DE69226775T2 - Dns-sequenzen von hpv42 papillomavirus :verwendungsmöglichkeit für diagnose - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Ethanol auf biologischem Wege.
• Das Verfahren zum Herstellen von Ethanol durch Fermentation von Vollkorn-Maischen ist wohlbekannt.
• In Biomass 16 (1988), 77-87, ist gezeigt worden, daß die Zugabe von alkalischen Proteaseenzymen zu Maische Amino-Stickstoff in ausreichender Weise erhöht, um beschleunigte Raten einer Ethanolfermentation zu unterstützen: Die Zugabe einer Protease, einer von Streptomyces griseus abgeleiteten alkalischen Protease, zu Sorghum- oder Milo-Maische führte zu höheren Ethanolfermentationsraten.
• Das kanadische Patent 1 143 677 beschreibt ein Verfahren zum Herstellen von Ethanol aus stärkehaltigem Ausgangsmaterial, wie Weizen, Gerste oder Roggen. Dieses Verfahren umfaßt eine Stufe eines Hydrolysierens von Stärke, Cellulose und einigen anderen Substanzen, die in den Getreidekörnern enthalten sind, in Gegenwart eines komplexen hydrolytischen Enzyms, das durch einen Pilz Trichoderma koningii produziert wird und C&sub1;-Enzym, Endo- und Exoglucanase, Cellobiase, Xylanase, β-Glucosidase, Protease und eine Anzahl von amylolytischen Enzymen enthält.
• Jedoch ermöglichen diese Verfahren nicht die Herstellung von Ethanol, wenn ein höherer Trockensubstanzgehalt der Maische in dem Fermenter vorliegt.
• Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, bei dem die Rate der Ethanolproduktion erhöht ist und in welchem Hefe Maische in Gegenwart eines höheren Gehalts der Maische an Trockensubstanz mit hochgradig gelösten Feststoffen in dem Fermenter fermentieren kann, und höhere Ethanolkonzentrationen zu erhalten.
• Die Erfindung betrifft bestimmte DNA-Sequenzen, die von dem Genom des Papillomavirus HPV42 abgeleitet sind, einschließlich der dessen vollständigem Genom entsprechenden Sequenz, wie auch rekombinante DNAs, insbesondere Vektoren, die die Gesamtheit oder einen Teil dieser DNA-Sequenzen, die Strukturproteine dieser Papillomaviren oder Teile dieser Proteine kodieren, enthalten. Die Erfindung betrifft gleichfalls Zellkulturen, die mit den genannten rekombinanten DNAs unter Bedingungen transformiert worden sind, die es erlauben, gegebenenfalls die entsprechenden, vom Genom von HPV42 abgeleiteten Sequenzen in Form der entsprechenden Proteine zu exprimieren. Die Erfindung betrifft schließlich Diagnosekits, die bestimmte der vorstehend definierten Produkte oder jene, deren Beschreibung folgt, einsetzen, und deren neue Anwendungen insbesondere bei der Unterscheidung zwischen gutartigen Genitalepithelläsionen und Läsionen vom Karzinomtyp oder Präkarzinomtyp, die durch Papillomaviren induziert werden.
• Die meisten der 60 oder mehr verschiedenen Typen humaner Papillomaviren, die bis heute identifiziert worden sind, sind sämtlich epitheliotrope Viren, von denen angenommen wird, daß sie für die Induktion von abnormalem Wachstum des infizierten Gewebes verantwortlich sind (1, 39). Gemäß ihren Gewebespezifitäten und ihrem jeweiligen Vorherrschen in malignen oder gutartigen Tumoren werden die Typen humaner Papillomaviren (HPV) in unterschiedliche Gruppen unterteilt, beispielsweise in Gruppen mit geringem Risiko (HPV 6,11) (2, 3), mit hohem Risiko (HPV 16, 18, 31, 33, 39, 57) (1, 4-8), Genital-HPV5 und mit Epidermodysplasia verruciformis assoziierte HPV5 (HPV 5, 8, 19, 25, 47) (1, 9-11) u. s. w. Um deren gegenseitige Verwandtschaft besser zu verstehen und im Notfall die Natur von deren Gewebespezifitäten zu ermitteln, ist auch vorgeschlagen worden, Sequenzvergleiche vorzunehmen. Aber die Versuche, Korrelationen zwischen bestimmten Eigenschaften des Virus und bestimmten für deren jeweilige Genome spezifischen Eigenschaften zu ermitteln, sind bis heute nicht erfolgreich gewesen. Die Demonstration der Schwierigkeit, solche Korrelationen zu ermitteln, wird besonders durch das Ergebnis der Sequenzuntersuchungen veranschaulicht, die an dem Papillomavirus HPV42 ausgeführt wurden, das bereits ausgehend von Vulvapapillomen dank der Verwendung einer DNA vom oralen HPV32-Typ (12) als Sonde unter Bedingungen niedriger Stringenz isoliert worden war (13). Gemäß dieser letztgenannten Veröffentlichung hat es sich herausgestellt, daß HPV42 in 3,5% der Genitalläsionen vorliegt, von denen die meisten histologische Charakteristika von Kondylomen oder flachen Papillomen aufweisen.
