DE69015261T2 - Verfahren zum Nachweis des humanen Papillomvirus. - Google Patents

Verfahren zum Nachweis des humanen Papillomvirus.

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Description

  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis spezifischer DNA-Abschnitte oder DNA- Regionen des humanen Papillomvirus (im folgenden als HPV bezeichnet). Diese Erfindung betrifft auch einen Nachweiskit, der bei diesem Verfahren zu verwenden ist,
  • Als ein Faktor beim Auftreten eines Cervixkarzinoms ist HPV in Betracht gezogen worden (M. Dürst et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 3812-3815, 1983). Es sind mehr als 50 Typen von HPV identifiziert worden, und in 40-60% der berichteten Fälle dieser Krankheit wurde HPV 16, in 10-20 % HPV 18 und in einem geringeren Prozentsatz andere Typen von HPV, am häufigsten HPV 33, nachgewiesen worden.
  • Ein Kultursystem zur Verwendung als Nachweisverfahren für HPV ist für solche Viren noch nicht entwickelt worden, und ein immunologischer Nachweis ist schwierig, weil die Produktion von Viruspartikel nicht nachgewiesen werden kann, wenn der Virus in der Form viraler DNA (d.h. nicht in Partikel gepackt) vorliegt. Aus diesen und anderen Gründen umfassen herkömmliche Nachweisverfähren hauptsächlich den Nachweis des viralen Gens selbst. Mit dem Southern-Hybridisierungsverfähren fanden M. Dürst et al., daß etwa 60% von Gewebeproben von Cervixkarzinomen DNA von HPV 16 oder HPV 18 enthalten. Die Empfindlichkeit des Nachweises durch Southern-Hybridisierung ist auf einem Pegel von 0,5-1,0 Kopien pro Zelle. Es wurde auch gefünden, daß die DNA von HPV in Geweben von Cervixkarzinomen in das humane Genom integriert ist. Dazu kommt noch, daß die integrierte HPV-DNA in der Regel eine große Zahl von Deletionen aufweist, und es wurden viele Fälle gefünden, in welchen die einzigen Regionen, welche eine vollständige Konservierung des Originals sind, die Gene E6 und E7 sind (Schwarz et al., Nature, 314, 111-114, 1985).
  • Mit der Southern-Hybridisierung, dem Verfahren, welches derzeit für den Nachweis von HPV- DNA verwendet wird, ist ein Nachweis nicht möglich, sofern nicht mindestens 1 pg HPV-DNA vorhanden ist. Dieses Nachweisverfahren wird auch durch die Notwendigkeit für mindestens etwa 100 mg Gewebeprobe eingeschränkt.
  • Im Vorkrebsstadium, jenes einer intraepithelialen Cervixneoplasie (CIN) gibt es ein Fortschreiten durch die Stadien CINI zu CINII und dann zu CINIII, bevor das Karzinomstandium erreicht wird. In Biopsien, die von Vorkrebsgewebe genommen wurden, kann nur eine kleine Probenmenge erhalten werden, und mit den derzeit angewendeten Nachweisverfahren ist ein Nachweis in diesen Proben oft schwierig.
  • Kürzlich ist die Polymerasekettenreaktion (PCR) als hochempfindliches Verfahren für eine genetische Diagnose entwickelt worden (Methods in Enzymology, 155, 335-350, 1987).
  • Das PCR-Verfahren kann angewendet werden, einzig und allein das Ziel-Gen enzymatisch und auf eine spezifische Weise zu amplifizieren, so daß es zum Nachweis des Ziel-Gens brauchbar ist, wobei eine hohe Spezifität schon bei einer geringen Probenmenge gegeben ist.
  • Im PCR-Verfahren ist das verwendete Enzym zum Beispiel das wärmebeständige Enzym Taq- Polymerase, und die Amplifizierung wird erzielt durch einen Zyklus des Denaturierungsschrittes der DNA bei 94ºC, gefolgt vom Aufschmelzschritt der Primer-DNA bei 55ºC und dem Schritt einer enzymatischen Synthese von Ketten komplementärer DNA bei 72ºC, welcher Zyklus bei diesen Temperaturen so oft wiederholt wird, bis eine exponentielle Amplifizierung des Ziel-Gens erreicht wird.
  • Durch 25malige Wiederholung des Temperaturzyklus wird die Ziel-DNA beispielsweise ungefähr 100 000mal amplifiziert. Dieses PCR-Verfahren ist zum Nachweis von HPV-DNA bei hoher Empfindlichkeit von einer Spurenmenge einer Probe äußerst brauchbar.
  • Der Nachweis von HPV-DNA unter Anwendung von PCR ist aus den Berichten von Melchers et al. (Journal of Medical Virology, 27, 329-335, 1989), Tidy et al. (Lancet, 1, 434, 1989), Shibata et al. (Laboratory Investigation, 59, 555-559, 1988), Young et al. (British Medical Journal, 298, 14-18, 1989), Hertz et al. (japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 128800/89) und von Morris et al. (WO88/06634) bekannt.
  • Beim Nachweis von HPV-DNA in einem Gewebe eines Cervixkarzinoms, welche DNA in das humane Genom integriert worden ist, ist ein Nachweis der DNA-Regionen E6 und E7, welche im humanen Genom als Ganzes konserviert sind, am besten geeignet. Die höchste Empfindlichkeit, die mit dem PCR- Verfahren möglich ist, wird mittels theoretischer Berechnung als Nachweis von 10&supmin;&sup6; pg HPV-DNA gefünden, aber um diese maximale Empfindlichkeit zu erzielen, ist es ein Erfordernis, daß die am besten geeignete Region der viralen DNA für die Amplifizierung gewählt wird.
