DE69300658T2 - Anthracyclin Analogon, Verbindung UCEG. - Google Patents

Anthracyclin Analogon, Verbindung UCEG.

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Description

    GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft eine neue Verbindung UCE6, welche Antitumoraktivität aufweist und als Antitumormittel brauchbar ist.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es wurde berichtet, daß zahlreiche Verbindungen, wie das Anthracyclin Antibiotika sind, die ein Antrachinongerüst besitzen [CRC Handbook of Antibiotic Compounds, CRC Press, U.S.A. (1981)].
    • KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Verbindung mit einer ausgezeichneten Antitumoraktivität.
  • Die Erfinder fanden, daß in einer Kultur, die durch Inkubation eines aus dem Boden isolierten Mikroorganismus (im folgenden als Stamm UOE6 bezeichnet) in einem Medium erhalten wurde, eine Substanz mit Antitumoraktivität gebildet wird. Die aktive Substanz wurde aus dem Medium isoliert und gereinigt. Die Untersuchung der physikalisch-chemischen Eigenschaften der gereinigten aktiven Substanz zeigte, daß die gereinigte aktive Substanz eine neue Verbindung darstellt. Die neue Verbindung wird UCE6 genannt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die neue Verbindung UCE6, die durch folgende Formel (I) dargestellt wird:
  • oder deren pharmazeutisch verträgliche Salze bereitgestellt.
  • UCE6 besitzt Antitumoraktivität.
  • Diese Verbindung kann erhalten werden, indem man einen Mikroorganismus, der zu den Actinomyceten gehört, kultiviert.
    • GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung wird im folgenden genauer beschrieben.
  • Physikalisch-chemische Eigenschaften von UCE6:
  • (1) Molekulargewicht: 436.
  • (2) Molekularformel: C&sub2;&sub4;H&sub2;&sub0;O&sub8;.
  • (3) Massenspektrometrie: Sekundärionen-Massenspektrum (Matrix : m-Nitrobenzylalkohol): m/z; 437 (M+H)&spplus;, 375, 350, 329, 280, 278, 238, 222, 207.
  • Hochauflösendes FAB Massenspektrum (Matrix : m- Nitrobenzylalkohol)): m/z
  • gefunden: 437,1242 (M+H)&spplus;
  • berechnet: 437,1236 (für C&sub2;&sub4;H&sub2;&sub1;O&sub8;).
  • (4) Spezifische Drehung: [α]D²² = + 350º (c = 0,0021, Methanol).
  • (5) Ultraviolettabsorptionsspektrum: (gemessen in Methanol) λmax nm (ε); 477 (15.000), 334 (14.800), 307 (27.600), 294 (25.300), 283 (26.100), 240 (25.300), 217 (23.500).
  • (6) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr-Methode): Vmax cm&supmin;¹; 3361, 1695, 1655, 1603, 1441, 1377, 1323, 1277, 1217.
  • (7) ¹³C-NMR-Spektrum (100 MHz, Lösung in DMSO-d&sub6;): δ ppm; 184,5, 182,6, 167,0, 162,2, 158,7, 139,0, 137,7, 132,3, 129,5, 128,9, 128,2, 123,7, 121,3, 118,9, 116,9, 111,8, 108,9, 107,7, 62,7, 51,4, 50,0, 23,8, 8,3 (beinhaltet ein nicht beobachtetes Signal).
  • (8) ¹H-NMR-Spektrum (500 MHz, (Lösung in DMSO-d&sub6;): δ ppm; ca. 13,5 (1H, br. s), 7,75 (1H, m), 7,14 (1H, m), 7,00 (1H, m), 6,82 (1H, m), 4,22 (2H, m), 4,17 (1H, m), 2,68 (1H, dd, J = 15,7, 7,3 Hz), 2,57 (1H, dd, J = 15,7, 5,0 Hz), 1,99 (3H, d, J = 1,8 Hz), 1,13 (3H, d, J = 6,2 Hz).
  • (9) Löslichkeit: löslich in Dimethylsulfoxid (DMSO), N,N- Dimethylformamid und Pyridin; kaum löslich in Wasser, Ethanol, Methanol, Ethylacetat und Chloroform.
  • (10) Farbreaktion: positiv in Anisaldehyd und Jod.
  • (11) Aussehen: ein rotes Pulver.
