DE69327503T2

DE69327503T2 - Arylazo Chromoionophore

Info

Publication number: DE69327503T2
Application number: DE69327503T
Authority: DE
Inventors: Michael Bloczynski; Thomas Bocker; Paul F. Corey
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Priority date: 1992-10-22
Filing date: 1993-10-13
Publication date: 2000-08-24
Anticipated expiration: 2013-10-14
Also published as: CA2104839C; PT594047E; JPH06207932A; ES2143483T3; ATE188552T1; DE69327503D1; AU4915693A; EP0594047B1; JP3312793B2; DK0594047T3; CA2104839A1; US5310888A; GR3033017T3; AU663415B2; EP0594047A1

Description

Calcium ist eines der wichtigsten Elemente, die im Körper vorgefunden werden. Es ist nicht nur für das Skelett, sondern auch für Zellen notwendig. Es gibt, im Durchschnitt, ca. 1 kg Calcium im menschlichen Körper, wovon 99% in den Knochen vorkommen und das verbleibende 1% in Plasma, extrazellulären Flüssigkeiten und interzellulären Kompartimenten verteilt ist. Dieser kleine Bruchteil spielt allerdings eine vitale Rolle in vielen biochemichen und physiologischen Funktionen wie als Zell-Regulator und -Botschafter. Diese Funktionen schließen Knochenbildung und Homostasis, Aufrechterhaltung der Zellmembran-Unversehrtheit und -Permeabilität, Nervenanregung, Muskelkontraktion und Blutkoagulation zusammen mit einer Steuerung vieler Enzym- und Hormon-Reaktionen ein.
Die Konzentration von Calcium in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Plasma, muß innerhalb eines sehr engen Bereichs gehalten werden. Sein Niveau bzw. die entsprechende Gehaltsmenge werden durch eine Anzahl von Hormonen, in erster Linie von Parathyroid-Hormon (PTH) und Calcitonin, gesteuert. PTH wird aus der Parathyroid-Drüse in Reaktion auf ein Absinken der Calcium-Konzentration in Plasma freigesetzt und fördert indirekt die Absorption von Calcium in den Magen- und Nierenkanälen und steigert die Calcium-Mobilisierung aus den Knochen. Calcitonin, das die Aktivität von PTH im Knochengewebe inhibiert, wird durch die Schilddrüse in Reaktion auf einen Anstieg von Calciumionen ausgeschieden.
Abweichungen von normalen Calcium-Gehaltsmengen treten bei bestimmten Krankheiten auf. Calcium-Gehaltsmengen, die deutlich unterhalb des Normalwerts liegen, können Hypoparathyroidismus, Vitamin-D-Mangel oder Nephritis anzeigen. Calcium-Gehaltsmengen, die oberhalb des Normalwerts liegen, können Hyperparathyroidismus, Vitamin-D-Vergiftung oder Myeloma anzeigen.
Der Normalwert vom Gesamt-Calcium in Plasma beträgt ca. 2,4 mM/l. Im allgemeinen haben Kinder die höchste Calcium-Konzentration, die mit dem Alter langsam abnimmt.
Die Bestimmung von Calcium in Serum begann mit dem gravimetrischen Verfahren, bei dem Calcium mit Ammoniumoxalat ausgefällt wurde, worauf der Niederschlag getrocknet und gewogen wurden. Dieses Verfahren wurde 1921 weiter verbessert, als über eine technische Verfahrensweise berichtet wurde, bei der das Calciumoxalat in Säure gelöst und das Oxalat durch Titration mit Kaliumpermanganat bestimmt werden. Eine Modifikation dieses Verfah rens, bei der die Waschstufe und Temperatur während der Titration standardisiert wurde, wurde als hauptsächliches Verfahren zur Bestimmung von Calcium angewandt. Obwohl einigermaßen genau, benötigten diese Verfahrensweisen große Mengen an Serum und waren zeitaufwendig. Eine empfindlichere und schnellere komplexometrische Titration wurde in den Jahren um 1940 eingeführt, wobei Murexid als ein Indikator angewandt wurde. Verschiedene weitere Indikatoren, z. B. Calcon, Calcein, Methylthymol-Blau, Eriochrom- Schwarz T, Glyoxalbis(2-hydroxyanil) und Arsenazo III, wurden anschließend eingeführt. Unabhängig vom Indikator, benötigten diese komplexometrischen Titrationsverfahren ein großes Volumen der Serumprobe, waren zeitaufwendig und wiesen den Nachteil eines schwachen Endpunkts sowie von Störungen durch Metallionen auf, die sich von Calcium unterscheiden.
In jüngerer Zeit wurde das Titrationsverfahren durch ein direktes spektrofotometrisches Verfahren unter Anwendung verschiedener metallochromer Indikatoren ersetzt, von denen das am häufigsten angewandte das ortho- Cresolphthalein (CPC)-Komplex-Verfahren ist. Bei diesem Verfahren verbindet sich Calcium zum CPC in einer alkalischen Lösung (pH = 10,5 bis 12), um einen tiefroten Calcium-Farbstoffkomplex zu bilden. Die Absorption des Farbstoffs steigt bei 575 nm an und ist proportional zur Konzentration von Calcium in der Probe. Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß es bei einem pH-Wert im Bereich von 10 bis 12 durchgeführt werden muß. Bei diesem pH-Niveau kann das Reagens Kohlendioxid absorbieren, was zu einer Basislinienabweichung führt.
Arsenazo III bildet gefärbte Komplexe mit vielen zwei- und dreiwertigen Kationen, kann aber zur Bestimmung mikromolarer Mengen von Calciumionen bei pH 5,5 ohne signifikante Störung durch Magnesiumionen angewandt werden. Dieses Reagens weist eine hohe Affinität für Calciumionen beim physiologischen pH-Wert, einen hohen Extinktionskoeffizient des Calcium- Farbstoffkomplexes bei 650 nm und eine hohe chemische Stabilität in wässrigen Lösungen auf. Daher ist es zu einem nützlichen Instrument zur Bestimmung mikromolarer Konzentrationen von Calcium in Einzelzellen geworden. Während Arseonazo III in großem Umfang von Forschern bei Untersuchungen des Calcium-Transports in Zellen und Zellfraktionen angewandt wird, ist seine Anwendbarkeit in der klinischen Chemie wegen des Vorhandenseins toxischer arsenischer Reste und deren damit einhergehender Sicherheits- und Umweltprobleme eingeschränkt geblieben.