  • Damit jeder Typus von HPV typenspezifisch identifiziert werden kann, ist es daher notwendig, ein Primerpaar zur Amplifizierung auszuwählen, welches typenspezifisch ist, und Sonden auszuwählen, die typenspezifisch sind und zum Nachweis verwendet werden.
  • Dazu kommt noch, daß zur Amplifizierung und zum Nachweis der gewählten Region oder Regionen das gewählte Primerpaar und die gewählten Sonden für den exakten Nachweis der Anwesenheit von HPV in klinischen Proben geeignet sein müssen.
  • Im oben erwähnten Bericht von Melchers et al. waren die gewählten Regionen L1 und E1-E2. Wie oben beschrieben, können die Regionen von HPV-DNA, die anders sind als E6 und E7, Deletionen aufweisen, wenn sie in das humane Genom integriert sind, und daher besteht die Gefahr, wenn die Regionen L1 und E1-E2 als die zu amplifizierenden Regionen während der Detektion von HPV gewählt werden, eines negativen Ergebnisses in Fällen, in welchen HPV tatsächlich vorhanden ist.
  • In den von den Gruppen von Tidy, von Shibata und von Young veröffentlichten Arbeiten waren die zur Amplifizierung gewählten Regionen E6 und/oder E7, aber der Nachweis von HPV in normalen Cervix-Gewebeproben war hoch, und zwar 30-84%. Die Häufigkeit des Auftretens des Typus 16 und des Typus 18 von HPV in normalem Cervixgewebe ist etwa 10% (Lancet 1, 703-705, 1987). Die Verfahren zum Nachweis von HPV dieser drei Gruppen, die oben erwähnt sind, wird wahrscheinlich zu Problemen führen, wenn es notwendig ist, zwischen gesundem und krankem Gewebe bei der klinischen Anwendung dieser Verfahren zu unterscheiden.
  • Die oben zitierten Patentanmeldungen der Gruppen von Hertz und von Morris erwähnen die Prüfüng klinischer Proben nicht.
  • Das Ziel dieser Erfindung bestcht darin, ein Verfahren zum Nachweis von HPV-DNA zur Verfügung zu stellen und einen Kit zur Verfügung zu stellen, welcher dieses Verfahren anwendet, während welchem während des Nachweises der HPV-DNA der Typus des Virus eindeutig identifiziert wird und die amplifizierte Region der HPV-DNA mit hoher Empfindlichkeit amplifiziert wird; dieses Verfahren soll auch einen Standard für Entscheidungen über die Malignität von Cervixgewebe hinsichtlich der Frage bieten, ob ein Cervixkarzinom, ein Vorkrebszustand oder keines von beiden vorliegt.
  • Kurz gefaßt betrifft diese Erfindung zuerst ein Verfahren für den Nachweis von HPV 16, HPV 18, HPV 33 oder einer Kombination dieser Viren, welches Verfahren eine Amplifizierung unter Verwendung eines Oligonukleotid-Primerpaares anwendet, welche Primer aus mindestens einer DNA-Region bestehen, welche von einem Teil oder von der gesamten E6- oder E7-Region der Genome von HPV 16, HPV 18 und HPV 33 gewählt ist.
  • Die Erfindung betrifft zweitens einen Nachweiskit zum Nachweis durch Anwendung des oben erwähnten Verfahrens, welcher Kit dadurch gekennzeichnet ist, daß er eine Sonde für den Nachweis einer amplifizierten DNA und auch das Primerpaar zur Amplifizierung einer spezifischen DNA-Region oder spezifischer DNA-Regionen enthält.
  • Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis des humanen Papillomvirus HPV 16, HPV 18, HPV 33 oder jeder Kombination dieser Viren durch Amplifizierung von mindestens einer HPV- DNA-Region unter Verwendung eines Oligonukleotid-Primerpaares zur Verfügung gestellt, welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß die DNA-Region eine Struktur aufweist, die in den Formeln 1 bis 6 gezeigt ist: Region I Region II
  • Gemäß der Erfindung wird auch ein Kit zum Ausführen des Verfahrens der Erfindung zur Verfügung gestellt, welcher ein Primerpaar für die Amplifizierung einer spezifischen HPV-DNA-Region gemäß einer der Formeln 1 bis 6 und eine Sonde für den Nachweis der amplifizierten DNA umfaßt.
  • Um die verschiedenen oben erwähnten Probleme zu lösen, beinhalten die unternommenen Schritte die Auswahl einer DNA-Region oder von DNA-Regionen, die fiir HPV 16, HPV 18 oder HPV 33 spezifisch sind, innerhalb der Grenzen der DNA-Regionen E6 und E7, welche alte HPV-Gene sind, die ohne Fehler in humanen Zellen, die mit HPV infiziert sind, vorhanden sind; die Synthese einer Oligonukleotid- Primer-DNA, welche für die Amplifizierung von HPV-DNA durch Anwendung von PCR benötigt wird, die Isolierung zellulärer DNA aus humanen Zellen, welche mit HPV infiziert sind; und die Amplifizierung dieser Regionen mit PCR; es ist notwendig, Regionen zu wählen, welche für den Virustyp typenspezifisch sind und welche darüber hinaus eine hohe Nachweisempfindlichkeit besitzen.
  • Wir haben diese Erfindung mit der Erkenntnis gemacht, daß es möglich ist, HPV 16, HPV 18 und HPV 33 auf einfache Weise nachzuweisen und insbesondere ihre Anwesenheit in klinischen Proben genau nachzuweisen, indem ein Kit verwendet wird, welcher Primer und Sonden für die Amplifizierung und den Nachweis einer spezifischen Region und spezifischer Regionen des HPV enthält.
