DE3853825T2 - Ionophore als reagenz zur bestimmung von ionen. - Google Patents
Ionophore als reagenz zur bestimmung von ionen.Info
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Description
- Es wurden neuartige Ionophore synthetisiert, die Ionen, wie Kalium, Natrium und Lithium, sogar in neutralen wäßrigen und alkoholischen Medien selektiv binden und auf eine solche Bindung durch Dämpfen oder Verstärken der Fluoreszenz reagieren. Diese Ionophore sind ideal für die selektive und direkte Bestimmung von gewissen Ionen in biologischen oder Umweltproben. Die Ionophore sind auch zweckmäßig für den Einbau in auf Faseroptik basierenden Sensoren für die kontinuierliche In-vivo oder In-vitro-Überwachung von Metallionen in Blut oder anderen biologischen Fluiden.
- Chromogene Ionophore (oder Ionophor-Farbstoffe) sind eine Klasse von auf Farbe reagierender Reagenzien für die Bestimmung von Ionen von Alkali- und Erdalkalimetallen. In diesen Reagenzien wird eine größenspezifische ionophore Gruppe (das ionenerkennende Ionophor) mit einem aromatischen Ring verschmolzen, welcher seinerseits mit einem Chromophor, wie einer Azo- oder einer Picrylamino-Gruppe, funktionalisiert wird. Chromogene Ionophore wurden ausgiebig untersucht (siehe H-G. Lohr und F. Vogtle, "Chromo and Fluoroionophores. A New Class of Dye Reagents," Acc. Chem. Res. 1985, 18, 65-72; M. Tagaji, und K. Uneo, "Crown Compounds as Alkali and Alkaline Barth Metal Ion Selective Chromogenic Reagents," Top. Curr. Chem. 1984, 121, 39-65). Es gibt zwei Klassen von chromogenen Ionophoren, jene, die eine vom ph-Wert abhängige Reaktion zeigen und jene, die bei einem neutralen PH-Wert funktionieren. Die erstere Klasse der Ionophoren zeigt dramatische Farbveränderungen. Die gefärbte Form wird jedoch gewöhnlich in organischen Lösungsmitteln festgestellt, und somit ist ein Extraktionsschritt zusätzlich zur Einstellung des ph-Wertes des Systems wesentlich. In der Technik gegenwärtig bekannte Chromionophore, die bei einem neutralen ph-Wert funktionieren, müssen noch eine ausreichende Farbveränderung zeigen. Ohne eine leicht feststellbare Farbveränderung können diese Chromionophore nicht als analytische Reagenzien zweckmäßig sein.
- Ein zweiter Typ von Ionophoren sind die "Fluorionophore". Die Messung der Fluoreszenzdämpfung oder einer verstärkten Fluoreszenzemission bei Bindung von Metallionen an diese fluorogenen Ionophoren ist genauer als Messungen, die auf chromogenen Phänomenen basieren. Dies ist der Fall, weil Fluoreszenzmessungen gegen einen dunklen Hintergrund vorgenommen werden, während chromogene Verfahren die Bestimmung der Absorptionsmaxima oder der Veränderungen in den Absorptionskoeffizienten erfordern. Unter den von der Literatur berichteten fluorogenen Ionophoren befinden sich jene von Nishida et al. in "Fluorescent Crown Ether Reagent For Alkali and Alkaline Earth Metal Ions," Chem. Lett., Seiten 1853-1854 (1982) und von Kenneth W. Street, Jr. und Shelly A. Kraus in "A New Metal Sensitive Fluorescence Reagent," Anal. Lett., 19 (7 und 8), 735-745 (1986), sowie von A. P. deSilva et al. in "Fluorescent Signaling Crown Ethers: 'Switching On' of Fluorescence by Alkali Metal Ion Recognition and Binding in situ", J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1986, 1709-10, beschriebenen. Allerdings leiden alle obigen Ionophore insofern unter einem Nachteil, als sie vom PH-Wert abhängig sind und nur bei einem PH-Wert funktionieren können, der viel höher ist als jener von normaler Körperflüßigkeit, und deshalb können sie nicht für Anwendungen in-vivo benutzt werden.
- Die vorliegende Erfindung schafft ein neuartiges Ionophor, das ein mit einer "Signalhälfte" verschmolzenes "ionenerkennendes System" umfaßt, welches Ionophor die allgemeine Strukturformel "Signalhälfte" "ionenerkennendes System"
- aufweist.
- Die Erfindung schafft ein Ionophor mit einem ionenerkennenden, mit einer Cumarinsignalhälfte über zwei Sauerstoffatome verschmolzenen Entschlüsselungssystem, das zur selektiven Bindung mit einem Na-, K- oder Li-Ion fähig ist, welches Ionophor eine Struktur der Formel:
- aufweist, worin:
- n und m gleiche oder unterschiedliche ganze Zahlen sind und n gleich 0 bis 3 und m gleich 0 bis 5 ist, und
- R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; gleich oder verschieden sind und von Wasserstoff, einer Hydroxy-, Amino- oder Alkylgruppe, einem fluorierten Kohlenwasserstoff, einem Aryl oder einem Thiol gebildet und derart gewählt sind, daß sie die selektive Bindung nicht stören.
- Figur 1 stellt ein Diagramm der Absorptionswerte und der relativen Intensität der Fluoreszenz gegenüber der Konzentration eines repräsentativen Reagenz-Ionophors dar.
- Figur 2 stellt die selektive Verstärkung der Fluoreszenz eines 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[222]-Entschlüßlers bei Bindung mit einem Kalium-Ion dar.
- Figur 3 stellt die selektive Verstärkung der Fluoreszenz eines 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[221]-Entschlüßlers bei Bindung mit einem Natrium-Ion dar.
- Figur 4 stellt die selektive Verstärkung der Fluoreszenz eines 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[211]-Entschlüßlers bei Bindung mit einem Lithium-Ion dar.
- Figur 5 stellt die selektive Verstärkung der Fluoreszenz eines 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[211]-Entschlüßlers bei Bindung mit einem Lithium-Ion in Gegenwart von Kryptofix 221 dar.
- Figur 6 stellt ein Diagramm der relativen Intensität der Fluoreszenz eines 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[211]-Entschlüßlers gegenüber Veränderungen der Konzentration von Na&spplus; und Li&spplus; dar.
- Figur 7 stellt ein Diagramm der Veränderungen der relativen Intensität der Fluoreszenz eines 6,7-(4-Methyl)-Cumaro[211]-Entschlüßlers gegenüber Veränderungen der Konzentration von Na&spplus; und Li&spplus; in Gegenwart von Kryptofix dar.
- Figur 8 stellt ein Diagramm der Fluoreszenz eines 6,7- (4-Methyl)-Cumaro-[222]-Entschlüßlers relativ zur Bindung eines Kalium-Ions in Gegenwart von serumähnlichen Konzentrationen von Natrium-Ionen dar.
- Figur 9 stellt ein Diagramm der Fluoreszenz eines 6,7- (4-Methyl)-Cumaro-[211]-Entschlüßlers relativ zur Bindung eines Lithium-Ions in Gegenwart von serumähnlichen Konzentrationen von Natrium-Ionen dar.
- Die selektiven Reagenz-Ionophore nach der vorliegenden Erfindung umfassen zwei Hälften, nämlich eine Cumarinhälfte, die eine "Signalhälfte" liefert, und eine dreidimensionale ionophore Entschlüsselungshälfte, wobei die letztere mit verschiedenen Metallionen Komplexe bilden kann. In diesem Sinne bildet der dreidimensionale Entschlüßler das "ionenerkennende System". (Siehe allgemeine Struktur I).
- Die "Signalhälfte" bei den Verbindungen nach der Erfindung ist eine chemische Hälfte, die an den "ionenerkennenden" Entschlüßler gebunden ist und beim Bilden eines Komplexes eines Metallions mit der Entschlüßlerhälfte eine Veränderung der optischen Eigenschaften an den Tag legen kann. Diese Veränderung der optischen Eigenschaften kann kolorimetrisch nachgewiesen werden, wenn die Bindung des Metallions zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximums führt, oder fluorometrisch, wenn eine Veränderung der Fluoreszenz stattfindet.
- Die Signalhälfte wird als chromogen betrachtet, wenn die Veränderung der optischen Eigenschaften eine kolorimetrische ist. Diese Veränderung kann sichtbar oder durch die Verwendung von spektrophotometrischen Messungen oder durch Reflexionsmessungen bestimmt werden.
