DE69233010T2

DE69233010T2 - Universale spenderzellen

Info

Publication number: DE69233010T2
Application number: DE69233010T
Authority: DE
Inventors: J. Peter SIMMS; L. Alfred BOTHWELL; A. Eileen ELLIOT; A. Richard FLAVELL; Joseph Madri; Scott Rollins; Leonard Bell; Stephen Squinto
Original assignee: Yale University; Oklahoma Medical Research Foundation
Current assignee: Yale University; Oklahoma Medical Research Foundation
Priority date: 1991-07-15
Filing date: 1992-07-14
Publication date: 2004-02-19
Anticipated expiration: 2012-07-15
Also published as: ATE237682T1; JPH06506604A; DE69233010D1; CA2113089A1; EP0591462A1; EP1041142A2; EP0591462B1; EP1041142A3; CA2113089C; JPH1057054A; WO1993002188A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft genetisch veränderte Endothelialzellen, und in Besonderen Endothelialzellen die modifiziert worden sind, um einer Lyse durch Komplement zu widerstehen und dem Immunmechanismus der Wirtszelle zur Entfernung fremder Zellen zu entgehen, wenn sie in einen nicht-autologen Wirt eingebracht werden.
Endothelialzellen sind spezialisierte Zellen, welche die Auskleidung der Herz- und der Blutgefäße bilden. Aufgrund ihres direkten Kontaktes mit dem zirkulierenden Blut wurden mehrere Vorschläge gemacht, um diese Zellen genetisch zu verändern und sie als "in vivo" Arzneimittelzuführungssysteme zu verwenden, z. B. von Culliton, B. J. 1989. "Designing Cells to Deliver Drugs", Science 246: 746– 751; und Zwiebel et al., "High-Level Recombinant Gene Expression in Rabbit Endothelial Cells Transduced by Retroviral Vectors", Science 243: 220–222 (Übertragung eines humanen Adenosindeaminasegens und eines Rattenwachstumshormongens auf Aortaendothelialzellen unter Verwendung eines retroviralen Vektors und Aufzeigen der Sekretion von Rattenwachstumshormon aus derartigen Zellen nach Aufbringen auf ein synthetisches vaskuläres Transplantat).
Natürliche Endothelialzellen spielen wichtige Rollen in der normalen Physiologie. Im Besonderen bilden diese Zellen die Grenzfläche zwischen dem Blut und der Gefäßwand und den Organen des Körpers. Als solche sezernieren Endothelialzellen verschiedene natürliche Produkte direkt in den Blutstrom, erhalten eine antithrombotische Oberfläche auf der Innenseite des Gefäßes, beschränken das Eindringen von Leukozyten in die Gefäßwand, regulieren verschiedene der biologischen Eigenschaften glatter Muskelzellen und nehmen Teil an der Regulierung des Gefäßwandtonus. Daher führt ein Verlust von Endothelialzellen zum Verlust dieser normalen pyhsiologischen Prozesse und führt letztendlich zu pathologischen Zuständen, wie etwa Koronararterienerkrankung, Organtransplantatabstoßung und Vaskulitis.
Dementsprechend besteht zusätzlich zu ihrer Verwendung als ein Medium für die in vivo-Verabreichung von Therapeutika ein Bedarf zur Bereitstellung genetisch veränderter Endothelialzellen, um natürliche Endothelialzellen zu ersetzen, welche aufgrund einer Erkrankung oder eines chirurgischen Eingriffs verlorengegangen sind.
In der Vergangenheit waren Vorschläge und/oder Arbeiten zur Verwendung von Endothelialzellen zur Verabreichung von Therapeutika oder zum Zellaustausch auf autologe Zellen begrenzt, d. h. auf Zellen, die von dem Organismus stammen, der der Behandlung unterzogen wird. Alternativ muss der Patient immunsupprimiert werden, was teuer ist und den Patienten infektionsanfällig macht.
Dieser Ansatz wies eine Vielzahl von Problemen auf. Zum Beispiel ist es schwierig, gesunde Endothelialzellen des zu behandelnden Individuums in wesentlichen Mengen zu züchten. Die Verfahren um dies durchzuführen, erfordern eine Entfernung eines Teils einer Gefäßanordnung und dann das Abschaben oder eine andere Art zur Entfernung der Endothelialzellen von den Gefäßwänden. Als ein Ergebnis muss, um geeignet für die Verabreichung von Therapeutika oder zum Zellaustausch zu sein, eine große Anzahl autologer Endothelialzellen in Kultur gezüchtet werden. Zur praktischen Anwendbarkeit, insbesondere im Falle des Zellaustausches, muss dieses Züchten rasch erfolgen. Unglücklicherweise ist die Zellverdoppelungszeit für Endothelialzellen in der Größenordnung von mindestens 24 bis 48 Stunden, was zu Zeitdauern in der Größenordnung von einer Woche oder mehr führt, bevor ausreichende Mengen Endothelialzellen für eine genetische Veränderung oder zum Zellaustausch verfügbar sind. Zusätzlich ist unter normalen physiologischen Bedingungen die Zellverdoppelungszeit für natürliche Endothelialzellen in vivo auch verlängert, wodurch natürlich auftretender Zellaustausch in vivo nachfolgend auf Endothelialzellverlust oder -beschädigung sehr ineffizient ist.
Wenn eine fremde Zelle in einen Wirt transplantiert wird, mobilisiert sich schnell das Immunsystem des Wirts, um die Zellen zu zerstören und dadurch den Wirt zu schützen. Der Angriff des Immunsystems auf die fremde Zelle wird als Transplantatabstoßung bezeichnet. Die erste Verteidigungslinie des Organismus ist entweder über eine lytische Zerstörung oder die Aktivierung von Prokoagulations- und Prothromboseeigenschaften der Donorendothelialzelle, was aus der Aktivierung des Komplementsystems des Wirts resultieren kann und allgemein bekannt ist als die "hyperakute Abstoßungsreaktion" oder einfach die "hyperakute Reaktion".
Mehrere Untersuchungen zeigten, dass die hyperakute Reaktion auf Transplantate von entweder xenogengen (von verschiedenen Spezies) und allotypischen (von einem verschiedenen Individuum der gleichen Spezies) Organen durch Antikörper-abhängige Aktivierung des Komplementsystems an der Oberfläche des Donorendotheliums vermittelt wird, wie z. B. diskutiert von Platt et al., 1990 "Transplantation of discordant xenografts: a review of progress", Immunology Today 11: 450–456. Das heißt, dass das Komplementsystem die Endothelialzellenauskleidung der Gefäße des transplantierten Organs angreift.
Das Komplementsystem ist eine komplexe Wechselwirkung von Plasmaproteinen und Membrancofaktoren, welche in einer Mehrstufen-, Multiproteinkaskadensequenz in Verbindung mit anderen immunologischen Systemen des Wirtsorganismus arbeitet. Der klassische Komplementweg umfasst eine anfängliche Antikörpererkennung und Bindung an eine antigene Stelle auf einer Targetzelle. Dieser Oberflächen-gebundene Antikörper reagiert nachfolgend mit der ersten Komponente des Komplements, Clq, wodurch ein Cl-Antikörperkomplex mit Ca2+, Clr und Cls gebildet wird, welcher proteolytisch aktiv ist. Cls spaltet C2 und C4 in aktive Komponenten C2a und C4a. Der C4b,2a-Komplex ist eine aktive Protease, die als C3-Konvertase bezeichnet wird und dient zur Spaltung von C3 in C3a und C3b. C3b bildet einen Komplex mit C4b,2a, um C4b,2a,3b zu erzeugen, welches C5 in C5a und C5b spaltet. C5b bildet einen Komplex mit C6 und dieser Komplex wechselwirkt mit C7 in der Fluidphase, wobei hydrophobe Domänen innerhalb von C5b und C6 exponiert werden, die den ternären C5b,6,7-Komplex in der Zellmembran stabilisieren. C8, welches in der Fluidphase ist, bindet dann an den ternären C5b,6,7-Komplex und dieser Komplex kann zur Entwicklung funktionaler Membranläsionen und langsamer Zelllyse beitragen. Beim Binden von C9 an C8 in dem C5b-8-Membrankomplex wird Lyse von fremden Zellen schnell beschleunigt.
Die anhängige US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/365,199, eingereicht am 12. Juni 1989, erteilt, der Oklahoma Medical Research Foundation offenbart, dass das humane Komplementregulationsprotein CD59 verwendet werden kann, um nichthumane Endothelialzellen, z. B. Endothelialzellen aus Schwein, vor einem Angriff durch humanes Komplement zu schützen, entweder wenn sie in Lösung mit den Zellen bereitgestellt werden oder in genetisch veränderten Zellen exprimiert werden. Siehe auch Zhao et al., 1991, "Amplified gene expression in CD59-transfected Chinese Hamster Ovary cells confers protection against the membrane attack complex of human complement", J. Biol. Chem. 266: 13418–13422. Die homologe Komplementinhibierungswirkung von CD59 beruht auf seiner Spezies-spezifischen Wechselwirkung mit den terminalen Komplementkomponenten C8 und C9, wie weiterhin von Rollins und Sims berichtet, 1990; "The complement inhibitory activity of CD59 resides in its capacity to block incorporation of C9 into membrane C5b-9", J. Immunol. 144: 3478–3483.
Wenngleich die Verwendung von CD59 sich erfolgreich auf das Problem einer hyperakuten Abstoßung als ein, Ergebnis eines Komplementsangriffs richtet, schützt sie nicht die Zelle gegen den gesamten Immunangriff des Wirtsorganismus gegen die fremden Endothelialzellen.
Beim Stimulieren von Immunantworten lösen Antigene viele molekulare und zelluläre Veränderungen aus. Lymphozyten erkennen Antigene als fremd und sind verantwortlich für die Initiierung von zellulären als auch homoralen Reaktionen bzw. Antworten gegen das präsentierte Antigen. B-Lymphozytzellen reagieren auf Antigen durch die Produktion von Antikörpern gegen das präsentierte Antigen; T-Lymphozyten reagieren durch Initiieren einer zellulären Antwort auf das präsentierte Antigen. Die beiden wesentlichen Subpopulationen von T-Zellen sind T_H-Zellen, die beteiligt sind Antigen zur Präsentation an B-Zellen zu prozessieren, gekennzeichnet durch das Vorliegen eines Zelloberflächenglykoproteins, das als CD4 bezeichnet wird, und cytolytische T-Lymphozyten (CTLs), die beteiligt sind an der Erkennung von Antigen auf Zelloberflächen und Lyse von Zellen, die als fremd erkannt sind, gekennzeichnet durch das Vorliegen eines Zelloberflächenglykoproteins, das als CD8 bezeichnet wird. T-Zellen erkennen Peptidfragmente in Verbindung mit einer der beiden Hauptklassen von Zelloberflächenglykoproteinen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC): Entweder Klasse I (MHC-I)- oder Klasse II (MHC-II)-Proteine. CD8 + T-Zellen erkennen Antigene in Verbindung mit MHC-I, während die CD4 + T-Zellen sie in Verbindung mit MHC-II erkennen.
Die MHC enthalten drei Hauptklassen von Genen. Klasse I-Gene codieren für die Hauptuntereinheiten von MHC-I-Glykoproteinen, bezeichnet als humane Leukozyt-Antigene in Menschen, wobei die grundliegenden HLA-A, B und C sind. Diese liegen auf praktisch allen Zellen vor und spielen eine Hauptrolle bei der Abstoßung von Allograften. Sie können auch Komplexe mit Peptidfragmenten vitaler Antigene auf Virus-infizierten Zellen bilden. Die Erkennung der Komplexe durch CD8 + CTLs führt zur Zerstörung von Virus-infizierten Zellen. Die Erkennung der Komplexe erfolgt durch einen einzigen Rezeptor auf den T-Zellen, welcher Antigene in Verbindung mit MHC erkennt.
Klasse II-Gene, die Hauptklassen in Menschen, bekannt als DP, DQ (Subklassen β2, α2 und β1α1) und DR (Subklassen β1, β2, β3 und α1), codieren für Zelloberflächenglykoproteine, die durch Antigen-präsentierende Zellen exprimiert werden, grundsätzlich B-Zellen, Makrophagen und dendritische Zellen. Zusammen mit Peptidfragmenten von Antigenen bilden die Klasse II-Proteine die Epitope, die von T-Helferzellen (CD4+) erkannt werden. Klasse III-Gene codieren für mindestens drei Proteine der Komplementkaskade und zwei cytotoxische Proteine, Gewebenekrosefaktor und Lymphotoxin, welche in verschiedenen Immunreaktionen umfasst sind, die Zellen zerstören.
T-Zell-vermittelte Immunreaktionen können in drei aufeinanderfolgenden Aktivierungsschritten angeordnet werden. Zuerst erkennen CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten (T-Zellen) das Vorliegen von nichtautologen MHC-Klasse II- bzw. Klasse I-Proteinen auf der Oberfläche der fremden Zelle.
Zum zweiten werden die T-Zellen aktiviert durch die Wechselwirkung eines Liganden mit den T-Zellrezeptoren und anderen zusätzlichen stimulierenden Molekülen, sodass Aktivierung abhängig ist von einer Vielzahl von Variablen, einschließlich homoalen Signalen, wie etwa Cytokinen, die von Proteinrezeptoren auf der Oberfläche der Zellen aufgenommen werden. Am wichtigsten ist die Wechselwirkung zwischen dem Antigen-spezifischen T-Zellrezeptor und Liganden, einem Komplex von MHC und antigenem Peptid auf der Antigenpräsentierenden Zelle (APC). Andere Rezeptoren, die auf der T-Zelle vorliegen, müssen auch mit ihren Liganden auf APC in Kontakt gebracht werden, um Aktivierung sicherzustellen. Wenn sie einmal aktiviert sind, synthetisieren und sezernieren die T-Zellen Interleukin-2 (IL-2) und andere Cytokine.
Die Cytokine, die von den aktivierten T-Zellen sezerniert werden, führen zu der dritten oder der Effektorphase der Immunantwort, welche eine Verstärkung und Aktivierung von Lymphozyten, Monozyten und anderen Leukozyten umfasst, die zusammen zur Zelllyse führen, wie z. B. berichtet von Pober et al., 1990 "The potential roles of vascular endothelium in immune reactions" Human Immunol. 28: 258–262.
In der Vergangenheit waren Versuche zur Unterbrechung der T-Zell-Immunreaktion im Allgemeinen mit einem begrenzten Erfolg verbunden. Zum Beispiel versuchten verschiedene Strategien Reagenzien verschiedener Typen zu verwenden, einschließlich Antikörper und Blockierungsproteine, um die Adhäsion zwischen T-Zellen und Fremdzellen zu stören. Lider et al., 1988, "Anti-idiotypic network induced by t cell vaccination against experimental autoimmune encephalomyelitis", Science 239: 181 berichteten von der Verwendung von T-Zell-Vakzinen; Owhashiand et al., 1988, "Protection from experimental allergic encephalomyelitis conferred by a monoclonal antibody directed against a shared idiotype on rat T cell receptors specific for myelin basic protein", J. Exp. Med. 168: 2153, berichteten von der Verwendung von T-Zellrezeptor-blockierenden Antikörpern; Brostoffand et al., 1984, "Experimental allergic encephalomyelitis: successful treatment in vivo with a monoclonal antibody that recognizes T helper cells", J. Immunol., 133: 1938, berichteten von der Verwendung von Antikörpern auf CD4; und Adorini et al., 1988, Dissociation of phosphoinositide hydrolysis and Ca2+ fluxes from the biological responses of a T-cell hybridoma", Nature, 334: 623–628, berichteten von der Verwendung von Blockierungspeptiden, die die Zellrezeptoren besetzen. Diese Strategien führten im Allgemeinen zu Immunreaktionen auf die Reagenzien, eher als der gewünschten Störung der T-Zellbindung.
Es wäre deutlich vorteilhaft, wenn man die Wahrscheinlichkeit der T-Zell vermittelten Reaktionen gegen transplantierte Zellen als auch Komplementvermittelten Angriff und Lyse der Zelle verringern könnte.
Es ist daher ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein verbessertes Verfahren und Zusammensetzungen bereitzustellen zum Aufbau von Endothelialzellen, die sowohl gegen Komplement- als auch zellulären Angriff widerstandsfähig sind wenn sie in einen fremden Wirt transplantiert werden.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung genetisch veränderte Zellen bereitzustellen, die nicht als fremd erkannt werden, wenn sie in einen fremden Wirt transplantiert werden und daher einem Angriff durch das Immunsystem entgehen.
Ein noch weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist die Bereitstellung genetisch veränderter Zellen, die nach Transplantation einem Komplement-vermittelten Angriff widerstehen können und Lymphozyten-vermittelter Lyse entgehen, insbesondere von CD4+ T-Lymphozyten, und bevorzugt CD8+ T-Lymphozyten.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines Mechanismus zum selektiven Abtöten solcher genetisch veränderter Zellen wenn ihr Vorliegen in dem Wirt nicht länger gewünscht ist.
Es ist ein noch weiterer Gegenstand der Erfindung ein biologisches Vehikel zur Zuführung therapeutischer Produkte bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine genetisch veränderte Säugerzelle zur Transplantation in einen Menschen oder ein Tier bereitgestellt, worin die Zelle auf ihrer Oberfläche keine Proteine exprimiert, die entweder durch Klasse I-Haupthistokompatibilitätskomplexgene oder Klasse II-Haupthistokompatibilitätskomplexgene codiert werden, welche eine T-Lymphozyten-vermittelte Reaktion gegen die Zelle auslösen, und worin die Zelle ein stabil eingebautes Nukleotidmolekül exprimiert, das für ein Protein codiert, das einen Komplement vermittelten Angriff der veränderten Zelle inhibiert, wenn sie in ein Lebewesen einer anderen Spezies oder ein anderes Individuum eingebracht wird.
Im Besonderen werden genetisch veränderte Zellen bereitgestellt, welche eine DNA-Sequenz umfassen, die durch die Zelle exprimiert wird, und welche für ein Protein codiert, das Komplement-inhibierende Wirkung aufweist, welches normalerweise in der Zelle nicht exprimiert wird. Diese Zellen können auch verändert sein, sodass sie auf ihren Zelloberflächen keine funktionellen Proteine exprimieren, die durch die Klasse II-Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Gene, die HLA DP-, DQ- und DR-Gene in humanen Zellen codiert werden, oder ihr Äquivalent in Zellen einer verschiedenen Spezies. Weiterhin können die genetisch veränderten Zellen auf ihren Zelloberflächen keines der Proteine exprimieren, die durch die Klasse I MHC-Gene, die HLA A-, B- und C-Gene in humanen Zellen codiert werden oder ihr Äquivalenten in Zellen einer verschiedenen Spezies. In einigen Ausführungsformen umfassen die Zellen eine genetische (DNA)-Sequenz, welche durch die Zelle exprimiert wird, und, die für ein Protein codiert, das in der Gegenwart eines ausgewählten Mittels zum Tod der Zelle führt.
Die genetische Sequenz, die für ein Protein codiert, das Komplementregulierende Wirksamkeit aufweist, schützt die Zelle vor hyperakuter Abstoßung durch Angriff und Lyse, welche aus einer Aktivierung des Komplementsystems resultiert. Die Entfernung der Zelloberflächenproteine, die durch die Klasse I (z. B. HLA A, B und C) und Klasse II (z. B. HLA DP, DQ und DR) MHC-Gene codiert werden, macht die Zellen im Wesentlichen nicht erkennbar durch die CD8+- und CD4+-T-Lymphozyten des Wirts. Die genetische Sequenz, die für ein Protein codiert, welches Zelltod herbeiführen kann, liefert einen Mechanismus zum Eliminieren genetisch veränderter Zellen aus dem Wirt, wenn ihr Vorliegen nicht länger gewünscht ist.
Die Zellen werden in Kultur modifiziert, unter Verwendung von Standard in vitro-Transfektionstechniken oder können aus transgenen Mäusen, die als Embryo modifiziert wurden, erhalten werden. Diese modifizierten Zellen können als universelle Donorzellen zum Verabreichen therapeutischer Mittel an den Wirt oder als Austausch für natürliche Zellen, welche geschädigt worden sind oder verlorengegangen sind, dienen. In der bevorzugtesten Ausführungsform sind die Zellen dissoziierte Endothelialzellen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Graph der Induktion von CD59-Antigen in CHO-Zellen, transfiziert mit Plasmid, enthaltend Human-CD59-cDNA, ¹²⁵I-1F1-gebundenes CD59 (Moleküle/Zelle × 10⁶) gegenüber Methotrexat (μg/ml). China-Hamster-Ovarzellen wurden mit einem Plasmid transfiziert, enthaltend den pFRSV-Vektor und cDNA für humanes CD59. Nach Subklonieren und Selektion wurden die Zellen in Medium gehalten, das Methotrexat enthielt und Oberflächenantigen wurde gemessen durch die spezifische Bindung von monoklonalem Antikörper ¹ ²⁵I-1F1 (10 μg/ml) gegen CD59. Alle Daten wurden hinsichtlich nichtspezifischer Bindung korrigiert, gemessen für Kontroll-(nicht transfiziert)-CHO-Zellen, die in der Abwesenheit von Methotrexat (Ursprung) gezüchtet wurden. Daten zeigen Mittelwerte ± S. E. von drei Messungen, die an verschiedenen Tagen gemacht wurden.
2 ist ein Graph der Entfernung von Zelloberflächen-CD59 durch Phosphatidylinositol-spezifischer Phospholipase C (PLPLC), wobei Zellzahlen gegen die mittlere Fluoreszenz aufgezeichnet sind. CD59-transfizierte CHO-Zellen, verstärkt durch Wachstum in 1 mg/ml Methotrexat, wurden suspendiert mit 2 × 10⁶/ml in HBSS und inkubiert für 1 h bei 37°C, mit entweder 0 (...) oder 1 (---) Einheiten/ml Phosphatidylinositol-spezifischer Phospholipase C. Zelloberflächen-CD59 wurde dann durch Flusszytometrie unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 1F1 (10 μg/ml) gemessen, welches mit FITC-Anti-Maus-IgG (67 μg/ml) nachgewiesen wurde. Histogramme zeigen die mittlere Fluoreszenz pro Zelle in logarithmischen Maßstäben. Ebenfalls gezeigt ist die Hintergrundzellfluoreszenz, gemessen in der Abwesenheit von 1 F1 (---).
3 ist ein Graph, der den Schutz von CD59-transfizierten CHO-Zellen vor Humanserumkomplement, Farbstofffreisetzung (%) gegen Humanserum (%) zeigt. CD59-transfzierte CHO-Zellen wurden induziert, um verschiedene Mengen CD59-Antigen zu exprimieren, durch Wachstum in Methotrexat enthaltendem Medium, exprimierte CD59-Moleküle/Zelle × 10^–5: 0,0 (dunkle Kreise), 1,9 (nicht ausgefüllte Kreise), 2,8 (dunkle Rauten), 6,8 (nicht ausgefüllte Dreiecke), 7,2 (dunkle Quadrate), 13,0 (nicht ausgefüllte Quadrate) und 31,3 (dunkle Rauten).
4 zeigt die Struktur des retroviralen Vektores, der in Beispiel 2 verwendet wird. Dieser Vektor wurde aufgebaut aus einem defekten Moloney Leukämievirus aus Maus. Der SV40-Promotor wurde herausgeschnitten und durch den SRalpha-Promotor ersetzt. Ein 500 by cDNA-Fragment, enthaltend die CD59-codierende Sequenz, wurde in einer Xhol-Stelle kloniert und durch Restriktionsanalyse nachgewiesen. Das resultierende Plasmid wurde als pRNSRαCD59 bezeichnet. Ecotroper Retrovirus wurde erzeugt durch Transfizieren von Psi2-Zellen mit Polybren und Selektieren in dem toxischen Aminoglycosid G418. Amphotrope Virusvorratsmaterialien wurden hergestellt durch Infizieren der amphotropen Packungszelllinie Psi-AM mit dem ecotropen Virus, wurden direkt zu Endothelialzellkulturen in der Gegenwart von Polybren gegeben und Transfektanten wurden mit 400 μg/ml G418 selektiert.
5 ist ein Graph der Zelloberflächenexpression von humanem CD59 auf Schweineaortaendothelialzellen (PAEC), wie durch Anti-CD59-Antikörper nachgewiesen und durch Flusscytometrieanalysen analysiert. Die durchgezogene Linie bedeutet die Fluoreszenzintensität von PAEC, infiziert mit dem Retrovirus, der in 4 gezeigt ist, der nur das Kontrollneomycinresistenzgen trägt. Die gestrichelte Linie, die kleingepunktete Linie und die Linie mit größeren Punkten bedeuten die Fluoreszenzintensität von CD59-exprimierenden PAEC-Zellklonen 2, 9 bzw. 1.
6 zeigt eine Scanningelektronenmikrophotographie von CD59-exprimierenden PAEC, die an synthetisches Gortex^TM-Implantat gebunden sind. 6a ist das Kontroll-Gortex^TM, 6b, c und d sind Gortex^TM mit CD59-exprimierenden Zellen, die darauf implantiert sind.
7 ist ein Balkendiagramm, das den Schutz von humanen CD59-exprimierenden PAEC vor Lyse durch humanes Komplement zeigt. Der ausgefüllte Balken bedeutet den Prozentanteil Zelllyse von PAEC, die humanes CD59 exprimieren. Der schraffierte Balken bedeutet den Prozentanteil Zelllyse von PAEC, die nur das Kontrollneomycinresistenzgen exprimieren, während der gepunktete Balken den Prozentanteil Zelllyse von Kontroll-(nichtinfizierte)-PAEC zeigt.
8A zeigt eine Restriktionsverdaukarte des Gentargetingvektors für das Invariante Kette-Gen aus Maus, kloniert in pBS (Bluescript). Der Targetingvektor enthält das Neomycingen (neo). 8B zeigt eine Teilrestriktionsverdaukarte des endogenen invariante Kette-Gens aus Maus und 8C zeigt eine Restriktionsverdaukarte des disrupierten invariante Kette-Gens, erhalten durch homologe Rekombination. Pfeile zeigen die Transkriptionsrichtung in allen drei Abbildungen. Die Erkennungsregion für die radioaktiv markierte invariante Gensonde, die für den in 9 gezeigten Southern Blot verwendet wird, wird durch einen ausgefüllten Balken unter 8C gezeigt.
9 ist ein Southern Blot, der das Restriktionsverdaumuster für zwei unabhängige Neomycin-resistente Mausembryonalstammzellklone zeigt, worin das endogene invariante Kette-Gen durch homologe Rekombination disrupiert worden ist und durch eine mutierte Form des Gens ersetzt wurde. Die beiden Klone sind bezeichnet als 11.10.93 und 11.10.128. Größenmarkierungen sind auf der linken Seite angegeben. Das Dralll-Restriktionsmuster der Elternzellen ist in der äußeren rechten Spur angegeben und ist deutlich verschieden von dem Restriktionsmuster der beiden Klone, die das modifizierte invariante Kette-Gen tragen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Schutz vor hyperakuter Abstoßung
Es ist bestimmt worden, dass die Lyse von Zellen durch Komplement typischerweise nur die terminalen Komplementkomponenten erfordert, im Gegensatz zu früheren Berichten, dass es wesentlich sein kann, die Komplementaktivierung in der C3-Stufe zu unterbrechen, wie z. B. in der PCT-Anmeldung WO 91/05855 beschrieben.
Schrittweise Zugabe von C6,7,8 und 9 zu C5b führt zur Bildung eines Membranangriffskomplexes (MAC), ein Poren-ähnlicher Komplex, der bei Einbringung in die Plasmamembran der Zielzelle bzw. Targetzelle Membranpermeabilität für Calcium und andere Ionen erhöht. Darauf folgend folgt Lyse der Plasmamembran und die Zelle wird entweder zerstört oder alternativ erfolgt eine nichtlytische Veränderung spezifischer Zellfunktionen, was vaskuläre Hämostase beeinträchtigt. Im Falle von humanen Endothelialzellen, die einem humanen Serumkomplement ausgesetzt sind, initiiert Membrandeposition des C5b-9-Komplexes eine Vielzahl von Prokoagulations- und Prothromboseveränderungen in der Zelle, von welchen angenommen wird, dass sie die Blutgerinnung und Thrombusbildung beschleunigen, wie z. B. beschrieben von Hattori et al., 1989 "Complement proteins C5b-9 induce secretion of high molecular weight multimers of endothelial von Willebrand Factor and translocation of granule membrane protein GMP-140 to the cell surface", J. Biol. Chem. 264: 9053–9060; Hamilton et al., 1990 "Regulatory control of the terminal complement proteins at the surface of human endothelial cells: Neutralization of a C5b-9 inhibitor by antibody to CD59", Blood 76: 2572–2577; und Hamilton und Sims 1991 "The terminal complement proteins C5b-9 augment binding of high density lipoprotein and its apoproteins A-I and A-II to human endothelial cells", J. Clin. Invest. 88: 1833–1840. Diese Reaktionen scheinen von der Insertion von C9 in die Plasmamembran der Targetzelle abzuhängen und können daher durch Wechselwirkung mit der Anordnung des C5b-9-Komplexes verhindert werden.
Membranproteininhibierungskomplement
Spezifische Membranproteine, die eine potente inhibierende Wirkung für die Komplementkaskade zeigen, sind isoliert und molekular kloniert worden.
Im Besonderen kann im Hinblick auf das humane Komplementsystem Schutz gegen die Porenbildungswirkung des C5b-9-Komplexes auf nicht-Primatenzellen überfragen werden durch Transfektion derartiger Zellen mit einer cDNA, die für das humane Komplementregulationsprotein CD59 codiert.
Das Vermögen CD59 in China-Hamsterovar-(CHO)-Zellen stabil zu exprimieren, ermöglichte eine direkte Beurteilung der inhibierenden Wirkung von C5b-9, die verliehen wird wenn CD59 selektiv in Säugerzellen exprimiert wird, die normalerweise weder CD59 noch HRF exprimieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die inhibierende Wirkung von humanen Blutzellen gegenüber dem Membranangriffskomplex von humanem Serumkomplement einer nichthumanen Säugerzelle verliehen werden kann durch Transfektion mit der CD59-cDNA und zeigen, dass die C5b-9-Inhibierungsfunktion dieses Proteins mit der Menge von neu exprimiertem Oberflächen CD59-Antigen korreliert.
Das Existenz dieser Proteine und die unten detailliert aufgeführten Untersuchungen zeigen, dass eine Deletion oder Inaktivierung dieser Zelloberflächenkomponenten das Risiko vaskulärer Thrombose erhöht und zu einer verringerten Aufbewahrungszeit für Plättchen und Plättchen-reiches Plasma und zu perfundierten Organen und transplantiertem Gewebe führt. Demgemäß kann das Überleben und die Funktion und die hämostatische Wirksamkeit von Plättchen, das Überleben und die Funktion von hämatopoetischen Vorläuferzellen, wie etwa CFU-S, CFU-GEMM und CFU-L und ihrer Nachkommenschaft, wie etwa BFU-E, BFU-MK und CFU-GM, als auch der reifen Blutzellen, einschließlich Erythrozyten, Plättchen, Monozyten, Granulozyten und Lymphozyten, die von diesen Vorläuferzellen nach Knochenmarkstransplantation stammen, als auch das Überleben von Organen und Geweben für eine Transplantation, welche gesammelt und in vitro aufbewahrt werden, erhöht werden, durch Zugabe des C5b-9-Inhibitors zum Aufbewahrungspuffer oder Perfusat und/oder durch Einführung und Expression des für CD59 codierenden Gens in die zu schützenden Zellen. Autoimmunstörungen und andere Krankheitszustände, die C5b-9 vermittelte Plättchenaktivierung umfassen, einschließlich Lupus, rheumatische Arthritis und zusätzliche Typen von Immunvaskulitis, können ebenfalls behandelt werden durch die intravaskuläre Verabreichung und/oder Transfektion und Expression einer wirksamen Menge des Inhibitors oder eines funktionell aktiven Polypeptids davon zum Supprimieren von C5b-9-Wirkung in einem Patienten, der eine derartige Behandlung benötigt. Ähnliche Verwendungen des Inhibitors können anwendbar sein für eine Zellkultur in Kulturmedium, das von humanem Blut stammt.
Die Daten, die in den Beispielen unten gezeigt sind, beweisen, dass Transfektion mit dem Gen für CD59 verwendet werden kann, um Schutz gegen den Membranangriffskomplex aus Komplement auf Zellen, die normalerweise die Aktivierung der humanen C5b-9-Proteine nicht restringieren, zu übertragen. Diese Daten bestätigen durch DNA-Transfektion die C5b-9-Inhibierungsfunktion, die früher dem CD59-Antigen zugeordnet wurde, das auf humanen Erythrozyten vorliegt, und schließen die Möglichkeit aus, dass die Wirkung, die in Verbindung mit diesem Protein gefunden worden ist, das Vorliegen eines anderen Membrankonstituenten mit Komplementinhibierungswirkung, der mit CD59-Antigen aufgereinigt wird, reflektiert. Trotz offensichtlicher Unterschiede bei der Glykosylierung zeigt die C5b-9-Inhibierungsfunktion, die für rekombinantes CD59, exprimiert in CHO-Zellen, beobachtet wird, Spezifität für humanes C8 und C9 (innerhalb C5b-9), analog zu derjenigen, die für die humane Enthrozytenmembran und für gereinigtes Erythrozyten CD59-Antigen beobachtet wird. Dieses Vermögen zum Verleihen von Spezies-selektivem Schutz gegen die Human-C5b-9-Proteine durch Transfektion einer nichthumanen Zelle mit cDNA, die für die CD59-Sequenz codiert, weist eindeutig nach, dass dieses 18 bis 21 kD Protein als ein homologer Komplementrestriktionsfaktor auf humane Blutzellen wirkt und ist übereinstimmend mit der Beobachtung, dass das Syndrom paroxysmaler nocturnaler Hämoglobinuri mit einer isolierten Erythrozyt-CD59-Defizienz verbunden sein kann.
Wie durch die folgenden Beispiele gezeigt, erwies sich die Komplemenfinhibierungswirkung von rekombinantem CD59 als gesättigt, wenn die Expression von Oberflächenantigen auf mehr als oder gleich 1,3 × 10⁶ Moleküle/CHO-Zelle amplifiziert war. Unter Annahme eines sphärischen Durchmessers von ungefähr 25 μm für die CHO-Zelle ist dies Äquivalent mehr als oder gleich 600 Molekülen CD59-Antigen/μm²-Plasmamembranoberfläche. Im Vergleich exprimieren humane Enthrozyten, die hochresistent gegenüber Aktivierung und Lyse durch humanes Komplement sind, ungefähr 2,5 × 10⁴ Moleküle CD59-Antigen/Zelle, was äquivalent ungefähr 200 Moleküle/μm² Membranoberfläche ist. Durch Extrapolieren dieser Daten sollten 1 × 10³ Moleküle CD59/Zelle oder mehr als oder gleich 1 Molekül CD59 Antigen/μm² Plasmamembranoberfläche wirksam sein, um Komplement-vermittelte Aktivierung und Lyse zu inhibieren.
Die Daten zeigen auch, dass rekombinantes CD59, exprimiert in CHO-Zellen, die Spezies-selektive Erkennung der humanen C5b-9-Charakteristik von CD59 in humanen Erythrozyten zeigt, trotz offensichtlicher Unterschiede in N-verknüpfter Glykosylierung. Die Daten zeigen, dass die Speziesselektivität, die durch CD59 gezeigt wird, welche Erkennung für humanes C8 (innerhalb C5b-8) und humanes C9 (innerhalb C5b-9) umfasst, durch das Kernprotein verliehen wird, unabhängig von seinem Kohlenhydrat, oder dass die relevanten Kohlenhydratstrukturen in dem rekombinanten Protein erhalten bleiben wenn es in CHO-Zellen exprimiert wird. Wie hier in den Zusammensetzungen und Verfahren für die Lebensverlängerung von Plättchen und Organen und Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit oder Suppression von Komplement-vermittelten Störungen verwendet, bedeutet "C5b-9-Inaktivator" jedes CD59 Molekül, einschließlich des 18 kDa Proteins auf Erythrozytenmembranen, Peptidfragmente davon mit C5b-9 Inhibierungswirkung, vorzugsweise enthaltend eine Membranbindungsdomäne, entweder isoliert aus natürlich erzeugten Materialien oder rekombinant veränderten Sequenzen. Der Ausdruck umfasst auch Zellen, die infiziert oder transfiziert sind mit dem Gen für CD59 oder einen biologisch funktionellen Teil davon und es oder ihn exprimieren, als auch Zellen in transgenen Mäusen, in welchen das Gen in Kombination mit einem Promotor, wie etwa K^d MHC Klasse 1 Promotor aus Maus stabil eingebracht worden ist in einen Embryo des Lebewesens, unter Verwendung einer Technik, wie etwa Mikroinjektion. Alle Molekulargewichte sind durch SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen bestimmt.
Andere Komplementinhibitoren, welche identifiziert worden sind und alleine oder in Kombination mit CD59 verwendet werden können, umfassen:

(1) CD46, ebenfalls bekannt als Membrancofaktorprotein (MCP), wie von Purcell et al., 1990 "The human cell surface glycoproteins HuLy-m5, membrane cofactor protein (MCP) of the complement system, and trophoblast leucocyte common (TLX) antigen, are CD46" J. Immunol. 70: 155–161; und Seya und Atkinson, 1989 "Functional properties of membrane cofactor protein of complement" Biochem. J: 264: 581–588 beschrieben. Dieser Inhibitor wirkt durch Binden an die Komplementkomponente C3b, wobei Moleküle aktiviert werden, die C3b in aktive Fragment spalten, wobei Akkumulation von C3b verhindert wird, und daher sein Beitrag zur Bildung des MAC. Siehe auch White et al., 1991 "Protection of mammalian cells from human complement-mediated lysis by transfection of human membrane cofactor protein (MCP) or decay accelerating factor (DAF)" Int. Meeting on Xenotransplantation– –(von rekombinantem humanen CD46 wird gezeigt, dass es den Schutz von Nicht-Primatenzellen vor Lyse durch humanes Komplement bereitstellt).
(2) CD55, ebenfalls bekannt als Zerfallsbeschleunigungsfaktor (DAF), beschrieben von Nicholson-Weller et al., 1982 "Isolation of a human erythrocyte membrane glycoprotein with decay-accelerating activity for C3 konvertases of the complement system" J. Immunol. 129: 184; Lublin und Atkinson, 1989" Decay accelerating factor: Biochemistry, molecular biology, and function" Annu. Rev. Immunol. 7: 35; Lublin et al., 1987 "The gene encoding decay-accelerating factor (DAF) is located in the complement-regulatory locus on the long arm of chromosome 1" J. Exp. Med. 165: 1371; und Medof et al., 1987 "Cloning and characterization of cDNAs encoding the complete sequence of decay accelerating factor of human complement" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2007. Dieser Inhibitor ist ein Membran-gebundenes Protein mit ungefähr 70 kD Molekülmasse, der den Aufbau der C3-Konvertase stört. Siehe auch White et al., 1991, welche berichten, dass rekombinanter DAF Schutz von Nicht-Primatenzellen vor Lyse durch humanes Komplement liefert.

Die relativen Beiträge von CD46, D55 und CD59 bei der Bereitstellung von Schutz vor Komplement-vermittelter Lyse sind beurteilt worden in humanen amniotischen Epithelzellen (HAEC) durch die Verwendung spezifischer Blockierungsantikörper, wie von Rooney et al., 1990 beschrieben in "Protection of human amniotic epithelial cells (HAEC) from complement-mediated lysis: expression on the cells of three complement inhibitory membrane proteins." Immunology 71: 308–311. Die Ergebnisse zeigten, dass CD59 im Vergleich mit CD46 und CD55 den größten Schutz gegen Komplementangriff bereitstellt. Zusätzlich wurde von einem Patienten mit paroxymaler nocturaler Hämoglobinurie, eine seltene Krankheit, die durch eine ungewöhnliche Suszeptibilität von Erythroyzten für lytische Wirkung von Komplement bewirkt wird, von Yamashina et al., 1990, beschrieben, dass er einen vererbten Mangel von CD59 ohne einen Mangel von CD55 aufweist. "Inherited complete deficiency of 20-kilodalton (CD59) as a cause of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria" New Engl. J. Med. 323: 1184–1189.
Im Gegensatz zur beobachteten intravaskulären Hämolyse, die für diesen Patienten beobachtet wird, der einen Mangel von CD59 aufweist aber normal bezüglich des Zerfallbeschleunigungsfaktors ist (und vermutlich normal für andere Komplementinhibitoren), zeigen Individuen mit vererbten Defekten oder Mängeln des Erythrozyten-CD55 (Zersetzungsbeschleunigungsfaktor) im Allgemeinen keine intravaskuläre Hämolyse, wie von Daniels, G. 1989 berichtet in "Cromerrelated antigens-blood group determinants on decay accelerating factor. Vox, Sang, 56: 205; Holguin et al., 1992 "Analysis of the effects of activation of the alternative pathway of complement on erythrocytes with an isolated deficiency of decay accelerating factor. J Immunol. 148: 498–502, wodurch nahegelegt wird, dass CD59 erforderlich und ausreichend ist, um diese Zellen vor cytolytischen Wirkungen von Komplement in humanem Plasma zu schützen.
Zellen, die zur Transplantation in einen fremden Wirt geeignet sind, werden vor Komplement-vermittelter Lyse geschützt durch Einbringen von DNA in die Zelle, die ein Protein oder eine Kombination von Proteinen codiert, welche Komplement-vermittelte Lyse inhibieren, z. B. CD59, CD55, CD46 und/oder andere Inhibitoren von C8 oder C9. CD59 ist der bevorzugte Inhibitor, der in die Zellen durch Transfektion oder Infektion mit einem Vektor eingebracht wird, welcher für das CD59-Protein codiert und wird auf der Oberfläche der transfizierten/infizierten Zellen exprimiert Der Inhibitor ist vorzugsweise von der gleichen Ursprungsspezies wie der Wirt, in welchen die Zellen transplantiert werden sollen.
Das Gen, das für den Komplementinhibitor codiert, kann in eine Zelle einer verschiedenen Ursprungsspezies eingebracht werden, z. B. kann ein humanes CD59-Gen in eine Schweinezelle eingebracht werden, sodass die Zelle einem Angriff widersteht, wenn sie in einen Menschen transplantiert wird, oder das Gen kann m eine Zelle der gleichen Ursprungsspezies eingebracht werden, sodass erhöhte Mengen des Proteins auf der Oberfläche der Zelle exprimiert werden. Zum Beispiel kann das Gen unter der Kontrolle eines Promotors angeordnet werden, der die Expression des Gens verstärkt, welches dann durch homologe Rekombination in das Wirtszellenchromosom an der Stelle insertiert wird, an welcher das Gen normalerweise lokalisiert ist, jedoch unter der Steuerung des Promotors, der Expression verstärkt oder es kann in das Chromosom an einem anderen Locus auf dem Chromosom insertiert werden.
DNA-Sequenzinformation für CD46, CD55 und CD59 ist in der Literatur angegeben worden.
Die Sequenz, die von Lublin et al., 1988 in "Molecular cloning and chromosomal localization of human membrane cofactor proteine (MCP): Evidence for inclusion in the multi-gene family of complement-regulatory proteins" J. Exp. Med. 168: 181– 194, für CD46 angegeben wird, ist unten gezeigt (Sequenz I.D. Nr. 1).
HUMCD46 cDNA Sequenz, erhalten von GenBank: HUMCD46Q
Die Sequenz, die von Medof et al., 1987 für CD55 beschrieben wird, ist unten gezeigt (Sequenz I.D. Nr. 2).
Humane DAF cDNA Sequenz, erhalten von GenBank HUMDAF; HUMDAFC1
FETT GEDRUCKTER TEXT = HUMDAFC1 (Promotor und 5'-Ende von Exon 1, Genomsequenz)
EINFACHER TEXT = HUMDAF cDNA
Die Aminosäure- und Nukleinsäuresequenzen, die von Philbrick, W. M., et al., 1990 Eur. J. Immunol. 20, 87–92 für CD59 beschrieben werden, sind wie folgt (Sequenz I.D. Nr. 3).
Die Aminosäuresequenz für das Protein ist:
Eine cDNA-Sequenz, die für das CD50 Protein codiert ist (Sequenz I.D. Nr. 4):
Übereinstimmende Oligonukleotidprimer können leicht entwickelt werden und dann verwendet werden, um Volllängen-cDNA-Sequenzen für diese Proteine zu erhalten durch Durchführen einer Polymerasekettenreaktionsamplifikation von humaner cDNA. Die Oligonukleotidprimer werden vorzugsweise mit spezifischen Restriktionsenzymstellen ausgestaltet, sodass die Volllängen-cDNA-Sequenzen leicht in Vektoren subkloniert werden können zur Verwendung bei der Transfektion/Infektion der Targetdonorzellen.
Einbringung von DNA, die für die Komplementinhibitoren codiert, in die Endothelialzellen.
DNA, die für die Komplementinhibitoren codiert, kann eingebracht werden in die Zellen in Kultur unter Verwendung von Transfektion oder in Embryos zur Herstellung transgener Lebewesen, die die Komplementinhibitoren auf der Oberfläche ihrer Zellen exprimieren.
Einbringung in Zellen in Kultur
Wie in der Technik bekannt, kann eine Transfektion durch Elektroporation, Calciumphosphatpräzipitation, ein Verfahren auf Lipofectinbasis oder Mikroinjektion oder durch die Verwendung einer "Genkanone" (gene gun) durchgeführt werden. In jedem Fall wird cDNA für das inhibierende Protein, wie etwa CD59, in einem Vektor auf Plasmidbasis subkloniert, welcher Elemente für eine effiziente Expression in der genetisch veränderten Zelle codiert. Der Vektor auf Plasmidbasis enthält vorzugsweise einen Marker, wie etwa das Neomycingen zur Selektion stabiler Transfektanten mit dem cytotoxischen Aminoglycosid G418 in eukaryontischen Zellen und ein Ampicillingen für Plasmidselektion in Bakterien.
Infektion, welche für Endothelialzellen bevorzugt ist, wird durchgeführt durch Einbringen der genetischen Sequenz für das inhibierende Protein in einen retroviralen Vektor. Verschiedene Verfahren sind in der Technik für eine solche Einbringung bekannt. Ein solches Verfahren, welches weit verbreitet in der Technik verwendet wird, verwendet einen defekten Maus-Retrovirus, Psi-2-Zellen zum Verpacken des Retrovirus und die amphotrope Verpackungszelllinie Psi-AM, um infektiösen amphotropen Virus herzustellen zur Verwendung bei einer Infektion der Target-Donorzellen, wie von Kohn et al., 1987 in "Retroviralmediated gene transfer into mammalian cells" Blood Cells 13: 285–298 beschrieben.
Alternativ kann anstelle eines defizienten Moloney Maus-Retrovirus ein Retrovirus des selbstinaktivierenden oder Doppelkopie-Typs verwendet werden, wie etwa derjenige, der von Hantzopoulos et al., 1989 in "Improved gene expression upon transfer of the adenosine deaminase minigene outside the transcriptional unit of a retroviral vector" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3519–3523, beschrieben.
Einbringen in Embryos zur Erzeugung von transgenen Mäusen, die Komplementinhibitor auf der Oberfläche ihrer Zellen exprimieren.
Eine Vielzahl von Verfahren sind dem Fachmann in der Technik bekannt zur Herstellung transgener Lebewesen, die ein Komplementinhihierungsprotein auf der Oberfläche der Zellen zur Verwendung als eine Quelle modifizierter Zellen zur Transplantation exprimieren. Beispiele besonders geeigneter Tiere umfassen transgene Mäuse. Das bekannteste Verfahren zum Herstellen einertransgenen Maus ist durch übermäßig schnelle Ovulation eines Donorweibchens, chirurgische Entfernung des Eis und Injektion des genetischen Materials in den Pronukleus des Embryos, wie durch das U. S. Patent Nr. 4,873,191 von Wagner et al. gelehrt, dessen Lehren hier eingeführt werden. Eine andere üblicherweise verwendete Technik umfasst die genetische Veränderung embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) wie im Besonderen unten in Beispiel 3 beschrieben.
ES-Zellen werden z. B. gezüchtet wie beschrieben in Robertson, E. J. "Embryoderived stem cell lines" in Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach. E. J. Robertson, Hrsg. 71–112 (Oxford-Washington, D. C.: IRL Press, 1987). Genetisches Material wird in die embryonalen Stammzellen z. B. eingebracht durch Elektroporation gemäß dem Verfahren von McMahon, A. P.
und Bradley, A. Cell 62, 1073–1085 (1991). Kolonien werden vom Tag 6 bis Tag 9 der Selektion gepickt auf Platten mit 96 oder 24 Vertiefungen (Costar) und expandiert und verwendet, um DNA für Southern Blot-Analyse zu isolieren.
Chimäre Mäuse werden erzeugt wie in Bradley, "Production and analysis of chimaeric mice" in Teratocarcinomas and embryonic stem cells; A practical approach E. J. Robertson, Hrsg. S. 113–151 (Oxford, Washington, D. C. IRL Press 1987) beschrieben, wobei deren Lehren hier eingeführt werden. Genetisches Material wird in Blastocysten injiziert. Aus diesen implantierten Weibchen, die trächtig werden, werden Chimäre aus der Nachkommenschaft selektiert und dazu gebracht Keimlinienchimäre zur Verwendung als Donorlebewesen erzeugen.
II. Schutz vor T-Zellen
Im Gegensatz zu den früheren Versuchen zum Blockieren der T-Zell-vermittelten Immunantwort unter Verwendung von Antikörpern oder Blockierungsverbindungen, wird genetische Veränderung der Zellen verwendet, um die T-Zell-Immunantwort zu unterbrechen. Die Donorendothelialzellen sind genetisch verändert, um nicht auf ihrer Oberfläche Proteine zu exprimieren, die durch entweder die Klasse I-Haupthistokompatibilitätskomplexgene oder die Klasse II-Haupthistokompatibilitätskomplexgene, codiert sind, welche eine T-Lymphozyten vermittelte Reaktion gegen die Zellen auslösen. Bevorzugter sind die Zellen verändert, um nicht im Wesentlichen alle Zelloberfläche-Klasse I- und Klasse II-MHC-Moleküle zu exprimieren. Wie hier verwendet, kann der Ausdruck "nicht exprimieren" entweder bedeuten, dass eine nicht ausreichende Menge auf der Oberfläche der Zelle exprimiert wird, um eine Antwort auszulösen oder dass das Protein, das exprimiert wird, defizient ist und daher keine Antwort auslöst.
Wie hier verwendet wird auf die MHC-Moleküle als HLA-Moleküle Bezug genommen, insbesondere die Klassen HLA A, B und C, und Klasse II HLA DP, DQ und DR und ihre Subklassen. Diese Terminologie wird im Allgemeinen als spezifisch für das humane MHC aufgefasst, soll jedoch hier die äquivalenten MHC-Gene von den Donorzellspezies umfassen, z. B. wenn die Zellen ihren Ursprung aus Schwein haben, würde der Ausdruck HLA die äquivalenten Schweine MHC-Moleküle, entweder MHC I oder II, betreffen.
Wenn die Klasse II MHC-Moleküle entfernt werden, erkennen CD4+ T-Zellen nicht die genetisch veränderten Endothelialzellen; wenn sowohl die Klasse I- als auch Klasse II-MHC-Moleküle entfernt werden, erkennen weder CD4+- noch CD8+-Zellen die modifizierten Zellen.
Die relative Wichtigkeit der CD4+- und CD8+-T-Zellsubpopulationen beim Vermitteln von Immunantworten, insbesondere Allograft- bzw. Allotransplantabstoßung, ist experimentell untersucht worden. Sowohl Experimente der Natur als auch Gentargeting durch homologe Rekombination lieferten gewisse Einblicke. Zum Beispiel reichert das AIDS-Virus (HIV) selektiv CD4+-T-Zellen und nicht CD8+-T-Zellen ab und zerstört praktisch die Immunabwehr des Körpers. Zusätzlich, wenngleich homologe Rekombination und Disruption des β2-Mikroglobulingens in Mäusen zur Eliminierung von CD8+-T-Zellen führt, bleiben die Mäuse, die diesen Genotyp erben, gesund und können einer Infektion durch Fremdorganismen, wie etwa Viren, widerstehen, wie von Zijlstra et al., 1989, "Germ-line transmission of a disrupted β2-microglobulin gene produced by homologous recombination in embryonic stem cells" Nature 342: 435 –438; und Koller et al., 1990 "Normal development of mice deficient in β2M, MHC class I proteins, and CD8+ T cells" Science 248: 1227–1230 berichtet. Diese beiden Beobachtungen legen zusammen nahe, dass CD4+-T-Zellen eine zentrale und wesentliche Rolle bei Immunantworten im Allgemeinen spielen, während CD8+-T-Zellen eine spezialisierte und weniger wichtige Rolle im Wirtsabwehrmechanismus spielen.
Die bevorzugte genetische Modifikation, die auf Endothelialzellen durchgeführt wird, umfasst 1) Disrupieren des endogenen Invariante Kette-Gens, welches beim Aufbau und dem Transport von Klasse II-MHC Molekülen zur Zelloberfläche und zur Beladung des antigenen Peptids wirkt und 2) Disrupieren des endogenen β2-Mikroglobulingens (β2M-Gen), welches für ein Protein codiert, das für die Zelloberflächenexpression aller Klasse I-MHC-Moleküle erforderlich ist. Es wird angenommen, dass eine invariante Kette erforderlich ist für die Insertion von antigenen Peptidfragmenten in das MHC-Klasse II-Molekül. Zusammen werden das antigene Peptid und MHC durch T-Zellen erkannt. In der Abwesenheit von antigenem Peptid wird normalerweise die T-Zellerkennung nicht erhalten noch ist das MHC-Klasse II-Molekül einwandfrei gefaltet. Daher ist in Zellen, denen eine Invariante Kette fehlt, die Präsentation von Peptid beseitigt und selbst wenn winzige Mengen Zelloberflächen-MHC erhalten werden, können sie frei von Peptid und daher nichtimmunogen sein.
Die Disruption dieser Gene wird verwirklicht mittels einer homologen Rekombinationsgentargetingtechnik, wie von Zijlstra et al., 1989; Koller et al., 1990 beschrieben; und Beispiel 2 unten zeigt die Disruption des invariante Kette-Gens.
Die Technik wird angewendet, um Expression des Klasse I MHC-Proteins auf der Zelloberfläche wie folgt zu supprimieren. Zuerst wird das komplette β₂M-Gen für die Targetdonorendothelialzelle kloniert, z. B. wird bei Schweineendothelialzellen das Schweine β2M-Gen kloniert. Dies wird durchgeführt indem zuerst cDNA für ein homologes β₂M-Gen, wie etwa das Maus-β₂M-Gen, erhalten wird. DNA-Sequenzinformation für die Maus β₂M-cDNA wurde von Parnes et al., 1983 Nature 302: 449–452 beschrieben. Übereinstimmende Oligonukleotidprimer werden leicht entwickelt, sodaß sie durch komplementäre Basenpaarung an die äußeren 5'- und 3'-Enden der Maus-β₂M-cDNA hybridisieren. Diese Oligonukleotidprimer werden dann verwendet, um Volllängen-cDNA-Sequenzen für Maus-β₂M-Protein zu erhalten, durch Durchführen einer Polymerasekettenreaktionamplifikation auf Maus-cDNA. Die Oligonukleotidprimer sind vorzugsweise ausgelegt, um für spezifische Restriktionsstellen an ihren Enden zu codieren, sodass Volllängen-cDNA-Sequenzen leicht in Plasmide subkloniert werden können.
Die Volllängenmaus β₂M-cDNA kann dann als eine radioaktiv markierte Hybridisierungssonde verwendet werden, um cDNA-Bibliotheken zu screenen, die aus der Quelle der Targetdonorendothelialzellen hergestellt sind, z. B. wird für Schweineendothelialzellen die Maus β₂M cDNA als eine Hybridisierungssonde verwendet, um eine Schweine-cDNA-Bibliothek zu screenen, welche in einen Lambda-Phagen-Vektor kloniert worden ist. Positive Hybridisierungsklone werden ausgewählt, gereinigt, in Plasmidvektoren subkloniert und dann unter in der Technik bekannten Verfahren sequenziert.
Das vollständige Schweine-β₂M-Gen, einschließlich nicht translatierter Nukleotidreste sowie den Teil des Gens, der für das exprimierte Gen codiert, können dann durch Screenen einer Schweinegenom-DNA-Bibliothek, kloniert in einen Lambda-Phagen-Vektor, mit radioaktiv markierter Schweine-β₂M-cDNA als Hybridisierungssonde, kloniert werden. Positive Klone werden ausgewählt, gereinigt, in Plasmidvektoren subkloniert und nachfolgend unter Verwendung in der Technik bekannter Verfahren subkloniert.
Wenn es einmal kloniert ist, wird das β₂M-Gen in einen Vektor auf Plasmidbasis oder vorzugsweise auf retroviraler Basis (der "Gentargetvektor) subkloniert, sodass der Leserahmen des β₂M-Gens durch Insertion einer kurzen DNA-Sequenz disrupiert wird, welche eine positive Selektion der Rekombination in den Endothelialzellen erlaubt, z. B. eines Neomycinresistenzgens (hier nachfolgend als "Positivselektionsgen" bezeichnet). Der Gentargetvektor trägt auch ein zusätzliches Selektionsgen (das "Negativselektionsgen"), außerhalb der disrupierten β₂M-Genregion, welches eine Selektion gegenüber nicht homologer Rekombination erlaubt, d. h. zur Selektion gegen Einbringung des gesamten Plasmids in die genetische Information der Zelle anstelle nur eines Teils des Plasmids, das das disrupierte β₂M-Gen trägt. Das Negativselektionsgen kann z. B. ein Herpes-Simplex-Thymidinkinasegen sein.
Der Gentargetvektor wird dann in die Zelle wie oben beschrieben transfiziert/infiziert und homologe Rekombinationsereignisse werden ausgewählt durch Screenen nach Klonen, die das Positivselektionsgen jedoch nicht das Negativselektionsgen exprimieren.
Die gleichen Verfahren werden verwendet, um homologe Rekombination des Invariante Kette-Gens wie in Beispiel 3 unten gezeigt, zu erreichen.
III. Zellen, die behandeln und zu verändern sind und Wirte
A. Genetisches Verändern von Zellen, zum Schutz vor Komplementund T-Zell-vermittelter Lyse
In einer bevorzugten hier beschriebenen Ausführungsform können Zellen, die genetisch verändert worden sind, in einen Wirt transplantiert werden, um ihnen zu ermöglichen gegenüber dem Immunsystem eines Wirts resistent zu sein und diesem zu entgehen. Der Wirt wird normalerweise ein Mensch oder ein domestiziertes Nutztier sein.
Wenngleich unter Bezugnahme auf Endothelialzellen beschrieben, insbesondere für dissoziierte Endothelialzellen zur Transplantation oder Injektion in einen Wirt, sind die Verfahren und Zusammensetzungen, die hier beschrieben werden, nicht auf Endothelialzellen begrenzt. Andere Zelltypen können ähnlich zur Transplantion modifiziert werden. Beispiele anderer Zelltypen umfassen Fibroblasten, Epithelzellen, Skelett-, Herz- und glatte Muskelzellen, Hepatocyten, Pankreasinselzellen, Knochenmarkszellen, Astrocyten, Schwann'sche Zellen und andere Zelltypen, dissoziiert oder verwendet als Gewebe (d. h. Organe). Wie hier beschrieben, soll "Endothelialzellen" eine Modifikation dieser anderen Zelltypen umfassen, es sei denn, es ist anders angegeben oder im Besonderen in den Beispielen beschrieben.
Die Zellen können von einer Vielzahl von Quellen stammen. Vorzugsweise sind die Zellen aufgrund der leichten Verfügbarkeit derartiger Zellen in großen Mengen und zu geringen Kosten nichthumanen Ursprungs. Zum Beispiel können die Zellen von Schwein oder Rind stammen. Zellen von Primaten, einschließlich Menschen, können verwendet werden, falls dies gewünscht ist. Selbst wenn humane Zellen verwendet werden, wird ein Schutz vor hyperakuter Abstoßung im Allgemeinen noch erforderlich sein, da Komplement-vermittelter Zellangriff auch selbst nachfolgend auf allotypische Transplantation stattfinden kann.
Die genetisch veränderten Zellen stammen normalerweise aus einem einzigen Klon oder, für einige Anwendungen, einer Gruppe individuell ausgewählter Klone. Auf diese Art können die Charakteristika der fertigen pharmazeutischen Präparation genau kontrolliert werden, sowohl hinsichtlich der Gesamteigenschaften der Zellen als auch ihres genetischen Aufbaus. Eine derartige Kontrolle ist von Wichtigkeit bei der Beurteilung der Wirksamkeit besonderer Behandlungsprotokolle und beim Erhalten einer gesetzlichen Zulassung für derartige Protokolle.
Die Zellen werden genetisch verändert, sodass sie ein Komplementinhibierungsprotein oder Komplementinhibierungsproteine auf ihrer Zelloberfläche exprimieren. Die Zellen werden auch genetisch verändert, sodass sie auf ihrer Zelloberfläche nicht Proteine exprimieren, die codiert werden entweder durch die Klasse 1-Haupthistokompatibilitätskomplexgene oder die Klasse II-Haupthistokompatibilitätskomplexgene, welche eine T-Lymphozytenvermittelte Reaktion gegen die Zelle auslösen. Selbst wenn humane Zellen verwendet werden, ist es vorteilhaft, die Zellen, wie hier beschrieben zu verändern, da die Zellpopulation im Allgemeinen nichtautologe Zellen umfassen wird, wenn die Zellen aus einem Individuum erhalten werden, das von dem zu behandelnden verschieden ist:
Die Endothelialzellen werden aus der Auskleidung eines Teils des vaskulären Systems erhalten, z. B. einem Blutgefäß oder einer Kapillare, und werden dann in einer Gewebekultur oder einem anderen geeigneten biologischen Medium gezüchtet und erhalten.
Zum Beispiel werden lange Gefäßendothelialzellen aus Schwein aus der thorakalen Aorta von männlichen Schweinen isoliert.