  • Diese Erfindung wird nachfolgend konkreter erklärt.
  • HPV 16, HPV 18 und HPV 33 werden vorher geklont, und ihre vollständigen Nukleotidsequenzen sind in Virology, 145, 181-185, 1985; Journal of Molecular Biology, 193, 599-608, 1987; und Journal of Virology, 58, 991-995, 1986 geoffenbart.
  • Innerhalb des Bereiches dieser E6-Region, wird die Region I, welche eine spezifische DNA-Region im HPV 16, HPV 18 und im HPV 33 ist, gewählt; auf die gleiche Weise wird innerhalb des Bereiches der E7-Region die Region II gewählt, welche in jedem dieser drei HPV-Typen eine spezifische DNA-Region ist. Tabelle I Gewählte Regionen in E6 und E7 von HPV 16, HPV 18 und HPV 33. Region
  • Für die Amplifizierung jeder dieser Regionen ist es notwendig, eine Oligonukleotid-Primer-DNA zu haben, welche ein Paar von Primer-DNAs ist, von welchen eine etwa 20 Reste der Abtastsequenz der amplifizierten Region vom 5'-Terminus besitzt, und von welchen die andere etwa 20 Reste der Antiabtastsequenz vom 3'-Terminus besitzt. Dieses Primerpaar sollte in der Lage sein, mit der vorher erwähnten, gewählten DNA-Region zu verschmelzen, und als ein Beispiel von ihnen kann die in Tabelle 2 gezeigte Primer-DNA unter Verwendung eines DNA-Synthetisierers synthetisiert und mittels HPLC gereinigt werden. Tabelle 2 Primerpaare für die Amplifizierung spezifischer Regionen von HPV 16, HPV 18 und HPV 33 Region
  • Es ist möglich, HPV-DNA zum Nachweis von Plasmiden, in welchen HPV geklont worden ist, von den Zellinien SiHa und HeLa, welche HPV-DNA enthalten, und von pathologischen Proben eines Cervixkarzinoms und von Vorkrebsproben zu reinigen. Jede der herkömmlichen Verfahren zur Reinigung von DNA aus Zellen oder Geweben kann angewendet werden. Es ist möglich, Proben der folgenden Arten zu verwenden: Proben von Operationen, Biopsie-Proben und Schmierproben von der Cervix, welche unter Verwendung eines Tupfers mit Baumwollspitze gewonnen werden; die Proben können durch Paraffinfixierung für die Prüfüng der pathologischen Proben des Cervixgewebes hergestellt werden.
  • Für das PCR-Verfahren sind ein Kit zur genetischen Amplifizierung, welcher die Taq-Polymerase enthält, und ein Gerät zur automatischen Genamplifizierung von Perkin-Elmer Cetus im Handel erhältlich, und mit ihrer Verwendung ist es möglich, das Primerpaar dieser Erfindung für die Amplifizierungsreaktion spezifischer DNA-Regionen zu verwenden.
  • Nach der Amplifizierung ist es möglich, zum Nachweis von HPV-DNA zum Beispiel eine Agarosegelelektrophorese, eine Punkthybridisierung und ähnliches anzuwenden.
  • Wenn die Punkthybridisierung angewendet wird, werden verschiedene HPV-Typen durch Wahl der Sonden-DNA, die für eine Region der DNA-Sequenz jedes HPV-Typus spezifisch ist, unterschieden.
  • Als Sonden-DNA kann jede Sonden-DNA, welche die oben angegebenen Anforderungen erfüllt, verwendet werden, und die in Tabelle 3 angegebenen Sonden sind Beispiele solcher Sonden. Tabelle 3 Sonden für den Nachweis von HPV 16, HPV 18 und HPV 33 Oligonukleotidsonden-DNA Region
  • Die DNA dieser Proben kann mit den gleichen, oben für die Primer-DNA erwähnten Verfahren synthetisiert und gereinigt werden. Die Sonden-DNA kann mit einem hohen Grad an Empfindlichkeit durch Markieren der Sonden-DNA nachgewiesen werden. Es kann jedes bekannte Verfahren zum Markieren angewendet werden, wie zum Beispiel das Markieren des 5'-Endes der Sonden-DNA mit ³²P unter Verwendung der T4-Polynukleotid-Kinase, in einem Isotopenmarkierungsverfahren und auch durch nicht- isotopische Markierungsverfahren, wie z.B. die enzymatische Markierung von Sonden-DNA, die Fluoreszenzmarkierung, die Markierung mit Biotin/Avidin oder durch den Einbau von Sulfongruppen in die Sonden-DNA, wie im Chemprobe-Kit (Takara), plus die Anwendung eines Antikörpers auf diese Gruppen, um die Sonde zu erkennen.
  • Um Nachweisgrenzen von HPV-DNA mit diesem Test zu ermitteln, kann die Matrizen-DNA- Probe, welche eine spezifische Menge von HPV-DNA enthält, mittels PCR amplifiziert und mittels Punkthybridisierung nachgewiesen werden. Die Matrizen-DNA-Probe kann durch Verdünnung von HPV- DNA aus geklonten Plasmiden mit Genom-DNA von normalem Cervixgewebe hergestellt werden.
  • Das Primerpaar und die Sonden dieser Erfindung können zum Nachweis von HPV-DNA, welche in einer Konzentration von 10&supmin;&sup6; vorliegt, verwendet werden, und es ist mit ihrer Verwendung möglich, mit hoher Empfindlichkeit die Regionen I und II in der DNA-Sequenz nachzuweisen, wodurch ein Nachweis von HPV 16, HPV 18 und HPV 33 mit hoher Empfindlichkeit ermöglicht wird.