- Die Veränderung der optischen Eigenschaften wird fluorometrisch nachgewiesen, wenn die Bindung des Metallions eine Dämpfung oder Verstärkung der Fluoreszenz bewirkt. Fluoreszenzmessungen werden Absorptionsmessungen gegenüber bevorzugt, da die Lichtintensitäten gegen einen dunklen Hintergrund gemessen werden. Zusätzlich wird zwischen der Fluoreszenzdämpfung und der Fluoreszenzemission die letztere bevorzugt, da bei dieser Messung das Verhältnis von Signal zu Geräusch minimiert wird, insbesondere bei höheren Konzentrationen von Metallionen. Somit ist die Sigualhälfte in den dreidimensionalen fluorogenen Entschlüßlern nach der Erfindung dazu vorgesehen, Licht zu absorbieren, vorzugsweise oberhalb 300 nm, und die absorbierte Lichtenergie als Fluoreszenz wieder auszustrahlen. Die Signalhälfte enthält eine chromophore Gruppe oder mehrere chromophore Gruppen, die einer wirksamen Absorption von Lichtenergie fähig sind.
- Die Reagenz-Ionophore der Erfindung enthalten Cumarin(oder 1,2-Benzopyron)-Ringsysteme als fluoreszierende Signalhälfte. Cumarin (1,2-Benzopyron) Struktur 8
- Die Struktur 9 (a) und (b) ist repräsentativ (Substituenten durch R&sub1; -R&sub4; angezeigt): Struktur 9
- worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; gleich oder verschieden sind und von H, einer Hydroxy-, Amino-, Alkyl- oder Arylgruppe, einem fluorierten Kohlenwasserstoff oder einem Thiol (und 3DC = dreidimensionaler Entschlüßler) gebildet sind.
- Bei den bevorzugteren Ausführungsbeispielen wurde entdeckt, daß die Substitution des Wasserstoffs an der Position 7 im Cumarinring mit einem Heteroatom mit freien Elektronenpaaren den Quantenertrag der Fluoreszenz fördert. Während die vorliegenden Erfinder nicht wünschen, durch eine Theorie gebunden zu sein, mag dies auf die Stabilisation der dipolaren Form zurückzuführen sein, wie in den Strukturen 10 und 11 für das Sauerstoffatom illustriert ist, welches das Übergangsmoment der elektronischen Erregung des Moleküls mit niedrigster Energie erhöht: Struktur 10 Struktur 11
- Ein besonders bevorzugtes Reagenz-Ionophor nach der Erfindung umfaßt 4-Methylcumarin, das durch die Positionen 6 und 7 oder 7 und 8 mit einem dreidimensionalen Entschlüßler verschmolzen ist. Die Verschmelzung findet durch -0- statt Die Strukturen 12 und 13 bilden gewisse bevorzugte Ausführungsbeispiele ab. Struktur 12 Struktur 13
- Obwohl die vorliegenden Erfinder nicht wünschen, durch eine wissenschaftliche Theorie gebunden zu sein, oder in anderer Weise dadurch beschränkt zu werden, entdeckten sie, daß Verbindungen, wie jene in den Strukturen 12 und 13 gezeigten, in polare Zustände erregt werden können, wenn sie bestrahlt werden. Es wurde postuliert, daß in dem Falle, in dem das Metallion mit dem Ionophor eine Bindung eingeht, dieses die Elektronen von den Heteroatomen des Ionophores abzieht und somit Störungen der Elektronen in diesen Heteroatomen bewirkt, d.h.: die Elektronen fließen von den Heteroatomen zu dem neu zu Komplexen verbundenen Metallion. Bei den Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung ist eines der Heteroatome eine Quelle von Elektronen, die beim Verfahren der optischen Reizung zum entferntliegenden Carbonylsauerstoff transportiert werden. Das Molekül reagiert als Ganzes auf die Gegenwart eines selektiv gebundenen Metallions, was zu einer Veränderung der Fluoreszenzemission führt. Diese Veränderung wird dazu benützt, um auf die Gegenwart des Zielmetallions zu schließen, das von seinem umgebenden Medium abgezogen wurde, um an das Ionophor gebunden zu werden, und gewünschtenfalls seine Menge quantitativ zu bestimmen. Somit dient die Signalhälfte als optischer Wandler zum Messen der ionenerkennenden Fähigkeit des Ionophors.
- Die ionenerkennende Hälfte der neuen Verbindungen nach der Erfindung ist ein dreidimensionaler Entschlüßler, der hinsichtlich seiner Hohlraumdimensionen weitgehend variieren kann. Unter dem Begriff "Hohlraum" wird jener dreidimensionale kugelförmige Raum verstanden, der für innerhalb des Entschlüßlers anbindende Metallionen verfügbar ist. Im allgemeinen sollten die Dimensionen des Hohlraumes ungefähr der Größe des Ionendurchmessers desjenigen Ions entsprechen, das unterzubringen erwünscht ist. Es ist somit bevorzugt, daß die Dimensionen des Hohlraums nicht wesentlich größer oder kleiner als der Ionendurchmesser sind. In diesem Sinne ist es bevorzugt, daß die Dimensionen des Hohlraums vom Ionendurchmesser des Ions nicht um mehr als ungefähr ± 0,8Å, vorzugsweise nicht mehr als etwa ± 0,5Å, und am bevorzugtesten nicht mehr als ungefähr ± 0,2Å, abweichen.
- Man sollte sich bewußt sein, daß die Entschlüßler gemäß ihren Hohlraummessungen für die Bestimmung von besonderen Ionen ausgewählt werden. Beispielsweise besitzt das Lithiumion einen Ionendurchmesser von 1,2Å, das Natriumion ungefähr 1,9Å und das Kaliumion ungefähr 2,66Å. Somit kann der Durchmesser des Hohlraumes von 1,3Å bis 3,0Å variiert werden, um diese besonderen Ionen selektiv unterzubringen. Ein Fachmann wird verstehen, daß die Größe des Hohlraumes durch Erhöhen der Anzahl überbrückender Äthoxygruppen (zum Beispiel durch Erhöhen der Anzahl der Wiederholungseinheiten n und m in den Strukturen 12 und 13 von 0 bis 12) zunehmend erhöht werden kann.
- Aus der Arbeit von J.M. Lehn ("Cryptates: Macropolycyclic Inclusion Complexes," Pure & Appl. Chem., 1977, 49, 857- 870) ist bekannt, daß 211-, 221- und 222-Entschlüßler (Strukturen 14, 15 und 16) Struktur 14 Struktur 15 Struktur 16
- mit einem jeweiligen Durchmesser des Hohlraums von 1,6Å, 2,2Å und 2,8Å, selektiv sind für die Bindung eines Lithium-, Natrium- und Kaliumions und somit als ionenerkennende Hälften der Reagenzien nach dieser Erfindung bevorzugt sind.
- Bei der Herstellung der Verbindungen nach der Erfindung wird die Signalgruppe an zwei anhängenden reaktiven Gruppen angefügt. Von diesen anhängenden reaktiven Gruppen können 2-Hydroxyäthoxy, 2-Chloräthoxy, 2-Jodäthoxy, 3-Hydroxypropoxy und die entsprechenden Chlor- und Jodanaloga dieser Verbindungen u.dgl. erwähnt werden. Diese Reaktion kann durch herkömmliche Verfahren, wie nukleophile Substitutionsreaktionen, durchgeführt werden.
- Beispielsweise können diese beiden anhängenden Gruppen gleichzeitig an die beiden Stickstoffe eines zweidimensionalen Diazakronenäthers angefügt werden, um den dreidimensionalen Entschlüßler zu erzeugen. Von den bei dieser Synthese zweckmäßigen zweidimensionalen Diazakronenäthern können 1,10-Diaza-18-Kronen-6, 1,7-Diaza-15-Kronen-5 1,7-Diaza-12-Kronen-4, 1,10-Diaza-21-Kronen-7, 1,13-Diaza-24-Kronen-6, 1,13-Diaza-27- Kronen-7, 1,16-Diaza-30-Kronen-8 und 1,4-Diaza-9-Kronen-3 erwähnt werden. Solche Kronenäther können im Handel erhalten oder zuerst gemäß in der veröffentlichten Literatur dargelegten Verfahren de novo synthetisiert werden. Man sollte sich bewußt sein, daß die Größe des zweidimensionalen Diazakronenäthers in großem Ausmaße die Größe des Hohlraums des sich ergebenden dreidimensionalen Entschlüßlers bestimmen wird.
- Bei den bevorzugten Synthesen der bevorzugten Ionophoren wird eine fluoreszierende Signalhälfte, wie 4-Methylcumarin, an den Positionen 6 und 7 durch Umsetzen von im Handel erhältlichem 4-Methyläsculetin (6,7-Dihydroxy-4-Methylcumarin) mit zwei Moläquivalenten von 2-Bromäthanol an die anhängenden 2-Hydroxy-Äthoxy-Gruppen angefügt. Die sich ergebende Verbindung wird chloriert, und die Chloratome werden durch Jodatome ersetzt, um 6,7-Di-(2'-Jodäthoxy)-4-Methylcumarin zu bilden. Diese Verbindung kann dann vorzugsweise mit Diazakronenäthern, wie 1,10-Diaza-18-Kronen-6, 1,7-Diaza-15-Kronen-5 oder 1,7- Diaza-12-Kronen-4 umgesetzt werden, um einen 6,7-(4-Methyl)- Cumaro-[222]-Entschlüßler und die jeweiligen [221]- und [211]- Entschlüßler zu erhalten. 1,10-Diaza-18-Kronen-6 und 1,7-Diaza- 15-Kronen-5 sind im Handel erhältlich, und 1,7-Diaza-12-Kronen- 4 kann gemäß dem Verfahren von J.M. Lehn (US-A-3,888,877, 10. Juni 1975) synthetisiert werden.