• Die Erfindung beruht auch auf der Entdeckung besonderer Sequenzen, die in HPV42 vorliegen, Sequenzen, die dessen Eigentümlichkeit ausmachen und die besonders genaue Nachweise von Papillomaviren des Typs HPV42 und Bestätigungen (oder Entkräftungen) von Ergebnissen von in vitro-Diagnostiken ermöglichen, die mit Sonden ausgeführt wurden, die DNA-Sequenzen enthalten, die von anderen Papillomaviren stammen. Diese Sequenzen oder Fragmente dieser Sequenzen können auch für die Erzeugung von besonders empfindlichen Hybridisierungssonden, insbesondere von Primern, die Analysen durch die als PCR bezeichnete Methode ermöglichen, verwendet werden.
• Im Folgenden wird Gebrauch gemacht von einer bestimmten Anzahl von Bemerkungen, die von englischen Ausdrücken abstammen. Sie wurden im Text belassen, um die Lektüre des Texts durch die Fachleute, denen diese Abkürzungen geläufig sind, zu erleichtern.
• Sie werden nachfolgend wiederholt und ihnen folgen die entsprechenden vollständigen englischen Ausdrücke und - in Klammern gesetzt
• - deren Übersetzungen in die französische Sprache:
• - NCR: non coding region (region non codante) [nicht kodierender Bereich];
• - ORF: open reading frame (phase de lecture ouverte) [offenes Leseraster];
• - PVF: papillomavirus-enhancer associated factor (site de liaison du facteur associé à 1'amplificateur de papillomavirus) [mit dem Papillomavirus-Enhancer assoziierter Faktor; Bindungsstelle für den mit dem Papillomavirus-Enhancer assoziierten Faktor];
• - GRE: consensus glucocorticoid responsive element (element consensus reagissant à un glucocorticoide) (Glucocorticoid-responsives Consensuselement];
• - bp: base pairs (paires de bases) [Basenpaare];
• - PCR: polymerase chain reaction (amplification par polymerisation de chaines) [Polymerase-Kettenreaktion];
• - nt: nucléotide [Nukleotid].
• Bevor mit der Beschreibung dieser Sequenzen oder Sequenzfragmente weiter fortgefahren wird, wird vorgeschlagen, den Stand der Technik kurz wiederzugeben und dann eine detaillierte Beschreibung des Genoms von HPV42 zu geben.
• Die folgende Darstellung erfolgt unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren, deren Legenden folgen:
• Fig. 1 : 1(a), 1(b), 1(c), 1(d), 1(e), 1(f), 1(g), 1(h), 1(i): Nukleotidsequenz des DNA-Strangs von HPV42, analog oder entsprechend der mRNA. Die Position 1 auf dem zirkulären Genom wurde durch Zuordnung im Rahmen eines Sequenzvergleichs (Alignment) zu den Positionen 1 von HPV11 und HPV39 bestimmt.
• Erste Nukleotide: +1, +1801, +3601 und +7201:
• Fig. 2: Verteilung der Initiationscodons (Startcodons) (nach oben weisende Balken) und der Stopcodons (nach unten weisende Balken) in den drei Leserastern von HPV42-DNA, der mRNA. Die ORFs wurden durch Vergleich mit anderen HPV-Typen identifiziert. Die Numerierung entspricht jener der Fig. 1.