  • Als Ergebnisse dieses Verfahrens und jene der Southern-Hybridisierung mit der gleichen Probe verglichen wurden, wurde tatsächlich gefünden, daß es mit unserem Verfahren möglich ist, HPV-DNA in der Probe nachzuweisen, welche durch Anwendung der Southern-Hybridisierung nicht nachgewiesen werden konnte. Es war möglich, HPV-DNA in 84% der Proben von Cervixkarzinomgewebe nachzuweisen, und es war möglich, HPV-DNA in 70% der Proben eines Vorkrebsgewebes in den Stadien CINI- CINIII nachzuweisen, wobei beide Raten hoch waren und ein Typifizieren der Viren möglich war.
  • HPV-DNA wurde in Proben eines Gewebes von normaler Cervix in 2% nachgewiesen, was eine geringere Rate ist als bei herkömmlichen Verfahren, so daß das Verfahren dieser Erfindung insbesondere dann nützlich ist, wenn ein Standard für den Nachweis einer Malignität im Cervixgewebe aufgestellt wird.
  • Das Primerpaar für die Amplifizierung der spezifischen DNA-Regionen dieses HPV und die Sonden für den Nachweis der amplifizierten DNA-Regionen können in Kit-Form zur Verfügung gestellt werden, und es ist mit der Verwendung des Kits möglich, humanes HPV 16, HPV 18, HPV 33 oder irgendeine Kombination von diesen einfach nachzuweisen. Zusätzlich können das Primerpaar, welches für die Amplifizierung der Regionen I und II gebraucht wird, im Kit in einem Gemisch zur Verfügung gestellt werden, und falls die zu testende Probe HPV-DNA besitzt, in welcher DNA von entweder der Region I oder der Region II eine Mutation durchgemacht hat, ist es möglich, die HPV-DNA zu amplifizieren, und wenn die klinischen Tests vorgenommen werden, ist es möglich, falsch negative Ergebnisse zu verhindern. Die Reagentien, die mit dem Kit zu verwenden sind, können in flüssiger Form sein, sie können aber auch in lyophylisierter Form vorliegen.
  • Die Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele detaillierter erklärt.
    • Beispiel 1 Amplifizierung und Nachweis der HPV-Regionen I und II mit dem PCR-Verfahren: (1-1) Herstellung von humaner Genom-DNA:
  • Zellen der humanen Cervixkarzinom-Zellinie SiHa enthalten 1-10 Kopien von DNA von HPV 16. HeLa-Zellen enthalten 10-50 Kopien von DNA von HPV 18. Diese Zellen wurden in 6 cm Kulturschalen getrennt kultiviert, wobei jede modifiziertes Dulbecco's Eagle-Medium (DMEM; Flow Laboratories) enthielt, welches 10% fötales Rinderserum (FBS; Flow Laboratories), 100 Einheiten/ml Streptomycin (Meiji Seika K.K.) und 100 Einheiten/ml Penicillin (Banyu Pharmaceuticals Co., Ltd.) enthielt. Als die Zellenzahl etwa 10&sup6; erreichte, wurde die Kultivierung gestoppt, und das Medium wurde entfernt. Die Zellen wurden mit 5 ml TE-Puffer (10 mMol Tris-HCl, pH 8,0, und 1 mMol EDTA), welcher 0,1 Mol NaCl enthielt, gewaschen, und dann wurden 5 ml 0,5% SDS den Schalen zugegeben, welche dann 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen wurden. Die Zellen wurden von den Schalen abgeschäbt und in Polystyrolröhrchen gesammelt. Den Röhrchen wurden 5 ml TE-Puffer zugegeben, welcher Protease K in einer Konzentration von 100 ug/ml enthielt, und die Röhrchen wurden 2 h bei 70ºC gehalten.
  • Fünf Milliliter eines Gemisches gleicher Mengen von Phenol und Chloroform wurden den Röhrchen zugegeben, welche dann leicht geschüttelt und bei 12 000 UpM in einem Rotor Nr. 3N (Tomy Seiko Co., Ltd.) 5 min zentrifugiert wurden. Der Überstand wurde erhalten. Ihm wurden 5 ml Chloroform zugegeben, und das Gemisch wurde leicht geschüttelt. Dann wurde erneut unter den gleichen Bedingungen zentrifügiert und der Überstand gewonnen.
  • Dem wäßrigen Überstand wurden 0,5 ml 3 Mol Natriumacetat in 10 ml Ethanol zugegeben, und das Gemisch wurde gründlich vermischt. Das Gemisch wurde 15 Minuten auf -70ºC gehalten und dann 10 Minuten bei 12 000 UpM im Rotor Nr. 3N zentrifügiert. Die Genom-DNA wurde als das Präzipitat erhalten.
  • Das Präzipitat wurde mit 80% Ethanol gespült und getrocknet. Dann wurde es in 1 ml sterilisiertem Wasser gelöst. Es wurden etwa 100 ug Genom-DNA erhalten.
  • Proben eines Cervixkarzinomgewebes, Kondylom acuminatum-Gewebes und normalen Cervixgewebes von Patienten, welche eine Hysterektomie eines Gebärmuttermyeloms durchmachten, wurden erhalten. Die Proben, welche jeweils 100 mg wogen, wurden mit einer Sezierschere in Stücke geschnitten, und es wurde den gleichen Arbeitsgängen wie oben gefolgt, mit einer Behandlung mit Protease K und dann mit Phenol und Chloroform, was etwa 100 ug Genom-DNA ergab.