In Biochemistry 19, 2396 (1980) berichtet Tsien über die Herstellung von 2-[[2-Bis(carboxymethyl)amino]-5-methylphenoxy]methyl-8-[bis(carboxymethyl)amino]chinolin (QUIN 1) und seines 6-Methoxy-Analogon (QUIN 2). Es wird beschrieben, daß diese Verbindungen als Fluoreszenz-Calciumionophoren anwendbar sind. In einer späteren Veröffentlichung (J. Biol. Chem., 260, 3440 (1985)) beschreiben Tsien et al, daß die Messung und Aufzeichnung der Fluoreszenz von QUIN 2 das am häufigsten angewandte Verfahren zur Messung von [Ca&spplus;&spplus;] ist. Sie stellen auch heraus, daß, obwohl QUIN 2 viele wichtige biologische Informationen geliefert hat, seine Anwendung gewisse inhärente Einschränkungen aufweist, weil seine bevorzugte Anregungswellenlänge von 339 nm zu niedrig ist. Es wird auch herausgestellt, daß sein Extinktionskoeffizent (< 5000) und seine Fluoreszenzquantenausbeute (0,03 bis 0,14) ebenfalls zu niedrig sind. Ausserdem macht eine Selbstfluoreszenz aus Zellen QUIN 2-Beladungsmengen von einigen 10 mMol oder mehr erforderlich, um ein zufriedenstellendes Ergebnis zu erhalten. Ebenfalls wird herausgestellt, daß QUIN 2 Signale von Ca&spplus;&spplus; ergibt, wobei seine Fluoreszenzintensität erhöht wird, und zwar ohne große Verschiebung bei weder den Anregungsnoch Emissionswellenlängen, und daß ein Bedarf für einen Indikator besteht, der auf Calcium reagiert, und zwar unter Verschiebung der Wellenlängen bei Aufrechterhaltung starker Fluoreszenz. Ein weiterer Mangel, über den bezüglich QUIN 2 berichtet wird, beruht darauf, daß seine Selektivität für Calcium gegenüber Magnesium und zweiwertigen Schwermetallkationen verbesserungsbedürftig ist. Dieser Artikel stellt des weiteren heraus, daß Verbindungen, die ein Stilben-Fluorophor und ein octakoordiniertes Tetracarboxylat-Muster von Ligandengruppen, charakteristisch für EGTA [Ethylenglycolbis(β-aminoethylether)]- und BAPTA [1,2-Bis(o-Aminophenoxy)ethan]-N,N, N',N'-tetraessigsäure, aufweisen, gegenüber QUIN 2 zu bevorzugen sind. Diese Bevorzugung beruht auf verschiedenen Faktoren wie verbesserter Selektivität für Ca&spplus;&spplus; und der Befähigung von BAPTA und EGTA, eine viel stärkere Fluoreszenz zusammen mit Wellenlängenverschiebungen bei Ca&spplus;&spplus;-Bindung zu ergeben. Die Herstellung und Anwendbarkeit dieser Verbindungen ist auch in US 4,603,209 von Tsien et al beschrieben.
In jüngerer Zeit haben Toner et al chromogene Derivate von BAPTA und von BAPTA-artigen Verbindungen in US 4,795,712 offenbart. Sie stellen heraus, daß die fluorogenen Verbindungen von Tsien den Nachteil aufweisen, im UV-Bereich des Spektrums zu absorbieren, so daß normale Bestandteile von Körperflüssigkeiten, welche ebenfalls im UV- und kurzen sichtbaren Wellen längenbereich absorbieren, dazu neigen, Hintergrund-Interferenz mit kolorimetrischen Ständard-Ausrüstungen und -Verfahren zu erzeugen. Sie sagen des weiteren, daß es wünschenswert wäre, hoch selektive Calcium-Komplexierverfahren zur Verfügung zu haben, die bei längeren Wellenlängen (oberhalb 400 nm) nachweisbar wären und sich zu anderen Wellenlängen bei Komplexbildung mit Calcium verschieben würden, um eine quantitative Analyse für Calcium zu ermöglichen, und zwar ohne Interferenz bzw. Störung aus bzw. durch Spezies, die UV- und kurzwelliges sichbares Licht absorbieren.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß Arylazo- Derivate von QUIN 1 und QUIN 2 in wirksamer Weise zur kolorimetrischen Bestimmung von Ca&spplus;&spplus; verwendbar sind, da sie hoch selektiv für Calcium in Medien sind, die auch Magnesiumionen enthalten. Ferner absorbieren diese Verbindungen Licht bei längeren Wellenlängen, als dies bei ähnlich derivatisierten BAPTAs der Fall ist, und zeigen und ergeben eine signifikant größere Verschiebung bei der Maximalabsorption der komplexierten - gegen - nicht-komplexierten Verbindung, als dies mit entsprechenden chromogenen BAPTA-Verbindungen der Fall ist.
Die vorliegende Erfindung umfasst Arylazo-Calcium-Chromoionophore, die durch Formel A gekennzeichnet sind:
In der obigen Formel sind X Wasserstoff oder ein einwertiges Kation, Y H oder ein Methoxyrest und R ein 5- oder 6-gliedriger, substituierter oder unsubstituierter aromatischer oder heteroaromatischer Ring oder ein kondensiertes Ringsystem aus 5- oder 6-gliedrigen, substituierten oder unsubstituierten aromatischen oder heteroaromatischen Ringen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung dieser Chromophoren zur quantitativen Bestimmung des Calcium-Ions.
Die Synthese der Chromoionophoren der vorliegenden Erfindung ist durch das folgende Schema I dargestellt, worin der vorher genannte Y-Substituent Wasserstoff ist. SCHEMA I
Bezüglich Schema I, werden die Calcium-Indikatoren 14 bis 41 (Tabelle 2) unter Anwendung der darin als solche bezeichneten Verfahren 1 oder 2 hergestellt. Verfahren 1 beinhaltet, daß man ein aromatisches Diazoniumsalz R-N&sub2;&spplus; mit 1 kuppelt, um Arylazo-Tetraester-Zwischenproduktverbindungen 2 bis 11 (Tabelle 1) zu ergeben, worauf eine Basen-Hydrolyse erfolgt, um die Calcium-Indikatoren 14 bis 23 (Tabelle 2) zu ergeben. Im Fall von QUIN 2 weist das Ausgangsmaterial 1 eine 6-Methoxygruppe auf. Tabelle 1
Im Verfahren 2 werden zuerst die Ester von 1 hydrolysiert, um Verbindung 13 zu ergeben, worauf diese mit dem aromatischen Diazoniumsalz gekuppelt wird, um die Indikatoren 24 bis 41 zu ergeben. Verfahren 1 ist insofern vorteilhaft, als die Arylazo-Tetraester-Zwischenproduktverbindungen hochkristallin und durch einfache Umkristallisation leicht zu reinigen sind. Deren Hydrolyse mit einer Base unter bevorzugten Bedingungen, d. h. mit einer stöchiometrischen Menge oder einem geringen Überschuß von 4,0 M KOH oder LiOH in n-Butylalkohol, ergibt die Calcium-Indikatorverbindungen direkt in einer reinen, leicht zu sammelnden und hoch wasserlöslichen Form, was keine zusätzliche Reinigung erforderlich macht. Verfahren 2 weist einen Vorteil in Zusammenhang mit der Synthese bestimmter Analogverbindungen auf, die sich für die basischen Hydrolyse-Bedingungen eignen. Einige Analogverbindungen können mit beiden Verfahren hergestellt werden, und es sind repräsentative Syntheseverfahren unten angegeben. Alle Ausgangsmaterialien sind für die Durchschnittsfachleute auf dem Gebiet der organischen Synthese rasch verfügbar und zugänglich.
Die Calcium-Indikatorverbindungen 43 bis 49 (Tabelle 2) weisen einen 6-Methoxy-Substituent im Chinolin-Ring auf und sind im Stand der Technik als QUIN 2-Verbindungen bekannt, die sich von denjenigen unterscheiden, die in der 6-Position unsubstituiert sind und als QUIN 1-Verbindungen bezeichnet werden. Diese können aus im Handel erhältlichem QUIN 2, freie Säure, Verbindung 42, X = H, (von MTM Research Chemicals, Windham, New Hampshire, USA) durch Reaktion mit einem geeigneten aromatischen Diazoniumsalz (R-N&sub2;&spplus;) unter Anwendung des Verfahrens 1 hergestellt werden. Alternativ dazu, können QUIN 2-Tetraethylester, die auch von MTM erhältlich sind, zuerst mit einem aromatischen Diazoniumsalz gekuppelt werden, um einen Arylazo-QUIN 2- Tetraester (z. B. 12) zu ergeben, welcher unter basischen Bedingungen hydrolysiert wird, um die Calcium-Indikatorverbindung (z. B. 48) durch Verfahren 2 gemäß Schema I' zu ergeben:

Schema 1'

Die Struktur und die Wellenlängen des Absorptionsmaximum für die Verbindungen 14 bis 41 und 43 bis 49 sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Tabelle 2 (Fortsetzung) Tabelle 2 (Fortsetzung) Tabelle 2 (Fortsetzung) Tabelle 2 (Fortsetzung)
Calcium-Indikatorverbindungen wie 54 bis 58 (Tabelle 3) sind Arylazo- Derivate von BAPTA, wie offenbart in der vorher genannten US 4,795,712. Diese Verbindungen können aus BAPTA-Tetraesterverbindungen 50 (Y=5-CH&sub3;) durch das Verfahren gemäß J. Biol. Chem. 260,3440 (1985) oder (Y=4-t-C&sub4;H&sub9;) durch das Verfahren gemäß US 4,795,712 hergestellt werden, wie dargestellt in Schema II. Schema II Tabelle 3
Die 5-Arylazo-BAPTA-Analogverbindungen (54 bis 58) wurden hergestellt, um die überlegenen Eigenschaften der Arylazo-QUIN-Verbindungen als Calcium- Indikatoren durch direkten Vergleich von BAPTA- und QUIN-Analogverbindungen mit denselben substituierten Arylazo-Resten zu belegen. In Tabelle 4 sind die im sichtbaren Bereich liegenden Spektraldaten für die unkomplexierten (- Ca&spplus;&spplus;) und die Metall-komplexierten (+ Ca&spplus;&spplus;) Indikatoren in Borat-Puffer von pH = 9,0 zusammengefaßt, wie dies des weiteren unter dem Abschnitt, der die Leistungsbewertung betrifft, beschrieben ist. Tabelle 4
Bezüglich Tabelle 4 ist es wichtig anzumerken, daß die Arylazo-QUIN- Verbindungen eine größere Verschiebung in ihren Absorptionsmaxima (Δλmax) bei Komplexierung mit Ca&spplus;&spplus; zeigen und ergeben, als dies bei den entsprechenden Arylazo-BAPTA-Verbindungen des Standes der Technik der Fall ist. Für die fünf Paare der in Tabelle 4 angegebenen Verbindungen lag die gestiegene Spektralverschiebung im Bereich von 30 bis 54 nm.
Ein Fachmann auf dem Gebiet der Farbstoffchemie könnte vorwegnehmen, daß das λmax einer unkomplexierten Arylazo-QUIN-Verbindung bei einer längeren Wellenlänge als derjenigen der entsprechenden Arylazo-BAPTA- Analogverbindung wegen der durch das Chinolin-Ringsystem sich ergebenden verlängerten Konjugation liegen sollte. Allerdings konnte man nicht vorwegnehmen, daß das λmax der Metall-komplexierten Arylazo-QUIN-Verbindung bei derselben oder einer kürzeren Wellenlänge als derjenigen der Arylazo-BAPTA- Analogverbindung liegen sollte. Dies erklärt teilweise die gestiegene Spektralverschiebung der Arylazo-QUIN-Indikatoren, wobei der Anstieg deutliche Vorteile bietet, wenn diese Verbindungen als Indikatoren in diagnostischen Assayverfahren für Calcium in biologischen Flüssigkeiten verwendet werden.
Es ist nicht zu erwarten, daß sich die Arylazo-QUIN-Verbindungen alle für die Bestimmung von Calcium in biologischen Flüssigkeiten, wie menschlichem Blut oder Plasma, eignen, wenn Calcium mit hohen Gehaltsmengen in einer Mischung vorhanden ist, die weitere Metallionen wie Magnesium enthält. Somit stellen Grynkiewicz et al in J. Biological Chem. 260, 3440 (1985) fest, daß "die hohe effektive Affinität von QUIN 2 für Ca&spplus;&spplus; ideal zur Messung von Gehaltsmengen... nahe 10&supmin;&sup7; M ist, was aber auch bedeutet, daß bei mikromolaren Gehaltsmengen oder darüber sich der Farbstoff einer Sättigung nähert und Auflösungsvermögen verliert."
In menschlichem Blut können die Gehaltsmengen von Ca&spplus;&spplus; im Bereich von 1 bis 20 mg/dl (2,5 · 10&supmin;&sup4; bis 5 · 10&supmin;³ M) liegen, und sogar bei einer Verdünnung der Probe auf 1 : 100 an einem typischen klinischen Analysegerät beträgt die endgültige Ca&spplus;&spplus;-Konzentration immer noch 2,5 · 10&supmin;&sup6; bis 5 · 10&supmin;&sup5; M, was voll im mikromolaren Bereich liegt. In unerwarteter Weise zeigen oder ergeben die Arylazo-QUIN-Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine lineare Reaktion auf Calcium in Serum über den Bereich von 0 bis 20 mg/dl, und zwar ohne Verlust an Auflösungsvermögen, wenn die Probe auf 1 : 100 in der analytischen Reagenslösung, die den Indikator enthält, verdünnt wird.
Was nun wiederum die Literaturstelle von Grynkiewicz et al betrifft, stellen sie heraus, daß "die Selektivität von QUIN 2 für Calcium gegenüber Magnesium verbesserungsbedürftig sei." Dies ist eine wichtige Betrachtungsweise, da Mg&spplus;&spplus;-Gehaltsmengen in Humanserum in typischer Weise höher als die Calcium-Gehaltsmengen sind und so hoch wie 2,93 mg/dl (1,2 · 10&supmin;³ M) liegen können. Die Interferenz durch Mg&spplus;&spplus; würde die Anwendbarkeit der Arylazo- QUIN-Indikatoren in medizinischen Diagnoseverfahren einschränken, wir haben jedoch keine signifikante Interferenz bei Gehaltsmengen, die um mehr als das 3-Fache höher lagen, mit Reagentien, die Verbindungen wie 14 enthielten, vorgefunden.
Grynkiewicz et al merken auch an, daß "größere Selektivität zur Bindung von Ca²&spplus; anstatt Mg²&spplus; bei ähnlichen Tetracarboxylat-Chelatoren beobachtet wird, in denen die Ringe durch Etherbindungen ohne einen Chinolin- Ringstickstoff verbunden sind." Im Gegensatz zu den durch diese Literaturstelle erhobenen Zweifeln, haben wir herausgefunden, daß die Arylazo-QUIN- Verbindungen sehr nützliche Indikatoren sind, die wesentliche Vorteile gegenüber Verbindungen des Standes der Technik zur Messung von Calcium in biologischen Proben bieten.
Wie oben dargelegt, können die Arylazo-QUIN-Verbindungen der vorliegenden Erfindung durch die allgemeine Formel A dargestellt werden, worin Y Wasserstoff oder eine Methoxygruppe und X Wasserstoff oder ein einwertiges Kation, z. B. Lithium, Natrium oder Kalium, sind, wobei Kalium die bevorzugte Spezies darstellt. Der Rest R kann eine aus einer großen Vielfalt von zu einem Ring geschlossenen aromtischen organischen Strukturen sein, welche unsubstituiert oder mit Resten wie, z. B., Alkyl-, Alkoxy-, Halo-, Cyano-, Nitro-, Aryl-, Heteroaryl-, Keto- oder Mesyl-Resten substituiert sind und die Struktur des Azofarbstoffs vervollständigen und die optischen Absorptionseigenschaften der Verbindungen der vorliegenden Erfindung bewirken. Typische Reste R sind:
1. Ein 6-gliedriger, substituierter oder unsubstituierter carbocyclischer oder aromatischer Ring. Beispiele solcher 6-gliedriger Ringe schließen 2-Nitrophenyl, 2-Nitro-4-fluorphenyl, 2-Nitro-4-chlorphenyl, 2-Nitro-4-trifluormethylphenl, 2-Nitro-4-cyanophenyl, 4-Nitrophenyl, 2-Fluor-4-nitrophenyl, 2-Chlor-4-nitrophenyl, 3-Nitro-4-sulfophenyl, 2,5-Dichlor-4-(2'-sulfoethylsulfonamido)phenyl, 2-Methansulfonyl-4- nitrophenyl, 2,4-Dinitrophenyl, 2-Chlor-5-nitrophenyl oder 3,5- Dinitrophenyl ein.
2. Ein 5- oder 6-gliedriger, substituierter oder unsubstituierter heteroaromatischer Ring, z. B. 2-Thiazolyl, 4-Methyl-2-thiazolyl, 4-Phenyl-2- thiazolyl, 4,5-Dimethyl-2-thiazolyl, 5-Nitro-2-thiazolyl, 5-Brom-2- thiazolyl, 4-Carboxymethyl-2-thiazolyl, 5-Nitrophenylsulfonyl-2-thiazolyl, 2-Pyridyl, 4,5-Dimethyl-2-pyridyl, 5-Chlor-2-pyridyl, 5-Brom-2-pyridyl, 3-Methyl-2-pyridyl, 5-Brom-3-nitro-2-pyridyl, 3-Chlor-5-trifluormethyl-2- pyridyl, 3,5-Dichlor-2-pyridyl, 3-Nitro-2-pyridyl, 4-Pyridyl, 2,5,6- Trifluor-3-chlor-4-pyridyl, 2-Methoxy-5-pyridyl, 2,6-Dimethoxy-3-pyridyl, 5-Nitro-2-pyrimidinyl, 4-Methyl-2-pyrimidinyl, 4,6-Dimethyl-2-pyrimidinyl, 4,6-Dimethoxy-2-pyrimidinyl, 4-Chlor-6-methyl-2-pyrimidinyl, 5-Methyl-3- isoxazolyl, 3-Methyl-5-isoxazolyl, 3-Methyl-5-isothiazolyl, 1-Ethyl-5- pyrazolyl, 2-(1,3,4-Thiadiazolyl), 5-Ethyl-2-(1,3,4-thiadiazolyl) oder 3-Phenyl-5-(1,2,4-thiadiazolyl).
3. Ein kondensiertes Ringsystem aus 5- oder 6-gliedrigen, substituierten oder unsubstituierten aromatischen oder heteroaromatischen Ringen, z. B. 4-Trifluormethyl-6-chlor-2-benzthiazolyl, 1-Naphthyl, 6-(2'-Hydroxyethyloxy)-2-benzthiazolyl, 6-t-Butyl-2-benzthiazolyl, 4-Methyl-5-chlor-2- benzthiazolyl, 4,5-Dimethyl-2-benzthiazolyl, 2-Benzthiazolyl, 5-Fluor-2- benzthiazolyl, 6-Sulfo-2-benzthiazolyl, 5,6-Dichlor-2-benzthiazolyl, 2-β- Naphthothiazolyl, 4-Brom-6-chlor-2-benzthiazolyl, 4,5-Dichlor-2- benzthiazolyl, 6-Nitro-2-benzthiazolyl, 4,5,6,7-Tetrachlor-2-benzthiazolyl, 1-Isochinolinyl, 5-Isochinolinyl, 6-Nitro-5-chinolinyl, 5-Chlor-2- benzoxazolyl, 5,6-Dimethyl-2-benzthiazolyl, 6-Ethoxy-2-benzthiazolyl, 6- Fluor-2-benzthiazolyl, 4-Methoxy-2-benzthiazolyl, 6-Methoxy-2- benzthiazolyl, 4-Methyl-2-benzthiazolyl oder 6-Methyl-2-benzthiazolyl.
Die vorliegende Erfindung wird nun noch weiter durch die vorliegenden Beispiele erläutert:

Beispiel I

Die Synthesen von 2-Nitrophenylazo-QUIN 1-Tetrakaliumsalz (14) und Thiazolylazo-QUIN 1 (20) sind typisch für den Verfahrensweg 1 zur Herstellung der Arylazo-QUIN-Analogverbindungen 14 bis 23 und 48.

Stufe 1 (Synthese der Tetraester-Zwischenproduktverbindung 2):

300 mg (2,18 mMol) 2-Nitroanilin und 1,2 ml konzentrierte wässrige HCl wurden bei 50ºC 1 h lang unter Rühren erwärmt. Die sich ergebende Paste wurde mit 3,0 ml Wasser verdünnt und in einem Eisbad 5 min lang gekühlt. Eine Lösung von 160 mg (2,2 mMol) NaNO&sub2; in 1,0 ml Wasser wurde zur gerührten Lösung rasch gegeben und im Eisbad 1 h lang gehalten. Die klare, fast farblose Lösung wurde ca. 2 min lang zu einer gerührten Lösung von 1,25 g (2,0 mMol) QUIN 1-Tetraethylester (1) (hergestellt gemäß dem Verfahren von Tsien, Biochemistry 19, 2396, 1980) in 40 ml CH&sub3;OH bei -10ºC getropft. Die Reaktionsmasse wurde bei -10ºC 30 min lang gerührt, auf Umgebungstemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Der Feststoff, der sich aus der Reaktionsmischung abschied, wurde filtriert, mit 250 ml CH&sub3;OH/H&sub2;O (1 : 1) gewaschen, in 60 ml CH&sub3;OH 1 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt und erneut filtriert. Das Rohprodukt wurde in 50 ml Ethylacetat (EtOAc) gelöst und mit 100 ml Hexan verdünnt, worauf ein Feststoff rasch aus der Lösung ausfiel. Die Mischung wurde in einem Kühlschrank über Nacht bei ca. 0ºC aufbewahrt; der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, mit Hexan gewaschen und im Vakuum bei 65ºC getrocknet, um die 2-Nitrophenylazo-QUIN 1-Tetraethylester- Zwischenproduktverbindung (1,18 g, 76,6%) als ziegelrote feine Nadeln mit F. = 120 bis 121,5ºC zu ergeben.
Rf = 0,4 an Kieselgel-TLC-Platten, entwickelt in EtOAc/Hexan (4 : 6).
IR (KBr) cm&supmin;¹: 3443, 2983, 1748, 1559, 1531, 1514, 1487, 1402, 1364, 1306, 1262, 1185, 1027;
¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ: 9,30 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 8,02 (d, J = 8,8 Hz; 1H), 7,82 bis 7,92 (m, 3H), 7,68 (t von d, Jt = 7,7 Hz und Jd = 1,4 Hz, 1H), 7,52 (t von d, Jt = 7,7 Hz und Jd = 1,3 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,75 (d, J = 1,3 Hz, 1H), 6,70 (br d, J = 8,0 Hz, 1H), 5,33 (s, 2H), 4,56 (s, 4H), 4,31 (q, J = 7,1 Hz, 4H), 4,22 (s, 4H), 3,56 (q, J = 7,1 Hz, 4H), 2,24 (s, 3H), 1,32 (t, J = 7,1 Hz, 6H), 1,20 (t, J = 7,1 Hz, 6H;
¹³C-NMR (CDCl&sub3;) ppm: 171,5, 170,9, 155,0, 150,5, 150,3, 147,4, 145,8, 140,0, 139,0, 136,7, 133,0, 132,6, 129,4, 128,5, 123,9, 122,0, 120,6, 120,1, 119,1, 115,7, 114,4, 112,4, 71,4, 61,2, 60,6, 59,3, 54,0, 20,9, 14,3, 14,2.
Anal. berechnet für C&sub3;&sub9;H&sub4;&sub4;N&sub6;O&sub1;&sub1;: C, 60,61; H, 5,74; N, 10,88
Gefunden: C, 61,00; H, 5,80; N, 11,02