• Fig. 3: Haupteigenschaften des nicht-kodierenden Bereichs (NCR). Es sind die folgenden Sequenzmotive des NCR, der sich von Nukleotid 7346 bis zu Nukleotid 113 (nt. 7346-113) erstreckt, aufgeführt. Es werden nachfolgend bestimmte Elemente spezifiziert, insbesondere Palindrome von 12 bp, die für das Papillomavirus spezifisch sind (nt. 7466, 7883, 44, 59); Polyadenylierungsstelle: nt. 7401; TATA-Box: nt. 6,74; CAAT-Box: nt. 15; konserviertes Promotorelement (AAAGGGAGTA): nt. 34; Bindungsstelle für den Kernfaktor 1 (NF1): nt. 7503, 7663, 7778, 7803; Bindungsstelle für den mit dem Faktor NF1 assoziierten Faktor (NFA): nt. 7552; Bindungsstelle für den mit dem Papilloma-Enhancer assoziierten Faktor (PVF): (nt. 7760).
• Das HPV42-Genom, das in dem Plasmid pSP64 vermehrt wurde, wurde durch Spaltung in zufällige Fragmente (Shotgun-Fragmentierung) in dem Phagen M13 subkloniert und durch die Didesoxy-Kettenabbruchmethode (14) sequenziert. Teile, die 93% des gesamten Genoms entsprechen, wurden ausgehend von jedem der Stränge erhalten und jedes der Nukleotide war Gegenstand von 5 Sequenzierungen. Die Abschnitte, hinsichtlich jener ein Zweifel bestehen blieb, wurden erneut in beiden Richtungen sequenziert, indem in beiden Richtungen synthetische Oligonukleotide, die als Primer verwendet wurden, eingesetzt wurden. Die lange Sequenz von 7917 bp (Fig. 1) hat einen GC-Gehalt von 39,5%. Das Nukleotid +1 wurde durch Zuordnung im Rahmen eines Sequenzvergleichs (Alignment) der Sequenz zu jenen der HPV vom Typ 11 und 39 definiert. Die bereits veröffentlichte Restriktionskarte (13) wurde bestätigt mit Ausnahme von zwei zusätzlichen Accl- Schnittstellen an den Positionen 895 und 943 auf beiden Seiten einer BglII-Schnittstelle.
• Die Sequenzanalyse, entsprechend den Rastern oder Phasen des offenen Leserasters (ORF), hat ergeben, daß die Organisation bewahrt wurde, die man bei sämtlichen Genomen von HPV findet (Fig. 2) (15, 39). Alle ORFs sind auf demselben DNA-Strang lokalisiert. Der Bereich E4 ist vollständig im Bereich E2 enthalten, wohingegen E1 wie auch die Bereiche L1 und L2 sich teilweise überlappen. Weder E4 noch E5 weisen ein ATG-Startcodon auf (Fig. 1, Tabelle 1). Sechs Polyadenylierungssignale (AATAAA) wurden im Genom lokalisiert. Zwei von diesen (nt. 4378, 7401) bestehen aus einer Reihe von Thymidinen und angrenzenden Purinen und einem CA-Dinukleotid (16, 17), die stromabwärts von den Gruppen früher bzw. später Gene, die funktionell miteinander verbunden sind, (im Englischen: "Cluster") angeordnet sind. Wahrscheinlich werden alle für die Polyadenylierung verwendet. Ein nicht-kodierender Bereich (NCR) von ungefähr 680 bp ist zwischen dem Stopcodon von L1 und dem Initiationscodon von E6 lokalisiert.
• Die allgemeinen Eigenschaften der NCR aller HPV sind in HPV42 gut konserviert (Fig. 3). Vier Kopien des Amplifizierungsmotivs ACCGNNNNCGGT sind auch hier in Abhängigkeit von E2 angeordnet (nt. 444, 59, 7466, 7883) (18, 19), Bindungsstellen für die Faktoren für die Transkription von NF1 (nt. 7503, 7663, 7778, 7803) (21, 22), NFA (nt. 7552) (20), ein Papillomavirus-Amplifizierungsprotein (NFA; nt. 7760) (20), zwei TATA-Boxen (nt. 6, 74), eine mutmaßliche CAAT-Box (nt. 15) wie auch ein konserviertes Promotorelement AAAGGGAGTA (nt. 34) (23) befinden sich in dem NCR. Es wurde in dem NCR kein Consensuselement, das ersichtlich auf ein Glucocorticoid anspricht, (GRE) lokalisiert (18, 19, 24). Man stellt wie bei HPV39 die Gegenwart eines GRE, das 3 Fehlpaarungen ("Mismatches") enthält, in dem ORF von L1 (nt. 6555) (8) bei HPV39 fest.