- In seinem breitesten Aspekt kann das Verfahren der Verwendung der Verbindungen nach der Erfindung als Reagenz-Ionophore zum Bestimmen von Ionen durch einfaches Kontaktieren des Ionophors mit derjenigen Probe ausgeführt werden, welche die Zielionen enthalten kann. Die Bestimmung der Ionen unter Verwendung der Ionophoren nach der Erfindung kann in flüssigen Medien stattfinden, die in ihrer Zusammensetzung weitgehend variieren. Beispielsweise ist ein reines Alkoholmedium, ein reines wäßriges Medium oder ein Gemisch der beiden zweckmäßig. Wenn das Reagenz-Ionophor jedoch in flüssiger Form verwendet wird, ist es in einem Lösungsmedium bevorzugt, das sich mit der zu analysierenden Probe verträgt.
- Man sollte sich bewußt sein, daß die vorliegenden Reagenz-Ionophore, speziell die fluorogenen Ionophore, in Medien mit neutralem oder basischem ph-Wert recht gut funktionieren. Somit ist eine Überwachung von rohen biologischen Systemen mit diesen Reagenzien möglich. Rohe biologische und physiologische und Umweltproben können in ihrem natürlichen Zustand auf ihren Ionengehalt untersucht werden, vorzugsweise nach dem Durchführen einer minimalen Präparierung der Probe, wie dem Befreien der Probe von suspendierten Verunreinigungen u.dgl. Das letztere kann durch Filtrieren, Sedimentieren, Zentrifugieren oder jede andere zweckmäßige konventionelle Technik bewerkstelligt werden. Man sollte sich jedoch bewußt sein, daß der Säuregehalt des Mediums vorzugsweise oberhalb einem ph-Wert von ungefähr 6,0 liegen sollte. Wenn es somit erwünscht ist, eine stark saure Probe zu analysieren, zum Beispiel einen Mageninhalt, sollte die Probe vor der Analyse neutralisiert werden. Der ph-Wert des untersuchten Mediums liegt vorzugsweise zwischen 7 bis 12.
- Die chromogenen Ionophore nach der Erfindung können bis zu einem gewissen Ausmaße in neutralen oder basischen Medien verwendet werden und zeigen beim Binden an das Ion eine meßbare Veränderung des Absorptionsmaximums oder der Reflektivität. Die erfindungsgemäßen fluorogenen Reagenz-Ionophore bieten jedoch den größten Vorteil für einen Betrieb in neutralen oder basischen Medien, und werden somit für eine Verwendung in solchen Systemen bevorzugt, speziell wenn eine Überwachung in vivo erwünscht ist.
- Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als Reagenz- Ionophore in Lösung zur Bestimmung von Ionen verwendet werden. Die Konzentrationen der Reagenz-Ionophoren können je nach dem benutztem Ionophor und dem Medium, in dem die Ionenbestimmung stattfinden soll, weitgehend variieren. Infolgedessen kann eine jegliche Konzentration, die dazu dient, sich mit einem Ion in einem gegebenen Medium zu einem Komplex zu verbinden, benutzt werden, und ein Fachmann wird leicht erkennen, daß die Ionophor-Konzentrationen optimiert werden können. Die vorliegenden Erfinder entdeckten jedoch, daß bei der Benutzung von Reagenz- Ionophoren in einem Wasser/Äthanol-Lösungssystem eine bevorzugte Konzentration des Reagenz-Ionophors 2,10&supmin;&sup5;M bis 3,10&supmin;&sup4;M beträgt. Diese bevorzugten Bereiche helfen eine Selbstdämpfung durch die Ionophoren zu verhindern.
- Man erwartet, daß die maximale Wirksamkeit der Fluoreszenz für fluorogene Ionophoren (wie das oben beschriebene) ungefähr bei einer Konzentration des Ionophors von 10&supmin;&sup4; M liegt (siehe Beispiel 7). Oberhalb dieser Konzentration kann erwartet werden, daß die Fluoreszenzemission infolge Selbstdämpfung abnimmt.
- Die Verbindunen können auch durch konventionelle Techniken für eine Verwendung als Reagenz-Ionophor immobilisiert werden, wie durch das Dispergieren der Verbindung in einer Matrix, wie einer Polymermatrix. Andere Möglichkeiten schließen die chemische Anbindung der Verbindung an die Matrixkomponenten oder herkömmliche Feststoffträger ein. Wenn die Verbindung so immobilisiert sind, kann die Konzentration der Ionophoren weitgehend variieren, und sie kann über 3,10&supmin;&sup4;M hinaus erhöht werden. Selbstdämpfung ist in dieser Situation kein Faktor.
- Matrizes sind speziell für eine Verwendung mit den chromogenen Ionophoren der Erfindung geeignet. Zweckmäßige Matrixkomponenten in dieser Beziehung sind jedwede Materialien, die dazu dienen können, das chromogene Reagenz-Ionophor auf eine im wesentlichen homogene Weise zu dispergieren. Die Homogenität wird das Schaffen einer gleichmäßigen Oberfläche für den Kontakt mit einer Probe erleichtern, welche möglicherweise ein zu untersuchendes Metallion enthält. Die Matrixkomponente sollte ein dispergierendes Medium sein, das insofern merkbar inert ist, als es eine erwünschte Farbentwicklung nicht behindert. Ferner ist bevorzugt, daß die Matrix lichtdurchscheinend bzw. transparent sei, so daß optimale optische Eigenschaften, wie die UV-Absorption, das Reflexionsvermögen und die Fluoreszenz genau gemessen werden können. Andere Formen der Immobilisierung schließen das Ablagern des Reagenzmittels durch herkömmliche Techniken auf optische Fasern ein.
- Der Bestimmbarkeitsbereich der Reagenz-Ionophoren nach der vorliegenden Erfindung für Ionen variiert weitgehend gemäß dem Ion, das zu bestimmen erwünscht ist und dem Medium, in dem die Bestimmung stattfindet. Ein Fachmann wird einsehen, daß die Konzentration des Analytions, über das es durch ein gegebenes fluorogenes Ionophor bestimmt werden kann, durch das Auflösen von bekannten Mengen des Ions in einer Lösung des Ionophors und durch graphisches Darstellen der Fluoreszenzemissionswerte gegenüber der Ionenkonzentration festgestellt werden kann. Es ist im allgemeinen bevorzugt, daß eine Lösung von ungefähr 10&supmin;&sup4;M des Ionophors zu diesem Zwecke benutzt wird. Graphische Darstellungen, wie diese, werden herkömmlicherweise als Norm verwendet, gegenüber welchen Emissionswerte von einer Probe, die eine unbekannte Ionenkonzentration enthält, verglichen werden können, um so die unbekannte Ionenkonzentration in der Probe zu bestimmen. Ähnliche Bereiche der Bestimmbarkeit können für die chromogenen Ionophoren bestimmt werden, indem die Veränderungen der Absorptionswerte gemessen und graphisch dargestellt werden. Visuelle Farbveränderungen können für gewisse Konzentrationen auch standardisiert werden, um Normfarbkarten zu entwickeln.
- Hinsichtlich der Bestimmung von Lithiumionen entdeckten die vorliegenden Erfinder, daß im Falle eines 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[211]-Entschlüßlers die Fluoreszenzemission bei Zugabe von Lithiumionen in Mengen bis zu ungefähr 5 mmol/l zunimmt, und bei ungefähr 6 mmol/l (Figur 6) einen Grenzwert erreicht. Somit scheint die Bestimmbarkeit dieses Reagenz-Ionophors für Lithiumionen bei 0 bis 6 mmol/l Lithiumionen zu liegen. Natrium zeigt bis zu einer Konzentration von ungefähr 6 mmol/l ebenfalls eine Zunahme der Fluoreszenzemission. Die maximale Verstärkung der Fluoreszenz beträgt jedoch weniger als ungefähr 25% jener, die man für Lithiumionen beobachtete, und somit können Lithiumionen in Gegenwart eines Natriumions bestimmt werden.
