DE69233716T2

DE69233716T2 - Immunglobulinvarianten für spezifische Fc-epsilon Rezeptoren

Info

Publication number: DE69233716T2
Application number: DE69233716T
Authority: DE
Inventors: Paula M. Uttica Jardieu; Leonard G. San Francisco Presta
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1991-08-14
Filing date: 1992-08-14
Publication date: 2008-10-30
Anticipated expiration: 2012-08-15
Also published as: LU91219I2; WO1993004173A1; ES2193136T3; HK1014542A1; CA2113813A1; EP0602126B1; ES2296839T3; DE69232944D1; EP1260521A2; DE69232944T2; AU2498192A; EP1260521B1; JPH06509944A; AU706584B2; CA2113813C; AU706584C; ATE233813T1; DK0602126T3; JP3457962B2; AU7038096A

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Aminosäuresequenzvarianten-Anti-IgE-Antikörper und speziell die medizinische Verwendung humanisierter Antikörper, die zur differenziellen Bindung an FcεRI und FcεRII fähig sind.
IgE ist ein Mitglied der Immunglobulin-Familie, die allergische Reaktionen, wie z. B. Asthma, Nahrungsmittelallergien, Typ-I-Hypersensitivität, und die geläufigen, weit verbreiteten Sinus-Entzündungen vermitteln. IgE wird an der Oberfläche von B-Zellen exprimiert und von diesen sekretiert. Durch B-Zellen synthetisiertes IgE wird in der B-Zellen-Membran durch eine Transmembrandomäne verankert, die durch eine kurze Membranbindungsregion an die reife IgE-Sequenz gebunden ist. IgE ist auch über dessen Fc-Region an einen IgE-Rezeptor niedriger Affinität (FcεRII, hiernach „FCEL") an B-Zellen (und Monozyten, Eosinophile und Blutplättchen) gebunden. Wird ein Säugetier einem Allergen exponiert, werden B-Zellen klonal amplifiziert, die IgE synthetisieren, die an das Allergen binden. Dieses IgE wiederum wird durch die B-Zellen in den Kreislauf freigesetzt, wo es von B-Zellen (über EFCL) und von Mastzellen und Basophilen über den so genannten Hochaffinitäts-Rezeptor (FcεRI, hiernach „FCEH") gebunden wird, der sich an der Oberfläche der Mastzellen und Basophilen findet. Solche Mastzellen und Basophilen werden dadurch für Allergen sensibilisiert. Die nächste Exposition eines Allergens vernetzt das FcεRI an diesen Zellen und aktiviert folglich ihre Freisetzung von Histamin und anderen Faktoren, die für klinische Hypersensitivität und Anaphylaxie verantwortlich sind.
Die Wissenschaft hat von Antikörpern berichtet, die zur Bindung an FCEL-gebundenem IgE, nicht jedoch an IgE fähig sind, das an FCEH lokalisiert ist (siehe beispielsweise WO 89/06138 und US-Patent 4.940.782 ). Diese Antikörper sind als klinisch vorteilhaft offenbart, da sie an IgE binden, das sich an frei im Körper zirkulierenden B-Zellen findet, jedoch nicht an FCEH binden und folglich Mastzellen oder Basophilen nicht aktivieren. Zusätzlich sind verschiedenartige Aminosäuresequenzvarianten von Immunglobulinen bekannt, z. B. „chimäre" und „humanisierte" Antikör per (siehe beispielsweise US-Patent 4.816.567 ; WO 91/09968 ; EP 452.508 ; und 91/16927 ). Humanisierte Antikörper sind Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z. B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ und andere Antigen-bindende Untersequenzen von Antikörpern), die eine von nicht-humanem Immunglobulin hergeleitete Minimalsequenz enthalten. Humanisierte Antikörper sind größtenteils humane Immunglobuline (Rezipienten-Antikörper), in denen Reste aus einer Complementary-Determining-Region (CDR) des Rezipienten durch Reste aus einer CDR einer nicht-humanen Spezies (Donor-Antikörper), wie z. B. Maus, Ratte oder Kaninchen ersetzt sind, die die erwünschte Spezifität, Affinität und Kapazität aufweist. In einigen Fällen sind Fv-Gerüst-Reste des Human-Immunglobulins durch entsprechende nicht-humane Reste ersetzt. Darüber hinaus kann ein humanisierter Antikörper Reste umfassen, die weder im Rezipienten-Antikörper, noch in den eingeführten CDR- oder Gerüst-Sequenzen vorhanden sind. Diese Modifizierungen werden durchgeführt, um die Antikörperleistungsfähigkeit weiter zu verfeinern und zu optimieren, wie unten ausführlicher beschrieben werden wird. Ebenso sind monovalente und bispezifische Antikörper an sich bekannt.
Es ist allgemein wohlverstanden, dass FCEH ähnlich wie FCEL an (eine) Erkennungsstelle(n) in der IgE-Konstant-(Fc-)Domäne bindet. Die IgE Erkennungsstelle(n) für die beiden Rezeptoren sind trotz der beträchtlichen, auf das Problem gerichteten früheren Bemühungen nur schlecht definiert.
Im letzten Jahrzehnt sind mehrere Studien durchgeführt worden, um zu ermitteln, welcher Teil des IgE-Moleküls an der Bindung an FcεRI und FcεRII beteiligt ist. Im wesentlichen sind drei Ansätze versucht worden. Erstens sind Peptide, die spezifischen Teilen der IgE-Sequenz entsprechen, entweder als kompetitive Inhibitoren der IgE-Rezeptorbindung (Gurt et al., Eur. J. Immun. 17, 437–440 (1987); Helm et al., Nature 331, 180–183 (1988); Helm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 9465–9469 (1989); Vercelli et al. Nature 338, 649–651 (1989); Nio et al., Peptide Chemistry, 203–208 (1990)) oder zur Hervorbringung von Anti-IgE-Antikörpern verwendet worden, die die IgE-Rezeptor-Wechselwirkung blockieren (Gurt et al., Molec. Immun. 24, 379–389 (1987); Robertson et al., Molec. Immun. 25, 103–113 (1988); Baniyash et al., Molec. Immun. 25, 705–711 (1988)). Das effektivste kompetitive Inhibitorpeptid war eine Sequenz, die 1000fach weniger aktiv als IgE war (Gurt et al., Eur. J. Immun. 17, 437–440 (1987)).
Helm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 9465–9469 (1989) fanden, dass ein den IgE-Resten 329–409 entsprechendes Peptid die In-vivo-Sensibilisierung von humanen, basophilen Granulozyten mit Human-IgE-Antikörpern blockierte. Weitere Studien wiesen darauf hin, dass die Reste 395–409 für die Bindung des 329–409-Peptids an FcεRI nicht essentiell waren (Helm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 9465–9469 (1989)). Es sei besonders erwähnt, dass die unten beschriebenen IgE-Sequenz-varianten die Sequenz von Padlan et al., Mol. Immun. 23, 1063 (1986) aufwiesen, dass jedoch die hierin verwendeten Immunglobulin-Resteanzahlen jene von Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987) sind.
Vercelli et al., Nature 338, 649–651 (1989) verwendeten rekombinante IgE-Peptide sowie monoklonale Anti-Fcε-Antikörper, um die B-Zellen-(FcεRII-)Bindungsstelle von Human-IgE zu untersuchen. Sie zogen denn Schluss, dass die FcεRII-Bindungsstelle sich in Fcε3 nahe K399-V402 befindet.
Burt et al., Eur. J. Immun. 17, 437–440 (1987) untersuchten sieben Peptide gegen Ratten-IgE auf Konkurrenz der Bindung an Ratten-Mastzellen. Ihr aktivstes Peptid, p129, war 1000fach weniger aktiv als IgE. p129 entspricht der Humansequenz 439–453, die die EF-Schleife umfasst. Ein weiteres ihrer Peptide, p130, das den Resten 396–419 in der Fcε3-Domäne entspricht, wies keine Aktivität auf.
Robertson et al., Molec. Immun. 25, 103–113 (1988) bewerteten IgE-Bindung durch ortsgerichtete Antikörper, die durch mehrere synthetische Peptide induziert wurden. Sie zogen den Schluss, dass die durch deren ε-Peptid-4 definierte Sequenz (den Resten 446–460 entsprechend) nicht signifikant an der Rezeptorbindung beteiligt war, während die durch deren ε-Peptid-3 definierte Sequenz (den Resten 387–401 entsprechend) sich wahrscheinlich proximal zur IgE-Rezeptor-Erkennungsstelle befindet.
Nio et al., Peptide Chemistry, 203–208 (1990) bewerteten zahlreiche Peptide in Bezug auf ihre Fähigkeit, die Histaminfreisetzung durch Human-Basophile in vitro zu inhibieren. Nur ein Peptid (Peptid 2, Tabelle 1) zeigte eine spezifische Inhibierung; dieses Peptid umfasste die Reste 376–388. Jedoch wies ein größeres Peptid, das diese Sequenz beinhaltete (Peptid 3, Tabelle 1), keine inhibitorische Aktivität auf.
Zweitens sind Mutationen in IgE teilweise erforscht worden. Schwarzbaum et al., Eur. J. Immun. 19, 1015–1023 (1989) (s. o.) fanden, dass eine Punktmutante, P404H (P442H auf Basis des hierin verwendeten Nummerierungssystems), eine 2fach herabgesetzte Affinität für FcεRI an Ratten-Basophilenleukämie-(RBL-)Zellen aufwies, jedoch ist die Interpretation dieses Befunds umstritten (Weetall et al., J. Immunol. 145, 3849–3854 (1990)).
Drittens sind chimäre Moleküle konstruiert worden. Human-IgE bindet nicht an den Maus-Rezeptor (Kulczycki Jr. et al., J. Exp. Med. 139, 600–616 (1974)), während Nager-IgE mit herabgesetzter Affinität an den Human-Rezeptor bindet (Conrad et al., J. Immun. 130, 327–333 (1983)); Human-IgG1 bindet nicht an IgE-Rezeptoren (Weetall et al., J. Immun. 145, 3849–3854 (1990)). Auf Basis dieser Beobachtungen haben mehrere Forschungsgruppen Human-Maus-Chimären oder Human-IgE-IgG-Chimären konstruiert. Weetall et al., J. Immun. 145, 3849–3854 (1990) stellten eine Reihe von Human-IgG1-Maus-IgE-Chimären her und zogen den Schluss, dass die Fcε2- und Fcε3-Domänen an der Bindung von Maus-FcεRI beteiligt sind, während die Fcε4-Domäne wahrscheinlich nicht an der Bindung an Maus-FcεRI beteiligt ist (jedoch möglicherweise an der Bindung an FcεRII beteiligt ist) Jedoch sind diese Schlussfolgerungen ungewiss, da sie in erster Linie auf das Fehlen der Bindung durch Chimären beruhen und drei der fünf Chimären fehlten einige Zwischenketten-Disulfidbindungen.
Nissim et al., EMBO J. 10, 101–107 (1991) konstruierten eine Reihe von Human-Maus-IgE-Chimären und maßen die Bindung an RBL-Zellen und zogen den Schluss, dass derjenige Teil von IgE, der mit hoher Affinität an den spezialisierten Fcε-Rezeptor an RBL-Zellen bindet, Fcε3 zugeordnet werden könnte.
Die von diesen Autoren berichteten Ergebnisse (z. B. Helm et al. und Burt et al.) sind unvereinbar. Weiters ist es im Falle von Anti-IgE-Antikörpern schwierig, die Möglichkeit unspezifischer Blockierung aufgrund sterischer Behinderung zu eliminieren (Schwarzbaum et al., Eur. J. Immun. 19, 1015–1023 (1989)). Es ist offensichtlich, dass in der Wissenschaft eine beträchtliche Verwirrung bezüglich derjenigen Domänen von IgE-Fc herrscht, die an der Bindung von IgE an FCEH bei der Erhaltung der für die IgE-Bindung an FCEH verantwortlichen IgE-Konformation beteiligt sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Allgemein gesprochen betrifft die vorliegende Erfindung Antikörper, die zur Bindung an FcεRII-gebundenes IgE fähig sind, die jedoch zur Bindung an FcεRI-gebundenes IgE im Wesentlichen unfähig sind, sowie ihre therapeutische Verwendung und ihre Verwendung zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung oder zur Prophylaxe von Allergien.
Gemäß einem der Aspekte stellt die vorliegende Erfindung einen Antikörper bereit, der zur Bindung an FcεRII-gebundenes IgE fähig ist, der jedoch im Wesentlichen zur Bindung an FcεRI-gebundenes IgE unfähig ist, umfassend einen humanen Rezipienten-Antikörper, in den an einer oder mehreren der Positionen 30, 30b, 30d, 33, 53, 91, 92, 93 und 94 der Leichtketten und Positionen 27, 28, 29, 29a, 31, 33, 34, 50, 52, 53, 54, 55, 58, 95, 97, 98, 99, 100 und 101 der Schwerkette Reste aus analogen Positionen im Donor-Antikörper MEA11, MAE13 oder MAE15 mit den in Seq.-ID Nr. 2 bis 7 dargelegten Leicht- und Schwerketten-Aminosäuresequenzen substituiert worden sind, oder einen Donor-Antikörper, der die Charakteristika des MEA11-Antikörpers besitzt, insbesondere bezüglich der Bindung von löslichem IgE, Bindung IgE- tragender B-Zellen, Blockierung der IgE-Bindung an FcεRI und FcεRII, In-vitro-Inhibierung der IgE-Produktion und Unfähigkeit zur Bindung an IgE-beschichtete Basophile, zur therapeutischen Verwendung.
Eine der bevorzugten Ausführungsformen ist ein Antikörper, der die Schwer- und Leichtkettensequenzen von humae11ver.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7a, 8, 8a, 8b oder 9 umfasst, worin humae11ver.1 die Schwer- und Leichtketten-Aminosäuresequenzen aufweist, wie sie in Seq.-ID Nr. 8 und 9 dargestellt sind, und humae11ver.2–9 die Schwer- und Leichtketten-Aminosäuresequenzen von humae11ver.1 aufweisen und weiters die in Tabelle 5 gezeigten Modifikationen einschließen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist ein Antikörper, der die Schwer- und Leichtketten-Aminosäuresequenzen von humae11ver.1 aufweist, wie sie in Seq.-ID Nr. 8 und 9 dargestellt sind, wobei die besagte Schwerkettensequenz an Position 60 mit Asparagin, an Position 61 mit Prolin und Position 67 mit Isoleucin substituiert ist.
Die differenziell bindenden Polypeptide dieser Erfindung sind zweckdienlich in diagnostischen Verfahren für IgE-Rezeptoren oder in der Therapie von IgE-vermittelten Störungen, wie z. B. Allergien. Sie sind ferner zweckdienlich in der Herstellung von Antikörpern, die zur Bindung von IgE-Regionen fähig sind, die an der Rezeptorbindung teilnehmen.
In einer der Ausführungsformen dieser Erfindung werden Varianten-IgE-Antikörper zur Anwendung in der Diagnose oder zur Therapie oder Prophylaxe von allergischen und anderen IgE-vermittelten Störungen bereitgestellt. In besonderen Ausführungsformen dieser Erfindung werden Anti-IgE-Variantenantikörper bereitgestellt, in denen ein oder mehrere Human-(Rezipienten-)Leichtkettenreste 4, 13, 19, 24, 29, 30, 33, 55, 57, 58, 78, 93, 94 oder 104, oder Schwerkettenreste 24, 37, 48, 49, 54, 57, 60, 61, 63, 65, 67, 69, 78, 82, 97 oder 100 modifiziert worden sind, vorzugsweise durch Substitution mit dem Rest, der an der entsprechenden Position im Donor-(vorzugsweise Maus-)Antikörper auftritt. In bevorzugten Ausführungsformen sind die gewählten Reste die Leichtkettenreste 13, 19, 58, 78 oder 104, oder die Schwerkettenreste 49, 49, 60, 61, 63, 67, 69, 82 oder 82c, und sind insbesondere bevorzugt die Schwerkettenreste 60, 61 oder der Leichtkettenrest 78.
In anderen Ausführungsformen stellen die Erfinder Antikörper bereit, die zur Bindung von FCEL-gebundenem IgE fähig sind, die jedoch im Wesentlichen unfähig sind, FCEH-gebundenes IgE zu binden oder Histaminfreisetzung aus Mastzellen oder Basophilen zu induzieren, umfassend eine Kabat-CDR-Domäne, in die ein positionsanaloger Rest aus einer Kabat-CDR-Domäne der Maus-Anti-huIgE-Antikörper MAE11, MAE13, MAE15 oder MAE17 substituiert worden ist. Ebenso werden hierin bispezifische Antikörper und IgE-monovalente Antikörper bereitgestellt; und humanisierte Antikörper, die eine Affinität für IgE aufweisen, die ungefähr das 0,1- bis 100fache jener von MAE11 beträgt.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 stellt die Sequenz von Human-IgE-Fcε2 und Fcε3 dar (Seq.-ID Nr. 1). Diese spezielle Sequenz stammt aus Padlan et al., Molec. Immun. 23, 1063–1075 (1986). Die Reste sind gemäß Kabat (s. o.) nummeriert. „X"-Reste sind aufgenommen, um die Padlan-IgE-Sequenz dem Kabat-Nummerierungssystem anzugleichen. Sequenzen, die bei der Herstellung verschiedener IgE-Mutanten verändert worden sind, sind unterstrichen; fett gedruckte Zahlen unter den Linien zeigen die Mutantenzahl an. β-Strang-Reste sind überstrichen; Schleifenreste sind durch alle jene Reste definiert, die zwischen zwei β-Strängen liegen.
2 stellt Leicht- und Schwerkettensequenzen für MAE11 (Seq.-ID Nr. 2 und 3), MAE13 (Seq.-ID Nr. 4 und 5) und MAE15 (Seq.-ID Nr. 6 und 7) dar.
3 stellt Schwer- und Leichtkettensequenzen für HuMae11V1 (Seq.-ID Nr. 8 und 9) dar.
4a und 4b stellt die prozentuelle Inhibierung der IgE-Bindung an FCEL- bzw. FCEH-Rezeptoren durch den monoklonalen Maus-Antikörper Mae11 sowie 3 humanisierten Varianten (v1, v8 und v9) dar.
5a–5d vergleichen die Bindung der MAE11-, MAE15- und MAE17-Antikörper an verschiedene huIgE-Varianten dar. MAE1 wird als Kontrolle bereitgestellt, die sowohl an B-Zellen, als auch an Mastzellen-gebundenes IgE bindet. Die Identität der in den Kästchen jeder Figur zusammengestellten Mutanten ist Tabelle 11 dargestellt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die IgE-Analogon-Polypeptide dieser Erfindung enthalten eine Aminosäuresequenz, die zu der eines natürlich auftretenden IgE homolog ist und die Fähigkeit aufweist, spezifisch oder differenziell an FCEL oder FCEH zu binden, jedoch, in unterschiedlichem Ausmaß, nicht an beide. Der Grad an Homologie solcher Polypeptide mit Wildform-IgE ist nicht entscheidend, da nur genug IgE-Sequenz beibehalten werden muss, um dem IgE das differenzielle oder spezifische Binden an einen oder zwei Rezeptoren zu ermöglichen. Im Allgemeinen werden die Polypeptide dieser Erfindung IgE-Fc-Analoga und ungefähr 80% bis 99% homolog zu einer Polypeptidsequenz einer natürlich auftretenden IgE-Schwerketten-Fc-Region sein. Homologie wird mittels herkömmlicher Verfahren ermittelt, in denen alle Substitutionen als nicht homolog (ob konservativ oder nicht konservativ) betrachtet werden und in denen die Sequenzen angeglichen werden, um maximale Homologie zu erzielen.
Es versteht sich, dass die hierin genannten IgE-Fc-Restenummern jene von Kabat sind. Bei der Anwendung der Reste-Lehren dieser Erfindung auf andere IgE-Fc-Domänen ist es notwendig, die gesamte Kandidat-Sequenz mit der Sequenz in 1 zu vergleichen, um die Reste anzugleichen und die Restenummern zu korrelieren. Zusätzlich kann die Identität von gewissen einzelnen Resten an jeder gegebenen Kabat-Stellen-Nummer wegen Interspezies- oder Allel-Divergenz von IgE zu IgE variieren. Wenn zum Beispiel angegeben wird, dass Substitutionen am Rest R383 (Human-IgE) eingeführt werden, versteht sich, dass damit die Einführung einer Substitu tion an derselben Stelle im IgE gemeint ist, obwohl genau diese Stelle (in Schleife AB) an einer anderen Restenummer lokalisiert sein kann oder im Eltern- oder Start-IgE durch einen Rest repräsentiert sein kann, der von dem durch Kabat beschriebenen verschieden ist. Jedoch werden hierin aus Gründen der Klarheit und Einfachheit die Restenummern und Identitäten der Kabat-Human-IgE-Schwerkettensequenzen verwendet. Es sei angemerkt, dass einige Kabat-Reste in der Pedlan-Sequenz deletiert wurden, wobei in diesem Fall das Kabat-Nummerierungssystem durch Insertion eines mit „X" bezeichneten Spacer-Restes (siehe 1) erhalten wird.
Auf ähnliche Weise wird das Kabat-System verwendet, um die bei der Herstellung von Varianten-, z. B. humanisierten Anti-IgE-Immunglobulinen, wie z. B. IgG, IgE, IgA oder IgD verwendeten Immunglobulin-Reste zu bezeichnen. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Rezipienten-Human-Immunglobulin-Stelle gemäß den Kabat-Untergruppen-III-(V_H-)Konsens- und κ-Untergruppen-I(V_L-)Konsens-Sequenzen nummeriert. Um zu ermitteln, welche Donor-Reste diesen Kabat-Konsens-Resten entsprechen, werden die Sequenzen maximal angeglichen, Lücken wie erforderlich eingeführt, wobei die Cystein-Reste der variablen Domäne als hauptsächliche Wegweiser verwendet werden. Es sei angemerkt, dass CDRs von Antikörper zu Antikörper beträchtlich variieren (und per definitionem keine Homologie mit den Kabat-Konsens-Sequenzen aufweisen). Die maximale Angleichung von Gerüst-Resten (insbesondere die Cysteine) erfordert häufig die Einfügung von „Spacer"-Resten in das Nummerierungssystem, die für die F_v-Region des Donor-Antikörpers zu verwenden sind. Zum Beispiel der unten genannte Rest „29a". Dieser stellt einen zusätzlichen Rest dar, der sich in der murinen Donor-Antikörper-V_H1-CDR findet, für den in der Konsens-Sequenz kein Gegenstück existiert, wobei seine Insertion jedoch erforderlich ist, um die maximale Angleichung von Konsens- und Donor-Sequenzen zu erhalten. In der Praxis also wird ein humanisierter Antikörper (ver. 1), der aus diesem Donor hergestellt wird, V_H1 mit Rest 29a enthalten.
Die differenziell bindenden Polypeptide dieser Erfindung enthalten typischerweise ungefähr 5 bis 250 Reste, die homolog zu einer IgE-Schwerketten-F-Region sind, werden jedoch für gewöhnlich ungefähr 10 bis 100 solcher Reste enthalten. Für ge wöhnlich werden die IgE-Fc3- und Fc4-Regionen zugegen sein, wobei die Fc3-Region Reste bereitstellt, die direkt an der Rezeptorbindung beteiligt sind und Fc4 zugegen ist, um die Konformationsintegrität sicherzustellen.
Im Allgemeinen ist das IgE Human-IgE, obgleich IgE aus Tieren, wie z. B. Ratten-, Maus-, Pferde-, Rinder-, Katzen- oder Schweine-IgE eingeschlossen ist. Wie oben angemerkt, wird eine Variation der Reste-Identitäten und Nummern für diese IgEs im Vergleich zur Sequenz in 1 vorhanden sein.
FCEH und FCEL sind als der an Mastzellen oder Basophilen auftretende, hochaffine IgE-Rezeptor (FCεRI, Ishizaka et al., Immunochemistry 7, 687–702 (1973)) bzw. als der niedrigaffine Rezeptor (FCεRII oder CD23) definiert, der an Zellen auftritt, die an der Entzündung beteiligt sind, wie z. B. an Monozyten, Eosinophilen und Blutplättchen, sowie an B-Zellen (Capron et al., Immun. Today 7, 15–18 (1986)). FCEH und FCEL umfassen Allele und vorherbestimmte Aminosäuresequenzvarianten davon, die IgE binden. Obwohl FCEH mehrere Polypeptidketten enthält, muss nur die Bindung von Kandidat-Polypeptiden an dessen Alpha-Kette gemessen werden, da die Alpha-Kette derjenige Teil von FCEH ist, der IgE bindet.
Differenzelle Bindung bedeutet, dass das Polypeptid an eines von FCEL oder FCEH im Ausmaß von zumindest ungefähr 75% desjenigen Ausmaßes bindet, mit dem das homologe, native IgE an diesen Rezeptor bindet, jedoch zu nicht mehr als ungefähr 20% desjenigen Ausmaßes an den anderen Rezeptor bindet, mit dem das homologe IgE an den anderen Rezeptor bindet. Die Bindung wird durch die Tests des Beispiels 3 ermittelt. In diese Erfindung aufgenommen sind Polypeptide, die in einem höheren Ausmaß als natives IgE zur Bindung an einen der beiden Rezeptoren fähig sind.
Varianten-Anti-huIgE-Antikörper
Varianten-Anti-huIgE-Antikörper wurden hergestellt, indem zuerst eine Gruppe monoklonaler Maus-Antikörper erhalten wurde, die zur Bindung an FCEL, nicht jedoch an FCEH fähig waren. 8 solche monoklonalen Maus-Antikörper, bezeichnet als MAE10, MAE11, MAE12, MAE13, MAE14, MAE15, MAE16 und MAE17, wurden durch herkömmliche Verfahren erhalten, die das Immunisieren von Mäusen mit Human-IgE oder einem aus Resten 315–547 von huIgE bestehenden Polypeptid und das Screenen auf Anti-IgE-Aktivität umfassten.