• Die Proteine E6 und E7 der HPV, die mit malignen Tumoren assoziiert sind, spielen bekanntermaßen eine entscheidende Rolle bei der Transformation der Zellen (25-28). Die Motive Cys-X-X-Cys, die die Form von "Zinkfingern" ("zinc-finger") aufweisen (29, 30) und deren Rolle als essenziell für die Transformation im Falle von HPV16 eingeschätzt wird (31), liegen viermal bzw. zweimal in E6 und E7 vor. Potentielle Donor-Spleißstellen (nt. 237) und Akzeptorstellen (nt. 412) in dem ORF von E6, die zu einer Transkription zu einer mRNA, die ein gespleißtes Protein E7, E6* kodiert, in der Lage sind, sind in HPV42 gut konserviert (32-34). Bis heute ist eine Spleißstelle lediglich in den HPV, die mit anogenitalen Krebserkrankungen assoziiert sind, identifiziert worden (6). Darüberhinaus ist das Zellteilungsmotiv des Proteins E7, das man mit dessen Transformationsfähigkeit assoziiert hat (31, 35-37), vollständig in HPV42 konserviert.
• Es konnte keinerlei ausgeprägte Sequenzhomologie zu anderen HPV-Typen, deren Sequenzen bekannt sind, nachgewiesen werden. Bei einer rechnerunterstützten Homologieanalyse wurden Homologien einer Größenordnung von 52 bis 56% mit den HPV vom Typ 6b, 11, 16, 18, 31 und 33 erhalten. Es handelt sich um Werte, die ausgesprochen niedrig sind, wenn man sie mit den Sequenzhomologien vergleicht, die man zwischen Viren derselben Untergruppe beobachten kann (4-11). Darüberhinaus weist HPV42, das man mit gutartigen Genitalläsionen in Verbindung bringt, Eigenschaften auf, die man bis heute lediglich von HPV kannte, die allein mit Karzinomen assoziiert sind; gleiches gilt bezüglich der Anwesenheit einer Stelle E6* und des in dem Protein E7 konservierten Zellteilungsmotivs. Darüberhinaus fehlt ein GRE, das in den NCR sämtlicher Genital-HPV-Sequenzen bis zum heutigen Tage vorliegt (8), im Gegenzug in dem NCR von HPV42. HPV42 kann folglich als erster sequenzierter Repräsentant einer neuen Gruppe humaner Papillomaviren angesehen werden.
• Aus dem Vorangegangenen folgt dementsprechend, daß die Organisation des Genoms bei HPV42 wie bei sämtlichen HPV5 konserviert ist. Trotz seiner Assoziierung mit gutartigen Genitalläsionen weist HPV42 Eigenschaften auf, die bis zum heutigen Tag allein entweder bei mit invasiven Karzinomen assoziierten HPV5 oder bei nicht-Genital-HPV5 gefunden wurden. Außerdem stellt man keinerlei ausgeprägte Sequenzhomologie von HPV42 mit den bekannten HPV fest. Die durch die Erfindung bereitgestellte Nukleotidsequenz beweist folglich die Identifizierung der Sequenz des ersten Typs einer neuen Untergruppe humaner Papillomaviren.
• Allgemein betrifft die Erfindung demnach gleichfalls jede rekombinante DNA, die die vorstehend genannte HPV-DNA oder Fragmente dieser HPV-DNA enthält, insbesondere Hybridisierungssonden, die aus diesen rekombinanten DNAs gebildet worden sind und speziell angepaßt sind für den Nachweis einer Infektion durch HPV42 oder eine Variante oder einen Subtyp dieses Papillomavirus. Diese Sonden können entweder selbst markiert oder auf Ebene bestimmter Nukleotide modifiziert werden, insbesondere hinsichtlich ihrer Paarung, direkt oder indirekt, mit einem unterscheidbaren Marker. Es versteht sich, daß in diesen Sonden die Abschnitte, die mit der Nukleotidsequenz, die der DNA des Papillomavirus entspricht und normalerweise aus einem Klonierungsvektor stammt, nicht verwandt sind, dergestalt sind, daß bei ihnen keine Gefahr besteht, daß sie unter strengen oder stringenten Bedingungen mit den anderen Nukleinsäuren hybridisieren, die gegebenenfalls in der Probe, die hinsichtlich ihres möglichen Gehalts an DNA des entsprechenden Papillomavirus oder einer seiner Varianten untersucht wird, enthalten sind.