1. Die thorakale Aorta wird aus dem geopferten Tier unter Verwendung steriler Techniken entnommen, Kreuzklammern des Aortabogens und der Aorta gerade überhalb der renalen arteriellen Ostia unter Verwendung steriler Klammern.
2. Die Organe/Gewebe werden in sterilem PBS-Puffer angeordnet, der 10X Penicillin, Streptomycin und Fungizon enthält. Diese werden auf Eis transportiert.
3. Nach Anordnen der Aorta auf einem sterilen Bereich in einer "Laminarflusswerkbank wird das die Aorta umgebende Fett und Adventitialgewebe von der Aorta entfernt. Mit einem Assistenten, der die Aorta nach unten hält, unter Verwendung der Klammern und einer sterilen Schere, wird das Gefäß der Länge nach aufgeschnitten, wobei das Endothelium exponiert wird. Das Endothelium wird dann mit dem sterilen PBS/antibiotisches Mittel enthaltenden Puffer gespült.
4. Nachfolgend auf dies wird das Endothelium mit einer sterilen Skalpellklinge abgeschabt und das geerntete Endothelium wird in ein steriles konisches Zentrifugenglas mit 15 cm³ übergeführt, wobei die Zellen mit einem Strom sterilen PBS-Puffer übergeführt werden. Die Rohre werden bei 1200 UpM zentrifugiert und der Überstand abgesaugt.
5. 5,0 ml steriles Medium (DMEM, 10% hitzeinaktiviertes fötales Kalbserum, Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 U/ml), 5 mM Hepes, 5 mM Pyurvat und 6 mM Glutamin werden in jedes Glas gegeben und die Zellpellets werden in dem Medium resuspendiert durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren der Lösung in einer sterilen 5 ml-Pipette.
6. 5,0 ml Zellaliquot (geerntet aus jeder Aorta) werden in einer Corning T25 Gewebekulturkolben angeordnet und die Kulturen inkubiert in einer Atmosphäre mit 5% CO₂, 95% Luftfeuchtigkeit bei 37°C.
7. Die Zellen werden dann bei Konfluenz mit einem 1 zu 3-Splitverhältnis unter Verwendung von 0,02% Trypsin (Worthington Biochemical Corp.) passagiert in einem Ca⁺⁺- und Mg⁺⁺-freiem PBS, das 0,01% EDTA enthält, um die Zellen von der Platte zu lösen und die Zellen zu dissoziieren.

Nachdem sie auf die unten beschriebene Art genetisch verändert worden sind, werden die Zellen normalerweise in Flüssigstickstoffbehältnissen aufbewahrt bis sie für die Behandlung eines bestimmten Patienten erforderlich sind. Die Möglichkeit zur Herstellung der Donorzellen im Voraus und zu ihrer Aufbewahrung bis sie erforderlich sind, ist ein wichtiger Vorteil.
Zellen werden dann auf einer Matrix zur Transplantation angeimpft Zum Beispiel werden dissoziierte Endothelialzellen zum Animpfen auf dem Inneren von GortexTM wie folgt vorbereitet.

1. Steriles GortexTM Material wird in einem sterilen, konischen Falcon^TM- Einwegreagenzglas mit 15 cm³ angeordnet. Beschichtungslösung, bestehend aus 0,1 M Natriumcarbonatpuffer, pH-Wert 9,3, und 100 μg/ml säurelösliches Typ I-Kollagen werden in das Reagenzglas gegeben. Nachfolgend auf eine Inkubation über Nacht bei 4°C wird das GortexTM mit sterilem PBS gespült. Typ I-Kollagen wird als eine Beschichtung verwendet, da es maximale, schnelle Endothelialzelladhäsion (75% Adhäsion in 30 min und 80% Adhäsion in einer Stunde) und Migration liefert. Siehe Madri et al., "The collagenous componentes of subendothelium: Correlation of structure and function" Lab. Invest. 43: 303–315 (1980).
2. Der Gortex^TM-Schlauch wird dann an einem Ende kreuzgeklammert und Endothelialzellen werden in das Lumen des Gortex^TM-Schlauchs eingebracht und das andere Ende wird kreuzgeklammert.
3. Das/die Segmente aus Gortex^TM wird/werden dann in einem sterilen Glas angeordnet und das Glas wird mit Medium gefüllt und mit 5 Umdrehungen/min in einer Atmosphäre mit 5% CO₂, 95% Luftfeuchtigkeit bei 37 °C für eine Stunde rotiert.
4. Die Gortex^TM-Segmente werden aus den Gläsern entnommen und mit sterilem Medium gewaschen.
5. Die GortexTM-Segmente werden in die Gefäßversorgung des Wirts transplantiert.