MAE11/15 und MAE13 erkennen unterschiedliche Epitope. Das MAE13-Epitop scheint dreidimensional in Nachbarschaft einer Schlüsselkomponente der FCEH-Bindungsstelle von IgE lokalisiert zu sein (belegt jedoch diese Stelle nicht unmittelbar), da bei hohen MAE13-Konzentrationen eine geringe Menge Histamin freigesetzt wird, was darauf hinweist, dass eine gewisse eingeschränkte, Antikörper-vermittelte Vernetzung von FECH mit MAE13 auftritt. MAE17 war in der Unterdrückung der B-Zellen-IgE-Synthese trotz der Tatsache, dass MAE11 und MAE13 eine höhere IgE-Affinität aufwiesen, höchst effektiv. Dies kann auf seine Fähigkeit zurückgeführt werden, die Komplementfixierung zu vermitteln (er wies ein IgG2a-Isotop auf und enthielt folglich ein zur Auslösung der Effektorfunktion fähiges Fc).
Von MAE11 und MAE15 wird angenommen, dass sie dasselbe IgE-Epitop erkennen. Beide Antikörper hatten bestimmte ungewöhnliche Eigenschaften in ihrer Aminosäuresequenz gemeinsam. Beispielsweise enthielt die CDR1 der Leichtkette von jedem 3 Asparaginsäurereste. CDR3 der Schwerketten von MAE11 und MAE15 enthielten 3 Histidinreste (bzw. enthielten 2 Argininreste).
Antikörper, wie z. B. die vorangehenden, mit den gewünschten IgE-Bindungseigenschaften können weiter modifiziert werden. Solche Modifizierungen fallen in zwei allgemeine Klassen. In der ersten Klasse werden die Antikörper dahingehend modifiziert, dass sie monovalent für IgE sind. Dies bedeutet, dass nur ein „Arm" des Antikörpers, d. h. eine Leicht-Schwerketten-Gabel des Antikörpers zur Bindung von IgE fähig sein soll. Der verbleibende Fv-„Arm" des Antikörpers (oder Arme im Falle von IgM) ist spezifisch für ein zweites (Nicht-IgE-)Antigen, zur Bindung irgendeines Antigens unfähig oder vollständig deletiert. Folglich umfasst der Ausdruck IgE-monovalent polyvalente Antikörper, die für IgE monovalent sind. Die besten Ergebnisse könnten mit der zweiten Alternative erhalten werden, da diese die Struktur des Antikörpers am getreusten erhalten und dem Antikörper möglicherweise die längste zirkulierende Halbwertszeit verleihen würde. IgE-monovalente, für FCEL-gebundenes IgE spezifische Antikörper umfassen im Optimalfall genügende Fc-Domänen der Schwerketten, um zur Komplementbindung und Ausübung von Effektorfunktionen fähig zu sein.
Das zweite Antigen, das von einer der Ausführungsformen des IgE-monovalenten Antikörpers erkannt wird, ist eines, das bei indirekter Vernetzung an FCEL durch den Antikörper hierin keinerlei toxische oder schädliche Reaktion hervorruft, d. h. das zweite Antigen ist nicht FCEH und ist im Allgemeinen eines, das sich im zu behandelnden Tier nicht findet (um unerwünschte Adsorption des Antikörpers an Geweben und Protein innerhalb des Körpers zu vermeiden). Folglich ist das zweite Antigen für gewöhnlich nicht FCEL (kann es aber sein). Jedoch wird das zweite Antigen unter gewissen Umständen ein im zu behandelnden Patienten vorhandenes Protein sein, z. B. wo solche Proteine als Träger oder Depotfreisetzer für die therapeutischen Antikörper hierin dienen sollen.
Solche monovalenten IgE-Antikörper werden durch an sich bekannte Verfahren hergestellt. Beispielsweise wird DNA, die für Anti-IgE-Fv-Schwer- und Leichtketten kodiert, an DNA ligiert, die für das Fc eines Human-Rezipienten-Antikörpers kodiert. Zusätzlich wird DNA bereitgestellt, die für Schwer- und Leichtketten eines Antikörpers kodiert, der zur Bindung eines zweiten Antigens oder nicht identifizierten Antigens fähig ist, oder die für Schwer- und Leichtkette kodiert, bei denen eine ausreichende Zahl von Resten aus den CDRs deletiert ist, so dass Nicht-IgE-Antigen-Bindung nicht länger auftreten kann. Ein herkömmlicher rekombinanter Wirt wird mit allen vier DNAs transformiert und die Produkte gewonnen. Unter Annahme zufälliger Kettenverteilung wird eine Subpopulation von Antikörperprodukten einen Arm mit Anti-IgE-Schwer- und Leichtkette und zumindest einen weiteren Arm mit Spezifität für ein zweites Antigen oder kein Antigen enthalten. Die gewünschte Subpopulation wird dann durch herkömmliche Verfahren gereinigt, z. B. durch Immunaffinitätsadsorption oder mittels Molekularsieb. Diese Antikörper können auch durch Reduktion der ur sprünglichen Antikörper, gefolgt von oxidativen Kettenrekombination hergestellt werden, wie sie vordem bei der Herstellung von monovalenten Antikörpern angewendet worden ist (siehe beispielsweise Glennie et al., Nature 295, 712 (1982)).
Zusätzlich zur IgE-Monovalenz werden die Antikörper in anderen Ausführungsformen dahingehend modifiziert, dass sie einen maximalen Anteil von Humansequenz enthalten (entsprechend der Erhaltung erforderlicher oder erwünschter Aktivität), d. h. sie werden in Chimären umgewandelt oder humanisiert. In beiden Fällen ist die funktionelle Wirkung, die Anti-IgE-Bindungsfähigkeit des Maus- oder eines anderen Donor-Antikörpers in ein Human-Milieu zu platzieren, um ihn so nicht-immunogen wie möglich zu machen. Es sind allgemeine Verfahren zur Herstellung von Chimären und zur Humanisierung von Antikörpern bekannt (wie oben erwähnt). Eine minimale Menge einer nicht-humanen Antikörpersequenz wird in den Rezipienten-Human-Antikörper substituiert. Typischerweise werden nicht-humane Reste in V_H, V_L, V_H-V_L-Schnittstelle oder Gerüst des Rezipienten-Human-Antikörpers substituiert. Im Allgemeinen sind die Kabat-CDRs humanisierter Antikörper zu ungefähr 80% und typischer ungefähr 90% homolog zu nicht-humanen Donor-CDRs. Die V_H-V_L-Schnittstellen- und Gerüst-Reste des humanisierten Antikörpers sind andererseits zu ungefähr 80%, für gewöhnlich ungefähr 90% und vorzugsweise ungefähr 90% homolog zum Rezipienten-Human-Antikörper. Die Homologie wird durch maximale Angleichung identischer Reste ermittelt. Der resultierende Antikörper ist (a) weniger immunogen im Menschen als ein Maus-Antikörper und (b) fähig zur Bindung an FCEL-gebundenes huIgE, jedoch im Wesentlichen unfähig zur Bindung an FCEH-gebundenes huIgE. Solche Antikörper umfassen typischerweise einen Human-Antikörper, der mit einem Aminosäurerest aus einer Complementary-Determining-Region (CDR), VL-VH-Schnittstelle oder einer Gerüst-Region eines nicht-humanen Anti-IgE-Antikörpers substituiert ist, der zur Bindung fähig ist. Eine oder mehrere und vorzugsweise alle der nicht-humanen CDRs L1, L2, L3, H1, H2 oder H3 werden in den Human-Antikörper-Rezipienten substituiert.
Die Charakteristika, die der MAE11-Antikörper innehatte, waren für die therapeutische Anwendung bevorzugt. Da MAE11 an lösliches IgE band, an IgE-tragende B- Zellen band, die IgE-Bindung an niedrig- und hochaffinen IgE-Rezeptor blockierte, die In-vitro-IgE-Produktion inhibierte und nicht an IgE-beschichtete Basophile band, wurde er als Donor-Antikörper für die Humanisierung ausgewählt. Der Rezipienten-Antikörper war Kabat-Human-Kappa-(Leicht-)Untergruppe I und Human-Untergruppe-III-Schwerkette, obwohl es sich versteht, das jeder andere Human-Antikörper in geeigneter Weise verwendet werden kann. Überraschenderweise wurden optimale Ergebnisse nicht einfach durch Substitution der Maus-CDRs anstelle der CDRs in einem Rezipienten-Human-Antikörper erhalten (3; Tabelle 4 unten). Stattdessen war es notwendig, die hydrophoben Donor-Gerüst-Reste, wie z. B. V_H 78, 48, 49, 63, 67, 69; 82 oder 82c, oder V_L 13, 19, 58, 78 oder 104 wiederherzustellen, um ein Ausmaß an Inhibierung der IgE-Bindung zu erzielen, das jenem des Donor-Antikörpers ähnlich war. Da die Funktion dieser Reste die Ausbildung der Konformation von CDRs ist, sind sie im Allgemeinen nicht an der Außenseite des Antikörpers exponiert und daher sollte die Verwendung der murinen Reste keine signifikante Auswirkung auf die Immunogenität haben. Andere Nicht-CDR-Reste, die eine Wirkung auf die Bindung ausüben, umfassten V_H 60, 61, 37, 24 und V_H 50, 52, 58 und 95 (Nicht-CDR nach Cothia, und V_L 4, V_L 33 (Nicht-CDR nach Cothia) und V_L 53 (Nicht-CDR nach Cothia). Die hydrophoben Reste des Human-Gerüsts werden im Allgemeinen mit anderen hydrophoben Resten substituiert (speziell jenen aus dem Donor-Antikörper), wie z. B. Valin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin oder Methionin. Die verbleibenden Nicht-CDR-Reste werden mit irgendeinem anderen Aminosäurerest substituiert, jedoch wiederum bevorzugt der an der analogen Stelle auftretende murine Rest.
Im Allgemeinen wird der Charakter des Anti-IgE-Antikörpers durch Substituieren, Deletieren oder Insertieren eines Restes an oder nahe den V_L-Stellen 30, 30b, 30d, 33, 55, 57, 58, 78, 93, 94 oder 104 (Reste 30, 30a, 30b, 30c, 30d sind unter Bezugnahme auf die Sequenz DYDGD in der Leichtkettensequenz, die in 3 dargestellt ist, genau bestimmt) und/oder des V_H-Reste 24, 37, 48, 49, 54, 57, 60, 61, 63, 65, 67, 69, 78, 82, 82c, 97, 100a oder 100c verbessert.
Die Position V_H-78 wird insbesondere bevorzugt mit Phenylalanin substituiert. Jedoch wird sie auch mit Leucin, Valin, Isoleucin, Methionin, Alanin oder jedem anderen Rest substituiert, der eine Verbesserung der Eigenschaften des Antikörpers bewirkt (siehe unten).
Die Position V_H-60 wird insbesondere bevorzugt mit Asparagin substituiert, obgleich eine Substitution mit Glutamin, Histidin, Lysin, Arginin oder jedem anderen Rest, der die Eigenschaften des Antikörpers verbessert, im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten ist.
Die Position V_H-61 wird insbesondere bevorzugt mit Prolin substituiert, obgleich Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin oder jeder andere Rest, der die Eigenschaften des Antikörpers verbessert, ebenfalls geeignet sind.
CDR-Reste wurden aus dem Donor-MaE11 eingebracht. Diese umfassten vier Inserte in V_L1 30a–30d sowie 91–94 (V_L3), V_H1 27–29, 29a, 31, 33 und 34, V_H2 53–55 und V_H3 97–101. V_L 30, 30b oder 30d sowie V_H 97, 100a oder 100c sind wichtig, um der CDR die Fähigkeit zur Bindung von IgE zu verleihen.
Die V_H-Positionen 97, 100a und 100c in humae11 (humanisierter Mae11) sind alle Histidin und 2 sind Arginin in MaE15. Diese Reste sicht wichtig für die IgE-Bindung. Einer, zwei oder drei von diesen werden durch Substitution mit basischen Resten, insbesondere Lysin oder Arginin, jedoch auch mit Alanin, Glycin, Valin, Isoleucin, Serin, Threonin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin, Methionin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan oder Prolin modifiziert.
Die V_L-Positionen 30, 30b und 30d von humae11 sind für die Bindung von IgE ebenfalls wichtig. In humae11 wird jede dieser Positionen vom sauren Rest Asparaginsäure belegt. Sie werden in anderen Ausführungsformen durch Glutaminsäure substituiert, können jedoch auch mit Alanin, Glycin, Valin, Isoleucin, Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin, Methionin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan oder Prolin substituiert werden. Es liegt im Schutzumfang dieser Erfindung, die Ladungen an den Positionen V_L 30, 30b und 30d mit jenen an V_H 97, 100a und 100c umzukehren, und zwar durch Einsetzen von Asparaginsäureresten in die drei V_H-Stellen (2 im Fall von humanisiertem MaE15) und Histidin in die drei V_L-Stellen.
Reste können auch benachbart den V_H-Positionen 97, 100a, 100c, 61 oder 61, oder V_L-Resten an Positionen 30, 30b, 30d oder 78 insertiert werden. Insertierte Reste werden im Allgemeinen der gleichen Art sein, z. B. würde ein saurer Rest in Nachbarschaft zu V_L-30, 30b oder 30d insertiert werden, während ein basischer Rest in Nachbarschaft zu V_H-97, 100 oder 100c insertiert wird. Die Reste an diesen Stellen können auch deletiert werden.
Humanisierte IgE-monovalente Antikörper sind ebenfalls im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten. In diesem Fall erweitert sich die Humanisierung auch auf den Anti-IgE-Arm, wenn erforderlich, auf den/die verbleibenden Arm(e). Nicht-IgE-bindende Arme können selbstverständlich aus Human-Antikörpern stammen und erfordern in einem solchen Fall keine Humanisierung.
Die vorangegangenen Variationen werden durch Einführung von Mutationen in die DNA, die für die Vorläuferform des Antikörpers kodiert, und Exprimieren der DNA in rekombinanter Zellkultur oder dergleichen bewerkstelligt. Dies wird durch herkömmliche Verfahren ortsgerichteter Mutagenese erzielt. Die Varianten werden dann in an sich bekannten Tests auf die gewünschte Eigenschaft hin gescreent. Im Fall von Anti-huIgE umfasst die gewünschte Eigenschaft die Erhöhung der Antikörperaffinität für huIgE, Erhöhung seiner Kapazität und Spezifität für FCEL-gebundenes IgE, Erhöhung der zur Stimulierung von Histaminfreisetzung aus Mastzellen oder Basophilen erforderlichen Antikörperkonzentration, Herabsetzung der Immunogenität in Menschen und andere Verbesserungen, die dem gewöhnlich Fachkundigen offensichtlich sind. Die Optimierung dieser Eigenschaften erfordert häufig das Abwägen einer Verbesserung gegen eine andere und ist daher eine Ermessenssache und hängt von den durch die beabsichtigte Verwendung des Antikörpers auferlegten Leistungsparametern ab.
Es wird bevorzugt, ein Human-IgG1 (oder einen anderen Komplement-fixierenden Antikörper) als das Rezipienten-Immunglobulin für die Humanisierung zu verwenden, obgleich IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM, IgD oder IgA ebenso als Rezipienten verwendet werden können. Vorzugsweise ist der Rezipient ein Komplement-fixierender IgG-Antikörper oder ein IgG-Antikörper, der zur Teilnahme an ADCC fähig ist.
Therapeutische, diagnostische und präparative Verwendungen
Die Anti-IgE-Antikörper hierin sind nützlich bei der Identifizierung von IgE-Aminosäuresequenzvarianten, in denen die FCEL- oder FCEH-bindenden Domänen modifiziert worden sind. FCEL- oder FCEH-spezifische Kandidat-Polypeptide werden mit diesen Antikörpern inkubiert und Analoga, an die diese Antikörper nicht binden, werden für die weitere Evaluierung, z. B. Ermittlung ihrer FCEH- bzw. FCEL-Rezeptorbindungseigenschaften ausgewählt. Jeder Antikörper, ob aus Maus, Mensch oder einer anderen Tierspezies stammend, oder eine Variante davon, wie z. B. die oben beschriebenen humanisierten Immunglobuline, der die epitopische Spezifität von irgendeinem der Antikörper MAE10–MAE17 (speziell MAE11/15, MAE13 oder MAE17) aufweist, ist gleichermaßen annehmbar. Solche Antikörper können leicht identifiziert werden, und zwar durch Immunisierung eines geeigneten Tieres oder durch Anwendung eines In-vitro-Fv-Selektionssystems, z. B. Phagemid, mit IgE des geeigneten tierischen Ursprungs und Screenen der Tiere oder Produkte auf Antikörper mit der Fähigkeit, mit MAE11/15, 13, 17 oder anderen Antikörpern, die im Wesentlichen dieselbe(n) epitopische(n Stelle(n) wie die hierin beschriebenen binden, um IgE zu konkurrieren. Wie erwähnt sind die Antikörper bei therapeutischer Anwendung wünschenswerterweise monovalent für FCEL-gebundenes IgE. Sie können bivalent und/oder bispezifisch sein, wenn sie verwendet werden, um IgE aus Plasma, Serum oder rekombinanter Zellkultur zu reinigen.
Die Anti-IgE-Antikörper (speziell jene mit herabgesetzter Immunogenität) sind in Therapien für die Behandlung oder Prophylaxe von Allergien zweckdienlich.
Die Antikörper werden typischerweise an einen Patienten verabreicht, von dem bekannt ist, dass er gegen ein Allergen sensibilisiert ist, vorzugsweise vor einer akuten allergischen Reaktion. Dosierungen und Verabreichungsweg hängen von den Zusatzfunktionalitäten, die den Antikörper begleiten (z. B. zytotoxische Agenzien, Immunglobulin-Effektorfunktionen usw.), dem Zustand des Patienten (einschließlich der Population von B-Zellen oder Mastzellen und Basophilen), der Halbwertszeit des Antikörpers, der Affinität des Antikörpers für seinen Rezeptor und anderen, dem Kliniker bekannten Parametern ab. Als allgemeine Richtlinie wird man aus Bluttests die Menge von Target-Zellen bestimmen, die im Patienten zirkulieren und die Menge von Antikörper bestimmen, um endogenes IgE zu verdrängen oder mit IgE wirksam zu konkurrieren, wobei die Population von FCEH-Rezeptoren sowie die Halbwertszeit und Affinität des Antikörpers für IgE berücksichtigt wird.
Therapeutische Polypeptide werden über intravenöse, intrapulmonale, intraperitoneale, subkutane oder andere geeignete Wege verabreicht. Vorzugsweise werden die Polypeptide s. c. (subkutan) oder i. v. (intravenös) über einen Zeitraum von ungefähr 1 bis 14 Tagen wie benötigt verabreicht. Im Falle der Unterdrückung der IgE-Synthese würde man die Menge von Anti-IgE-Antikörper bestimmen, die erforderlich ist, um einen wesentlichen Teil der IgE-sekretierenden B-Zellen-Population zu unterdrücken oder abzutöten. Die Inhibierung oder Unterdrückung der B-Zellen-Population umfasst entweder Herabsetzungen der IgE-Sekretion oder die Verminderung der Gesamtzahl IgE-sekretierender B-Zellen oder beides. Kandidat-Dosierungen können leicht durch die Verwendung von In-vitro-Zellkulturen oder Tiermodellen ermittelt werden.
Die Therapie allergischer Störungen mit Anti-FCEL-gebundenem IgE kann optional mit anderen bekannten Therapien für Allergien erzielt werden. Diese umfassen die Verabreichung von Gamma-Interferon, Allergen-Desensibilisierung, Herabsetzung der Exposition mit Allergen, Behandlung mit Antihistaminen und dergleichen.
BEISPIEL 1
Herstellung monoklonaler Antikörper gegen IgE
Acht monoklonale Antikörper mit der Fähigkeit zur Blockierung der Bindung von IgE an das FCEH wurden verwendet. Diese monoklonalen Antikörper, bezeichnet als MAE10–MAE17, wurden auf folgenden Weise hergestellt. Gereinigtes Human-IgE wurde aus Überständen von U266B1-Zellen (ATCC TIB 196) mittels Affinitätschromatographie an einem vorher isolierten Anti-IgE-Antikörper (Genentech MAE1, obgleich andere Anti-huIgE-Antikörper gleichermaßen zweckdienlich sind) hergestellt. Für MAE12 wurden fünf weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 6 Wochen in ihre Fußsohlen mit 10 μg des gereinigten IgE in Ribi-Adjuvant immunisiert. Nachfolgende Injektionen wurden in derselben Weise eine und drei Wochen nach den anfänglichen Immunisierungen durchgeführt. Drei Tage nach der letzten Injektion wurden die Inguinal- und Popliteallymphknoten entfernt und gepoolt, und eine Einzelzellsuspension hergestellt, indem das Gewebe durch ein Stahlsieb gepresst wurde. Für MAE14, MAE15 und MAE13 wurden die Immunisierungen in ähnlicher Weise durchgeführt mit der Ausnahme, dass für MAE13 30 μg IgE je Injektion verwendet wurden und IgE 315–547 als Perfusions-Boost verwendet wurde; für MAE10 und MAE11 wurden Injektionen subkutan in zwei Dosen von 100 μg und einem letzten Boost von 50 μg verabreicht, und Milzzellen wurden verwendet, und Milzzellen wurden für die Fusionen verwendet. Die Zellen wurden in einem Verhältnis von 4:1 mit Mausmyelom P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580) in glucosereichem Medium (DMEM), das 50% w/v Polyethylenglykol 4000 enthielt, fusioniert.
Fusionierte Zellen wurden in einer Dichte von 2 × 10⁵ je Napf in 96-Napf-Gewebekulturplatten ausplattiert. Nach 24 Stunden wurde selektives HAT-Medium (Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin, Sigma Chemical Company, Nr. H0262) zugesetzt. Von 1440 ausplattierten Näpfen enthielten 365 wachsende Zellen nach der HAT-Selektion.
Fünfzehn Tage nach der Fusion wurden Überstände unter Anwendung eines Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) auf die Anwesenheit von Human-IgE- spezifischen Antikörpern getestet. Der ELISA wurde wie folgt durchgeführt, wobei alle Inkubationen bei Raumtemperatur erfolgten. Testplatten (Nunc Immunoplate) wurden für 2 Stunden mit Ratten-Anti-Maus-IgG (Boehringer Mannheim, Nr. 605-500) bei 1 μg/ml in 50 mM Natriumcarbonatpuffer, pH 9,6 beschichtet, dann mit 0,5% Rinderserumalbumin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 30 Minuten geblockt, dann vier Mal mit 0,05% Tween 20 enthaltendem PBS (PEST) gewaschen. Testüberstände wurden zugesetzt und zwei Stunden unter Schütteln inkubiert, dann vier Mal mit PEST gewaschen. Human-IgE (gereinigt aus U266-Zellen wie oben beschrieben) wurde mit 0,5 μg/ml zugesetzt und für eine Stunde unter Schütteln inkubiert, dann vier Mal in PEST gewaschen. Meerrettich-Peroxidase-konjugiertes Ziege-Anti-Human-IgE (Kirkegaard und Perry Labs, Nr. 14-10-04, 0,5 mg/ml) wurde in einer Verdünnung von 1:2.500 zugesetzt und für eine Stunde inkubiert, dann vier Mal mit PEST gewaschen. Die Platten wurden entwickelt, indem 100 μl/Napf einer Lösung, die 10 mg o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid (Sigma Chemical Company, Nr. p8287) und 10 μl einer 30%igen Wasserstoffperoxidlösung in 25 ml Phosphat-Citratpuffer, pH 5,0 enthielt, zugegeben und für 15 Minuten inkubiert wurde. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl/Napf 2,5 M Schwefelsäure gestoppt. Die Daten wurden durch Lesen der Platten in einem automatischen ELISA-Plattenlesegerät bei einer Absorption von 490 nm erhalten. Für MAE12 wurden 365 Überstände getestet und 100 waren spezifisch für Human-IgE. Ähnliche Häufigkeiten der IgE-Spezifität wurden erhalten, wenn auf die anderen Antikörper gescreent wurde. Alle der hierin beschriebenen monoklonalen Antikörper waren von IgG1-Isotyp mit Ausnahme von MAE17, der ein IgG2b war, und MAE14, der ein IgG2a war.
Jeder der IgE-spezifischen Antikörper wurde in Tests auf Zellen-Basis und Plattentests weiter getestet, um auf Antikörper zu selektieren, die an IgE in der Weise banden, dass sie die IgE-Bindung an FECH inhibierten und die zur Bindung an FCEH-gebundenes IgE unfähig sind. Die Ergebnisse dieser Tests sind unten in Tabelle 1a und Tabelle 1b dargestellt.
1. FACS-basierende Tests zur Analyse von monoklonalen Maus-Anti-Human-IgE-Antikörpern.
Screening der Bindung von monoklonalem Maus-Anti-Human-IgE-Antikörper an IgE an CHO 3D10 (FcERI Alpha+).