• Das erfindungsgemäße Verfahren für die in vitro-Diagnose an einer zu untersuchenden biologischen Probe, die normalerweise von einem menschlichen Patienten stammt, hinsichtlich einer Infektion durch ein Papillomavirus, das eine Genitalneoplasie, insbesondere einen Zervix-, Vulva- oder Peniskrebs zur Folge haben oder ausgelöst haben kann, ist folglich gekennzeichnet durch das Inkontaktbringen einer Sonde, wie sie vorstehend definiert ist, mit den Nukleinsäuren dieser Probe, die gegebenenfalls vorab für die Sonde zugänglich gemacht worden sind, vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen und durch den Nachweis des Hybridisierungsprodukts, das zwischen der gesuchten viralen DNA, die gegebenenfalls in der Probe vorhanden ist, und der Sonde gebildet worden ist.
• Jede der erfindungsgemäßen Sonden oder die Mischungen, die die vorstehend genannte Sonde enthalten, können insbesondere, wie folgt, verwendet werden, wobei natürlich beabsichtigt ist, daß die beschriebenen Diagnoseassays nicht als Beschränkungen hinsichtlich der Einsatzbedingungen, unter denen diese Sonden oder Mischungen von Sonden tatsächlich eingesetzt werden können, aufgefaßt werden.
• In dem in Betracht gezogenen Beispiel handelt es sich beispielsweise um die Identifizierung eines HPV desselben Typs wie HPV42 in einer Biopsie, in Zellen, die durch Abschaben von Läsionen erhalten wurden, oder in Schnitten von Biopsien, die durch Carnoy- Mischung (Ethanol, Chloroform, Essigsäure 6 : 3 : 1) fixiert und in Paraffin eingeschlossen wurden. Die Überprüfung erfordert die vorab erfolgende Extraktion der DNA der Abstriche gemäß Verfahren, deren Prinzip bekannt ist, und setzt die Analyse dieser DNA durch Experimente molekularer Hybridisierung, die unter stringenten oder weniger stringenten Bedingungen ausgeführt werden, mittels radioaktiver Sonden (markiert mit 32P oder 35S), hergestellt ausgehend von HPV gemäß der Erfindung, oder von Mischungen von DNAs oder von HPVs, die diese enthalten, ein.
• Mehrere Hybridisierungsverfahren können eingesetzt werden. Man kann beispielsweise das Verfahren einer unter Verwendung von (Proben)Flecken erfolgenden Hybridisierung einsetzen. Dieses Verfahren umfaßt nach der Denaturierung der DNA die Abscheidung einer aliquoten Menge DNA auf Membranen (Nitrocellulose oder "Genescreenplus"), die Hybridisierung jeder Membran unter den üblichen Bedingungen mit einer Mischung von Sonden und den Nachweis der radioaktiven Hybridisierungsprodukte durch Exposition der Membranen in Kontakt mit einem Radiographiefilm. Man kann auch ein Replika-Hybridisierungsverfahren verwenden. Dieses Verfahren umfaßt die elektrophoretische Auftrennung der nach Behandlung der DNA durch Restriktionsenzyme erzeugten DNA-Fragmente auf einem Agarosegel, den Transfer der Fragmente nach alkalischer Denaturierung auf Membranen (Nitrocellulose, "Genescreenplus") und deren Hybridisierung unter üblichen Bedingungen mit der geeigneten Mischung von Sonden. Die Bildung radioaktiver Hybridisierungsprodukte wird nach Exposition der Membranen in Kontakt mit einem Radiographiefilm nachgewiesen.
• Die radioaktiven Sonden werden entweder durch HPV-DNAs, die durch das Nick-Translationsverfahren markiert worden sind, oder durch RNAs, die durch Transkription viraler DNAs, die in einen Vektor, beispielsweise vom Typ SP6, insertiert worden sind, hergestellt worden sind, gebildet. Die Verwendung radioaktiver Sonden weist den Vorteil einer großen Empfindlichkeit auf, aber dies schließt nicht die Verwendung von nicht-radioaktiven Sonden aus, beispielsweise von biotinylierten Sonden und solchen, die in der Lage sind, durch Antikörper erkannt zu werden, die entweder selbst markiert sind oder selbst durch Antikörper erkannt werden, die einen enzymatischen Marker, fluoreszierenden Marker, u. s. w. tragen.
• Die Erfindung betrifft gleichfalls kompetente Zellkulturen, die mit rekombinanten DNAs des vorstehend angegebenen Typs transformiert sind, insbesondere jene, in denen die Nukleotidsequenz, die der DNA entspricht, oder die DNA-Sequenz von HPV39 unter die Kontrolle von Transkriptions- und/oder Regulationselementen dieser Nukleotidsequenz in der Zellkultur gestellt ist.
