Demnach ist herausgefunden worden, daß die chromogenen Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine Empfindlichkeit gegenüber Calciumionen zeigen. Die chromogenen Verbindungen können in ein flüssiges Einzelreagens eingebracht werden, das zur Anwendung an bzw. in automatisierten klinischen Analysiergeräten zur Bestimmung der Calcium-Konzentration in physiologischen Flüssigproben wie Blut angepaßt ist.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Assayverfahren und eine Reagenszusammensetzung zur Messung von Calciumionen, insbesondere von Calciumionen in Blut und weiteren physiologischen Flüssigkeiten, anzugeben und bereitzustellen.
- Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, das obige Assayverfahren sowie die entsprechende Reagenszusammensetzung zur Verfügung zu stellen, welche eine schnelle Bestimmung des Ion ermöglichen.
- Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, das obige Assayverfahren und die entsprechende Reagenszusammensetzung zur Verfügung zu stellen, welche einen hohen Selektivitätsgrad aufweisen.
- Auch ist es eine Aufgabe der Erfindung, das obige Assayverfahren und die entsprechende Reagenszusammensetzung zur Verfügung zu stellen, welche insbesondere für photometrische klinische Analysiergeräte angepaßt sind.
- Ebenso ist es Aufgabe der Erfindung, das obige Assayverfahren und die entsprechende Reagenszusammensetzung zur Verfügung zu stellen, welche eine genaue, präzise und einfache Alternative zu herkömmlichen Verfahrensweisen darstellen.
- Noch eine Aufgabe der Erfindung ist es, eine Trockentestvorrichtung bereitzustellen, worin die obige Reagenszusammensetzung in eine Matrix eingebracht ist.
- Schließlich ist es Aufgabe der Erfindung, das obige Assayverfahren und die entsprechende Reagenszusammensetzung zur Verfügung zu stellen, welche die quantitative Bestimmung von Calcium in Blutserum und weiteren biologischen Flüssigkeiten durch spektrophotometrische Verfahren in einem homogenen, einphasigen Lösungsmittelsystem ermöglichen, wobei keine Probenvorbehandlung erforderlich ist.
- Weitere Gegenstände und Merkmale der Erfindung werden nun im folgenden einerseits ersichtlich und andererseits herausgestellt.
- Kurz gesagt, die vorliegende Erfindung beruht darauf, daß eine neue chromogene Verbindung der allgemeinen Formel (I) aufgefunden wurde:
- worin gilt:
- R ist Wasserstoff oder ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylrest;
- X ist CH&sub2;, CH&sub2;CH&sub2;, CH=CH, O, S, SO&sub2;, S-S, NR;
- W ist CH, C-OH oder N;
- M ist ein p-Nitrophenylazo-, 2,4-Dinitrophenylazo-, 2,4,6- Trinitrophenylazo-, p-Nitrostyryl-, p-Benzochinonimino-, Bis- (4-dimethylaminophenyl)hydroxymethyl-, 3-Phenylisothiazolyl- 5-azo-, Thiazolyl-5-azo- oder ein Isothiazolyl-5-azo-Rest;
- k ist 1;
- l ist 0 oder 1; und
- n ist 0 oder 1.
- Eine bevorzugte chromogene Verbindung der vorliegenden Erfindung, die sich als besonders geeignet zur Bestimmung von Calcium im Blut erwiesen hat, ist ein chromogenes dimarkiertes Tetrasäure-Diphenol auf Basis der Formel (I), worin gilt: R ist Wasserstoff; X ist CH&sub2;; W ist COH; M ist ein p-Nitrophenylazo-Rest; und k, l und n sind jeweils 1. Dieses Chromoionophor weist ein relativ starres Tetraaryl- Gerüst mit 2 daran gebundenen Chromophoren auf und wird chemisch als Bis (2-hydroxy-3-(2'-aminophenyl)-5-(4"- nitrophenylazo))methan-N,N,N',N'-tetraessigsäure bezeichnet.
- Die Verbindungen der Formel (I) können in ein Reagens zum Nachweis des Vorliegens von in Lösung vorhandenem Calcium eingebracht werden. Eine derartige Reagenszusammensetzung umfaßt eine Verbindung der allgemeinen Formel (I), eine Prozentmenge (gewichtsbezogen auf das Volumen) eines Magnesium-maskierenden Agens sowie einen Puffer. Eine bevorzugte Reagenszusammensetzung enthält das oben beschriebene bevorzugte chromogene dimarkierte Tetrasäure- Diphenol, eine auf das Volumen bezogene Prozentgewichtsmenge eines Magnesium-Maskierungsmittels von ca. 0,05% sowie eine Puffer, der in einer Menge vorhanden ist, um die Reagenszusammensetzung auf einen pH-Wert von ca. 8,5 bis ca. 9,2 einzustellen. Es kann ein oberflächenaktives Mittel zur Reagenszusammensetzung gegeben werden, um die Empfindlichkeit gegenüber Calcium zu erhöhen. Ein Antioxidans kann ebenfalls, falls gewünscht, enthalten sein.
- Weitere Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung betreffen Verfahren zur Synthese verschiedener chromogener Verbindungen der vorliegenden Erfindung.