- Eine durch Natriumionen in einem System wie diesem verursachte Störung der Fluoreszenz kann durch Verändern des Mediums, in dem die Bestimmung stattfindet, auch selektiv unterdrückt werden. Dies kann durch Zugabe eines bekannten Überschusses eines im Handel erhältlichen, natriumionenselektiven, nicht-lichtansprechenden Ionophors, zum Beispiel 120 bis 180 mmol/l Kryptofix 221, bewerkstelligt werden. Auf diese Weise kann der Bestimmbarkeitsbereich für Lithiumionen so modifiziert werden, um von 0-20 mmol/l Lithiumionen zu reichen, wohingegen Natriumionen nicht störend wirken (siehe Figur 7). Andere Beispiele möglicher Modifikationen bestünden darin, einen [221]- Entschlüßler an ein Polymergerust zu binden (J. Nuclear Sci. & Technol., 1983 20, 439-440). Diese Konstruktion ist dazu fähig, Natriumionen durch Präzipitation zu sequestrieren, und wird in einigen Fällen gegenüber der Verwendung von Kryptofix 221 zum Verbessern sowohl der Selektivität wie auch der Sensitivität des 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[211]-Entschlüßlers für Lithium- Ionen bevorzugt.
- Hinsichtlich der Bestimmung von Kaliumionen zeigt eine graphische Darstellung der Fluoreszenzemission einer Lösung von 10&supmin;&sup4;M eines 6,7,(4-Methyl)-Cumaro-[222]-Entschlüßlers gegenüber der Kaliumionen-Konzentration einen selektiven Grenzwert bei ungefähr 15 mmol/l Kaliumionen. Dehalb wird angenommen, daß der bevorzugte Bereich für die Bestimmung von Kaliumionen unter Verwendung dieses Ionophors ungefähr von 0 bis 15 mmol/l Kaliumionen reicht, welcher ziemlich weit oberhalb des erwarteten Niveaus dieses Ions in biologischen Proben, wie menschlichem Blutserum, liegt. Ähnliche Bereiche zur Bestimmung von Natriumionen mit einem 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[221]-Entschlüßler sind ebenfalls bevorzugt.
- Zusätzlich zum selektiven Sequestrieren von störenden Ionen, wie oben angemerkt, können der Bestimmungsbereich und die quantitativen Fähigkeiten der erfindungsgemäßen Reagenz- Ionophore durch andere Mittel erhöht werden. Beispielsweise wird ein Fachmann einsehen, daß eine Probe, die eine hohe Konzentration des zu untersuchenden Ions enthält, so verdünnt werden kann, daß die Konzentration des Ions zum optimalen Bereich seiner Bestimmbarkeit fällt. Wie oben angedeutet, mag ein zweiter Ansatz darin bestehen, das Ionophor durch konventionelle Techniken an einer Feststofffläche zu immobilisieren. Eine Immobilisation wird die Selbstdämpfung verhindern, und der Bestimmbarkeitsbereich kann durch Erhöhen der Beladungsmengen mit dem immobilisierten Ionophor erweitert werden, so daß zum Bilden von Komplexen mehr Reagenz-Ionophor verfügbar ist.
- Die Ionophore nach der vorliegenden Erfindung können in vielen verschiedenen Anwendungen verwendet werden, bei denen es erwünscht ist, spezifische Ionen zu bestimmen. Selektive Ionophore für Kaliumionen sind bei der schnellen und genauen Bestimmung dieser Ionen in Körperfluiden u.dgl. von Interesse. Es können selektive fluorogene Ionophore für Kalium in Reagenzausrustungen verwendet werden, wobei herkömmliche Protokolle leicht zum Mischen einer Lösung entwickelt werden können, vorzugsweise einer alkoholischen Lösung des Ionophors mit Blutserumproben, um dann das Kalium unter Verwendung von Fluoreszenzspektrometern zu messen. Die vorliegenden Erfinder entdeckten, daß repräsentative Ionophore nach der vorliegenden Erfindung in wäßrigen und alkoholischen Lösungen über eine lange Zeitspanne stabil sind, und somit stellen sie die bevorzugten Lösungen dar. Chromogene Ionophore können in Reagenzausrüstungen ebenfalls verwendet werden. Beispielsweise können sie auf Kunststoffstreifen oder Filterpapier geschichtet und so als Eintauchstäbe für Serumanalysen verwendet werden. Die Ionenkonzentration kann durch Vergleichen einer Farbveränderung mit einem standardmäßigen Farbmuster mittels visueller oder Reflexionsmeßtechniken, wie oben im einzelnen dargestellt, bestimmt werden.
- Die fluorogenen Ionophore können auch in automatische, auf Faseroptik basierende Analyseinstrumente, speziell mit sich gabelnder Faseroptik, eingefügt werden. Beispielsweise kann das fluorogene Ionophor am äußeren Ende herkömmlicher optischer Fasern immobilisiert werden, oder eine Lösung des Ionophors kann mit der optischen Faser unter Verwendung einer mit einer durchlässigen Membrane für den Transport der Ionen in sie versehenen Sensorkappe in Kontakt gebracht werden. Ein Zweig der gabelförmigen Faseroptik mag somit das Licht für die Erregung führen, wogegen der andere Zweig die Fluoreszenzemission führen kann. Faseroptiken verwendende optische Sensoren weisen eine Anzahl von Vorteilen gegenüber elektrochemischen Sensoren auf. Erstens erfordern sie keine Bezugssignale, und zweitens sind sie keinen elektrischen Störungen unterworfen, wie jenen, welche von Oberflächenpotentialen herrühren, da das primäre Signal optischer Natur ist. Optische Sensoren können Konzentrationen der Zielionen messen, ohne die Probe in signifikanter Weise zu stören, und können somit für eine kontinuierliche Überwachung verwendet werden; ein Beispiel dazu ist die die Überwachung von Kaliumionen im menschlichen Blut während Operationen in vivo. Auf Faseroptik basierende Sensoren bieten auch den Vorteil, daß das Signal über lange Distanzen hinweg (z.B. 2-100 Meter) übermittelt werden kann, wodurch eine Fernmessung erleichtert wird. Ferner sind sie einer Miniaturisierung zugänglich.
- Gewisse Ionophore nach dieser Erfindung bilden vorzugsweise Komplexe mit Natriumionen, was zu einer verstärkten Fluoreszenz oder zu einer Farbveränderung führt. Diese können dazu verwendet werden, um Testausrüstungen oder auf Faseroptik basierende Sensoren zum Bestimmen von Natriumionen zu entwikkein. Ein Beispiel dafür liegt in der Bestimmung der Leckage von Meereswasser in elektronische Instumente in gebündelten Arrays für Schallmessungen oder in wiederverwendbaren Zusatztriebwerken, die beim Abschießen von Fahrzeugen in den Weltraum verwendet werden.
- Selektive Ionophore für Lithiumionen sind bei der Bestimmung von therapeutischen Spiegeln von Lithium in Blutserum zweckmäßig. Lithium spielt eine wichtige Rolle bei der Beherrschung einer Anzahl psychiatrischer Beschwerden. Lithium wird in Form von Tabletten, Kapseln, oder flüssig oral verabreicht. Da Lithium sich potentiell nachteilig auf die Nieren und die Schilddrüse auswirken kann, ist es wichtig, die Lithiumdosierung sorgfältig unter Kontrolle zu halten. Bisher wurde der Lithiumspiegel im Blut (Serum) durch zeitaufwendige und kostspielige Vorgänge der Flammenphotometrie- oder der atomaren Absorptionsspektrophotometrie überwacht (siehe Toxicology and Therapeutic Drug Monitoring, Kapitel 61, "Lithium", Seiten 1377-1379).
- Bei einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird ein fluorogenes Reagenz und ein Analysesystem für die Überwachung des Lithiumgehaltes im Blute geschaffen. Dieses Indikatorsystem wird dem Kliniker bei der schnellen und kostengünstigen Steuerung der Lithiumdosierung behilflich sein, um einen Dosierungsbereich zu schaffen, der nach aller Wahrscheinlichkeit therapeutisch ist, ohne das Risiko der Toxizität einzugehen. Das vorliegende Reagenz ist besonders zweckmäßig für diese Analyse des Blutserums, nämlich für die Bestimmung von Lithium, das für medizinische Behandlungen verwendet wird, selbst in Gegenwart von wesentlichen Mengen von natürlich vorkommenden Natrium- und Kaliumionen. Lithium besitzt einen relativ engen therapeutischen Bereich. Dosierungen von 0,7 - 1,7 mmol/l können akute manische Symptome in einigen Fällen lindern, während Dosierungen von ungefähr 2,0 mmol/l oder darüber toxisch sein können. Die Empfindlichkeit des vorliegenden fluorogenen Indikators liegt innerhalb dieses kritischen Bereiches. Im allgemeinen können so niedrige Konzentrationen wie 0,1 mmol/l bestimmt werden.