a. CHO 3D10-Zellen (FcERI-Alphakette-stabiler Transfektant; Hakimi et al., J. Biol. Chem. 265, 22079) mit 5 × 10⁵ Zellen je Probe werden mit U266 IgE-Standard (Chargen-Nr. 13068-46) bei 10 μg/ml in 100 μl FACS-Puffer (0,1% BSA, 10 mM Natriumazid in PBS, pH 7,4) für 30 Minuten bei 4°C inkubiert, gefolgt von einem Waschvorgang mit FACS-Puffer. Das Ausmaß der IgE-Bindung wird durch Inkubieren eines Aliquots von IgE-beladenen Zellen mit einem polyklonalen, FITC-konjugierten Kaninchen-Anti-Human-IgG (Accurate Chem. Co. AXL-475F, Chargen-Nr. 16) bei 50 μg/ml für 30 Minuten bei 4°C, gefolgt von drei Waschvorgängen mit FACS-Puffer ermittelt.
b. IgE-beladene Zellen werden mit 100 μl Maus-Anti-Human-IgE-Hybridom-Überstand (Maus-IgG-Konzentration im bereich von 1 bis 20 μg/ml) für 30 Minuten bei 4°C inkubiert, gefolgt von einem Waschvorgang mit FACS-Puffer. Ein monoklonaler Anti-Human-IgE-Antikörper (MAE1) von Genentech mit 10 μg/ml wird als positive Bindungskontrolle verwendet. Der monoklonale Antiköper von Genentech (MAD 6P), der IgE nicht erkennt, wird bei 10 μg/ml als negative Kontrolle verwendet.
c. Die Bindung der monoklonalen Antikörper an Human-IgE an CHO-Zellen wird detektiert durch Inkubieren von Zellen mit 20 μg/ml FITC-konjugiertem, F(ab)2-affinitätsgereinigtem Ziege-Anti-Maus-IgG (Organon Teknica Kat.-Nr. 10711-0081) für 30 Minuten bei 4°C, gefolgt von drei Waschvorgängen mit FACS-Puffer. Die Zellen werden 400 μl Puffer zugegeben, der 2 μg/ml Propidiumiodid (Sigma Kat.-Nr. P4170) enthält, um abgestorbene Zellen zu färben.
d. Zellen werden an einem FACSCAN-Durchflusszytometer von Becton Dickinson analysiert. Vorwärts-Lichtstreuungs- und 90-Grad-Seitenstreuungs-Gates werden eingestellt, um eine homogene Population von Zellen zu analysieren. Abge storbene Zellen, die sich mit Propidiumiodid anfärben, werden von der Analyse ausgeschlossen. Hybridom-Überstände, die IgE an CHO-3D10-Zellen nicht binden, wurden als Kandidaten für weiteres Screening betrachtet.