  • (12) Dünnschichtchromatographie: Rf 0,61 [entwickelt mit n- Hexan : Ethylacetat : Methanol (5 : 5 : 1, V/V) auf Silikageldünnschicht (HPTLC Platte Art. 5715, von Merck)]. Rf 0,49 [entwickelt mit Chloroform:Methanol = 10:1]. Nach Abschluß der Entwicklung kann die Stelle mit UCE6 mittels UV-Absorption detektiert werden.
  • Die pharmazeutisch verträglichen Salze von UCE6 schließen pharmazeutisch verträgliche Metallsalze ein. Unter diese Metallsalze fallen Alkalimetallsalze, wie das Natriumsalz und Kaliumsalz sowie Erdalkalimetallsalze, wie das Magnesiumsalz und das Calciumsalz.
  • Die biologische Aktivität von UCE6 wird im folgenden beschrieben.
  • (A) Wachstumshemmung von HeLaS&sub3;-Zellen
  • Jeweils 0,1 ml einer 3 x 10&sup4; Zellen/ml HeLaS&sub3;- Zellsuspension (ATCC HTB22) in MEM-Medium (von Nissui Seiyaku), welches 10 % fötales Kälberserum und 2 mM Glutamin enthielt (im folgenden als Medium A bezeichnet), wurden in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen pipettiert. 0,05 ml der Testverbindung, gegebenenfalls mit Medium A verdünnt, wurde in jede Vertiefung gegeben und anschließend in einem Kohlendioxidgasinkubator 72 Stunden bei 37ºC inkubiert. Nachdem der Überstand der Kultur entfernt worden war, wurden 0,1 ml des Mediums A, welches 0,02 % Neutralrot enthielt, zum Rückstand gegeben. Die Zellen wurden in einem Kohlendioxidgasinkubator bei 37ºC eine weitere Stunde kultiviert, um die Zellen hierdurch zu färben. Nachdem der Überstand der Kultur entfernt worden war, wurde der Rückstand einmal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Das Pigment wurde mit 0,001 N Salzsäure/30 % Ethanol extrahiert und die Absorption bei 550 nm mit einem Mikroplattenlesegerät gemessen. Anschließend wurde der IC&sub5;&sub0; (die Konzentration der Testverbindung, die in der Lage ist, das Wachstum der Zellen zu 50 % zu hemmen) errechnet, indem die Absorption von unbehandelten Zellen mit der Absorption von Zellen, die mit der Testverbindung (bei verschiedenen Konzentrationen der Testverbindung) behandelt worden waren, verglichen wurde. Die Resultate sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Verbindung
  • Eine Methode zur Herstellung von UCE6 wird im folgenden beschrieben.
  • UCE6 kann erhalten werden, indem ein Mikroorganismus (welcher zu den Actinomyceten gehört und in der Lage ist, UCE6 zu produzieren) in einem Medium kultiviert, UCE6 in Kultur akkumuliert und aus der Kultur gewonnen wird.
  • Als UCE6-produzierender Mikroorganismus kann jeder Stamm benutzt werden, soweit er zu den Actinomyceten gehört und in der Lage ist, UCE6 zu produzieren. Desweiteren sind Mutanten eines derartigen Stammes, die entweder durch künstliche Mutationstechniken (zum Beispiel UV-Bestrahlung, Röntgenbestrahlung, Behandlung mit einem mutagenen Agens) oder durch eine spontane Mutation erhalten werden, erfindungsgemäß geeignet. Als ein typisches Beispiel eines Stammes sei der Stamm UOE6 genannt.
  • Die mykologischen Eigenheiten des Actinomycetenstamms UOE6 werden wie folgt beschrieben.
    • 1. Morphologie
  • In einem üblichen Agarmedium bildet der Stamm UOE6 verzweigte Substrathyphen, welche Querwände besitzen. Es wird weder die Bildung von Lufthyphen noch eine charakteristische Segmentierung in den Substrathyphen beobachtet. Es wird keine Spore gebildet, weder Sporangium noch Sklerotium.
    • 2. Wachstum in verschiedenen Medien
  • Der Stamm UOE6 wächst mäßig oder kräftig in synthetischen und natürlichen Medien, welche gewöhnlicherweise benutzt werden, und zeigt orange oder braune Substrathyphen. In einigen Medien produziert er ein braunes lösliches Pigment.
  • Im folgenden werden die Eigenschaften des Wachstums und der Farbe, welche beobachtet werden, wenn der Stamm UOE6 in verschiedenen Medien 20 Tage bei 28ºC kultiviert wird, 5angegeben. Die Farben werden gemäß der im Color Harmony Manual [Container Corporation of America) beschriebenen Klassifizierung ausgedrückt.