Stufe 2 (Synthese von 14, X = K):

1,000 g (1,294 mMol) 2-Nitrophenylazo-QUIN 1-Tetraethylester (2) und 35 ml n-Butylalkohol (n-BuOH) wurden in einem 100 ml Kolben bei Umgebungstemperatur unter Argon 10 min lang gerührt. Die Suspension wurde dann mit 1,54 ml (6,16 mMol, 4,75 Äquivalenten) 4,00 M wässriger KOH (hoch reiner Halbleiter-Grad) und zusätzlichen 7 ml n-BuOH behandelt und bei Umgebungstemperatur unter Argon über Nacht gerührt. Nach 23 h zeigte TLC (Kieselgel; n-BuOH/Essigsäure (HOAc)/H&sub2;O (4 : 1 : 1): Produkt Rf = 0,16, Ausgangsmaterial-Rf = 0,95) an, daß die Reaktion vollständig war. Die Reaktionsmasse wurde in ein Zentrifugenrohr unter Spülung des Kolbens mit ca. 2 ml n-BuOH überführt und dann bei 20000 · G 10 min lang zentrifugiert, wor auf der Überstand vom entstandenen Pellet abpippettiert und verworfen wurde. Das Pellet wurde zweimal unter Ultraschall in 20 ml n-BuOH resuspendiert und wie oben zentrifugiert. Das endgültige Pellet wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur unter Vakuum im Zentrifugenrohr getrocknet, pulverisiert und in ein Fläschchen überführt, worin es unter Vakuum weitere 2 Tage lang bei Umgebungstemperatur getrocknet wurde, um 1,03 g (90%) der Titelverbindung (14) als ziegelrotes Pulver zu ergeben, das Spuren des bei der Aufarbeitung verwendeten Lösungsmittels zurückhielt.
IR (KBr) cm&supmin;¹: 3442 (breit), 2928, 1597, 1507, 1397, 1286, 1241, 1182;
¹H-NMR (D&sub2;O) δ: 9,20 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 8,04 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,96 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,79 bis 7,90 (m, 3H), 7,62 (t von d, Jt = 7,7 Hz und Jd = 1,5 Hz, 1H), 6,83 bis 6,90 (m, 2H), 6,70 bis 6,79 (m, 2H), 5,41 (s, 2H), 4,42 (s, 4H), 3,95 (s, 4H), 2,16 (s, 3H);
¹³C-NMR (D&sub2;O) ppm: 182,3, 181,3, 157,7, 154,8, 152,1, 148,7, 148,0, 141,2, 140,9, 140,2, 136,8, 135,2, 134,5, 132,2, 131,2, 127,2, 124,4, 123,4, 122,7, 121,1, 119,6, 117,2, 114,4, 73,7, 62,0, 59,8, 22,7
Anal.: ber. für C&sub3;&sub1;H&sub2;&sub4;N&sub6;O&sub1;&sub1;K&sub4; · 1/4n-BuOH · 3H&sub2;O
Theorie: C, 43,40; H, 3,70; N, 9,49
Gefunden: C,43,27; H, 3,92; N, 9,28

Beispiel II

Synthese von Thiazolylazo-QUIN 1 (20, X = K)

Stufe 1 (Synthese der Tetraester-Zwischenproduktverbindung 8):

Eine 1,0 ml Mischung aus H&sub2;SO&sub4;/H&sub2;O (7 : 3, V/V) wurde in einem Eisbad gekühlt, und es wurde NaNO&sub2; (44,8 mg, 0,65 mMol) zugefügt. Eine Lösung von 2-Aminothiazol (66 mg, 0,65 mMol) in 0,5 ml HOAc wurde zugetropft, die Mischung wurde bei 0 bis 5ºC 1,5 h lang gerührt und dann mit 1,0 ml H&sub2;O verdünnt. Nach Rühren über weitere 40 min wurde die entstandene Lösung des Diazoniumsalzes, über 15 min. zu einer Lösung von 1 (250 mg, 0,4 mMol) in 5,0 ml eiskaltem CH&sub3;OH getropft. Die Mischung wurde bei 0 bis 5ºC 1 h lang gerührt und dann mit 75 ml H&sub2;O verdünnt. Der orangerote Feststoff, der ausfiel, wurde durch Filtration gesammelt, mit 100 ml H&sub2;O gewaschen und getrocknet, um 8 zu ergeben (220 mg, 75%). Umkristallisation aus EtOAc/Hexan (1 : 3, V/V) ergab die analytische Probe als orangerotes Pulver mit einem F. von 100 bis 102ºC.
IR (CHCl&sub3;) cm&supmin;¹: 3001, 2933, 1744, 1559, 1506, 1487, 1412, 1373, 1309, 1258, 1192, 1139, 1109, 1024;
¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ: 9,19 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 8,39 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,99 (d, J = 3,5 Hz, 1H), 7,92 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,35 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 6,86 bis 6,91 (m, 2H), 6,68 bis 6,73 (m, 2H), 5,26 (s, 2H), 4,66 (s, 4H), 4,33 (q, J = 7,1 Hz, 4H), 4,21 (s, 4H), 4,12 (q, J = 7,1 Hz, 4H), 2,23 (s, 3H), 1,34 (t, J = 7,1 Hz, 68), 1,21 (t, J = 7,1 Hz, 6H);
¹³C-NMR (CDCl&sub3;) ppm: 171,4, 170,6, 155,2, 151,2, 150,3, 143,4, 138,95, 138,89, 136,7, 133,0, 132,4, 128,7, 122,0, 120,8, 120,1, 119,9, 116,4, 114,4, 112,5, 71,3, 60,6, 56,4, 54,0, 20,9, 14,24, 14,20
Anal.: ber. für C&sub3;&sub6;H&sub4;&sub2;N&sub6;O&sub9;S: C, 58,84, H, 5,76, N, 11,44
gef.: C, 58,85, H, 5,70, N, 11,63

Stufe 2:

Eine Suspension von 8 (0,144 g, 0,196 mMol) in n-BuOH (8,8 ml) wurde bei Umgebungstemperatur mit 4,0 M KOH (0,245 ml, 0,98 mMol, 5 Äq) behandelt und 7 h lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann bei 5ºC 17 h lang gekühlt, in ein Zentrifugenrohr mit einigen ml n-BuOH überführt und bei 7500 · G 20 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, worauf das sich ergebende Pellet unter Ultraschall in ca. 3 ml frischem n-BuOH resuspendiert und erneut zentrifugiert wurde. Das Produkt wurde mit EtOAc und Hexan durch Resuspension/Zentrifugation gewaschen und im Vakuum (0,1 Torr) bei 60ºC 2 h lang getrocknet, um 20 (0,133 g, 87%) als dunkelrotes Tetrakaliumsalz zu ergeben.
IR (KBr) cm&supmin;¹: 3418 (breit), 1587, 1505, 1396, 1287, 1247, 1202, 1179, 1136, 1022;
¹H-NMR (D&sub2;O) δ: 9,15 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 8,07 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 7,81 (d, J = 3,5 Hz, 1H), 7,72 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,43 (d, J = 3,5 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 6,76 (d, J = 0,7 Hz, 1H), 6,62 bis 6,70 (m, 2H), 5,31 (s, 2H), 4,40 (s, 4H), 3,87 (s, 4H), 2,10 (s, 3H);
¹³C-NMR (D&sub2;O) ppm: 182,5, 180,6, 157,8, 156,0, 152,1, 145,0, 141,1, 140,3, 139,6, 135,3, 134,2, 132,0, 124,3, 123,7, 123,0, 121,0, 120,6, 117,2, 114,8, 73,6, 62,4, 59,7, 22,7
Anal.: berechnet für C&sub2;&sub8;H&sub2;&sub2;N&sub6;O&sub9;SK&sub4; · ¹/&sub2;n-BuOH · 3H&sub2;O:
Theorie: C, 41,60; H, 3,84; N, 9,70
Gefunden: C, 41,77; H, 3,81; N, 9,89
Die im folgenden beschriebene Synthese von Benzthiazolylazo-QUIN 1- Tetrasäure (32) und von (4-Trifluormethyl-6-chlorbenzthiazolylazo)-QUIN-1- Tetrasäure (39) ist typisch für den Verfahrensweg 2 zur Herstellung der Arylazo-QUIN 1-Analogverbindungen 24 bis 41.

Beispiel III

(Synthese der Benzthiazolylazo-QUIN 1-Tetrasäure 32)

Stufe 1 (Synthese von QUIN 1-Tetrasäure (13 X = H):

6,24 g (10 mMol) QUIN 1-Tetraethylester (1) wurden in 100 ml EtOH gelöst und mit einem 5-molaren Überschüss wässriger 4 M KOH behandelt. Die Reaktionsmischung wurde 16 h lang bei 40ºC gerührt, worauf die Reaktion durch TLC (Kieselgel; EtOH : HOAc : H&sub2;O (4 : 1 : 1) bezüglich ihrer Vollständigkeit überprüft wurde. Nach der Zugabe von 100 ml H&sub2;O wurde das EtOH unter vermindertem Druck verdampft, und es wurde der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von 1 M HCl auf 2,5 eingestellt. Die Tetrasäure begann halb kristallin/halb gummiartig auszufallen. Ein völlig kristallines Produkt wurde nach 24stündigem Rühren isoliert.
¹H-NMR (CD&sub3;OD) δ: 8,22 (d, 1H), 7,67 (d, 1H), 7,40 (d, 2H), 7,07 (t, 1H), 6,85 (d, 1H), 6,84 (s, 1H), 6,66 (d von d, 1H), 5,35 (s, 2H), 4,30 (s, 4H), 4,07 (s, 4H), 2,18 (s, 3H)
Analyse: berechnet für C&sub2;&sub5;H&sub2;&sub5;NO&sub9;: C, 58,71; H, 4,93; N, 8,22
Gefunden: C, 58,75; H, 4,89; N, 8,34

Stufe 2 (Diazotierung)

220 mg (1,46 mMol) 2-Aminobenzthiazol wurden in einer Mischung aus 15 ml H&sub3;PO&sub4; und 5 ml HOAc unter Ultraschall gelöst, bei 0ºC gekühlt und mit 0,25 ml 40%-iger Nitrosylschwefelsäure behandelt. Die Reaktionsmischung wurde 2 h lang bei 0ºC gerührt, und es erfolgte dann die Zugabe einer kleinen Menge Harnstoff. Nach Rühren über eine weitere Stunde war die Lösung fertig zur Verwendung in Stufe 3.

Stufe 3 (Kupplung)

0,747 g (1,46 mMol) QUIN 1-Tetrasäure (13, X = H) wurden in einer Mischung aus 100 ml CH&sub3;OH und 50 ml H&sub2;O gelöst, auf -20ºC gekühlt und mit der Diazonium-Lösung aus Stufe 2 behandelt. Die Reaktionsmischung wurde bei pH 4 durch die Zugabe von konzentrierter NaOH gehalten. Die Lösung wurde auf Umgebungstemperatur erwärmt, und es wurde der pH-Wett auf 2,5 eingestellt. CH&sub3;OH wurde unter vermindertem Druck verdampft, und es wurde das Produkt 32 unter Filtration gesammelt. Ausbeute: 0,9 g (91%).

Stufe 4 (Reinigung)

Unreines 32 wurde durch Blitz-Chromatographie an einer RP-2- Kieselgelsäule (Kieselgel 60, silaniert, Partikelgröße = 0,063 bis 0,200 mm; von E. Merck) unter Entwicklung mit einem mit KOH auf pH 9 eingestellten Lösungsmittelgemisch aus CH&sub3;OH/H&sub2;O (2 : 3) gereinigt. Vor Aufbringung auf die Säule wurde die Tetrasäure in einem Minimalvolumen des entwickelnden Lösungsmittels suspendiert und mit einem 4 molaren Überschuss von 4 M KOH behandelt, um eine homogene Lösung zu erhalten. Säulen-Fraktionen, enthaltend Reinprodukt, wurden gesammelt und auf pH 2,5 angesäuert; CH&sub3;OH wurde unter vermindertem Druck entfernt, und es wurde reines 32 durch Filtration gewonnen.
¹H-NMR (CD&sub3;OD + DMSO-d&sup6;) δ: 9,20 (d, 1H), 8,21 (d, 1H), 8,03 (d, 1H), 8,00 (d, 1H), 7,96 (d, 1H), 7,54 (t, 1H), 7,46 (t, 1H), 7,04 (d, 1H), 6,89 (d, 18), 6,81 (d, 1H), 6,69 (d von d, 1H), 5,33 (s, 2H), 4,67 (s, 4H), 4,13 (s, 4H), 2,23 (s, 3H)
Anal.: berechnet für C&sub3;&sub2;H&sub2;&sub8;N&sub6;O&sub9;S: C, 57,14, H, 4,20; N, 12,50
Gefunden: C, 57,32; H, 4,26; N, 12,71

Beispiel IV

Synthese der (4-Trifluormethyl-6-chlorbenzthiazolylazo)-QUIN 1- Tetrasäure (39)

Stufe 1:

2-Amino-4-trifluormethyl-6-chlorbenzthiazol wurde diazotiert, wie dies oben für die Herstellung von 32 beschrieben ist.

Stufe 2:

QUIN 1-Tetrasäure (13) wurde mit der in Stufe 1 hergestellten Diazonium-Lösung gemäß dem zur Herstellung von 32 angewandten Verfahren gekuppelt, mit der Ausnahme, daß die Kupplung bei -60ºC durchgeführt wurde und keine Steuerung des pH-Wertes der Reaktion erfolgte.
Ausbeute: 84%.