2. Histamin-Freisetzung aus Peripherblut-Basophilen.
Heparinisiertes Blut wurde aus normalen Spendern erhalten und 1:4 in einem modifizierten Tyrodes-Puffer (25 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, MgCl₂, 0,3 mg/ml HSA, pH 7,35) verdünnt, dann mit 1 nM Human-IgE (ND) bei 4°C für 60 Minuten inkubiert. Zellen wurden dann dem Tyrodes-Puffer zugesetzt, der entweder die monoklonalen Maus-Anti-IgE-Antikörper (10 mg/ml) oder ein polyklonales Anti-Human-Antiserum als positive Kontrolle enthielt, und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden pelletiert, das Histamin in Überständen acetyliert und der Histamingehalt unter Verwendung eines RIA-Sets (AMAC Inc., Wesbrook, Main) bestimmt. Gesamthistamin wurde aus Zellen bestimmt, die mehreren Einfrier- und Auftau-Zyklen unterworfen worden waren. Die prozentuelle Histaminfreisetzung wurde als nM Histamingehalt im Überstand – nM spontan freigesetztes Histamin dividiert durch nM Gesamthistamin in der Probe berechnet.
3. Blockierung der FITC-konjugierten IgE-Bindung an die FcERI-Alpha-Kette.
Die Wirkung der Antikörper auf die IgE-Bindung wurde untersucht, indem FITC-markiertes IgE mit verschiedenen Mae-Antikörpern bei 37°C für 30 Minuten in PBS, das 0,1% BSA und 10 mM Natriumazid, pH 7,4 enthielt, vorinkubiert und der Komplex dann mit 5 × 10⁵ 3D10-Zellen bei 4°C für 30 Minuten inkubiert wurde. Die Zellen wurden dann drei Mal gewaschen und die mittlere ?Kanal-Fluoreszenz bei 475 nM gemessen. Ein Maus-Anti-Human-IgE-mAb (Mae1), der die IgE-Bindung an die FcERI-Alpha-Kette nicht blockiert, wurde als Kontrolle verwendet.
4. Analyse der Maus-Anti-Human-IgE-Bindung an die Membran-IgE-positive B-Zelle U266