- Es werden nun Umfang und Inhalt der Erfindung, unter Einschluß der Verbindungen, Reagenszusammensetzungen und deren Verwendung, von Synthese und Zubereitung sowie von experimentellen Ergebnissen, im folgenden dargelegt. Die obigen und weiteren Gesichtspunkte sowie signifikante Vorteile der vorliegenden Erfindung sollen durch die folgende detaillierte Beschreibung zusammen mit den beigefügten Zeichnungen klargestellt sein, worin:
- Fig. 1 einen Reaktionsweg zur Synthese eines chromogenen dimarkierten Tetrasäure-Diphenols der vorliegenden Erfindung beschreibt;
- Fig. 2 einen Reaktionsweg zur Synthese eines chromogenen monomarkierten Tetrasäure-Diphenols der vorliegenden Erfindung beschreibt;
- Fig. 3 einen Reaktionsweg zur Synthese eines chromogenen Tetrasäure-Phenols der vorliegenden Erfindung beschreibt;
- Fig. 4 das Absorptions(reaktions)verhalten einer Reagensformulierung gegenüber Calcium darstellt, welche das chromogene dimarkierte Tetrasäure-Diphenol mit und ohne ein oberflächenaktives Mittel enthält; und
- Fig. 5 das lineare Spektralverhalten einer Reagenszusammensetzung gegenüber Calcium darstellt, welche das chromogene dimarkierte Tetrasäure-Diphenol enthält; und
- Fig. 6 die Korrelationsdaten für eine Reagenszusammensetzung darstellt, welche das chromogene dimarkierte Tetrasäure-Diphenol enthält, verglichen mit dem auf Atomabsorption beruhenden spektrophotometrischen Primärbezugsverfahren (AAS).
- Die folgenden Definitionen werden gegeben, um Umfang und Inhalt der vorliegenden Erfindung klarzustellen und die Befähigung zu deren Durchführung und Anwendung zu schaffen.
- Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "chromogen" diejenige charakteristische Eigenschaft eines chemischen Systems, durch die ein nachweisbares Reaktionsverhalten in Reaktion auf einen äußeren Reiz erzeugt wird. Somit ist beispielsweise ein lonophor chromogen, wenn es dazu befähigt ist, eine nachweisbare Reaktion bei Komplexierung mit einem Ion zu ergeben, wobei die nachweisbare Reaktion bzw. das entsprechende Verhalten nicht nur auf eine unten definierte Farbänderung eingeschränkt sind.
- Der Begriff "nachweisbare Reaktion" bedeutet eine Änderung bei oder das Auftreten einer Eigenschaft in einem System, zu deren Wahrnehmung man befähigt wird, entweder durch direkte Betrachtung oder instrumentell, wobei die entsprechenden Vorgänge bzw. Abläufe eine Funktion des Vorhandenseins bzw. Vorliegens eines spezifischen Ions in einer wässrigen Testprobe sind. Einige Beispiele nachweisbarer Reaktionen sind Änderung oder Auftreten von Farbe, Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Reflexionsverhalten, Chemilumineszenz oder Infrarot-Spektrum, welche ganz allgemein als chromogene Reaktionen bezeichnet werden. Weitere Beispiele nachweisbarer Rekationen können die Änderung bei den elektrochemischen Eigenschaften, beim pH-Wert sowie bei der kernmagnetischen Resonanz sein.
- Eingeschlossen in die Bedeutung eines C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylrestes sind Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, s-Butyl- und t-Butylreste. Diese können unsubstituiert oder substituiert sein, unter der Voraussetzung, daß keiner der Substituenten die Durchführung oder Funktionsweise der hier beanspruchten Testmaßnahmen und die entsprechenden Mittel oder Vorrichtungen zur Bewerkstelligung des Nachweises von Calciumionen beeinträchtigt oder stört. Der Begriff "Aryl", wie er hier verwendet ist, schließt substituierte oder unsubstituierte Aryl-Reste mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Phenyl-, Tolyl-, Butylphenyl-, Naphthylethyl-, Chlorphenyl-, Nitrophenyl- und Carboxyphenyl-Reste, ein.
- Die Verbindung der Formel (I) schließt als Teil ihrer Struktur eine besondere Art eines chemisch konfigurierten Restes ein, der dazu befähigt ist, seine physiko-chemischen Eigenschaften zu ändern, wenn ein Komplex aus dem Calciumion und der Verbindung der allgemeinen Formel (I) gebildet wird. D.h., es findet bei Vorliegen eines Calciumions in einer Testprobe, und zwar unabhängig davon, ob weitere Ionen vorhanden sind oder nicht, eine nachweisbare Änderung bei den entsprechenden physiko-chemischen Eigenschaften statt. Diese Befähigung zur Ausübung einer entsprechenden Reaktion auf die Komplexierung trägt in großem Maße zur Eignung von Verbindung (I) zur Durchführung eines Assayverfahrens mit dem Analyt oder Ziel-Ion bei.
- Die vorher beschriebenen Verbindungen der Formel (I) können in eine Reagenszusammensetzung eingebracht werden, die sich bei Zubereitung in Form einer wässrigen Lösung, als geeignet zum Nachweis des Vorliegens bzw. Vorhandenseins von Calciumionen erwies. Da die Verbindungen der Formel (I) eine Tendenz zur Komplexbildung sowohl mit Calciumionen als auch mit Magnesiumionen aufweisen, wird ein Maskierungsmittel benötigt, um eine durch in Humanserum und weiteren biologischen Flüssigkeiten vorhandene Magnesiumionen hervorgerufene spektrale Interferenz zu eliminieren.Eine bevorzugte Reagenszusammensetzung enthält, zusätzlich zum bevorzugten chromogenen dimarkierten Tetrasäure-Diphenol, ein Maskierungsmittel für Magnesium in einer Konzentration von 0,05% (gewichtsbezogen auf das Volumen). Beispiele geeigneter Maskierungsmittel sind 8-Hydroxychinolin und 8- Hydroxychinolin-5-sulfonsäure. Weitere geeignete Maskierungsmittel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind dem Durchschnittsfachmann unmittelbar und ohne weiteres bekannt.
- Die Reagenszusammensetzung enthält auch einen Puffer, um eine pH-Umgebung von ca. 8,5 bis ca. 9,2 zu ergeben.