B. Behandlung von Zellen oder Patienten mit einem C5b-9-Inaktivator, um Komplement-vermittelten Angriff zu inhibieren.
Alternativ kann ein C5b-9-Inaktivator in Lösung an Zellen oder einen Patienten verabreicht werden, um Komplement-vermittelten Angriff zu inhibieren. Verabreichung oder Expression des Inhibitors oder eines Polypeptids, das seine funktionelle Domäne repräsentiert und C5b-9-Inhibierungsaktivität besitzt, erzeugt aus dem isolierten natürlich erzeugten Inhibitor oder aus genetisch veränderten Zellen, die Inhibitor exprimieren (oder bevorzugter sezernieren), um Plättchen- oder Endothelialzellaktivierung in einem Patienten zu blockieren, der eine solche Behandlung erfordert, sollten dabei den Patienten vor C5b-9-vermittelten Procoagulations- und Prothrombosereaktionen schützen.
Plättchen die erhalten wurden aus Patienten mit der erworbenen Stammzellkrankheit paroxymale nocturnale Hämoglobinurie (PNH) erwiesen sich dahingehend, dass sie anormale Empfindlichkeit gegenüber Fluidphasenkomplementaktivierung zeigen, wie durch ein ungewöhnlich hohes Risiko venöser Thrombose charakterisiert. Die gleiche Entdeckung ist gleichermaßen anwendbar auf andere Typen Komplement-vermittelter Störungen bzw. Krankheiten, insbesondere im Hinblick auf die Entdeckung, dass der Inhibitor auch auf der Oberfläche von Endothelialzellen gefunden wird. Als ein Ergebnis kann Verabreichung des Inhibitorproteins, entweder gereinigt aus Zellen oder exprimiert von Zellen, die unter Verwendung von Rekombinationstechniken verändert wurden, oder Teilen des Peptids mit der gleichen messbaren Wirkung, diesen Patienten verabreicht werden, um die Heftigkeit der Störung zu lindern.
Behandlungen von Patienten mit Immunstörungen und Immunkrankheiten, wie etwa Immunovaskulitits, rheumatische Arthritis, Sklerodermie, disseminierter intravaskulärer Gerinnung, Lupus, paroxymaler nocturnaler Hämoglobinurie, thrombotischer thrombolytischer Purpura, vaskulärer Okklusion, Reokklusion nach Operation, Koronarthrombose und Myokardinfarzierung wird durch Verabreichung einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung durchgeführt, enthaltend einen C5b-9-Inaktivator, wie oben definiert, sodass Prokoagulationsprozesse supprimiert werden.
Im Falle transfundierter Blutzellen, Vorläufer hämatopoetischer Stammzellen, erhalten aus oder enthalten in Knochenmark, verwendet für Transplantation, oder transplantierter Organe oder Gewebe, wird der gereinigte Membraninhibitor von C5b-9 oder das funktionell äquivalente Polypeptid oder der funktionell äquivalente Antikörper zuerst auf die Zelloberfläche beschichtet oder das Gen in die Vorläuferzellen wie oben beschrieben eingeführt vor Transplantation oder Transfusion in den Rezipienten. Die Vorläuferzellen könnten aus der gleichen Ursprungsspezies wie der Rezipient oder aus transgenen Lebewesen einer verschiedenen Spezies stammen, worin das Gen für CD59 für die rezipienten Spezies in einen Embryo unter Verwendung von Techniken eingebracht wird, die dem Fachmann in der Technik bekannt sind, wie etwa Mikroinjektion. Die Zusammensetzungsmenge, die einem Patienten verabreicht werden muss, der eine solche Behandlung erfordert, wird in Abhängigkeit von der speziellen Störung oder Erkrankung und der Schwere des Leidens abhängen. Behandlungsdosen werden auch mit den einzelnen Patienten in Abhängigkeit von der Reaktion auf die Behandlung, der genetische Variabilität und der Wirkung von mitverabreichten Arzneimitteln variieren. Im Allgemeinen jedoch werden die Zusammensetzungen, die hier offenbart sind, intravenös in einer Dosis von ungefähr Nanogramm inhibierendes Protein oder Peptid pro Milliliter verabreicht oder Genexpression wird verwendet, um Oberflächenexpression von mindestens 1 × 10³ Moleküle/Zelle oder 1 Molekül Cd59/μm² zu bewirken. Die Behandlung kann in der Form einer Einzelverabreichung der Zusammensetzung sein oder es kann eine periodische oder kontinuierliche Verabreichung über eine ausgedehnte Zeitdauer erfolgen, entsprechend dem Erfordernis. Zur Behandlung einer Immunstörung oder -Erkrankung wird der C5b-9 Inaktivator intravenös in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wie etwa Kochsalzlösung, oder einem pyhsiologisch verträglichen Puffer verabreicht. In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, CD59 in Kombination mit genetisch veränderten Zellen zu verabreichen. um die Wirksamkeit zu maximieren.
Isolierte, funktionell wirksame Poylpeptide, die die geeignete Tertiärstruktur aufweisen, um C5b-9 zu inhibieren, haben Anwendbarkeit zur Erhöhung der hämostatischen Wirksamkeit und zum Ausdehnen der in vitro-Aufbewahrungszeit von Blut- und Plättchenpräparationen. Es besteht ein großer Bedarf zur Verlängerung der Halbwertszeit und der therapeutischen Effizienz von Plättchen, die in vitro aufbewahrt werden. Für Plättchen-enthaltende Lösungen, insbesondere plättchenreiches Plasma (PRP), besteht ein enormer medizinischer Bedarf für Transfusionen. Die derzeitige Haltbarkeit von Plättchenpräparationen ist ungefähr 72 Stunden. Eine Erhöhung der geeigneten Lebenszeit derartiger Präparationen bedeutet einen wesentlichen Fortschritt im Stand der Technik und erfüllt einen dringenden menschlichen und medizinischen Bedarf.
Im Falle humaner Organe und Gewebe zur Transplantation können die C5b-9-Inaktivatoren zudem Perfusions- oder Aufbewahrungsmedium gegeben werden, um die vaskulären Auskleidungszellen vor weitergehender Komplementaktivierung während in vitro-Aufbewahrung zu schützen. Zusätzlich würde durch Beschichten dieser Endothelialzellen mit einem Membranverankerten C5b-9-Inaktivator oder Insertieren des Gens zum Exprimieren des C5b-9-Inaktivators in die Zellen, wie unten detaillierter beschrieben, das Organ oder Gewebe vor cytolytischen und thrombotischen Wirkungen geschützt sein, die durch Komplementaktivierung entstehen, welche bei Transplantation initiiert werden, wobei Komplement-vermittelte akute Abstoßung umgangen wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform, worin der C5b-9-Inaktivator alleine verabreicht wird, wird der C5b-9-Inaktivator in Kombination mit Antikoagulationsmittel, wie etwa ACD, CPD, Heparin oder Oxalat, verabreicht, sodass die Konzentration in den Plättchen oder PRP ungefähr Nanogramm-Inaktivator/ml ist, oder exprimiert in einer Konzentration von mindestens 1 × 10³ Inhibitor/ml. Ähnlich ist zur Organaufbewahrung der C5b-9-Inaktivator in Kombination mit Perfusions- oder Aufbewahrungslösungen oder Kulturmedium, sodass die Konzentration ungefähr Nanogramm-Inaktivator/ml ist.
Zusammensetzungen, die zum Ausdehnen der Haltbarkeit von Plättchenpräparationen, die in vitro aufbewahrt werden, geeignet sind, enthalten C5b-9-Inhibitor in einer Menge, die ausreichend ist, um C5b-9-vermittelte Plättchenaktivierung zu inhibieren. Im Allgemeinen werden diese Zusammensetzungen zu Plättchenpräparationen, wie etwa plättchenreiches Plasma, gegeben werden, sodass die Endkonzentration inhibierendes Polypeptid in der Präparation im Bereich von größer als 2 Ki (Ki = Konzentration der halben maximalen Inhibierung) des Inaktivators in der Lösung ist. Für CD59 und andere Polypeptide, welche eine Membranbindungsdomäne umfassen, wird die therapeutisch wirksame Dosis weniger als 1 μm Inaktivator/ml oder mindestens 1 × 10³ Moleküle Inaktivator/Plättchen oder andere Zelle sein. Geeignete Zusammensetzungen. können auch zusätzliche Antikoagulationsmittel, wie etwa Oxalat, Citrat und Heparin, enthalten. Die C5b-9-Inhibitor-enthaltenden Zusammensetzungen können zu dem Gesamtblut, so wie es abgenommen wurde, oder zu Plättchenpräparationen nach Verarbeiten des Bluts in isolierte Plättchenpräparationen, gegeben werden.
Durch Erhöhen der Oberflächenkonzentration dieser Komplementinhibitoren in der Plasmamembran durch Erhöhen des Gehaltes von Transkript-mRNA für das Protein werden die Zellen vor aktiviertem Komplement C5b-9 nach Infusion oder Gewebe/Organ-Transplantation geschützt.
IV. Zelltermination
Da die veränderten Zellen einem Angriff durch das Komplementsystem widerstehen und das T-Zellsystem umgehen, können die Zellen und ihre Nachkommen theoretisch im Wesentlichen unbegrenzt innerhalb des Wirtsorganismus bestehen. Da Ereignisse geschehen können, unter welchen es wünschenswert ist, diese Zellen aus dem Wirt zu entfernen, wird vorzugsweise weiteres genetisches Verändern durchgeführt, worin die Zellen mit einem internen "Selbstzerstörungs-" oder "Suizid-"Mechanismus versehen sind.
Im Allgemeinen umfasst ein derartiger Mechanismus das Vorliegen eines Gens in der Zelle, welches ein Protein, üblicherweise ein Enzym, exprimiert, welches lethale Empfindlichkeit der Zelle gegenüber einem spezifischen Reagenz, das normalerweise in der Umgebung der Zelle nicht vorliegt, verleiht. Zum Beispiel wandelt das Bakterienenzym Cytosindeaminase (CyD) das nichttoxische Arzneimittel 5-Fluorocytosin in 5-Fluoruracil um, welches umgekehrt innerhalb der Zelle in 5-Fluoruridin-5'-triphosphat und 5-Fluor-2'-deoxyuridin-5'-monophosphat umgewandelt wird, welches sowohl RNA- als auch DNA-Synthese inhibiert und dadurch zu Zelltod führt, wie von Mullin et al., 1992 "Transfer of the bacterial gene for cytosine deaminase to mammalian cells confers lethal sensitivity to 5-fluorocytosine: a negaticve selection system" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 33–37 berichtet.
Demgemäß kann durch Insertieren des Gens für Bakterien CyD in das Genom der Donorendothelialzelle Zelltod zu einer gewünschten Zeit durch einfaches Verabreichen von 5-Fluorcytosin an den Wirtsorganismus realisiert werden. Die Sequenz des Bakterien-CyD-Gens ist bekannt und daher kann ein Einbau des Gens in die Donorendothelialzellen auf eine ähnliche Art durchgeführt werden, wie sie verwendet wird, um das CD59-Gen zu insertieren.
Andere Gene, die derzeit bekannt sind oder noch identifiziert werden, welche lethale Empfindlichkeit gegenüber einem ausgewählten Material verleihen, können ebenfalls für diesen Zweck verwendet werden.
V. Klinische Anwendungen
Wie oben diskutiert, können die veränderten Zellen für Zellaustausch und Arzneimittelverabreichung verwendet werden.
Koronararterienkrankheitsbehandlung
Koronararterienerkrankung wird beispielsweise bewirkt durch eine Blockierung innerhalb von Blutgefäßen, welche die Zuführung von Sauerstoff und Nährstoffen zum Herzen verringert. Die derzeitige Behandlung einer Koronararterienblockierung ist entweder durch mechanisches Dilatieren des blockierten Gefäßes von Innen mit einem angioplastischen Ballon oder die Verwendung eines Austauschgefäßes, z. B. eines synthetischen Implantats oder ein Teil der Vena Saphena, um zu überbrücken oder einen neuen Kanal um die Blockierung zu bilden.
Koronarangioplastie umfasst die Insertion eines Katheters von dem Beingefäß in die Koronärarterie und das Aufblähen eines Ballons am äußeren Ende des Katheters, um den Arterioskleroseherd zu dilatieren. Diese Ballonaufblähung hat unglücklicherweise die nicht wünschenswerte Nebenwirkung der Entfernung von Endothelialzellen von der inneren Auskleidung des Blutgefäßes.
In der klinischen Praxis ist die Reokklusion des behandelten Gefäßes nachfolgend auf eine Koronarangioplastie, d. h. Restenose, ein wesentliches medizinisches Problem, da sie innerhalb von 6 Monaten nachfolgend auf 30 bis 50% der durchgeführten Verfahren auftritt und mit einer wesentlichen Patientenmorbidität und Gesundheitsfürsorgeaufwänden verbunden ist. Die grundlegenden Gründe für die Restenose sind akute Thrombusbildung aufgrund des Verlustes der antithrombotischen Oberfläche, die durch die Endothelialzellen bereitgestellt wird und Neointimabildung aufgrund nicht überprüfter Stimulierung von glatten Muskelzellen durch Zellen, die aus Blut stammen, wiederum aufgrund des Verlustes der schützenden Endothelialzellschicht.
Koronarbypass-Transplantationschirurgie umfasst nicht das Entfernen der Blockierung für Blutfluss in der Koronararterie, wobei anstelle dessen ein Bypass verwendet wird, zum Umleiten des Blutflusses um das blockierte Gefäß, um den Rest des Herzmuskels zu versorgen. Wenn ein Teil der Vena Saphena verwendet wird, um den Bypass zu bilden, wird die innere Auskleidung aus Endothelialzellen normalerweise von der Gefäßwand abgetragen und die glatten Muskelzellen in der Blutgefäßwand verletzt.
Der Verlust der Endothelialauskleidung führt zum Verlust mehrerer kritischer Endothelialeigenschaften, einschließlich dem Verlust der Antikoagulationsoberfläche, Verlust wichtiger glatter Muskelzellregulationskraft, und dem Verlust der Schutzwandabdeckung, welche glatte Muskelzellen vor Plättchen, Monocyten und Lymphozyten abschirmt. Die nachfolgende Antwort bzw. Reaktion des Blutgefäßes auf diese pathologische Verletzung ist zweifach: 1) die physiologische und vorteilhafte Migration von Endothelialzellen vomRand der Wunde zum Wiederherstellen luminaler Integrität und 2) der pathophysiologischen Migration von glatten Muskelzellen von dem Inneren der Blutgefäßwand in Richtung des Lumens, was zur Neointimabildung und Postintervention-Okklusion führt.
Okklusion periphärer Arterien und Koronararterienbypasstransplantate ist eine häufige und wichtige klinische Erkenntnis. Zwei Drittel der Vena Saphena-Koronarbypasstransplantate sind nach 6 bis 11 Jahren nachfolgend auf die Bypassoperation entweder stark erkrankt oder vollständig okkludiert. Periphärarterienbypasstransplantate erleiden im Allgemeinen Okklusion innerhalb von 2 bis 5 Jahren.
Synthetische Implantate zeigen auch hohe Okklusionsraten. Anfangs sind Implantate dieses Typs nicht endothelialisiert. Dies führt zu einem wesentlichen Auftreten früher Okklusion aufgrund von Thrombose. Mit der Zeit werden die Implantate teilweise reendothelialisiert durch Migration von arteriellen Endothelialzellen von proximalen und distalen anastomotischen Stellen oder durch das Einwachsen von Kapillarendothelialzellen durch das poröse synthetische Implantat auf der luminalen Oberfläche. Jedoch ist der Prozess der Endothelialzellmigration normalerweise langsam und erlaubt keine vollständige Abdeckung des Implantats durch arterielle Endothelialzellen. Weiterhin sind einwachsende Kapillarendothelialzellen weniger in der Lage zum Inhibieren einer Gerinnselbildung als arterielle Endothelialzellen. Versuche zum Wiederbesetzen periphärer Implantate bzw. Transplantate mit autologen Endothelialzellen zeigten, dass unvollständige Abdeckung des Transplantats zum Zeitpunkt der Animpfens zu Transplantatverschluss und zu einem Verlust des klinischen Vorteils des Animpfungsverfahrens führt.
Die genetisch veränderten Zellen, die hier beschrieben werden, liefern einen wichtigen Mechanismus zum Lösen dieser kritischen Probleme bei der Revaskularisierung. Diese Zellen können verwendet werden, um denudierte Gefäße oder Transplantate ohne wesentliche Abstoßung durch das Immunsystem des Patienten zu reendothelialisieren. Da die Zellen in hoher Zahl vor dein chirurgischen Verfahren gezüchtet werden können, sind geeignete Vorräte zur Abdeckung großer Bereiche denudierter Gefäße oder nackter Transplantate verfügbar. In diesem Zusammenhang kann weiterhin eine genetische Veränderung der Endothelialzellen durchgeführt werden gemäß der anhängigen Anmeldung mit der Seriennummer 07/820,011, eingereicht am 6. Januar 1992, mit dem Titel "Genetically Engineered Endothelial Cells Exhibiting Enhanced Migration and Plasminogen Activator Activity", wobei die Lehren von dieser hier eingeführt werden, um die Migrationsrate der Donorendothelialzellen zu erhöhen und so eine schnellere Reendothelialisierung zu erreichen.
Ein typisches Verfahren zum Implantieren universeller Donorendothelialzellen in eine Koronararterie eines Patienten ist wie folgt:

1. Durchführen diagnostischer Katheterisierung des Patienten zur Bestimmung der Heftigkeit, Lokalisierung und Zugänglichkeit der Koronar (oder Periphär)-Arterienerkrankung für Angioplastie, Atherektomie, Lasertherapie oder andere Formen mechanischer Revaskularisierung.
2. Unter der Annahme, dass Schritt (1) bestimmt, dass therapeutische Angioplastie geeignet ist, Durchführen eines Standardballonangioplastieverfahrens.
3. Entfernen der genetisch veränderten Endothelialzellen, die hier beschrieben sind, aus der Aufbewahrung unter flüssigem Stickstoff, Auftauen der Zellen auf 37°C und ihr Vorbereiten zum Einbringen mittels des Angioplastieverfahrens indem sie in sterilem gepuffertem Medium suspendiert werden.
4. Verwenden einer Standarddrahtaustauschtechnik, Entfernen des Ballonangioplastiekatheters und sein Ersetzen durch einen Dappelballonkatheter mit einer Infusionsaustrittsöffnung, die zwischen den beiden Ballons positioniert ist.
5. Positionieren des äußeren Endes des Doppelballonkatheters in der angioplastifizierten Koronararterie, wobei die Doppelballons das denudierte Segment der Arterie spreizen, d. h. den Teil der Arterie, in welchem die Endothelialauskleidung durch das Angioplastieverfahren entfernt worden ist.
6. Sachtes Aufblähen der Doppelballons während der distale Koronarkreislauf mit Standardperfusionstechniken unterstützt wird.
7. Einbringen der veränderten Endothelialzellen in das extrakorporale Ende des Doppelballonkatheters und infundieren der Zellen in den isolierten Raum in dem Blutgefäß zwischen den beiden Ballons in einer Konzentration von z. B. 2 bis 10 × 10⁶ Zellen pro 10 Milliliter Lösung, um den denudierten Teil des Gefäßes anzuimpfen.
8. Nach ungefähr 20 bis 30 Minuten Entleeren des Doppelballonkatheters, um normale Koronarperfusion mit vorhergehender Qualität wieder zu erreichen.
9. Entfernen des Doppelballonkatheters, gefolgt von Standardnachkatheterisierungsverfahren.

Ähnlich kann ein synthetisches oder autologes vaskuläres Transplantat oder Steht mit genetisch veränderten Endothelialzellen beschichtet werden und dann in einen Patienten implantiert werden durch:

1. Durchführen diagnostischer Katheterisierung des Patienten zur Bestimmung der Heftigkeit, Lokalisierung und Zugänglichkeit der Koronar (oder Periphär)-Arterienerkrankung für vaskuläre Bypassoperation mit autologem, synthetischem oder anderem Transplantat- bzw. Implantatmaterial.
2. Im Falle eines synthetischen Implantats oder Stents, wie etwa eines Implantats oder Stents, hergestellt aus DACRON oder rostfreiem Stahl, Beschichten des Implantats oder Stents mit Typ I Collagen und Fibronectin in Sättigungsmengen von größer als oder gleich 25 mg/ml in Carbonatpuffer, pH-Wert 9,4; oder im Falle eines autologen Transplantats bzw. Implantats, Gewinnen der Vena Saphena oder eines anderen Gefäßes unter Verwendung herkömmlicher chirurgischer Techniken.
3. Kanülieren des proximalen Endes und Ligieren des distalen Endes des synthetischen Implantats oder Vena Saphena-Transplantats.
4. Entfernen der genetisch veränderten Endothelialzellen aus der Aufbewahrung unter flüssigem Stickstoff, ihr Auftauen auf 37°C und dann ihr Vorbereiten zum Animpfen des Implantats durch ihr Suspendieren in sterilem gepuffertem Medium:
5. Injizieren der veränderten Endothelialzellen in einer Konzentration von z. B. 2 bis 10 × 10⁶ Zellen pro 10 Milliliter Lösung durch die proximale Kanülenöffnung in das Lumen des Transplantats bzw. Implantats und Rotieren des Implantats für ungefähr 60 Minuten, um es den universellen Donorendothelialzellen zu erlauben, die Implantatoberfläche zu bedecken.
6. Implantieren des angeimpften Implantats bzw. Transplantats in die Koronar- oder Periphärarterie unter Verwendung von chirurgischen Standardfeintechniken.