a. U266 B1-Zellen (Membran-IgE +) wurden in Basalmedium kultiviert, das mit 15% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (Hyclone Kat.-Nr. A-1111-L), Penicillin, Streptomycin (100 Units/ml) und L-Glutamin (2 mM) ergänzt war.
b. Zellen (5 × 10⁵/Aliquot) werden in 100 μl FACS-Puffer, der monoklonale Maus-Anti-Human-IgE-Antikörper zu 10, 5, 1 0,5 und 0,1 μg/ml enthält, für 30 Minuten auf Eis in 96-Napf-Rundboden-Mikrotiterplatten inkubiert, gefolgt von zwei Waschvorgängen mit FACS-Puffer. Der monoklonale Antikörper MAE1 von Genentech wurde als positive Kontrolle verwendet.
c. Zellen werden in 100 μl FACS-Puffer, der 50 μg/ml (1:20-Stammlösung) FITC-konjugiertes, F(ab')-2-affinitätsgereinigtes Ziege-Anti-Maus-IgG (Organon Teknika Kat.-Nr. 1711-0084) enthält, für 30 Minuten auf Eis inkubiert, gefolgt von drei Waschvorgängen mit FACS-Puffer. Die Zellen werden 400 μl FACS-Puffer zugegeben, der 2 μg/ml Propidiumiodid enthält, um abgestorbene Zellen anzufärben.

5. FACS-basierende Bindungstests an FcERII-(C23+-)B-Zelle IM9

a. FACS-Analyse der IgE-Bindung an FcERII-(CD23-)(+)-B-Zelllinie IM9. Das IM9-Human-B-Zellen-Myelom ATCC CCL 159 (Ann. N. Y. Acad. Sci. 190, 221–234 (1972)) wurde in GIF-Basalmedium mit 10% hitzeinaktiviertem, fötalem Kälberserum, Penicillin, Streptomycin (100 Units/ml) und L-Glutamin (2 mM) gehalten.
b. Zellen (5 × 10⁵ Aliquot) wurden in 100 ml FACS-Puffer, der 2 μg/ml U266-IgE-Standard enthielt, für 30 Minuten bei 4°C in 96-Napf-Mikrotiterplatten inkubiert, gefolgt von 2 Waschvorgängen mit FACS-Puffer. Als Kontrolle wurden Zellen in Puffer alleine oder in Puffer inkubiert, der 2 μg/ml Human-IgG1 (Behring Diagnostics Kat.-Nr. 400112, Chargen-Nr. 801024) enthielt.
c. Zellen wurden dann mit monoklonalen Maus-Anti-Human-IgE-Antikörpern bei 0,1 bis 10 μg/ml für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Der monoklonale Antikörper MAE1 von Genentech wurde als positive Kontrolle verwendet.
d. Zellen wurden in 100 μl FACS-Puffer, der 50 μg/ml FITC-konjugiertes F(ab')2-Ziege-Anti-Maus-IgG (Organon Teknika Kat.-Nr. 1711-0084) enthielt, für 30 Minuten bei 4°C inkubiert, gefolgt von 3 Waschvorgängen mit FACS-Puffer.
e. Zellen wurden 400 μl Puffer zugegeben, der 2 μg/ml Propidiumiodid enthielt, um abgestorbene Zellen anzufärben.
f. Zellen wurden an einem FACSCAN-Durchflusszytometer von Becton Dickinson analysiert. Vorwärts-Lichtstreuungs- und 90-Grad-Seitenstreuungs-Gates wurden eingestellt, um eine homogene Population von Zellen zu analysieren und abgestorbene Zellen, die sich mit Propidiumiodid anfärbten, wurden von der Analyse ausgeschlossen. FITC-positive Zellen (IgE-Bindung) wurden in Bezug auf Zellen analysiert, die mit FITC-Kaninchen-Anti-Human-IgE alleine gefärbt waren.
g. Als positive Kontrolle zur Ermittlung des CD23-Levels an der Oberfläche von IM9-Zellen wurde in jedem Experiment ein Aliquot von Zellen mit monoklonalem Maus-Leu 20-Antikörper (Anti-CD23) von Becton Dickinson bei 10 μg/ml für 30 Minuten bei 4°C gefärbt, gefolgt von 2 Waschvorgängen. Die Zellen wurden dann mit FITC-konjugiertem, f(ab')-2-affinitätsgereinigtem Ziege-Anti-Maus-IgG bei 50 μg/ml inkubiert.

6. Antikörper-Blockierung der FITC-konjugierten IgE-Bindung an den niedrigaffinen IgE-Rezeptor.
Die Bindung von 40 nM FITC-markiertem IgE an den niedrigaffinen IgE-Rezeptor (CD23), exprimiert an der B-Lymphoblastenzelle IM-9 wurde mittels Durchflusszytometrie an einem FACSCAN-Durchflusszytometer analysiert. Die Wirkung der Antikörper auf die FITC-IgE-Bindung wurde untersucht, indem FITC-IgE mit den Maus- Anti-Human-Antikörpern bei 0,1 bis 10 μg/ml vorinkubiert, bei 37°C für 30 Minuten in 0,1% BSA und 10 mM Natriumazid, pH 7,4 enthaltendem PBS ?chimärisiert und der Komplex mit 5 × 10⁵ Zellen bei 4°C für 30 Minuten inkubiert wurde. Die Zellen wurden dann drei Mal gewaschen und die mittlere Kanal-Fluoreszenz bei 475 nM gemessen.
7. IgE-In-vitro-Testprotokoll

a. Einkernige Peripherblut-Zellen wurden aus normalen Spendern getrennt.
b. Zellen wurden gründlich mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, um so viele Blutplättchen wie möglich zu entfernen.
c. Einkernige Zellen wurden gezählt und mit 1 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. (Medien = DMEM + Pen/Strep + 15% Pferdeserum + IL-2 (25 U/ml) + IL-4 (20 ng/ml)).
d. Antikörper wurden in geeigneten Konzentrationen am Tag 0, 5 und 8 zugesetzt.
e. Kulturen wurden in 24-Napf-Falcon-Gewebekulturplatten für 14 Tage inkubiert.
f. Am Tag 14 wurden Überstände entfernt und mittels einem IgE-spezifischen ELISA-Protokoll auf IgE-Konzentrationen hin getestet.