- Es ist herausgefunden worden, daß die Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels zum Reagens die spektrale Reaktionsweise des Chromoionophor gegenüber Calcium verbessert, wodurch eine genauere und bessere Analyse von Calcium in der Probe erreicht wird. Ein oberflächenaktives Mittel wie ein Polyethylenoxidalkylether, z.B. oberflächenaktive Mittel, die unter den Handelsbezeichnungen Brij 35, Tergitol TMN6 und Triton X-100 verkauft werden, können zur Anwendung gelangen.
- Es kann auch ein Antioxidans im Reagens enthalten sein. Ausserdem kann die Reagenszusammensetzung Herstellexzipienten, Stabilisierumittel und weitere inerte Bestandteile enthalten, die alle dem Durchschnittsfachmann ohne weiteres und unmittelbar bekannt oder auf routinemäßigem Wege ohne großen experimentellen Aufwand ermittelbar sind.
- Die Reagenszusammensetzung kann zum Gebrauch in flüssiger Form vorliegen oder in eine geeignete Trägermatrix eingebracht sein, um eine Testvorrichtung zu bilden. Die Vorrichtung kann solche Formate wie einen Eintauch-und- Ablese-Streifen für Urin oder eine Test-Platte zur Anwendung in einem automatischen Blut-Analysegerät aufweisen oder eine Mehrschichtstruktur bilden, wie sie in US 3,992,158 und 4,292,272 beschrieben ist.
- In den folgenden Beispielen sind verschiedene Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung dargelegt. Selbstverständlich sind die im folgenden beschriebenen Zubereitungen und Verfahrensweisen lediglich zum Zwecke der Veranschaulichung und Verdeutlichung angegeben, und es können weitere Bestandteile, Mengenanteile und Verfahrensweisen in Übereinstimmung mit dem affenbarungsgehalt der vorliegenden Erfindung eingesetzt und angewandt werden.
- Materialien und Verfahren
- Wenn nichts anderes angegeben ist, wurden Reaktionsteilnehmer und Lösungsmittel einer Reagensgrad-Reinheit verwendet, wie sie von den jeweiligen Chemikalienlieferanten erhalten wurden. Toluol und Acetonitril wurden über Molekularsieben (4-A) getrocknet. Aceton wurde über wasserfreiem Kaliumcarbonat getrocknet. Radikal-freies Tetrahydrofuran (THF) wurde über Natrium-Benzophenon-Ketyl vor Gebrauch destilliert.
- Die Schemlzpunkte wurden mit einem Thomas-Hoover- Kapillarapparat bestimmt, die ¹H-NMR-Spektren wurden mit einem Varian Gemini 200 MHz Spektrometer aufgenommen, und die chemischen Verschiebungen sind in Parts per Million (δ) abwärts von Tetramethylsilan angegeben. Die Elementaranalysen wurden von SPANG Mikroanaltisches Labor von Eagle Harbor, MI, durchgeführt.
- Die Synthese-Abfolge ist in Fig. 1 dargestellt und wird nun beschrieben.
- Brom (16,0 g, 100 mmol) wurde zu einer Lösung von t-Butylarnin (14,6 g, 200 mmol) in trockenem Toluol (250 ml) bei -30ºC getropft. Die Lösung wurde auf -75ºC abgekühlt, und es wurde eine Lösung von Bisphenol(1) (10,0 g, 49,9 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (150 ml) zugegeben, worauf man die Reaktionsmischung sich über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen ließ. Wasser (50 ml) wurde zugegeben, danach wurde heftig 20 Minuten lang gerührt, und es wurde die organische Schicht abgetrennt und mit 15%- igem NaOH (2 x 30 ml) gewaschen. Die vereinigten wässrigen Extrakte wurden auf -20ºC abgekühlt, mit 6 N HCl auf einen pH-Wert von ca. 2 angesäuert und mit CH&sub2;Cl&sub2; (2 x 30 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden getrocknet (über MgSO&sub4;), und es wurden das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand an einer Kieselgel-Säule mit Petrolether/CH&sub2;Cl&sub2; (1:1) als Eluierungsmittel gereinigt, um das Dibromid (2) (12,8 g, 72%) als weißen Feststoff mit F.: 92-93,5ºC zu ergeben.
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;) : δ 4,02 (s, CH&sub2;, 2H), 5,75 (br s, OH, 2H), 6,73 (t, ArH, 2H), 7,09 (d, ArH, 2H), 7,33 (d, ArH, 2H)
- Analyse:
- berechnet für C&sub1;&sub3;H&sub1;&sub0;Br&sub2;O&sub2;: C: 43,61; H: 2,82
- gefunden: C: 43,63; H: 2,73
- Eine Mischung aus Dibromid (2) (15,2 g, 42,2 mmol), Benzylbromid (24,25 g, 141,6 mmol) und aus wasserfreiem K&sub2;CO&sub3; (21,3 g, 154 mmol) in trockenem Aceton wurde gerührt und unter Argon 48 h lang am Rückfluß gehalten. Das Lösungsmittel und das überschüssige Benzylbromid wurden unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde zwischen CH&sub2;Cl&sub2; und Wasser verteilt. Die organische Schicht wurde getrocknet (über MgSO&sub4;), und es wurde das Rohprodukt an einer Kieselgel- Säule mit CH&sub2;Cl&sub2;-Petrolether (1:1 bis 3:1) als Eluierungsmittel chromatographiert, um (3) (22,8 g, 100%) als farbloses viskoses Öl zu ergeben.