    • (1-2) Synthese und Reinigung einer Oligonukleotid-Primer-DNA und Sonden-DNA:
  • Wenn spezifische DNA-Sequenzen von Gewebe mittels des PCR-Verfahren amplifiziert werden sollen, sind etwa 20 Basen der Abtastsequenz vom 5'-Ende der zu amplifizierenden Region und etwa 20 Paare der Antiabtastsequenz vom 3'-Ende der zu amplifizierenden Region zur Verwendung als die Oligonukleotid-Primer-DNA nötig. Auch zur Identifizierung der verschiedenen HPV-Typen mittels Hybridisierung wird Oligonukleotidsonden-DNA benötigt.
  • Die in den Tabellen 2 und 3 gezeigten Primer-DNA bzw. Sonden-DNA wurden mit einem DNA- Synthetisator (Applied Biosystems) synthetisiert, und nach der Entschützung wurde die DNA durch Ionenaustausch-HPLC auf einem TSK-Gel in einer DEAE-2SW-Säule gereinigt. Dann wurde sie auf einer Sep-Pak C18-Säule (Waters) entsalzt, und etwa 50 ug jeder DNA wurden erhalten.
    • (1-3) Amplifizierung der Regionen I und II von HPV 16 mittels des PCR-Verfahrens:
  • Von SiHa-Zellen und von HeLa-Zellen, zwei Proben eines Cervixkarzinoms von zwei Patienten, die mit HPV 16 infiziert waren, zwei Kondylom acuminatum-Proben von zwei Patienten, die mit HPV 6 oder HPV 11 infiziert waren, und zwei Proben von gesundem Cervixgewebe von zwei Patienten, an denen eine Hysterektomie vorgenommen worden war, wurde 1 ug Genom-DNA mittels der in (1-1) beschriebenen Verfahren gereinigt und in ein Röhrchen von 0,5 ml (Bio Bik) gegeben. Das Röhrchen wurde 10 Minuten auf 94ºC erhitzt, und dem Röhrchen wurden 10 ul einer Lösung, welche im Gene Amp-Kit (Perkin-Elmer Cetus) vorgesehen war, zugegeben, welcher ein 10x Amplifizierungspuffer (100 mMol Tris-HCl, pH 8,3, 500 mMol KCl, 15 mMol MgCl&sub2; und 0,1% (Gew./Vol.) Gelatin), 16 ul eines 1,25 mMol dNTP-Gemisches (dATP, dGTP, dCTP und dTTP), 1 ul eines 20 uMol p16-1-Primers, 1 ul eines 20 uMol p16-2R-Primers und 0,5 ul von 5 Einheiten/ul Tga-Polymerase war. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zugeben von sterilisiertem Wasser auf 100 ul gebracht.
  • Diesem Reaktionsgemisch wurden 100 ul Mineralöl (Sigma) zugegeben, und ein automatisierter Genamplifikator (Thermal Cycler; Perkin-Elmer Cetus) wurde für die Amplifizierungsreaktion verwendet.
  • Die Reaktion wurde 1 Minute bei 94ºC für die Denaturierung, 2 Minuten bei 55º zum Verschmelzen der Primer und 2 Minuten bei 72ºC für die Synthesereaktion fortgeführt. Dieser Zyklus wurde insgesamt 30mal wiederholt. Nach der Reaktion wurde das Mineralöl der oberen Schicht entfernt. Dann wurden 10 ul des Reaktionsgemisches mittels Gelelektrophorese auf einem Gemisch von 3% Nusieve GTG Agarose und 1% Sea-kem Agarose (FMC) analysiert. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt, und die DNA-Banden wurden geprüft. Es wurde amplifizierte DNA gefünden.
  • Eine Bande im Bereich von 140 Basenpaaren (Bp) wurde mit DNA von SiHa-Zellen und von Proben eines Cervixkarzinoms von Patienten, die mit HPV 16 infiziert waren, gefünden.
  • DNA von HeLa-Zellen, von Proben von Patienten mit Kondylom acuminatum und von Proben von normalem Cervixgewebe wurde nicht amplifiziert, so daß die DNA der Primer p 16-1 und p16-2R HPV 16 spezifisch amplifizierte.
  • Mit den gleichen Verfahren wurden die Primer p16-3 und p16-4R für die Amplifizierung der Region II verwendet. Es wurde eine amplifizierte DNA in der Region von 89 Bp in SiHa-Zellen und in Proben von Patienten mit Cervixkarzinom, welche mit HPV 16 infiziert waren, gefünden.
    • (1-4) Identifizierung des HPV-Typus unter Anwendung von Punkthybridisierung:
  • Das in (1-3) erhaltene Gemisch wurde 10 Minuten auf 94ºC erhitzt und dann rasch in einem Eisbad abgekühlt, so daß die DNA denaturiert wurde. Dann wurde 1 ml des Reaktionsgemisches auf eine Nylonmembran (Schleicher & Schell) punktförmig aufgetragen und mit ultraviolettem Licht von 254 nm 10 Minuten belichtet, um die DNA auf die Membran zu fixieren.
  • Diese Membran wurde in 10 ml Vorhybridisierungspuffer (5x Denhardt'sche Lösung, 5x SSC, 0,1% SDS mit 100 ug/ml DNA von Lachssperma) 2 Stunden bei 37ºC für die Vorhybridisierung gehalten.
  • Als nächstes wurde die Sonden-DNA pB16-1, welche am 5'-Ende mit ³²P markiert war, zugegeben, und eine Hybridisierung wurde für 2 Stunden bei 37ºC durchgeführt.