Zusätzlich zu ihrer Verwendung zum Zellaustausch bzw. Ersatz liefern die genetisch veränderten Endothelialzellen einen ausgezeichneten Mechanismus für die Verabreichung therapeutischer Mittel, entweder lokal an der Stelle der Zellimplantation oder systemisch. Diese Zellen können auch PDGF oder PGF-Antagonisten, Thrombolytika oder Thrombinantagonisten sezernieren, um Restenose in einem Gefäß oder einer Implantatwand zu inhibieren. Systemische Arzneimittelzuführung über universelle Donorendothelialzellen kann am wirkungsvollsten durchgeführt werden durch die Verwendung genetisch veränderter mikrovaskulärer (kapillarer) Endothelialzellen, die mehrere Vorteile bieten, einschließlich eines relativen großen Verhältnisses von Oberflächen zu Volumen, insbesondere wenn die Zellen in ein Kapillarnetzwerk wie oben beschrieben, angeimpft werden, und direkte Sezernierung von therapeutischen Proteinprodukten ohne eine Barriere für Diffusion. Beispiele der Typen von Mitteln, die auf diese Art verabreicht. werden können, umfassen Blutgerinnungsfaktoren, Gerinnungslösungsfaktoren, Hormone, Wachstumsfaktoren; Cytokine, Enzyme und Cholesterolbindungs- oder – entfernungsproteine. In jedem Fall wird ein geeignetes Gen oder eine Kombination von Genen in das Genom der Donorendothelialzellen vor Transplantation insertiert.
Ein typisches Verfahren zum Isolieren von Zellen dieses Typs, z. B. aus Schwein als Quelle, ist wie folgt:

1. Mikrovaskuläre Schweineendothelialzellen (PMEC) werden isoliert indem zuerst die epididymalen Fettpolster und/oder Nieren des männlichen Schweins unter Verwendung steriler Techniken entfernt werden. Um dies durchzuführen, werden die Organe oder Gewebe in sterilem HEPES-Puffer (pH-Wert 7,4) angeordnet, welcher 140 mM NaCl, 10 mM HEPES, 10 mM KCl, 0,1 mM CaCl₂, 0,2 mM MgCl₂, 11 g/Liter NaHCO₃, 5,0 g/Liter Glucose, 100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin enthält. Bei Nieren wird das perirenale Fett abgeschnitten und die Nieren werden in sterilem HEPES-Puffer wie oben angeordnet.
2. Die großen sichtbaren Gefäße werden aus dem Epdidymalfett herausgeschnitten und das Fett wird dann in sterilem HEPES-Puffer angeordnet. Das Fettgewebe wird in sterilen Falcon "Blue Max" -Gläsern mit 50 ml angeordnet, welche eine kleine Menge sterilen HEPES-Puffer enthalten und das Fett wird für 3 bis 5 Minuten mit einer Schere zerschnitten.
3. Das zerschnittene Gewebe wird dann in 50 ml Erlenmeyer Kolben ungeordnet, die gleiche Volumina sterilen HEPES-Puffer enthalten, enthaltend 5 mg/ml Collagenase und 5-mg/ml Rinderserumalbumin (BSA). Die Kolben werden bei 37°C unter Bewegen für 20 Minuten-inkubiert. Ein kleines Aliquot (0,1 ml) wird aus jedem Kolben alle 20 Minuten entnommen und dann hinsichtlich des Auftretens von röhrenähnlichen Fragmenten des Kapillarbetts untersucht. Die Inkubation wird fortgesetzt, bis der Hauptteil des zerschnittenen Gewebes röhrenähnliche Fragmente und einzelne Zellen enthält.
4. Die Zellsuspension wird bei 200 × g für 7 Minuten in 15 ml sterilen konischen Gläsern zentrifugiert. Die obere weiße Fettschicht wird dann abgesaugt und die Pellets werden in 10 ml HEPES-Puffer resuspendiert, welcher 10% BSA enthält, und dann zusätzlich zweimal erneut zentrifugiert und resuspendiert.
5. Die resultierenden Pellets werden in 45% Percoll resuspendiert und mit 15.000 × g für 20 Minuten bei 4°C in einem SS34 Rotor mit Festwinkel zentrifugiert. Die Kaillargeßäßbündel der PMECs sind in einer milchig gebrochen weißen Schicht nahe der obersten Adipocyt-enthaltenden Schicht und oberhalb einer durchscheinenden, die größere Gefäßfragmente enthält. Die mikrovaskulären Gefäßbündel und freien Endothelialzellen werden mit einer sterilen Pipette aufgenommen und dann durch Zentrifugation in HEPES-BSA mit 200 × g für 3 Minuten pelletiert. Die Gefäßbündel werden in Medium (Medium 199E, enthaltend 20% wärmeinaktiviertes FBS, Penicillin, Streptomycin, 5 mM HEPES, 5 mM Pyruvat und 5 mM Glutamin, 1 : 1 gemischt mit dem gleichen Medium, enthaltend 10 % FBS, welches für 48 Stunden konditioniert worden ist durch Inkubieren über konfluenten Endothelialzellkulturen) resuspendiert.
6. Die Zellen werden dann in Gewebekulturkolben angeimpft, die mit 1,5% Gelatine in PBS über Nacht beschichtet worden sind.
7. Die PMEC-Kulturen werden dann in einer Atmosphäre mit 5% CO₂, 95 % Luftfeuchtigkeit bei 37°C inkubiert. Die PMEC werden routinemäßig passagiert bei Konfluenz unter Verwendung von 0,02% Trypsin in einem Ca²⁺- und Mg²⁺freien PBS-enthaltenden EDTA, um die Zellen von der Platte abzulösen und Zellaggregate zu dissoziieren.
8. Zu transfizierende/infizierende Zellen werden bei einem Splitverhältnis von 1 zu 4 auf 75 ml Corninggewebekulturkolben angeordnet, die mit 1,5% Gelatine in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung über Nacht beschichtet worden sind. Nach einer Inkubation über Nacht werden die Zellen wie oben für CD59 beschrieben, transfiziert/infiziert.
9. Die genetisch veränderten Endothelialzellen können unter flüssigem Stickstoff eingefroren und aufbewahrt werden bis sie benötigt werden.
10. Um die genetisch veränderten Zellen in einem Zellnetzwerk anzuimpfen, werden die veränderten Zellen zuerst in einer 5 mg/ml Lösung von neutralisiertem säurelöslichem Typ I-Collagen (isoliert aus Kalbdermis) in einer Konzentration von 3,0 × 10⁶ Zellen pro ml Kollagenlösung bei 4°C dispergiert.