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;) : δ 4,02 (s, ArCH&sub2;Ar, 2H), 4,82 (s, ArCH&sub2;O, 4H) , 6,75-7, 02 (m, ArH, 4H), 7,28-7,52 (m, ArH, 12H)
- Analyse:
- berechnet für C&sub2;&sub7;H&sub2;&sub2;Br&sub2;O&sub2;: C: 60,25; H: 4,12
- gefunden: C: 60,36; H: 4,21
- n-Butyllithium (2,4 M) (22 ml, 52 mmol) wurden bei -78ºC zu einer Lösung von Verbindung (3) (11,5 g, 22,1 mmol) in trockenem THF (300 ml) gegeben. Nach 10 Minuten wurde die Lösung in eine Lösung von Trimethylborat (63,4 g, 610 mmol) in THF (80 ml), das ebenfalls auf -78ºC gekühlt war, übergeleitet. Die sich ergebende Mischung wurde bei -78ºC 30 Minuten lang gerührt, worauf man das Ganze sich innerhalb von 1 h auf 0ºC erwärmen ließ und dann 2 N HCl (160 ml) zugab. Nach 1-ständigem Rühren wurde Ether (150 ml) zugefügt, und es wurde weitere 4 h lang gerührt. Die organische Schicht wurde abgetrennt, und es wurde die wässrige Schicht mit Ether (3 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten Ether-Schichten wurden mit 3N NaOH (3 x 100 ml) extrahiert, und es wurden die wässrigen Extrakte vereinigt und mit konzentrierter HCl bei 0ºC angesäuert. Eine weiße Feststoff-Suspension wurde über Nacht in einem Kühlschrank bei 4ºC aufbewahrt, dann wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet, um die Borsäure-Verbindung (4) (6,4 g, 62%) als weißen Feststoff zu gewinnen.
- ¹H-NMR (CD&sub3;OD): δ 4,00 (s, ArCH&sub2;Ar, 2H), 4,70 (s, ArCH&sub2;O, 4H), 6,95 - 7,50 (m, ArH, 16H)
- Eine Mischung aus o-Jodanilin (5,00 g, 22,8 g), Borsäure- Verbindung (4) (4,86 g, 10,4 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (0,34 g, 0,30 mmol), 2M wässrigem Na&sub2;CO&sub3; (30 ml), EtOH (16 ml) und aus Benzol (60 ml) wurde bei 85ºC unter Argon 48 h lang erwärmt. Es wurden 50 mg zusätzlicher Katalysator nach 24 h zugefügt. Die organische Schicht wurde abgetrennt, und es wurde die wässrige Schicht mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO&sub4;), und es wurden das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand an Kieselgel mit Petrolether-EtOAc (5:1) als Eluierungsmittel chromatographiert, um das Diamin (5) (4,48 g, 77%) als blaßgelbe glasartige Substanz zu ergeben.
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;) : δ 3,78 (br s, NH&sub2; 4H), 4,17 (s, ArCH&sub2;Ar, 2H), 4,39 (s, ArCH&sub2;O, 4H), 6,70-7,00 (m, ArH, 8H), 7,05-7,37 (m, ArH, 16H)
- Analyse:
- berechnet für C&sub3;&sub9;H&sub3;&sub4;N&sub2;O&sub2;: C: 83,25; H: 6,09
- gefunden: C: 83,24; H: 6,21
- Eine Lösung des Diamins (5) (9,05 g, 16,1 mmol), von Ethylbromacetat (26,9 g, 161 mmol) und Lutidin (17,2 g, 18,7 mmol) in trockenem CH&sub3;CN wurde zwei Tage lang am Rückfluß gehalten. Zusätzliche 5 ml Ethylbromacetat wurden zugefügt, und es wurde 1 weiteren Tag lang erwärmt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurden zwischen CH&sub2;Cl&sub2; und Wasser verteilt. Die organische Phase wurde abgetrennt, und es wurde die wässrige Schicht mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert, die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (über Na&sub2;SO&sub4;), das Lösungsmittel jirn Vakuum entfernt und der Rückstand an Kieselgel mit CH&sub2;Cl&sub2;-EtOAc (98:2 bis 95:5) als Eluierungsmittel chromatographiert, um den Tetraester (6) (7,10 g, 49%) als blaßgelbe glasartige Substanz zu ergeben.
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 1,10 (t, CH&sub3;, 12H), 3,60 - 4,45 (m, CH&sub2;N + CH&sub2;O + ArCH&sub2;Ar, 22H), 6,85 - 7,60 (m, ArH, 24H)
- Analyse:
- berechnet für C&sub5;&sub5;H&sub5;&sub8;N&sub2;O&sub1;&sub0;: C: 72,83; H: 6,44
- gefunden: C: 72,72; H: 6,49
- Eine Mischung aus Tetraester (6) (4,95 g, 5,46 mmol), 10% Pd/C (0,52 g), Essigsäure (1 ml) und EtOH (125 ml) wurde unter einem Wasserstoff-Druck von 50 psi 18 h lang geschüttelt. Der Katalysator wurde durch Filtration über Celite beseitigt, und es wurde das Lösungsmittel im Vakuum eingedampft, um die Verbindung (7) (4,0 g, 100%) als blaßgelbe glasartige Substanz zu ergeben. Eine analytische Probe von (7) wurde durch Chromatographie an Kieselgel mit CH&sub2;Cl&sub2;-EtOAc (97:3) als Eluierungsmittel erhalten.
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 1,15 (t, CH&sub3;, 12H), 3,40 - 4,30 (m, CH&sub2;O + CH&sub2;N + ArCH&sub2;Ar, 18H), 6,87 (t, ArH, 2H), 7,02-7,33 (m, ArH, 12H), 7,99 (s, OH, 2H)
- Analyse:
- berechnet für C41H46N&sub2;O&sub1;&sub0;: 67,75; H: 6,38
- gefunden: C: 67,84; H: 6,55
- Eine Mischung aus Tetraester (7) (0,94g, 1,29 mmol) in THF- H&sub2;O (1:1, 20 ml) und NaHCO&sub3; (2,6 g) wurde auf 0 bis 5ºC abgekühlt, und es wurde eine Suspension von p- Nitrobenzoldiazonium-Tetrafluorborat (2,00 g, 8,44 mmol) in kaltem THF-H&sub2;O (1:1, 32 ml) innerhalb von 40 Minuten zugetropft. Die Mischung, die sich von farblos nach rotbraun verfärbte, wurde bei Raumtemperatur 2 h lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und es wurde der Rückstand zwischen CH&sub2;Cl&sub2; und Wasser verteilt. Die wässrige Schicht wurde mehrmals mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert, und es wurden die verienigten organischen Schichten mit 2N HCl gewaschen und getrocknet (über Na&sub2;SO&sub4;). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und es wurde der Rückstand durch Chromatographie an Kieselgel mit CH&sub2;Cl&sub2;-EtOAc (98:2) gereinigt, um die Verbindung (8) (0,53 g, 40%) als dunkelorangefarbene glasartige Substanz zu ergeben.