- Bei einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel werden chromophore Ionophore auf ein zweckmäßiges Substrat geschichtet, um einen Teststreifen oder eine Testscheibe herzustellen. Der sich ergebende Feststoff-Indikator kann dann in eine zu analysierende flüssige Probe eingetaucht werden, oder es kann ein Tropfen einer Probe daraufgebracht werden. Es können verschiedene zu analysierende Probenkonzentrationen getestet werden, und die Entwicklung eines Farbtons kann visuell mit einem solchen verglichen werden, der durch eine bekannte Lithiumkonzentration erzeugt wird. Alternativ kann die Gegenwart von Lithium durch eine Veränderung der Reflektivität bestimmt werden, wobei zu diesem Zweck herkömmliche Analysegeräte verwendet werden, wie jene, die für ein Reflexionsspektrum beschrieben werden.
- Das folgende sind spezifischere Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung.
- Im Handel erhältliches 4-Methyläsculetin (6,7-Dihydroxy-4-Methylcumarin) wurde zuerst durch Umsetzen mit 2-Bromäthanol zu 6,7-Di-(2'-Hydroxyäthyl)-4-Methylcumarin umgewandelt. (Siehe Beispiel 1). Die Reaktion dieser Verbindung mit Thionylchlorid in Toluol in Gegenwart von Pyridin (siehe Beispiel 2) erzeugte 6,7-Di-(2'-Chloräthyl)-4-Methylcumarin, das dann zur entsprechenden Dijod-Verbindung umgewandelt wurde, indem es mit Natriumjodid in rückströmendem Azeton umgesetzt wurde (siehe Beispiel 3). Die Dijod-Verbindung wurde mit einem Moläquivalent von im Handel erhältlichem 1,10-Diaza-18-Kronen-6 in Azetonitril unter Rückfluß in Gegenwart von Natriumkarbonat umgesetzt. Die Verbindung (6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[222]-Entschlüßler) wurde hergestellt und als sein Natrium-Komplex über einer Aluminiumoxyd-Kolonne gereinigt und durch Infrarot, ¹HNMR-Spektroskopie und Massenspektrometrie durch schnelles Atombombardement (FAB) bestätigt (siehe Beispiel 4). Das Natriumion konnte beim Kontakt mit einer wäßrigen Lösung von Kaliumchlorid leicht durch ein Kaliumion ersetzt werden. Die Struktur des 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[222]-Entschlüßlers wird unten gezeigt: Struktur 17
- Der 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[222]-Entschlüßler wurde aus der Dijod-Verbindung und aus 1,7-Diaza-15-Kronen-5 in rückströmendem Azetonitril in Gegenwart von Lithiumkarbonat hergestellt. Nach der Reinigung wurde die Verbindung als Natriumjodid-Komplex erhalten, obwohl bei der Herstellung keine Natriuin enthaltenden Reagenzien verwendet wurden (siehe Beispiel 5). Vermutlich wurden durch dieses Ionophor Natriumionen aus Glasteilen und/oder aus bei chromatographischer Reinigung verwendetem Aluminiumoxyd extrahiert. Die starke Affinität dieser Verbindung für Natriumionen wird somit demonstriert. Beim Schütteln von 0,75 g der mit Natriumjodid einen Komplex bildenden Ionophoren mit 20 ml einer 10%-igen äthanolhaltigen Lösung von Kalziumchlorid in einer Polyäthylen-Flasche, wurden die Natriumionen zu mehr als 80% gegen Kalziumionen ausgetauscht. Diese Verbindung wird unten gezeigt: Struktur 18
- Der 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[211]-Entschlüßler wurde von der Dijod-Verbindung und von 1,7-Diaza-12-Kronen-4 (gemäß dem Verfahren von J.J. Lehn, US-Patent 3,888,877, 10. Juni 1975) in Gegenwart von 1,8-bis(Dimethylamino)-Naphthalin synthetisiert. Das ionenfreie Ionophor wurde über Aluminiumoxyd gereinigt (siehe Beispiel 6) und durch Infrarot, ¹HNMR und Massenspektrometrie bestätigt. Es kann wie folgt dargestellt werden. Struktur 19
- Die Fluoreszenzerregungsspektren der Verbindungen zeigen eine starke Ahnlichkeit in ihren Absorptionsspektren. Die Fluoreszenzmessungen wurden in einem neutralen 50/50- Äthanol/Wassermedium unter Verwendung einer erregenden Wellenlänge von 330 nm und Abtastung der Emissionswellenlängen zwischen 340-540 nm durchgeführt, was eine breite Spitze mit einem Maximum bei 410 nm ergab. Die Zugabe von Metallionen zur Lösung veränderte das UV-Spektrum nicht. Es wurde jedoch eine selektive Verstärkung der Fluoreszenz beobachtet, wenn das Metallion mit der besten "Einpassung" in den Hohlraum des Ionophors zugegeben wurde. Somit zeigte der 6,7-(4-Methyl)-Cumaro[222]-Entschlüßler (Struktur 17), mit seinem zur Aufnahme von Kaliumionen ideal geeigneten Ionophorenhohlraum, eine dramatische Verstärkung der Fluoreszenz für dieses Ion. Natrium- und Lithiumionen zeigten eine sehr geringe Veränderung der Intensität der Fluoreszenz. (Siehe Figur 2). In menschlichem Blutserum ist der Natriumspiegel hoch (135-148 mmol/l), während derjenige für Kaliumionen von 3,5-5,3 mmol/l reicht. Figur 8 zeigt, daß der 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[222]-Entschlüßler Veränderungen der Konzentration der Kaliumionen quantitativ messen kann, welche in Gegenwart von 135 mmol/l Natriumionen bei einem neutralen ph-Wert von 2 bis 8 mmol/l reichen. Das Ionophor könnte deshalb für einen auf Fluoreszenz basierenden Sensor für die direkte Überwachung von Kaliumionen in Blutseruui und anderen biologischen Fluiden ideal geeignet sein. Es sollte angemerkt werden, daß keine kinetische Barriere gegenüber einer Komplexbildung zwischen den Ionophoren und Metallionen besteht.
- Das Gleichgewicht spielt sich rasch ein, und so wird eine kontinuierliche Überwachung möglich gemacht.
- Der Ionophoren-Hohlraum in einem 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[221]-Entschlüßler (Struktur 18) ist ideal für die Aufnahme von Natriumionen. Eine dramatische Verstärkung seiner Fluoreszenz wurde beobachtet, wenn der in 50/50 Äthanol/Wasser aufgelöste, durch Kalziumionen gebundene, 6,7-(4-Methyl)-Cumaro- [221]-Entschlüßler mit Natriumionen behandelt wurde. Kaliumund Lithiumionen zeigten eine sehr geringe Auswirkung auf seine Fluoreszenz. (Figur 3). Dieses Ionophor eignet sich für die quantitative Bestimmung von Natriumionen, sogar in Gegenwart eines großen Überschusses an Kalium-, Lithium- und Kalziumionen.
- Der 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[221]-Entschlüßler (Struktur 19) zeigt eine dramatische Verstärkung der Fluoreszenz bei Lithiumionen. Der Ionophoren-Hohlraum ist recht groß (1,6 Å im Durchmesser) verglichen mit der Größe des Lithiumions (1,2 Å im Durchmesser). Somit zeigt das Natriumion (1,9 Å im Durchmesser) auch eine beträchtliche Verstärkung der Fluoreszenz. (Figur 4). Die Selektivität dieses Reagenz für Lithiumionen in Konkurrenz mit Natriumionen kann durch die Verwendung von im Handel erhältlichem Kryptofix 221, das ein nicht-lichtansprechendes Ionophor ist, verbessert werden. (Figur 5). Unter Verwendung eines bekannten Überschusses an Kryptofix 221 zusammen mit einem 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[211]-Entschlüßler war es möglich, 0,5 bis 6,0 mmol/l Lithiumionen in Gegenwart von 140 mmol/l Natriumionen quantitativ zu messen. (Siehe Figur 9). Menschliches Blutserum enthält normalerweise weniger als 0,3 mmol/l, und der toxische Bereich reicht von 3 bis 6 mmol/l. Die Fähigkeit des 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[211]-Entschlüßlers, Lithiumionen bei therapeutischen Spiegeln im Blutserum in Gegenwart von 140 mmol/l Natriumionen zu messen, wird durch die in Figur 9 präsentierten Daten veranschaulicht.
- Das folgende ist ein spezifischerer Bericht über die Synthese von gewissen der Reagenz-Ionophoren und über Experimente, die ihre Ionenselektivität testeten.
- Eine Lösung von 9,6 g 6,7-Dihydroxy-4-Methylcumarin und 12,5 g 2-Bromäthanol in 375 ml wasserfreiem Azetonitril und 75 ml wasserfreiem N,N-Dimethylformamid wurde mit 21,0 g wasserfreiem Kalziumfluorid unter Stickstoffatmosphäre gerührt und 7 Tage lang auf 750 geheizt. Nach leichtem Abkühlen wird die Lösung gefiltert, und das Filtrat wird zur Trockene verdampft. Eine Titelverbindung aus braunein Feststoff bleibt zurück.