Dieses Gemisch wird plattiert auf Clusterplatten mit 24 Vertiefungen in 0,75 ml Aliquote und in einem Inkubator bei 37°C unter Atmosphäre mit 5% CO₂, 95% Luftfeuchtigkeit angeordnet. Nachfolgend auf Gelierung des Kollagens wird Medium übenden Gelen aufgebracht. Die Zellen werden dann wie oben kultiviert, wobei die Zellen täglich wieder versorgt werden. Nach 3 Tagen werden die Gele von den Platten abgeschabt unter Verwendung eines sterilen Teflon^TM-Zellschabers und in vier Liter Bellco^TM Suspensionskulturbehälter für eine Woche übergeführt und dann unter flüssigem Stickstoff eingefroren, und aufbewahrt bis sie benötigt werden: Aufgrund ihres mehrstufigen Schutzes gegen das Wirtsimmunsystem umgehen die veränderten Donorendothelialzellen Implantat- bzw. Transplantatabstoßung, die normalerweise mit der Transplantation von nicht autologen Zellen verbunden ist und können daher verwendet werden, um ihr codiertes therapeutisches Mittel für wesentliche Zeitdauern zu verabreichen bis sie z. B. aus dem Wirt durch einen Selbstzerstörungsmechanismus des oben beschriebenen Typs entfernt werden.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden nicht begrenzenden Beispiele vollständiger beschrieben.
Beispiel 1: Verfahren zur Expression von Human-Komplementinhibierenden Proteinen in Säugerzellen, insbesondere humanem CD59 oder funktionell äquivalenten Polypeptiden.
Wenngleich eine Beschreibung unter besonderer Bezugnahme auf CD59 erfolgt, sind diese Verfahren gleichermaßen auf CD55 und CD46 anwendbar.
Materialien: Human-Komplement-Proteine C5b6, C7, C8 und C9 wurden gereinigt und analysiert auf funktionelle Wirkung gemäß den von Widmer und Sims, J. Biol. hem. 260, 8014–8019 (1985) beschriebenen Verfahren. Humanserum, das defizient ist bezüglich Komplement-Protein C8 (C*D) und die humanen Komplement-Proteine C8 und C9 wurden hergestellt und gemäß Sims, P. J., Biochemistry 23, 3248–3260 (1984) und Cheng, K., et al., J. Immunol., 135, 459– 464 (1985) untersucht. Methotrexat wurde von Lederle Laboratories (Carolina, Puerto Rico) bezogen. BCECF/AM war von Molecular Proben (Eugene, OR). N-Glycanase war von Genzyme (Cambridge, MA). Alle anderen Chemikalien waren von Reagenz- oder analytischer Qualität.
Lösungen:
Abgeglichene Hank's Salzlösung (HBSS, Hanksäbalanced salt solution) wurde von Whittaker M. A. Bioproducts (Walkersville, MD) bezogen und 1%ig (Gew.-V) in Fettsäure-freiem Rinderserumalbumin (Sigma) hergestellt.
Antikörper:
Monoklonaler Antikörper gegen CD59 (1 F1) wurde erhalten von Dr. Motowo Tomita (Showa Universität, Tokio). Fab-Fragmente monospezifischer Kaninchen-Antikörper gegen humanes Erythrocyten-CD59 wurden wie von Sims, P. J., Rollins, S. A. und Wiedmer, T. (1989) beschrieben, hergestellt. Kaninchen-Antiserum, das mit CHO-Membranen reaktiv ist, wurde hergestellt durch wiederholte Injektion von Plasmamembranen, die von gezüchteten CHO-Zellen stammen, und die IgG-Fraktion (Anti-CHO) wurde hergestellt durch Affinitätsreinigung unter Verwendung von Protein A-Sepharose (Sigma). Kaninchen-Anti-Human-Erythrozyt wurde von Cappel (Cochranville, PA) bezogen.
Erythrozytenmembranprotein, das inhibierend für C5b-9 ist (CD59):
Das 18 kDa Humanerythrozytenprotein, das inhibierend für C5b-9 vermittelte Aktivierung und Lyse ist, CD59, wurde isoliert durch Modifizieren von Verfahren, die von Sugita et al. (1988) beschrieben sind. Zusätzliche Reinigung wurde erhalten durch Mono-Q^TM FPLC (Pharmacia). CD59 Polypeptide mit inhibierender Wirkung können auch Affinitäts-gereinigt werden unter Verwendung Inhibitorspezifischer Antikörper. Antikörper, wie etwa α-P18, welche das C5b-9-Inhibitorpolypeptid binden, werden auf Chromatographiematrixmaterial immobilisiert durch Techniken, die dem Fachmann in der Technik allgemein bekannt sind, wobei das Material, das 18 kDa Protein enthält, über die Chromatographiematrix geführt wird, nichtbindendes Material durch Waschen entfernt wird, dann das gebundene Material mit einer stärker konzentrierten Salzlösung oder eine ähnliche Technik entfernt wird. Polypeptide mit der Fähigkeit zum Inhibieren von C5b-9- vermittelten Prokoagulationsreaktionen werden rekombinant erzeugt. Nukleinsäuresequenzen, die für CD59 oder aktive Fragmente davon codieren, werden aus einer Human-cDNA-Bibliothek oder, vorzugsweise, dem hier beschriebenen Klon isoliert. Zum Beispiel wird humane DNA isoliert und verdaut mit Restriktionsenzymen, um Fragmente geeigneter Größe und mit geeigneten kohäsiven Enden zu bilden, um in einen der bekannten und kommerziell verfügbaren Expressionsvektoren legiert zu werden (z. B. Lambda gt11-Vektorsystem von Promega). Alternativ wird die isolierte DNA geschert und die geeigneten Linker werden an die resultierende Fragmente ligiert, welche dann in den gewählten Expressionsvektor insertiert werden.
Vektoren, die humane DNA-Fragmente erhalten, werden als nächstes in den geeigneten Bakterienstamm transformiert, normalerweise ein Stamm von E.coli, der indem Expressionsvektorkit enthalten ist, um die DNA-Genbank oder Bibliothek zu erzeugen. Plattieren der Vektor-enthaltenden Bakterien der Bibliothek auf geeignetem Medium führt zur Expression des insertierten humanen DNA-Fragments. Die Kolonien werden auf das Vorliegen von DNA gescreent, die das C5b-9 inhibierende Polypeptid codiert und exprimiert, unter Verwendung spezifischer Antikörper, wie etwa αP18. Positive Kolonien werden isoliert und für die Expression im großen Maßstab von rekombinant erzeugtem inhibierendem Protein verwendet.
Auf diese Art kann intaktes inhibierendes Protein als auch modifizierte Polypeptide und funktionelle Fragmente und Derivate davon rekombinant hergestellt werden. Funktionelle Polypeptide die die Tertiärstruktur aufweisen und die Fähigkeit zum Inhibieren von C5b-9 können erzeugt werden durch eines der bekannten oben diskutierten Verfahren oder durch andere Techniken, die herkömmlicherweise dem Fachmann in der Technik bekannt sind. Diese isolierten und gereinigten Polypeptide können weiterhin gemischt werden mit pharmazeutisch verträglichen Trägern, um Zusammensetzungen zu bilden zur Verwendung bei der Verlängerung der Zellaufbewahrungsdauer oder zur Behandlung von Immunstörungen oder Krankheiten.
Die folgenden Verfahren sind geeignet zum Nachweis und Quantifizieren der C5b-9-inhibierenden Wirkung von CD59 oder Fragmenten davon.
Proteinmarkierung für Fluoreszenz- oder Radiomarkierung:
Für flusscytometrie wurden alle Antikörper konjugiert mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC). Die IgG-Fraktion von Affinitäts-gereinigtem Ziegenantikörper gegen Maus-IgG (Sigma) wurde mit FITC-Antimaus-IgG markiert. Farbstoft : Protein-Verhältnisse liegen im Bereich von 3 bis 6. In allen Fällen wird nicht eingebaute Markierung (¹²⁶I oder FITC) durch Gelfiltration gefolgt durch gründliche Dialyse entfernt.
Monoklonaler Antikörper 1F1 wurde mit IODO-GEN^TM (Pierce Chemical Co.) auf eine spezifische Aktivität von 6221 cpm/ng radioaktiv markiert.
Proteinkonzentrationen:
Konzentrationen von unmarkierten Proteinen werden bestimmt unter Voraussetzung der folgenden Extinktionskoeftizienten (E^1% ₂₈₀): Maus-IgG (15), C8 (15,1) und C9 (9,6). Die Konzentrationen von FITC-markierten Proteinen werden bestimmt durch Farbstoffbindungsassay (BioRad), unter Verwendung des jeweiligen unmarkierten Proteins als Standard. Die FITC-Konzentration wird bestimmt unter Voraussetzung einer molaren Extinktion (492 nm) von 68.000.
Western Blot
Gereinigtes humanes Erythrozyten-CD59 (1 μg) und das Antigen aus CD59-transfizierten CHO-Zellen wurden denaturiert (3 min, 100°C) in 2% SDS unter nichtreduzierenden Bedingungen und einer Elektrophorese unterzogen in einem 15% homogenen Gel unter Verwendung eines Laemmli-Puffersystems, U. K. Nature 227, 680–685 (1970). Nachfolgend auf Überführung auf Nitrocellulose wurden Immun-Blots durchgeführt durch Inkubieren über Nacht bei 23°C mit entweder monoklonalem Anti-CD59 (10 μg/ml) oder Kaninchen-Anti-CD59 (10 μg/ml) in TBS (150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH-Wert 7,4) mit 1 Rinderserumalbumin. Blots wurden mit einer Verdünnung von 1 : 1000 des geeigneten Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-IgG, an alkalische Phosphatase (Sigma) konjugiert, entwickelt.
Transfektion und Expression von CD59-cDNA in CHO-Zellen.
Das EcoRI-Fragment, das für das CD59-Protein codiert, das von Philbrick, W. M., et al., Eur. J. Immunol. 20, 87–92 (1990) beschrieben ist, wurde in die EcoRI-Stelle in dem μFRSV-Expressionsvektor subkloniert, der von Slanetz, A. E. und Bothwell, A. L. M., Eur. J. Immunol. 21, 179–183 (1991) beschrieben ist.
Die Aminosäuresequenz für das durch diesen Insert codierte Protein ist:
Die cDNA-Sequenz, die das CD59-Protein codiert, ist:
DER FRSV.CD59-Vektor wurde mit Sall (20 μg) linearisiert und in 10⁷ CHO-Zellen durch Elektroporation (2 kV, 25 Mikrofarad) eingebracht. Die Zellen wurden in Eagle's-Minimalmedium (GIBCO) eingebracht, das 10 mg/ml Adenosin, Thymidin und Deoxyadenosin enthielt und für 1 bis 2 Tage gehalten. Das Medium würde dann durch Eagle's-Minimalmedium, dem Deoxynukleoside fehlten, jedoch welches 0,09 μg/ml Methotrexat und 10% dialysiertes fötales Kalbsserum (GIBCO) enthielt, ersetzt. Nach 2 bis 3 Wochen wurden einzelne Klone isoliert, expandiert und selektiert bei ansteigenden Gehalten Methotrexat.
Die resultierenden Transfektanten wurden subkloniert und selektiert hinsichtlich Wachstum im Medium, das mit Methotrexat supplementiert ist, und dann amplifiziert durch kontiuierliches Kultivieren mit zunehmenden Konzentrationen von Methotrexat, im Bereich von bis zu 1 mg/ml, wie in 1 gezeigt.
Immun-Blots von CD59, exprimiert durch transfizierte CHO-Zellen und humane Erythrocyten, wurde durchgeführt. Immun-Blots wurden mit monoklonalem Antikörper 1F1 (10 μg/ml) und Kaninchen-Anti-CD59 IgG (10 μg/ml) durchgeführt.
Das aus transfizierter CHO-Zelle erhaltene Protein wies ein größeres Molekulargewicht auf als das native Molekül Basierend auf der spezifischen Bindung von radiomarkiertem monoklonalem Antikörper gegen dieses Antigen wurde Zelloberflächen-CD59 von 0 (in nicht transfizierten CHO-Kontrollen) auf ungefähr 4,2 × 10⁶ Moleküle/Zelle (für diejenigen CD59-Transfektanten, die in 1 mg/ml Methotrexat gehalten wurden) erhöht.
Quantifizierung von Zelloberflächen CD59-Antigen
Die spezifische Bindung von ¹²⁵I-markiertem 1F1 wurde verwendet, um den Gehalt von CD59-Antigen, exprimiert durch CD59-transfizierte CHO-Zellen, zu quantifizieren. Die CHO-Zellen (CD59-Transfektanten und Kontrollen) wurden auf Gewebekulturplatten mit 48 Vertiefungen bis zu Konfluenz wachsen gelassen, in HBSS gewaschen und dann mit 1% Paraformaldehyd (10 min, 23°C) fixiert. Nach Waschen zum Entfernen von Fixiermittel wurden die Zellen inkubiert mit einer Sättigungskonzentration von Antikörpern, 10 μg/ml ¹²⁵I-1F1, für 30 min bei 23°C. Die Zellen wurden dann sechsmal in eiskaltem HPBSS gewaschen und zellassoziierter Antikörper wurde mit 4% Natriumdodecylsulfat (SDS) eluiert. Radioaktivität wurde gemessen durch Photonenzählen und bezüglich nichtspezifischer Bindung korrigiert, gemessen in der Gegenwart eines 20-fachen Überschusses von nicht-markiertem Antikörper. Daten für CD59-Transfektanten wurden angegeben als Erhöhung des Oberflächenantigens relativ zu nicht transfizierten CHO-Zellkontrollen.
Subklonieren eines cDNA-Klons für humanes CD59 in dem eukaryontischen Expressionsvektor pFRSV und Transfizieren in CHO-Zellen über Elektroporation zeigt, dass CD59 in Zellen exprimiert werden kann, die normalerweise nicht CD59 oder HRF exprimieren und dass es Schutz vor Komplement-vermittelter Lyse verleihen. Wenngleich pFRSV ausgewählt wurde, um schrittweise die DANN, die den Dihydrofolatreduktaselokus flankiert, in einer Methotrexatkonzentration abhängigen Art zu amplifizieren, könnten andere Vektoren auch verwendet werden, wie etwa pFRSV-SRα.
Der Vektor pFRSV ist erfolgreich verwendet worden, um Expression nach Genamplifikation zu erhöhen durch Selektion in Methotrexat-enthaltendem Medium. Der Plasmidvektor pFRSV-SRα besitzt eine viel stärkere Promotor- angetriebene Expression der eingebrachten cDNA. Das SalI-EcoRI-Fragment (800 bp) von pcDL-SRα296 (Takebe, et al., Molec. Cell. Biol. 8: 466–472 (1988)) wurde in die HindlII-EcoRI-Stelle von pFRSV, beschrieben von Slanetz und Bothwell (1991), insertiert, Dieses Plasmid exprimiert viel höhere Basalgehalte von CD59 und anderen insertierten cDNAs als der pFRSV-Vektor.
Exprimieren in Säugerzellen, insbesondere Endothelialzellen, kann auch durchgeführt werden durch Infektion unter Verwendung von Retrovirusvektoren. Dieses Verfahren ist milder und effizienter als Elektroporation als ein Mittel zum Einbringen der DNA in Zellen. Retroviren, die verschiedene Arzneimittelresistenzmarker zur Selektion aufweisen, stellen ein Mittel dar zum Einbringen multipler cDNAs zum Exprimieren in Endothelialzellen. Retroviren, die derzeit in der Entwicklung für diesen Zweck sind, umfassen die Verwendung von Neo, Hygrogycin und Histidinol als selektierbare Marken. Alle diese Resistenzgene sind erhältlich auf BamHI-Fragmenten und können leicht in retrovirale Vektoren insertiert werden, um die Resistenz eines gegebenen Vektors zu verändern. Das DHFR-Gen ist auch verfügbar in Retrovirusvektoren. Retroviren, die CD59 exprimieren, angetrieben durch den SRα-Promotor oder den retroviralen LTR (lange terminale Wiederholung)-Promotor können verwendet werden.
Die Verwendung von Retroviren, die unterschiedliche Arzneimittelresistenzmarker aufweisen, kann die Koexpression von CD59 mit entweder DAF(CD55) oder MCP(CD46) erleichtern. Koexpression mit CD59 kann effektiver sein als CD59 alleine beim Minimieren von Endothelialzellaktivierung. Wenngleich es wünschenswert ist, ist es nicht essenziell für den Retrovirus, dass er einen Arzneimittelresistenzmarker trägt. Es können Retroviren entwickelt werden, die sowohl CD59 als auch CD55 oder CD46 von einem einzelnen Virus exprimieren. Es ist ebenfalls möglich Vektoren zu verwenden, die verschiedene Arzneimittelmarker zur Expression aller drei Komplement-Regulationsproteine CD59, CD55 und CD46 aufweisen.
Molekulargewichtsvergleich von rekombinantem, natürlichem und deglykosyliertem CD59.
Membranproteine von CD59-transfizierten CHO-Zellen (CD59-Expression amplifiziert durch Wachstum in 1 mg/ml Methotrexat) wurden mit 2% Triton X100, 20 mM Tris, 10 mM EDTA, 50 mM Benzamidin, 200 mM N-Ethylmaleimid, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, pH-Wert 7,4, extrahiert. Nach Entfernen von unlöslichem Material durch Zentrifugation bei 11.000 × g, 5 min, wurden die Detergenzextrakte 1.0-fach verdünnt und CD59-Antigen wurde durch Immunaffinitätschromatographie gereinigt, unter Verwendung von Antikörper, immobilisiert auf Affi-Gel 10 (BioRad). Antigen wurde mit 1 M Glycin, 0,2% Triton X-100, 10 mM EDTA, 50 mM Benzamidin, 200 mM N-Ethylmaleimid, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, pH-Wert 3,0, eluiert; dialysiert gegen 200 mM Natriumphosphat, 10 mM EDTA, 50 mM Benzamidin, 200 mM N-Ethylmaleimid, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, pH-Wert 8,6; und konzentriert auf 200 μg/ml. Nach Denaturieren unter reduzierenden Bedingungen (0,5% SDS, 100 mM β-Mercaptoethanol; 100°C, 3 min) wurde Immunaffinitäts-gereinigtes CD59 inkubiert (37°C, 24 h) mit 30 Einheiten/ml N-Glycanase in der Gegenwart von 10 mM 1,10-Phenanthrolin und dann durch Silberfärbung nach 8 bis 25% SDS-PAGE (PHAST System, Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) analysiert.
Rekombinantes CD59, exprimiert auf der Oberfläche dieser Zellen, war suszeptibel für eine Entfernung durch Phosphatidylinositol-spezifischen Phospholipase C-Verdau, was übereinstimmend mit seiner Bindung an die Membran über einen Glycolipidanker ist, wie in 2 gezeigt. Konfluente Monoschichten von CD59-transfizierten CHO-Zellen, erhalten in 1,0 mg/ml Methotrexat, wurden aus T-25-Gewebekulturflaschen mit Versen/EDTA (Whittaker M. A. Biopcoducts) freigesetzt. Nach Waschen und Suspendieren auf 2 × 10⁶ Zellen/ml in HBSS wurden diese Zellen 1,0 Einheiten/ml 'Phosphatidylinositol-spezifischer Phospholipase C (ICN Biochemicals, Indianapolis, IN) oder Enzymverdünnungspuffer als eine Kontrolle ausgesetzt. Nach Inkubation für 1 h bei 37°C wurden 25 μl jeder Zellsuspension in Gläser gegeben, die 25 μl monoklonalen Antikörper 1F1 enthielten (Endkonzentration 10 μg 1F1/ml in HBSS). Nach 30 mir Inkubation bei 4°C wurden 10 μl FITC-Anti-Maus-IgG zugegeben (Endkonzentration 87 μg IgG/ml) und Zellen wurden für zusätzliche 15 min bei 23°C inkubiert. Oberflächen-CD59 wurde durch spezifisches Binden von monoklonalem Antikörper 1F1 quantifiziert, gemessen mit einem FACSCAN (Becton, Dickinson & Co.) Flusszytometer, wobei der FL1-Fluoreszenzkanal (520 nm) auf logarithmische Verstärkung eingestellt war.
Durch Western Blots zeigte CD59, exprimiert durch die transfizierten CHO-Zellen, eine deutlich geringere Migration auf SDS-PAGE (scheinbares Molekulargewicht 21 bis 24 KD) als CD59, das in humanen Erythrozyten vorliegt (scheinbares Molekulargewicht von 18 bis 21 kDa). Nach Verdau mit N-Glycanase zum Entfernen von Asparagin-verknüpftem Kohlenhydrat, comigrierten rekombinantes CD59, isoliert von CHO-Transfektanten, und CD59, isoliert von humanen Erythrocyten, mit scheinbaren Molekulargewichten von 12 bis 13 kDa durch SDS-PAGE.
Schutz von CD59-transfizierten CHO-Zellen vor Porenbildungsaktivität von Human-C5b-9.
Die funktionelle Aktivität von rekombinantem CD59, das in transfizierten CHO-Zellen exprimiert wird, wurde beurteilt durch Untersuchen von Komplementvermittelter Farbstofffreisetzung unter Verwendung des intrazellulären Fluorszenzfarbstoffindikators BCECF/AM Unter Ausnutzung des Vermögens zur schrittweisen Verstärkung der Genexpression durch Wachstum in verschiedenen Konzentrationen Methotrexat, wie in 1 gezeigt, wurde die Beziehung zwischen dem CD59-Antigengehalt und der inhibierenden Wirkung auf C5b-9 beurteilt.