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;); δ 1,14 (t, CH&sub3;, 12H), 3,70 - 4,25 (m, CH&sub2;N + CH&sub2;O, 16H), 4,37 (s, ArCH&sub2;Ar, 2H), 7,13 - 7,48 (m, ArH + OH, 9H), 7,83 (s, ArH, 4H), 8,10 (ABq, ArH, 8H), 8,92 (s, OH, 1H)
- Analyse:
- berechnet für C&sub5;&sub3;H&sub5;&sub2;N&sub8;O&sub1;&sub4;: C: 62,10; H: 5,11
- gefunden: C: 62,27; H: 5,12
- Wasser (4 ml) wurde zu einer Lösung des Tetraesters (8) (0,50 g, 0,49 mmol) in Dioxan (19 ml) gegeben. Die Mischung wurde in einem Eisbad gekühlt, und es wurde LiOH (0,30 g , 12,5 mmol) zugefügt. Die Mischung, die sich sofort violett verfärbte, wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum beseitigt, und es wurde der Rückstand zwischen Ether und verdünnter HCl (pH = ca. 4) verteilt. Die Ether-Schicht wurde abgetrennt, und es wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um die Tetrasäure (9) (0,48 g, ca. 100%) als rotbraunen Schaum zu ergeben.
- ¹H-NMR (CD&sub3;OD) : δ 3,50 - 4,35 (m, CH&sub2;N + ArCH&sub2;Ar, 10H), 7,04 - 7,44 (m, ArH, 8H), 7,85 (d, ArH, 4H), 8,12 (ABq, ArH, 8H)
- Analyse:
- berechnet für C45H36N8O14 x 0,5 H&sub2;O C: 58,63; H: 4,05
- gefunden: C: 58,48; H: 4,22
- Monomarkiertes Tetrasäure-Diphenol (11) wurde aus dem Zwischenprodukt Tetraester-Diphenol (7) durch die in Fig. 1 dargestellte Synthese über den Tetraester (10) durch Anwendung einer 1:1-Stöchiometrie für die Diazotierungskupplungsreaktion nach Hydrolyse der Estergruppen erhalten, wie in Fig. 2 gezeigt. Diese Verbindung weist die allgemeine Formel (I) auf, worin R Wasserstoff, X CH&sub2;, W COH, M ein p-Nitrophenylazo-Rest und n 1 sind, und worin entweder (i) k 1 und l 0 oder (ii) k 0 und l 1 sind.
- In Fig. 3 ist die Synthese eines Triaryl-Tetrasäure-Phenols der vorliegenden Erfindung dargestellt.
- Eine Mischung aus der Borsäure-Verbindung (12) (6,84 g, 25,1 mmol), 2-Jodanilin (13) (11,02 g, 50,3 mmol), Tetrakis(triphenylhosphin)palladium (0,85 g, 0,74 mmol), 2 M wässrigem Na&sub2;CO&sub3; (71 ml), Toluol (142 ml) und aus Ethanol (35 ml) wurde auf 90ºC unter Argon 48 h lang erhitzt. Zusätzliche 90 mg des Palladium-Katalysators wurden nach 24 h zugefügt. Die organische Schicht wurde abgetrennt, und es wurde die wässrige Schicht mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO&sub4;), und es wurden das Lsungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand an Kieselgel mit Petrolether-EtOAC (4:1 bis 2:1) als Eluierungsmittel chromatographiert, um das Diamin (14) (3,6 g, 39%) als grauen Feststoff mit F.: 130-132ºC zu ergeben.
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;) : δ 3,43 (br s, NH&sub2;, 4H), 4,28 (s, CH&sub2;O, 2H), 6,58 (d, ArH, 2H), 6,72-7,89 (m, ArH, 4H), 7,01 - 7,38 (m, ArH, 10H)
- Analyse:
- berechnet für C&sub2;&sub5;H&sub2;&sub2;N&sub2;O x 3,5 H&sub2;O: C: 69,91; H: 6,81
- gefunden: C: 69,94; H: 6,47
- Eine Lösung des Diamins (14) (3,41 g, 9,50 mmol) von Ethylbromacetat (15,9 g, 95,2 mmol) und Lutidin (10,2 g, 95,2 mmol) in Acetonitril (100 ml) wurde 5 Tage la[ng am Rückfluß gehalten. Zusätzliche Mengen von Ethylbromacetat (7,53 g, 45,1 mmol) und Lutidin (5,06 g, 47,2 mmol) wurden nach 24 h und 48 h zugefügt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum beseitigt, und es wurde der Rückstand zwischen CH&sub2;Cl&sub2; und Wasser verteilt. Die organische Schicht wurde getrocknet (über MgSO&sub4;), und es wurden das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand an Kieselgel mit Petrolether-EtOAc (4:1 bis 3:1) chromatographiert, um den Tetraester (15) (4,7 g, 69%) als weiße Kristalle mit F.: 120 - 122ºC zu ergeben.