8. Die Affinitätskonstante (kd) von Maus-mAb für Human-IgE wurde durch Gleichgewichtsbindung (Scatchard-Analyse) wie folgt ermittelt:

a. IgE-(ND- und PS-)Allotypen wurden mit dem Chloramin-T-Verfahren iodiert und mit einer PD10 Sephadex-G25-Säule (Pharmacia Kat.-Nr. 17-0851-01) in RIA-Puffer:PBS, 0,5% Rinderserumalbumin (Sigma Kat.-Nr. A-7888), 0,05% Tween 20 (Sigma Kat.-Nr. P-1379), 0,01% Thimerosal (Sigma Kat.-Nr. T-5125), pH 7,4 von freiem ¹²⁵I Na getrennt. Ungefähr 78–95% der Strahlung nach der Säule wurden mit 50% Trichloressigsäure präzipitiert und die spezifische Aktivität der iodinierten IgE- Präparate lag im Bereich von 1,6 bis 13 μCi/μg unter Annahme einer Zähleffizienz von 70%.
b. Eine festgesetzte Konzentration von ¹²⁵I-IgE (ungefähr 5 × 10⁴ cpm) wurde variierenden Konzentrationen von unmarkiertem IgE (1 bis 200 nM) in einem Endvolumen von 0,1 ml RIA-Puffer in 12 × 75 mm Polypropylenröhrchen zugesetzt. Maus-Anti-Human-IgE-mAbs (20 nM Endkonzentration) in 0,1 ml RIA-Puffer wurden dann für ein End-Testvolumen von 0,2 ml zugesetzt.
c. Proben wurden 16–18 Stunden bei 25°C unter stetigem Rühren inkubiert.
d. Gebundenes und freies ¹²⁵I-IgE wurden durch Zugabe eines 0,3 ml-Gemisches von affinitätsgereinigtem Ziege-Anti-Maus-IgE (Boehringer Mannheim Kat.-Nr. 605 208), gekoppelt an CNBr-aktivierte Sepharose 4B (Kat.-Nr. 17-0430-01) und Träger-Protein A-Sepharose (Repligen Kat.-Nr. IPA 300) in RIA-Puffer getrennt und 1 bis 2 Stunden bei 25°C unter stetigem Rühren inkubiert. RIA-Puffer (1 ml) wurde dann zugesetzt und die Röhrchen 5 Minuten bei 400 × g zentrifugiert. Die Proben wurden gezählt, um die Gesamtaktivität zu ermitteln. Die Überstände wurden mit einer fein ausgezogenen Pasteurpipette abgesaugt, Proben nochmals gezählt und die gebundenen versus freien Zählwerten berechnet.
e. Die Scatchard-Analyse wurde unter Anwendung eines Fortran-Programms (Scanplot) auf Basis des von P. Munson am NIH geschriebenen Liganden-Programms durchgeführt. Scanplot verwendet eine Massenwirkungs-Gleichungsanpassung von "Gebunden" als Funktion von "Gesamt" unter Anwendung der Rodbard-Regressionsanalyse.

BEISPIEL 2
Herstellung von Varianten-IgE
Auf Basis des IgE-Fc-Modells von Padlan und Davies (Mol. Immunol. 23, 1063 (1986)), das auf der Kristallstruktur von Human-IgG1-Fc basiert (Deisenhofer, Bio chem. 20, 2361–2370 (1981)), wurde eine Reihe von Mutanten konstruiert, die verwendet werden könnten, um die Bindung von Human-IgE an seine Rezeptoren zu testen. Diese Mutanten werden als Emut 1–13 bezeichnet und sind unten in Tabelle 2 aufgezählt. Die Fcε3-Domäne besteht aus sieben β-Strängen, die eine β-Faltblattstruktur bilden, die für alle Immunglobulindomänen charakteristisch ist; es gibt sechs Schleifen, die diese sieben β-Stränge verbinden. Die Erfinder beziehen diese Schleifen auf die 2 β-Stränge, die sie verbinden, z. B. verbindet die Schleife AB die β-Stränge A und B. Die Erfinder haben Mutanten von Human-IgE konstruiert, in denen sie fünf der Fcε3-Domänen-Schleifen mit ihren Gegenstücken aus Human-IgG1 substituiert haben (Tabelle 2, 1–5). Die sechste Schleife enthält die Glykosylierungsstelle im IgE sowie IgG und wurde daher nicht verändert. Eine der Mutanten (Tabelle 2, 6) wurde durch Austauschen von Human-Fcε3-β-Strang D gegen sein Human-IgG1-Fcgamma2-Gegenstück hergestellt. Sieben zusätzliche Mutanten (Tabelle 2, 7–13) bestanden aus der Substitution von Ala-Resten in die Fcε3-β-Stränge und eine Schleife in Fcε2.
Ein Human-IgE-Gen wurde aus U266, einer öffentlich zugänglichen Zelllinie kloniert. Das Gen wurde in einen früher beschriebenen Phagemid-Vektor kloniert, der den Human-Cytomegalovirus-Enhancer und Promotor, ein 5'-Intron und das sv40-Polyadenylierungssignal enthält (Gorman et al., DNA and Prot. Eng. Techn. 2, 3–10 (1990)). Die Mutagenese wurde mit dem Kunkel-Verfahren (T. A. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488–492 (1985)) unter Verwendung von Puffern und Enzymen durchgeführt, die mit dem Muta-gene-Phagemid In-vitro-Mutagenese-Set von BioRad bereitgestellt werden, gemeinsam mit Oligonucleotiden, die für die unten in Tabelle 2 gezeigten Human-IgG1-Sequenzen kodieren. Die Sequenzen der mutierten IgE-DNAs wurden nur an der Mutationsstelle unter Anwendung der ³⁵S-Didesoxy-Sequenzierung überprüft. TABELLE 2

¹ Schleife = 1 B-Strang = β
² Sequenzen in eckigen Klammern stammen von Mutanten, in denen Alaninreste und nicht IgG-Sequenzen verwendet wurden, um die IgE-Target-Sequenz zu ersetzen. Reste in runden Klammern wurden in diesen Mutanten nicht verändert.

Die mutierten IgEs wurden in Human-Urnieren-293-Zellen vorübergehend exprimiert (Gorman et al., s. o.), an einer Maus-Anti-Human-IgE-Antikörper-Affinitätssäule gereinigt und Proben mittels SDS-PAGE analysiert, um sicherzustellen, dass die mutierten Proteine das richtige Molekulargewicht aufwiesen.
BEISPIEL 3
Löslicher FCEH-Bindungstest
Dieser Test ist ein Zweiphasen-Inhibierungs-ELISA, der ausschließlich die Bindung an das FCEH misst. In diesem Test werden ELISA-Platten mit einem monoklonalen Antikörper gegen FCEH in einer Konzentration von 1 μg/ml in 50 mM Natriumcarbonat, pH 9,6 für zwei Stunden bei Raumtemperatur beschichtet und für zwei Stunden mit 0,5% Rinderserumalbumin enthaltendem PBS geblockt, dann drei Mal mit ELISA-Waschpuffer gewaschen. Mutanten-IgE-Proben werden dann den Näpfen zugesetzt und für eine bis zwei Stunden inkubiert. Das überschüssige Mutanten-IgE wird durch Absaugen entfernt und dann wird biotinyliertes IgE mit 50 ng/ml für 15 Minuten zugesetzt, gefolgt von fünf Waschvorgängen mit ELISA-Waschpuffer. An Meerrettich-Peroxidase konjugiertes Streptavidin (Sigma Chemical Company Nr. S5512) wurde in einer Verdünnung von 1:500 für 15 Minuten zugesetzt, dann drei Mal mit ELISA-Waschpuffer gewaschen. Die Farbentwicklung erfolgte mit einem Tetramethylbenzidin-Peroxidase-Substratsystem (Kirkegaard & Perry Labs Nr. 50-76-00, Chargen-Nr. NA 18) für sieben Minuten bei 25°C. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 M HCl gestoppt. Die Fähigkeit der IgE-Mutante, an FCEH zu binden, wird durch das Ausmaß ermittelt, in dem die Bindung des biotinylierten IgE verhindert wird. Dieser Test wurde kreiert, um auf etwaige FCEH-Bindung durch das Mutanten-IgE zu testen, und ist nicht als Bestimmung der Affinität der Mutante für FCEH bezüglich nativem IgE anzusehen.
FACS-basierte Bindungstests für U266-IgE-Mutanten
Gewebekulturüberstände aus mit U266-IgE-cDNA transfektierten 293s-Zellen wurden entweder 48 oder 96 Stunden nach der Transfektion geerntet. Gewebekulturüberstände wurden mit Amicon Centriprep 30^®-Zentrifugalkonzentratoren (30.000 MW-Cutoff) 5fach konzentriert. Die konzentrierten Überstände wurden über eine Affinitätssäule mit monoklonalem Maus-Anti-U266-IgE (Genentech MAE1 gekoppelt an CNBr-Sepharose) geschickt. U266-IgE wurde mit 3,0 M Kaliumcyanat in 50 mM Trispuffer, pH 7,8 eluiert. Protein enthaltende (bestimmt durch O. D. 280 nm) Elu atfraktionen wurden gepoolt und in Amicon Centricon 30^®-Konzentratoren gegeben. Der Eluatpuffer wurde gegen PBS ausgetauscht, indem mehrmals PBS durch den Konzentrator filtriert wurde. Das Endvolumen des affinitätsgereinigten Überstands lag im Bereich von 0,5 bis 1 ml. Die strukturelle Intaktheit der rekombinanten IgE-Mutanten wurde an 1–12%igen SDS-PAGE-Gelen analysiert und mit U266-IgE-Standard verglichen, der aus der U266-Zelllinie erhalten wurde. Die Mutanten wurden auch auf ihre Fähigkeit hin analysiert, an eine Reihe von monoklonalen und IgE-Antikörpern zu binden, um die richtige Faltung und strukturelle Übereinstimmung mit nativem IgE weiter zu ermitteln. Die Konzentration von immunreaktivem IgE für jede IgE-Mutante wurde mit einem Human-IgE-Capture-ELISA wie folgt bestimmt. Nunc-Immunoplate-Maxisorp^®-Platten (Nunc Nr. 4-39451) wurden über Nacht bei 4°C mit einem Maus-IgG1-Anti-U266-IgE (MAE1) von Genentech bei 1 μg/ml in Beschichtungspuffer (50 mM Natriumcarbonatpuffer, pH 9,6) beschichtet. Der Beschichtungsantikörper wurde durch drei Waschvorgänge mit ELISA-Waschpuffer (0,05% Tween 20 (US Biochemical Corporation Nr. 20605) in PBS) entfernt. Unspezifische Stellen wurden mit ELISA-Verdünnungspuffer (50 mM Tris-gepufferte Kochsalzlösung, enthaltend 0,5% BSA (Sigma Chemical Company Nr. A-7888), 0,05% Tween 20 und 2 mM EDTA) für zwei Stunden bei 25°C auf einem Kreisschüttler geblockt. Der Verdünnungspuffer wurde durch dreimaliges Waschen mit ELISA-Verdünnungspuffer entfernt. Zweifach-Reihenverdünnungen der IgE-Mutanten in ELISA-Verdünnungspuffer wurden der Platte zugesetzt. 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,3 und 15,6 ng/ml U266-IgE-Standard (Charge 13068-46) wurde in zweifacher Ausführung als Standard zugesetzt. Proben und Standard wurden für zwei Stunden bei 25°C inkubiert, gefolgt von dreimaligem Waschen mit ELISA-Waschpuffer. IgE wurde mit HRP-konjugiertem Schaf-Anti-Human-IgE (ICN Nr. N060-050-1) 1:8000 in ELISA-Verdünnungspuffer für 90 Minuten bei 25°C detektiert, gefolgt von 3 Mal Waschen mit ELISA-Waschpuffer. Das HRP-Konjugat wurde mit einem Tetramethylbenzidin-Peroxidase-Substratsystem (Kirkegaard & Perry Labs Nr. 50-76-00, Chargen-Nr. NA 18) für 7 Minuten bei 25°C entwickelt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 M HCl gestoppt. Das Reaktionsprodukt wurde mit einem Zweiwellenlängen-Spektralphotometer bei 450 nm abzüglich der Absorption bei 570 nm analysiert. Die U266-IgE-Standards wurden verwendet, um eine Standardkurve zu erzeugen und die IgE-Konzentrationen der Probe wurden durch nicht-parametrische, lineare Regressionsanalyse extrapoliert.
FcERI-Alpha(+)-CHO-3D10-(FCEH exprimierende) und FcERII-(CD23)-(+)-IM9-(FCEL exprimierende)B-Zelllinien wurden für die Bindungstests verwendet. Der stabil transfektierte CHO-(duk-)Zellklon 3D10 (JBC 265, 22079–22081 (1990)) wurde in Iscove-modifizierten Dulbecco-Medien gehalten, die mit 10% hitzeinaktiviertem, fötalem Kälberserum, 80 μg/ml Gentamycinsulfat und 5 × 10^–7 M Methotrexat ergänzt waren. Das IM9-Human-B-Zellen-Myelom ATCC CCL 159. (Ann. N. Y. Acad. Sci. 190, 221–234 (1972)) wurde in GIF-Basalmedium mit 10% hitzeinaktiviertem, fötalem Kälberserum, Penicillin, Streptomycin (100 Units/ml) und L-Glutamin (2 mM) gehalten. Als positive zur Ermittlung des CD23-Levels an der Oberfläche von IM9-Zellen wurde in jedem Experiment ein Aliquot von Zellen mit monoklonalem Maus-Leu 20-Antikörper (Anti-CD23) von Becton Dickinson bei 10 μg/ml für 30 Minuten bei 4°C gefärbt, gefolgt von 2 Waschvorgängen in FACS-Puffer. Die Zellen wurden dann mit FITC-konjugiertem, F(ab')-2-affinitätsgereinigtem Ziege-Anti-Maus-IgG bei 5 μg/ml inkubiert. Anhaftende Zellen wurden durch Inkubation mit 10 mM EDTA in PBS für 2 Minuten bei 37°C von den Gewebekulturplatten entfernt. Die Zellen wurden gezählt, dann in FACS-Puffer (0,1% BSA, 10 mM Na-Azid in PBS, pH 7,4) in einer Konzentration von 5 × 10⁶/ml resuspendiert. CHO3D10- und IM9-Zellen (5 × 10⁵/Aliquot) wurden für 30 Minuten bei 4°C in 96-Napf-Mikrotiterplatten in 100 μl FACS-Puffer inkubiert, der U266-IgE-Standard oder IgE-Mutanten mit 2 μg/ml enthielt, gefolgt von zweimaligem Waschen mit FACS-Puffer. Als Kontrolle wurden Zellen mit Puffer alleine oder 2 μg/ml Human-IgG1 (Behring Diagnostics Nr. 400112, Chargen-Nr. 801024) enthaltendem Puffer inkubiert. Die Zellen wurden dann in 100 μl FACS-Puffer, der FITC-konjugiertes Kaninchen-Anti-Human-IgE bei 20 μg/ml (Accurate Chem. Co. Nr. AXL 475F, Chargen-Nr. 040A) enthielt, für 30 Minuten bei 4°C inkubiert, gefolgt von 3-maligem Waschen mit FACS-Puffer. 400 μl Puffer, der 2 μg/ml Propidiumiodid enthielt, wurde der Zellsuspension zugesetzt, um abgestorbene Zellen anzufärben. Die Zellen wurden an einem FACSCAN-Durchflusszytometer von Becton Dickinson analysiert. Vorwärts-Lichtstreuungs- und 90-Grad-Seitenstreuungs-Gates wurden eingestellt, um eine homogene Population von Zellen zu analysieren und abgestorbene Zellen, die sich mit Propidiumiodid anfärbten, wurden von der Analyse ausgeschlossen. FITC-positive Zellen (IgE-Bindung) wurden im Vergleich mit Zellen analysiert, die mit FITC-Kaninchen-Anti-H-IgE alleine gefärbt worden waren.