- Ausbeute 90%: ¹HNMR (DMSO - d&sub6;) δ 7;2 (s, 1H), 7,05 (s, 1H). 6,2 (s, 1H), 4,1(m. 4H), 3,75 (m, 4H), 2,4 (s. 3H).
- Eine Lösung von 17 g der in Beispiel 1 erhaltenen Dihydroxy-Verbindung und 12 g Pyridin in 800 ml wasserfreiem Toluol wird gerührt und unter Stickstoffatmosphäre auf 40º erhitzt. 18,1 g Thionylchlorid werden während eines Zeitraumes von 25 Minuten unter Rühren zugegeben. Das Gemisch wird 3 Stunden lang bei Rückflußtemperatur erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Umgebungstemperatur wird die Lösung dekantiert. Der Rückstand wird aufgebrochen, mit Wasser und Toluol gewaschen und mit der oben schwimmenden Flüssigkeit vermischt. Die organische Schicht wird abgeschieden und mit verdünnter Salzsäure und dann mit einer gesättigten Natriumbikarbonatlösung gewaschen. Die organische Schicht wird abgeschieden, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und verdampft. Ausbeute 61%: ¹HNMR (CDCl&sub3;) δ 7,15 (s, 1H), 6,8 (s, 1H), 6,15 (s, 1H), 4,35 (m, 4H), 3,9 (m, 4H), 2,4 (s, 3H).
- Eine Lösung von 11,6 g des in Beispiel 2 erhaltenen Dichlorids und von 13,7 g wasserfreiem Natriumjodid in 130 ml wasserfreiem Azeton wird unter Stickstoffatmosphäre gerührt und 4 Tage lang auf Rückflußtemperatur erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Umgebungstemperatur wird die Lösung zur Trockene verdampft. Der feste Rückstand wird in Dichlormethan aufgelöst und mit einer Natriumthiosulfatlösung gewaschen. Die organische Schicht wird abgeschieden, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und zur Trockene verdampft, wodurch sich das Rohprodukt ergibt. Eine Reinigung auf deaktiviertem Aluminiumoxyd mit der mobilen Phase von Dichlormethan mit 10% Äther ergibt die Titelverbindung. Ausbeute 49%: IR 1741 cm&supmin;¹ (α, β -ungesättigtes δ-Lacton C=O); ¹HNMR (CDCl&sub3;) δ 7.1 (s, 1H), 6,75 (s, 1H), 6,15 (s, 1H), 4,4 (m, 4H), 3,5 (m, 4H), 2,4 (s, 3H): FABMS 501 (M+H).
- Eine Lösung von 0,55 g des in Beispiel 3 erhaltenen gereinigten Dijodids und 0,29 g 1,10-Diaza-18-Kronen-6 in 45 ml wasserfreiem Azetonitril wird mit 0,47 g Natriumkarbonat unter Stickstoffatmosphäre gerührt und 6 Tage lang auf Rückflußtemperatur erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Umgebungstemperatur wird die Lösung zur Trockene verdampft. Der feste Rückstand wird in Chloroform aufgelöst und mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Schicht wird abgeschieden, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und zur Trockene verdampft, wodurch sich das Rohprodukt ergibt. Eine Reinigung auf Aluminiumoxyd mit einer mobilen Phase von 1/1 Tetrahydrofuran und Dichlormethan, gefolgt von 85/10/5 Dichlormethan/Äther/Methanol ergibt die gereinigte Titelverbindung mit dem gebundenen Narriumion, wie durch FABMS angezeigt wird.
- Ausbeute 60%: IR 1708 cm&supmin;¹ (α,ß-ungesättigtes delta-Lacton C=O); ¹HNMR (CDCl&sub3;) w 7,25 (s, 1H), 6,85 (s, 1H), 6,15 (s, 1H), 4,40 (t, 2H), 4.30 (t, 2H), 3,55 (m, 16H), 2,98 (t, 2H). 2,91 (t, 2H), 2,75 (m, 8H), 2;50 (s, 3H): FABMS 507 (M+H), 529 (M+Na), 545 (M+K); UV (50% CE&sub3;CH&sub2;OH) λ max ( ε ) 228 (5 450), 287 (1 690) , 338 (3 170); Fluoreszenz (50% CH&sub3;CH&sub2;OH) lambda ex 330 nm, lambda em 340-540 nm (Spitze bei 410 nm)
- Eine Lösung von 0,95 g des in Beispiel 3 erhaltenen gereinigten Dijodids und 0,41 g 1,7-Diaza-15-Kronen-5 in 90 ml wasserfreiem Azetonitril wird unter Stickstoffatmosphäre mit 1,12 g Lithiumkarbonat und 4 Tropfen Wasser gerührt, um die Base zu aktivieren, und 6 Tage lang auf Rückflußtemperatur erhitzt. Nach Abkühlen auf Umgebungstemperatur wird die Lösung gefiltert, und das Filtrat wird zur Trockene verdampft, um das Rohprodukt zu ergeben.
- Die Reinigung wird wie in Beispiel 4 fortgesetzt, wodurch sich die Titelverbindung mit gebundenen Natriumionen ergibt, wie durch FABMS angezeigt wird. Da Natrium während keines Herstellungsschrittes zugegeben wurde, wird angenommen, daß eine Verschmutzung durch Natriumionen durch Glasteile verursacht wird. In einem Experiment zum Austausch von gebundenen Natriumionen gegen Kalziumionen wurden 0,75 g des natriumgebundenen Ionophors in 20 ml absolutem Äthanol und 2 g (Überschuß) Kalziumchlorid in einem Kunststoffbehälter unter Stickstoffatmosphäre bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wird auf sein halbes Volumen verdampft. Das überschüssige Präzipitat aus Kalziumchlorid wird durch Filtern entfernt. Das Filtrat wird erneut auf sein halbes Volumen verdampft, und das überschüssige Salz wird entfernt. Das verbleibende Filtrat wird zur Trockene verdampft. FABMS bestätigt, daß der Austausch größer als 80% des vollständigen ist. m/z 537 (M + Ca&spplus;² + Cl&supmin;) mit einem Cl&supmin;-Isotopmuster.
- Ausbeute 50%: IR 1705 cm&supmin;¹ (α,ß-ungesättigtes delta-Lacton C=O); ¹HNMR (CDCl&sub3;)δ 7.35 (s. 1H) 7;0 (s, 1H), 6,2 (s. 1H), 4,4 (m. 4H), 3,8 (m, 12H), 3,0 (m, 12H), 2,5 (s, 3H); FABMS 463 (M+H), 469 (M+Li), 485 (M+Na): Uv (50% CH&sub3;CH&sub2;OH) λ max ( ε ) 227 (15 000), 288 (3 920) , 339 (8 600); Fluoreszenz (50% CH&sub3;CH&sub2;OH) lambda ex 330 nm, lambda em 340-540 nm (Spitze bei 410 nm).
- Eine Lösung von 0,5 g des in Beispiel 3 erhaltenen gereinigten Dijodids und 0,174 g 1,7-Diaza-12-Kronen-4 (Ref. J.M. Lehn, US-Patent 3,888,877, 10. Juni 1975) in 50 ml wasserfreiem Azetonitril wird mit 0,45 g 1,8-bis(Dimethylamino)-Naphthalin unter Stickstoffatmosphäre gerührt und 6 Tage lang auf Rückflußtemperatur erhitzt. Nach Abkühlen auf Umgebungstemperatur wird die Lösung zur Trockene verdampft. Der feste Rückstand wird in Chloroform aufgelöst und gefiltert. Das Filtrat wird zur Trockene verdampft, um das Rohprodukt zu ergeben. Die Reinigung wird wie in Beispiel 4 fortgesetzt, wodurch sich die von jeglichen gebundenen Metallionen freie Titelverbindung ergibt, wie durch MSFAB angezeigt wird. Ausbeute 30%: IR 1708 cm&supmin;¹ (α,ß -unqesättigtes w-Lakton c=0); ¹HNMR (CDCl&sub3;) δ 7,1 (s, 1H). 6,85 (s, 1H). 6,15 (s, 1H), 4,3 (m, 4H). 3,5 (m, 8H), 2,9 (m. 12H). 2,5 (s, 3H); FABMS 419 (M+H), 441 (M+Na); UV (50% CH&sub3;CH&sub2;OH) g max ( e ) 226 (16 350), 287 (4 460); 336 (8 820); Fluoreszenz (50% CH&sub3;CH&sub2;OH) lambda ex 330 nm, lambda em 340-540 nm (Spitze bei 410 nm).