• Darüberhinaus und unter Berücksichtigung der neu entdeckten Eigenschaften von HPV42 dessen Verwendung zum Bestätigen - oder Entkräften - einer in vitro-Diagnose eines potentiellen Karzinoms oder eines bereits existierenden Karzinoms, die erstellt wurde unter Verwendung - insbesondere unter den weiter oben ausgeführten Bedingungen - von Sonden, die HPVs einsetzen, die Eigenschaften aufweisen, die jenen von HPV42 ähneln, insbesondere auf Ebene ihrer OFRs von E6, E6* und/oder E7. Es handelt sich insbesondere um ein oder mehrere der folgenden HPVs: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV39 und HPV57.
• Die Erfindung betrifft folglich insbesondere in vitro-Diagnose- Kits, umfassend:
• - einerseits eine Sonde, die eine DNA enthält, die der Gesamtheit oder einem Teil der DNA von HPV42 oder einer DNA, die mit der Vorangehenden unter stringenten Bedingungen hybridisiert, entspricht,
• - andererseits mindestens eine Sonde, die eine DNA enthält, die der Gesamtheit oder einem Teil der DNA von mindestens einem der Papillomaviren HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV39 und HPV57 entspricht.
• Für den Fachmann zeigt sich klar, daß die Ausführung von Hybridisierungsassays, die unter den Bedingungen, die noch weiterhin angegeben werden, (insbesondere unter stringenten Hybridisierungsbedingungen) mit diesen Zusammenstellungen von Sonden ausgeführt werden, es dem Fachmann erlaubt, entweder eine Diagnose eines potentiellen oder bestehenden Karzinoms zu bestätigen oder zumindest zu nuancieren oder sogar eine solche Diagnose zu entkräften. Insbesondere kann die Diagnose eines potentiellen oder bestehenden Karzinoms bei der Annahme bestätigt werden, wo man ein Fehlen von Hybridisierung der Papillomavirus-DNA, die in dem Abstrich enthalten ist, der sie enthält, mit HPV42-DNA, aber ein positives Ergebnis in den Hybridisierungsassays mit einer der anderen DNAs des Kits feststellt. Im Gegenzug erlaubt eine positive Hybridisierung ebenfalls mit der HPV42-DNA, je nach Fall entweder eine pessimistische Diagnose dieses Typs zu nuancieren oder zu entkräften. Um eine klarere Diagnose zu erhalten, kann es erforderlich sein, die Hybridisierungsassays mit Sonden zu vervollständigen, die aus der HPV42-DNA stammende spezifischere Fragmente enthalten, insbesondere Fragmente, die die Gesamtheit oder einen Teil der Fragmente enthalten, die beispielsweise sich zwischen den jeweils nachfolgend angegebenen Endnukleotiden erstrecken: nt. 7342 bis nt. 870.
• Unter diesen Fragmenten gibt man häufig jenen den Vorzug, die insbesondere die Gesamtheit oder einen Teil der ORFs E6* oder E7 oder ferner die Gesamtheit oder einen Teil des NCR, der keine GRE- Stelle enthält und sich zwischen nt. 7342 und nt. 108, insbesondere von nt. 7556 bis nt. 7576 erstreckt, enthalten.
• Die Erfindung betrifft ferner Sequenzen von mindestens 15 Nukleotiden, die aus der Gesamtsequenz von HPV42 stammen oder von dieser abgeleitet sind, insbesondere von 20 bis 40 Nukleotiden, die als PCR-Primer eingesetzt werden können und Feinanalysen zur Identifizierung einer Papillomavirus-DNA durch Vergleich mit für Papillomaviren charakteristischen Nukleotidsequenzen ermöglichen. Bevorzugte Primer stammen von den Nukleotidsequenzen, die weiter oben angegeben worden sind. Diese Primer liegen in doppel- oder einzelsträngiger Form vor.