Nachdem stabile Expression bei jeder Methotrexatkonzentration erreicht war, wurden die CD59-transfizierten Zellen auf Empfindlichkeit gegenüber humanem Serum-Komplement unter Verwendung einer BCECF/AMFarbstofffreisetzungsuntersuchung getestet. Nach Inkubation mit BCECF/AM (15 μM) und Waschen wurden konfluente Monoschichten mit 5 mg/ml Kaninchen-Anti-CHO-IgG und 25% C8D inkubiert, um C5b-67 auf der Plasmamembran abzulagern. Dann wurde humanes Serum, das 10 mM EDTA enthielt, als Quelle von C8 und C9 zugegeben. Farbstofffreisetzung in den Überstand wurde nach 15 min bei 37°C durchgeführt, mit Korrektur auf nicht-spezifische Freisetzung, welche für abgestimmte Kontrollen beobachtet wurde, ohne Inkubation in C8D.
Wie in 3 gezeigt, führte erhöhte Amplifikation von CD59 zu einer deutlichen Abnahme der Empfindlichkeit der transfizierten CHO-Zellen für Farbstofffreisetzung, die durch Immunaktivierung von Human-Serum-Komplement induziert wird. Für Zellen, die in 200 μg/ml Methotrexat gezüchtet wurden (entsprechend einer Amplifikation der Zelloberflächenexpression von ungefähr 1,2 × 10⁶ Molekülen CD59/Zelle), wurde keine Komplement-vermittelte Farbstofffreisetzung beobachtet, selbst bei den höchsten getesteten Konzentrationen von Serum (75%).
Um Komplement-inhibierende Wirkung zu zeigen, wurde CD59-Expression transfizierter CHO-Zellen amplifiziert durch Wachstum in 50 μg/ml Methotrexat: Die Zellen wurden mit Farbstoff durch Inkubation in BCECF/AM inkubiert; und C5b-67 wurde wie in 3 beschrieben, abgelagert. Nach Waschen wurden die Zellen inkubiert (4°C, 30 min), entweder mit 0 mg/ml oder 0,5 mg/ml funktionell inhibierendem Antikörper (Fab-Fragmente) für CD59. Ungebundener Antikörper wurde entfernt; C8 (1 μg/ml) und verschiedene Mengen C9 wurden zugegeben; und Farbstofffreisetzung wurde nach 15 min bei 37°C gemessen.
Die Resistenz gegenüber Komplement-vermittelter Membranschädigung, die für CD59-exprimierende CHO-Zellen beobachtet wird, widerspiegelte Inhibierung von C9-abhängiger Aktivierung der Komplementpore und diese Inhibierung wurde revertiert vor Inkubieren der Zellen mit Fab-Fragmenten eines funktionell blockierenden Antikörpers, der gegen das CD59-Antigen gerichtet ist. Diese Daten bestätigen, dass der Schutz gegen Human-Serum-Komplement, der für CD59-Transfektanten beobachtet wird, mit der Expression von Zelloberflächen-CD59 verbunden ist und nicht auf andere Veränderungen in diesen Zellen zurückzuführen ist, die durch Langzeitkultivieren in Methotrexat induziert werden können.
Human-Selektivität von Komplement-inhibierender Funktion, exprimiert durch CD59-transfizierte CHO-Zellen.
CD59-transfizierte CHO-Zellen sind selektiv geschützt vor den Wirkungen der Human-C5b-9-Proteine, auf eine analoge Art wie Spezies-selektive Resistenz gegenüber Lyse, die für humane Erythrozyten und für Membranen beobachtet wird, die mit gereinigtem CD59-Antigen aus Human-Erythrozyten rekonstituiert sind. In diesen Studien wurden Anti-CHO-IgG und humanes C8D verwendet, um den humanen C5b-67-Komplex auf der CHO-Zellplasmamembran abzulagern, vor Inkubation in entweder von Human- oder Meerschweinchenserum, das EDTA enthält, als eine Quelle der C8- und C9-Komponenten des C5b-9-Komplexes.
CD59-Expression durch transfizierte CHO-Zelle wurde amplifiziert durch Wachstum bei verschiedenen Methotrexatkonzentrationen; die konfluenten Monoschichten wurden mit BCECF/AM beladen; und humanes C5b-67 wurde wie oben beschrieben abgelagert. Nach Waschen wurden die C5b67-Zellen zu C5b-9-Zellen gemacht durch Inkubieren (15 min, 37°C) mit entweder 10% (V/V) humanem Serum bzw. Humanserum (ausgefüllte Symbole) oder 10% (V/V) Meerschweinchenserum (nicht ausgefüllte Symbole) in der Gegenwart von 10 mM EDTA.
CD59, exprimiert durch transfizierte CHO-Zellen, schützte diese Zellen vor Porenbildung durch humanes C5b-9, jedoch nicht wenn C8- und C9-Komponenten dieses Komplexes durch Meerschweinchenproteine ersetzt wurden.
Humanes C5b-67 wurde auf K562-Zellen abgelagert durch sukzessive Inkubation mit Anti-Human-Erythrozyten-Antiserum (1,5% (V/V, enthaltend 10 mM EDTA) und 60% (V/V) humanes C8-abgereichertes Serum (verdünnt in HBSS). Nach Beladen mit BCECF/AM wurden Zellen mit entweder 0 mg/ml oder 1 mg/ml funktionell blockierendem Antikörper für CD59 inkubiert (4°C, 30 min). Nach Entfernung von ungebundenem Antikörper wurden die Zellen C5b-9 gemacht durch Inkubieren in entweder Human- (Kreise) oder Meerschweinchen (Dreiecke)-Serum, enthaltend 10 mm EDTA. Dieses Vermögen zum Begrenzen bzw. Restingieren der Poren-bildenden Wirkung, die bei Einbringung von humanem (jedoch nicht Meerschweinchen) C8 und C9 in C5b-9 entsteht, wurde auch beobachtet für CD59; das konstitutiv auf der Oberfläche von humanen K562-Zellen exprimiert wird, der Zelllinie, von welcher die cDNA für CD59, die in diesen Studien verwendet wird, ursprünglich stammt.
Die effektive Potenz von CD59 und anderen Inhibitoren des C5b-9-Komplexes hängt von der Anzahl von C5b-9-Komplexen ab, die pro Einheitsfläche Plasmamembran erzeugt werden. Daher kann die inhibierende Wirkung von CD59 auf die cytolytische und Zell-stimulierende Wirkung von C5b-9 beseitigt werden durch Erhöhen der Zugabe der aktivierten Komplementkomponenten, die zum Aufbau des C5b-9-Komplexes erforderlich sind. Die Schutzwirkungen von CD59 können erhöht werden durch bereitstellen von CD59 in Verbindung mit CD46 und/oder CD55. In dieser Formulierung wird CD59 in Verbindung mit CD46 und/oder CD55 exprimiert durch Transfektion oder Infektion mit einem Vektor, der das Gen für jedes Protein enthält. Die Koexpression dieser Gene wird dazu dienen, um die Menge von C5b-9 zu begrenzen, die an der Zelloberfläche erzeugt werden kann (durch die inhibierenden Wirkungen von CD46 und/oder CD55 auf die Umwandlung von C5 in C5b durch die Komplement-Enzyme) und zum Schutz vor den cytolytischen und Zell-stimulierenden Wirkungen des restlichen C5b-9, das durch Umwandlung von C5 in C5b durch Plasmin und andere Enzyme gebildet wird, die nicht durch die Wirkung von CD46 und/oder CD55 inhibiert werden.
Beispiel 2: Expression von humanem CD59 in Schweinendthelialzellen schützt sie vor hyperakuter Abstoßung durch humanes Komplement
Dieses Beispiel zeigt, dass wenn Volllängen-cDNA, die für das humane CD59-Protein codiert, stabil in das Genom einer Schweineaortaendothelialzelle (PAEC) eingebaut wird und auf der Zelloberfläche exprimiert wird, es diese Zellen vor Komplement-vermittelten Angriff schützt, gemäß Untersuchung durch Human-Komplement-vermittelter Zelllyse in vitro.
Kulturen von PAEC wurden in DMEM kultiviert, das 10% fötales Rinderserum (FBS), 5 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin und 1% von jeweils Penicillin und Streptomycin (P/S) enthielt. Vor retroviraler Infektion wurden die Zellen auf 50 Konfluenz wachsen gelassen. Subkonfluente PAEC wurden infiziert durch Verwendung des amphotropen helfertreien retroviralen Vektors pRNSRalphaCD59+. Die Struktur dieses retroviralen Konstrukts ist in 4 gezeigt. Als Kontrollen wurden auch PAEC mit einem retroviralen Kontrollvektor infiziert, der das Arzneimittelselektionsmarkergen Neomycin enthielt oder wurden nicht infiziert. Die amphotropen retrovialen Vorratsmaterialien wurden zu subkonfluenten Zellen gegeben, die in einem T-25-Gewebekulturkolben in einem Gesamtvolumen von 3 ml wachsen. Polybren wurde in die Kolben gegeben und die Kulturen wurden bei 37°C für 2 bis 5 Stunden inkubiert. Das Zellkulturmedium wurde dann entfernt, Monoschichten wurden zweimal in 5 ml Medium gespült und dann wurden 5 ml Medium zu diesen Zellen gegeben, welche bei 37°C in 8% CO2 inkubiert wurden.
Nach einer Inkubationdauer von 24 bis 48 Stunden wurden die Zellen G418 (400 μg/ml) ausgesetzt, um bezüglich stabiler Integration des retroviralen Konstrukts zu selektieren. Neomycin-resistende Kolonien wurden auf die Zelloberflächenexpression von humanem CD59 durch Flusszytometrietechniken (FACS-Analyse) untersucht. Um Zelloberflächenexpression von humanem CD59 auf Schweineendothelialzellen zu beurteilen, wurden konfluente Neomycinresistende Zellklone in T-75-Gewebekulturflaschen bis zur Konfluenz wachsen gelassen und Zellen wurden für FACS-Analyse durch Inkubation in Versene-EDTA für 10 Minuten bei 37 °C freigesetzt. Geerntete Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und dann in 2 ml Färbepuffer resuspendiert, der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 0,2% Natriumazid und 2% FBS enthielt. Zellen wurden dann mit einem Hämacytometer gezählt, durch Zentrifugation pelletisiert, zweimal mit Färbepuffer gespült und dann für 30 min bei 23°C mit einem primären Antikörper für humanes CD59, entweder polyklonales Kaninchen-Anti-CD59 mit 10 μg/ml oder Maus-Anti-CD59 monoklonales 1F1 (erhalten von Dr. Motowa Tomita, Showa Universität, Japan) mit 1 μg/ml, inkubiert. Die Zellen werden dann zweimal in Färbepuffer gespült und dann für 30 Minuten bei 23°C mit einem FITC-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG oder einem Anti-Maus-IgG, verdünnt 1 : 50 in Färbepuffer, inkubiert. Die Zellen wurden zweimal in Färbepuffer, einmal in PBS gespült und dann resuspendiert in 1% Paraformaldehyd in PBS und durch FACS analysiert. Positive Zelloberflächenexpression von humanem CD59 (gemäß Messung durch Fluoreszenzintensität auf der X-Achse) ist in 5 für die Zellklone 1, 2 und 9 gezeigt, jedoch nicht für Kontroll-PAEC, das infiziert ist mit einer Kontrolle, die nur das Neomycinresistenzgen enthält.
Im Hinblick auf ihr biologisches Verhalten waren die CD59-infizierten PAEC nicht verschieden von entweder nicht infizierten PAEC oder PAEC, die mit Kontrollvektor infiziert sind. Zum Beispiel hielten sie Proliferationsraten aufrecht, die identisch mit nichtinfizierten Zellen waren und sie zeigten kein Überwachsen von Monoschichten oder Prolieferation in Suspension und waren Kontaktinhibiert. Zusätzlich waren CD59-infizierte Schweineendothelialzellen in der Lage zum Binden an ein synthetisches GortexTM-Implantat, wie durch die in 6 gezeigte Scanning-Mikrophotographie gezeigt. Zwei Quadratzentimeter aus synthetischem GortexTM wurden dampfsterilisiert, in sterilen 35 mm Petrischalen für Bakteriologie angeordnet und mit sterilen Edelstahl-Gittern mit einem Gitterabstand von einem Zentimeter bedeckt. CD59-infizierte PAEC wurden dann in die zentralen Gitterflächen mit einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen in einem Volumen von 0,5 ml Kulturmedium, wie oben beschrieben, angeimpft und bei 37 °C in 5% CO₂ inkubiert. Nach zwei Tagen wurde den Kulturen Medium wieder zugeführt und nach zusätzlichen zwei Tagen wurde das Medium abgesaugt und die Kulturen wurden mit PBS gewaschen und dann mit gepuffertem 2 Glutaraldehyrd, 4% Paraformaldehyd für 1 Stunde fixiert. Die Gitter wurden dann entfernt und das GortexTM wurde vorbereitet für Scanningelektronenmikroskopie. 6 zeigt, dass PAEC, die humanes Zelloberflächen-CD59 exprimieren, sowohl an synthetische Gortex^TM-Implantate als auch normale Endothelialzellen binden.
Im Hinblick auf ihre biologische Wirkung wurden CD59-infizierte PAEC auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Cytolyse durch Komplement in Humanserum untersucht. Um dies durchzuführen, wurden CD59-infizierte PAEC, Kontroll-PAEC, nur mit Vektor infiziert, und nicht infizierte PAEC in Gewebekulturschalen mit 48 Vertiefungen bei einer Dichte von 1,25 × 10⁵ Zellen/Vertiefung in DMEM mit 10% FBS, 2 mM Glutamin und P/S plattiert. Das Kulturmedium wurde entfernt und die Zellen wurden dreimal mit Medium ohne FBS gewaschen. Als nächstes wurde humanes-Serum, verdünnt in DMEM in verschiedenen Konzentrationen, zu den Kulturen für 2 Stunden bei 37°C gegeben. Der Prozentanteil lebensfähiger Zellen, die in den Kulturen verbleiben, wurde beurteilt durch Färben der Zellen mit 0,1% Trypanblau. 7 zeigt, dass mehr als 80 nicht-infizierte oder Kontroll- (nur mit Vektor infiziert) PAEC durch humanes Serum abgetötet wurden, während weniger als 10% CD59 infizierte PAEC abgetötet wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Expression von humanem CD59 auf der Oberfläche von Schweineendothelialzellen diese Zellen vor der cytolytischen Wirkung von Antikörper und humanem Serum schützt, wodurch nahegelegt wird, dass diese Zellen in vivo vor Komplement-vermittelter hyperakuter Abstoßung geschützt sein würden.
Beispiel 3: Disurption des invariante Kette-Gens durch homologes Rekombinationsgentargeting
Dieses Beispiel zeigt, dass das invariante Kette-Gen disrupiert werden kann in Mausembyronalstammzellen durch sein spezifisches und stabiles Ersetzen in dem Genom durch eine mutierte und nicht-funktionelle Form des invariante Kette-Gens, und dass Austausch des nativen invariante Kette-Gens durch eine nichtfunktionelle Mutante erreicht werden kann in einer gegebenen Zelle durch Gentargetingtechnologie, welche den Vorteil eines homologen Rekombinationsereignisses zwischen dem mutierten Gen und dem nativen invariante Kette-Gen benutzt. Eine Partialrestriktionsenzymkarte für das invariante Kette-Gen aus Maus ist in 8B gezeigt. Verdau von Maus-Genom-DNA mit dem Restriktionsenzym Dralll sollte ein invariante Kette-Gen-Fragment von ungefähr 8,7 kb erzeugen, wenn diese DNA durch Southern Blots mit einer radioaktiv markierten Sonde, die spezifisch für das invariante Kette-Gen aus Maus ist, sondiert wird. Dieses Ergebnis wird erhalten und gezeigt in 9 (Spur identifiziert als Elternzellen).
Um das invariante Kette-Gen aus Maus durch homologe Rekombination zu disrupieren, wurde ein Gentargetvektor aufgebaut, um eine Sequenz des invariante Kette-Gens zwischen den Nukleotiden 661 und 1064 durch das Neomycingen zu ersetzen. Diese genetische Veränderung führt zu der Eliminierung des Hauptteils von Exon 1, einschließlich des Translationsinitierungscodons ATG, und einem großen Teil des Promotors, einschließlich der TATA-Box und CAAT-Box, welche als Regulationselemente wirken, die erforderlich sind für genaue und effiziente Transkription des invariante Kette-Gens, wie von Zhu und Jones, 1989, in "Complete sequence of the murine invariant chain (Ii) gene" Nucleic Acids Res. 17: 447–448 berichtet. Dieser Gentargetvektor ist in 8A als ein Hauptbeispiel der Disruptionsstrategie gezeigt. Durch Deletieren dieser Region des invariante Kette-Gens wird die gesamte Expression dieses Gens, einschließlich Transkription und Translation, eliminiert sein. Es folgt daher, dass die Expression von Klasse II MHC-Genprodukten disrupiert sein wird.
Austausch des nativen invariante Kette-Gens durch das mutierte invariante Kette-Gen wurde in Mausembryonalstammzellen gezeigt. Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) wurden routinemäßig nach Bedarf passagiert in ES-Wachstumsmedium, enthaltend DMEM (viel Glukose) mit 15% PBS und 0,1 mM 2-Mercaptoethanol. Die ES-Zellen wurden auf einer konfluenten Schicht primärer Embryonenfibroblasten gehalten. Zwei Tage vor der Transfektion der ES-Zellen mit dem Gentargetingvektor wurden die Zellen in Kultur expandiert. Um diese Zellen zu transfizieren wurden 25 μg DNA, die dem Invarianten Kette-Targetvektor entspricht, in 1 × 10⁷ ES-Zellen durch Elektroporation eingebracht, unter Verwendung eines BioRad Elektroporators der auf 250 μF und 0,32 kV eingestellt war. Die ES-Zellen wurden dann auf 10 × 100 mm Nunc^TM-Gewebekulturschalen angeimpft und stabile Transfektanten wurden selektiert hinsichtlich chromosomaler Integration mittels Neomycinresistenz in G418 (170 μg/ml) und/oder Gangcyclovir in einigen Versuchen, worin das Herpes Simplex Virus-Thymidinkinasegen in dem Targetvektor enthalten war.
Nach 14 Tagen in Selektionsmedium wurden einzelne Neomycin resistente Kolonien selektiert und auf Versorgungsschichten konfluenter embryonaler Fibroblasten propagiert. Genom-DNA wurde aus 55 einzelnen stabilen Transfektanten isoliert und über Nacht mit entweder den EcoRI- oder DralII-Restriktionsendonukleasen verdaut. Verdaute DNA wurde durch Elektrophorese aufgetrennt, geblottet auf GeneScreen+^TM Nylonmembranen und dann mit einer radioaktiv markierten DNA-Sonde hybridisiert, die spezifisch für das Invariante Kette-Gen aus Maus ist. Das Muster der Hybridisierungsbanden für zwei unabhängige Klone, 11.10.93 und 11.10.128, gezeigt in 9, ist übereinstimmend mit der Mutanten-Form des Invarianten Kette-Gens (worin Exon 1 disrupiert wurde durch Neomycin-Gensequenzinsertion) worin das endogene Invariante Kette-Gen homogen rekombiniert und ersetzt ist. Das beobachtete Muster des Restriktionsnukleaseverdaus ist diagrammartig in 8C angegeben. Die Rekombinationshäufigkeit wurde als 2 in 55 Klonen bestimmt. Diese Daten zeigen daher, dass dieser Targetvektor das native zelluläre invariante Kette-Gen disrupieren kann.
SEQUENZAUFLISTUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER: Sims, Peter J. Bothwell, Alfred L. M. Elliott, Eileen, A. Flavell, Richard A. Madri, Joseph Rollins, Scott Bell, Leonard Squinto, Stephen
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: UNIVERSELLE DONORZELLEN
(iii) SEQUENZANZAHL: 4
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Kilpatrick & Cody
(B) STRASSE: 1100 Peachtree Street, Suite 2800
(C) STADT: Atlanta
(D) STAAT: Georgia
(E) LAND: U. S.
(F) ZIP: 30309–4530
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUM TYP: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) DERZEITIGE ANMELDERDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: US
(B) EINREICHUNGSDATUM:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) ANWALT/VERTRETERINFORMATION
(A) NAME. Pabst, Patrea L.
(B) REGISTRIERNUMMER: 31,284
(C) REFERENZ/VERZEICHNISNUMMER: OMRF135
(ix) TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: 404-815-6500
(B) TELEFAX: 404-815-6555
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 1:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 2124 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGART: Einzel
(D) Topologie: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK: GenBank HUMCD46Q
(B) KLON: HUMCD46 cDNA