  • 1. Glucose/Asparagin-Agarmedium
  • Wachstum und Farbe der Substrathyphen: recht gut, hell gelbbraun (3gc).
  • Lösliches Pigment: gebildet, blaßbraun.
  • 2. Glycerin/Asparagin-Agarmedium Wachstum und Farbe der Strubstrathyphen: recht schwach, hellaprikot (4ea).
  • Lösliches Pigment: keines.
  • 3. Sucrose/Nitrat-Agarmedium
  • Wachstum und Farbe der Substrathyphen: mäßig, hellaprikot (4ea).
  • Lösliches Pigment: wenig gebildet, blaßbraun.
  • 4. Stärke/anorganisches Salz-Agarmedium
  • Wachstum und Farbe der Substrathyphen: mäßig, pastellorange (4ic).
  • Lösliches Pigment: gebildet, blaßbraun.
  • 5. Tyrosin-Agarmedium
  • Wachstum und Farbe der Substrathyphen: mäßig, staubig-orange (41c).
  • Lösliches Pigment: keines.
  • 6. Angereichertes Agarmedium
  • Wachstum und Farbe der Substrathyphen: schwach, hell-gelbbraun (3gc).
  • Lösliches Pigment: wenig gebildet, blaßbraun.
  • 7. Malzextrakt/Hefeextrakt-Agarmedium
  • Wachstum und Farbe der Substrathyphen: gut, pastellorange (4ic).
  • Lösliches Pigment: wenig gebildet, blaßbraun.
  • 8. Hafermehl-Agarmedium
  • Wachstum und Farbe der Rückseite: recht gut, hellorange (4ia).
  • Lösliches Pigment: wenig gebildet, blaßbraun.
    • 3. Physiologische Eigenschaften
  • Im folgenden werden die physiologischen Eigenschaften des Stammes UOE6 beschrieben. Der Wachstumstemperaturbereich wird bestimmt, nachdem der Stamm 7 Tage inkubiert worden ist, während andere Daten erhalten werden, nachdem er 1 bis 3 Wochen inkubiert worden ist.
  • (1) Verwertung einer Kohlenstoffquelle: auf einem Agarmedium werden L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Fructose, Sucrose, L-Rhamnose, Raffinose und D-Mannitol für UOE6 verwendet. Inosit wird jedoch nicht für UOE6 verwendet.
  • (2) Wirkung auf Milch: er verursacht weder Koagulation noch Verflüssigung.
  • (3) Hydrolyse von Stärke: ja.
  • (4) Wachstumstemperaturbereich: 15 bis 35ºC.
  • (5) Produktion von Melanoidpigment: auf definierten Medien nicht beobachtet (Tyrosin Agarmedium, Pepton/Hefe/Eisen- Agarmedium).
  • (6) Verflüssigung von Gelatine: auf einem definierten Medium nicht gewachsen (Glucose/Pepton Gelatine Medium).
    • 4. Zellwandbildung
  • Aminosäuren einschleißlich Alanin, Glutaminsäure, 3- Hydroxydiaminopimelinsäure und Glycin sowie Saccharide einschließlich Xylose und Arabinose werden in der Zellwand des Stammes UOE6 detektiert, der nach der Methode von Kawamoto et al. präpariert worden ist [J. Bacteriol., 146, 57 - 534 (1981)] (Zellwandtyp II, Saccharidmuster D).
  • Gestützt auf diese Eigenheiten von UOE6 wird der Stamm UOE6 in die Actinomyceten eingeordnet. Da keine Spore an UOE6 haftet, ist es schwierig, das Genus des Stammes zu bestimmen.
  • Gemäß dem Budapester Vertrag ist dieser Stamm bei dem Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305 Japan unter der Zugangsnummer FERM BP-3877 seit dem 28. Mai 1992 hinterlegt.
  • Eine Methode zur Inkubation des UCE6-produzierenden Stammes wird im folgenden beschrieben.
  • Um den UCE6-produzierenden Stamm erfindungsgemäß zu kultivieren, kann eine übliche Kultivierungsmethode der Actinomyceten benutzt werden. Als ein Kultivierungsmedium kann entweder ein synthetisches Medium oder ein natürliches Medium benutzt werden, soweit es eine verwertbare Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Stoffe und benötigte Substanzen, die das Wachstum des Stammes und/oder die Produktion von UCE6 fördern, enthält.