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;) : δ 1,10 (t, CH&sub3; 12H), 3,60 - 4,25 (m, CH&sub2;O + CH&sub2;N, 18H), 6,51 (d, ArH, 2H), 6,95 - 7,62 (m, ArH, 14H)
- Analyse:
- berechnet für C&sub4;&sub1;H&sub4;&sub6;N&sub2;O&sub9;: C: 69,28; H: 6,52
- gefunden: C: 69,34; H: 6,57
- Eine Mischung aus dem Tetraester (15) (4,50 g, 6,33 mmol), 10% Pd/C (0,45 g), Essigsäure (1 ml) und aus Ethanol (65 ml) wurde unter einem Wasserstoff-Druck von 50 psi 24 h lang geschüttelt. Es wurden eine zusätzliche Menge des Katalysators (200 mg) und der Essigsäure (2 ml) zugefügt und die Hydrierung weitere 24 h lang durchgeführt. Der Katalysator wurde abfiltriert, das Lösungsmittel im Vakuum beseitigt und der Rückstand an Kieselgel mit Petrolether- EtOAc (4:1) chromatographiert, um (16) (3,50 g, 78%) als blaßgelbes Öl zu ergeben.
- ¹H-NMR (CDCl&sub3;) : δ, 1,14 (t, CH&sub3;, 12 H), 3,94 (br s, CH&sub2;N, 8H), 4,04 (q, CH&sub2;O, 8H), 6,90 - 7,35 (m, ArH, 11H), 8,03 (br s, OH, 1H)
- Analyse:
- berechnet für C&sub3;&sub4;H&sub4;&sub0;N&sub2;O&sub9;: C: 65,79; H: 6,50 gefunden: C: 66,02; H: 6,48
- Eine Mischung aus Tetraester-Phenol (18) (2,60 g, 4,19 mmol) in THF-H&sub2;O (1:1, 50 ml) und aus NaHCO&sub3; (4,1 g) wurde auf bis 5ºC abgekühlt, und es wurde eine Suspension von p- Nitrobenzoldiazonium-Tetrafluorborat (3,15 g, 13,3 mmol) in kaltem THF-H&sub2;O (1:1, 50 ml) zugetropft. Die Mischung wurde über Nacht gerührt, das Lösungsmittel im Vakuum beseitigt und der Rückstand zwischen CH&sub2;Cl&sub2; uind Wasser verteilt. Die organische Schicht wurde mit 2N HCl geschüttelt und getrocknet (über MgSO&sub4;), und es wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde an Kieselgel mit Petrolether-EtOAc (3:1 bis 1:1) chromatographiert, um geringfügig verunreinigten Tetraester (17) (ca. 1,6 g) zu ergeben, der in der nächsten Stufe ohne weitere Reinigung eingesetzt wurde.
- Eine Teilmenge des Tetraesters (17) (0,74 g, 0,96 mmol) wurde in einer Mischung aus Dioxan (32 ml) und entionisiertem Wasser (8 ml), enthaltend LiOH (0,59, 24,5 mmol), gelöst. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, das Lösungsmittel im Vakuum beseitigt und der Rückstand zwischen Ethylether und Wasser verteilt. Die wässrige Schicht wurde mit einer zusätzlichen Teilmenge Ethylether extrahiert und mt 2N HCl auf pH = 3,4 angesäuert. Die wässrige Schicht wurde mit Ethylether (3 x 30 ml) extrahiert, und es wurde das Lösungsmittel im Vakuum aus den vereinigten Extrakten entfernt. Man ließ das Rohprodukt durch eine Dowex 50x8 saure Kationaustauschsäule laufen, um die Tetrasäure (18) (0,18 g) als dunkelrote glasartige Substanz zu ergeben.
- ¹H-NMR (CD&sub3;OD): δ 3,99 (br s, CH&sub2;N, 8H), 7,0 - 8,5 (m, ArH, 14H)
- Analyse:
- ber. für C&sub3;&sub2;H&sub2;&sub7;N&sub5;O&sub1;&sub1; x 2H&sub2;O: C: 55,41, H: 4,50,
- gef.: C: 55,19, H: 4,86
- Diese Verbindung weist die allgemeine Formel (I) auf, worin R Wasserstoff, X CH&sub2;, W COH, M ein p-Nitrophenylazo-Rest, n 0 und k 1 sind.
- 1M Tetramethylammoniumhydroxid (TMAOH) wurde von Southwestern Analytical Chemicals gekauft. Triton X-100 und Brij-35 kamen von ICI, und Tergitol TMN6 wurde vqn Union Carbide gekauft. Calciumchlorid und Magnesiumchlorid mit analytischem Reinheitsgrad wurden verwendet, um das Reaktionsverhalten der Calcium-Chromoionophore auf die Kationen zu ermitteln. 2- (Cyclohexylamino)ethansulfonsäure (CHES) wurde von Calbiochem erhalten. 3,3'-Thiodipropionsäure kam von Sigma. Alle Materialien wurden, wie erhalten, eingesetzt.
- Die UV-VIS-Spektren der verschiedenen Formen der Calcium- Chromoionophore wurden in 1,0 x 10&supmin;&sup4; M Lösungen der jeweiligen Verbindungen in Wasser gemessen. Eine 1,0 x 10&supmin;² M Vorratsiösung der jeweiligen Verbindung wurde in 0,05 M TMAOH hergestellt. Die Lösungen wurden in typischer Weise wie folgt hergestellt. 0,02 ml der Vorratslösung wurden zu 2,0 ml des entsprechenden Reagens gegeben. 0,1 N HCl wurden zum Erhalt der Säure-Form (HL) und 0,1 M TMAOH für die Basen-Form (L) verwendet. Die sich ergebenden Lösungen wurden von 700 bis 300 nm an einem Cary-3-Spektrophotometer gescannt. Die Spektren der Kation-Komplexe (LM&spplus;) bei pH-Optimum wurden durch Zugabe von 0,02 ml CaCl&sub2; und MgCl&sub2;, jeweils 1,0 M in ihre jeweiligen Küvetten, die 2 ml Reagens enthielten, erhalten und von 700 bis 300 nm gescannt.