- Es wurde eine Grundlösung des Ionophors mit einer Konzentration von 10&supmin;³ M in 50/50 Äthanol/Wasser bei neutralem pH- Wert hergestellt. Fluoreszenzmessungen wurden bei Umgebungstemperatur unter Verwendung einer erregenden Wellenlänge von 330 nm und Abtastung der Emissionswellenlängen zwischen 340-540 nm durchgeführt, was eine breite Spitze mit einem Maximum von 410 nm ergab. Die Messungen wurden an Lösungen vorgenommen, die von einer Konzentration von 10&supmin;&sup5; M bis 10&supmin;³ M reichten. Über diesem Bereich gehorcht die UV-Absorption dem Beerschen Gesetz, wohingegen die Fluoreszenzemission von 10&supmin;&sup5; M bis 10&supmin;&sup4; M zunimmt, dann aber von 10&supmin;&sup4; M bis auf 10&supmin;³ M abnimmt. Diese Studie weist daraufhin, daß unter diesen Bedingungen die optimale Konzentration für eine maximale Fluoreszenzwirksamkeit ungefähr 10&supmin;&sup4; beträgt (siehe Figur 1).
- Der mit Natriumjodid einen Komplex bildende 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[222]-Entschlüßler wurde mit 10&supmin;&sup5; M in 50/50 Äthanol/Wasser bei neutralem ph-Wert gegeben. Fluoreszenzmessungen wurden bei Umgebungstemperatur unter Anwendung einer erregenden Wellenlänge von 330 nm und Abtastung der Emissionswellenlängen zwischen 340-540 nm durchgeführt, was eine breite Spitze mit einem Maximum von 410 nm ergab. Die Zugabe eines Tropfens einer Lösung von 1 M Kaliumchlorid zu 2,5 ml der Ionophor-Lösung in einer Küvette führte zu einer dramatischen Verstärkung der Fluoreszenzemission. Anderseits bewirkte die Zugabe eines Tropfens einer Lösung von 1 M Natriumchlorid eine leichte Dämpfung der Fluoreszenz. Die Zugabe von Lithiumchlorid zeigte eine sehr geringe Veränderung der Fluoreszenz (Figur 2). Dieser Versuch veranschaulicht, daß das Ionophor ein selektiver Indikator für Kaliumionen ist.
- Der in Beispiel 8 beschriebene Versuch wurde mit einem mit 10&supmin;&sup4; M Kalziumchlorid einen Komplex bildenden (4-Methyl)- Cumaro-[221]-Entschlüßler wiederholt. Die Zugabe eines Tropfens von 1 M Natriumchlorid zeigte eine dramatische Verstärkung der Fluoreszenzemission, während Kaliumchlorid und Lithiumchlorid eine sehr geringe Veränderung zeigten (Figur 3) und so die Selektivität dieses Ionophors für Natriumionen unter Beweis stellten.
- Der in Beispiel 8 beschriebene Versuch wurde für einen 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[211]-Entschlüßler wiederholt, welcher eine Verstärkung der Fluoreszenzemission für Lithiumchlorid zeigte. Natriumchlorid zeigt jedoch auch eine beträchtliche Verstärkung der Fluoreszenz, wohingegen Kaliumchlorid überhaupt keine Wirkung zeigt (Figur 4). Zur Verbesserung der Selektivität dieses Entschlüßlers für Lithiumionen gegenüber Natriumionen wurde der Grundlösung ein großer Überschuß (140 mmol/l) eines im Handel erhältlichen Entschlüßlers Kryptofix 221 (Struktur 15), ein nicht-lichtansprechendes Ionophor, von dem bekannt ist, daß es für Natriumionen selektiv ist, zugegeben. Die Zugabe von Lithiumchlorid zu dieser Lösung verstärkt die Fluoreszenzemission, während die Zugabe von Natriumchlorid eine geringe Auswirkung hat (Figur 5).
- Es wurden Lösungen von flucrogenen Ionophoren (10&supmin;&sup4; M) in 50/50 Äthanol/Wasser, welche variierende Mengen eines gegebenen Salzes (Lithiumchlorid, Natriumchlorid oder Kaliumchlorid) enthielten, hergestellt. Die Fluoreszenzemissionen dieser Lösungen wurden gemessen (wie in Beispiel 8 beschrieben) und gegenüber den Salzkonzentrationen graphisch dargestellt. Die Figur 6 zeigt solch eine graphische Darstellung für einen 6,7- (4-Methyl)-Cumaro-[211]-Entschlüßler gegenüber Lithiumchlorid und Kaliumchlorid. Ein Grenzwert für die Fluoreszenzverstärkung wurde für Lithiumchlorid und Kaliumchlorid oberhalb 6 mmol/l beobachtet. Die Verstärkung der Fluoreszenz für Natriumchlorid ist hingegen gering (weniger als 25% des für Lithiumchlorid beobachteten Wertes), und somit ist das Ionophor für eine quantitative Messung von Natriumionen nicht bevorzugt. Die Selektivität des Ionophors für Lithiumionen gegenüber Natriumionen kann durch die Zugabe eines bekannten Überschusses (1,5 x 10&supmin;¹ mmol/l) von Kryptofix 221 zur Grundlösung dramatisch verbessert werden. Figur 7 zeigt, daß der Grenzwert für Lithiumchlorid in dieser Lösung 20 mmol/l beträgt, während Natriumchlorid die Fluoreszenz nicht signifikant beeinflußt. Das System ist nun hochselektiv für Lithiumionen.
- Eine graphische Darstellung ähnlich der in Figur 6 abgebildeten mit einem Grenzwert von 15 mmol/l für Kaliumchlorid wurde für einen 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[222]-Entschlüßler erhalten. Die Natrium- und Lithiumionen zeigten eine sehr geringe Veränderung der Fluoreszenz. Ähnliche Resultate wurden für den 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[221]-Entschlüßler erhalten, bei dem ein Grenzwert von 15 mmol/l für Natriumchlorid beobachtet wurde, wogegen Lithiumchlorid und Kaliumchlorid eine sehr geringe Auswirkung auf die Fluoreszenz zeigten.
- Die Selektivität und die Empfindlichkeit eines 6,7-(4- Methyl)-Cumaro-[222]-Entschlüßlers bei der direkten quantitativen Analyse von Kaliumionen in menschlichem Blutserum wird in diesem Beispiel veranschaulicht. Die Konzentration von Kaliumionen in menschlichem Blutserum variiert von 3,5-5,3 mmol/l, wogegen Natriumionen in einem großen Überschuß (135-148 mmol/l) vorhanden sind. Lösungen in 50/50 Äthanol/Wasser bei neutralem ph-Wert, welche 10&supmin;&sup4; M 6,7-(4-Methyl)-Cumaro-[222]-Entschlüßler und 135 mmol/l Natriumchlorid enthielten, aber mit variierenden Mengen (0-8,0 mmol/l) Kaliumchlorid, wurden hergestellt. Die Fluoreszenzemission dieser Lösungen wurde gemessen, wie in Beispiel 8 beschrieben ist. Die Figur 8 zeigt, daß die Fluoreszenzemission des Ionophors mit zunehmenden Mengen von Kaliumionen zunimmt, was die Fähigkeit des Ionophors veranschaulicht, kleine Veränderungen der Kaliumionen in Gegenwart eines großen Überschusses an Natriumionen zu messen. (Eine Veränderung der Konzentration der Natriumionen in der Grundlösung auf 140 mmol/l bzw. 150 mmol/l beeinflußte die Intensitäten der Fluoreszenzemission des Ionophors signifikant). Da die Fluoreszenzintensitäten reproduzierbar sind und nur auf Veränderungen der Konzentrationen der Kaliumionen ansprechen, können sie bei der Herstellung von Standardkarten (Intensität gegenüber der Konzentration) für Kaliumionen verläßlich verwendet werden. Diese Karten können dann verwendet werden, um den Spiegel an Kaliumionen in menschlichen Serumproben zu bestimmen.
- In diesem Beispiel wird die Fähigkeit eines 6,7-(4- Methyl)-Cumaro-[211]-Entschlüßlers zur quantitativen Analyse von Lithiumionen in Gegenwart eines großen Überschusses von Natriumionen veranschaulicht. Menschliches Blutserum enthält normalerweise keine Lithiumionen. In Patienten, die sich einer Lithiumtherapie unterziehen, variiert der bevorzugte Spiegel von Lithium im Blutserum jedoch von 0,7-1,3 mmol/l, wohingegen der toxische Spiegel von 3-6 mmol/l reicht. Es wurden Lösungen in so/so Äthanol/Wasser bei neutralem pH-Wert hergestellt, welche 10&supmin;&sup4; M Ionophor, 150 mmol/l Kryptofix 221, 140 mmol/l Natriumchlorid, aber variierende Mengen (0-6 mmol/l) an Lithiumchlorid enthielten. Die Fluoreszenzemission dieser Lösungen wurde so gemessen, wie in Beispiel 8 beschrieben ist. Figur 9 zeigt, daß die Fluoreszenzemission mit zunehmenden Mengen an Lithiumionen zunimmt, was die Fähigkeit des Ionophors veranschaulicht, kleine Veränderungen der Lithiumionen in Gegenwart eines großen Überschusses an Natriumionen zu messen. Wie in Beispiel 12 beeinflussen die Schwankungen der Konzentration der Natriumionen die Fluoreszenzintensitäten nicht signifikant. Unter den in diesem Beispiel beschriebenen Bedingungen sprechen die Fluoreszenzintensitäten nur gegenüber Veränderungen der Konzentration der Lithiumionen an, und somit können sie dazu verwendet werden, Standardkarten (Fluoreszenzintensität gegenüber der Konzentration) für Lithiumionen anzufertigen. Die Karten können zur Bestimmung der Lithiumionen im Blutserum verwendet werden. Aus Figur 9 wird klar, daß das System besonders auf die Bestimmung von Lithiumionen in den therapeutischen und toxischen Bereichen empfindlich ist.