  • Als Kohlenstoffquelle können zum Beispiel Glucose, Stärke, Dextrin, Mannose, Fructose, Sucrose, Lactose, Xylose, Arabinose, Mannitol und Melasse entweder einzeln oder in Kombination verwendet werden. Desweiteren sind auch Kohlenwasserstoffe, Alkohole und organische Säuren brauchbar, soweit sie von dem Stamm verwertet werden.
  • Als Stickstoffquellen können z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat, Harnstoff, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Casaminosäuren entweder einzeln oder in Kombination benutzt werden. Zusätzlich kann das Medium anorganische Salze enthalten wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Kaliumdihydrogenphosphat, Eisen-II-sulfat, Calciumchlorid, Mangansulfat, Zinksulfat oder Kupfersulfat, wenn nötig. Desweiteren kann es ein geeignetes Spurenelement (geeignete Spurenelemente) enthalten, die in der Lage sind, das Wachstum des Stammes und/oder die Produktion von UCE6 zu fördern.
  • Als Kultivierungsmethode kann geeigneterweise eine Flüssigkultur oder eine submerse Rührkultur gewählt werden. Die Inkubation wird bei einer Temperatur von 16 bis 37ºC durchgeführt, vorzugsweise bei 25 bis 32ºC, und bei pH 4 bis 10, vorzugsweise 6 bis 8. Üblicherweise ist die Kultivierung innerhalb von 1 bis 7 Tagen beendet und somit das Zielprodukt UCE6 gebildet und in der Zellbrühe und den Zellen akkumuliert. Der pH-Wert des Kulturmediums wird mit Hilfe von wäßrigem Ammoniak oder einer Aminoniumcarbonatlösung kontrolliert. Wenn der Produktinhalt in dem Kulturmedium das maximale Niveau erreicht, wird die Inkubation beendet.
  • Das Produkt UCE6 wird aus der Kultur isoliert und gereinigt durch eine Methode, die gewöhnlich für die Isolierung und Reinigung eines mikrobiellen Metaboliten aus seiner Kultur verwendet wird. Zum Beispiel wird die Kultur durch Filtration in den Kulturüberstand und die Zellen getrennt. Die Zellen werden zum Beispiel mit Chloroform oder Aceton extrahiert. Dann wird der Extrakt mit dem Kulturüberstand vereinigt und über eine Säule gegeben, die mit einem Polystyroladsorbens, wie das Diaion HP20 (von Mitbusishi Kasei Corporation), gepackt worden ist, um die aktive Komponente zu adsorbieren. Die aktive Komponente wird zum Beispiel mit Ethylacetat oder Aceton eluiert. Das Eluat wird konzentriert und UCE6 wird daraus zum Beispiel durch Silikagelsäulenchromatographie oder Hochleistungsflüssigchromatographie erhalten. Während der Inkubations- und Reinigungsprozeduren können die Verhaltensweisen von UCE6 mit Hilfe der UV-Absorption von UCE6 als Indikator beobachtet werden.
  • Das UCE6 kann prinzipiell nach der bekannten Methode, beschrieben von Cameron, D.W. et al, Tetrahedron Letters, 3, 5593-5596 (1992), hergestellt werden.
  • Falls man Salze von UCE6 erhalten möchte, kann UCE6 so wie es ist gereinigt werden, wenn das rohe UCE6 in der Form eines Salzes erhalten wird. Falls UCE6 in freier Form erhalten wird, können Salze in herkömmlicher Weise gebildet werden.
  • Das UCE6 ist als Antitumoragens brauchbar, welches als solches direkt oder in verschiedenen Dosierungsformen verwendet werden kann. Wenn UCE6 zum Beispiel in Form einer Injektion verwendet wird, kann es in einem auf diesem Gebiet herkömmlicherweise verwendeten Lösungsmittel, wie einer physiologischen Kochsalzlösung oder einer Glucose-, Lactose- oder Mannitollösung zur Injektion, gelöst werden. Alternativ kann UCE6 gemäß einer herkömmlichen Art und Weise gefriergetrocknet werden, um ein Produkt für die Injektion zu liefern oder UCE6 kann zu einem injektionsfähigen Pulver präpariert werden, indem ihm Natriumchlorid zugefügt wird. Zusätzlich kann die Injektion auch ein Hilfsagens wie Polyethylenglykol, HCO-60 (oberflächenaktive Substanz von Nikko Chemical Co., Ltd.) sowie einen Träger wie Ethanol und/oder ein Liposom oder Cyclodextrin enthalten. Diese Injektionen werden im allgemeinen für die intravenöse Verabreichung verwendet aber sie können auch für intraarterielle, intraperitoneale oder intrathorakale Verabreichung verwendet werden.