Die vorangehenden Tests wurden verwendet, um die Fähigkeit von IgE-Analoga des Beispiels 2 zu ermitteln, an FCEH und FCEL zu binden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. TABELLE 3 Bindung von IgE und IgE-Analoga an FCEH und FCEL

Probe/Mutante	Konz. (μg/ml)	FCEH-Alpha % CHO 3D10 (+)	FCEL (CD23) % IM9 (+)
U266 IgE	10	90,3	92,5
U266 IgE	5	89,9	82,6
U266 IgE	0,5	59,6	4,6
U266 IgE	0,1	15,8	1,7
1	1,65¹	1,7	4,3
2	1,65	34,3	48,9
3	1,65	32,3	1,2
4	1,65	4,9	9,2
5	1,65	60,5	73,9
6	1,65	1,4	71,6
7	1,65	76,4	4,6
8	1,65	70,3	16,3
9	1,65	84,2	94,3
10	1,65	67,5	84,8
11	1,65	70,8	61,5
12	1,65	84,7	90,3
13	1,65	85,7	96,1
dh 184 (+)	1,65	83,8	21,1
PA13² (Kontrolle)	10	1,3

¹ Werte basierend auf quantitativem ELISA. U266 wurde als Standard und monoklonaler Maus-Anti-F_c-Antikörper als Fänger verwendet.
² Ein CDR-gepfropftes Human-IgG.

Drei mutierte IgEs zeigten einen vollständigen Verlust der Bindung an den FCEH-Rezeptor: Mutanten 1, 4, und 6. Mutante 6 veränderte β-Strang D am Ende von Fcε3 nahe der Fcε2-Domäne. Mutanten 1 und 4 umfassten die Veränderung von zwei Fcε3-Schleifen, die benachbart sind und sich nahe der Fcε4-Domäne befinden. Man beachte, dass Mutante 7 eine Untermenge der Mutante 1 ist, in der die drei C-terminalen Reste von Schleife AB zu Alanin geändert worden sind (Tabelle 2, 1 versus 7). Jedoch beeinflusst Mutante 7 nicht die Bindung an FCEH. Die Erfinder interpretieren dies dahingehend, dass entweder 1) FcεRI zumindest einen der IgE-Reste 377–381 bindet oder 2) der zusätzliche Rest in der durch IgE-Schleife AB (8 Reste) substituierten IgG1-Schleife AB (9 Reste) die Deformation einer der benachbarten Bindungsdeterminanten, möglicherweise Schleife EF bewirkte. Dass Mutanten 8 und 10 keine Auswirkung auf die FcεRI-Bindung hatten, bedeutet höchstwahrscheinlich, dass der FCEH-Rezeptor nicht in den Hohlraum hineinragt, der durch Schleife AB und β-Strang D begrenzt wird.
Obwohl Mutante A ein Gly444 ersetzendes Leu aufwies (Tabelle 2), sollte dies die Konformation der Schleife EF nicht beeinflussen. Rest 444 liegt vor dem N-Terminus dieser α-Helix. Zusätzlich weist Maus-IgE ein Val an Position 444 auf und Ratten-IgE weist ein Asp auf. Die beiden verborgenen hydrophoben Reste in der Mitte der α-Helix, W448 und 1449 werden in der substituierten IgG1-Schleife beibehalten (W448, L449), sowie auch G541, das die α-Helix terminierte. Folglich sollte die Konformation der Schleife EF in IgE und IgG1 ähnlich sein.
Mutanten 2 und 3 zeigten eine verminderte Bindung an FCEH. Da Schleife BC nahe dem β-Strang D liegt und Schleife CD sich in Nachbarschaft der Schleife EF befindet, ist es denkbar, dass ein oder zwei Reste in Schleifen BC und CD FCEH berühren.
Fünf mutierte IgEs zeigten eine Minderung der Bindung an den FCEL-Rezeptor: Mutanten 1, 3, 4, 7 und 8. Mutanten 1 und 4 wurden oben diskutiert. Mutante 3 umfasste die Veränderung der Schleife CD; im Gegensatz zu FCEH spielt die Schleife CD offensichtlich eine Hauptrolle bei der FCEL-Bindung. Mutante 7, die wie oben diskutiert eine Untermenge der Mutante 1 ist, umfasst den C-terminalen Teil der Schleife AB und liegt proximal der Schleife EF. Zusätzlich besteht Mutante 8 aus der Ersetzung von zwei Thr-Resten (387, 389) mit Ala; diese beiden Reste sind Teil von β-Strang B, der sich am Grund des oben erwähnten Hohlraums befindet, der von Schleife AB und β-Strang D begrenzt wird. Mutante 10 umfasst zwei unterschiedliche Reste in diesem Hohlraum (438, 440) am β-Strang E, der dem β-Strang B benachbart ist. Da Mutante 10 die FCEL-Bindung nicht beeinflusste, ziehen die Erfinder den Schluss, dass der FCEL-Rezeptor nur minimal in den Hohlraum eindringen sollte, während der hochaffine Rezeptor nicht in den Hohlraum eindringt.
Zusätzlich zu einer Glykosylierungsstelle an Asn430, die der Glykosylierungsstelle in IgG-Fc entspricht, enthält Human-IgE eine weitere Glykosylierungsstelle an Asn403. Mutante 9 wandelte Asn403 und Thr405 in Alanin um (Tabelle 2). Der Kohlenhydratverlust hatte keine Wirkung auf die Bindung an beide Rezeptoren.
Auf Basis der Informationen von den Mutanten 1–13 schlagen die Erfinder vor, dass FCEH und FCEL Bindungsstellen an IgE-Fc aufweisen, die unterschiedlich sind aber überlappen. Der niedrigaffine Rezeptor scheint mit einem vergleichsweise kleineren Teil der IgE-Fcε3-Domäne in Wechselwirkung zu treten, die drei benachbarte Schleifen umfasst: AB, CD und ER Im Gegensatz dazu interagiert der hochaffine Rezeptor mit einem größeren Teil von IgE-Fcε3, der Schleife EF, β-Strang D und möglicherweise den N-terminalen Teil der Schleife AB umfasst. Teile der Schleifen BC und CD in Nachbarschaft der Schleife EF und β-Strang D können ebenfalls mit FCEH Wechselwirken. Zusätzlich könnte FCEL in den Hohlraum eindringen, der von Schleife AB und β-Strang D begrenzt wird, wogegen FCEH dies nicht tut. Da die Erfinder keinerlei Mutanten in FCε4 und nur eine in Fcε2 (Mutante 13) bewertet haben, ist es möglich, dass Teile dieser zwei Domänen eine Rolle bei der IgE-Rezeptor-Bindung spielen.
BEISPIEL 4
Herstellung von humanisiertem MaE11
Reste wurden aus MaE11 ausgewählt und in ein Human-Fab-Antikörper-Milieu (V_H-Region Kabat-Untergruppe III und V_L-Region Kappa-Untergruppe I) insertiert oder substituiert. Eine erste Version, humae11v1 oder Version 1, ist in Tabelle 4 beschrieben. TABELLE 4 Änderungen der Konsens-Sequenzen in V_H Human-Untergruppe III und V_L-κ-Untergruppe I (Kabat) für humanisiertes MaE11 Version 1

* Diese Reste variieren typischerweise trotz ihrer Position in CDRs nicht. Die in den KI- und III-CDR-Sequenzen (insbesondere die CDRs nach Chothia-Strukturanalyse) vorhandenen, verbleibenden Reste variieren stark unter Rezipienten-Human-Antikörpern.

Die Affinität der Version 1 wurde beurteilt und erwies sich als ungefähr 100fach niedriger als jene des Donor-Antikörpers Mae11 (siehe 4a und 4b). Daher wurden weitere Modifizierungen der Sequenz von Version 1 wie in Tabelle 5 gezeigt durchgeführt. Es wurde die Fähigkeit dieser weiteren Modifizierungen ermittelt, die Bindung von markiertem huIgE an FCEH zu inhibieren.
Die 50%-Inhibierungstests, deren Ergebnisse in Tabelle 5 gezeigt sind, wurden folgendermaßen durchgeführt:
Eine 96-Napf-Testplatte (Hersteller Nunc) wurde mit 0,05 ml des chimären FcεRI-Alpha-Ketten-IgG1-Rezeptors in 1 μg/ml Beschichtungspuffer (50 nmol Carbonat/Bicarbonat, pH 9,6) beschichtet. Der Test wurde für 12 Stunden bei 4–8°C durchgeführt. Die Näpfe wurden abgesaugt und es wurden 250 μl Blockpuffer (PBS- –1% BSA, pH 7,2) zugesetzt und für eine Stunde bei 4°C inkubiert. In einer gesonderten Testplatte wurden die Proben und der Referenz-Maus-MaE11-Antikörper ausgehend von 200 μg/ml durch 1:10-Verdünnung mit Testpuffer (0,5% BSA, 0,05% Tween 20, PBS, pH 7,2) titriert, und es wurde ein gleiches Volumen von 10 ng/ml biotinyliertem IgE mit 10 ng/ml zugesetzt, und die Platte für 2–3 Stunden bei 25°C inkubiert. Die FcεRI-beschichteten Näpfe wurden drei Mal mit PBS-0,05% Tween 20 gewaschen und dann 50 μl aus den Probennäpfen transferiert und unter Schütteln für 30 Minuten bei 25°C inkubiert. 50 μl/Napf Streptavidin-HRP, in Testpuffer 1:5000 verdünnt wur den für 15 Minuten unter Schütteln inkubiert und die Platte dann wie vorher gewaschen. 50 μl/Napf Microwell-Peroxidase-Substrat (Kirkegaard & Parry Laborstories) wurden zugesetzt und die Farbe für 30 Minuten entwickelt. Die Reaktion wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens von einnormaler HCl gestoppt und die Absorption bei 450 nm gemessen. Die Konzentration für eine Inhibierung von 50% wurde durch Auftragen der prozentuellen Inhibierung gegen die Konzentration des blockierenden Antikörpers mit einer nichtlinearen 4-Parameter-Kurvenanpassung für jeden Antikörper mittels INPLOT berechnet. TABELLE 5 Humanisierte MaE11-Varianten

* Inhibierung der FITC-IgE-Bindung an FCEH (FcERI). Volllängen-Antikörper und humanisierte Fragment-Versionen: Mittelwert und Standardabweichung (S. D.) von drei Tests.
# Ein F(ab)-X/F(ab)-1-Verhältnis von > 16 bedeutet, dass diese Variante auch bei den höchsten verwendeten F(ab)-Konzentrationen keine Bindung zeigte.