  • Unter Verwendung eines Megalabel Kit (Takara) zum Markieren der Sonde mit ³²P wurde die folgende Arbeitsweise ausgeführt. Zuerst wurde 1 ul der Sonden-DNA bei einer Konzentration von 10 pMol/ul mit 1 ul eines x10 Phosphorylierungspuffers, 5 ul von 10 uCi/ul [γ-³²P]ATP (Amersham) und 1 ul T4-Polynukleotid-Kinase (10 Einheiten) gernischt, und das Gemisch wurde durch Zugabe von 2 ul sterilisiertes Wasser auf 10 ul gebracht. Dann wurde das Gemisch 30 Minuten bei 37ºC reagieren gelassen. Nach der Reaktion wurde das Gemisch 10 Minuten auf 65ºC erwärmt, und dann wurden 2 ul des Reaktionsgemisches (etwa 10&sup8; cpm) bei der Hybridisierung verwendet.
  • Nach der Hybridisierung wurde die Membran 2mal jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur in der Waschlösung 1, welche 0,1% SDS in 2x SSC enthielt, gewaschen, und als nächstes 2mal jeweils 20 Minuten bei 55ºC in der Waschlösung 2, welche 0,1% SDS in 0,2x SSC enthielt, gewaschen. Die Membran wurde getrocknet und dann in eine Kassette gegeben, welche einen Röntgenfilm (Fuji-Film) enthielt. Die Kassette wurde 3 Stunden auf -70ºC gehalten, um den Film für die Autoradiographie zu exponieren.
  • Auf diese Weise erschienen Flecken, welche das Ergebnis einer Hybridisierung zwischen der amplifizierten DNA von den SiHa-Zellen und der Sonde pB16-1 und auch zwischen der amplifizierten DNA vom Cervixkarzinomgewebe, welches mit HPV 16 infiziert war, und der Sonde pB16-1 waren. Keine Hybridisierung wurde mit der DNA von HeLa-Zellen, von Gewebe von Kondylom acuminatum oder von gesundem Cervixgewebe gefünden.
  • Die Hybridisierung wurde auf die gleiche Weise unter Verwendung der Sonde pB33-I und der Sonde pB18-I vorgenommen. Es wurde keine Hybridisierung gefünden. Diese Ergebnisse zeigten, daß die Primer p16-I und p16-2R HPV 16 spezifisch amplifizierten, und auch, daß die Sonde pB16-I HPV 16 durch Hybridisierung mit ihr in einer spezifischen Weise nachweisen konnte.
  • Eine DNA der Region II von HPV 16, welche unter Anwendung der Primer p16-3 und p16-4R amplifiziert worden war, wurde mit der Sonde pB16-II spezifisch hybridisient.
    • (1-5) Nachweisempfindlichkeit von DNA von HPV 16, geprüft unter Verwendung der Regionen I und II von HPV 16:
  • Wir prüften die Nachweisgrenze von DNA von HPV 16 unter Anwendung der Regionen I und II in einem experimentellen Modellsystem, welches geklonte Plasmide anwendete. Das Plasmid war das Restriktionsfragment B von der Verdauung mit PstI, welches die Regionen E6 und E7 der HPV 16-DNA (1776 Bp; Journal of Virology, 58, 979-982, 1986) aufwies, eingebaut in die PstI-Stelle des Vektors pSV2neo (5,6 kB). Das Plasmid wurde als p16PstIB bezeichnet.
  • Die Länge der gesamten humanen Genom-DNA ist 3x10&sup9; Bp. Es wurden daher 10 Kopien von p16PstIB/Genom-DNA sein, dieses Plasmid wurde in Genom-DNA verdünnt, welche mit den Verfahren von (1-1) aus normalem Cervixgewebe erhalten wurde. In diesem Schritt wurden 245 pg P16PstIB mit 10 ug normaler Genom-DNA verdünnt. Dieses Gemisch wurde mit normaler Genom-DNA zehnfach verdünnt, und die Modell-Matrizen-DNA, in wekher 10 bis 10&supmin;&sup6; Kopien von p16PstIB pro Genom-DNA waren, wurde hergestellt. 1 ug Genom-DNA mit 10&supmin;&sup6; Kopien p16PstIB entsprachen etwa 10&supmin;&sup6; pg HPV- DNA, was grob ein Molekül war. Dann wurde 1 ug dieser Modell-Matrizen-DNA in den in (1-3) gezeigten Verfahren verwendet, um die Region I zu amplifizieren. Als nächstes wurden die Verfahren von (1-4) für die Punkt-Hybridisierung angewendet. Es wurden nicht mehr als 10&supmin;&sup6; Kopien/Genom-DNA gefünden. Es wurde der gleiche Empfindlichkeitsgrad gefünden, als die Region II auf die gleiche Weise geprüft wurde.
  • Diese Ergebnisse zeigten, daß es mit der Verwendung der Regionen I und II möglich ist, ein Molekül HPV-DNA (10&supmin;&sup6; pg) in einer Probe nachzuweisen, und daß das PCR-Verfahren für einen Nacheis mit äußerst hoher Empfindlichkeit angewendet werden kann.
    • (1-6) Amplifizierung und Nachweis der Regionen I und II von HPV 18 und HPV 33:
  • Es wurden die Amplifizierung und der Nachweis von HPV 18 und HPV 33 ausgeführt.
  • Als Matrizen-DNA wurde DNA (7,9 kB), welche die Regionen E6 und E7 von HPV 18 aufwies, in die Stelle EcoRI des Plasmids pBR322 von Escherichia coli eingebaut, was ein Plasmid ergab, welches als pHPV 18 (EMBO J, 3, 1151-1157, 1984) bezeichnet wird. Als Matrizen-DNA wurde gleichermaßen DNA (7,9 kB), welche die Regionen E6 und E7 von HPV 33 aufwies, in die Stelle BglII des Plasmids plink322 von E. Coli eingebaut, was ein Plasmid ergab, welches als pHPV33 (J. Virol., 58, 991-995, 1986) bezeichnet wird. Erneut wurde als Matrizen-DNA DNA (7,9 kB), welche die Regionen E6 und E7 von HPV 16 aufwies, in die Stelle EcoRI des oben erwähnten Plasmids pBR322 von E. coli eingebaut, was das Plasmid pHPV 16 ergab (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 3812-3815, 1983). Jede dieser Matrizen-DNAs wurde in einer Menge von 1 ng und mit 1 ug Genom-DNA verwendet, welche von SiHa-Zellen oder von HeLa-Zellen mit den Verfahren von (1-1) hergestellt wurde.