Stufe 3:

RP-2-Säulen-Reinigung von 39 war dieselbe wie die oben für die Reinigung von 32 beschriebene.
¹H-NMR (CD&sub3;OD + DMSO-d&sub6;) δ: 9,15 (d, 1H), 8,45 (d, 1H), 8,29 (d, 1H), 8,07 (d, 1H), 7,84 (d, 1H), 7,08 (d, 1H), 6,86 (d, 1H), 6,73 (d, 1H), 6,62 (d von d, 1H), 5,32 (s, 2H), 4,73 (s, 4H), 4,04 (sd, 4H), 2,19 (s, 3H)
Anal.: berechnet für C&sub3;&sub3;H&sub2;&sub6;ClF&sub3;N&sub6;O&sub9;S: C, 51,13; H, 3,38; N, 10,84
Gefunden: C, 51,38; H, 3,47; N, 10,63

Beispiel V

Die Synthese der 2-Nitrophenylazo-BAPTA-Analogverbindung 54 und der Thiazolyl-BAPTA-Analogverbindung 56 sind typisch für die beiden Verfahrenswege zur Herstellung der Arylazo-BAPTA-Analogverbindungen 54 bis 58.

Synthese von 51:

0,110 g (0,19 mMol) 50 (Y = 5-CH&sub3;) (hergestellt wie beschrieben von Grynkiewicz in J. Biol. Chem. 260, 3440 (1985)) wurden in 75 ml CH&sub3;OH gelöst, filtriert und auf -40ºC abgekühlt, worauf 2-Nitrobenzol- Diazoniumtetrafluorborat (0,048 g, 0,2 mMol) (hergestellt wie beschrieben von Doyle und Bryker in J. Org. Chem. 44, 1572 (1979)) auf einmal und dann 5 ml Aceton zugefügt wurden. Die Reaktion wurde auf -20ºC erwärmt, bei dieser Temperatur 2 h lang gerührt und dann auf Umgebungstemperatur erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde zur Trockene unter vermindertem Druck eingedampft und durch Chromatographie (Kieselgel) unter Entwicklung mit Hexan/EtOAc (7 : 3, V/V) gereinigt, um 51 (23 mg, 16%) als einen orangefarbenen Feststoff mit F. = 105-6ºC zu ergeben.
¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ: 7,89 (br d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,44 bis 7,69 (m, 5H), 6,75 bis 6,84 (m, 2H), 6,66 bis 6,70 (m, 2H), 4,35 bis 4,42 (m, 2H), 4,28 bis 4,35 (m, 2H), 4,25 (s, 4H), 4,13 (s, 4H), 4,08 (q, J = 7,1 Hz, 6H), 4,06 (q, J07,1 Hz, 4H), 2,26 (s, 3H), 1,16 (t, J = 7, 1 Hz, 6H), 1,15 (t, J = 7,1 Hz, 6H).
¹³C-NMR (CDCl&sub3;) ppm: 171,5, 170,9, 150,3, 150,0, 147,2, 143,8, 137,1, 132,9, 132,1, 129,5, 124,0, 122,3, 122,2, 122,0, 121,5, 119,5, 118,7, 118,6, 117,1, 117,0, 114,7, 105,1, 77,8, 77,7, 67,5, 67,0, 61,3, 61,1, 60,9, 60,7, 53,9, 53,7, 20,9, 14,1, 14,0; MS (EI, Direkteinlaß) m/z (relative Intensität) 751 (11,7%, M&spplus;), 678 (100%)

Synthese von 54:

7,52 mg (0,01 mMol) 51 in 0,5 ml n-BuOH wurden mit 17,5 gl (7 Äq) 4 M LiOH behandelt und bei Umgebungstemperatur 17,3 h lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in ein Mikrozentrifugenrohr überführt und bei 7000 · G 5 min geschleudert. Der Überstand wurde verworfen, und es wurde das entstandene Pellet mit 0,5 ml n-BuOH gewaschen und dann mit 1,0 ml EtOAc resuspendiert und zentrifugiert, worauf es im Vakuum getrocknet wurde, um 54 (5,1 mg, 77%) als ziegelrotes Pulver zu ergeben.
¹H-NMR (D&sub2;O) δ: 8,09 (d von d, J&sub1; = 8,2 Hz und J&sub2; = 1,1 Hz, 1H), 7,82 (t von d, Jt = 7,7 Hz und Jd = 1,2 Hz, 1H), 7,62 (t von d, Jt = 7,8 Hz und Jd = 1,3 Hz, 1H), 7,48 bis 7,57 (m, 2H), 7,46 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,97 (s, 1H), 6,7 bis 6,80 (m, 3H), 4,40 (s, 4H), 4,05 (s, 4H), 3,73 (s, 4H), 2,25 (s, 3H)
¹³C-NMR (D&sub2;O) ppm: 182,6, 181,5, 152,5, 151,6, 148,0, 147,3, 140,6, 137,5, 135,1, 132,4, 128,8, 127,7, 125,1, 125,0, 122,9, 121,7, 118,1, 109,5, 70,5, 69,9, 60,2, 60,0, 22,7.

Synthese von 53 (Y = 5-CH&sub3;, X = Li)

0,6026 g,(1,0 mMol) 50 (Y = 5-CH&sub3;) wurden in 50 ml n-BuOH suspendiert, mit 4 M LiOH (1,75 ml, 7 Äq) behandelt und bei Umgebungstemperatur 17 h lang gerührt. Das weiße Feststoffprodukt wurde bei 7000 · G abzentrifugiert, mit 10 ml n-BuOH und dann mit 15 ml EtOAc gewaschen und im Vakuum getrocknet, um 53 (Y = 5-CH&sub3;, X = Li) in quantitativer Ausbeute zu ergeben.
IR(Br) cm&supmin;¹: 3440 (breit), 2928, 1599, 1500, 1412, 1325, 1250, 1158, 1130, 1041, 985, 925;
¹H-NMR (D&sub2;O) δ: 7,10 bis 7,14 (m, 1H), 6,90 bis 7,00 (m, 3H), 6,75 bis 6,85 (m, 3H), 4,37 (s, 4H), 3,87 (s, 4H), 3,82 (d, 4H), 2,27 (s, 3H)
¹³C-NMR (D&sub2;O) ppm: 182,6, 152,6, 152,4, 143,3, 140,6, 135,1, 124,9, 124,3, 121,4, 121,0, 118,0, 117,8, 70,4, 70,1, 60,1, 59,8, 22,7
Anal.: berechnet für C&sub2;&sub3;H&sub2;&sub2;N&sub2;O&sub1;&sub0;Li&sub4; · LiOH · 3H&sub2;O
Theorie: C, 46,65; H, 4,94; N, 4,73
Gefunden: C, 46,32; H, 4,82; N, 4,52

Synthese von 56:

2-Aminothiazol (20 mg, 0,2 mMol) wurden in 200 ul HOAc gelöst und zu einer gerührten Mischung von Nitrosylschwefelsäure (32 mg, 0,25 mMol) und HOAc (200 ul) getropft, welche in einem Eisbad gehalten wurde. Die Mischung wurde 45 min lang gerührt, worauf eine kleine Menge Harnstoff zugefügt wurde. Nach anfänglichen 5 min wurde die Mischung zu einer gerührten Lösung von 53 (60 mg, 0,1 mMol) in 1,0 ml H&sub2;O und 0,25 ml CH&sub3;OH getropft, welche bei 0 bis 5ºC gehalten wurden, und man ließ das Ganze 3 h lang reagieren. Die Reaktionsmischung wurde 4mal mit 1 ml Anteilen von EtOAc extrahiert, und es wurden die vereinigten Extrakte über MgSO&sub4; getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, um 56 (42 mg, 70%) zu ergeben. RP-2-Säulenchromatographie (wie in Stufe 4 bei der Synthese von 32) ergab das reine Produkt
¹H-NMR (CD&sub3;OD) δ: 7,95 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,57 bis 7,65 (m, 3H), 6,77 bis 6,990 (m, 3H), 6,68 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,84 (s, 4H; COOH), 4,25 bis 4,50 (m, 4H), 4,30 (s, 4H), 4,07 (s, 4H), 2,27 (s, 3H)

Bestimmung von Absorptionsmaxima

Die optischen Absorptionsmaxima der unkomplexierten und komplexierten Formen der Calcium-Indikatorverbindungen 14 bis 41 und 43 bis 49 wurden in Borat-Puffer von pM = 9 bestimmt und ermittelt. Genügend Indikator wurde im Puffer gelöst, um eine Absorption von ca. 1,0 bis 2,0 zu erzeugen, gemessen mit einem UV-VIS-Spektrometer. Für Standard-Küvetten mit 1 cm Wellenlänge und 4,0 ml Volumen betrugen die typischen Menge 0,15 bis 0,35 mg des Indikators in 4,0 ml Puffer. Die unkomplexierten Absorptionsmaxima wurden ermittelt, dann wurden ca. 2,0 mg CaCl&sub2; (ein 50- bis 100-fach molarer Überschuß) zugefügt, und es wurde das komplexierte Absorptionsmaximum bestimmt und ermittelt.