Wie aus Tabelle 5 und den 4a und 4b ersichtlich ist, zeigte Version 8 (in der Human-Reste der Version 1 an den Stellen 60 und 61 in der Leichtkette durch ihre Mae11-Gegenstücke ersetzt waren) eine wesentlich gesteigerte Affinität. Weitere Steigerungen der Affinität sind in Versionen 8a und 8b zu beobachten, wo ein oder zwei murine Reste Human-Reste ersetzten. Sonstige Steigerungen, praktisch zumindest auf das Niveau von Mae11, wurden durch Ersetzen der sich im Inneren von V_H und V_L befindenden hydrophoben Human-Reste durch ihre MaE11-Gegenstücke erzielt, was die als Version 9 bezeichnete Variante (siehe Tabelle 5 und 4a und 4b) lieferte. Demgemäß werden die humanisierten Antikörper dieser Erfindung Affinitäten im Bereich des ungefähr 0,1- bis 100fachen derjenigen von MAE11 aufweisen.
Tabelle 6 untersucht die Wirkungen verschiedener Kombinationen von humanisierten maE11-IgG1-Varianten auf die FCEH-Affinität. TABELLE 6 Humanisierte MaE11-IgG1-Varianten

* L1 = V_L wie in F(ab)-1 (verborgene Human-Reste – nicht dem Lösungsmittel exponiert); L9 = V_L wie in F(ab)-9 (verborgene murine Reste); H1 = V_H wie in F(ab)-1 (verborgene Human-Reste); H8 = V_H wie in F(ab)-8 (F(ab)-1 mit AlaH60Asn, AspH61 Pro); H9 = V_H wie in F(ab)-9 (verborgene murine Reste); H8b = V_H wie in F(ab)-8b (F(ab)-8 mit PheH67Ile).

BEISPIEL 5
Erzeugung von IgE-Mutanten
IgE-Mutanten (Tabelle 7) wurden hergestellt, um ihre Wirkung auf die Bindung an Anti-IgE, speziell MaE11, und an FcεRI und FcεRII zu beurteilen. Einige dieser Mutanten wurden konstruiert, um einen spezifischen Aminosäurerest durch einen anderen Rest mit entweder ähnlicher oder sehr verschiedener Ladung oder Größe zu substituieren. Die Auswirkung dieser Änderungen auf die Rezeptorbindung widerspiegelt sich in der untenstehenden Tabelle.
Die Rezeptor-Tests werden im Wesentlichen wie folgt durchgeführt:
Eine 96-Napf-Testplatte (Hersteller Nunc) wurde mit 0,05 ml FcεRI- oder RII-chimären Rezeptor in 1 μg/ml Beschichtungspuffer (50 nmol Carbonat/Bicarbonat, pH 9,6) beschichtet. Der Test wurde für 12 Stunden bei 4–8°C durchgeführt. Die Näpfe wurden abgesaugt und 250 μl Blockpuffer (PBS- –1% BSA, pH 7,2) zugesetzt und für eine Stunde bei 4°C inkubiert. In einer gesonderten Testplatte wurden die Proben und der Referenz-Maus-MaE11-Antikörper ausgehend von 200 μg/ml durch 1:10-Verdünnung mit Testpuffer (0,5% BSA, 0,05% Tween 20, PBS, pH 7,2) titriert und es wurde ein gleiches Volumen von 10 ng/ml biotinyliertem IgE mit 10 ng/ml zugesetzt und die Platte für 2–3 Stunden bei 25°C inkubiert. Die FcεRI-beschichteten Näpfe wurden drei Mal mit PBS-0,05% Tween 20 gewaschen und dann 50 μl aus den Probennäpfen transferiert und unter Schütteln für 30 Minuten bei 25°C inkubiert. 50 μl/Napf Streptavidin-HRP, in Testpuffer 1:5000 verdünnt wurden für 15 Minuten unter Schütteln inkubiert und die Platte dann wie vorher gewaschen. 50 μl/Napf Microwell-Peroxidase-Substrat (Kirkegaard & Parry Laborstories) wurden zugesetzt und die Farbe für 30 Minuten entwickelt. Die Reaktion wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens von 1-normaler HCl gestoppt und die Adsorption bei 450 nm gemessen. Die Absorption wurde gegen die Konzentration des blockierenden Antikörpers MaE11 aufgetragen und eine Inhibierungs-Standardkurve mittels INPLOT erzeugt. TABELLE 7 Aminosäuresequenz von IgE-Mutanten

* Positive Rezeptorbindung gekennzeichnet durch „+", keine Bindung durch „–", und positive Bindung, jedoch geringer als ungeändert, ist durch „+/–" gezeichnet. Wo mehr als ein Test durchgeführt wurde, sind die Ergebnisse durch Beistriche getrennt.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Antikörper, der in der Lage ist, sich an FcεRII-gebundenes IgE zu binden, aber im Wesentlichen nicht in der Lage ist, sich an FcεRI-gebundenes IgE zu binden, umfassend zumindest eine Fab-Region eines menschlichen Empfängerantikörpers, in welche an einer oder mehreren Positionen 30, 30b, 30d, 33, 53, 91, 92, 93 und 94 in der Leichtkette und Positionen 27, 28, 29, 29a, 31, 33, 34, 50, 52, 53, 54, 55, 58, 95, 97, 98, 99, 100 und 101 in der Schwerkette Reste von analogen Positionen im Spenderantikörper MAE11, MAE13 oder MAE15 mit den Leicht- und Schwerkettenaminosäuresequenzen, die in Seq.-ID Nr. 2 bis 7 dargelegt sind, oder im Spenderantikörper mit den Eigenschaften des MAE11-Antikörpers, insbesondere bei der Bindung von löslichem IgE, der Bindung von IgE-tragenden B-Zellen, beim Blockieren von IgE-Bindung an FcεRI und FcεRII, bei der Hemmung von In-vitro-IgE-Produktion und fehlender Bindung an IgE-beschichtete Basophilen, substituiert wurden, zur Verwendung in Therapie.
Antikörper nach Anspruch 1, worin der Spenderantikörper MAE11 ist.
Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, worin der menschliche Empfängerantikörper eine menschliche Kabat-Untergruppe-I-kappa-(Leicht-)Kette und eine menschliche Untergruppe-III-Schwerkette aufweist.
Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, der ein IgG1-, IgG2-, IgG3- oder IgG4-Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 4, der ein komplementfixierender IgG-Antikörper oder ein IgG-Antikörper ist, der in der Lage ist, an ADCC teilzunehmen.
Antikörper, der Fab-Schwer- und -Leichtkettensequenzen von humae11ver.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7a, 8, 8a, 8b oder 9 umfasst, worin humae11ver.1 die Schwer- und Leichtkettenaminosäuresequenzen umfasst, die in Seq.-ID Nr. 8 und 9 dargestellt sind, und humae11ver.2–9 die Schwer- und Leichtkettenaminosäuresequenzen von humae11ver.1 umfassen, wobei sie weiters die Modifikationen inkorporieren, die in Tabelle 5 dargestellt sind.
Antikörper, der Fab-Schwer- und -Leichtkettenaminosäuresequenzen von humae11ver.1 umfasst, wie in den Seq.-ID Nr. 8 und 9 dargelegt, wobei die Schwerkettensequenz an Position 60 mit Asparagin, an Position 61 mit Prolin und Position 67 mit Isoleucin substituiert ist.
Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5, der eine zusätzliche Substitution von einem oder mehreren Spenderantikörpergerüstresten an Positionen umfasst, die aus 4, 13, 19, 33, 53, 58, 78 und 104 in der Leichtkette und 24, 37, 50, 52, 58, 60, 61, 78, 48, 49, 63, 67, 69, 82, 82c und 95 in der Schwerkette ausgewählt sind.
Antikörper nach Anspruch 8 mit hydrophoben Spendergerüstresten an Positionen 13, 19, 58, 78 und 104 in der Leichtkette und 48, 49, 63, 67, 69, 78, 82 und 82c in der Schwerkette.
Antikörper nach Anspruch 8 mit Spenderresten an 4, 33 und 53 in der Leichtkette und 24, 37, 50, 52, 58, 60, 61 und 95 in der Schwerkette.
Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und 8 bis 10 mit Substitution, Deletion oder Insertion eines Spenderantikörperrests an oder angrenzend an die Stellen 30, 30b, 30d, 33, 55, 57, 58, 78, 93, 94 oder 104 in der Leichtkette und/oder Stellen 24, 37, 48, 49, 54, 57, 60, 61, 63, 65, 67, 69, 78, 82, 82c, 97, 100a oder 100c in der Schwerkette.
Antikörper nach Anspruch 11, worin V_H 78 mit Phenylalanin substituiert ist.
Antikörper nach Anspruch 11, worin V_H 78 mit Leucin, Valin, Isoleucin, Methionin oder Alanin substituiert ist.
Antikörper nach Anspruch 11, worin V_H 60 mit Asparagin substituiert ist.
Antikörper nach Anspruch 11, worin V_H 60 mit Glutamin, Histidin, Lysin oder Arginin substituiert ist.
Antikörper nach Anspruch 11, worin V_H 61 mit Prolin substituiert ist.
Antikörper nach Anspruch 11, worin V_H 61 mit Glycin, Alanin, Valin, Leucin oder Isoleucin substituiert ist.
Antikörper nach Anspruch 8, worin Reste aus dem Spender MAE11 importiert sind, einschließlich vier Inserts in V_L1 30a–30d sowie V_L3 91–94, V_H1 27–29, 29a, 31, 33 und 34, V_H2 53–55 und V_H3 97–101.
Antikörper nach Anspruch 11, worin eine beliebige der V_H-Positionen 97, 100a und 100c einen anderen basischen Rest als Histidin aufweist, vorzugsweise Lysin oder Arginin.
Antikörper nach Anspruch 11, worin eine beliebige der V_H-Positionen 97, 100a und 100c einen Rest aufweist, der aus Alanin, Glycin, Valin, Isoleucin, Serin, Threonin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin, Methionin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan oder Prolin ausgewählt ist.
Antikörper nach Anspruch 11, worin eine beliebige der V_L-Positionen 30, 30b und 30d Glutaminsäure ist.
Antikörper nach Anspruch 11, worin eine beliebige der V_L-Positionen 30, 30b und 30d einen Rest aufweist, der aus Alanin, Glycin, Valin, Isoleucin, Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin, Methionin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan oder Prolin ausgewählt ist.
Antikörper nach Anspruch 11, worin beliebige der V_L-Positionen 30, 30b und 30d Histidin sind und beliebige der V_H-Positionen 97, 100a und 100c Asparaginsäure sind.
Antikörper nach Anspruch 11, worin Reste angrenzend an einen beliebigen der V_H-Reste an Positionen 97, 100a, 100c, 60 oder 61 oder V_L-Reste an Positionen 30, 30b, 30d oder 78 insertiert sind.
Antikörper nach Anspruch 24, worin die insertierten Reste ähnlicher Art sind, d. h. saure Reste, die angrenzend an V_L 30, 30b oder 30d, oder basische Reste, die angrenzend an V_H 97, 100a oder 100c insertiert sind.
Antikörper nach Anspruch 11, worin die Reste an beliebigen von V_L 30, 30b oder 30d oder 78 oder von V_H 97, 100a, 100c, 60 oder 61 deletiert sind.
Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, der ein bispezifischer Antikörper ist.
Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, der für FcεRII-gebundenes IgE monovalent ist und zu einer Immunglobulineffektorfunktion in der Lage ist und eine Fc-Domäne umfasst, die zumindest zwei Schwerketten umfasst.
Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, der eine menschliche Consensus-Schwerketten- und -Leichtkettensequenz umfasst.
Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, der eine IgE-Affinität aufweist, die im Wesentlichen dieselbe oder größer ist als jene von MAE11 für IgE.
Verwendung eines Antikörpers nach einem der vorangegangenen Ansprüche zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Prophylaxe von Allergien.
Verwendung nach Anspruch 32, worin das Arzneimittel zur Verabreichung an einen Patienten dient, der auf ein Allergen sensibilisiert ist.
Verwendung nach Anspruch 33, worin das Arzneimittel zur Verabreichung vor einer akuten allergischen Reaktion dient.
Verwendung nach einem der Ansprüche 31 bis 33, worin das Arzneimittel zur Verabreichung über den intravenösen, intraperitonealen oder subkutanen Weg dient.
Verwendung nach Anspruch 34, worin das Arzneimittel zur subkutanen Verabreichung dient.
Verwendung nach einem der Ansprüche 31 bis 35, worin das Arzneimittel zur Verwendung gemeinsam mit einer weiteren Therapie zur Behandlung von Allergien dient.
Verwendung nach Anspruch 36, worin die weitere Therapie die Verabreichung von Gamma-Interferon, Allergendesensibilisierung, Reduktion der Exposition gegen über Allergen oder Verabreichung von Antihistaminen ist.