  • Mit den Verfahren von (1-3) wurde ein Reaktionssystem, welches die Primer-DNAs p18-1 und p18-2R oder noch p33-1 und p33-2R enthielt, die mit den Verfahren von (1-2) erhalten wurden, zur Amplifizierung verwendet. Mit den Verfahren von (1-4) wurde eine Punkt-Hybridisierung durchgeführt; in diesem Schritt wurde als Sonden-DNA pB18-I und pB33-I, welche wie in (1-2) beschrieben erhalten wurden, verwendet.
  • Als die Amplifizierung mit p 18-1 und p18-2R als die Primer vorgenommen wurde, hybridisierte die amplifizierte DNA von pHPV18 oder von HeLa mit der Sonde pB33-I, und Punkte erschienen.
  • Als die Amplifizierung mit p33-1 und p33-2R als die Primer vorgenommen wurde, zeigte nur pHPV33 einen Hybridisierungspunkt mit der Sonde pB33-I. Dies zeigte, daß, wenn die Primer-DNA für den entsprechenden Typus des Virus verwendet wurde, die DNA der Region I spezifisch amplifiziert wurde, und es war möglich, sie mit der geeigneten Sonden-DNA nachzuweisen.
  • Auf die gleiche Weise wurden verschiedene Matrizen-DNAs unter Anwendung eines Reaktionssystems amplifiziert, welches als die Primer entweder p18-3 und p18-4R oder noch p33-3 und p33-4R enthielt, welche mit den Verfahren von (1-2) erhalten worden waren; als die Sonden-DNAs wurden pB18- II und pB33-II, welche mit den Verfahren von (1-2) erhalten worden waren, verwendet, um die Region II von HPV 18 und HPV 33 nachzuweisen. Wir fanden, daß auch mit der Region II der entsprechende Typus des Virus amplifiziert wurde, und es war möglich, ihn mit der geeigneten Sonden-DNA nachzuweisen.
  • Unter Anwendung der Verfahren von (1-5) wurden verschiedene Matrizen-DNA-Plasmide mit Genom-DNA verdünnt, welche von gesundem Cervixgewebe erhalten wurde, und die geeigrieten Primerpaare und die geeignete Sonde wurden zur Amplifizierung und zum Nachweis verwendet. Auf die gleiche Weise wie in (1-5) war es möglich, HPV-DNA bei dem äußerst empfindlichen Nachweispegel von 10&supmin;&sup6; Kopien/Genom-DNA nachzuweisen. Das heißt daß es möglich war, etwa 10&supmin;&sup6; pg HPV-DNA in der Probe nachzuweisen, was grob ein Molekül der HPV-DNA war.
  • Die oben erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die Virustypen HPV 16, HPV 18 und HPV 33 unter Anwendung der Regionen I und II von HPV effizient identifiziert werden können, und daß der Nachweis auf einem äußerst empfindlichen Pegel möglich ist, wenn Primerpaare und die Sonde, die verwendet werden, HPV 16, HPV 18 und HPV 33, auf welche getestet wird, entsprechen.
    • Beispiel 2
  • Herstellung eines Amplifizierungs- und Nachweiskits für HPV 16, HPV 18 und HPV 33:
  • Es wurde ein Kit für die Amplifizierung und den Nachweis von HPV 16, HPV 18 und HPV 33 in Proben hergestellt.
  • Als Primer zur Verwendung bei der Amplifizierung von DNA: 4uMol Lösungen von P16-1, p 16- 2R, p18-1, p18-2R, p33-1 und p33-2R wurden getrennt in 100 ul TE-Puffer gelöst, und diese wurden als die HPV-Primerlösungen I (Komponente A) bezeichnet. Gleichermaßen wurden p16-3, P16-4R, P18-3, p18-4R, p33-3 und p33-4R getrennt in 100 ul TE-Puffer gelöst, und diese wurden als die HPV-Lösungen II (Komponente B) bezeichnet. Als nächstes wurden p16-1, p16-2R, P16-3, p16-4R, p18-1, p18-2R, p18- 3, p18-4R, p33-1, p33-2R, p33-3 und p33-4R getrennt in TE-Puffer auf eine Konzentration von 4 uMol gelöst, und diese wurden als die HPV-Lösungen III (Komponente C) bezeichnet.
  • Als die Sonden für den Nachweis von DNA wurden pB16-I, pB16-II, pB18-I, pB18-II, pB33-I und pB33-II getrennt in TE-Puffer mit der Konzentration von 2 ug in 20 ul gelöst, und diese wurden als die HPV 16-I-Sondenlösung (Komponente D), die HPV 16-II-Sondenlösung (Komponente E), die HPV 18-I-Sondenlösung (Komponente F), die HPV 18-II Sondenlösung (Komponente G), die HPV 33-I- Sondenlösung (Komponente H) und die HPV 33-II-Sondenlösung (Komponente I) bezeichnet.