- 1. Spektralreaktionen von Reagentien, enthaltend die chromogenen Verbindungen der vorliegenden Erfindung
- Da es von nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln bekannt ist, daß sie sehr stark mit dem Azophenol-Chromophor wechselwirken, wurde deren Effekt auf das Wellenlängenmaximum des Calcium-Komplexes für die verschiedenen chromogenen Chromophore der vorliegenden Erfindung untersucht.
- a. Chromogenes dimarkiertes Tetrasäure-Diphenol (9)
- Die folgende Reagensformulierung wurde verwendet:
- 5,0 x 10&supmin;&sup5; M chromogenes dimarkiertes Tetrasäure-Diphenol (9) 0,1 M CHES (pH = 9,0)
- Die Spektraldaten waren:
- worin L das unkomplexierte Chromoionophor, LCA²&spplus; der Calcium- Chromoionophor-Komplex und LMG²&spplus; der Magnesium- Chromoionophor-Komplex sind.
- b. Chromogenes monomarkiertes Tetrasäure-Diphenol (11)
- Die folgende Reagensformulierung wurde verwendet:
- 1,0 x 10&supmin;&sup4; M chromogenes monomarkiertes Tetrasäure-Diphenol (11)
- 0,1 M CHES (pH = 9,0)
- Die Spektraldaten waren:
- c. Tetrasäure-Phenol (18)
- Die folgende Reagensformulierung wurde verwendet:
- 1,0 x 10&supmin;&sup4; M chromogenes Tetrasäure-Phenol (18)
- 0,1 M CHES (pH = 9,2)
- Die Spektraldaten waren:
- Die Zugabe von Brij-35 ergibt eine größere bathochrome Verschiebung der wellenlängenmaxima bei Komplexierung des Ionophor mit Calcium, wobei dieser Effekt erwünscht ist, um endogene spektrale Interferenzen herabzusetzen.
- 2. Wirkung von Brij-35 auf das Calcium-Assayverfahren
- Bei nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln wurde herausgefunden, daß sie einen wesentlichen Anstieg beim Absorptionsvermögen des Calcium-Komplexes und einen damit einhergehenden Anstieg bei der Empfindlichkeit des Reagens verursachten. Die folgende Tabelle zeigt den Effekt von Brij- 35 auf die Calcium-Reaktion auf eine Reagensformulierung von 1,0 x 10&supmin;&sup4; M dimarkiertes chromogenes Tetrasäure-Diphenol (9), 0,1 M CHES (pH = 9,0, mit 2,0 ml Reagens + 0,08 ml Probe) für verschiedene Calcium-Gehaltsmengen: Δ 500 nm
- Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt.
- 3. Bevorzugtes Reagens für ein Calcium-Assayverfahren
- Eine Reihe von Versuchen wurde durchgeführt, um das Leistungsvermögen eines das bevorzugte chromogene dimarkierte Tetrasäure-Diphenol (9) enthaltenden Reagens bei der Analyse
- von Calcium zu bewerten. Die folgende Formulierung wurde verwendet:
- 2,5 x 10&supmin;&sup4; M chromogenes Tetrasäure-Diphenol (9)
- 0,1 M CHES (pH = 9,0)
- 2,0 mM 8-Hydroxychinolin-5-sulfonsäure
- 0,1% (G/V) 3,3'-Thiodipropionsäure
- 2,0% (G/V) Triton X-100
- Die Proben wurden an einemn TECHNICON RA-XT Analysegerät von Miles Inc. bewertet (TECHNICON RA-XT ist eine eingetragene Handelsmarke von Miles Inc., Tarrytown, New York). Die folgenden Instrumentenparamenter wurden angewandt ünd eingehalten:
- Reagensvolumen 390 µl
- Probenvolumen 6 µl
- Verzug 2 min
- Filter 550 nm
- Typ Endpunkt
- Weglänge der Zelle 7 mm
- Das spektrale Reaktionsverhalten der Reagenszusammensetzung gegenüber verschiedenen Konzentrationen von Calcium in der Probe ist in Fig. 5 dargestellt.
- Die Empfindlichkeit der Reagenszusammensetzung wurde ebenfalls ermittelt, und die Daten sind die folgenden:
- 4. Spektralreaktion gegenüber Calcium eines Reagens, das das monomarkierte Tetrasäure-Diphenol (11) enthält.
- Die folgende Reagensformulierung wurde eingesetzt:
- 2,0 x 10&supmin;&sup4; chromogenes monomarkiertes Tetrasäurediphenol (11)
- 0,1 M CHES (pH 9,0)
- Bei Vermischen von 0,04 ml Probe mit 2,00 ml Reagens waren die Ergebnisse:
- 5. Spektralreaktion gegenüber Calcium eines das Tetrasäure- Phenol (18) enthaltenden Reagens
- Die folgende Reagensformulierung wurde eingesetzt:
- 1,1 x 10&supmin;&sup4; M chromogenes Tetrasäure-Diphenol
- 0,1 M CHES (pH = 9,2)
- 1,0% (G/V) Brij-35
- Bei Vermischen von 0,05 ml Probe mit 2,00 ml Reagens waren die Ergebnisse:
- 6. Korrelation des Verfahrens unter Verwendung eines das dimarkierte Tetrasäure-Diphenol (9) enthaltenden Reagens gegenüber dem AAS-Verfahren
- Es wurde die Reagensformulierung von IV A 3 eingesetzt.