Leistungsbewertung

Das Leistungsvermögen von Verbindung 14 wurde in einer flüssigen Reagens-Zubereitung an einem Technicon AXON ®-Analysiergerät bewertet. Das Reagens war aus 100 mM Borat-Puffer zusammengesetzt, enthaltend 100 mg/l Verbindung 14. Die Instrumentenparameter waren die folgenden:
R1-Volumen 350 ul
Probenvolumen 4 ul
Spülvolumen 50 ul
Verzögerung 3 Minuten
Filter 505/750 nm
Typ Endpunkt/Absinken
Die Linearität wurde mit wässrigen Calcium-Lösungen im Konzentrationsbereich von 0 bis 20 mg/dl ermittelt und bewertet. Die Figur, worin die Calcium-Konzentration gegen die Änderung der Absorption bei 505 nm aufgetragen ist, veranschaulicht die Linearität der Reaktion.
Mehrfach-Linearregressionsanalyse der Daten in Fig. 1 ergibt die Gleichung:
Y = 0,0625 X - 0,001
worin Y die Δ-Absorption bei 505 nm, geteilt durch die Absorption bei 750 nm, und X die Calcium-Konzentration in mg/dl sind. Der Korrelationskoeffizient (R) beträgt 0,9997.

Claims

1. Arylazo-Chromoionophore, gekennzeichnet durch die Formel:

worin X Wasserstoff oder ein einwertiges Kation, Y H oder eine Methoxygruppe und R eine zum Ring geschlossene aromatische organische Struktur sind, welche die Struktur des Azo-Farbstoffs vervollständigt.

2. Arylazo-Chromomionophore gemäß Anspruch 1, worin R ein 5- oder 6-gliedriger, substituierter oder unsubstituierter carbocyclischer aromatischer oder heteroaromatischer Ring oder ein kondensiertes Ringsystem aus 5- oder 6-gliedrigen, substituierten oder unsubstituierten carbocyclischen aromatischen oder heteroaromatischen Ringen ist.

3. Arylazo-Chromoionophore gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, worin der carbocyclische, aromatische oder heteroaromatische Ring mit Alkyl-, Alkoxy-, Halo-, Cyano-, Nitro-, Aryl-, Heteroaryl-, Keto- oder Mesyl- Resten substituiert ist.

4. Arylazo-Chromoionophore gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin R ein substituierter 6-gliederiger carbocyclischer aromatischer Ring ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 2-Nitrophenyl, 2-Nitro-4- fluorphenyl, 2-Nitrid-4-chlorphenyl, 2-Nitro-4-trifluormethylphenyl, 2-Nitro- 4-cyanophenyl, 4-Nitrophenyl, 2-Fluor-4-nitrophenyl, 2-Chlor-4-nitrophenyl, 3-Nitro-4-sulfophenyl, 2,5-Dichlor-4-(2'-sulfoethylsulfonamido)phenyl, 2-Methansulfonyl-4-nitrophenyl, 2,4-Dinitrophenyl, 2-Chlor-5-nitrophenyl und aus 3,5-Dinitrophenyl.

5. Arylazo-Chromoionophore gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin Y H ist.

6. Arylazo-Chromoionophore gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin X Kalium ist.

7. Arylazo-Chromoionophore gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, worin R ein 5- oder 6-gliedriger heteroaromatischer Ring ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 2-Thiazolyl, 4-Methyl-2-thiazolyl, 4-Phenyl-2- thiazolyl, 4,5-Dimethyl-2-thiazolyl, 5-Nitro-2-thiazolyl, 5-Brom-2- thiazolyl, 4-Carboxymethyl-2-thiazolyl, 5-Nitrophenylsulfonyl-2-thiazolyl, 2-Pyridyl, 4,6-Dimethyl-2-pyridyl, 5-Chlor-2-pyridyl, 5-Brom-2-pyridyl, 3-Methyl-2-pyridyl, 5-Brom-3-nitro-2-pyridyl, 3-Chlor-5-trifluormethyl-2- pyridyl, 3,5-Dichlor-2-pyridyl, 3-Nitro-2-pyridyl, 4-Pyridyl, 2,5,6- Trifluor-3-chlor-4-pyridyl, 2-Methoxy-5-pyridyl, 2,6-Dimethoxy-3-pyridyl, 5-Nitro-2-pyrimidinyl, 4-Methyl-2-pyrimidinyl, 4,6-Dimethyl-2-pyrimidinyl, 4,6-Dimethoxy-2-pyrimidinyl, 4-Chlor-6-methyl-2-pyrimidinyl, 5-Methyl-3- isoxazolyl, 3-Methyl-5-isoxazolyl, 3-Methyl-5-isothiazolyl, 1-Ethyl-5- pyrazolyl, 2-(1,3,4-Thiadiazolyl), 5-Ethyl-2-(1,3,4-thiadiazolyl) und aus 3-Phenyl-5-(1,2,4-thiadiazolyl).

8. Arylazo-Chromoionophore gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, worin R ein kondensiertes Ringsystem aus 5- oder 6-gliedrigen, substituierten oder unsubstituierten carbocyclischen aromatischen oder heteroaromatischen Ringen ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 4-Trifluormethyl-6- chlor-2-benzthiazolyl, 1-Naphthyl, 6-(2'-Hydroxyethyloxy)-2-benzthiazolyl, 6-t-Butyl-2-benzthiazolyl, 4-Methyl-5-chlor-2-benzthiazolyl, 4,5-Dimethyl- 2-benzthiazolyl, 2-Benzthiazolyl, 5-Fluor-2-benzthiazolyl, 6-Sulfo-2- benzthiazolyl, 5,6-Dichlor-2-benzthiazolyl, 2-β-Naphthothiazolyl, 4-Brom-6- chlor-2-benzthiazolyl, 4,5-Dichlor-2-benzthiazolyl, 6--Nitro-2- benzthiazolyl und aus 4,5,6,7-Tetrachlor-2-benzthiazolyl.

9. Verfahren zum Nachweis von Calcium-Ion in wässriger Flüssigkeit, von der angenommen wird, daß sie ein solches Ion enthält, wobei das Verfahren Stufen umfaßt, in denen man die Flüssigkeit mit einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 in Kontakt bringt und die optische Dichteänderung in der Flüssigkeit bestimmt, die sich aus der Komplexierung von Calcium-Ion mit der genannten Verbindung ergibt.

10. Reagenssystem zum Nachweis von Calcium-Ion in wässrigen Proben, umfassend eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8.