• In Zusammenhang mit dem Vorangegangenen betrifft die Erfindung folglich ein Verfahren, um in vitro die Gegenwart entweder einer Nukleinsäure, die HPV42 kodiert, oder einer mRNA nachzuweisen, wobei das Verfahren insbesondere die folgenden Schritte umfaßt:
• a) die biologische Probe, von der vermutet wird, daß sie eine mit HPV42 verwandte DNA enthält, die vorab für einen ersten Primer zugänglich gemacht worden ist, in Gegenwart von Nukleosidtriphosphaten und einem Induktionsmittel für die Polymerisation (je nachdem: Polymerase oder reverse Transkriptase) unter Bedingungen in Kontakt zu bringen, die die Hybridisierung zwischen diesen Primern und der gesuchten DNA ermöglichen, und ausgehend von diesen mit der mRNA oder cDNA hybridisierten Primern eine Polymerisation auszuführen, um einen Doppelstrang zu erzeugen, der aus dem Produkt der Verlängerung des Primers, hybridisiert entweder mit dem Strang der gesuchten Nukleinsäure oder mit der entsprechenden mRNA, sofern diese in der biologischen Probe vorliegen, gebildet wird,
• b) den in Schritt a) erhaltenen Doppelstrang dergestalt zu denaturieren, daß das Produkt aus der Verlängerung des Primers von der nachzuweisenden DNA oder mRNA "getrennt" wird,
• c) das erhaltene Produkt aus der Verlängerung mit einem zweiten Primer (in dem Sinne, den man weiter oben diesem Ausdruck zugewiesen hat) in Kontakt zu bringen, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die (1) zu jener des ersten Primers nicht komplementär ist und (2) komplementär zu einer Sequenz des vorher gebildeten Verlängerungsprodukts ist,
• d) gegebenenfalls die Stufen a) und b) und c) zu wiederholen in Gegenwart der im Überschuß eingesetzten ersten und zweiten Primer und der erforderlichen Reagenzien für die Erzeugung neuer Verlängerungsprodukte, die ihrerseits als Matrize für zusätzliche Synthesen verwendet werden, bis man eine ausreichende Menge erhält, um Verlängerungsprodukte der verwendeten Primer nachweisen zu können,
• e) die Gegenwart der für die Anwesenheit der DNA von HPV42 oder der entsprechendem RNA charakteristischen Verlängerungsprodukte nachzuweisen.
• Die Ausführung des vorstehend erläuterten Nachweisverfahrens wird ausgehend von einer biologischen Probe, die einem Patienten entnommen worden ist und beispielsweise durch eine Biopsie, ein Operationsteil, eine biologische Flüssigkeit gebildet wird, realisiert. Für weitere Einzelheiten, betreffend die Technik bezüglich des vorstehend beschriebenen Nachweisverfahrens, oder für die Ausarbeitung von Varianten dieses Verfahrens kann der Fachmann nützlicherweise auf Grundlagen zurückgreifen, die in den Patentschriften US- 4,683,202 und US-4,683,195 beschrieben worden sind.
• Was das für die PCR verwendete Protokoll oder allgemeiner das Protokoll, das für die Analysenmethode verwendet wurde, die auf einer Amplifizierung von von HPV42 stammenden genetischen Sequenzen beruht, betrifft, versteht es sich, daß die Ketten aus der Polymerisation umso länger sind, je größer die Übereinstimmung der nachgewiesenen Papillomavirus-DNA, zumindest auf Ebene des betreffenden Bereichs, mit dem Bereich von HPV42, von dem die Sonden stammen, ist.
• Die folgenden Tabellen geben noch weitere analytische Elemente an, die sich beziehen auf:
• - hauptsächliche Eigenschaften des HPV42-Genoms,
• - Ergebnisse aus vergleichender Analyse (Prozentsätze der Sequenzhomologie zwischen HPV42 und den Genomen anderer Papillomaviren).
• Schließlich wird am Ende dieser Beschreibung die Bibliographie der Veröffentlichungen, auf die im vorliegenden Text Bezug genommen worden ist, angegeben. TABELLE 1 HAUPTSÄCHLICHE EIGENSCHAFTEN DES GENOMS VON HPV 42
• : ausgehend von dem ersten ATG, mit Ausnahme von E4 und E5 TABELLE 2 VERGLEICHENDE ANALYSE DER GENOME VON HPVs
• Die Werte stellen Prozentangaben der Homologie nach Alignment mit dem Programm von Needleman und Wunsch (38) dar.
• n. t.: nicht bestimmt
• a: % Homologie der Nukleotide
• b: % Homologie, bezogen auf die Aminosäuren
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• 34. Smotkin, D. und Wettstein, F. O., Proc. Natl. Acad. Bei. USA 83, 460-4684 (1986).
• 35. Phelps, W. C., Yee, C. L., Münger, K. und Howley, P. M., Cell 53, 539-547 (1988).
• 36. Münger, K, Weness, B. A, Dysca, N., Phelps, W. C., Harlow, E. und Howley, P. M., EMBO J. 8, 4099-4105 (1989).
• 37. Figge, J. und Smith, T. F., Nature 334, 109 (1988).