  • Die Komponenten A, D, F und H wurden zusammen in einem Amplifizierungs- und Nachweiskit I für HPV vorgesehen; die Komponenten B, E, G und I wurden zusammen in einem Amplifizierungs- und Nachweiskit II für HPV vorgesehen; und die Komponenten C, D, E, F, G, H und I wurden zusammen in einem Amplifizierungs- und Nachweiskit III für HPV vorgesehen (Tabelle 4). Tabelle 4 Bausätze für die Amplifizierung und den Nachweis von HPV Kit Komponente Primerlösung Sondenlösung Verwendungen
    • Beispiel 3 Nachweis von HPV-DNA in Proben von Cervixkarzinom- und -vorkarzinomgewebe:
  • Mit den Verfahren von (1-1) wurde Genom-DNA von etwa 100 mg Gewebe von 43 Patienten erhalten, welche eine Cervikalkarzinomoperation durchgemacht hatten, und von etwa 10 mg Gewebe, welches während einer Biopsie von 27 Patienten mit Vorkarzinomgewebe erhalten wurde. Von diesen zwei gepoolten Proben wurden etwa 100 ug bzw. etwa 10 ug Genom-DNA erhalten.
  • Dann wurde 1 ug von jeder dieser Genom-DNAs denaturiert, indem sie 10 Minuten lang auf 84ºC erhitzt wurde. Der denaturierten DNA wurden 10 ul x10 Puffer aus dem Gene Amp-Kit sowie 16 ul einer 1,25 mMol dNTP-Lösung, 0,5 ul von 5 Einheiten/ul Taq-Polymerase und 5 ul Komponente A vom Kit I von Beispiel 2 zugegeben. Dieses Gemisch wurde durch Zugabe von sterilisiertem Wasser auf 100 ul aufgefüllt. Mit den Verfahren von (1-3) wurden die Region I von HPV 16, HPV 18 und HPV 33 in einem einzigen Röhrchen amplifiziert.
  • Nach der Amplifizierung wurde die DNA denaturiert, und 1 ul der Reaktionslösung wurde auf jede von drei Nylonmebranen fleckenartig aufgetragen. Drei Nylonmembranen wurden auf die gleiche Weise hergestellt, und die Hybridisierung wurde mit dem Verfahren von (1-4) ausgeführt.
  • Auf diese Weise wurden jeweils 1 ul der Komponenten D, F und H, die im Beispiel 2 beschrieben sind, verwendet, und mit den Verfahren von (1-4) wurden die Sonden-DNAs pB16-I, pB18-I und pB33-I hergestellt, indem sie mit ³²P markiert wurden, und die richtige Sonde wurde den drei Membranen zugegeben, gefolgt von der Hybridisierung. Jede dieser HPV-Typen konnte identifiziert werden.
  • Wie in Tabelle 5 gezeigt, konnte von den Cervixkarzinom-Proben von 43 Patienten HPV-DNA in 36 Proben (84%) nachgewiesen werden. Tabelle 5 Nachweis von HPV-DNA in Proben eines Cervixkarzinoms Gesamt
  • Wie in Tabelle 6 gezeigt ist, konnte von den Proben des Vorkarzinomcervixgewebes von 27 Patienten HPV-DNA in 19 Proben (70%) nachgewiesen werden.
  • HPV-DNA wurde in 5 der 8 Patienten in CINI, in 7 der 9 Patienten in CINII und in 7 der 10 Patienten in CINIII nachgewiesen werden, so daß ein Nachweis von HPV-DNA in allen Stadien von CINI bis CINIII möglich war.
  • Die gleiche Art von Ergebnissen wurde unter Verwendung der Region II erhalten. Aus diese Weise war es möglich, die Regionen I und II von wirklichen pathologischen Proben effektiv nachzuweisen. Tabelle 6 Nachweis von HPV-DNA in Proben von Vorkarzinom-Cervixgewebe Gesamt
    • Beispiel 4 Nachweis von HPV-DNA in Proben von gesundem Cervixgewebe:
  • Etwa 1 mg Schleimhautzellen von der Cervix, welche mit Hilfe von Baumwolltupfern von 42 Frauen aus Bereichen von histologisch normaler Cervix gewonnen wurden, wurden mit den Verfahren von (1-1) behandelt, um Genom-DNA zu sammeln. Es wurden etwa 1 ug DNA erhalten. Mit den Verfahren von Beispiel 3 wurde in den Proben nach HPV-DNA gesucht. In 2% der Proben (1/42 Subjekten) wurde HPV-DNA gefünden. Dies zeigt, daß dieses Verfahren ein sehr effektives Verfahren zum Nachweis von Malignitäten im Cervixgewebe ist.
  • Wie oben detailliert erklärt, stellt diese Erfindung ein Verfahren zum hochempfindlichen Nachweis von HPV-DNA zur Verfügung, insbesondere durch die Verwendung der PCR, in welchem Verfahren die Regionen I und II identifiziert werden, und mit welchem Verfahren das HPV-Genom in Krebsgewebe und in Vorkrebsgewebe mit hoher Empfindlichkeit nachgewiesen werden kann; diese Erfindung stellt auch einen Kit zur Verfügung, welcher dieses Verfahren anwendet.

Claims (3)

1. Verfahren zum Nachweis von humanem Papillomvirus HPV 16, HPV 18, HPV 33 oder jeder Kombination dieser Viren durch Amplifizierung von zumindest einer HPV-DNA-Region mittels eines Oligonukleotid-Primerpaares, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Region eine in den Formeln 1 bis 6 gezeigte Struktur besitzt: Region
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Primerpaare eine Struktur besitzen, die in den Formeln 7- 12 gezeigt ist: Region
3. Kit zum Ausführen des Verfahrens zum Nachweis des humanen Papillomvirus nach Anspruch 1, wobei der Kit ein Primerpaar zur Amplifizierung einer spezifischen HPV-DNA-Region gemäß einer der Formeln 1 bis 6 von Anspruch 1 und eine Sonde für den Nachweis der amplifizierten DNA umfaßt.
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