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 2:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 2847 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGART: Einzel
(D) Topologie: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(vi) URPSURNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK: GenBank HUMFAF; HUMDAFC1
(B) KLON: Human DAF cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: diverse Merkmale (misc_feature)
(B) LOKALISIERUNG: 1..819
(D) ANDERE INFROMATION: /Anmerkung = "HUMDAFC1 (Promotor und 5'-Ende von Exon 1, Genomsequenz)

(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 2:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 3:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 103 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: Einzel
(D) Topologie: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(v) FRAGMENTTYP: N-terminal
(vi) URSPRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(B) KLON: CD59

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 3

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 4:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 315 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGART: Einzel
(D) Topologie: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(vi) URPSURNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(B) KLON: CD59

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 4

Claims

Genetisch veränderte Säugerzelle zur Transplantation in einen Menschen oder ein Tier, worin die Zelle auf ihrer Oberfläche keine Proteine exprimiert, die entweder durch Klasse I Haupthistokompatibilitätskomplexgene oder Klasse I Haupthistokompatbilitätskomplexgene codiert werden, welche eine T-Lymphozyten-vermittelte Reaktion gegen die Zelle auslösen, und worin die Zelle ein stabil eingebautes Nukleotidmolekül exprimiert, das für ein Protein codiert, das einen Komplement-vermittelten Angriff der veränderten Zelle inhibiert, wenn sie in ein Lebewesen einer anderen Spezies oder ein anderes Individuum eingebracht wird.
Zelle nach Anspruch 1, worin das Nukleotidmolekül für ein Protein codiert, das einen Komplement-vermittelten Angriff in der gleichen Spezies wie der Spezies, von welcher die Zelle stammt, inhibiert und worin das Nukleotidmolekül an einem unterschiedlichen Locus lokalisiert ist wie das natürlich auftretende Gen, das das gleiche Molekül innerhalb der Zelle codiert.
Zelle nach Anspruch 1, worin der Promotor des Gens, das für einen Proteininhibitor eines Komplement-vermittelten Angriffs auf die das Gen enthaltende Wirtszelle codiert, verändert ist, um die Expression des Gens innerhalb der Wirtszelle zu erhöhen.
Zelle nach Anspruch 1, worin das Protein, das einen Komplementvermittelten Angriff inhibiert, ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus CD59, CD46 und CD55.
Zelle nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Endothelialzellen, Fibroblasten, Epithelzellen, Skelett-, Herz- und glatten Muskelzellen, Häpatocyten, Pankreasinselzellen, Knochenmarkszellen, Astrocyten und Schwann'schen-Zellen.
Zelle nach Anspruch 1, worin die Zelle nicht menschlichen Ursprungs ist, das Komplement-inhibierende Protein ein menschliches Protein ist und die MHC-Klasse II-Gene ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus der Zellspezies, die äquivalent HLA DP, DR und DQ ist.
Zelle nach Anspruch 1, worin die Zelle nicht menschlichen Ursprungs ist, das Protein, das Komplement-vermittelten Angriff inhibiert, ein menschliches Protein ist und die MHC-Klasse I-Gene ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus der Zellspezies, die äquivalent HLA A, B und C ist.
Zelle nach Anspruch 1, worin die Zelle die Klasse-II-MHC-Proteine als ein Ergebnis einer Disruption des Invarianten Kettengens der Klasse II MHC-Gene nicht exprimiert.
Zelle nach Anspruch 1, worin die Zelle die Klasse-I-MHC-Proteine als ein Ergebnis einer Disruption des β2-Mikroglobulingens nicht exprimiert.
Zelle nach Anspruch 1, weiterhin umfassend ein Nukleotidmolekül, welches durch die Zelle exprimiert wird und welches für ein Protein codiert, welches in der Gegenwart einer ausgewählten Verbindung zum Zelltod führt.
Zelle nach Anspruch 10, worin das Nukleotidmolekül für bakterielle Cytosindeaminase codiert.
Zelle nach Anspruch 1, worin die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Zellen, die ihren Ursprung bei Mensch, Rind und Schwein haben.
Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 6 bis 12, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus hämatopoetischen Vorläuferzellen, Nachkommen von hämatopoetischen Vorläuferzellen und den reifen Blutzellen.
Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin die Zelle ein Nukleotidmolekül exprimiert, welches für ein therapeutisches Mittel codiert, welches durch die Zelle sekretiert wird und worin die Zelle das Molekül normalerweise nicht exprimiert, das Molekül vom gleichen Promotor exprimiert oder das Molekül aus mehreren Loci exprimiert.
Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 14, die auf ihrer Oberfläche mehr oder gleich 10³ CD59-Moleküle/Zelle oder mehr oder gleich 1 Molekül CD59-Antigen/μm² Plasmamembranoberfläche exprimiert.
Zelle nach Anspruch 14, worin die Zelle eine mikrovaskuläre Endothelialzelle ist.
Zelle nach Anspruch 1, welche eine Mauszelle ist.
Zelle nach Anspruch 17, worin die Zelle die Klasse II MHC-Proteine als Ergebnis einer Disruption des Invarianten Kettengens der Klasse II MHC-Gene nicht exprimiert.
Zelle nach Anspruch 17, worin die Zelle die Klasse 1 MHC-Proteine als Ergebnis einer Disruption des β2-Mikroglobulingens nicht exprimiert.
Transgene Maus, enthaltend eine der Zellen nach den Ansprüchen 17 bis 19.
Organ einer transgenen Maus, wobei das Organ aus Zellen nach einem der Ansprüche 17 bis 19 gebildet ist.
Prothese zur Implantation in ein Tier oder einen Menschen mit Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 16, die daran gebunden sind.
Prothese nach Anspruch 22, worin die Prothese ein Gefäßimplantat ist und die Zellen mikrovaskuläre Endothelialzellen sind.
Verfahren zur Reendothelialisierung eines freigelegten Blutgefäßes ex vivo, umfassend das Applizieren von Zellen nach Anspruch 16 oder der Prothese nach Anspruch 23 auf das Gefäß.
Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 16 oder ein Organ nach Anspruch 21 oder eine Prothese nach den Ansprüchen 22 oder 23 zur Verwendung in der Medizin.
Verwendung der Zellen nach Anspruch 16 oder der Prothese nach Anspruch 22 bei der Herstellung eines Mittels zur Reendothelialisierung eines denudierten Blutgefäßes.