  • UCE6 kann auch oral verabreicht werden, indem es mit einem geeigneten Excipienten, einem Disintegrationsmittel, einem Bindemittel, einem Gleitmittel, etc. in herkömmlicher Art und Weise vermischt wird, um eine Tablette, ein Granulat, ein Pulver oder einen Syrup herzustellen. Desweiteren kann UCE6 mit einem herkömmlich verwendeten Träger gemischt und in ein Suppositorium für die rektale Verabreichung überführt werden.
  • Die Dosierung kann entsprechenderweise in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg, dem Alter des Patienten und dem Zustand des Patienten variieren. Der Verabreichungsweg kann auch gemäß dem Zustand des Patienten und der Dosierung entsprechend variiert werden. Zum Beispiel kann UCE6 intermittierend in einer Dosis von 10 bis 60 mg/kg einmal am Tag verabreicht werden.
  • Das folgende Beispiel dient zur weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung ohne sie zu begrenzen.
    • BEISPIEL 1
  • Der Actinomyceten-Stamm UOE6 (FERM BP-3877) wurde als Impfstamm verwendet. Dieser Stamm wurde in 300 ml eines Impfmediums (pH 7,2 vor der Sterilisation) inokuliert, das 5 g/l Bacto Trypton (von Difco), 5 g/l Hefeextrakt, 3 g/l Fleischextrakt, 10 g/l lösliche Stärke, 10 g/l Glucose und 5 g/l Calciumcarbonat in einem 2 l Erlenmeyerkolben enthielt, und dann bei 28ºC für 120 Stunden unter Rühren bei 200 UPM inkubiert.
  • Das somit erhaltene Impfkulturmedium wurde in einem Verhältnis von 5 Vol-% in 18 l eines Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung, welche sich in einem 30 l Schüttelfermenter befand, überführt. Die Impfkultur wurde darin bei 28ºC unter Lüften mit einer Rate von 18 1/min und Schütteln bei 200 UPM kultiviert.
  • Zusammensetzung des Fermentationsmediums: 50 g/l lösliche Stärke, 15 g/l Sojabohnenmehl, 0,5 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g/l MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,5 g/l Mg&sub3;(PO&sub4;)&sub2; 8H&sub2;O (pH 7,0 vor der Sterilisation eingestellt mit NaOH).
  • Die Kultivierung wurde 144 Stunden fortgesetzt, ohne den pH des Mediums zu kontrollieren.
  • 36 l Methanol wurden der Kultur zugefügt, um dadurch UCE6 zu extrahieren. Zum Methanolextrakt wurden 18 l Wasser gegeben und die Mischung wurde über eine Säule gegeben, die mit dem nichtionischen porösen Harz Diaion HP20 (von Mitsubishi Kasei Corporation) gepackt war. Folglich wurde aktive Substanz (einschließlich UCE6) an dem Harz adsorbiert. Nachdem die Verunreinigungen mit einer Mischung aus Methanol und Wasser (85 : 15, V/V) eluiert worden waren, wurde die aktive Substanz mit Methanol eluiert. Die Methanolfraktion wurde konzentriert und auf eine Silikagelsäule (Lichroprep-Si60, Art. 9390, von Merck) gegeben und anschließend mit Hexan/Ethylacetat/Methanol (8 : 5 : 1, V/V) entwickelt. Die somit eluierte aktive Fraktion wurde konzentriert und auf eine Sephadex LH20-Säule (von Pharmacia) gegeben und anschließend mit Methanol entwickelt. Die somit eluierte aktive Fraktion wurde konzentriert und getrocknet. Dadurch wurden 38 mg von UCE6 als purpurrotes Pulver erhalten.
  • Erfindungsgemäß wird ein neues Fermentationsprodukt UCE6 bereitgestellt, welches Antitumoraktivität besitzt.
  • Während die Erfindung genau und bezugnehmend auf spezifische Beispiele beschrieben worden ist, ist es für einen Fachmann offensichtlich, daß verschiedene Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne von ihrem Umfang abzuweichen.

Claims (3)

1. Verbindung der folgenden Formel (I):
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
2. Pharmazeutisches Mittel, das einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und, als aktiven Inhaltsstoff, eine antitumoral wirksame Menge der Verbindung oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon nach Anspruch 1 umfaßt.
3. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1 (UCE6), welches die Züchtung eines UCE6-produzierenden Stammes in Gegenwart einer assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquelle und die Gewinnung von UCE6 aus der Kulturbrühe umfaßt.
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