- Die in den Beispielen 12 und 13 beschriebenen Versuche wurden unter Verwendung von Wasser als Medium wiederholt. Es wurden quantitative Analysen der Kalium- und Lithiumionen erzielt. Die Fluoreszenzintensitäten waren im allgemeinen höher.
- 2,8 g Thionylchlorid werden tropfenweise einer gerührten Lösung von 2,4 g 1,2-Bis-(2-Hydroxyäthoxy)-4-Nitrobenzol (nach Verfahren V von Abakumova, Kolenko und Kodess hergestellt, welches aus dem Zhurnal Organicheskoi Khimii, Bd. 18, Nr. 7, Seiten 1495-1498, Juli 1982, übersetzt wurde) und 0,9 g Pyridin in 55 ml wasserfreiem Toluol bei 70ºC unter Stickstoffatmosphäre zugegeben. Nach der Zugabe wird die Lösung 18 Stunden lang auf 110ºC erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Umgebungstemperatur wird die Lösung mit 2%-iger Salzsäure gewaschen. Die organische Schicht wird getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und zur Trockene verdampft. Die Titelverbindung wurde in einer Ausbeute von 80% erhalten.
- Eine Lösung von 2,8 g des im Beispiel 15 erhaltenen Dichlorids und 3,8 g wasserfreien Natriumjodids in 35 ml wasserfreiem Azeton wird unter Stickstoffatmosphäre gerührt und 2 Tage lang auf Rückflußtemperatur erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Umgebungstemperatur wird die Lösung zur Trockene verdampft. Der feste Rückstand wird in Äther aufgelöst und mit einer Lösung aus Natriumthiosulfat gewaschen, um Jod zu entfernen. Die organische Schicht wird abgeschieden, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und zur Trockene verdampft, und nach der Rekristallisation aus Hexan wird die Titelverbindung hergestellt. Ausbeute 60%. IR 1503 cm&supmin;¹ und 1349 (aromatisches C-NO&sub2;); ¹HNMR (CDCl&sub3;) δ 7.83 (d. 1H), 7,77 (s, 1H). 7,.0 ( α , 1H), 4,38 (t, 4H), 3,48 (t, 4H); MS (CI, Methan) , m/z 464 (M + H), 492 (M + 29), 504 (M + 41), 336 (MH - HI).
- Eine Lösung von 2,0 g des in Beispiel 16 erhaltenen Dijodids und 1,0 g 1,10-Diaza-18-Kronen-6 in 160 ml wasserfreiem Azetonitril wird mit 1,7 g Natriumkarbonat unter Stickstoffatmosphäre gerührt und 6 Tage lang auf Rückflußtemperatur erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Umgebungstemperatur wird die Lösung gefiltert, und das Filtrat wird zur Trockene verdampft. Der Rückstand wird in Dichlormethan aufgelöst und durch eine Aluminiumoxyd-Kolonne geführt. Das Produkt wird mit einem Gemisch von Chloroform und Methanol (97/3) eluiert. Die Lösung wird zur Trockene verdampft, wodurch goldgelbe Flocken zurückbleiben. Ausbeute 79%: IR 1516 cm&supmin;¹ und 1343 (aromatisches C- NO&sub2;); ¹HNMR (DMSO-d&sub6;) δ 7.65-8,2 (br m, 2H). 7,1-7,4 (br m, 1H). 4,1-4,25 (br m. 4H). 3i65 (s, 8H), 3,4-3.6 (br m, 8H), 2,6-3,0 (br m. 12H); FABMS 470 (M+H), 492 (M+Na), 508 (M+K).
- Es wird eine Hydrierung von 1 g des in Beispiel 17 erhaltenen Produktes in 40 ml Äthanol mit 10% Palladium auf Kohlenstoff unter 75 psig Wasserstoff vorgenommen und 18 Stunden lang auf 75º erhitzt. Nach dem Abfiltern des Katalysators wird das Filtrat konzentriert, um die Titelverbindung als viskose, bräunliche Flüssigkeit zu erhalten. Ausbeute 88%:
- IR 3350 cm&supmin;¹ (-NH&sub2;); ¹HNMR (CDCl&sub3;)δ 6,73 (d. 1H), 6,63 (d. 1H). 6,28 (m. 1H), 4,07-4,2 (m. 4H), 3,6-3,7 (m. 8H). 3,4-3,6 (m. 8H). 2,75-2,83 (m. 4H), 2,68 (m. 8H).
- Eine Lösung von 0,65 g des in Beispiel 18 erhaltenen Amins und 0,41 g 4-Chlor-3,5-Dinitrobenzotrifluorid in 22 ml Methanol wird mit 0,13 g Natriumbikarbonat unter Stickstoffatmosphäre gerührt und 20 Stunden lang auf Rückflußtemperatur erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Umgebungstemperatur wird die Lösung zur Trockene verdampft. Der Rückstand wird in Dichlormethan aufgelöst und durch eine Aluminiumoxyd-Kolonne geführt. Das Produkt wird mit einem Gemisch von 1% Methanol in Dichlormethan eluiert. Die Lösung wird zur Trockene verdampft, was ein leuchtendrotes Pulver zurückläßt. Ausbeute 30%: IR 1511 cm&supmin;¹ und 1355 (aromatisches C-NO&sub2;), 3452 (sekundäres N-H); ¹NMR (CDCl&sub3;) δ 8,42 (s. 1H). 8,38 (s, 1H). 6,88 (d, 1H), 6,78 (m. 1H). 6,67 (m, 1H). 4,1-4,25 (m. 4H), 3,65 (s. 8H), 3,4-3,6 (br m. 8H), 2,84 (m. 4H), 2,7 (m. 8H); FABMS 674 (M+H). 696 (M+Na).
Claims (7)
1. Ionophor mit einem ionenerkennenden, mit einer
Cumarinsignalhälfte über zwei Heteroatome verschmolzenen
Entschlüsselungssystem, das zur selektiven Bindung mit einem Na-,
K- oder Li-Ion fähig ist, welches Ionophor eine Struktur der
Formel:
aufweist, worin:
n und m gleiche oder unterschiedliche ganze Zahlen
sind und n gleich 0 bis 3 und m gleich 0 bis 5 ist; und
R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; gleich oder verschieden sind und von
Wasserstoff, einer Hydroxy-, Amino-, Alkylgruppe, einem
fluorierten Kohlenwasserstoff, einem Aryl oder einem Thiol gebildet
und derart gewählt sind, daß sie die selektive Bindung nicht
behindern.
2. Ionophor nach Anspruch 1, bei dem R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und
R&sub4; gleich oder verschieden sind und ein Alkyl oder ein Thiol
sind.
3. Ionophor nach Anspruch 1, welches die Formel:
besitzt
4. Verfahren zum Feststellen von Na-, K- oder Li-
Ionen in einer Probe, welche die folgenden Verfahrensschritte
aufweist:
(a) Kontaktieren der Probe in einem im wesentlichen
neutralen oder basischen Medium mit einem Ionophor nach einem
der Ansprüche 1 bis 3, mit einer Affinität für diese Ionen
während einer Zeit, die ausreicht, um die Bindung einiger oder
aller Ionen an das Ionophor zuzulassen, die in der Probe
vorhanden sein mögen, wobei das Ionophor im ungebundenen Zustande
eine gewisse Fluoreszenz zeigt und eine Veränderung der
Fluoreszenz im gebundenen Zustande zeigt;
(b) Messen der Fluoreszenz des Ionophors nach dem
Kontakt mit der Probe; und
(c) Feststellen der Gegenwart von Ionen in der Probe
durch Vergleich der Fluoreszenz des Ionophors nach dem Kontakt
mit der Probe mit der Fluoreszenz des Ionophors im ungebundenen
Zustande, und Feststellen des Vorhandenseins oder des Fehlens
von Ionen in der Probe durch Veränderung oder Fehlen einer
Veränderung der Fluoreszenz des kontaktierten Ionophors.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß das Testmedium alkoholisch, wäßrig oder ein Gemisch von
beiden ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß das reagierende Ionophor auf einer optischen Faser
immobilisiert ist.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß das Ionophor die im Anspruch 3 angegebene Formel besitzt.
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