- Proben mit weniger als 8 mg/dl Ca²&spplus; wurden durch Verdünnen von Biocell-Human-Poolserum mit einem Verdünnungsmittel (wässriges 140 mM NaCl/4 mM KCl) erhalten. Proben mit Calcium-Werten von mehr als 11 mg/dl wurden durch Zugabe entsprechender Anteilsmengen von 1,0 M CaCl&sub2; zu Human- Poolserum erhalten. Der Haupt-Assay-Wert des RA system - Kalibrators wurde herangezogen, um das Reagens bei der Korrelation zu kalibrieren. Die Korrelation des neuen Calcium-Verfahrens gegenüber dem Atomabsorptionsspektrophotometer(AAS)-Verfahren war sehr gut (Fig. 6).
- Einige Vorteile der vorliegenden Erfindung, welche aus der vorstehenden Beschreibung ersichtlich sind, betreffen das Assayverfahren sowie Reagenszusammensetzungen, bei denen chromogene achtzähnige Tetracarboxyl-Phenole und -Diphenole zur Anwendung gelangen, wobei die quantitative Bestimmung von Calcium in Blutserum und weiteren biologischen Flüssigkeiten durch spektrophotometrische Verfahren in einem homogenen Einzelreagensverfahren durchgeführt wird. Das entwickelte Assayverfahren und die entsprechenden Reagenszusammensetzungen lassen sich ohne weiteres an einem automatisierten klinischen Blut-Analysegerät zur Anwendung bringen.
Claims (10)
1. Chromogene Verbindung mit der Struktur:
worin gilt:
R ist Wasserstoff oder ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylrest;
X ist CH&sub2;, CH&sub2;CH&sub2;, CH=CH, O, S, SO&sub2;, S-S, NR;
W ist CH, C-OH oder N;
M ist ein p-Nitrophenylazo-, 2,4-Dinitrophenylazo-, 2,4,6-
Trinitrophenylazo-, p-Nitrostyryl-, p-Benzochinonimino-, Bis-
(4-dimethylaminophenyl)hydroxymethyl-, 3-Phenylisothiazolyl-
5-azo-, Thiazolyl-5-azo- oder ein Isothiazolyl-5-azo-Rest;
k ist 1;
l ist 0 oder 1; und
n ist 0 oder 1.
2. Chromogene Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R
Wasserstoff, X CH&sub2;, W COH, M ein p-Nitrophenylazo-Rest und k,
l und n 1 sind.
3. Zusammensetzung zum Nachweis des Vorliegens von
Calciumionen in Lösung, wobei die genannte Zusammensetzung
die Verbindung aus einem der Ansprüche 1 bis 2, ein
Maskierungsmittel für Magnesium, ein oberflächenaktives
Mittel und einen Puffer enthält, um den pH-Wert der
Reagenszusammensetzung auf 8,5 bis 9,2 einzustellen.
4. Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, worin das
oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von ca. 2
Gew.%, bezogen auf das Volumen, vorhanden ist.
5. Zusammensetzung gemäß jedem der Ansprüche 3 und 4, worin
das oberflächenaktive Mittel ein Polyethylenoxidalkylether
ist.
6. Verfahren zur selektiven Bestimmung des Vorliegens von
Calciumionen in einer Testprobe, wobei man:
die genannte Testprobe mit einer Reagenszusammensetzung, die
eine der Verbindungen gemäß jedem der Ansprüche 1 und 2
enthält, zusammenbringt.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6,
worin die genannte Reagenszusammensetzung ferner ein
Maskierungsmittel für Magnesium, ein oberflächenaktives
Mittel und einen Puffer enthält, um den pH-Wert der
Reagenszusammensetzung bei 8,5 bis 9,2 aufrechtzuerhalten.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7,
worin das oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von
ca. 2 Gew.%, bezogen auf das Volumen, vorhanden ist.
9. Verfahren zur Herstellung eines chromogenen Ionophor der
Formel (I):
wobei man:
(a) eine Verbindung (2) bereitstellt, die die Formel
aufweist:
(b) die Phenol-Gruppen der Verbindung (2) schützt, um eine
Verbindung mit der Formel (3) zu ergeben:
(c) die Verbindung (3) lithiiert und boriert, um eine
Verbindung der Formel (4) zu ergeben:
(d) die Verbindung (4) mit einer Verbindung der Formel (5):
in der Gegenwart eines Katalysators reagieren läßt, um eine
Verbindung (6) mit der Formel zu bilden:
(e) die Verbindung (6) alkyliert, um eine Verbindung (7) der
Formel zu bilden:
(f) die Phenolgruppen der Verbindung (7) von den
Schutzgruppen befreit, um eine Verbindung (8) mit der Formel
zu bilden:
(g) die Verbindung (8) mit einer Verbindung (9) der Formel:
kuppelt, um Verbindung (10) zu bilden:
(h) die Verbindung (10) hydrolysiert, um die chromogene
Verbindung (I) zu bilden,
wobei gilt:
R ist Wasserstoff oder ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylrest;
R' ist ein Benzyl-, Allyl-, Methoxymethyl-, Ethoxyethylrest;
R" ist ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-, Arylrest;
R"' ist eine Elektronen abziehende Gruppe (NO&sub2;, CF&sub3;,
SO&sub2;R,COOR)
L ist Cl, Br, BF&sub4;;
X ist CH&sub2;, CH&sub2;CH&sub2;, CH=CH, O, S, SO&sub2;, S-S, NR;
Y ist Cl, Br, J;
M ist ein p-Nitrophenylazo-, 2,4-Dinitrophenylazo-, 2,4,6-
Trinitrophenylazo-, p-Nitrostyryl-, p-Benzochinonimino-, Bis-
(4-dimethylaminophenyl)hydroxymethyl-, 3-Phenylisothiazolyl-
5-azo-, Thiazolyl-5-azo- oder ein Isothiazolyl-5-azo-Rest;
k ist 1;
l ist 0 oder 1; und
n ist 0 oder 1.
10. Verwendung der Verbindung gemäß jedem der Ansprüche 1
und 2 bei der Bestimmung von Calcium.
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