• 38. Needleman, S. B. und Wunsch, C. D., J. Mol. Biol. 48, 443-450 (1970).
• 39. Kcotsky. L. A., Galloway, D. A. und Holmes, K. K., Am. J. Epidemiol. Rev. 10, 122-163 (1988).

Claims (12)

1. Von einem Papillomavirus HPV42 stammende DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen aus DNA, die durch die Nukleotidsequenz der Fig. 1 oder eines Fragments von jener mit mindestens 15 Nukleotiden gekennzeichnet ist, oder ferner aus einer entsprechenden DNA mit mindestens 15 Nukleotiden oder einem entsprechenden DNA-Fragment mit mindestens 15 Nukleotiden, die mit den Vorangehenden unter stringenten Bedingungen hybridisieren, besteht.

2. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß deren Sequenz einer von jenen, die nachfolgend durch die nachfolgend für deren jeweilige Endnukleotide angegebenen Positionen, Nukleotid 7342 bis Nukleotid 870, definiert sind, oder jedem beliebigen Fragment mit mindestens 15 Nukleotiden, das in dieser Sequenz enthalten ist, oder ferner jedem beliebigen DNA-Fragment mit mindestens 15 Nukleotiden, das mit den Vorangehenden unter stringenten Bedingungen hybridisiert, entspricht.

3. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz eine der folgenden Sequenzen enthält: Nukleotid 7342 bis Nukleotid 108, insbesondere von Nukleotid 7556 bis 7576.

4. DNA nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment einem der folgenden Gene von HPV42 entspricht: E1, E2, E4, L1, L2 oder der Gesamt heit oder einem Teil des intergenischen nicht-kodierenden (NC-) Bereichs.

5. DNA nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment einem der folgenden Gene von HPV42 entspricht: E6 oder E7.

6. DNA nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß deren Sequenz jener eines nichtkodierenden Bereichs (NCR), der sich zwischen den Nukleotiden 7342 und 108 erstreckt, oder jedem beliebigen Fragment mit mindestens 15 Nukleotiden, das in dieser Sequenz enthalten ist, entspricht und daß dieser NCR oder dieses Fragment keine Glucocorticoid-responsiven Consensuselemente ("consensus glucocorticoid responsive elements"; GRE) enthält.

7. Hybridisierungssonde, gebildet durch eine von der DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 6 abgeleitete DNA.

8. PCR-Primer, umfassend mindestens 15, vorzugsweise 20 bis 40 Nukleotide, wobei dieser Primer von einer der DNAs oder einem DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 6 abstammt.

9. in vitro-Nachweisverfahren für eine Infektion durch ein Papillomavirus des Typs HPV42 bei einer zu untersuchenden biologischen Probe, gekennzeichnet durch das Inkontaktbringen einer entsprechenden Sonde, wie sie in Anspruch 6 definiert ist, mit den Nukleinsäuren dieser Probe, die gegebenenfalls vorab für die Sonde zugänglich gemacht worden sind, vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen und durch den Nachweis des Hybridisierungsprodukts, das zwischen der gesuchten viralen DNA, die gegebenenfalls in der Probe vorhanden ist, und der Sonde gebildet worden ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die in vitro-Diagnostik auf den Nachweis von Kondylomen oder von flachen Papillomen, die zu Transformationen zu Karzinomen nicht imstande sind, ausgerichtet ist.

11. Diagnosekit, welcher die Bestätigung oder die Entkräftung einer in vitro-Diagnostik des potentiellen oder tatsächlichen karzinomischen Charakters einer Papillomavirus-Infektion ermöglicht, umfassend:

- einerseits eine Sonde, die eine DNA enthält, die der Gesamtheit oder einem Teil der DNA von HPV42 oder einer DNA, die mit der Vorangehenden unter stringenten Bedingungen hybridisiert, entspricht,

- andererseits mindestens eine Sonde, die eine DNA enthält, die der Gesamtheit oder einem Teil der DNA von mindestens einem der Papillomaviren HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV39 und HPV57 entspricht.

12. Anwendung von zwei verschiedenen Primern gemäß Anspruch 8 für den Nachweis und die Feinanalyse einer Papillomavirus-DNA, die in einer biologischen Probe enthalten ist, hinsichtlich ihrer Identität mit jener von HPV42, zumindest auf Ebene der entsprechenden Bereiche von deren jeweiligen genomischen DNAs oder ihrer jeweiligen Verwandtschaftsgrade.